JP2022522786A - 構成的に活性なキメラサイトカイン受容体 - Google Patents

Abstract

構成的に活性なキメラサイトカイン受容体（ＣＡＣＣＲ）が本明細書で提供される。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を担持する免疫細胞上に存在する場合、そのようなＣＡＣＣＲは、免疫細胞の活性化、増殖、持続性、および／または効力の増加を可能にする。本明細書に記載のＣＡＣＣＲを作製および使用する方法も提供される。【選択図】図３Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月１日に出願された米国仮出願第６２／８１２，９１１号、および２０２０年２月２４日に出願された米国仮出願第６２／９８０，８２３号に対する優先権の権益を主張するものであり、これら両方の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、配列表を含む。２０２０年２月２１日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、ＡＴ－０２３＿０３ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、２５１，６５２バイトのサイズである。

悪性腫瘍関連抗原を認識するように遺伝子改変された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の養子移入は、がん治療への新しいアプローチとして有望であることが示されている。Ｔ細胞は、抗原認識部分とＴ細胞活性化ドメインで構成される融合タンパク質であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変することができる。

Ｔ細胞の増殖、細胞毒性の効力、および持続性は、シグナル伝達経路によって促進される。従来のＣＡＲ設計は、ＣＤ３ｚｅｔａ活性化（シグナル１）と共刺激（シグナル２、例えば４－１ＢＢ、ＯＸ４０、および／またはＣＤ２８発現）の２つのシグナルを提供する。いくつかの状況では、第３のシグナル（シグナル３）である、サイトカイン誘導性サイトカイン受容体シグナル伝達（例えば、免疫増強のためのサイトカインサポート）が望ましくあり得る。しかしながら、シグナル３を提供するアプローチには、重大な制限がある。

サイトカインサポートを提供するための１つのアプローチは、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を組換えサイトカイン（複数）／サイトカイン模倣体の全身注入と組み合わせること、およびサイトカインを細胞外に分泌／発現するようにＣＡＲ－Ｔ細胞を操作することを含む。サイトカインには多面的な効果があり、他の細胞タイプの機能にも影響を与え得るため、ＣＡＲ－Ｔ細胞による免疫増強サイトカインの全身投与または産生には少なくとも２つの大きな欠点がある：（ｉ）これらのアプローチはヒトに全身毒性を引き起こす可能性がある、および（ｉｉ）同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の文脈では、これらのアプローチは、同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞の拒絶反応を加速し、それによって治療効果を損なう可能性のあるバイスタンダー宿主免疫活性化を引き起こす可能性がある。サイトカインサポートを提供する別のアプローチは、構成的に活性化された二量体化サイトカイン受容体、ＩＬ－７Ｒａの導入に基づく－これは、シグナル伝達出力の性質（ＩＬ－７シグナル伝達のみ）と規模を制限する。サイトカインサポートを提供するためのさらに別のアプローチは、シグナル３をＣＡＲ分子に直接組み込むことを含んだ（Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１８ Ｍａｒ；２４（３）：３５２－３５９）。このアプローチの制限は、シグナル３の強度がＣＡＲ活性化の強度に依存することである。標的（およびＣＡＲの活性化）がない場合、シグナル３は伝達されない。

サイトカインシグナルを調整可能な方法でＣＡＲ－Ｔ細胞に特異的に標的化することによりこれらの欠点を回避し、安全性プロファイルと治療効果を改善するための解決策が必要である。この必要性に対処する組成物および方法が本明細書で提供される。

本開示は、構成的に活性なキメラサイトカイン受容体（ＣＡＣＣＲ）を提供する。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を担持する免疫細胞（ＣＡＲ－Ｉ細胞、例えばＣＡＲ－Ｔ細胞）上に存在する場合、そのようなＣＡＣＣＲは、免疫細胞の活性化、増殖、持続性、および／または効力の増加を可能にする。本明細書に記載のＣＡＣＣＲを作製および使用する方法も提供される。

したがって、一態様では、２つのモノマーから構成されるＣＡＣＣＲであって、各モノマーは、（ａ）膜貫通ドメイン、（ｂ）ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）結合ドメイン、および（ｃ）動員ドメインを含み、モノマーは構成的に二量体化されている、ＣＡＣＣＲが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、細胞外ドメインリガンド結合ドメインを含まない。

いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫ結合ドメインは、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体に由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫ結合ドメインは、配列番号６の天然に存在するＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２に由来する。いくつかの実施形態では、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体は、Ｈ４９９Ｌ、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ、およびＧ５０９Ｎから選択されるアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体は、Ｈ４９９Ｌ、Ｓ５０５Ｎ、およびＷ５１５Ｋ置換、またはＳ５０５ＮおよびＷ５１５Ｋ置換を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＳＴＡＴ動員ドメインである。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメイン、例えば、ＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメイン、例えば、ＩＬ２Ｒｂ（３３３～５５１）、ＩＬ２Ｒｂ（３９３～４３３、５１８～５５１）、ＩＬ２Ｒｂ（３３９～３７９、３９３～４３３、５１８～５５１）、ＩＬ２Ｒｂ（３３３～５５１、Ｙ３８１Ｓ、Ｙ３８４Ｓ、Ｙ３８７Ｓ）、ＩＬ２Ｒｂ（３３３～５５１、Ｙ３６４Ｓ、Ｙ３８１Ｓ、Ｙ３８４Ｓ、Ｙ３８７Ｓ）を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ１２Ｒｂ１由来のＳＴＡＴ動員ドメイン、例えば、ＩＬ１２Ｒｂ１（６２２～６６２）を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ１２Ｒｂ２からのＳＴＡＴ動員ドメイン、例えば、ＩＬ１２Ｒｂ２（７１４～８６２）またはＩＬ１２Ｒｂ２（７７５～８２５）を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメイン、例えば、ＩＬ２１Ｒ（３２２～５３８）を含む。

本明細書で提供される関連する態様は、本開示のＣＡＣＣＲのいずれか１つをコードするポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらにコードし、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｆｌｔ－３、ＷＴ－１、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、ＬｅＹ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、ＣＤ４４ｖ６、ＲＯＲ１、ＣＤ１９、クローディン１８．２（クローディン１８Ａ２、またはクローディン１８アイソフォーム２）、ＤＬＬ３（デルタ様タンパク質３、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａデルタホモログ３、Ｄｅｌｔａ３）、Ｍｕｃ１７（ムチン１７、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ３）、ＦＡＰアルファ（線維芽細胞活性化タンパク質アルファ）、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合遺伝子座タンパク質Ｇ６ｄ、ｃ６ｏｒｆ２３、Ｇ６Ｄ、ＭＥＧＴ１、ＮＧ２５）、および／またはＲＮＦ４３（Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ４３、ＲＩＮＧフィンガータンパク質４３）に結合する。

別の態様では、本開示の少なくとも１つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と少なくとも１つのＣＡＣＣＲとを含む操作された免疫細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、同種異系免疫細胞である。他の実施形態では、免疫細胞は自己免疫細胞である。免疫細胞は、Ｔ細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、および幹細胞に由来する免疫細胞からなる群から選択され得る。関連する態様では、本開示の操作された免疫細胞のいずれかを含む医薬組成物、およびそのような医薬組成物を含むキットが本明細書で提供される。

別の態様では、治療有効量の本明細書に記載の操作された免疫細胞のうちのいずれかを対象に投与することを含む、対象のがんを治療する方法が本明細書で提供される。

本開示の操作されたＣＡＣＣＲの概略図を示す。 本開示のＣＡＣＣＲとＣＡＲを共発現させるために使用できる本開示のベクターの概略図を示す。１つ以上のサイトテールをタンデムに結合して、１つ以上のサイトカインからのシグナル伝達を模倣することができる。対照ＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）ＣＡＲを発現するベクターの概略図も示される。 サイトカイン受容体シグナル伝達を構成的に活性化するＴｐｏＲ膜貫通（ＴＭ）変異体の同定を示す。 構成的に活性なキメラサイトカイン受容体を共発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大の結果を示す。 異なるＩＬ－２条件下でのＣＡＲ－Ｔ細胞産物における分化とメモリーＴ細胞サブセットの分布を示す。 各ＴｐｏＲ ＴＭバリアントによって媒介される構成的サイトカインシグナル伝達の程度を示す。 ＴｐｏＲ ＴＭ変異体の細胞傷害活性を示しており、構成的サイトカイン受容体シグナル伝達がＣＡＲ－Ｔ細胞の効力を増強することを示している。 ＴｐｏＲ ＴＭ変異体の細胞毒性活性と耐久性を示す。 増殖因子非依存性アッセイにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞の経時的な濃縮を示す。 増殖因子非依存性アッセイにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞の経時的な拡大倍率を示す。 増殖因子非依存性アッセイにおける、ＣＡＲ＋Ｔ細胞間のメモリーＴ細胞サブセットの経時的な分布を示す。 示されたＣＡＣＣＲを共発現するＣＡＲ－Ｔ細胞によるＳＴＡＴシグナル伝達経路の活性化を示す。 全長または短縮型サイトテールを発現するＨＥＫ２９３ Ｔ細胞におけるレポーターアッセイで示されるＣＡＣＣＲシグナル伝達強度の最適化を示す。 全長または短縮型サイトテールを発現するＨＥＫ２９３ Ｔ細胞におけるレポーターアッセイで示されるＣＡＣＣＲシグナル伝達強度の最適化を示す。 全長または短縮型サイトテールを共発現する初代ＣＡＲ－Ｔ細胞で示されるＣＡＣＣＲシグナル伝達強度の最適化を示す。 短縮型ＩＬ２Ｒｂサイトテールを担持するＣＡＣＣＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＩＬ－２ではなくＩＬ－１５のシグナル伝達をより厳密に模倣することを示す。 タンデムに融合した異なるサイトテールのコンビナトリアルシグナル出力を示す。 ＣＡＲ－Ｔ細胞のメモリー分化に対するＣＡＣＣＲの効果を示す。 増殖因子非依存性条件下でのＣＡＲ－Ｔ細胞の生存およびメモリー分化に対するＣＡＣＣＲの影響を示す。 様々なＣＡＣＣＲを共発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害活性を示す。 ＣＡＣＣＲが、液性腫瘍標的ＢＣＭＡに向けられたＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害活性を改善したことを示す。 ＣＡＣＣＲが同所性多発性骨髄腫に対するインビボ抗腫瘍活性およびＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性を改善したことを示す。 ＣＡＣＣＲが確立された固形腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を改善したことを示す。

本開示は、構成的に活性なキメラサイトカイン受容体（ＣＡＣＣＲ）を提供する。構成的に活性で調整可能なキメラサイトカイン受容体の存在は、シグナル３の免疫増強が免疫増強の必要性を満たすことを可能にする。したがって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を担持する免疫細胞（ＣＡＲ－Ｉ細胞、例えばＣＡＲ－Ｔ細胞）上に存在する場合、そのようなＣＡＣＣＲは、免疫細胞の活性化、増殖、持続性、および／または効力の増加を可能にする。本明細書に記載のＣＡＣＣＲを作製および使用する方法も本明細書で提供される。

本開示のＣＡＣＣＲは調整可能であり、ＣＡＲ－Ｔ細胞活性、持続性などの増強のための柔軟なサイトカインシグナル伝達出力を有する。コンポーネント、作成方法、および使用方法を以下に順番に説明する。

Ｉ．構成的に活性なキメラサイトカイン受容体（ＣＡＣＣＲ）
本開示のＣＡＣＣＲは、２つのモノマーから構成され、各モノマーは、（ａ）膜貫通ドメイン、（ｂ）ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）結合ドメイン、および（ｃ）動員ドメインを含み、モノマーは構成的に二量体化されている。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲは、細胞外リガンド結合ドメインを含まない。

いくつかの実施形態では、モノマーは同一であり、構成的に活性なホモダイマーを生じさせる。そのような実施形態では、ベクターで発現される必要があるタンパク質の数が減少する。いくつかの実施形態では、モノマーは同一ではなく、構成的に活性なヘテロダイマーを生じさせ、これは特定の状況下で望ましくあり得る。

本開示のＣＡＣＣＲのモノマーは、自発的に二量体化することができ、外因性刺激またはリガンドの非存在下でシグナル伝達を活性化することができる（リガンド非依存性二量体化）。活性のレベルは、ＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインに導入された変異によって制御することができる。当業者は、ＣＡＣＣＲのモノマーが１００％の時間において二量体化されておらず、モノマーとして存在し得ることを理解するであろう。

Ａ．膜貫通ドメイン
本開示のＣＡＣＣＲは、膜貫通ドメインを含む。本開示の膜貫通ドメインは、それらがモノマー対との構成的二量体化を可能にし、したがって細胞内部分での構成的ＪＡＫ活性化、ならびに例えば受容体の細胞質領域でのＳＴＡＴの構成的動員およびリン酸化を可能にするような配列を含む。

膜貫通ドメインはＮ末端にあり、Ｃ末端の細胞内／細胞質ドメインに結合している。いくつかの実施形態では、結合は、任意選択でリンカーを介して達成される。

本明細書で使用される場合、膜貫通ドメインは、それが発現される細胞の膜に挿入することができる。いくつかの実施形態では、本開示の膜貫通ドメインは、細胞膜にまたがり、細胞外部分、および／または細胞内部分を含む。

いくつかの実施形態では、本開示の膜貫通ドメインは操作されており（合成であり）、天然に存在する膜貫通ドメインのいずれにも類似しておらず、例えば、それらは天然に存在していない。

他の実施形態では、本開示の膜貫通ドメインは、天然に存在する受容体に由来する。

いくつかの実施形態では、本開示の膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫ活性化ドメインは、例えば、以下の受容体のうちの１つ以上に由来する：エリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）、インターロイキン６シグナルトランスデューサー（ＧＰ１３０またはＩＬ６ＳＴ）、プロラクチン受容体（ＰｒｌＲ）、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）、顆粒球コロニー刺激因子受容体（ＧＣＳＦＲ）、およびトロンボポエチン受容体／骨髄増殖性白血病タンパク質受容体（ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ）。天然に存在する受容体に由来する場合、受容体全体、または受容体の膜貫通配列全体は、細胞内部分で構成的活性化および構成的ＪＡＫ結合／活性化を達成するために必ずしも必要ではない可能性がある。したがって、天然に存在する受容体の断片を利用することができる。さらに、特定の変異は、下流のシグナル伝達をさらに調整するために、天然に存在する受容体に由来する膜貫通ドメインに導入されてもよい。

いくつかの実施形態では、本開示の膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫ活性化ドメインは、天然に存在するＥｐｏＲ受容体に由来する。

いくつかの実施形態では、本開示の膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫ活性化ドメインは、天然に存在するＧＰ１３０受容体に由来する。

いくつかの実施形態では、本開示の膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫ活性化ドメインは、天然に存在するＰｒｌＲ受容体に由来する。

いくつかの実施形態では、本開示の膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫ活性化ドメインは、天然に存在するＧＨＲ受容体に由来する。

いくつかの実施形態では、本開示の膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫ活性化ドメインは、天然に存在するＧＣＳＦ受容体に由来する。

いくつかの実施形態では、本開示の膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫ活性化ドメインは、天然に存在するＴＰＯＲ受容体に由来する。

表１ａは、膜貫通タンパク質が由来する、本開示に提供される天然に存在する受容体の例示的な全長配列を提示する。表１ａに提供される配列は、例えば、表１ｂおよび１ｃにおいてどのより後期の突然変異が発現されるかに関する、参照配列である。

いくつかの実施形態では、本開示の膜貫通ドメインは、表１ａに示される天然に存在するＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ（骨髄増殖性白血病タンパク質）受容体の短縮バージョンに由来する。

いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインは、表１ａのＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２を含む。

表１ｂは、本開示の例示的な膜貫通ドメインアミノ酸配列を提供し、膜貫通ドメインは、天然に存在するＴＰＯＲ受容体に由来する。

いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインは、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、および少なくともＨ４９９でのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインは、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、およびアミノ酸置換Ｈ４９９Ｌを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインは、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、および少なくともＳ５０５でのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインは、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、およびアミノ酸置換Ｓ５０５Ｎを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインは、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、および少なくともＧ５０９でのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインは、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、およびアミノ酸置換Ｇ５０９Ｎを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインは、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、および少なくともＷ５１５でのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインは、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、およびアミノ酸置換Ｗ５１５Ｋを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインは、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、ならびにＨ４９９およびＳ５０５でのアミノ酸置換を含む（表１ｂに提供される配列）。

いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインは、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、ならびにＨ４９９およびＷ５１５でのアミノ酸置換を含む（表１ｂに提供される配列）。

いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインは、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、ならびにＨ４９９、Ｓ５０５、およびＷ５１５でのアミノ酸置換を含む（表１ｂに提供される配列）。

いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインは、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、ならびにＳ５０５およびＷ５１５におけるアミノ酸置換を含む（表１ｂに提供される配列）。

いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインは、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、ならびにＨ４９９およびＧ５０９でのアミノ酸置換を含む（表１ｂに提供される配列）。

いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインは、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、ならびにアミノ酸置換Ｈ４９９ＬおよびＳ５０５Ｎを含む（表１ｂに提供される配列）。

いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインは、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、ならびにアミノ酸置換Ｈ４９９ＬおよびＷ５１５Ｋを含む（表１ｂに提供される配列）。

いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインは、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、ならびにアミノ酸置換Ｈ４９９ＬおよびＧ５０９Ｎを含む（表１ｂに提供される配列）。

いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインは、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、ならびにアミノ酸置換Ｓ５０５ＮおよびＷ５１５Ｋを含む（表１ｂに提供される配列）。

いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインは、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、ならびにアミノ酸置換Ｈ４９９Ｌ、Ｓ５０５Ｎ、およびＷ５１５Ｋを含む（表１ｂに提供される配列）。

いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインは、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、ならびにＨ４９９およびＳ５０５でのアミノ酸置換を含む（表１ｂに提供される配列）。

本開示のＣＡＣＣＲは、ＣＡＲ担持免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）において必要とされ、特定の状況または条件において望まれるシグナル３／免疫増強のレベルを達成するために調整可能である。

いくつかの実施形態では、低レベルのＳＴＡＴ５活性化は、ＣＡＲ担持免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）において望ましい。例として、そのような実施形態では、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、およびアミノ酸置換Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ、またはＨ４９９Ｌ／Ｇ５０９Ｎを含むＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインを導入することができる。

いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ５活性化のレベルの増加は、ＣＡＲ担持免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）において望まれる。例として、そのような実施形態では、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、ならびにアミノ酸置換Ｈ４９９Ｌ、Ｓ５０５Ｎ、およびＷ５１５Ｋを含むＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインを導入することができる。別の例として、そのような実施形態では、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、ならびにアミノ酸置換Ｓ５０５ＮおよびＷ５１５Ｋを含むＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインを導入することができる。

いくつかの実施形態では、メモリーＴ細胞への分化の増加は、ＣＡＲ担持免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）において望まれる。例として、そのような実施形態では、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、およびアミノ酸置換Ｗ５１５Ｋ、またはＨ４９９Ｌ／Ｇ５０９Ｎを含むＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインを導入することができる。

いくつかの実施形態では、メモリーＴ細胞への分化の増加は、ＣＡＲ担持免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）において望まれる。例として、そのような実施形態では、ＴＰＯＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２、ならびにアミノ酸置換Ｓ５０５Ｎ／Ｗ５１５ＫおよびＨ４９９Ｌ／Ｓ５０５Ｎ／Ｗ５１５Ｋを含むＣＡＣＣＲの膜貫通ドメインを導入することができる。

また、細胞傷害性効力、応答の持続性、および持続性の増加を増加させるための置換、例えば、Ｓ５０５Ｎ／Ｗ５１５ＫおよびＨ４９９Ｌ／Ｓ５０５Ｎ／Ｗ５１５Ｋ置換が本明細書で提供される。

Ｂ．ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）結合ドメイン
本開示のＣＡＣＣＲは、細胞内ＪＡＫ結合ドメインを含む。ＪＡＫ結合ドメインは、直接またはリンカーを介して、膜貫通ドメインのＣ末端に結合する。ＪＡＫ結合ドメインは、キメラサイトカイン受容体の細胞側の膜貫通ドメインに結合している。

いくつかの実施形態では、ＪＡＫ結合ドメインは、ＪＡＫ－１結合ドメイン、ＪＡＫ－２結合ドメイン、ＪＡＫ－３結合ドメイン、またはＴＹＫ２結合ドメインである。

いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲのＪＡＫ結合ドメインは、天然に存在し、および天然に存在する受容体に由来する。

いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲのＪＡＫ結合ドメインは合成である。

表１ｂおよび表１ｃは、本開示の膜貫通ドメインおよびＪＡＫ２結合ドメインの例示的なアミノ酸配列を提示する。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲは、表１ｂおよび１ｃの配列から選択されるアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲは、表１ｂおよび１ｃの配列のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む膜貫通およびＪＡＫ２結合ドメインを含む。

Ｃ．動員ドメイン
本開示のＣＡＣＣＲは、細胞質動員ドメインを含む。動員ドメインは、ＳＴＡＴ動員ドメイン、ＡＰ１動員ドメイン、Ｍｙｃ／Ｍａｘ動員ドメイン、またはＮＦｋＢ動員ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、例えば、受容体尾部（サイトテール（ｃｙｔｏｔａｉｌ））またはサイトカイン受容体尾部に由来するシグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）動員（Ｓｔａｔ活性化）ドメインである。本開示のＣＡＣＣＲのこれらの細胞内動員ドメインは、ＣＡＲおよびキメラサイトカイン受容体（例えば、本開示のキメラサイトカイン受容体を有するＣＡＲ－Ｔ細胞）を含む免疫細胞におけるシグナル３の伝播を可能にする。Ｓｔａｔ動員ドメインを介して伝播されるサイトカインシグナル伝達は、細胞のサイトカインベースの免疫増強を可能にする。いくつかの実施形態では、免疫増強は恒常性であり、例えば、シグナル伝達は、ＣＡＲを担持する免疫細胞の増加を引き起こす。いくつかの実施形態では、免疫増強は炎症性であり、例えば、シグナル伝達は、ＣＡＲを担持する免疫細胞の効力の増加を引き起こす。いくつかの実施形態では、免疫増強は、疲弊を防ぎ、例えば、シグナル伝達は、ＣＡＲを担持する免疫細胞の長期機能を維持する。

いくつかの実施形態では、本開示の動員ドメインは合成であり、天然に存在する受容体断片に類似していない。いくつかの実施形態では、免疫増強は、疲弊を防ぎ、例えば、シグナル伝達は、ＣＡＲを担持する免疫細胞の長期機能を維持する。

いくつかの実施形態では、本開示のＳｔａｔ動員ドメインは合成であり、天然に存在する受容体断片に類似していない。

他の実施形態では、本開示のＳｔａｔ動員ドメインは、例えば、天然に存在するサイトカイン受容体に由来する、天然に存在する受容体の細胞質尾部に由来する。天然に存在する受容体のこれらの細胞質尾部は、受容体の膜貫通ドメインのＪＡＫ活性化ドメインの下流の領域であってよい。キメラサイトカイン受容体のＳｔａｔ動員ドメインは、少なくとも１つの受容体由来の少なくとも１つのＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｓｔａｔ動員ドメインは、少なくとも１つのＳＴＡＴ１動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｓｔａｔ動員ドメインは、少なくとも１つのＳＴＡＴ２動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｓｔａｔ動員ドメインは、少なくとも１つのＳＴＡＴ３動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｓｔａｔ動員ドメインは、少なくとも１つのＳＴＡＴ４動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｓｔａｔ動員ドメインは、少なくとも１つのＳＴＡＴ５動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｓｔａｔ動員ドメインは、少なくとも１つのＳＴＡＴ６動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｓｔａｔ動員ドメインは、少なくとも１つのＳＴＡＴ７動員ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、Ｓｔａｔ動員ドメインが由来する天然に存在する受容体は、サイトカイン受容体ではない。

いくつかの実施形態では、Ｓｔａｔ動員ドメインが由来する天然に存在する受容体は、サイトカイン受容体である。Ｔ細胞免疫増強サイトカインがシグナル伝達する例示的なサイトカイン受容体には、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－１５受容体、およびＩＬ－２１受容体が含まれるが、これらに限定されない。代替の実施形態では、Ｓｔａｔ動員ドメインが由来する受容体は、サイトカイン受容体ではない。ＣＡＣＣＲのＳｔａｔ動員ドメインを選択することにより、選択したシグナル伝達に受容体を向け直すことができる。

いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲは、リンカーを伴って、または伴わずに、膜貫通／ＪＡＫ２結合ドメインのＣ末端に接続された動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、１つ以上のアミノ酸残基を含む。

表２ａは、本開示のＣＡＣＣＲの動員ドメインが由来する例示的な受容体を提示する。表２ｂは、本開示の動員ドメインの例示的なアミノ酸配列を提示する。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲは、表２ｂの受容体配列のうちの１つ以上から選択されるアミノ酸配列を含む動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲは、表２ｂの配列のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む動員ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲのＳｔａｔ動員ドメインは、１つの受容体由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。

複数の出力を生成するために、２つ以上のＳＴＡＴ動員ドメインをタンデムに結合して、１つ以上のサイトカインからのシグナル伝達を模倣することができる。

いくつかの実施形態では、２つ以上のＳＴＡＴ動員ドメインは、リンカーを伴って、または伴わずに、タンデムに結合され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、１つ以上のアミノ酸残基を含む。

いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ動員ドメインは、例えば、１つを超えるＳＴＡＴ動員ドメインを含む、１つを超える受容体の部分を含む。そのような実施形態では、タンデムサイトカインシグナル伝達ドメインが提供され、シグナル伝達の増強を可能にする。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲのモノマーのＳＴＡＴ動員ドメインは、１つを超える受容体由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含み、例えば、２、３、４、５、または６つもの受容体由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ動員ドメインは、複数の経路を刺激するためにタンデムに連結され得る（例えば、持続性増強ＳＴＡＴ５および炎症促進性ＳＴＡＴ４のためのＩＬ７Ｒ（３１６～４５９）－ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５～８２５）断片融合、持続性増強のためのＩＬ７Ｒ（３１６～４５９）－ＩＬ２Ｒｂｓｍａｌｌ（３９３～４３３、５１８～５５１）、持続性増強と抗疲弊のためのＩＬ７Ｒ（３１６～４５９）－ＥＧＦＲ（１１２２～１１６５）、持続性増強と抗疲弊のためのＩＬ２Ｒｂｓｍａｌｌ（３９３～４３３、５１８～５５１）－ＥＧＦＲ（１１２２～１１６５））。

複数の出力を生成する際に、個々のＳＴＡＴ動員ドメインの細胞膜への近接性は、それらのそれぞれのシグナル伝達出力の強度に影響を及ぼし得る。表２ｃは、各出力を細胞膜の近位または遠位のいずれかに配置することのできる、二重出力を有するＣＡＣＣＲの例を示す。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲは、表２ｃから選択された二重出力を有する動員ドメインを含む。

理論またはメカニズムに拘束されることなく、いくつかの実施形態では、ＪＡＫタンパク質（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、またはＴＹＫ２）は、本開示の二量体化されたＣＡＣＣＲに結合される。２つの結合したＪＡＫタンパク質が活性化され、ＣＡＣＣＲの動員ドメイン上のチロシン残基をリン酸化することができる。次いで、リン酸化された動員ドメインは、動員されたタンパク質に結合することができ（例えば、リン酸化されたＳＴＡＴ動員ドメインはＳＴＡＴタンパク質に結合する）、これは転じて核内の転写イベントをもたらす。

Ｄ．例示的なＣＡＣＣＲ
表３は、本開示の例示的なＣＡＣＣＲ配列を示す。受容体は、シグナル配列、例えば、配列ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号８９）のＣＤ８ＳＳとともに発現され得る。

いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲは、表３の配列のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、配列番号９０～９８および１０７～１３９のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体は、配列番号９０～９８および１０７～１３９のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体に由来する膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲは、配列番号６の天然に存在するＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲは、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、表２ｂに示される受容体配列のうちの１つ以上のアミノ酸配列を含む動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ２Ｒｂ、ＩＬ１２Ｒｂ１、ＩＬ１２Ｒｂ２、およびＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインからなる群から選択される１つ以上の動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４６、６８、６９、７０、７１、または７２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４６、６８、６９、７０、７１、または７２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４７、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０６、または１４３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４７、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０６、または１４３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ１２Ｒｂ１またはＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２Ｒｂ１またはＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号６７、８６、または８７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２Ｒｂ１またはＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号６７、８６、または８７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、表２ｃに示される１つ以上の動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７ＲａおよびＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７ＲａおよびＩＬ１２Ｒｂ１由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７ＲａおよびＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号９０または１１９のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号９０または１１９のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲは、Ｈ４９９、Ｓ５０５、Ｇ５０９、またはＷ５１５での１つ以上のアミノ酸置換を含む、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体由来の膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体は、Ｈ４９９Ｌ置換を含む。いくつかの実施形態では、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体は、Ｓ５０５Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体は、Ｇ５０９Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体は、Ｗ５１５Ｋ置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、表２ｂに示される受容体配列のうちの１つ以上のアミノ酸配列を含む動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ２Ｒｂ、ＩＬ１２Ｒｂ１、ＩＬ１２Ｒｂ２、およびＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインからなる群から選択される１つ以上の動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４６、６８、６９、７０、７１、または７２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４６、６８、６９、７０、７１、または７２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４７、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０６、または１４３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４７、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０６、または１４３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ１２Ｒｂ１またはＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２Ｒｂ１またはＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号６７、８６、または８７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２Ｒｂ１またはＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号６７、８６、または８７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、表２ｃに示される１つ以上の動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７ＲａおよびＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７ＲａおよびＩＬ１２Ｒｂ１由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７ＲａおよびＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号９２、９４、１２１、または１２３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号９２、９４、１２１、または１２３のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲは、Ｈ４９９ＬおよびＳ５０５Ｎ置換を含む、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体由来の膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、表２ｂに示される受容体配列のうちの１つ以上のアミノ酸配列を含む動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ２Ｒｂ、ＩＬ１２Ｒｂ１、ＩＬ１２Ｒｂ２、およびＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインからなる群から選択される１つ以上の動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４６、６８、６９、７０、７１、または７２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４６、６８、６９、７０、７１、または７２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４７、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０６、または１４３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４７、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０６、または１４３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ１２Ｒｂ１またはＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２Ｒｂ１またはＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号６７、８６、または８７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２Ｒｂ１またはＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号６７、８６、または８７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、表２ｃに示される１つ以上の動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７ＲａおよびＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７ＲａおよびＩＬ１２Ｒｂ１由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７ＲａおよびＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号９１、９８、１２０、または１２７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号９１、９８、１２０、または１２７のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲは、Ｈ４９９ＬおよびＷ５１５Ｋ置換またはＨ４９９ＬおよびＧ５０９Ｎ置換を含む、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体由来の膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、表２ｂに示される受容体配列のうちの１つ以上のアミノ酸配列を含む動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ２Ｒｂ、ＩＬ１２Ｒｂ１、ＩＬ１２Ｒｂ２、およびＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインからなる群から選択される１つ以上の動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４６、６８、６９、７０、７１、または７２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４６、６８、６９、７０、７１、または７２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４７、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０６、または１４３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４７、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０６、または１４３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ１２Ｒｂ１またはＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２Ｒｂ１またはＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号６７、８６、または８７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２Ｒｂ１またはＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号６７、８６、または８７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、表２ｃに示される１つ以上の動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７ＲａおよびＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７ＲａおよびＩＬ１２Ｒｂ１由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７ＲａおよびＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号９７または１２６のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号９７または１２６のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲは、Ｓ５０５ＮおよびＷ５１５Ｋ置換を含む、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体由来の膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、表２ｂに示される受容体配列のうちの１つ以上のアミノ酸配列を含む動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ２Ｒｂ、ＩＬ１２Ｒｂ１、ＩＬ１２Ｒｂ２、およびＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインからなる群から選択される１つ以上の動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４６、６８、６９、７０、７１、または７２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４６、６８、６９、７０、７１、または７２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４７、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０６、または１４３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４７、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０６、または１４３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ１２Ｒｂ１またはＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２Ｒｂ１またはＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号６７、８６、または８７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２Ｒｂ１またはＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号６７、８６、または８７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、表２ｃに示される１つ以上の動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７ＲａおよびＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７ＲａおよびＩＬ１２Ｒｂ１由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７ＲａおよびＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号９６、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１２５、１２８、１２９、１３２、１３４、１３６、または１３８のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号９６、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１２５、１２８、１２９、１３２、１３４、１３６、または１３８のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲは、Ｈ４９９ＬおよびＷ５１５Ｋ置換を含む、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体由来の膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、表２ｂに示される受容体配列のうちの１つ以上のアミノ酸配列を含む動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ２Ｒｂ、ＩＬ１２Ｒｂ１、ＩＬ１２Ｒｂ２、およびＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインからなる群から選択される１つ以上の動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４６、６８、６９、７０、７１、または７２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４６、６８、６９、７０、７１、または７２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４７、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０６、または１４３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４７、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０６、または１４３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ１２Ｒｂ１またはＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２Ｒｂ１またはＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号６７、８６、または８７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２Ｒｂ１またはＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号６７、８６、または８７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、表２ｃに示される１つ以上の動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７ＲａおよびＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７ＲａおよびＩＬ１２Ｒｂ１由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７ＲａおよびＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号９３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲは、Ｈ４９９Ｌ、Ｓ５０５Ｎ、およびＷ５１５Ｋ置換を含む、ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体由来の膜貫通ドメインおよび／またはＪＡＫ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、表２ｂに示される受容体配列のうちの１つ以上のアミノ酸配列を含む動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ２Ｒｂ、ＩＬ１２Ｒｂ１、ＩＬ１２Ｒｂ２、およびＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインからなる群から選択される１つ以上の動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４６、６８、６９、７０、７１、または７２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４６、６８、６９、７０、７１、または７２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４７、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０６、または１４３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号４７、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０６、または１４３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ１２Ｒｂ１またはＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２Ｒｂ１またはＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号６７、８６、または８７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２Ｒｂ１またはＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号６７、８６、または８７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２１Ｒ由来のＳＴＡＴ動員ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、表２ｃに示される１つ以上の動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７ＲａおよびＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７ＲａおよびＩＬ１２Ｒｂ１由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、ＩＬ７ＲａおよびＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号９５、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２４、１３０、１３１、１３３、１３５、１３７、または１３９のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号９５、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２４、１３０、１３１、１３３、１３５、１３７、または１３９のアミノ酸配列を含む。

Ｅ．ＣＡＣＣＲの発現
本明細書で提供されるＣＡＣＣＲのうちのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドが本明細書で提供される。同様に、そのようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターではない。

いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＣＡＣＣＲおよびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲとＣＡＲの発現は、リンカーによって分離された単一のポリペプチド鎖として発現される。図２は、本開示のＣＡＣＣＲとＣＡＲを共発現させるために使用できるベクターの概略図を示す。１つ以上の動員ドメインをタンデムに結合して、１つ以上のサイトカインからのシグナル伝達を模倣することができる。

ＩＩ．ＣＡＲを担持する免疫細胞
本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とＣＡＣＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む操作された免疫細胞が本明細書で提供される。本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ－Ｉ細胞）とＣＡＣＣＲを発現する操作された免疫細胞が本明細書で提供される。免疫細胞の例は、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、インバリアントＮＫＴ細胞、マスト細胞、骨髄由来食細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マクロファージ、ならびに単球を含む。免疫細胞は、例えば、非限定的に、幹細胞に由来する細胞も指す。幹細胞は、成人幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より具体的には非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。

したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＣＣＲを含むＣＡＲ－Ｔ細胞が本明細書で提供される。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメイン（例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ））と、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインと、を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインは、１つのポリペプチド、すなわち、一本鎖にある。多重鎖（ｍｕｌｔｉｃｈａｉｎ）ＣＡＲおよびポリペプチドも、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、多重鎖ＣＡＲは、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞外リガンド結合ドメインを含む第１のポリペプチドと、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドと、を含み、ポリペプチドは一緒に構築して多重鎖ＣＡＲを形成する。

ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、目的の標的に特異的に結合する。目的の標的は、例えば、非限定的に、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｆｌｔ－３、ＷＴ－１、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、ＬｅＹ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、ＣＤ４４ｖ６、ＲＯＲ１、ＣＤ１９、クローディン１８．２（クローディン１８Ａ２、またはクローディン１８アイソフォーム２）、ＤＬＬ３（デルタ様タンパク質３、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａデルタホモログ３、Ｄｅｌｔａ３）、Ｍｕｃ１７（ムチン１７、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ３）、ＦＡＰアルファ（線維芽細胞活性化タンパク質アルファ）、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合遺伝子座タンパク質Ｇ６ｄ、ｃ６ｏｒｆ２３、Ｇ６Ｄ、ＭＥＧＴ１、ＮＧ２５）、および／またはＲＮＦ４３（Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ４３、ＲＩＮＧフィンガータンパク質４３）を含む任意の目的の分子であってよい。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、可動性リンカーによって結合された標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖可変（ＶＬ）領域および重鎖可変（ＶＨ）領域を含むｓｃＦｖを含む。単鎖可変領域断片は、短い連結ペプチド（例えば、グリシン－セリン含有リンカー）を使用することによって軽鎖および／または重鎖の可変領域を連結することにより作製される（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６，１９８８）。一般に、リンカーは、短い、可撓性ポリペプチドであり、一般的に約２０以下のアミノ酸残基から構成され得る。次に、リンカーは、薬物の付着または固体支持物への付着のような、追加的機能のために修飾され得る。一本鎖バリアントは、組換えまたは合成的のいずれかで生み出され得る。ｓｃＦｖの合成産生のために、自動合成装置が使用され得る。ＳｃＦｖの組換え産生のために、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含む好適なプラスミドは、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物細胞のような真核生物、またはＥ．ｃｏｌｉのような原核生物のいずれかの好適な宿主細胞中に導入され得る。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションのような日常的な操作によって作製され得る。生じたｓｃＦｖは、当該技術分野で既知の標準的なタンパク質精製技法を使用して単離され得る。

本発明によるＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合に続く細胞内シグナル伝達を担い、免疫細胞の活性化および免疫応答（シグナル１および／または２）をもたらす。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが発現する免疫細胞の通常のエフェクター機能のうちの少なくとも１つを活性化する能力を有する。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲにおける使用のための細胞内シグナル伝達ドメインは、これらの配列の任意の類似体またはバリアント、および同じ機能的能力を有する任意の合成配列と同様に、例えば、限定なく、抗原受容体の会合に続くシグナル形質導入を開始することと協調して作用するＴ細胞受容体および共受容体の細胞質配列であり得る。細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞質シグナル伝達配列の２つの異なるクラス、抗原依存性の一次活性化を開始するものと、抗原独立様式で作用して二次的または共刺激シグナルを提供するものと、を含む。一次細胞質シグナル伝達配列は、ＩＴＡＭの免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフとして知られているシグナル伝達モチーフを含み得る。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスのチロシンキナーゼに対する結合部位として機能するさまざまな受容体の細胞質内尾部において見出される明確に定義されたシグナル伝達モチーフである。本発明において使用されるＩＴＡＭの例は、非限定的な例として、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子のドメインを含む。

いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５３１３３．）およびＣＤ２８（ＮＰ＿００６１３０．１）の断片からなる群から選択される共刺激分子の一部を含む。

ＣＡＲは、細胞の表面膜上に発現される。したがって、ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含み得る。本明細書に開示されるＣＡＲに好適な膜貫通ドメインは、（ａ）細胞、好ましくは、例えば、限定なく、リンパ球細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のような免疫細胞の表面上で発現される能力と、（ｂ）事前定義された標的細胞に対して免疫細胞の細胞応答を方向付けるために、リガンド結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインと相互作用する能力と、を有する。膜貫通ドメインは、天然または合成供給源のいずれかに由来し得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、ＣＤ３複合体、ＩＬ－２受容体ｐ５５（鎖）、ｐ７５（β鎖）もしくはγ鎖、Ｆｃ受容体のサブユニット鎖、特にＦｃγ受容体ＩＩＩもしくはＣＤタンパク質を構成するα、β、γまたはδポリペプチドのようなＴ細胞受容体のサブユニットであり得る。代替的には、膜貫通ドメインは、合成的であり得、ロイシンおよびバリンのような主に疎水性残基を含み得る。いくつかの実施形態では、該膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）に由来する。膜貫通ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインと該膜貫通ドメインとの間にストークドメインをさらに含み得る。ストークドメインは、最大３００アミノ酸、好ましくは１０～１００アミノ酸、最も好ましくは２５～５０アミノ酸を含み得る。ストーク領域は、ＣＤ８、ＣＤ４、またはＣＤ２８の細胞外領域の全てもしくは一部から、または抗体定常領域の全てもしくは一部からのような、天然に発生する分子の全てまたは一部に由来し得る。代替的には、ストークドメインは、天然に発生するストーク配列に対応する合成配列であり得るか、または完全に合成ストーク配列であり得る。いくつかの実施形態では、該ストークドメインは、ヒトＣＤ８α鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）の一部である。別の特定の実施形態では、該膜貫通ドメインおよびヒンジドメインは、ヒトＣＤ８α鎖の一部を含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと、さらに第２のシグナル伝達ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲは、ＢＣＭＡまたはＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ８αヒトヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、ならびに４－１ＢＢシグナル伝達ドメインに特異的に結合する細胞外リガンド結合ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲは、配列番号１４０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号１４１または１４２のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、ＣＡＲ免疫細胞は、本開示のＣＡＣＣＲを含むＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＣＣＲは、Ｈ４９９Ｌ、Ｓ５０５Ｎ、およびＷ５１５Ｋの三重置換、またはＳ５０５ＮおよびＷ５１５Ｋの二重置換（例えば、配列番号１２または１３）を有する、配列番号６の天然に存在するＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２の膜貫通／ＪＡＫ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲは、ＩＬ２Ｒｂ由来の動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＣＣＲは、ＩＬ２Ｒｂ（３９３～４３３、５１８～５５１）またはＩＬ２Ｒｂ（３３９～３７９、３９３～４３３、５１８～５５１）由来の動員ドメイン（例えば、配列番号７７または７８）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号１４１または１４２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号１１３、１１４、または１１６のアミノ酸配列を含むＣＡＣＣＲを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、プラスミドベクターを介して導入遺伝子として免疫細胞中に導入され得る。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターはまた、例えば、ベクターを受けた細胞の同定および／または選択を提供する選択マーカーを含むことができる。

表４は、本明細書に開示されるＣＡＲにおいて使用され得るＣＡＲ構成成分の例示的な配列、ならびに本明細書で例示される抗体および／またはＣＡＲ配列を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲ免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、例えば、ＲＱＲ８のような自殺ポリペプチド（ｓｕｉｃｉｄｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３１５３３９１Ａを参照されたい。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、細胞の表面上で発現される。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、ＣＡＲ構築物に含まれる。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、ＣＡＲ構築物の部分でない。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲのうちのいずれか１つの細胞外ドメインは、モノクローナル抗体に対して特異的な（モノクローナル抗体に特異的に認識される）１つ以上のエピトープを含み得る。これらのエピトープは、本明細書ではｍＡｂ特異的エピトープとも称される。例示的なｍＡｂ特異的エピトープは、その全体が本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１６／１２０２１６号に開示される。これらの実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、目的の標的に特異的に結合する抗原結合ドメインと、１つ以上のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合する１つ以上のエピトープと、を含む。ｍＡｂ特異的エピトープを含むＣＡＲは、単鎖または多鎖であり得る。

本明細書に記載されるＣＡＲの細胞外ドメインにおけるモノクローナル抗体に対して特異的なエピトープの包含は、ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞の選別および枯渇を可能にする。いくつかの実施形態では、枯渇を可能にすることは、例えば対象への投与時の有害な影響の場合に、安全スイッチを提供する。

免疫療法での使用のための操作された免疫細胞を調製する方法も、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＡＣＣＲおよびＣＡＲを免疫細胞中に導入することと、細胞を拡大することと、を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、細胞を提供することと、ＣＡＣＣＲを発現させることと、少なくとも１つのＣＡＲを細胞の表面で発現させることと、を含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＡＣＣＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、およびＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドによって細胞をトランスフェクトすることと、細胞においてポリヌクレオチドを発現させることと、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＡＣＣＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、およびＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドによって細胞をトランスフェクトすることと、細胞においてポリヌクレオチドを発現させることと、を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲおよびＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、細胞における安定的な発現のために１つ以上の発現ベクターに存在する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞における安定的な発現のためにウイルスベクターに存在する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、例えば、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターであり得る。

いくつかの実施形態では、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、エレクトロポレーションによって細胞中に直接導入されるｍＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅのようなＣｙｔｏＰｕｌｓｅエレクトロポレーション技術は、細胞中への材料の送達のために生細胞を一過的に透過処理するために使用され得る（例えば、ＵＳ ６，０７８，４９０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０００８２７、およびＰＣＴ／ＵＳ２００４／００５２３７）。パラメータは、最小の死亡率を伴う高トランスフェクション効率のための条件を決定するために変更され得る。

免疫細胞、例えばＴ細胞をトランスフェクトする方法も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、Ｔ細胞をＲＮＡと接触させることと、Ｔ細胞にアジャイルパルスシーケンスを適用することと、を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）をトランスフェクトする方法は、免疫細胞をＲＮＡと接触させることと、細胞にアジャイルパルスシーケンスを適用することと、を含む。

いくつかの実施形態では、方法は、例えば、限定なく、ＴＣＲの構成成分、免疫抑制剤の標的、ＨＬＡ遺伝子、および／またはＰＤＣＤ１もしくはＣＴＬＡ－４のような免疫チェックポイントタンパク質を発現する少なくとも１つの遺伝子を不活性化することによる、細胞を遺伝子改変するステップをさらに含み得る。遺伝子を不活性化することにより、目的の遺伝子は機能的なタンパク質形態で発現されないことが、意図される。いくつかの実施形態では、不活性化される遺伝子は、例えば、限定なく、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＧＲ、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、ＰＤ－１、およびＣＴＬＡ－４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、方法は、選択的ＤＮＡ切断によって遺伝子を選択的に不活性化することができるレアカット（ｒａｒｅ－ｃｕｔｔｉｎｇ）エンドヌクレアーゼを細胞中に導入することによって１つ以上の遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）、またはＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ－９もしくはＣａｓ１２ａ）であり得る。

別の態様では、細胞を遺伝子改変するステップは、免疫抑制剤の標的を発現する少なくとも１つの遺伝子を不活性化することによって免疫細胞を改変することと、任意選択で、免疫抑制剤の存在下で細胞を拡大することと、を含み得る。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＡＣＣＲを発現しない操作された免疫細胞と比較して、改善された細胞傷害性、増加した拡大、および／または増加したレベルのメモリー表現型マーカーを示す。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＡＣＣＲを発現しない操作された免疫細胞と比較して、（ｉ）インビボ持続性の増加、（ｉｉ）ＳＴＡＴ活性化の増加、（ｉｉｉ）細胞傷害性の増加、（ｉｖ）メモリー表現型マーカーのレベルの増加、（ｖ）拡大（増殖）の増加、またはこれらの機能的特徴の組み合わせを示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される１つ以上の機能的特徴の改善は、ＣＡＣＣＲに導入された変異／改変に依存して、調整可能である。いくつかの実施形態では、開示される１つ以上のＣＡＣＣＲを含む操作された免疫細胞によって活性化されるＳＴＡＴは、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＣＡＣＣＲを含む免疫細胞によって増加または維持されるメモリー表現型マーカーは、幹細胞メモリー（Ｔｓｃｍ）マーカーおよびセントラルメモリー（Ｔｃｍ）マーカーを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＣＡＣＣＲを含む免疫細胞によって示される１つ以上の機能的特徴の改善は、ＣＡＣＣＲを発現しない免疫細胞と比較して、それらの間の値および範囲を含む、少なくとも約２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１２５倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、または約１０５００倍までもである。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＣＡＣＣＲを含む免疫細胞によって示される１つ以上の機能的特徴の改善は、ＣＡＣＣＲを発現しない免疫細胞と比較して、それらの間の値および範囲を含む、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、または約５００％までもである。

ＩＩＩ．治療法
本開示のＣＡＣＣＲおよびＣＡＲを担持する細胞を含む医薬組成物が本明細書で提供される。

上述の方法によって得られた操作されたＣＡＣＣＲ担持およびＣＡＲ担持免疫細胞（例えばＴ細胞）、またはそのような操作された免疫細胞に由来する細胞株は、医薬として使用することができる。いくつかの実施形態では、かかる医薬品は、例えばウイルス性疾患、細菌性疾患、がん、炎症性疾患、免疫疾患、または加齢関連疾患のような障害を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では、がんは固形がんである。いくつかの実施形態では、がんは液体がんである。がんは、胃がん、肉腫、リンパ腫、白血病、頭頸部がん、胸腺がん、上皮がん、唾液がん、肝臓がん、胃がん、甲状腺がん、肺がん、卵巣がん、乳がん、前立腺がん、食道がん、膵臓がん、神経膠腫、白血病、多発性骨髄腫、腎細胞がん、膀胱がん、子宮頸がん、絨毛がん、結腸がん、口腔がん、皮膚がん、および黒色腫からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、対象は、局所進行性もしくは転移性黒色腫、扁平上皮性頭頸部がん（ＳＣＨＮＣ）、卵巣がん、肉腫、または再発性もしくは難治性の古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）を有する以前に治療された成人対象である。

いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞、または操作された免疫細胞に由来する細胞株は、それを必要とする対象における障害の治療のための医薬の製造に使用され得る。いくつかの実施形態では、障害は、例えば、がん、自己免疫障害、または感染症であり得る。

また、本明細書では、そのような治療を必要とする対象を治療する方法も、提供される。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、非限定的に、ヒトおよび他の霊長類（例えば、チンパンジー、カニクイザル、ならびに他の類人猿およびサル種）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ）、飼育哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）、実験動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、およびモルモットなどのげっ歯類）、ならびに鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、および他の家禽鳥類、アヒル、ガチョウなどのような飼育、野生、およびゲーム用鳥類）を含む任意の脊椎動物を指す。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。例示的な実施形態では、対象は、ヒトである。

いくつかの実施形態では、この方法は、本明細書に記載のＣＡＣＣＲおよびＣＡＲを担持する、本開示の免疫細胞を、それを必要とする対象に提供することを含む。

いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＣＣＲおよびＣＡＲを担持するＴ細胞は、頑健なインビボ細胞拡大を経ることができ、長期間残存することができる。

本発明の治療方法は、改善すること、治癒的または予防的であり得る。本発明の方法は、自己免疫療法の一部または同種免疫療法治療の一部のいずれかであり得る。

別の態様では、本発明は、腫瘍を有する対象における腫瘍の増殖または進行を阻害する方法であって、有効量の、本明細書に記載のＣＡＣＣＲを発現およびＣＡＲを発現する免疫細胞を対象に投与することを含む、方法を提供する。別の態様では、本発明は、対象におけるがん細胞の転移を阻害または防止する方法であって、有効量の本明細書に記載の操作された免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。別の態様では、本発明は、腫瘍を有する対象において腫瘍退縮を誘導する方法であって、有効量の本明細書に記載の操作された免疫細胞を対象に投与することを含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本明細書における操作されたＴ細胞は、対象において非経口的に投与され得る。

本明細書ではさらに、それを必要とする対象における、がんの治療のための、または腫瘍の増殖もしくは進行を阻害するための医薬の製造における、本明細書に提供される操作されたＴ細胞うちのいずれかの使用が提供される。

いくつかの実施形態では、治療は、免疫抑制治療を受けている対象中に投与され得る。実際、本発明は、好ましくは、かかる免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活性化に起因して、少なくとも１つの免疫抑制剤に対して耐性を持たせられている細胞または細胞の集団に依存する。この態様では、免疫抑制治療は、対象内での本発明による免疫細胞の選択および拡大を助けるはずである。本発明に従う細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）または移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）によるものを含む、任意の簡便な様式で実施され得る。本明細書に記載される組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内もしくはリンパ内注射、または腹腔内で対象に投与され得る。本開示のＣＡＣＣＲおよびＣＡＲを担持する細胞またはその医薬組成物は、以下の投与経路のうちの１つ以上を介して投与され得る：静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮下、局所、経口、経皮、腹腔内、眼窩内、移植により、吸入により、髄腔内、脳室内、耳経由、または鼻腔内。

いくつかの実施形態では、（本開示のＣＡＣＣＲとＣＡＲを担持する）細胞または細胞集団の投与は、それらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む、例えば、体重１ｋｇあたり約１０⁴～約１０⁹細胞の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞または細胞集団の投与は、体重１ｋｇあたり約１０⁴～１０⁵細胞、体重１ｋｇあたり１０⁵～１０⁶細胞、体重１ｋｇあたり１０⁶～１０⁷細胞、体重１ｋｇあたり１０⁷～１０⁸細胞、または体重１ｋｇあたり１０⁸～１０⁹細胞の投与を含み得る。細胞または細胞の集団は、１回以上の用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、該有効量の細胞は、単回用量として投与され得る。いくつかの実施形態では、該有効量の細胞は、期間にわたって２回以上の用量として投与され得る。投与のタイミングは、主治医の判断の範囲内であり、対象の臨床状態に依存する。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーのような任意の供給源から得られることができる。個々の必要性は変化するが、一方で、当該分野の範囲内の特定の疾患または状態に対する所与の細胞型の有効量の最適範囲の決定。有効量は、治療的または予防的利益を提供する量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、同時治療の種類、もしあるなら、治療の頻度ならびに所望の効果の性質に依存するであろう。いくつかの実施形態では、有効量の細胞またはそれらの細胞を含む組成物は、非経口投与される。いくつかの実施形態では、投与は、静脈内投与であり得る。いくつかの実施形態では、投与は、腫瘍内の注射によって直接行われ得る。

方法は、本明細書に提供されるＣＡＲおよびＣＡＣＣＲを担持する操作された免疫細胞を投与する前に、１つ以上の治療薬を対象に投与することをさらに含み得る。ある特定の実施形態では、薬剤は、リンパ枯渇（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）（プレコンディショニング）レジメンである。例えば、かかる療法を必要とする対象をリンパ枯渇させる方法は、対象に特定の有効用量のシクロホスファミド（２００ｍｇ／ｍ²／日～２０００ｍｇ／ｍ²／日、約１００ｍｇ／ｍ²／日～約２０００ｍｇ／ｍ²／日、例えば、約１００ｍｇ／ｍ²／日、約２００ｍｇ／ｍ²／日、約３００ｍｇ／ｍ²／日、約４００ｍｇ／ｍ²／日、約５００ｍｇ／ｍ²／日、約６００ｍｇ／ｍ²／日、約７００ｍｇ／ｍ²／日、約８００ｍｇ／ｍ²／日、約９００ｍｇ／ｍ²／日、約１０００ｍｇ／ｍ²／日、約１５００ｍｇ／ｍ²／日または約２０００ｍｇ／ｍ²／日）および特定の用量のフルダラビン（２０ｍｇ／ｍ²／日～９００ｍｇ／ｍ²／日、約１０ｍｇ／ｍ²／日～約９００ｍｇ／ｍ²／日、例えば、約１０ｍｇ／ｍ²／日、約２０ｍｇ／ｍ²／日、約３０ｍｇ／ｍ²／日、約４０ｍｇ／ｍ²／日、約４０ｍｇ／ｍ²／日、約５０ｍｇ／ｍ²／日、約６０ｍｇ／ｍ²／日、約７０ｍｇ／ｍ²／日、約８０ｍｇ／ｍ²／日、約９０ｍｇ／ｍ²／日、約１００ｍｇ／ｍ²／日、約５００ｍｇ／ｍ²／日または約９００ｍｇ／ｍ²／日）を投与することを含む。例示的な投薬レジメンは、治療有効量の操作された免疫細胞の患者への投与の前３日間に約３０ｍｇ／ｍ²／日のフルダラビンを投与することと組み合わせて、またはその前、またはその後に、約３００ｍｇ／ｍ²／日のシクロホスファミドを患者に毎日投与することを含む、対象を治療することを伴う。

いくつかの実施形態では、特に、本明細書に提供される操作された細胞がＣＤ５２の表面発現を除去または最小化するように遺伝子編集されている場合に、リンパ枯渇は、アレムツズマブのような抗ＣＤ５２抗体の投与をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ５２抗体は、約１～２０ｍｇ／日のＩＶ、例えば、約１３ｍｇ／日のＩＶの用量で、１、２、３日以上投与される。抗体は、リンパ枯渇レジメンの他の要素（例えば、シクロホスファミドおよび／またはフルダラビン）の投与と組み合わせて、その前に、またはその後に、投与され得る。

ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＣＣＲおよびＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む組成物は、任意の数の化学療法剤と組み合わされて投与され得る。

ＩＶ．キットおよび製品
本開示は、本明細書に記載のＣＡＣＣＲおよびＣＡＲを担持する細胞のいずれか１つ以上、ならびにそれらの医薬組成物を含むキットを提供する。本開示はまた、本明細書に記載のＣＡＣＣＲおよびＣＡＲを担持するＣＡＲ－１細胞のいずれか１つ以上、それらの医薬組成物、および本明細書に記載のキットを含む製品を提供する。

以下の実施例は、例示目的のみのために提供され、決して本発明の範囲を限定するように意図されるものではない。

本開示を通して参照される全ての特許および非特許文献は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

実施例１：サイトカインシグナル伝達を構成的に活性化するＴｐｏＲ ＴＭ変異体の同定
トロンボポエチン受容体（ＴｐｏＲ）の配列を使用して、プロトタイプの構成的に活性なキメラサイトカイン受容体（ＣＡＣＣＲ）を設計した。ＴｐｏＲは、ＪＡＫ－Ｓｔａｔシグナル伝達経路を活性化することができ、ホモ二量体受容体としてシグナルを伝達する。ＴｐｏＲ活性における単一点変異（アミノ酸置換）は、受容体活性を調節することが示されている（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ｆｅｂ １２；１１０（７）：２５４０－５．；ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０１１ Ｊｕｌ；２５（７）：２２３４－４４．；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１６ Ｆｅｂ ５；２９１（６）：２９７４－８７）。この例では、構成的に活性なキメラサイトカイン受容体が天然に存在するＴｐｏＲ受容体から操作された。天然のＴｐｏＲ受容体の細胞外ドメインが除去されたため、リガンド結合能を失った。１～３個の変異がその膜貫通ドメインに導入された。ＴｐｏＲサイトテールは、所望の／記載されたサイトカイン受容体のもので置換された。図１は、操作された構成的に活性なキメラサイトカイン受容体の概略図を示す。

ＣＡＲ－Ｔ細胞との関連で構成的に活性なキメラサイトカイン受容体の有用性を実証するために、各ＴｐｏＲ膜貫通（ＴＭ）バリアントを、第２世代ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ（２１７３ｓｃＦｖ；Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１５ Ｆｅｂ １８；７（２７５）：２７５ｒａ２２．に記載）をコードするレンチウイルスベクターにクローニングした。サイトカイン受容体とＣＡＲの化学量論的共発現を可能にするために、両方の遺伝子はＰ２Ａペプチドを介して連結された。形質導入された細胞の検出を容易にするために、ｖ５エピトープタグ（ＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ（配列番号１４４））を、ｓｃＦｖとＣＤ８ヒンジドメインの間に挿入した。

図２は、構成的に活性なキメラサイトカイン受容体およびＣＡＲを共発現するために使用されるレンチウイルスベクターの概略図を示す。

表４は、使用したコンストラクトに関連する配列を示す。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞レポーターアッセイを使用して、構成的サイトカインシグナル伝達が可能なＴｐｏＲ ＴＭバリアントをスクリーニングした。簡潔に述べると、２０，０００のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ポリ－Ｌ－リジンでコーティングされた９６ウェルの平底プレートの各ウェル中に播種し、一晩接着させた。サイトカイン受容体－ＣＡＲコンストラクト（２．５ｎｇ）、ホタルルシフェラーゼ（１００ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を駆動するＳｔａｔ応答エレメント、およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ対照レポーターベクター（１ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に５ｕＬの最終体積で混合した（「ＤＮＡ混合物」）。陰性対照として、全てのサイトカインシグナル伝達ドメインを欠くＢＦＰ ＣＡＲコンストラクトを細胞にトランスフェクトした。陽性対照として、細胞に全長ヒトＥｐｏＲ（サイトカイン受容体－ＣＡＲコンストラクトの代わりのエリスロポエチン受容体）をコードするベクターをトランスフェクトし、外因性組換えヒトＥｐｏの添加によりＳｔａｔ５シグナル伝達を誘導できるようにした。５ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭにおいて０．３ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で５分間インキュベートし、次いで、ＤＮＡ混合物に添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートし、１０ｕＬの総量をＨＥＫ－２９３Ｔを含む各ウェルに添加した。トランスフェクションの４８時間後、Ｓｔａｔ５レポーター活性を、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価した。Ｓｔａｔ５レポーター活性の誘導倍率を、サイトカイン受容体を除く全てのベクターでトランスフェクトされ、未処理のままにされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のものに対して正規化した。

図３ａおよび３ｂは、サイトカイン受容体シグナル伝達を構成的に活性化するＴｐｏＲ ＴＭ変異体の同定を示す。図３ａは、使用されたレンチウイルスベクターの概略図を示す。それは、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＩＬ７シグナル伝達を模倣するＩＬ７Ｒ（３１６～４５９）サイトテールを担持する。図３ｂは、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイによって決定されるときの、Ｓｔａｔ５レポーター活性を示す。野生型ＴｐｏＲ ＴＭドメイン（ＴｐｏＲ（４７８～５８２））を担持するサイトカイン受容体はＳｔａｔ５を自発的に活性化しなかった。ＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｓ５０５Ｎ）、ＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｗ５１５Ｋ）、およびＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｈ４９９Ｌ、Ｇ５０９Ｎ）変異体は、弱いＳｔａｔ５活性化をもたらした。ＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｈ４９９Ｌ、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ）は中程度のＳｔａｔ５アクティビティを可能にし、ＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ）は最も強いＳｔａｔ５シグナルを生成した。

実施例２：構成的に活性なキメラサイトカイン受容体を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の生成
次に、これらのサイトカイン受容体が初代ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞との関連でシグナルを伝達するかどうかを試験した。サイトカイン受容体ＣＡＲをコードするレンチウイルスを作製するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの前日に、６ウェルプレートのウェルあたり１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充した２ｍＬのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中にｍＬあたり４５万細胞で播種した。トランスフェクションの日に、レンチウイルスを、６ウェルプレートのウェルあたり２５０ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）においてレンチウイルスパッケージングベクター１．５ｕｇのｐｓＰＡＸ２、０．５ｕｇのｐＭＤ２Ｇ、０．５ｕｇの適切なＣＡＲベクターを一緒に混合することによって調製した（「ＤＮＡ混合物」）。２５０ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭにおいて１０ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で５分間インキュベートし、次いで、ＤＮＡ混合物に添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートし、５００ｕＬの総量をＨＥＫ２９３Ｔを含むウェルの側面にゆっくりと添加した。トランスフェクションの１日後に、６ウェルプレートにおけるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の各ウェルからの培地を、ウェルあたり２ｍＬのＴ細胞形質導入培地、すなわち、１０％ＦＢＳを補充したＸ－Ｖｉｖｏ－１５で置き換えた。トランスフェクションの２日後に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのレンチウイルス上清を回収し、０．４５ミクロンフィルター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して細胞残屑を除去し、Ｌｅｎｔｉ－Ｘコンセントレーター（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を製造者の使用説明書に従って使用して２５倍に濃縮し、アリコートで瞬間冷凍した。レンチウイルス力価は、凍結レンチウイルスのアリコートを解凍し、４倍段階希釈を行い、ＪｕｒｋａＴ細胞（クローンＥ６－１；ＡＴＣＣ）で限界希釈滴定を行うことによって決定した。０日目に、精製されたＴ細胞を、１００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で補充されたＸ－ｖｉｖｏ－１５培地（Ｌｏｎｚａ）において、Ｇｒｅｘ－２４プレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ番号８０１９２Ｍ）を補充したＸ－Ｖｉｖｏ－１５培地（Ｌｏｎｚａ）において、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、およびヒトＴ ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－１１１－１６０、１：１００希釈）で活性化した。２日目に、Ｔ細胞をＴ細胞形質導入培地に５０万細胞／ｍＬで再懸濁し、Ｇｒｅｘ－２４プレートで１００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ－２とともにＭＯＩ＝５のそれぞれのレンチウイルスストックで形質導入した。形質導入が完了した５日目に、細胞を回収して洗浄し、残留ＩＬ－２を除去した。次いで、それらをＴ細胞拡大培地、すなわち５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）を補充したＸ－Ｖｉｖｏ－１５に再懸濁し、各サンプルを２つの部分に均等に分割し、１つの部分に標準プロトコールに従う１００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ－２を入れ、もう１つは低濃度の２５ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ－２を入れた。細胞を、Ｔ細胞拡大培地とそれぞれの濃度のヒトＩＬ－２を使用して、必要に応じてより大きなＧ－Ｒｅｘ容器（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）中で拡大した。５、９、および１４日目に、各サンプルのＴ細胞の絶対数を数え、形質導入効率を、フローサイトメトリーを使用してＦＩＴＣコンジュゲートｖ５タグモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に結合したＴ細胞のパーセンテージを検出することにより、決定した。１４日目または１５日目に、ＣＡＲ－Ｔ細胞産物を、凍結保存し、さらなるアッセイのために必要に応じて解凍した。

図４ａ～４ｃは、構成的に活性なキメラサイトカイン受容体を共発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の生成の結果を示す。野生型ＴｐｏＲ ＴＭサイトカイン受容体（ＴｐｏＲ（４７８～５８２））を有するＣＡＲ－Ｔ細胞培養と比較して、ＴｐｏＲ ＴＭ変異体を担持するＣＡＲ－Ｔ細胞培養は、総Ｔ細胞数（図４ａ）とＣＡＲ－Ｔ細胞数（図４ｂ）の両方に関してより強力な拡大を受けた。図４ａ～４ｃは、ＴｐｏＲ ＴＭ変異体の形質導入効率が、野生型ＴｐｏＲ（４７８～５８２）の対応物と同等かそれ以上であることを示す。ＴｐｏＲ ＴＭ変異体は、ＣＡＲ－Ｔ細胞産物のより高い収量を可能にする。さらに、より低いＩＬ－２濃度でＴｐｏＲ ＴＭ変異体を拡大させることは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大または収量に影響を及ぼさなかった（図４ｃ）。

ＣＡＲ－Ｔ細胞生成の１４日目に、ＣＡＲ－Ｔ細胞のメモリー表現型が決定された。簡潔に述べると、サンプルを、ＰＢＳで洗浄し、Ｆｃでブロックし、次いで、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで希釈した以下の抗体カクテルで染色した：ＢＵＶ３９５コンジュゲート抗ヒトＣＤ３、ＢＶ５１０コンジュゲート抗ヒトＣＤ８、ＢＶ６０５コンジュゲートヒトＣＤ４およびＦＩＴＣコンジュゲートｖ５タグ（ＣＡＲ検出用）、ＰＥ／Ｃｙ７コンジュゲート抗ヒトＣＤ６２Ｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、およびＢＶ７８５コンジュゲート抗ヒトＣＤ４５ＲＯ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。最後に、サンプルをＰＢＳで洗浄し、細胞ペレットをＦＡＣＳ分析のために１３０ｕＬのＰＢＳ＋１％ＢＳＡに再懸濁させた。

図５は、ＣＡＲ－Ｔ細胞産物におけるメモリーＴ細胞サブセットの分布を示す。野生型ＴｐｏＲ（４７８～５８２）の対応物と比較して、ＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｗ５１５Ｋ）およびＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｈ４９９Ｌ、Ｇ５０９Ｎ）変異体は、標準の１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２条件で拡大した場合により大きな分化を示した。低ＩＬ－２条件での増殖は分化を改善した。標準濃度のＩＬ－２と協調して、ＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｗ５１５Ｋ）およびＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｈ４９９Ｌ、Ｇ５０９Ｎ）変異体によって誘導されるより強いＳｔａｔ５シグナル伝達は、ＣＡＲ－Ｔ細胞分化の加速をもたらし得、低ＩＬ－２条件での拡大は、構成的サイトカイン受容体を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞との関連でより有利であり得る。

実施例３：ＴｐｏＲ ＴＭ変異体は、ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞におけるサイトカインシグナル伝達を構成的に活性化する
ＴｐｏＲ ＴＭ変異体によって媒介されるサイトカインシグナル伝達の強度を決定するために、ＴｐｏＲ ＴＭサイトカイン受容体バリアントを担持するＣＡＲ－Ｔ細胞を、１００ｕＬの無血清ＲＰＭＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で、３７℃、５％ＣＯ₂の加湿インキュベーターで４時間血清飢餓状態にした。陽性対照として、外因性組換えヒトＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍＬ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を４時間の血清飢餓の最後の３０分間に添加した。４時間後、ＢＵＶ３９５コンジュゲート抗ヒトＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＦＩＴＣコンジュゲートｖ５タグモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を含む抗体カクテルを、細胞に添加し、最後の２０分間インキュベートした。次いで、各１００ｕＬサンプルに３５ｕＬの１６％パラホルムアルデヒドを添加し、３７℃で１５分間インキュベートして細胞を固定した。次いで、細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、－２０％で１または２晩１００％冷メタノールで透過処理した。ＦＡＣＳ分析の日に、細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、Ｆｃでブロッキングし、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡにおいて希釈されたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７複合体化抗マウス／ヒトＳｔａｔ５（ｐＹ６９４）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。暗所における室温での１時間のインキュベーション後、細胞を、ＦＡＣＳ分析前に３回洗浄した。

図６ａ～６ｂは、ｐＳｔａｔ５＋細胞のパーセンテージ（図６ａ）およびｐＳｔａｔ５染色の幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）（図６ｂ）によって反映される、各ＴｐｏＲ ＴＭバリアントによって媒介される構成的サイトカインシグナル伝達の程度を示す。ＴｐｏＲ ＴＭ単一変異体（ＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｓ５０５Ｎ）およびＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｗ５１５Ｋ））は、感知できるほどのＳｔａｔ５活性化を誘導しなかったが、ＴｐｏＲ ＴＭ二重変異体（ＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ）および三重変異体（ＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｈ４９９Ｌ、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ））は、比較的強力な構成的Ｓｔａｔ５活性化を誘導した。低ＩＬ－２および標準ＩＬ－２濃度で拡大したＣＡＲ－Ｔ細胞は、同等のＳｔａｔ活性化プロファイルを生成した。Ｓｔａｔ５が活性化されたのは、同じ培養における、ＣＡＲを担持するＴ細胞（ＣＡＲ＋）と、ＣＡＲを担持しないＴ細胞（ＣＡＲ－）のみであり、サイトカインシグナル伝達がＣＡＲ－Ｔ細胞特異的であることを示している。

実施例４：構成的サイトカイン受容体は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性効力および応答の長期持続性を増強した
構成的サイトカイン受容体シグナル伝達がＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害活性を増強するかどうかを試験するために、標的細胞としてＵ８７ＫＯ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｎｕｃＧＦＰを使用した。Ｕ８７ＫＯ－ＥＧＦＲｖＩＩＩは、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ ＳＡ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）からの好意による寄贈品である。Ｕ８７ＫＯ－ＥＧＦＲｖＩＩＩは、まず転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を使用して内因性野生型ＥＧＦＲをノックアウトし、次いで、レンチウイルス形質導入を介して完全長ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩを安定的に過剰発現させることによって、親細胞株Ｕ８７ＭＧ（ＡＴＣＣ）に由来した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞解析イメージングシステムを介した標的細胞イメージングを促進するために、Ｕ８７ＫＯ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｎｕｃＧＦＰ標的細胞は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｇｒｅｅｎレンチウイルス試薬（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いた第２のレンチウイルス形質導入によってＵ８７ＫＯ－ＥＧＦＲｖＩＩＩに由来した。５，０００のＵ８７ＫＯ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｎｕｃＧＦＰ標的細胞を、播種し、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、および２０～２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する５０ｕＬのＲＰＭＩにおいて黒色の壁および平坦で透明な底を有する９６ウェルプレートにおいて付着することを可能にした。ＴｐｏＲ ＴＭバリアントサイトカイン受容体を担持するＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ（２１７３ ｓｃＦｖ）Ｔ細胞を解凍し、１：８および１：２のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で播種した標的細胞に添加した。比較のために、外因性組換えヒトＩＬ－７を添加した場合と添加しない場合の野生型ＴｐｏＲ（４７８－５８２）ＣＡＲ－Ｔ細胞をアッセイに含めた。該当する場合、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、浮遊細胞を元のプレートから標的細胞の新しいプレートに移すことにより、示された時点で再チャレンジされた。重複したウェルを、各条件について設定した。細胞傷害性は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞解析イメージングシステムを使用して、各時点での生標的細胞の数を列挙することによって決定された。

図７ａ～７ｄは、１：８のＥ：Ｔ比でのＴｐｏＲ ＴＭ変異体の細胞傷害活性を示している。Ｓｔａｔ５（図６ａ～６ｂ）を効果的に活性化できないことと一致して、単一のＴｐｏＲ ＴＭ変異体ＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｓ５０５Ｎ）（図７ａ）およびＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｗ５１５ＫＮ）（図７ｂ）は、野生型ＴｐｏＲ（４７８～５８２）対照を担持する対応物と比較した機能強化を示さなかった。図７ｃは、標準的なＩＬ－２濃度で拡大したＴｐｏＲ二重変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞が増強されなかったことを示し、一方、低ＩＬ－２条件で拡大したＴｐｏＲ二重変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞は、標的細胞の溶解においてより強力であった。図７ｄは、ＣＡＲ－Ｔ細胞生成中のＩＬ－２濃度に関係なく、ＴｐｏＲ三重変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞が標的細胞溶解においてより強力であったことを示す。これは、構成的サイトカイン受容体シグナル伝達がＣＡＲ－Ｔ細胞の効力を増強することを示す。

図８ａ～８ｂは、１：２のＥ：Ｔ比でのＴｐｏＲ ＴＭ二重（図８ａ）および三重変異体（図８ｂ）の細胞傷害活性を示す。一次応答の間、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、サイトカイン受容体の活性に関係なく、標的の細胞を同等に効果的に排除した。しかしながら、新しいターゲットで再チャレンジした場合、構成的に活性なキメラサイトカイン受容体を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞のみが機能を維持し、構成的サイトカイン受容体シグナル伝達がＣＡＲ－Ｔ細胞応答の持続性を増強することを示す。

実施例５：構成的サイトカイン受容体は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性を増強し、ＣＡＲ＋Ｔｓｃｍの拡大を促進した。
標的または外因性サイトカインの非存在下でのＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性に対する構成的サイトカイン受容体シグナル伝達の増強効果を確認するために、増殖因子非依存性アッセイを実施した。簡潔に述べると、全てのサンプルにわたるＣＡＲ－Ｔ細胞のパーセンテージは、非形質導入（ＮＴＤ）Ｔ細胞の添加により、最も低い形質導入効率（３５．７％）のサンプルに対して正規化された。１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、および２０～２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む４ｍＬのＲＰＭＩ中に０．２５×１０⁶／ｍＬのＣＡＲ担持Ｔ細胞の細胞。次に、細胞をＴ２５組織培養フラスコに播種した。陽性対照として、外因性ヒトＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍＬ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を、構成的サイトカイン受容体シグナル伝達を欠くＣＡＲ－Ｔ細胞（野生型ＴｐｏＲ（４７８～５８２））に添加した。各条件から２００ｕＬの２重のサンプルを回収し、Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して染色した。サンプルを、ＰＢＳで洗浄し、Ｆｃでブロックし、次いで、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで希釈した以下の抗体カクテルで染色した：ＢＵＶ３９５複合体化抗ヒトＣＤ３、ＢＶ５１０複合体化抗ヒトＣＤ８、ＢＶ６０５複合体化ヒトＣＤ４およびＦＩＴＣ複合体化ｖ５タグ（ＣＡＲ検出用）、ＰＥ／Ｃｙ７複合体化抗ヒトＣＤ６２Ｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＢＶ７８５複合体化抗ヒトＣＤ４５ＲＯ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。最後に、サンプルをＰＢＳにおいて洗浄し、細胞ペレットをＦＡＣＳ分析の前に、１２３ｃｏｕｎｔ ｅＢｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）（１２０ｕＬのＰＢＳ＋１％ＢＳＡにおける１０ｕＬの計数ビーズ）を含有する１３０ｕＬのＰＢＳ＋１％ＢＳＡに再懸濁させた。

図９は、増殖因子非依存性アッセイにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞の経時的な濃縮を示す。野生型ＴｐｏＲ ＴＭ（ＴｐｏＲ（４７８～５８２）ならびにＴｐｏＲ ＴＭ単一変異体（ＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｓ５０５Ｎ）およびＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｗ５１５ＫＮ））を担持するＣＡＲ－Ｔ細胞は濃縮されなかったが、ＴｐｏＲ ＴＭ二重変異体および三重変異体を担持するＣＡＲ－Ｔ細胞は経時的に濃縮され、構成的サイトカイン受容体シグナル伝達を受けたＣＡＲ担持Ｔ細胞が優先的に生存したことを示す。

図１０ａ～１０ｂは、増殖因子非依存性アッセイにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞の経時的な拡大倍率を示す。拡大倍率は、各時点でのＣＡＲ－Ｔ細胞の絶対数をアッセイの０日目のＣＡＲ－Ｔ細胞の数に正規化することによって決定された。図１０ａは、サイトカイン受容体シグナル伝達を生産的に活性化できなかったＴｐｏＲ ＴＭ単一変異体が、野生型ＴｐｏＲ ＴＭ（ＴｐｏＲ（４７８～５８２））を担持するＣＡＲ－Ｔ細胞と同じ速度で減少したことを示す。対照的に、図１０ｂは、ＴｐｏＲ ＴＭ二重変異体または三重変異体を担持するＣＡＲ－Ｔ細胞が、標的および外因性サイトカインの非存在下で延長された生存を有したことを示す。低ＩＬ－２条件で拡大したＴｐｏＲ ＴＭ二重変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞は、標準的なＩＬ－２条件で増殖した対応物と比較して、持続性の増加を示した。低および標準のＩＬ－２条件で製造されたＴｐｏＲ ＴＭ三重変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞は、持続性において同等の中間的な増強を示した。特に、ＴｐｏＲの二重および三重変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞はより長く持続したが、最終的には減少し、構成的サイトカイン受容体シグナル伝達がＣＡＲ－Ｔ細胞の不死化または形質転換をもたらす可能性は低いことを示している。

図１１は、増殖因子非依存性アッセイにおけるＣＡＲ＋Ｔ細胞間のメモリーＴ細胞サブセットの経時的な分布を示す。野生型ＴｐｏＲ ＴＭ（ＴｐｏＲ（４７８～５８２））と比較して、構成的に活性なサイトカイン受容体を担持するＣＡＲ－Ｔ細胞（この場合、低ＩＬ－２条件で拡大したＴｐｏＲ ＴＭ三重変異体である）は、長寿命の抗腫瘍免疫を媒介するサブセットである幹細胞メモリーＴ細胞（Ｔｓｃｍ）の絶対数の拡大を示す。特に、ＴｐｏＲ ＴＭ三重変異体からの構成的シグナル伝達は、Ｔｓｃｍ ＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大において、外因性のヒトＩＬ－７補充よりも効果的であった。

実施例６：構成的サイトテールは、目的のシグナル伝達経路を活性化するように調整することができる
ＣＡＲ－Ｔ細胞の運命と機能を調節するサイトカインの能力は、さまざまな下流のシグナル伝達経路を誘発する能力に由来する。例えば、ＩＬ－７／ＩＬ－２／ＩＬ－１５を介したＳＴＡＴ５の活性化は、Ｔ細胞の生存と拡大を促進するが、ＩＬ－１２を介したＳＴＡＴ４の活性化は、短命のエフェクターへの最終分化を促進する。より広範囲のサイトカインシグナルを模倣できる動員ドメイン（すなわち、サイトテール）を設計することは、ユーザーがプログラム可能なシグナル伝達結果に柔軟性を提供し、それによってＣＡＲ－Ｔ細胞の運命と機能の制御をもたらす。

ＣＡＣＣＲが追加のサイトカイン受容体を介して媒介されるシグナルを伝達できるかどうかを調べるために、図３のＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）サイトテールをＩＬ２ＲｂまたはＩＬ１２Ｒｂ２の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する代替サイトテールに置き換えた。次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞レポーターアッセイを使用して、これらのキメラのシグナル伝達能力を評価した。簡単に説明すると、２０，０００のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ポリ－Ｌ－リジン被覆された９６ウェルの平底プレートの各ウェル中に播種し、一晩接着させた。サイトカイン受容体－ＣＡＲコンストラクト（２．５ｎｇ）、ホタルルシフェラーゼ（１００ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を駆動するＳｔａｔ応答エレメント、およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ対照レポーターベクター（１ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に５ｕＬの最終体積で混合した（「ＤＮＡ混合物」）。陰性対照として、全てのサイトカインシグナル伝達ドメインを欠くＢＦＰ－ＣＡＲコンストラクト、または膜貫通型変異を欠くため構成的にシグナル伝達できないＴｐｏＲ（４７８～５８２）．ＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）コンストラクトのいずれかを細胞にトランスフェクトした。５ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭにおいて０．３ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で５分間インキュベートし、次いで、ＤＮＡ混合物に添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートし、１０ｕＬの総量をＨＥＫ－２９３Ｔを含む各ウェルに添加した。トランスフェクションの４８時間後、それぞれのＳｔａｔレポーターの活性を、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価した。Ｓｔａｔ５レポーター活性の誘導倍率は、対照ＢＦＰ－ＣＡＲコンストラクトでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の誘導倍率に正規化された。

図１２は、異なるシグナル伝達ドメインを担持するコンストラクトが、異なるＳＴＡＴ経路を優先的に活性化することを示す。具体的には、ＩＬ２Ｒｂ（３３３～５５１）とＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）はＳＴＡＴ５を活性化し、ＩＬ１２Ｒｂ２（７１４～８６２）はＳＴＡＴ４を活性化し、それぞれの親受容体に期待されるシグナル伝達を反映している。これは、ＣＡＣＣＲをプログラムして、目的のシグナル伝達ドメインと融合することにより、所望のシグナル伝達経路を活性化できることを示している。さらに、図３と一致して、ＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ）二量体化ドメインを担持するＣＡＣＣＲは、それらのＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｈ４９９Ｌ、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ）対応物よりも強いシグナル伝達をもたらした。したがって、ＣＡＣＣＲシグナル伝達出力の強度は、これらの二量体化ドメインのいずれかとの融合によってさらに調整することができる。

実施例７：ＣＡＣＣＲシグナリングドメインを最適化して、ベクターカーゴサイズを縮小しながらシグナル強度を調節できる
現在、ウイルスベースの遺伝子送達法（例えば、レンチウイルスおよびレトロウイルスを介した遺伝子導入）がＣＡＲ－Ｔ細胞の製造に日常的に使用されている。カーゴサイズが大きくなると、形質導入効率とＣＡＲ－Ｔ細胞の収量が減少する。したがって、カーゴのサイズを縮小することは、製造の成功を確実にするために有益である。ＣＡＣＣＲの動員／シグナリングドメインの最適化は、２つの理由でこの目的を達成するための手段を提供する。第１に、ＩＬ２Ｒｂ（３３３～５５１）の場合と同様に、サイトカイン受容体由来のシグナル伝達ドメインは、長さが２００アミノ酸超に達し、トランスファーベクターで６５０塩基対を超える可能性がある。第２に、シグナル伝達ドメイン内のチロシン残基は、下流のシグナル伝達を開始および伝播するために重要であるが、それらのいくつかは、シグナル伝達の持続時間と強度を制限する負のフィードバックループに参加することもできる。したがって、サイトテールシグナル伝達ドメインをトリミングすることにより、ベクターカーゴのサイズを縮小できるだけでなく、サイトテールシグナル伝達を調節する機会も提供される。この目的のために、全長ＩＬ１２Ｒｂ２（７１４～８６２）およびＩＬ２Ｒｂ（３３１～５５１）尾部内のチロシン残基を特定し、バリアントを生成して、サイトテールシグナル伝達を媒介できる短縮型コンストラクトを同定した。

全長ＩＬ１２Ｒｂ２（７１４～８６２）には、２つのリン酸化可能なチロシン残基、Ｙ７６７およびＹ８００が含まれており、これらは下流のシグナル伝達に関与し得る。Ｙ８００のみを含む短縮型ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５－８２５）尾部を生成し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞レポーターアッセイを使用してＳＴＡＴ４を活性化する能力を評価した。簡単に説明すると、２０，０００のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ポリ－Ｌ－リジン被覆された９６ウェルの平底プレートの各ウェル中に播種し、一晩接着させた。ＣＡＣＣＲ－ＣＡＲコンストラクト（２．５ｎｇ）、ホタルルシフェラーゼ（１００ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を駆動するＳｔａｔ応答エレメント、およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ対照レポーターベクター（１ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に５ｕＬの最終体積で混合した（「ＤＮＡ混合物」）。陰性対照として、全てのサイトカインシグナル伝達ドメインを欠くＢＦＰ ＣＡＲコンストラクトを細胞にトランスフェクトした。５ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭにおいて０．３ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で５分間インキュベートし、次いで、ＤＮＡ混合物に添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートし、１０ｕＬの総量をＨＥＫ－２９３Ｔを含む各ウェルに添加した。トランスフェクションの４８時間後、Ｓｔａｔ４レポーターの活性を、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価した。Ｓｔａｔ４レポーター活性の誘導倍率は、対照ＢＦＰ－ＣＡＲコンストラクトでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の誘導倍率に正規化された。

図１３Ａ～Ｂは、全長ＩＬ１２Ｒｂ２（７１４－８６２）サイトテールに匹敵するＳＴＡＴ４活性化が可能な短縮型ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５～８２５）サイトテールの同定を示す。図１３Ａは、全長ＩＬ１２Ｒｂ（７１４～８６２）尾部および短縮型ＩＬ１２Ｒｂ（７７５～８２５）サイトテールの概略図を示す。各尾部に含まれるチロシン残基（Ｙ）の位置は示されている通りである。図１３Ｂは、より強力なＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ）二量体化ドメインに融合すると、短縮型ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５～８２５）サイトテールが全長ＩＬ１２Ｒｂ２（７１４～８６２）サイトテールのＳＴＡＴ４シグナル伝達強度を完全に再現したことを示す。より弱いＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｈ４９９Ｌ、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ）二量体化ドメインに融合すると、短縮型ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５～８２５）サイトテールは、全長ＩＬ１２Ｒｂ２（７１４～８６２）サイトテールのＳＴＡＴ４シグナル伝達強度を部分的に再現した。

全長ＩＬ２Ｒｂ（３３３～５５１）サイトテールには、下流のシグナル伝達に関与し得る６つのチロシン残基が含まれている。これらのうち、Ｙ３６４（受容体の膜貫通ドメインに最も近いチロシン残基）は、ＰＩ３Ｋを活性化してＴ細胞の分化と増殖を促進し、細胞骨格の再編成を促進して受容体の内在化を誘導することが報告されている。したがって、Ｙ３６４はＴ細胞エフェクター機能を促進することが可能であり、ＩＬ２Ｒｂシグナル伝達の強度と持続時間を制限することも可能である。６つのチロシン残基から３つ（Ｙ３６４、Ｙ４１８、およびＹ４３６）、または６つのチロシン残基から２つ（Ｙ４１８およびＹ４３６）を含む短縮型ＩＬ２Ｒｂサイトテールを生成し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞レポーターアッセイを使用してＳＴＡＴ５を活性化する能力を評価した。簡単に説明すると、２０，０００のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ポリ－Ｌ－リジン被覆された９６ウェルの平底プレートの各ウェル中に播種し、一晩接着させた。ＣＡＣＣＲ－ＣＡＲコンストラクト（２．５ｎｇ）、ホタルルシフェラーゼ（１００ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を駆動するＳｔａｔ応答エレメント、およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ対照レポーターベクター（１ｎｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に５ｕＬの最終体積で混合した（「ＤＮＡ混合物」）。陰性対照として、全てのサイトカインシグナル伝達ドメインを欠くＢＦＰ ＣＡＲコンストラクトを細胞にトランスフェクトした。５ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭにおいて０．３ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で５分間インキュベートし、次いで、ＤＮＡ混合物に添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートし、１０ｕＬの総量をＨＥＫ－２９３Ｔを含む各ウェルに添加した。トランスフェクションの４８時間後、Ｓｔａｔ５レポーターの活性を、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価した。Ｓｔａｔ５レポーター活性の誘導倍率は、対照ＢＦＰ－ＣＡＲコンストラクトでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の誘導倍率に正規化された。

図１４Ａ～Ｂは、全長ＩＬ２Ｒｂ（３３３～５５１）尾部と比較して同等またはそれ以上のＳＴＡＴ５活性化が可能な短縮型ＩＬ２Ｒｂ尾部の同定を示す。図１４Ａは、全長ＩＬ２Ｒｂ（３３３～５５１）尾部および２つの短縮型ＩＬ２Ｒｂ尾部の概略図を示す。各尾部に含まれるチロシン残基（Ｙ）の位置は示されている通りである。点線は、短縮型尾部から削除された全長ＩＬ２Ｒｂ（３３３～５５１）尾部の相互結合領域を表す。図１４Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞レポーターアッセイの結果を示し、ここでは、全長ＩＬ２Ｒｂ（３３３～５５１）のＳＴＡＴ５シグナル伝達が、Ｙ３６４、Ｙ４１８、およびＹ５３６を含むＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｈ４９９Ｌ、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ）ＩＬ２Ｒｂ（３３９～３７９、３９３～４３３、５１８～５５１）サイトテールによって完全に再現される。ＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ）．ＩＬ２Ｒｂ（３９３～４３３、５１８～５５１）サイトテールでは、受容体の内部移行を仲介するＹ３６４をさらに除去すると、ＳＴＡＴ５のシグナル伝達強度が劇的に向上した。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞アッセイは、サイトテールトランスフェクションから４８時間以内に読み取り値が測定される短期アッセイである。それはサイトテール活性の効率的なスクリーニングプラットフォームを提供するが、このアッセイの限られた期間は、長期の構成的サイトカインおよびサイトテールシグナル伝達に続いて引き起こされる負のフィードバックループの複雑さを反映していない。減少型ＩＬ２Ｒｂ尾部バリアントの長期シグナル伝達活性をより正確に評価するために、２週間の生産プロセスを使用してＣＡＣＣＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成し、細胞内フローサイトメトリーによってＳＴＡＴ５の活性化を評価した。この目的のために、ＣＡＣＣＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、５％ＣＯ₂で３７℃で加湿インキュベーター中で４時間、１００ｕＬの無血清ＲＰＭＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で血清飢餓した。陽性対照として、外因性組換えヒトＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を４時間の血清飢餓の最後の３０分間に添加した。４時間後、ＢＵＶ３９５コンジュゲート抗ヒトＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＦＩＴＣコンジュゲートｖ５タグモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を含む抗体カクテルを、細胞に添加し、最後の２０分間インキュベートした。次いで、各１００ｕＬサンプルに３５ｕＬの１６％パラホルムアルデヒドを添加し、３７℃で１５分間インキュベートして細胞を固定した。次いで、細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、－２０％で１または２晩１００％冷メタノールで透過処理した。ＦＡＣＳ分析の日に、細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、Ｆｃでブロッキングし、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡにおいて希釈されたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７複合体化抗マウス／ヒトＳｔａｔ５（ｐＹ６９４）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。暗所における室温での１時間のインキュベーション後、細胞を、ＦＡＣＳ分析前に３回洗浄した。

図１５は、全長または短縮型ＩＬ２Ｒｂサイトテールを担持する初代ＣＡＣＣＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５活性化を示す。最大のＳＴＡＴ５活性化は、Ｙ３６４内在化モチーフを欠いた短縮型ＩＬ２Ｒｂ（３９３～４３３、５１８～５５１）サイトテールを担持するＣＡＣＣＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞によって誘発された。中間のＳＴＡＴ５活性化は、短縮型ＩＬ２Ｒｂ（３３９～３７９、３９３～４３３、５１８～５５１）サイトテールを担持するＣＡＣＣＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞で観察された。同じ培養内のＣＡＲ陰性集団ではＳＴＡＴ５の活性化は観察されず、サイトテールシグナル伝達のＣＡＲ－Ｔ細胞特異的性質を示している。特に、全長ＩＬ２Ｒｂ（３３３～５５１）サイトテールを担持するＣＡＣＣＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞では、ＳＴＡＴ５活性はほとんどまたはまったく検出されなかった。これは、全長ＩＬ２Ｒｂ（３３３～５５１）サイトテールに存在する他の３つのチロシン残基が原因である可能性があり、長期的な負の調節を誘発する可能性がある。したがって、そのような負の調節モチーフを排除するためのサイトテールシグナル伝達ドメインの最適化は、構成的かつ生産的なシグナル伝達が長期的に維持されることを確実にするために有益である。強いサイトテールは強い負のフィードバック応答を誘発する可能性があるため、長期的な刺激には弱いサイトテールが好ましくあり得る。

実施例７：最適化されたＩＬ２Ｒｂ由来のサイトテールは、ＩＬ－２ではなくＩＬ－１５のシグナル伝達をより厳密に模倣する
ＩＬ－２とＩＬ－１５は、共通ガンマ鎖とＩＬ２Ｒｂで構成されるヘテロ二量体サイトカイン受容体を介して天然でシグナルを伝達する２つのサイトカインである。同じ天然の受容体を共有しているにもかかわらず、ＩＬ－２とＩＬ－１５はＴ細胞の分化と持続性に異なる影響を及ぼす。ＩＬ－２は短命のエフェクター分化を誘導するが、ＩＬ－１５は長命のメモリーＴ細胞の生成を促進する。さらに、ＩＬ－１５の血清濃度の上昇は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法に対する患者の応答と正の相関があることが示されている。したがって、ＩＬ－２ではなくＩＬ－１５のシグナル伝達と効果を模倣するサイトテールが好ましい。本発明者らは、減少型ＩＬ２ＲｂサイトテールがＩＬ－２またはＩＬ－１５シグナル伝達をより厳密に模倣しているかどうかを判断しようとした。

この目的のために、本発明者らは、リツキシマブミモトープ、４－１ＢＢおよびＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインに結合された、ＢＣＭＡに向けられたＰ５Ａ２ ｓｃＦｖを担持する例示的なＣＡＲを含むＣＡＲ－Ｔ細胞を利用した（参照により本明細書に組み込まれるＵＳ１０，２９４，３０４を参照されたい）。短縮型ＩＬ２Ｒｂ尾部を共発現するＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞が生成され、それらの遺伝子発現プロファイルは、外因性組換えヒトＩＬ－２またはＩＬ－１５に曝露された対照ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較された。ＣＡＣＣＲおよびＣＡＲをコードするレンチウイルスを作製するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの前日に、６ウェルプレートのウェルあたり１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充した２ｍＬのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中にｍＬあたり４５万細胞で播種した。トランスフェクションの日に、レンチウイルスを、６ウェルプレートのウェルあたり２５０ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）においてレンチウイルスパッケージングベクター１．５ｕｇのｐｓＰＡＸ２、０．５ｕｇのｐＭＤ２Ｇ、０．５ｕｇの適切なＣＡＲベクターを一緒に混合することによって調製した（「ＤＮＡ混合物」）。２５０ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭにおいて１０ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で５分間インキュベートし、次いで、ＤＮＡ混合物に添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートし、５００ｕＬの総量をＨＥＫ２９３Ｔを含むウェルの側面にゆっくりと添加した。トランスフェクションの１日後に、６ウェルプレートにおけるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の各ウェルからの培地を、ウェルあたり２ｍＬのＴ細胞形質導入培地、すなわち、１０％ＦＢＳを補充したＸ－Ｖｉｖｏ－１５で置き換えた。トランスフェクションの２日後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からレンチウイルス上清を回収し、０．４５ミクロンフィルター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して細胞残屑を除去し、粗レンチウイルス上清をＴ細胞形質導入に直接使用した。０日目に、精製されたＴ細胞を、１００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で補充されたＸ－ｖｉｖｏ－１５培地（Ｌｏｎｚａ）において、Ｇｒｅｘ－２４プレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ番号８０１９２Ｍ）を補充したＸ－Ｖｉｖｏ－１５培地（Ｌｏｎｚａ）において、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、およびヒトＴ ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－１１１－１６０、１：１００希釈）で活性化した。２日目に、Ｔ細胞をＴ細胞形質導入培地に５０万細胞／ｍＬで再懸濁し、Ｇｒｅｘ－２４プレートに１００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ－２とともに等量の粗レンチウイルス上清で形質導入した。５日目に、使用済み培地をＴ細胞拡大培地、すなわち５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）と１００ＩＵ／ｍＬヒトＩＬ－２を補充したＸ－Ｖｉｖｏ－１５に置き換えることにより、サイトテール発現ＣＡＲ－Ｔ細胞を培養した。このとき、サイトテールを欠く対照ＣＡＲ－Ｔ細胞は、１００Ｕ／ｍＬヒトＩＬ－２のみ、または１００Ｕ／ｍＬヒトＩＬ－２と１０ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ－１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）のいずれかで拡大した。細胞を、Ｔ細胞拡大培地とそれぞれの濃度の組換えサイトカインを使用して、必要に応じてより大きなＧ－Ｒｅｘ容器（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）中で拡大した。１３日目に、細胞をＺｏｍｂｉｅ ＮＩＲ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、ＢＵＶ３９５コンジュゲートＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＰ５Ａ２ ｓｃＦｖに特異的な抗イディオタイプ抗体で標識し、次いで、ＦＡＣＳで選別してＣＡＲ＋Ｔ細胞を濃縮した。次いで、選別されたＣＡＲ＋Ｔ細胞をＧｒｅｘ－２４プレートでＴ細胞拡大培地でさらに２日間培養し、ＣＡＣＣＲ ＣＡＲ＋Ｔ細胞を外因性サイトカインの非存在下に残し、選別された対照ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、外因性の非存在下サイトカイン、１００Ｕ／ｍＬヒトＩＬ－２で処理、または１０ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ－１５で処理のいずれかに残した。１５日目に、Ｅａｓｙ Ｓｅｐ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して生きているＣＡＲ＋Ｔ細胞を濃縮し、その後のＲＮＡ抽出とＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ遺伝子発現分析（Ｈｕｍａｎ ＣＡＲ－Ｔ Ｐａｎｅｌ；ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のために細胞ペレットを急速凍結した。

データは、短縮型ＩＬ２Ｒｂ尾部を担持するＣＡＣＣＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＩＬ－２ではなくＩＬ－１５のシグナル伝達をより厳密に模倣することを示す。例として、サイトテールＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ）．ＩＬ２Ｒｂ（３９３～４３３、５１８～５５１）、およびＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｈ４９９Ｌ、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ）を試験した。ＩＬ２Ｒｂ（３３９～３７９、３９３～４３３、５１８～５５１）．図１６Ａは、サンプル調製のための実験計画およびワークフローの概略図である。図１６Ｂは、１３～１５日目からＩＬ－２で処理された対照ＣＡＲ－Ｔ細胞の遺伝子発現プロファイルと比較した、ＣＡＣＣＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞の遺伝子発現プロファイルを示す。図１６Ｃは、１３～１５日目からＩＬ－１５で処理された対照ＣＡＲ－Ｔ細胞の遺伝子発現プロファイルと比較した、ＣＡＣＣＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞の遺伝子発現プロファイルを示す。各サンプルのＬｏｇ２変化倍率（ＦＣ）は、１３～１５日目からの未処理のままにされた対照ＣＡＲ－Ｔ細胞に対する正規化によって計算された。線形回帰分析によって決定されるＲ²値と最良適合線（実線）は、各グラフに示される。示されているデータは、２人のドナーの代表的なものである。ＣＡＣＣＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞の遺伝子発現プロファイルはＩＬ－２処理サンプルとの相関を示さなかったが（図１６Ｂ）、ＩＬ－１５処理サンプルとは正の相関を示した（図１６Ｃ）。これらは、短縮型ＩＬ２Ｒｂ尾部を担持するサイトテールが、ＩＬ－２ではなくＩＬ－１５の下流のシグナル伝達および転写応答をより厳密に模倣していることを示唆する。

実施例９：構成的サイトテールはコンビナトリアルシグナル伝達出力用にプログラムできる
図１２に示されるように、様々なサイトカイン受容体に由来するシグナル伝達ドメインを担持するＣＡＣＣＲは、親受容体を連想させるシグナル伝達を活性化することができる。サイトテールは、１つを超えるサイトテールをタンデムで融合することにより、複数の親受容体からの同時シグナル伝達を模倣するように設計でき、コンビナトリアルシグナル伝達の結果を達成できると仮定した。タンデムサイトテールからのコンビナトリアルシグナル伝達出力を試験するために、ＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）サイトテールを短縮型ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５～８２５）サイトテールと融合することにより、構成的７．１２ｔａｉｌを生成し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞レポーターアッセイを使用してシグナル伝達を評価した。

図１７Ａ～Ｄは、７．１２ｔａｉｌによって例示されるような、構成的タンデムサイトテールの設計およびシグナル伝達能力を示す。図１７Ａは、構成的７．１２ｔａｉｌの概略図を示す。図１７Ｂは、７．１２ｔａｉｌバリアントおよびＣＡＲを共発現するために使用される、それらのＴｐｏＲ（４７８～５８２）二量体化／ＪＡＫ結合ドメインのみが異なるレンチウイルスベクターの概略図を示す。図１７Ｃ～Ｄは、それぞれ、示されたサイトテールに融合された、ＴｐｏＲ（４７８～５８２；Ｓ５０５Ｎ；Ｗ５１５Ｋ）およびＴｐｏＲ（４７８～５８２；Ｈ４９９Ｌ；Ｓ５０５ＮＷ５１５Ｋ）二量体化／ＪＡＫ結合ドメインをそれぞれ担持するコンストラクトのＳＴＡＴレポーター活性を示す。ＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）サイトテールはＳＴＡＴ５を強力に活性化したが、ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５～８２５）サイトテールはＳＴＡＴ４を強力に活性化した。しかしながら、ＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）で観察されたように、両方のサイトテールをタンデムで融合させたＩＬ１２Ｒｂ２（７７５～８２５）サイトテールは、ＳＴＡＴ５とＳＴＡＴ４の両方を同時にコンビナトリアルに活性化した。これは、通常２つ以上の異なる負のサイトカイン受容体を必要とする複数のシグナル伝達経路が単一のサイトテールで達成できることを示す。

実施例１０：構成的サイトテールは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型と機能を指示するために単一または複数の出力で調整することができる
次に、異なるシグナル伝達出力を担持する構成的サイトテールが、初代ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型と機能に異なる影響を及ぼし得るかあるかどうかを判断した。Ｔ細胞の生存とメモリーの維持を促進するＩＬ－７とは異なり、ＩＬ１２はＴ細胞の分化を促進する炎症性サイトカインである。したがって、ＩＬ７ＲａまたはＩＬ１２Ｒｂ由来のサイトテールを介したシグナル伝達がこれらの異なる表現型を差次的に指示できるかどうかを調べ、両方の尾部をタンデムで融合することの正味のコンビナトリアル効果を評価しようとした。

この目的のために、７ｔａｉｌ（すなわちＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９））または１２ｔａｉｌのバリアント（すなわちＩＬ１２Ｒｂ２（７７５～８２５）もしくはＩＬ１２Ｒｂ２（７１４～８６２））のいずれかを共発現するヒト初代ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成した。図１３Ａを参照されたい。ＣＡＣＣＲおよびＣＡＲをコードするレンチウイルスを作製するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの前日に、６ウェルプレートのウェルあたり１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充した２ｍＬのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中にｍＬあたり４５万細胞で播種した。トランスフェクションの日に、レンチウイルスを、６ウェルプレートのウェルあたり２５０ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）においてレンチウイルスパッケージングベクター１．５ｕｇのｐｓＰＡＸ２、０．５ｕｇのｐＭＤ２Ｇ、０．５ｕｇの適切なＣＡＲベクターを一緒に混合することによって調製した（「ＤＮＡ混合物」）。２５０ｕＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭにおいて１０ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で５分間インキュベートし、次いで、ＤＮＡ混合物に添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートし、５００ｕＬの総量をＨＥＫ２９３Ｔを含むウェルの側面にゆっくりと添加した。トランスフェクションの１日後に、６ウェルプレートにおけるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の各ウェルからの培地を、ウェルあたり２ｍＬのＴ細胞形質導入培地、すなわち、１０％ＦＢＳを補充したＸ－Ｖｉｖｏ－１５で置き換えた。トランスフェクションの２日後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からレンチウイルス上清を回収し、０．４５ミクロンフィルター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して細胞残屑を除去し、粗レンチウイルス上清をＴ細胞形質導入に直接使用した。０日目に、精製されたＴ細胞を、１００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で補充されたＸ－ｖｉｖｏ－１５培地（Ｌｏｎｚａ）において、Ｇｒｅｘ－２４プレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ番号８０１９２Ｍ）を補充したＸ－Ｖｉｖｏ－１５培地（Ｌｏｎｚａ）において、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、およびヒトＴ ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－１１１－１６０、１：１００希釈）で活性化した。２日目に、Ｔ細胞をＴ細胞形質導入培地に５０万細胞／ｍＬで再懸濁し、Ｇｒｅｘ－２４プレートに１００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ－２とともに等量の粗レンチウイルス上清で形質導入した。５日目に、使用済み培地をＴ細胞拡大培地、すなわち５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）と１００ＩＵ／ｍＬヒトＩＬ－２を補充したＸ－Ｖｉｖｏ－１５に置き換えることにより、細胞を培養した。細胞を、Ｔ細胞拡大培地とそれぞれの濃度のヒトＩＬ－２を使用して、必要に応じてより大きなＧ－Ｒｅｘ容器（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）中で拡大した。１４日目に、ＣＡＲ－Ｔ細胞産物のメモリー表現型解析は、フローサイトメトリーによって、ＰＥ／Ｃｙ７コンジュゲートＣＤ６２Ｌ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＢＶ７８５コンジュゲートＣＤ４５ＲＯ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）との共染色とともに、ＦＩＴＣコンジュゲートｖ５タグモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してＣＡＲ形質導入細胞を検出することによって実施された。ＣＡＣＣＲシグナル伝達を欠いた陰性対照として、ＢＦＰまたは７ｔａｉｌに結合した野生型ＴｐｏＲ（４７８～５８２）膜貫通ドメインを共発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を並行して生成した。

図１８は、ＣＡＲ－Ｔ細胞産物のメモリー分化に対するサイトテールの影響を示す。２人の健康なドナーから生成された１４日目のＣＡＣＣＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞産物のメモリー表現型が示されている。ＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）サイトテールを共発現するＣＡＲ－Ｔ細胞は幹細胞メモリー（Ｔｓｃｍ）集団を保持したが、ＩＬ１２Ｒｂ２由来のサイトテールを担持するＣＡＲ－Ｔ細胞は、中央メモリー（Ｔｃｍ）集団の増加を伴うＴｓｃｍ集団の顕著な減少を示した。これらは、ＣＡＲの関与がない場合、ＩＬ１２Ｒｂ２由来のサイトテールを介した構成的ＩＬ１２様シグナル伝達が、ＴｓｃｍからＴｃｍへの進行性の分化を促進することを示唆した。さらに、タンデムＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）を共発現するＣＡＲ－Ｔ細胞。ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５～８２５）サイトテールは、Ｔｓｃｍ集団の回復を示し、単一のＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）サイトテールを担持するＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型を模倣した。これは、単一のサイトテールの負の影響が、タンデムサイトテールのコンビナトリアルシグナル伝達によって軽減できることを示している。

さらに、ＣＡＣＣＲシグナル伝達が、生存および細胞傷害性を含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能的結果を導くことができるかどうかを調査した。長期のＴ細胞生存を促進するＩＬ－７シグナル伝達と比較して、ＩＬ－１２シグナル伝達は代わりに短命の最終分化エフェクターへの分化を促進する。これをサポートするために、長期生存が可能であり、長期のＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性を媒介すると考えられているＴｓｃｍ集団は、ＩＬ１２Ｒｂ２由来の尾部を担持するＣＡＲ－Ｔ細胞ではほとんどなかった。異なるサイトテールを介したシグナル伝達がＣＡＲ－Ｔ細胞の生存と分化をプログラムできるかどうかを調べるために、ＣＡＣＣＲを共発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を標的細胞または外因的に補充されたサイトカインの非存在下で培養する増殖因子非依存性アッセイを実施した。これらの条件下で、ＣＡＲ－Ｔ細胞数とメモリー分化を経時的にモニターした。

簡潔に述べると、凍結保存されたＣＡＲ－Ｔ細胞を解凍して数え、全てのサンプルにわたるＣＡＲ－Ｔ細胞のパーセンテージは、非形質導入（ＮＴＤ）Ｔ細胞の添加により、最も低い形質導入効率のサンプルに対して正規化された。対照として、サイトテールの代わりにＢＦＰを共発現するＣＡＲ－Ｔ細胞（ＢＦＰ ＣＡＲ）を使用した。１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、および２０～２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｃｏｎを含む１．５ｍＬのＲＰＭＩ中に０．２５×１０⁶のＣＡＲ＋Ｔ細胞／ｍＬを、２４ウェル組織培養プレートに播種した。示された日に、各条件から１００ｕＬの複製サンプルを採取し、Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して染色した。サンプルを、ＰＢＳで洗浄し、Ｆｃでブロックし、次いで、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで希釈した以下の抗体カクテルで染色した：ＢＵＶ３９５複合体化抗ヒトＣＤ３、ＢＶ５１０複合体化抗ヒトＣＤ８、ＢＶ６０５複合体化ヒトＣＤ４およびＦＩＴＣ複合体化ｖ５タグ（ＣＡＲ検出用）、ＰＥ／Ｃｙ７複合体化抗ヒトＣＤ６２Ｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＢＶ７８５複合体化抗ヒトＣＤ４５ＲＯ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。最後に、サンプルをＰＢＳにおいて洗浄し、細胞ペレットをＦＡＣＳ分析の前に、１２３ｃｏｕｎｔ ｅＢｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）（１２０ｕＬのＰＢＳ＋１％ＢＳＡにおける１０ｕＬの計数ビーズ）を含有する１３０ｕＬのＰＢＳ＋１％ＢＳＡに再懸濁させた。

図１９Ａ～Ｂは、２人のドナー由来の細胞の代表的なデータを示す。図１９Ａおよび図１９Ｂは、それぞれ、示されたサイトテールに融合されたＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ）およびＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｈ４９９Ｌ、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ）二量体化／ＪＡＫ結合ドメインを担持するコンストラクトについて、アッセイの開始時（０日目）の入力と比較した、ＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大倍率を示す。対照ＢＦＰ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）サイトテールを担持するＣＡＲ－Ｔ細胞はより遅い速度で減少し、ＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）サイトテールを介した構成的シグナル伝達がＣＡＲ－Ｔ細胞の生存を改善したことを示している。対照的に、ＩＬ１２Ｒｂ２由来のサイトテールを担持するＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＢＦＰ ＣＡＲ－Ｔ細胞により匹敵する速度で減少し、延命効果を欠くことを示唆している。特に、タンデムＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）を担持するＣＡＲ－Ｔ細胞。ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５～８２５）サイトテールは、ＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）サイトテールにより匹敵する延命効果をもたらした。図１９Ｃ～Ｄは、それぞれ、示されたサイトテールに融合された、ＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ）およびＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｈ４９９Ｌ、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ）二量体化／ＪＡＫ結合ドメインを担持するコンストラクトの増殖因子非依存性アッセイの７日目のＣＡＲ－Ｔ細胞分化を示す。対照ＢＦＰ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＩＬ１２Ｒｂ２由来サイトテールを担持するＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）サイトテールを担持するＣＡＲ－Ｔ細胞は、より豊富であるだけでなく、Ｔｓｃｍ集団においてより豊富であった。図１９Ｃ～Ｄを参照されたい。タンデムＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５～８２５）サイトテールを担持するＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｔｓｃｍ濃縮を改善した。特定のメカニズムに限定されることなく、結果は、ＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）サイトテールとの融合が単一のＩＬ１２Ｒｂ２（７７５～８２５）サイトテールの表現型を無効にしたことを示唆している。まとめると、これらのデータは、タンデムサイトテールシグナル伝達のコンビナトリアル機能効果を繰り返し、異なるサイトテールコンストラクトの調整可能性を示している。

Ｔｓｃｍ集団が豊富なＣＡＲ－Ｔ細胞産物は、拡大、持続性、および活性の改善に関連している。しかしながら、最終分化したＣＡＲ－Ｔ細胞は短命であり、増殖の可能性が限られているため、有効性が低下する。これらの特性がＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）およびＩＬ１２Ｒｂ２由来のサイトテールによって異なった影響を受けたことを考慮し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性に影響を及ぼすこれらのサイトテールの能力を評価した。

この目的のために、５，０００のＵ８７ＫＯ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｎｕｃＧＦＰ標的細胞を、播種し、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、および２０～２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する５０ｕＬのＲＰＭＩにおいて黒色の壁および平坦で透明な底を有する９６ウェルプレートにおいて付着することを可能にした。ＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）またはＩＬ１２Ｒｂ由来のサイトテールを担持するＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ（２１７３ ｓｃＦｖ）Ｔ細胞を解凍し、１：３のＥ：Ｔ比で播種された標的細胞に添加した。標的細胞はＣＡＲ－Ｔ細胞よりも多いため、標的細胞の増殖を制御するには、ＣＡＲ－Ｔ細胞を繰り返しまたは連続して殺傷する必要がある。対照として、サイトテールの代わりにＢＦＰ ＣＡＲを共発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を使用した。経時的な生きている標的細胞の数は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞解析イメージングシステムを介してモニターされた。

図２０Ａ～２０Ｂは、様々なＣＡＣＣＲを共発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害活性を示す。図２０Ａ～Ｂは、それぞれ、示されたサイトテールに融合された、ＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ）およびＴｐｏＲ（４７８～５８２、Ｈ４９９Ｌ、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ）二量体化／ＪＡＫ結合ドメインを担持するＣＡＣＣＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞による標的細胞クリアランスを示す。ＢＦＰ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ＩＬ１２Ｒｂ２由来のサイトテールを担持するＣＡＲ－Ｔ細胞は、おそらく増殖能が限られており寿命が短いため、インビトロでの連続殺傷活性にいくらかの活性が見られるか、またはまったく改善が見られなかった。対照的に、ＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）サイトテールを担持するＣＡＲ－Ｔ細胞は、おそらく増殖と持続性の強化により、改善された連続殺傷活性を示した。特に、タンデムＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）．ＩＬ１２Ｒｂ２（７７５～８２５）サイトテールを担持するＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）サイトテールと同等またはそれ以上の連続殺傷活性を示し、単一のサイトテール内の持続性促進のＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）シグナル伝達ドメインとエフェクター促進のＩＬ１２Ｒｂ２（７７５～８２５）シグナル伝達ドメインの組み合わせは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の寿命、拡大、および即時エフェクター機能を同時に増強できることを示唆する。

実施例１１：構成的サイトカイン受容体は、液性腫瘍標的に向けられたＣＡＲのインビトロ細胞傷害性を増強する
我々は、ＣＡＣＣＲが、膠芽腫などの固形腫瘍の標的であるＥＧＦＲｖＩＩＩに向けられたＣＡＲの活性を増強できることを実証した。ＣＡＣＣＲが血液腫瘍標的の異なるｓｃＦｖ全体に広く適用可能かどうかを判断するために、血液悪性腫瘍のマーカー（すなわち、ＢＣＭＡ）に向けられたＣＡＲコンストラクトにＣＡＣＣＲをさらにクローン化し、ＢＣＭＡ陽性標的細胞株に対する長期細胞傷害性を評価した。

ホタルルシフェラーゼとＧＦＰレポーターを安定して発現する標的細胞は、レンチウイルス形質導入によって生成された。１０，０００個のＬｕｃ－ＧＦＰ標識標的細胞を、白色の平底９６ウェル組織培養プレートにウェルあたり１００ｕＬで播種した。凍結保存されたＣＡＲ－Ｔ細胞を解凍して数え、全てのサンプルにわたるＣＡＲ－Ｔ細胞のパーセンテージは、非形質導入（ＮＴＤ）Ｔ細胞の添加により、最も低い形質導入効率のサンプルに対して正規化された。次いで、１００ｕＬの容量のＣＡＲ－Ｔ細胞を、示されたエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比で３重で標的細胞の各ウェルに添加した。「標的のみ」の陰性対照として、Ｔ細胞の代わりに１００μＬの培地を標的細胞に添加した。２～３日後、ウェルを穏やかにピペッティングして混合し、１００ｕＬの各Ｔ細胞含有ウェルを１０，０００個の新たにプレーティングした１００μＬのＬｕｃ－ＧＦＰ標識標的細胞を含む新しい白色の平底９６ウェル組織培養プレートに移した。「標的のみ」のウェルは、Ｔ細胞の代わりに新鮮な培地を入れた。新しいプレートを３７℃でインキュベートし、古い９６ウェルプレートに残っている生きている標的細胞の数を、ＯＮＥ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の使用説明書に従って使用して決定した。生きている標的細胞のパーセンテージは、ルシフェラーゼシグナルを「標的のみ」のウェルのシグナルに正規化することによって計算され、細胞傷害性のパーセンテージは、１００％－生きている標的細胞％として計算された。全ての細胞傷害活性が停止するまで、２日または３日ごとに新鮮な標的細胞への連続転送とルシフェラーゼの読み出しを行った。

図２１は、ＣＡＣＣＲが、液性腫瘍標的であるＢＣＭＡに向けられたＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害活性を改善したことを示す。図２１は、Ｅ：Ｔ＝１０：１でのＭＭ１．Ｓ多発性骨髄腫細胞株に対するＢＣＭＡ ＣＡＲ（Ｐ５Ａ２ ｓｃＦｖ）の細胞傷害性を示しており、ＣＡＣＣＲの共発現がＣＡＲ－Ｔ細胞の長期細胞傷害性を増加させたことを示している。

実施例１２：ＣＡＣＣＲはＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ活性を増強する
ＣＤ１９およびＢＣＭＡを標的とするようなＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、血液悪性腫瘍の治療において前例のない臨床的成功を収めている。高率の完全奏効が達成されているが、ほとんどの患者が最終的に再発するため、これは一時的なものである。さらに、ＣＡＲ－Ｔ細胞は固形腫瘍の治療においてより限定的な成功を収めている。再発と応答の欠如の理由の中には、不十分なＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大と持続性、ならびに免疫抑制微小環境によるＣＡＲ－Ｔ細胞の機能的阻害が含まれる。ＣＡＣＣＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ特性評価により、標的駆動型の増殖、持続性、効力、および疲弊プロファイルの改善が明らかになったため、次に、これらの機能強化がインビボでの抗腫瘍活性の改善につながるかどうかを調べた。

血液悪性腫瘍との関連でＣＡＣＣＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ活性を調べるために、多発性骨髄腫の同所性異種移植モデルにおいて、４－１ＢＢおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに結合したＢＣＭＡ特異的Ｐ５Ａ２ ｓｃＦｖを担持するＣＡＲ－Ｔ細胞を利用した。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）欠損ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を介したノックアウトによって生成され、ＴＣＲ駆動型の異種反応性による潜在的な混乱を回避した。８～１０週齢のメスのＮＳＧマウスを前５×１０⁶のＭＭ１．Ｓ－Ｌｕｃ－ＧＦＰの静脈内接種の前日に１Ｇｙで照射した。腫瘍移植の１４日後、マウスを、腫瘍量に基づいて無作為化し、そして指示されたＣＡＲ－Ｔ細胞の１×１０^6個、または３×１０⁶個のいずれかを静脈内投与した（１群当たりｎ＝１０）。腫瘍の進行は生物発光イメージングによってモニターされた。Ｔ細胞投与の３０日後に、３×１０⁶個のＣＡＲ－Ｔ細胞を投与されたマウスは、末梢におけるＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の数え上げのために採血された。具体的には、各マウスからの５０ｕＬの全血を、ＡＣＫ Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して赤血球溶解にかけ、Ｆｃでブロックし、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで希釈した次の抗体カクテルで染色した：ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＣＤ４５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＢＶ４２１コンジュゲート抗ヒトＣＤ４５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、およびＰ５Ａ２ ｓｃＦｖに特異的な抗イディオタイプ抗体。最後に、サンプルをＰＢＳにおいて洗浄し、細胞ペレットをＦＡＣＳ分析の前に、１２３ｃｏｕｎｔ ｅＢｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）（１２０ｕＬのＰＢＳ＋１％ＢＳＡにおける１０ｕＬの計数ビーズ）を含有する１３０ｕＬのＰＢＳ＋１％ＢＳＡに再懸濁させた。

図２２Ａ～Ｃは、ＣＡＣＣＲが同所性多発性骨髄腫に対するインビボ抗腫瘍活性およびＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性を改善したことを示す。図２４Ａ～Ｂは、それぞれ、示されたＣＡＲ－Ｔ細胞の１×１０⁶個または３×１０⁶個のいずれかでの処置に応答した腫瘍の進行を示す。対照のＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は最初の腫瘍退縮を仲介することができたが、細胞注入の２２日後に腫瘍が再発したため、この反応は短命であった。しかしながら、ＣＡＣＣＲを共発現するＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍の再発を大幅に遅らせ、応答の持続性を改善した。図２４Ａ～Ｂの統計は、図２２Ａの６～３４日目と図２２Ｂの６～４４日目からのテューキーの多重比較による反復測定一元配置分散分析に基づく^**ｐ＜０．０１および^***ｐ＜０．００１を表す。図２２Ｃは、Ｔ細胞注入の３０日後に３×１０⁶個のＣＡＲ－Ｔ細胞で処置されたマウスの末梢血に存在するＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の数を示す。対照ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置されたマウスで観察された腫瘍再発と一致して、対照ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞はもはや末梢で検出できなかった。対照的に、腫瘍再発の予防に優れたＣＡＣＣＲ ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、インビボでもより有意に豊富であった。図２４Ｃの統計は、テューキーの多重比較による通常の一元配置分散分析に基づいて、^*ｐ＜０．０５および^****ｐ＜０．０００１を表す。これらは、改善されたＣＡＣＣＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性が、部分的に、強化された長期腫瘍制御を媒介し、応答の持続性を延長したことを示唆している。

さらに、膠芽腫などのＣＡＲ－Ｔ細胞療法に抵抗することが知られている固形腫瘍との関連で、ＣＡＲ－Ｔ細胞活性に対するＣＡＣＣＲへの影響を評価した。この目的のために、４－１ＢＢおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに結合した２１７３ ｓｃＦｖを担持するＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ、およびＥＧＦＲｖＩＩＩを安定して過剰発現するＬＮ２２９ヒト神経膠芽腫細胞株（ＬＮ２２９－ＥＧＦＲｖＩＩＩ）を利用した。８～１０週齢のメスＮＳＧマウスに３×１０⁶個のＬＮ２２９－ＥＧＦＲｖＩＩＩを皮下移植した。腫瘍が確立した２５日後、マウスを、腫瘍量に基づいて無作為化し、そして指示されたＣＡＲ－Ｔ細胞の１．５×１０⁶個、または３×１０⁶個のいずれかを静脈内投与した（１群当たりｎ＝８～１０）。腫瘍の進行は、キャリパー測定によって週に２回モニターされた。

図２３は、ＣＡＣＣＲが確立された固形腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を改善したことを示す。コントロールＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ－Ｔ細胞による治療は、ＬＮ２２９－ＥＧＦＲｖＩＩＩ腫瘍の増殖を遅らせることができましたが、腫瘍が最終的に進行するにつれて、反応は一過性で最適ではなかった。対照的に、ＣＡＣＣＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞による処置は、完全な腫瘍退縮をもたらした。特に、１．５×１０⁶個のＣＡＣＣＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞の低用量でさえ腫瘍除去に十分であった。統計は、３～３８日のテューキーの多重比較による反復測定一元配置分散分析に基づく３×１０⁶個の対照ＣＡＲ－Ｔ細胞による処置と比較して、^**ｐ＜０．０１を表す。これらの結果は、ＣＡＲ－Ｔ細胞のシグナル伝達ドメインと非冗長的に相乗作用して改善された活性を与えるＣＡＣＣＲの能力を繰り返す。

Claims (57)

1. ２つのモノマーで構成される構成的に活性なキメラサイトカイン受容体（ＣＡＣＣＲ）であって、各モノマーが、
   ａ．膜貫通ドメインと、
   ｂ．ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）結合ドメインと、
   ｃ．動員ドメインと、を含み、
   前記モノマーが構成的に二量体化されている、構成的に活性なキメラサイトカイン受容体（ＣＡＣＣＲ）。
2. 前記ＪＡＫ結合ドメインが、ＪＡＫ１結合ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＣＣＲ。
3. 前記ＪＡＫ結合ドメインが、ＪＡＫ２結合ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＣＣＲ。
4. 前記ＪＡＫ結合ドメインが、ＪＡＫ３結合ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＣＣＲ。
5. 前記ＪＡＫ結合ドメインが、ＴＹＫ２結合ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＣＣＲ。
6. 前記ＪＡＫ結合ドメインが、表１ｂに示されている膜貫通アミノ酸配列のうちの１つを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のＣＡＣＣＲ。
7. 前記動員ドメインが、少なくとも１つの受容体由来の、ＳＴＡＴ－１、ＳＴＡＴ－２、ＳＴＡＴ－３、ＳＴＡＴ－４、ＳＴＡＴ－５、ＳＴＡＴ－６、またはＳＴＡＴ－７の動員ドメインから選択されるＳＴＡＴ動員ドメインを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のＣＡＣＣＲ。
8. 前記膜貫通ドメインおよび／または前記ＪＡＫ結合ドメインが、ＥｐｏＲ、ＧＰ１３０、ＰｒｌＲ、ＧＨＲ、ＧＣＳＦＲ、またはＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体に由来する、請求項１～７のいずれか１項に記載のＣＡＣＣＲ。
9. 前記膜貫通ドメインおよび／または前記ＪＡＫ結合ドメインが、前記ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体に由来する、請求項１～７のいずれか１項に記載のＣＡＣＣＲ。
10. 前記膜貫通ドメインおよび／または前記ＪＡＫ結合ドメインが、前記ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体に由来し、前記ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体が、配列番号６の天然に存在するＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体のアミノ酸４７８～５８２を含む、請求項９に記載のＣＡＣＣＲ。
11. 前記ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体が、配列番号６のＨ４９９、Ｓ５０５、Ｗ５１５、およびＧ５０９において１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１０に記載のＣＡＣＣＲ。
12. 前記ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体が、Ｈ４９９Ｌ、Ｓ５０５Ｎ、Ｗ５１５Ｋ、およびＧ５０９Ｎから選択されるアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む、請求項１１に記載のＣＡＣＣＲ。
13. 前記ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体がアミノ酸置換Ｈ４９９Ｌを含む、請求項１１に記載のＣＡＣＣＲ。
14. 前記ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体がアミノ酸置換Ｓ５０５Ｎを含む、請求項１１に記載のＣＡＣＣＲ。
15. 前記ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体がアミノ酸置換Ｗ５１５Ｋを含む、請求項１１に記載のＣＡＣＣＲ。
16. 前記ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体がアミノ酸置換Ｇ５０９Ｎを含む、請求項１１に記載のＣＡＣＣＲ。
17. 前記ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体がアミノ酸置換Ｈ４９９ＬおよびＳ５０５Ｎを含む、請求項１１に記載のＣＡＣＣＲ。
18. 前記ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体がアミノ酸置換Ｈ４９９ＬおよびＷ５１５Ｋを含む、請求項１１に記載のＣＡＣＣＲ。
19. 前記ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体がアミノ酸置換Ｓ５０５ＮおよびＷ５１５Ｋを含む、請求項１１に記載のＣＡＣＣＲ。
20. 前記ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体がアミノ酸置換Ｈ４９９ＬおよびＧ５０９Ｎを含む、請求項１１に記載のＣＡＣＣＲ。
21. 前記ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体がアミノ酸置換Ｈ４９９ＬおよびＳ５０５Ｎを含む、請求項１１に記載のＣＡＣＣＲ。
22. 前記ＴＰＯＲ／ＭＰＬＲ受容体がアミノ酸置換Ｈ４９９Ｌ、Ｓ５０５Ｎ、およびＷ５１５Ｋを含む、請求項１１に記載のＣＡＣＣＲ。
23. 前記モノマーが同一である、請求項１～２２のいずれか１項に記載のＣＡＣＣＲ。
24. 前記モノマーが異なる、請求項１～２２のいずれか１項に記載のＣＡＣＣＲ。
25. 前記動員ドメインが、サイトカイン受容体由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載のＣＡＣＣＲ。
26. 前記動員ドメインが、表２ａに示されている受容体から選択される受容体由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載のＣＡＣＣＲ。
27. 前記動員ドメインが、表２ｂに示される受容体配列のうちの１つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載のＣＡＣＣＲ。
28. 前記動員ドメインがＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載のＣＡＣＣＲ。
29. 前記ＩＬ７ＲａがＩＬ７Ｒａ（３１６～４５９）である、請求項２８に記載のＣＡＣＣＲ。
30. 前記動員ドメインがＩＬ２Ｒｂ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載のＣＡＣＣＲ。
31. 前記ＩＬ２Ｒｂが含む前記動員ドメインがＩＬ７Ｒａ由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む、請求項３０に記載のＣＡＣＣＲ。
32. 前記動員ドメインがＩＬ１２Ｒｂ２由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載のＣＡＣＣＲ。
33. 前記ＩＬ１２Ｒｂ２がＩＬ１２Ｒｂ２（７１４～８６２）またはＩＬ１２Ｒｂ２（７７５～８２５）を含む、請求項３２に記載のＣＡＣＣＲ。
34. 前記動員ドメインが２つの受容体由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載のＣＡＣＣＲ。
35. 前記動員ドメインが２つのサイトカイン受容体由来のＳＴＡＴ動員ドメインを含む、請求項１～３４のいずれか１項に記載のＣＡＣＣＲ。
36. 前記２つのサイトカイン受容体が、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ２Ｒｂ、およびＩＬ１２Ｒｂ２からなる群から選択される、請求項３５に記載のＣＡＣＣＲ。
37. 請求項１～３６のいずれか１項に記載のＣＡＣＣＲのうちのいずれか１つをコードするポリヌクレオチド。
38. 請求項３７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
39. 請求項３７に記載のポリヌクレオチドとキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するポリヌクレオチドと、を含む、請求項３７に記載の発現ベクター。
40. 前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｆｌｔ－３、ＷＴ－１、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、ＬｅＹ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、ＣＤ４４ｖ６、ＲＯＲ１、ＣＤ１９、クローディン１８．２（クローディン１８Ａ２、またはクローディン１８アイソフォーム２）、ＤＬＬ３（デルタ様タンパク質３、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａデルタホモログ３、Ｄｅｌｔａ３）、Ｍｕｃ１７（ムチン１７、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ３）、ＦＡＰアルファ（線維芽細胞活性化タンパク質アルファ）、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合遺伝子座タンパク質Ｇ６ｄ、ｃ６ｏｒｆ２３、Ｇ６Ｄ、ＭＥＧＴ１、ＮＧ２５）、および／またはＲＮＦ４３（Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ４３、ＲＩＮＧフィンガータンパク質４３）に結合する、請求項３９に記載の発現ベクター。
41. 前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項３８～４０のいずれか１項に記載の発現ベクター。
42. 請求項３８～４１のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む操作された免疫細胞。
43. 前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項４２に記載の操作された免疫細胞。
44. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、請求項１～３６のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＣＡＣＣＲと、を含む操作された免疫細胞。
45. 前記ＣＡＲおよび前記ＣＡＣＣＲが化学量論的に等しい量で発現される、請求項４４に記載の操作された免疫細胞。
46. 前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
47. 前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｆｌｔ－３、ＷＴ－１、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、ＬｅＹ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、ＣＤ４４ｖ６、ＲＯＲ１、ＣＤ１９、クローディン１８．２（クローディン１８Ａ２、またはクローディン１８アイソフォーム２）、ＤＬＬ３（デルタ様タンパク質３、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａデルタホモログ３、Ｄｅｌｔａ３）、Ｍｕｃ１７（ムチン１７、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ３）、ＦＡＰアルファ（線維芽細胞活性化タンパク質アルファ）、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合遺伝子座タンパク質Ｇ６ｄ、ｃ６ｏｒｆ２３、Ｇ６Ｄ、ＭＥＧＴ１、ＮＧ２５）、および／またはＲＮＦ４３（Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ４３、ＲＩＮＧフィンガータンパク質４３）に結合する、請求項４２～４６のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
48. 前記細胞が同種異系免疫細胞である、請求項４２～４７のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
49. 前記細胞が自己免疫細胞である、請求項４２～４７のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
50. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、および幹細胞に由来する免疫細胞からなる群から選択される、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
51. 操作された免疫細胞を調製する方法であって、請求項３７に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３８～４１のいずれか１項に記載の発現ベクターを免疫細胞に導入することを含む、方法。
52. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、および幹細胞に由来する免疫細胞からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
53. 請求項４２～５０のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞を含む、医薬組成物。
54. 請求項４２～５０のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞または請求項５３に記載の医薬組成物を含むキット。
55. 対象のがんを治療する方法であって、治療有効量の請求項４２～５０のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞または請求項５３に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
56. 前記がんが固形腫瘍を含む、請求項５５に記載の方法。
57. 前記がんが液性腫瘍を含む、請求項５５に記載の方法。

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