KR102411571B1

KR102411571B1 - 치료제

Info

Publication number: KR102411571B1
Application number: KR1020187005607A
Authority: KR
Inventors: 존 마허; 다니엘라 요르다노바 아츠흐코바; 린지 메이 휠딩; 벤자민 오웬 드레이퍼
Original assignee: 킹즈 컬리지 런던
Priority date: 2015-07-31
Filing date: 2016-07-28
Publication date: 2022-06-21
Also published as: HK1256383A1; JP7053037B2; EP3328880A1; WO2017021701A1; US20190002521A1; US10703794B2; US20210095000A1; US11802143B2; EP3939992A1; US20200277353A1; KR20180028528A; ES2883633T3; IL256511A; EP3328880B1; CA2993746A1; US20200331981A1; GB201513540D0; MX2018001009A; JP2018521663A; JP2021168675A

Abstract

면역 반응성 세포, 예컨대 (i) (a) 신호전달 영역; (b) 보조 자극 신호전달 영역; (c) 경막 도메인; 및 (d) 표적 항원상 제1 에피토프와 특이적으로 상호작용하는 결합 요소를 포함하는 제2 세대 키메라 항원 수용체와; (ii) (e) (b)의 보조 자극 신호전달 영역과 상이한 보조 자극 신호전달 영역; (f) 경막 도메인; 및 (g) 표적 항원상 제2 에피토프와 특이적으로 상호작용하는 결합 요소를 포함하는 키메라 보조 자극 수용체를 발현하는 T 세포가 제공된다. 이 배열은 평행 키메라 활성화 수용체(pCAR)이라 지칭된다. 이 유형의 세포는 치료법에 유용하고, 이 세포가 사용되는 키트와 방법, 그리고 이 세포를 제조하기 위한 방법이 기술 및 청구된다.

Description

치료제

본 발명은 신규 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor; CAR)를 암호화하는 핵산, CAR 자체, 이 핵산을 포함하고 있는 세포, 그리고 치료법에 있어서 이 세포의 용도, 구체적으로는 선택된 표적에 대한 T 세포 반응을 촉진하는 데 있어서 이 세포가 사용되는 방법에 관한 것이다.

인공 T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 면역 수용체라고도 지칭될 수 있는 키메라 항원 수용체(CAR)는 조작된 수용체로서 당 업계에 널리 공지되어 있다. 이 키메라 항원 수용체(CAR)는 주로 면역 효과기 세포, 구체적으로 T 세포를 형질 전환하여, 이 세포에 특정의 특이성을 제공하는 데 사용된다. 키메라 항원 수용체(CAR)는, 특히 이것이 입양 세포 이식(adoptive cell transfer)과 같은 기술들에 사용될 수 있는 암 면역요법 분야에서 연구되고 있다. 이러한 치료법에 있어서 T 세포는 환자로부터 분리된 다음, 특정 형태의 암에서 발견되는 항원에 특이적인 수용체를 발현하도록 변형된다. 그 결과 암 세포를 인지하여 사멸할 수 있게 된 T 세포는 환자에 다시 도입된다.

제1 세대 CAR은 가장 일반적으로 CD3 제타(z)를 이용하여 TCR 유사 신호를 제공하고, 이로써 암 세포 파괴 기능이 발휘된다. 그러나 CD3z 사슬 융합 수용체의 관여는 동시 보조자극 신호의 부재 하에서는 충실한 IL-2 분비 및/또는 증식을 유도하기에 충분할 수 없다. 생리학적 T 세포 반응에 있어서, 최적의 림프구 활성화는 CD28이나 4-1BB와 같은 보조 자극 수용체(신호 2) 하나 이상의 관여를 필요로 한다. 결과적으로 T 세포는 또한 종양 항원 의존적 방식으로 보조 자극 신호를 수용하도록 조작되기도 하였다.

이것과 관련하여 중요한 성과가 달성되었는데, 기능성 항원 의존적 보조 자극 신호를 인간의 1차 T 세포에 전달하여, 암 세포 파괴 활성을 보이는 것 이외에 T 세포 증식을 허용하는'제2 세대 CAR'의 성공적인 디자인이 그것이다. 제2 세대 CAR은 가장 일반적으로 CD28 또는 4-1BB로부터 유래하는 모듈들을 이용하여 보조 자극을 제공한다. 보조 자극과 CD3 제타 신호의 병합 전달은 제2 세대 CAR이, 이의 제1 세대 대응물(CD3z 신호 단독)의 전달과 비교되었을 때, 명백히 월등한 기능을 발휘하도록 만든다. 제2 세대 CAR의 일례는 미국 특허 제7,446,190호에서 확인된다.

더욱 최근에는 소위 '제3 세대 CAR'이 제조된 바 있다. 이는 다수의 신호전달 도메인들을 병합하여, 그 효능을 더욱 증대한다(예컨대 CD28+4-1BB+CD3z 또는 CD28+OX40+CD3z). 제3 세대 CAR에 있어서, 신호전달 도메인들은 CAR 엔도 도메인(CAR endodomain) 내에 일렬로 정렬되어 CD3z의 상류에 자리잡는다.

그러나 일반적으로 이러한 제3 세대 CAR로 달성된 결과들은 실망스럽게도 제2 세대 입체배열로 달성된 결과들에 비하여 단지 미약한 정도로만 개선되었다.

다수의 구조체로 형질전환된 세포를 사용하는 것도 또한 제안된 바 있다. 예를 들어 Kloss 외 다수의 문헌[Nature Biotechnology 2012, doi:10.1038/nbt.2459]은, 제1 항원을 표적화하는 신호 활성화 영역(CD3 제타 사슬)을 포함하는 CAR과, 제2 항원을 표적화하는 CD28 및 4-1BB 보조자극 영역을 둘 다 포함하는 키메라 보조 자극 수용체(CCR)를 가지는 T 세포의 형질 도입을 기술하고 있다. 상기 구조체 2개는 자체의 각 항원에 상이한 결합 친화도로 결합하고, 그 결과 부작용을 줄일 목적으로 치료법의 특이성을 향상시킬 수 있는 '종양 감지' 효과가 달성된다.

T 세포가 성장하면서, 시토킨을 생산하고, 항원 발현 종양 표적 세포에 의한 자극 단계들을 수 회 반복하여 사멸 신호를 전달할 수 있는 상태로 유지될 수 있는 시스템을 개발하는 것이 요망된다. 차선의 보조 자극이 제공되면 T 세포들은 재 자극시 이러한 효과기 기능들을 빨리 잃게 되고, 이로써 "아네르기(anergy)"라고 알려진 상태에 돌입하게 된다. CAR T 세포가 시험관 내에서 연속으로 재 자극되면, 이 CAR T 세포는 점진적으로 효과기 특성들(예컨대 IL-2 생산 능 및 증식 능)을 잃게 되고, 분화하여 더 많은 효과기 유사 세포가 되는데, 다시 말해서 보조 자극 효과를 나타내기 쉽지 않게 된다. 이는 암 면역요법에 바람직하지 않은데, 그 이유는 더 많이 분화된 세포는 수명이 더 짧아지고, 반복적으로 자극될 때 종양 미세환경 중에서 추가의 성장/활성화를 진행하는 능력이 감소하는 경향이 있기 때문이다.

본 출원인들은, 다수의 보조 자극 영역들이 내부에 배열되어 있는 변별적 구조체들의 조합을 사용하여 유효 T 세포 반응을 유도할 수 있음을 발견하였다.

본 발명의 제1 양태에 의하면,

(i) (a) 신호전달 영역;

(b) 보조 자극 신호전달 영역;

(c) 경막 도메인; 및

(d) 표적 항원상 제1 에피토프와 특이적으로 상호작용하는 결합 요소

를 포함하는 제2 세대 키메라 항원 수용체와;

(ii) (e) (b)의 보조 자극 신호전달 영역과 상이한 보조 자극 신호전달 영역;

(f) 경막 도메인; 및

(g) 표적 항원상 제2 에피토프와 특이적으로 상호작용하는 결합 요소

를 포함하는 키메라 보조 자극 수용체

를 발현하는 면역 반응성 세포가 제공된다.

본 출원인들은, 이 시스템의 효능은 우수하다는 것을 발견하였는데, 구체적으로 유사한 요소들을 가지는 종래의 제3 세대 CAR이 사용될 때 달성되는 효능보다 더 우수할 수 있음을 발견하였다. 본 발명의 유형의 구조체들은 '평행 키메라 활성화 수용체(parallel chimeric activating receptor)' 또는 'pCAR'이라고 칭하여질 수 있다.

뿐만 아니라, 세포의 증식 능, 즉 세포 자체의 세포 독성 효능을 유지하고, IL-2를 방출하는 세포의 능력은 항원 발현 종양 세포로 인한 자극의 반복되는 다수의 단계들 동안 유지된다.

이론에 의해 국한되지 않을 때, pCAR 내 요소들의 배열은 활성을 촉진할 수 있다. 예를 들어 정의상 제3 세대 CAR 내 보조 자극 모듈들 중 하나는, 자체의 자연상 위치로부터 멀리 떨어져 원형질 막 내소엽 가까이에 배치되어야 한다. 이러한 배열은, 일반적으로 필수(obligate) 막 결합 파트너 분자들로의 손상된 접근 경로로 인하여, 막 결합 파트너 분자들이 정상적으로 신호를 보내지 못하도록 할 수 있다. 대안적으로 제3 세대 CAR 내 보조 자극 신호전달 모듈 2개가 매우 근위에 존재하면, 입체적으로 문제를 일으키고, 이로 말미암아 하나 이상의 하류 신호전달 경로가 완전히 관여하지 못하도록 막을 수 있다. 본 발명의 배열은 이러한 문제점 둘 다를 해결한다. 신호전달 부 (b) 및 (e)는 둘 다 경막 도메인에 직접 융합될 수 있는데, 이는 상기 신호전달 부 (b) 및 (e) 둘 다가 세포 내에서 원형질 막에 인접하여 존재하도록 보장한다. 더욱이 상기 신호전달 부 (b) 및 (e)는 세포 내 변별적 위치들에 존재할 수 있으며, 서로가 입체적으로 상호작용하지 않게 될 것이다.

본 발명의 제1 양태에 사용되기 적합한 면역 반응성 세포는 T 세포, 예컨대 세포 독성 T 세포, 조력자 T 세포 또는 조절 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 구체적으로 면역 반응성 세포는 T 세포이다.

상기 적합한 요소 (a)는 임의의 적합한 신호전달 영역, 예컨대 면역 수용체 티로신 기반 활성화 모티프(Immune-receptor-Tyrosine-based-Activation-Motif; ITAM)를 포함하는 임의의 영역을 포함할 수 있다[예를 들어 Love et al. Cold Spring Harbor Perspect. Biol 2010 2(6)1 a002485 참조]. 특정 구현예에서, 신호전달 영역은, 예컨대 미국 특허 제7,446,190호에 기술된 바와 같은 인간 CD3[제타] 사슬의 세포 내 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다.

구체적으로 이는 전장 인간 CD3 제타 사슬의 52번 내지 163번 아미노산 잔기에 걸쳐 확장되어 있는 도메인을 포함한다. 이는 다수의 다형성 형태들(예컨대 서열 번호 gb|AAF34793.1 및 gb|AAA6039.1)(각각 하기 서열 번호 1 및 서열 번호 2)을 가진다:

본원에 사용된 바와 같은 '변이체'란 용어는, 기본 서열의 자연 발생 다형성 형태인 폴리펩티드 서열뿐만 아니라 사슬 내 하나 이상의 아미노산이 삽입, 제거 또는 치환된 합성 변이체를 지칭한다. 그러나 변이체는 기본 서열의 생물학적 효과와 유사한 생물학적 효과를 보인다. 예를 들어 상기 예시된 변이체는 인간 CD3 [제타] 사슬의 세포 내 도메인의 작동 방식과 유사한 방식으로 작동할 것이다. 어떤 아미노산이 이 아미노산이 속한 군과 동일한 군에 속하면서 대략적으로 유사한 특성들을 가지는 상이한 아미노산으로 치환될 때, 이와 같은 아미노산 치환은 "보존적"인 것으로 간주될 수 있다. 비 보존적 치환은, 아미노산들이 상이한 유형이나 군에 속하는 아미노산들로 치환되는 경우이다.

아미노산 군들은 하기와 같이 정의된다:

군 아미노산 예

비극성: A, V, L, I, P, M, F, W

비 하전 극성: G, S, T, C, Y, N, Q

산성: D, E

염기성: K, R, H

당업자들에게 널리 공지되어 있는 바와 같이, 보존적 치환에 의해 펩티드의 1차 구조를 변경하는 것은 해당 펩티드의 활성을 유의미하게 변경시킬 수 없는데, 그 이유는 서열에 삽입된 아미노산의 측쇄가 유사한 결합을 형성할 수 있고, 이 측쇄는 치환으로 빠지게 된 아미노산의 측쇄로서 접촉하기 때문이다. 펩티드의 형태를 결정하는 데 중요한 영역 내에서 치환이 일어났을 때 조차도 그러하다.

비 보존적 치환도 또한 가능할 수 있는데, 다만 이 비 보존적 치환은 전술된 바와 같은 폴리펩티드의 기능을 방해하지 않는다. 넓은 의미에서 말하자면, 폴리펩티드의 생물학적 활성이 변경되지 않는 소수의 비 보존적 치환이 가능할 것이다.

일반적으로 변이체는 기본 서열, 예컨대 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열과 적어도 70%, 예컨대 적어도 71%, 75%, 79%, 81%, 84%, 87%, 90%, 93%, 95%, 96% 또는 98% 동일할 아미노산 서열을 가질 것이다. 이 내용 중 동일성은 서열 번호 2 또는 단편, 구체적으로 하기 기술된 단편을 기본 서열로 보는 BLASTP 컴퓨터 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다. BLAST 소프트웨어는 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi(2009년 3월 12일 기준으로 접속 가능)를 통해 공중이 이용 가능하다.

보조 자극 신호 서열(b)은 경막 도메인(c)과 신호전달 영역(a) 사이에, 그리고 결합 요소(d)와는 떨어져서 위치하는 것이 적합하다. 이와 유사하게 보조 자극 신호 서열(e)은 경막 도메인(f)에 인접하고, 결합 요소(g)와는 떨어져서 위치하는 것이 적합하다.

상기 요소 (b) 및 (e)로 사용되기 적합한 보조 자극 신호전달 영역들도 또한 당 업계에 널리 공지되어 있으며, B7/CD28 과의 일원들, 예컨대 B7-1, B7-2, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-H7, BTLA, CD23, CTLA-4, Gi24, ICOS, PD-1, PD-L2 또는 PDCD6; 또는 ILT/CD85 과 단백질, 예컨대 LILRA3, LILRA4, LILR31, LILRB2, LILR33 또는 LILRB4; 또는 종양 괴사 인자(TNF) 상과 일원들, 예컨대 4-1BB, BAFF, BAFF R, CD27, CD30, CD40, DR3, GITR, HVE, LIGHT, 림포톡신-알파, 0X40, RELT, TAGI, TL1A, TNF-알파 또는 TNF RII; 또는 SLAM 과 일원들, 예컨대 2B4, BLAME, CD2, CD2F-10, CD48, CD58, CD84, CD229, CRACC_, NTB-A 또는 SLAM; 또는 TIM 과 일원들, 예컨대 TIM-1, TIM-3 또는 TIM-4; 또는 기타 보조 자극 분자들, 예컨대 CD7, CD96, CD160, CD200, CD300a_,CRTAM, DAP12, 덱틴-1, DPPIV, EphB6, 인테그린 알파 4 베타 1, 인테그린 알파 4 베타 7/LPAM-1, LAG-3 또는 TSLP R을 포함한다.

보조 자극 신호전달 영역들의 선정은, 형질 전환된 세포에 대해 의도되는 구체적인 용도에 따라서 선택될 수 있다. 구체적으로 상기 (b)와 (e)에 대해 선택된 보조 자극 신호전달 영역들은 서로 상승적으로 작동하거나 협동하여 작동할 수 있는 영역들이다. 예를 들어 상기 (b)와 (e)에 대한 보조 자극 신호전달 영역들은 CD28, CD27, ICOS, 4-1BB, 0X40, CD30, GITR, HVEM, DR3 또는 CD40으로부터 선택될 수 있다.

특정 구현예에서, (b) 또는 (e) 중 하나는 CD28이고, 다른 하나는 4-1BB 또는 OX40이다.

특정 구현예에서, (b)는 CD28이다.

또 다른 특정 구현예에서, (e)는 4-1BB 또는 OX40이고, 특히 4-1BB이다. 또 다른 구현예에서, (e)는 CD27이다.

상기 (c) 및 (f)의 경막 도메인은 동일하거나 상이할 수 있지만, 특히 세포 표면상에서 구조체들의 격리를 보장하기 위해서는 상이하여야 한다. 바이러스 벡터에 직접 반복 핵산 서열이 포함되면, 이 바이러스 벡터는 직접 반복부들 사이에 서열 결실을 포함한 채로 재 배열되기 쉽게 만들어지므로, 상이한 경막 도메인들의 선정은 벡터의 안정성을 향상시킬 수도 있다. 그러나 (c) 및 (f)의 경막 도메인들이 동일한 경우, 이와 같은 위험은 동일한 단백질 서열을 암호화하도록 선택된 코돈들의 변형 또는 '동요(wobbling)'에 의해 감소할 수 있다.

적합한 경막 도메인들이 당 업계에 공지되어 있으며, 예컨대 CD8α, CD28, CD4 또는 CD3z 경막 도메인들을 포함한다.

보조 자극 신호전달 영역이 전술된 바와 같은 CD28을 포함하는 경우, CD28 경막 도메인은 적합한 선택권을 보인다. 전장 CD28 단백질은 서열 번호 3의 220개 아미노산 단백질이다.

(상기에서, 경막 도메인은 굵은 글씨체로 나타냄)

구체적으로 보조 자극 신호전달 영역들 중 하나는 CD28의 힌지 영역을 기반으로 하고, 또한 적합하게는 CD28의 경막 도메인과 엔도 도메인을 기반으로 한다. 구체적으로 서열 번호 3의 114번 내지 220번 아미노산들(하기 서열 번호 4로서 보인 바와 같은 아미노산들)을 포함한다.

특정 구현예에서, 상기 보조 자극 신호전달 영역들 (b) 또는 (e) 중 하나는 서열 번호 5의 c-myc 태그를 포함하는 서열 번호 4의 변형된 형태이다.

c-myc 태그는 널리 공지되어 있으며, 하기 서열 번호 5의 서열이다.

c-myc 태그는, 엑토 도메인(ectodomain)으로의 삽입 또는 엑토 도메인 내부 영역의 치환에 의해 보조 자극 신호전달 영역 (b) 또는 (e)에 부가될 수 있으며, 그 결과 서열 번호 3의 1번 내지 152번 아미노산 영역 내부에 위치하게 된다.

특히 바람직한 구현예에서, c-myc 태그는 CD28 서열 내 MYPPPY 모티프를 치환한다. 이 모티프는 잠재적으로 유해한 서열에 해당한다. 이 모티프는 CD28과 이의 자연 리간드들, CD80 및 CD86 사이의 상호 작용에 관여하므로, CAR T 세포가 상기 리간드들 중 어느 하나를 발현하는 표적 세포와 조우할 때 표적을 벗어난 독성이 발현될 가능성을 제공한다. 이 모티프가 전술된 바와 같은 태그 서열로 치환됨으로써 원치 않는 부작용이 발생할 가능성은 감소한다.

그러므로 특정 구현예에서, 구조체의 보조 자극 신호전달 영역 (b)는 서열 번호 6의 서열이다.

더욱이 c-myc 에피토프를 첨가하는 것은, 모노클로날 항체를 사용하여 CAR T 세포들을 검출하는 것을 촉진한다는 의미를 갖는다. 이는 매우 유용한데, 그 이유는 일부 가용 항체가 사용될 때 유동 세포계측 검출법은 신뢰할 수 없는 것으로 판명되었기 때문이다.

뿐만 아니라 c-myc 에피토프 태그가 제공되면, 표적화된 CAR T 세포들의 항원 독립적 증식은, 예컨대 용액 중 적당한 모노클로날 항체 또는 고체 상(예컨대 백(bag))에 고착된, 적당한 모노클로날 항체가 사용되는 CAR 가교에 의해 촉진될 수 있었다.

또한 TCR의 가변 영역 내 항 인간 c-myc 항체에 대한 에피토프, 즉 9e10의 발현은 시험관 내 및 생체 내 둘 다에서 항체 매개 세포 독성 및 보체 매개 세포 독성을 발휘할 수 있기에 충분한 것으로 앞서 확인된 바 있다[Kieback et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105(2) 623-8]. 그러므로 이러한 에피토프 태그의 제공은 또한 "자살 시스템(suicide system)"으로서 사용될 수 있었고, 이로써 항체는, 만약 독성이 발현되는 경우 생체 내에서 CAR T 세포를 고갈시키는 데 사용될 수 있었다.

결합 요소들 (d) 및 (g)는 상이할 것이고, 동일한 중첩 에피토프 또는 상이한 에피토프와 결합할 것이다. 특정 구현예에서, 제1 및 제2 에피토프는 동일한 수용체 또는 항원과 결합하게 된다. 그러므로 전술된 바와 같이 제1 및 제2 에피토프는 몇몇 경우 동일하거나 중첩될 수 있고, 그 결과 결합 요소들 (d) 및 (g)는 자체들의 결합에 있어서 경쟁하게 될 것이다. 대안적으로 제1 및 제2 에피토프는 상이할 수 있으며, 예상되는 구체적 치료법에 따라서 동일한 항원 또는 상이한 항원과 결합할 수 있다. 하나의 구현예에서, 항원은 상이하지만, 동일한 질병, 예컨대 동일한 특정 암과 연관될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이 '항원'이란 용어는, 결합 요소들과 결합할, 특정 결합 쌍의 임의의 일원을 지칭한다. 그러므로 상기 용어는 표적 세포상 수용체들을 포함한다.

그러므로 적합한 결합 요소들 (d) 및 (g)는 관심 표적을 인지하는 능력을 가지는 pCAR을 제공하는 임의의 요소일 수 있다. 본 발명의 pCAR을 유도하는 표적은, T 세포 반응을 유도하는 것이 요망될, 임상적 관심이 있는 임의의 표적일 수 있다. 이 표적은, 다양한 유형의 암과 연관된 마커, 예컨대 하나 이상의 ErbB 수용체 또는 α_vβ₆ 인테그린, 전립선 암과 연관된 마커(예컨대 전립선 특이 막 항원(PSMA)과 결합하는 결합 요소가 이용됨), 유방암과 연관된 마커(예컨대 Her-2(ErbB2라고도 알려짐)를 표적화하는 결합 요소가 이용됨), 그리고 신경아세포종과 연관된 마커(예컨대 GD2를 표적화하는 결합 요소가 이용됨), 흑색종, 소 세포 또는 비 소 세포 폐 암종, 육종 및 뇌 종양과 연관된 마커들을 포함할 것이다. 특정 구현 예에서, 표적은 전술된 바와 같은 하나 이상의 ErbB 이량체 또는 콜로니 자극 인자-1 수용체(CSF-1R) 또는 α_vβ₆ 인테그린인데, 이것들은 모두 몇몇 고형 종양들에 연루되어 있다.

본 발명의 pCAR에 사용되는 결합 요소들은 선택된 표적을 인지하는 항체들을 포함할 수 있다. 편의상 결합 요소로서 사용되는 항체는, 바람직하게 낙타, 인간 또는 기타 종으로부터 유래하는 단일 도메인 항체 또는 단일 사슬 항체(scFv)이다. 단일 사슬 항체는 원하는 표적에 특이적인 하이브리도마의 V 영역 유전자로부터 클로닝될 수 있다. 이러한 하이브리도마의 제조는 통상적인 작업이 되었으며, 그 절차는 본원에 반복되어 기술되지 않을 것이다. 가변 영역 중쇄(VH) 및 가변 영역 경쇄(VL)를 클로닝하기 위해 사용될 수 있는 기술은 문헌[Orlandi et al., Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 86: 3833-3837 (1989)]에 기술되었다. 간단히 말해서, mRNA가 하이브리도마 세포주로부터 분리된 다음, 이 mRNA는, 예컨대 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 키트가 사용되어 상보성 DNA(cDNA)로 역 전사된다. VH 및 VL 유전자들의 서열에 대응하는 서열 특이적 프라이머들이 사용된다. 클로닝된 VH 유전자가 예상한 바들과 맞아떨어졌음을 확인하기 위해, 클로닝된 생성물의 서열 분석과, VH 및 VL 유전자들의 공지 서열에 대한 비교가 사용될 수 있다. 그러면 VH 및 VL 유전자들은, 예컨대 (gly4-ser)3 링커를 암호화하는 올리고뉴클레오티드가 사용되어 서로 부착된다.

대안적으로 pCAR의 결합 요소는 리간드, 예컨대 T1E 펩티드(ErbB 동종 이량체 및 이종 이량체와 결합), 콜로니 자극 인자-1(CSF-1) 또는 IL-34(둘 다 CSF-1 수용체에 결합)를 포함할 수 있다. T1E 펩티드는, 성숙 인간 TGF-α 단백질의 N-말단과 가장 가까운 아미노산 7개(전 형질전환 성장 인자 알파 동형체 1의 40번 내지 46번 아미노산(NP_003227.1))에 의해 치환된, N-말단과 가장 가까운 아미노산 5개(즉 전 상피 성장 인자 전구체의 971번 내지 975번 아미노산(NP_001954.2))를 제외한, 전체 성숙 인간 EGF 단백질로 이루어진 키메라 융합 단백질이다.

또 다른 구현 예에서, pCAR의 결합 요소는 α_vβ₆ 인테그린 특이적 결합제를 포함한다. α_vβ₆ 인테그린은, 다수의 유형의 암에서 강력하게 상향 조절되는 것으로 확인된 바, 현재 암 표적으로서 간주되고 있다. α_vβ₆는, 바이러스 외피 단백질 VP1 내 RGD 모티프를 통한 결합에 의하여, 구제역 바이러스(FMDV) 수용체인 것으로 시험관 내에서 확인되었다. 결과적으로 미국 특허 제8,383,593호에 기술된 바와 같이, FMDV로부터 유래하는 다양한 펩티드들, 구체적으로 FMDV의 VP1 단백질로부터 기원하고, RGD 모티프를 포함하는 펩티드들은, 증가한 결합 효능과 결합 특이성을 보였다. 구체적으로 이러한 펩티드들은 서열 모티프

또는

을 포함하는데, 다만 여기서 LX⁵X⁶L 또는 LX⁵X⁶I는 알파 나선 구조 내에 포함되어 있고, X⁵ 및 X⁶는 나선체 촉진 잔기들로서, [알파]-나선체 중간에서 발견되는 것에 대한 형태적 선호도(conformational preference)가 1을 초과한다[Creighton, 1993 and Pace C. N. and Scholtz J. M. (1998), Biophysical Journal, Vol. 75, pages 422-427 참조]. 구체적으로 이러한 잔기들은 독립적으로 Glu, Ala, Leu, Met, Gln, Lys, Arg, Val, Ile, Trp, Phe 및 Asp로 이루어진 군으로부터 선택된다.

이러한 서열들의 구체 예들은 서열 번호 9 내지 11의 서열 또는 이것들의 변이체들, 즉

또는

를 포함한다.

이들 펩티드는 본 출원의 CAR에 대한 결합 요소들의 특정 군을 이룰 수 있다.

선택된 악성종양, 예컨대 호지킨 림프종과 일부 유방암에 대해서, 2개의 자연 리간드는 CSF-1과 IL-34이며, 이 리간드들은 (d) 및 (g)에 특히 적합한 결합 요소들을 이룬다. 그러나, 이 리간드들은 상이한 친화도로 결합한다. 결합 친화도는 관찰되는 활성에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 경우, 더 낮은 결합 친화도를 보이는 결합 요소가 결합 요소 (d)로 사용되고, 더 높은 결합 친화도를 보이는 결합 요소가 결합 요소 (g)로 사용되도록 보장하는 것이 유리할 수 있다. 구체적으로 하나의 구현 예에서, 제2 세대 CAR(i)의 자체의 동족 표적에 대한 상대적 친화도는, 이 CAR의 동반자 TNFR 기반 키메라 보조 자극 수용체(ii)의 상대적 친화도보다 더 낮다. 이는, 만약 이러한 상대적 친화도 관계가 유지된다면, 높은 친화도 또는 낮은 친화도를 가지는 표적화 부들이 각각의 위치에 사용되는 것을 방해하지 않는다. 그러므로 본 발명의 경우 특정 구현 예에서, 결합 요소 (d)는, 비교적 낮은 결합 친화도를 보이는 CSF-1인 반면에, 결합 요소 (g)는 더 높은 결합 친화도를 보이는 IL-34를 포함한다.

적합하게 결합 요소는, 세포 표면상에서의 발현을 촉진하는 리더 서열과 결합한다. 다수의 리더 서열이 당 업계에 공지되어 있으며, 이러한 리더 서열은 대식세포 콜로니 자극 인자 수용체(FMS) 리더 서열 또는 CD124 리더 서열을 포함한다.

추가의 구현 예에서, pCAR을 발현하는 세포는 키메라 시토킨 수용체, 구체적으로 4αβ키메라 시토킨 수용체를 공동 발현하도록 조작된다. 4αβ에 있어서, IL-4 수용체-α 사슬의 엑토 도메인은 막을 관통하여 IL-2/15 수용체-β의 엔도 도메인에 연결된다. 이는, 적합한 지원 배지(4αβ의 경우에는 유일한 시토킨 지원물로서 IL-4 포함) 중 유전자 조작된 T 세포의 배양에 의해, 유전자 조작된 T 세포가 세포 외에서 선택적 증식과 증량을 할 수 있도록 만든다. 이와 유사하게, IL-4 수용체-α 사슬의 엑토 도메인이, 공통의 γ 사슬에 결합하기도 하는 시토킨에 의해 자연적으로 결합하는 또 다른 수용체의 엔도 도메인과 막을 관통하여 연결되어 있는 시스템이 키메라 시토킨 수용체와 함께 사용될 수 있다.

논의된 바와 같이, 이러한 세포는 표적 세포 군집에 대한 T 세포 매개 면역 반응을 자극하는 치료법에 유용하다. 그러므로 본 발명의 제2 양태는, 표적 세포 군집에 대한 T 세포 매개 면역 반응의 자극을 필요로 하는 환자를 대상으로 이러한 반응을 자극하기 위한 방법을 제공하는데, 이 방법은 전술된 바와 같은 면역 반응성 세포의 군집을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 결합 요소 (d) 및 (g)는 표적 세포에 특이적이다.

본 발명의 제3 양태에 있어서, 상기 항목들 중 임의의 하나에 따라서 면역 반응성 세포를 제조하기 위한 방법이 제공되는데, 이 방법은 상기 정의된 바와 같은 구조의 CAR(i)을 암호화하는 제1 핵산과; 상기 정의된 바와 같은 구조의 CAR(ii)을 암호화하는 제2 핵산을 세포에 형질 도입하는 단계를 포함한다.

구체적으로 이와 같은 방법에서, 환자로부터 유래하는 림프구에 (i) 및 (ii)의 CAR들을 암호화하는 핵산들이 형질 도입된다. 구체적으로, T 세포는, 예컨대 레트로바이러스 매개 형질 도입에 의해 유전자 변형이 되고, 그 결과 CAR 암호화 핵산들은 숙주 T 세포 게놈에 도입되며, 이로써 안정한 CAR 발현이 허용된다. 이후 T 세포는, 선택적으로 증식 후에 환자에 재도입되어 유리한 치료 효과를 제공할 수 있다. 세포, 예컨대 T 세포가 키메라 시토킨 수용체, 예컨대 4αβ를 공동 발현하도록 조작되는 경우, 증식 단계는 시토킨을 포함하는 배지, 예컨대 4αβ의 경우 유일한 시토킨 지원물로서 IL-4를 포함하는 배지 중에서의 세포 외 배양 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 키메라 시토킨 수용체는, 변별적 특성들을 가지는 공통의 γ 시토킨(예컨대 IL-7)에 의해 점유되는 엔도 도메인에 연결된, IL-4 수용체-α 사슬의 엑토 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 환경에서 IL-4가 존재하는 가운데 이루어진 세포 증식은, IL-7이 이와 같은 효과를 달성하는 타고난 능력을 활용하면서, 세포 분화를 더 적게 진행할 수 있다. 이러한 방식으로, 원하는 분화 상태에 있는 유전자 조작 T 세포의 선택적 증식 및 증량이 보장될 수 있다.

본 발명의 제4 양태에 있어서, 상기 CAR(i)을 암호화하는 제1 핵산과, 상기 CCR(ii)을 암호화하는 제2 핵산의 조합이 제공된다. 앞서 밝힌 바와 같이, 이러한 조합은 pCAR이라 지칭된다. 핵산에 적합한 서열들은 당업자에게 명백할 것이다. 서열은 필요한 면역 반응성 세포에 사용되도록 최적화될 수 있다. 그러나 몇몇 경우들에 있어서, 상기 논의된 바와 같이, 코돈은 반복 서열들이 생성되는 것을 막기 위해 최적화된 상태로부터 변형되거나 '동요'될 수 있다. 이러한 핵산의 구체 예들은 전술된 바람직한 구현 예들을 암호화할 것이다.

형질 도입을 달성하기 위하여, 본 발명의 제4 양태의 핵산은 벡터, 예컨대 플라스미드 또는 레트로바이러스 벡터에 적합하게 도입된다. 플라스미드 벡터를 비롯한 이러한 벡터들, 또는 이 벡터들을 함유하는 세포주들은 본 발명의 추가 양태를 이룬다.

제1 및 제2 핵산, 또는 이것들을 함유하는 벡터는, 본 발명의 제1 양태에 의한 면역 반응성 세포를 현장에서 제조할 목적으로 제공되는 키트 내에서 합하여 질 수 있다.

전술된 핵산에 의해 암호화되는 평행 키메라 활성화 수용체(pCAR)는 본 발명의 추가 양태를 이룬다.

지금부터 본 발명은 실시예에 의하여, 그리고 하기 도면들을 참고로 구체적으로 기술될 것인데,

도 1은, 본 발명을 구현하는 CAR 및 pCAR의 패널(C34B 및 34CB라고도 칭하여짐)의 개략도이다. 모든 CAR과 pCAR은 4αβ, 즉 IL4 수용체-α 엑토 도메인이 막을 관통하여 IL-2 수용체-β의 엔도 도메인에 융합된 키메라 시토킨 수용체와 함께 SFG 레트로바이러스 벡터 내에서 공동 발현되었다. 4αβ가 사용되면, 이 4αβ는 감마 c(γc) 사슬을 모집하기 때문에, IL-4 내에서의 배양을 통한 유전자 변형 T 세포의 선택적 증량과 증식이 가능하다.

도 2는, 도 1에 보인 CAR을 사용하여 수행된 실험의 결과들을 보여준다. 이들 CAR 및 pCAR을 발현하는 T 세포(1 x 10⁶개 세포)(또는 비 형질 도입(UT) 세포; 대조군)는 동족 표적 항원(c-fms에 의해 암호화되는 콜로니 자극 인자-1 수용체(CSF-1R))을 발현하는 T47D 종양 세포(T47D-FMS) 또는 동족 표적 항원을 발현하지 않는 T47D 종양 세포(T47D)와 함께 시험관 내에서 24시간 동안 공동 배양되었다. 이후 잔여 생 종양 세포들은 MTT 검정에 의해 정량되었다.

도 3은, 도 1의 CAR 및 pCAR을 발현하는 T 세포(또는 비 형질 도입 T 세포; 대조군)가 외인성 시토킨 부재 하에 Ag 자극의 연속적 단계들의 대상이 되었던 대표적 실험의 결과들을 보여준다. 자극은, T47D FMS 단일 층 상에서 1주일 간격으로 배양함으로써 제공되었고, T 세포 수는 지정된 간격을 두고 계수되었다.

도 4는, 도 3에 보인 바와 유사한 반복 실험들(7회)로부터 모아진 데이터를 보여주는데, 이때 데이터는 각 자극 주기 이후의 주에 일어난 CAR T 세포 증식 배수를 나타낸다.

도 5는, 도 3에 보인 실험에 있어서 제2회차, 제6회차, 제9회차 및 제12회차 자극 주기에 수행된 예시적 세포 독성 검정 결과들을 보여준다. 이는, 각 재 자극 주기로부터 24시간 후 T47D FMS 및 비 변형 T47D 단일 층을 사멸하는 T 세포의 능력에 대해 시험하여 구해진 것이다(MTT 검정).

도 6은, 각 자극 주기 후 1일 경과 시 배양액으로부터 분리된 상청액을 대상으로 IL-2 및 IFN-γ 함량에 대해 ELISA로 시험한 결과들을 보여준다.

도 7은, CSF-1R 발현 악성 대세포 림프종의 생체 내 이종 이식 편 모델의 확립을 보여주고 있는데, 이는 추후 CAR과 pCAR 조작 T 세포의 항 종양 활성에 대한 시험이 수행될 수 있는 발판이 되었다. 이 모델은 반딧불이 루시퍼라아제(luc)와 레드 형광 단백질(RFP)를 발현하도록 조작된 K299 세포가 사용되어 확립되었다. 도 7의 A는, 지정된 용량의 K299 luc 세포가 정맥 내 주입된 후 생성된 종양을 보여주는 것으로서, 생물발광 영상화(BLI)에 의해 정량되었다. 대표적인 BLI 영상들은 2백만개의 종양 세포를 이식 받은 마우스가 사용되었을 때의 영상들인 도 7의 B에 보였다. 지정된 조직들 중 RFP+ 종양 세포가 발현되었음(도 7의 C)을 보여주고 있는데, 이는 이 모델에서 림프 소절 내에만 종양이 생성된다는 것을 입증해준다. 5개의 대표적인 림프 소절 종양에서의 CSF-1R 발현은 도 7의 D에 보인다.

도 8은, K299 luc 세포들이 SCID 베이지 마우스에 정맥 내 주입되는 치료 연구의 결과들을 보여준다(군당 9마리, 2회의 별도 실험으로 나누어 실시). 5일 후, 마우스는 CAR T 세포로 처리되었다. 종양으로부터 모아진 생물발광 방사 데이터는 도 8의 A에 보인다. 개별 마우스로부터의 생물발광 방사는 도 8의 B에 보이고, 마우스 생존율은 도 8의 C에 보인다.

도 9는, 시간이 경과함에 따른 치료 연구에 사용된 동물들의 중량을 보여준다.

도 10 ~ 13은, 본 발명의 T 세포를 발현하는 이중 CAR(C34B)로부터의'소진 마커(exhaustion marker)'발현에 관한 분석 결과들을 보여주는데, 여기서 도 10은 PD1 분석 결과들을 보여주고, 도 11은 TIM3 분석 결과들을 보여주며, 도 12는 LAG3 분석 결과들을 보여주고, 도 13은 2B4 분석 결과들을 보여준다.

도 14는, 본 발명을 구현하는 pCAR을 포함하며 제조된, 인테그린 αvβ6에 대해 표적화된 구조체와 CAR 패널(SFG TIE-41BB/A20-28z라 명명됨)의 개략도이다. A20-28z는 구제역 바이러스로부터 유래한 A20 펩티드가 사용되어 표적화되는 제2 세대 CAR이다. A20은 높은 친화도로 αvβ6와 결합하고, 이보다 85배 내지 1000배 더 낮은 친화도로 다른 RGD-결합 인테그린과 결합한다. C20-28z는, A20의 핵심 요소들이 인테그린 결합 활성을 보이지 않도록 돌연 변이된 부합 대조군이다. CAR 모두는, 도 1에 도시된 바와 같이, 4αβ와 공동 발현되었다.

도 15는, 유동 혈구계측법에 의해 작성된 일련의 히스토그램으로서, A375 puro 및 Panc1 세포에 인테그린이 발현되었음을 보여준다. 세포는 항 β6(Biogen Idec)→ 2차 항 마우스 PE, 항 αvβ3 또는 항 αvβ5(둘 다 APC 접합됨; Bio-Techne)로 염색되었다. 게이트들은 2차 항체 단독 또는 아이소타입 대조군을 기준으로 설정되었다.

도 16은, αvβ6에 표적화된, 본 발명의 pCAR을 비롯한 CAR의 세포 독성을 보여주는 일련의 그래프이다. 지정된 CAR 및 pCAR을 발현하는 T 세포는 αvβ6-음성 종양 세포(Panc1 및 A375 puro) 또는 αvβ6-양성 종양 세포(Bxpc3 및 A375 puro β6)와 공동 배양되었다. 데이터는, 2회 내지 7회의 독립된 실험들(각 실험은 3회씩 반복 실시)의 평균 ± SEM을 보여준다. *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001.

도 17은, αvβ6에 표적화된, 본 발명의 pCAR을 비롯한 CAR에 의한 IFN-γ의 생산을 보여주는 일련의 그래프이다. 지정된 CAR 및 pCAR을 발현하는 T 세포는 αvβ6-음성 종양 세포(Panc1 및 A375 puro) 또는 αvβ6-양성 종양 세포(Bxpc3 및 A375 puro β6)와 공동 배양되었다. 데이터는, 5회 내지 6회의 독립된 실험들(각 실험은 2회씩 반복 실시)의 평균 ± SEM을 보여준다. *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ns - 유의미하지 않음.

도 18은, 전술된 CAR 및 pCAR-조작 T 세포를 사용하는 재 자극 실험 결과들을 보여주는 것으로서, T 세포의 증식 및 αvβ6 인테그린을 발현하는 표적 세포(Bxpc3) 또는 발현하지 않는 표적 세포(Panc1)의 파괴가 수반된 반복되는 항원 자극이 가해지는 A20-28z/T1E-41BB pCAR T 세포의 능력을 나타내고 있다.

도 19는, A20-28z가 T1E-41BB, T1E-CD27 또는 T1E-CD40와 공동 발현되었던, pCAR 조작 T 세포가 사용되는 재 자극 실험의 결과들을 보여주는데, 본 실험을 통하여 TNF 수용체 과의 부가 일원에 의한 보조 자극의 비교 평가가 가능하다. 대조군 T 세포는 형질 도입되지 않았던 한편(NT), CAR은 절단형(tr) 엔도 도메인을 함유하였다. T 세포는 αvβ6 인테그린을 발현하는 표적 세포(Bxpc3) 또는 발현하지 않는 표적 세포(Panc1) 상에서 재 자극되었고, 이는 자극되지 않은 T 세포와 비교되었다. Bxpc3 세포의 경우, 지속적인 세포 독 활성을 동반한(도 19의 B) 매우 활발한 증식(도 19의 A)이 A20-28z/T1E-CD27 T 세포에서 관찰되었다. 이와는 대조적으로, Panc1 세포의 경우, 지속적인 세포 독 활성을 동반한(도 19의 B) 매우 활발한 증식(도 19의 A)이 A20-28z/T1E-CD27 T 세포에서 관찰되었다. 이 데이터는, TNF 수용체 과의 부가 일원들이 pCAR 포맷을 사용하여 보조 자극 또한 전달할 수 있음을 나타낸다.

실시예 1

호지킨 림프종, 악성 대 세포 림프종, 그리고 일부 고형 종양, 예컨대 삼중 음성 유방암에서 과 발현되는 (c-FMS에 의해 암호화되는) CSF-1 수용체에 대해 표적화된 CAR 패널을 마련하였으며, 이를 도 1에 개략적으로 도시하였다. CAR 패널은 표적화 부로서 2개의 자연 발생 리간드, 즉 CSF-1 또는 IL-34 중 어느 하나와 함께 제2 세대 CAR과 제3 세대 CAR을 둘 다 포함하였다. 비록 CSF-1 및 IL-34는 둘 다 CSF-1 수용체와 결합하지만, IL-34가 훨씬 더 높은(CSF-1의 경우보다 34배 더 높은) 친화도로 결합한다.

구조체 SFG C28ζ 및 SFG CTr을 SFG 레트로바이러스 벡터에 NcoI/XhoI 단편으로서 클로닝하여, 결실시킨 env 유전자가 먼저 점유하고 있던 자연 발생 NcoI 위치에 이것들의 개시 코돈이 존재하도록 보장하였다. 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(MoMLV) 장 말단 반복 부(LTR)(프로모터 활성 보유)로부터 유전자 발현을 달성하였으며, RNA의 바이러스 팩키징(virus packaging) 여부는, 스플라이싱(splicing) 공여체 및 수용체 위치가 측접하고 있는 MoMLV ψ 팩키징 신호에 의해 확인하였다.

또 다른 구조체 모두는 중합효소 불완전 프라이머 연장(Polymerase Incomplete Primer Extension; PIPE) 클로닝 방법이 사용되어 디자인 및 클로닝되었다. PIPE 클로닝 방법은 종래의 제한 효소 의존 클로닝 방법 및 결찰 의존 클로닝 방법에 대한 대안으로서, PCR을 기반으로 하는 방법이다. 이 방법은, 원치 않는 잔기들을 추가로 암호화하여 단백질을 발현할 수 있었던 통합 제한 위치들의 포함을 필요로 하지 않는다. PIPE 방법은 PCR 반응의 최종 주기 중 증식 과정의 비효율성, 즉 dNTP 가용성 감소로 말미암을 수 있는 비효율성 (비효율성은 돌출 5' 말단을 가지는, 부분 단일 가닥(PIPE) PCR 생성물을 생성시킴)을 바탕으로 한다. 벡터 특이적 프라이머 조는 PCR 벡터 선형화에, 그리고 5'벡터 말단 중첩 서열들을 가지는 다른 프라이머 조는 삽입 증식을 위해 사용하였으며, 이때 PIPE에 의해 불완전 연장 생성물을 생성하였다. 다음 단계에서, PIPE 생성물들을 혼합한 다음, 단일 가닥 중첩 서열들로 어닐링(annealing)시키고 나서, 완전 SFG CAR 구조체로 조립하였다. 진단 제한 분해에 의해 클로닝이 성공적으로 이루어졌음을 확인하였다. 모든 구조체를 대상으로 DNA 서열 결정을 수행하였는데, 이를 통하여 PCR 유도 돌연변이(Source Bioscience, UK)를 전혀 함유하지 않는, 예측 암호화 서열이 존재하였음을 확인하였다.

패널은, CSF-1 또는 IL-34가 28z 및 4-1BB와 결합하거나, 또는 이와 반대인, "이중 표적화된" 키메라 활성화 수용체(pCARS)를 2개 포함하였다. 이후, 토세아 아시그나(Thosea Asigna)(T)2A-함유 레트로바이러스 벡터를 사용하여 상기 이중 표적화 pCAR 조합을 동일 T 세포 군집 내에서 화학 양론적으로 공동 발현되도록 만들었다. 이러한 CAR들 중 하나를 'C34B'(CSF1-28z + IL34-41BB)로 명명하였고, 다른 하나를 '34CB'(IL34-28z + CSF1-41BB)로 명명하였다.

이 같은 이중 표적화 CAR T 세포에 있어서, 보조 자극 모티프 둘 다(CD28/ 4-1BB)를 이것들 자체의 자연상 위치, 즉 막에 인접한 위치에 배치하되, 서로 간에는 물리적으로 격리되도록 하여, 동일 T 세포 내에서 공동 발현되도록 만들었다.

벡터에서 추가의 T2A 요소를 사용하여 모든 CAR을 IL-4 반응성 4αβ 수용체와 공동 발현되도록 만들었다. 이는, IL-4를 이용하여 T 세포의 증량/증식을 가능하게 하였고, 그 결과 선정 후에 상기 다양한 세포 군집들의 기능을 더욱 용이하게 비교할 수 있게 되었다.

본 실험들이 주로 중점을 두는 것은, FMS/CSF-1 수용체 표적을 발현하거나 이것을 발현하지 않는 종양 표적 세포로 인한 반복 재 자극에 있어서 T 세포의 거동을 시험하는 것이다. 각각의 주기에 있어서, 지정된 IL-4 증식 CAR-T 세포 1백만개를 RPMI + 인간 AB 혈청 중에 현탁하고 나서, 항원 발현 표적(T47D FMS) 또는 항원 비 발현(null) 표적(T47D)의 합류 단일 층과 함께 (24웰 접시에서) 배양하였다.

그 다음, 만일 CAR T 세포들이 지속적으로 생존하면서 단일 층을 파괴하면, T 세포 1백만개를 제거하고, 동일한 방식으로 매주 재 자극하였다. 매주 주기마다 일어난 T 세포 증식에 따라서 각 시점에서의 총 세포 수를 추론하였다.

이 실험 모두를 통틀어서, 그 어떠한 외인성 시토킨도 존재하지 않는 조건 하(예컨대 IL-2 또는 IL-4 부재 하)에 T 세포들을 배양하여, T 세포들은 생존 및 증식을 위해 자신들의 시토킨을 스스로 생성해야 했다. 유효 보조 자극의 제2 마커를 제공하는, T 세포/종양 세포 공동 배양액으로부터 수집한 상청액을 대상으로 ELISA를 수행하여, 시토킨(IFN-γ 및 IL-2) 생성을 확인하였다.

표적(FMS 암호화 CSF-1 수용체)을 발현하는 종양 단일 층에 대한 T 세포의 1차 노출에서, 사멸 작용을 보일 것으로 예측되었던 CAR은 모두 예상대로였던 것이 확인(도 2)되었다(12회 실험으로부터 모아진 데이터 참조). 대조군은 UT(비 형질 도입), P4(관련 없는 항원인 PSMA 표적화), 그리고 CT4(엔도 도메인이 절단된 것)였다. 예상한 바대로, CAR T 세포는 그 어떤 것도 CSF-1 수용체가 발현되지 않는 종양 세포(T47D)를 사멸하지 않았다.

대표적인 재 자극 실험 결과들을 도 3에 보였다. 7개의 실험으로부터 모은 재 자극 데이터를 도 4에 보였다. 이 경우, 제1차 주기에서의 증식은 대부분의 구조체가 유사하였지만, IL-34 표적화 제2 세대 및 제3 세대 구조체는 이것들의 증식이 다른 것들보다 활발하지 못하였다. 이는 아마도 IL-34 표적화 부의 친화도가 지나치게 높았기 때문일 것이다.

그러나, 후반부 주기들에 있어서는 C34B 이중 pCAR 조합(IL-34 표적화 4-1BB 보조 자극 모티프와 공동 발현되는, CSF-1 표적화 28z 제2 세대 CAR)은 일관되게 명백히 월등한 것으로 발현되었다.

도 3에 보인 실험에 있어서, 각 재 자극 주기 이후 24시간 경과시에 상청액을 수집하여, ELISA로써 시토킨(IFN-γ 및 IL-2) 함량에 대해 분석하였다. MTT 검정을 통해 잔여 종양 세포의 생존율을 측정하였다(도 5에 대표적 예들을 도시함). 시토킨 생성 결과들을 도 6에 보였다. 각 자극 주기를 통틀어서 오로지 C34B CAR T 세포들만 이 IL-2를 생성하는 능력을 보유하였음이 확인되었다. 이 능력은, 제1차 주기 이후 다른 CAR 조합 모두에 의해서는 상실되었다. 반복된 재 자극을 통하여 IL-2를 생성하는 능력을 지속적으로 보유하게 되는 것은, CAR T 세포에서는 좀처럼 보이지 않았는데, 이는 이중 보조 자극 전달이 근본적으로 이와 같은 세포들의 분화를 시험관 내에서 변경하고, 아네르기의 발생을 지연시킨다는 것을 암시하는 것이다.

연 이은 Ag-자극 주기에서 단일 층 파괴 후 생 T 세포의 수도 또한 모니터링하였고, 그 결과들을 도 5에 보였다. 재 자극의 제2차 주기 후, C34B를 제외한 모든 CAR들은 CSF-1R 의존적 종양 세포 사멸을 달성하는 능력을 잃어버리기 시작하였다. 이와는 대조적으로, C34B를 발현하는 T 세포는, 재 자극 반복 주기 제13차까지는 본 세포 독성 검정에서 항원 의존적 효능을 보유하였지만, 비 변형 T47D 세포에 대해서는 세포 독성을 전혀 보이지 않았다.

또한, 이와 같은 T 세포상 소위 "소진 마커"들(PD1, TIM3, 2B4 및 LAG3)도 유동 혈구계측법으로 측정하였다. 그 결과들을 도 10 내지 도 13에 보였다. 예상한 바 대로, 재 자극된 T 세포에 있어서 다양한 소진 마커를 발현하는 T 세포의 백분율은 점진적으로 증가하였지만, 이는 항원 자극 시 C34B 세포의 증식, 종양 세포 파괴 또는 시토킨 방출을 지연시키지는 않았다. 이는, C34B의 월등한 기능은 소진 마커의 지연되는 상향조절의 결과가 아님을 암시한다.

요악하면, 본 발명의 pCAR 접근법은 세포를 하나의 상태로 유지함으로써, 이 세포가 더 많은 회차수의 재 자극을 통해 항원에 대한 반응성을 보유하도록 만드는 것으로 보인다. pCAR은, 제어 기억 상태를 지나쳐 분화를 지연시킬 수 있고, 세포가 활성화될 때 세포가 IL-2를 생성하는 능력을 보유하도록 하면서 아네르기 발생은 지연시키는 것으로 보인다는 증거가 있다.

실시예 2

생체 내 효과의 분석

CSF-1 수용체 표적이 낮은 수준으로 발현되고, 질병이 림프 소절 전반에 걸쳐 퍼져 있는, 매우 공격적인 생체 내 이종 이식 편 모델을 사용하여 실시예 1에서 사용된 CAR 패널을 대상으로 항 종양 활성에 대해 시험하였다(도 7). 반딧불이 루시퍼라아제로 종양 세포를 표지하여, 유발 가능 질병(disease burden)을 비 침습적으로 모니터링하였다.

SCID/베이지 마우스를 6개의 군으로 무선 할당하였으며(2회 독립 실험을 통틀어 군당 9마리 동물), PBS 200 μL 중에 재 현탁한 2 x 10⁶개의 K299 종양 세포를 정맥 내(IV) 접종하였다. 제5일에, 군들을 이하 지정된 처리 계획들 중 어느 하나로 처리하였다:

● C4B 군: 20 x 10⁶개 C4B T 세포 IV

● C34B 군: 20 x 10⁶ C34B T 세포 IV

● 43428Bz: 20 x 10⁶ 43428Bz T 세포 IV

● 34CB 군: 20 x 10⁶ 34CB T 세포 IV

● UT(비 형질 도입) 군: 20 x 10⁶개의 비 형질 도입 T 세포 IV

● NT(미처리) 군: PBS 200 μL IV

본 연구 지속 기간 중 적절한 시점에서 생물발광 영상화(BLI)를 통하여 종양 성장을 모니터링하였다.

그 결과들을 도 8에 보였다. 여기서, 더 낮은 평균 BLI 발광도를 보이고(도 8의 A 및 B), 종양 진행이 지연되거나 종양 퇴행이 일어나, 마우스 생존 기간을 연장시킨 것으로 보아(도 8의 C), 기능을 가장 잘 수행하는 시스템은 pCAR, C34B의 시스템이었다.

실험 전반에 걸쳐 동물의 중량을 측정하였으며, 이때 유의미한 독성은 확인되지 않았다(도 9).

실시예 3

αvβ6 의존적 방식으로 T 세포 활성화를 유도하는 pCAR을 조작하기 위한, 표적화 부의 선정

단독으로 또는 확장된 ErbB 과와 함께 αvβ6 인테그린을 표적화하는 CAR 패널을 마련한 것을 도 14에 개략적으로 보였다. 이 경우에 사용된 결합 요소는 구제역 바이러스(혈청형 01 BFS)로부터 유래하는 외피 단백질 VP1의 GH-루프로부터 유래하는 A20 펩티드(서열 번호 11)였다(미국 특허 제8,927,501호). 이를 CD124 신호 펩티드의 하류에 배치하여, CD28 및 CD3ζ 엔도 도메인과 융합되게 함으로써, A20-28ζ, 즉 제2 세대 CAR을 만들었다. 유사하되, 핵심 RGDL 모티프가 AAAA로 치환되어, 표적화 펩티드(CD20이라 칭함)가 뒤섞인 구조체를 포함하는 대조군(C20-28ζ)을 제조하였다. 제2 대조군은 CD28 절단형 엔도 도메인에 융합된 A20(A20-Tr)을 포함하였다.

본 발명의 pCAR(TIE-41BB/A20-28z라 칭함)을 제조하기 위해, 막을 관통하여 CD8α와, 그리고 41BB 엔도 도메인과 융합된 pan-ErbB 표적화 펩티드(T1E)를 포함하는 키메라 보조 자극 수용체와 함께 A20-28z가 공동 발현되도록 만들었다.

지정된 경우, CAR을 4αβ 키메라 시토킨 수용체와 되도록 만들어, IL-4 매개 증량이 시험관 내에서 이루어지도록 만들었다. 토세아 아시그나(T) 2A 리보좀 스킵 펩티드(ribosomal skip peptide)를 사용하여, IL-4 수용체 α 엑토 도메인이 막을 관통하여 공유 IL-2/15 수용체 β의 엔도 도메인과 융합되어 있는IL-4 반응성 4αβ 키메라 시토킨 수용체의 동 몰 공동 발현을 달성하였다. 이러한 키메라 분자를 레트로바이러스 유전자 도입에 의해 인간 T 세포 내에서 발현시켰다.

유동 혈구계측법을 사용하여 암 세포 주 A375의 인테그린 발현 패턴을 평가하였으며(도 15), 이 암 세포주를 αvβ6-음성 종양 세포(Panc1 및 A375 puro) 또는 αvβ6-양성 종양 세포(Bxpc3 및 A375 puro β6)로 구분하였다. 이 세포를, 24 시간, 28 시간 또는 72 시간 중 어느 하나의 시간 동안 효과기:표적의 비 1:1로 CAR T 세포와 공동 배양하였으며, 이후에는 MTT 검정을 통해 세포 독성을 평가하고, 그 결과를 미처리 종양 세포의 경우에 비해 나타냈다. 결과들을 도 16에 보였다.

이 데이터는, A20-28z CAR T 세포는 αvβ6 인테그린을 발현하는 모든 표적 세포(Bxpc3 및 A375 β6 puro)를 사멸하지만, 이 인테그린을 발현하지 않는 표적(Panc1 및 A375 puro)은 사멸하지 않음을 보여준다. 두 번째로, 대조군 CAR C20-28z 및 A20-Tr은 이 검정에서 비활성이었다. 세 번째로, T1E-41BB/A20-28z pCAR을 발현하는 T 세포는, αvβ6 인테그린을 발현하는 표적 세포(Bxpc3 및 A375 β6 puro)를 효율적으로 사멸시켰다. 이 결과들은 모두 예상한 바 대로였다. 그러나 주목할 점은, T1E-41BB/A20-28z pCAR을 발현하는 T 세포도 또한 αvβ6을 발현하지 않는 표적 세포(Panc1 및 A375 puro)를 사멸하였다는 점이다. 이는, pCAR 입체배열 내에서 A20 펩티드가 비 αvβ6 인테그린과 낮은 친화도로 결합하는 능력이, 이와 같이 조작된 T 세포의 활성화를 촉발하는 데 충분하다는 것을 보여준다.

그 다음, pCAR과 조작된 대조군 T 세포에 의한 IFN-γ 생성을 평가하였다. αvβ6를 발현하지 않는 종양 세포(Panc1 및 A375 puro) 또는 αvβ6 발현하는 종양 세포(Bxpc3 및 A375 puro β6)를, 유전자 조작된 T 세포와 효과기:표적의 비 1:1로 공동 배양하고 나서, 24 시간, 48 시간 또는 72 시간 경과 후 상청액을 수집하였다. IFN-γ의 수준을 ELISA(eBioscience)에 의해 정량하였다. 결과들을 도 17에 보였다. 예상한 바 대로, 대조군은 유의적 양만큼의 IFN-γ를 생성하지 않았던 반면에, A20-28z CAR T 세포는 αvβ6-양성 종양 세포(Bxpc3 및 A375 puro β6)와 함께 배양되었을 때 IFN-γ를 방출하였다. 주목할 점은, 본 발명의 pCAR을 발현하는 T 세포, 즉 TIE-41BB/A20z는, αvβ6-양성 종양 세포(Bxpc3)와 함께 배양되었을 때 A20-28z T 세포보다 더 많은 양의 IFN-γ를 생성하였다는 점이다. 뿐만 아니라, TIE-41BB/A20z+ T 세포는 αvβ6-음성 종양 세포(Panc1 및 A375 puro)와 함께 배양되었을 때 IFN-γ를 생성하였다. 다시 말해서, 이는, pCAR 입체배열 내에서 A20 펩티드가 비 αvβ6 인테그린과 낮은 친화도로 결합하는 것은, 이와 같이 조작된 T 세포들의 활성화를 촉발하기 충분하다는 것을 말해준다.

그 다음, IL-2 지원 없이 CAR T 세포 군집을 Panc1 종양 세포(αvβ6 음성) 또는 Bxpc3 종양 세포(αvβ6 양성)로 2주마다 재 자극하였다. 췌장 담관 선암종(PDAC) 환자로부터 유래하는 CAR T 세포와 종양 세포를 효과기:표적의 비 1:1로 공동 배양하였다(도 18). 처음에 T 세포를 웰 당 2 x 10⁵개 세포만큼 첨가한 후, 공동 배양한지 72시간 경과하였을 때 계수하여 증식 여부를 평가하였다(맨 위의 패널). T 세포 첨가 72시간 후 세포 독성을 MTT 검정에 의해 평가하였다(아래의 패널). 만일 충분한 수(2 x 10⁵ 개)의 T 세포가 존재한다면, T 세포를 새로운 종양 단일 층 상에서 재 자극하였고, 이 경우 72시간 경과 후 상기 과정을 반복하였다.

결과들을 도 18에 보였다. 이 결과들은, A20-28z/T1E-41BB⁺ T 세포가 IL-2 방출과 αvβ6⁺ Bxpc3 세포의 파괴를 동반하는(데이터는 보이지 않음) 증식의 단계를 다수 회 진행한다는 것을 보여준다. 다시 말해서, A20-28z/T1E-41BB⁺ T 세포는 또한 IL-2 방출과 Panc1 종양 세포의 파괴를 동반하는 증식의 단계를 다수 회 진행하였다.

전반적으로, 결과들은 A20-28z/T1E-41BB를 포함하는 pCAR이, αvβ6에 대해 표적화하는 제2 세대 CAR 보다 향상된 시험관 내 기능을 보임을 명백히 보여주었다. 더욱이, A20-28z/T1E-41BB⁺ T 세포는 또한 상기 인테그린을 확인 불가능한 수준으로 최소한 발현하는 Panc1 또는 A375 puro 세포에 의한 활성화를 진행하였다. C34B pCAR이 사용되어 얻어진 발견들(실시예 1 및 2)을 고려하였을 때, 이는, 41BB CCR과의 고 친화도 결합 상호작용이 일어나고, 제2 세대 28z CAR과의 저 친화도 상호작용이 일어날 때, 일련의 재 자극이 진행됨에 따라서 pCAR 입체배열이 T 세포 활성화를 일어나게 만들 수 있음을 말해준다.

실시예 4

기능성 pCAR 조작을 위한 대안적 TNF 수용체 과 일원인 CD27의 용도

출발 재료로서 A20-28z/T1E-41BB pCAR을 사용하여, 41BB 모듈이 TNF 수용체 과의 대안적 일원, 즉 CD27 또는 CD40으로 치환된 추가의 pCAR을 조작하였다. 엔도 도메인이 절단되도록(tr) 대조군 pCAR을 조작하였다. αvβ6를 발현하는 표적 세포(Bxpc3) 또는 αvβ6를 발현하지 않는 표적 세포(Panc1)를, 웰당 5 x 10⁴개 세포의 밀도로 24 웰 평판에 도말하였다. 24시간 경과 후 5 x 10⁴개 pCAR T 세포를, 외인성 시토킨의 지원이 없는 조건 하에 표적 세포 또는 빈 웰("비 형질 도입 세포 웰")에 첨가하였다. 72시간 경과한 후, 웰들로부터 T 세포를 수집하여 계수하였다(도 19의 A). MTT 검정을 수행함으로써 잔여 표적 세포들의 생존%를 측정하여, T 세포가 첨가되지 않고 도말된 대조군 표적 세포의 생존%와의 비교를 실시하였다(도 19의 B). 만일 각각의 자극 주기 후 T 세포가 증식되면, 전술된 바와 정확히 동일하게 상기 T 세포를 새로운 표적 세포로 재 자극하였다. 이전과 같이 72시간 경과한 후 CAR T 세포 증식(도 19의 A) 및 MTT 검정(도 19의 B)을 수행하였다. 매 72시간 주기마다 주기 중 T 세포가 더 이상 증식하지 않을 때까지, pCAR T 세포의 반복적 재 자극과, 표적 세포 사멸 여부에 관한 평가를 상기와 같은 방식으로 계속 진행하였다.

이 데이터는, 지속적인 T 세포 증식과 종양 세포 사멸에 의해 알 수 있는 바와 같이, T 세포가 Panc1 표적 세포에 의해 자극될 때 A20-28z/T1E-41BB pCAR의 월등한 기능을 다시 한번 확인시켜주었다. 이는, A20 펩티드와 비αvβ6 인테그린의 저 친화도 결합은 이와 같이 조작된 T 세포들의 활성화를 촉발하기에 충분하다는 추가의 확신을 주었다. 그러나 주목할 점은, A20-28z/T1E-CD27 pCAR은, αvβ6 발현 Bxpc3 세포로 재 자극될 때 최고의 증식 수준(도 19의 A) 및 지속적인 종양 세포 사멸(도 19의 B)을 달성하였다는 점이다. 이와는 대조적으로, 본 검정에서 CD40 기반 pCAR은 중간 정도 수준의 기능을 보였다. 아울러, 이 데이터는, 월등한 기능을 보이는 pCAR을 조작하는 데 다수의 TNF 수용체 과 일원들(예컨대 CD27 또는 41BB)이 사용될 수 있음을 보여준다.

SEQUENCE LISTING <110> King's College London <120> Therapeutic Agents <130> P3052/WO <150> GB1513540.3 <151> 2015-07-31 <160> 11 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 3 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val 1 5 10 15 Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr 20 25 30 Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser 35 40 45 Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu 50 55 60 Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser 65 70 75 80 Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr 85 90 95 Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys 100 105 110 Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 115 120 125 Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 130 135 140 Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly 145 150 155 160 Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile 165 170 175 Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met 180 185 190 Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro 195 200 205 Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 210 215 220 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn 1 5 10 15 Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu 20 25 30 Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly 35 40 45 Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe 50 55 60 Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn 65 70 75 80 Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr 85 90 95 Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 100 105 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tag <400> 5 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 6 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> costimulatory signalling region <400> 6 Ile Glu Val Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Asp Asn 1 5 10 15 Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys 20 25 30 Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val 35 40 45 Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala 50 55 60 Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser 65 70 75 80 Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His 85 90 95 Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 100 105 110 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> SITE <222> 5,6 <223> Xaa is any amino acid residue <400> 7 Arg Gly Asp Leu Xaa Xaa Leu 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> SITE <222> 5,6 <223> Xaa is any residue <400> 8 Arg Gly Asp Leu Xaa Xaa Ile 1 5 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 9 Tyr Thr Ala Ser Ala Arg Gly Asp Leu Ala His Leu Thr Thr Thr His 1 5 10 15 Ala Arg His Leu 20 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 10 Gly Phe Thr Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met 1 5 10 15 Asn Arg Pro Phe 20 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 11 Asn Ala Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys 1 5 10 15 Val Ala Arg Thr 20

Claims

(i) (a) 신호전달 영역;
(b) 보조 자극 신호전달 영역;
(c) 경막 도메인; 및
(d) 표적 항원상 제1 에피토프와 특이적으로 상호작용하는 결합 요소
를 포함하는 제2 세대 키메라 항원 수용체 (CAR)와;
(ii) (e) (b)의 보조 자극 신호전달 영역과 상이한 보조 자극 신호전달 영역;
(f) 경막 도메인; 및
(g) 표적 항원상 제2 에피토프와 특이적으로 상호작용하는 결합 요소
를 포함하는 키메라 보조 자극 수용체 (CCR)
를 발현하는, T 세포 또는 자연 살해(NK) 세포에서 선택된 면역 반응성 세포.
제1항에 있어서, T 세포인 면역 반응성 세포.
제1항 또는 제2항에 있어서, (b)와 (e)에 대한 보조 자극 신호전달 영역들은 CD28, CD27, ICOS, 4-1BB, 0X40, CD30, GITR, HVEM, DR3 또는 CD40으로부터 선택되는 면역 반응성 세포.
제3항에 있어서, (b) 또는 (e) 중 하나는 CD28이고, 다른 하나는 4-1BB 또는 OX40인 면역 반응성 세포.
제3항에 있어서, (b)는 CD28 이고 (e)는 4-1BB 또는 CD27인 면역 반응성 세포.
제1항에 있어서, (c) 및 (f)의 경막 도메인은 CD8α 및 CD28 경막 도메인으로부터 선택되는 면역 반응성 세포.
제1항에 있어서, 제1 및 제2 에피토프는 동일한 수용체 또는 항원과 결합하는 면역 반응성 세포.
제1항에 있어서, 키메라 시토킨 수용체를 공동 발현하는 면역 반응성 세포.
제8항에 있어서, 키메라 시토킨 수용체는 4αβ인 면역 반응성 세포.
제1항에 있어서, 결합 요소 (d) 또는 결합 요소 (g) 중 적어도 하나는 ErbB 이량체에 대한 리간드, 콜로니 자극 인자-1 수용체(CSF-1R) 또는 α_vβ₆ 인테그린 특이 결합제인 면역 반응성 세포.
제1항에 있어서, 결합 요소 (d)는 CSF-1을 포함하고, 결합 요소 (g)는 IL-34를 포함하는 면역 반응성 세포.
제1항에 있어서, 결합 요소 (d)는 서열 모티프
또는
[다만 여기서 LX⁵X⁶L 또는 LX⁵X⁶I는 알파 나선 구조 내에 포함되어 있고, X⁵ 및 X⁶는 나선체 촉진 잔기들임]를 포함하는 펩티드인 α_vβ₆ 인테그린 특이 결합제이고; 결합 요소 (g)는 T1E 펩티드이고,
상기 T1E 펩티드는, 전체 성숙 인간 EGF 단백질로 이루어진 키메라 융합 단백질이지만, 상기 EGF 단백질의 N-말단과 가장 가까운 아미노산 5개가 성숙 인간 TGF-α 동형 1 단백질(TGF-α isoform 1 protein)의 N-말단과 가장 가까운 아미노산 7개에 의해 치환된, 면역 반응성 세포.
제1항에 있어서, 결합 요소 (d)의 결합 친화도는 결합 요소 (g)의 결합 친화도보다 낮은 면역 반응성 세포.
제1항에 따른 면역 반응성 세포를 제조하는 방법으로서, 제1항에 정의된 바와 같은 구조 (i)의 CAR을 암호화하는 제1 핵산; 그리고 제1항에 정의된 바와 같은 구조 (ii)의 CCR을 암호화하는 제2 핵산을 단리된 세포에 형질 도입하는 단계를 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 면역 반응성 세포는 키메라 시토킨 수용체를 포함하고, 증식 단계는 시토킨이 존재할 때 진행되는 방법.
제1항에 정의된 바와 같은 (i)의 CAR을 암호화하는 제1 핵산과, 제1항에 정의된 바와 같은 (ii)의 CCR을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 벡터.
제1항에 정의된 바와 같은 (i)의 CAR을 암호화하는 제1 핵산과, 제1항에 정의된 바와 같은 (ii)의 CCR을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 키트.
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