CN117279945A - 嵌合细胞因子受体及其在细胞疗法中的用途 - Google Patents

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张亚峰
朱延亮
史苗苗
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Abstract

本申请提供了一种免疫效应细胞，该免疫效应细胞表达嵌合细胞因子受体和功能性外源受体，该嵌合细胞因子受体包含第一胞外抗原结合结构域、第一跨膜结构域和细胞因子受体胞内结构域；该功能性外源受体包含第二胞外抗原结合结构域、第二跨膜结构域和胞内信号传导结构域。

Description

嵌合细胞因子受体及其在细胞疗法中的用途
交叉引用
本申请要求于2021年4月19日提交的国际专利申请号PCT/CN2021/088111的优先权权益，其内容通过援引以其全文并入本文。
序列表
本申请通过援引并入了与本申请一起提交的序列表，该序列表为文本格式，标题为“P11132-PCT.220419.Sequence Listing.txt”，创建于2022年4月15日，大小为10,10,034字节。
1.技术领域
本披露涉及嵌合细胞因子受体、包含其的工程化免疫效应细胞及其使用方法。本披露进一步涉及用于治疗用途的细胞的活化和扩增，特别涉及基于功能性外源受体(诸如嵌合抗原受体)的T细胞免疫疗法。
2.背景技术
T细胞的过继转移代表一种新兴的抗癌创新治疗策略。然而，各种障碍限制了CAR-T细胞疗法的功效和/或阻止了其广泛应用，尤其是在实体瘤中。FDA批准了四种CAR-T产品，它们都是自体CAR-T细胞，源自受试者自身的T细胞。源自健康供体的同种异体CAR-T细胞提供了一种更具商业可行性的现成(off-the-shelf)选择，有可能治疗更广泛的受试者。尽管同种异体CAR-T细胞比自体CAR-T细胞具有更多优点，但对前者的反应的持久性比后者短。因此，本领域需要具有改进的持久性的下一代同种异体CAR-T细胞。
3.发明内容
在一方面，本文提供了一种免疫效应细胞，该免疫效应细胞表达(i)嵌合细胞因子受体，该嵌合细胞因子受体包含(a)第一胞外抗原结合结构域、(b)第一跨膜结构域和(c)细胞因子受体胞内结构域；和(ii)任选地功能性外源受体，该功能性外源受体包含(a)第二胞外抗原结合结构域、(b)第二跨膜结构域和(c)胞内信号传导结构域。
在一方面，本文提供了一种免疫效应细胞，该免疫效应细胞表达(i)嵌合细胞因子受体，该嵌合细胞因子受体包含(a)第一跨膜结构域和(b)细胞因子受体胞内结构域；和(ii)功能性外源受体，该功能性外源受体包含(a)胞外抗原结合结构域、(b)第二跨膜结构域和(c)胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，免疫效应细胞表达(i)嵌合细胞因子受体，该嵌合细胞因子受体包含(a)第一胞外抗原结合结构域，其中该第一胞外抗原结合结构域源自NKG2D、截短的NKG2D、靶向NKG2D配体的抗体或其抗原结合片段、TIGIT或SIRP-α、或其变体，(b)第一跨膜结构域，和(c)细胞因子受体胞内结构域；和(ii)任选地功能性外源受体，该功能性外源受体包含(a)第二胞外抗原结合结构域、(b)第二跨膜结构域和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施例中，免疫效应细胞表达(i)嵌合细胞因子受体，该嵌合细胞因子受体包含(a)第一胞外抗原结合结构域，其中该第一胞外抗原结合结构域源自NKG2D、截短的NKG2D、靶向NKG2D配体的抗体或其抗原结合片段、TIGIT或SIRP-α、或其变体，(b)第一跨膜结构域，和(c)细胞因子受体胞内结构域；和(ii)功能性外源受体，该功能性外源受体包含(a)第二胞外抗原结合结构域、(b)第二跨膜结构域和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施例中，免疫效应细胞包含SEQ ID NO:29、135、141、143或149的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29、135、141、143或149具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，免疫效应细胞包含SEQ ID NO:30-134、136-140、142、144、146或148的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:30-134、136-140、142、144、146或148具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，免疫效应细胞包含SEQ ID NO:150或151的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:150或151具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，免疫效应细胞进一步包含一个或多个标签。在一些实施例中，标签与嵌合细胞因子受体和/或功能性外源受体连接。在一些实施例中，与嵌合细胞因子受体连接的标签不同于与功能性外源受体连接的标签。在一些实施例中，与嵌合细胞因子受体和/或功能性外源受体连接的标签包含SEQ ID NO:4、5或158-160的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:4、5或158-160的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，胞外抗原结合结构域与靶细胞诸如肿瘤细胞的表面上表达的抗原结合。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域源自NKG2D或截短的NKG2D(诸如NKG2D或截短的NKG2D的ECD)或其变体。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:6、156或157的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6、156或157具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域源自NKG2D配体或其变体。在一些实施例中，NKG2D配体选自由MICA/B、ULBP-1、ULBP-2,5,6和ULBP-3组成的组。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含与NKG2D配体结合的一个或多个scFv或一个或多个sdAb。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域源自TIGIT或其变体。在一些实施例中，胞外抗原结构域源自TIGIT的ECD。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:145具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域源自SIRP-α或其变体。在一些实施例中，胞外抗原结构域源自SIRP-α的ECD。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:147具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第一或第二胞外抗原结合结构域与靶细胞诸如肿瘤细胞的表面上表达的抗原结合。在一些实施例中，第一或第二胞外抗原结合结构域源自NKG2D或截短的NKG2D(诸如NKG2D或截短的NKG2D的ECD)或其变体。在一些实施例中，第一或第二胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:6、156或157的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6、156或157具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第一或第二胞外抗原结合结构域源自NKG2D配体或其变体。在一些实施例中，NKG2D配体选自由MICA/B、ULBP-1、ULBP-2,5,6和ULBP-3组成的组。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含与NKG2D配体结合的一个或多个scFv或一个或多个sdAb。在一些实施例中，第一或第二胞外抗原结合结构域源自TIGIT或其变体。在一些实施例中，第一或第二胞外抗原结构域源自TIGIT的ECD。在一些实施例中，第一或第二胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:145具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第一或第二胞外抗原结合结构域源自SIRP-α或其变体。在一些实施例中，第一或第二胞外抗原结构域源自SIRP-α的ECD。在一些实施例中，第一或第二胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:147具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，第一跨膜结构域包含Janus激酶(JAK)结合结构域。在一些实施例中，JAK结合结构域源自由EPOR、GHR、TPOR和其变体组成的组。在一些实施例中，JAK结合结构域源自TPOR，例如，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:7具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，JAK结合结构域源自EPOR。在一些实施例中，JAK结合结构域源自GHR。
在一些实施例中，细胞因子受体胞内结构域源自一种或多种细胞因子受体，该一种或多种细胞因子受体选自由以下组成的组：IL2Rα、IL7Rα、IL9R-1、IL9R-2、IL9R-3、IL12Rβ1、IL12Rβ2、IL15Rα、IL15Rβ-1、IL15Rβ-2、IL15Rβ-3、IL18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体及其组合。在一些实施例中，细胞因子受体胞内结构域选自IL-7Rα、IL12Rβ1、IL12Rβ2、IL15Rα、IL15Rβ-1、IL15Rβ-2、IL15Rβ-3、IL-18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、IL9R-1、IL9R-2、IL9R-3、IL-7Rα-IL12Rβ1、IL-7Rα-IL15Rα、IL-7Rα-IL15Rβ-1、IL-7Rα-IL15Rβ-2、IL7Rα-IL21R-1、IL7Rα-IL21R-2、IL7Rα-IL21R-3、IL7Rα-IL23R-2、IL7Rα-GMCSFRα、IL-7Rα-GM-CSFRβ-1、IL-7Rα-GM-CSFRβ-2、IL12Rβ1-IL15Rα、IL12Rβ1-IL15Rβ-1、IL12Rβ1-IL15Rβ-2、IL12Rβ1-IL-21R-1、IL12Rβ1-IL-21R-2、IL12Rβ1-IL-21R-3、IL12Rβ1-IL-23R-2、IL12Rβ1-GM-CSFRα、IL12Rβ1-GM-CSFRβ-1、IL12Rβ1-GM-CSFRβ-2、IL12Rβ2-IL15Rα、IL12Rβ2-IL15Rβ-1、IL12Rβ2-IL15Rβ-2、IL12Rβ2-IL-21R-1、IL12Rβ2-IL-21R-2、IL12Rβ2-IL-21R-3、IL12Rβ2-IL-23R-2、IL12Rβ2-GM-CSFRα、IL12Rβ2-GM-CSFRβ-1、IL12Rβ2-GM-CSFRβ-2、IL15Rα-IL-21R-1、IL15Rα-IL-21R-2、IL15Rα-IL-21R-3、IL15Rα-IL-23R-2、IL15Rα-GM-CSFRα、IL15Rα-GM-CSFRβ-1、IL15Rα-GM-CSFRβ-2、IL15Rβ-1-IL-21R-1、L15Rβ-1-IL-21R-2、IL15Rβ-1-IL-21R-3、IL15Rβ-1-IL-23R-2、IL15Rβ-1-GM-CSFRα、IL15Rβ-1-GM-CSFRβ-1、IL15Rβ-1-GM-CSFRβ-2、IL15Rβ-2-IL-21R-1、IL15Rβ-2-IL-21R-2、IL15Rβ-2-IL-21R-3、L15Rβ-2-IL-23R-2、IL15Rβ-2-GM-CSFRα、IL15Rβ-2-GM-CSFRβ-1、IL15Rβ-2-GM-CSFRβ-2、IL-21R-1-IL-23R-2、IL-21R-1-GM-CSFRα、IL-21R-1-GM-CSFRβ-1、IL-21R-1-GM-CSFRβ-2、IL-21R-2-IL-23R-2、IL-21R-2-GM-CSFRα、IL-21R-2-GM-CSFRβ-1、IL-21R-2-GM-CSFRβ-2、IL-21R-3-IL-23R-2、IL-21R-3-GM-CSFRα、IL-21R-3-GM-CSFRβ-1、IL-21R-3-GM-CSFRβ-2、IL-23R-2-GM-CSFRα、IL-23R-2-GM-CSFRβ-1、IL-23R-2-GM-CSFRβ-2、IL-7Rα-IL-9R-2、IL12Rβ1-IL-9R-2、IL12Rβ2-IL-9R-2、IL15Rα-IL-9R-2、IL15Rβ-1-IL-9R-2、IL15Rβ-2-IL-9R-2、IL-21R-1-IL-9R-2、IL-21R-2-IL-9R-2、IL-21R-3-IL-9R-2、IL-23R-2-IL-9R-2、GM-CSFRα-IL-9R-2、GM-CSFRβ-1-IL-9R-2、GM-CSFRβ-2-IL-9R-2、IL-7Rα-IL-12Rβ2、或其变体。在一些实施例中，细胞因子受体胞内结构域包含以下区域，该区域具有选自SEQ ID NO:8-28的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:8-28的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施例中，细胞因子受体胞内结构域包含SEQ ID NO:8、10、14-17或20-28中的一个或多个氨基酸序列。
在一些实施例中，功能性外源受体是T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、嵌合TCR(cTCR)、或T细胞抗原偶联物(TAC)样嵌合受体。在一些实施例中，功能性外源受体是CAR。在其他实施例中，功能性外源受体是TCR。在一些实施例中，功能性外源受体是如第5.2.2部分中更详细描述的CAR。例如，CAR的胞外结构域可以是任何形式，包括例如单CAR、双CAR、串联CAR或分离的CAR。功能性外源受体的胞外结构域可以与靶细胞(例如，肿瘤细胞)上表达的抗原结合。在一些实施例中，CAR与肿瘤相关抗原结合。在一些实施例中，肿瘤相关抗原选自由以下组成的组：GPC3、AFP、密蛋白18.2、CD19、CD20、CD22、BCMA、GD2、DLL3、MSLN、CD30、CLL1和CD33。在一些特定实施例中，本文提供的CAR与GPC3结合。在一些更特定的实施例中，CAR包含SEQ ID NO:29或135的氨基酸序列。在一些特定实施例中，本文提供的CAR与CD19结合。在一些更特定的实施例中，CAR包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列。在一些特定实施例中，本文提供的CAR与CD33结合。在一些更特定的实施例中，CAR包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列。
在一些实施例中，第二跨膜结构域源自选自由CD8、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。在一些实施例中，第二跨膜结构域来自CD8α或CD28。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施例中，初级胞内信号传导结构域来自CD3ζ。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。
在一些实施例中，共刺激信号传导结构域源自共刺激分子，该共刺激分子选自由CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含CD28的胞内结构域和/或CD137的胞内结构域。
在一些实施例中，功能性外源受体进一步包含位于胞外抗原结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域来自CD8α。
在一些实施例中，嵌合细胞因子受体和/或功能性外源受体进一步包含位于嵌合细胞因子受体和/或功能性外源受体的N末端的信号肽。在一些实施例中，信号肽来自CD8α。
在一些实施例中，免疫效应细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK T细胞、巨噬细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、单核细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞。在一些实施例中，T细胞是细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、自然杀伤T细胞、αβT细胞或γδT细胞。
在另一方面，本文提供了一种多肽，该多肽包含(i)嵌合细胞因子受体，该嵌合细胞因子受体包含(a)第一胞外抗原结合结构域、(b)第一跨膜结构域和(c)细胞因子受体胞内结构域；和(ii)任选地功能性外源受体，该功能性外源受体包含(a)第二胞外抗原结合结构域、(b)第二跨膜结构域和(c)胞内信号传导结构域。在一方面，本文提供了一种多肽，该多肽包含(i)嵌合细胞因子受体，该嵌合细胞因子受体包含(a)第一跨膜结构域和(b)细胞因子受体胞内结构域；和(ii)功能性外源受体，该功能性外源受体包含(a)胞外抗原结合结构域、(b)第二跨膜结构域和(c)胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，多肽包含(i)嵌合细胞因子受体，该嵌合细胞因子受体包含(a)第一胞外抗原结合结构域，其中该第一胞外抗原结合结构域源自NKG2D、截短的NKG2D、靶向NKG2D配体的抗体或其抗原结合片段、TIGIT或SIRP-α、或其变体，(b)第一跨膜结构域，和(c)细胞因子受体胞内结构域；和(ii)任选地功能性外源受体，该功能性外源受体包含(a)第二胞外抗原结合结构域、(b)第二跨膜结构域和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施例中，多肽包含(i)嵌合细胞因子受体，该嵌合细胞因子受体包含(a)第一胞外抗原结合结构域，其中该第一胞外抗原结合结构域源自NKG2D、截短的NKG2D、靶向NKG2D配体的抗体或其抗原结合片段、TIGIT或SIRP-α、或其变体，(b)第一跨膜结构域，和(c)细胞因子受体胞内结构域；和(ii)功能性外源受体，该功能性外源受体包含(a)第二胞外抗原结合结构域、(b)第二跨膜结构域和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:29、135、141、143或149的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29、135、141、143或149具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:30-134、136-140、142、144、146或148的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:30-134、136-140、142、144、146或148具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽进一步包含一个或多个标签。在一些实施例中，标签与嵌合细胞因子受体和/或功能性外源受体连接。在一些实施例中，与嵌合细胞因子受体连接的标签不同于与功能性外源受体连接的标签。在一些实施例中，与嵌合细胞因子受体连接的标签包含SEQ ID NO:4、5或158-160的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:4、5或158-160的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，免疫效应细胞包含SEQ ID NO:150或151的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:150或151具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域与靶细胞诸如肿瘤细胞的表面上表达的抗原结合。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域源自NKG2D或截短的NKG2D(诸如NKG2D或截短的NKG2D的ECD)或其变体。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域包含SEQID NO:6、156或157的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6、156或157具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域源自截短的NKG2D(氨基酸位置89-216，SEQ ID NO:157)。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域源自截短的NKG2D(氨基酸位置98-216，SEQ IDNO:156)。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域源自TIGIT(诸如TIGIT的ECD)。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域源自SIRP-α(诸如SIRP-α的ECD)。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域源自靶向NKG2D配体或其变体的抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，NKG2D配体选自由MICA/B、ULBP-1、ULBP-2,5,6和ULBP-3组成的组。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含与NKG2D配体结合的一个或多个scFv或一个或多个sdAb。
在一些实施例中，第一跨膜结构域包含Janus激酶(JAK)结合结构域。在一些实施例中，JAK结合结构域源自由EPOR、GHR、TPOR或其变体组成的组。在一些实施例中，JAK结合结构域源自TPOR，例如，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:7具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，JAK结合结构域源自EPOR。在一些实施例中，JAK结合结构域源自GHR。
在一些实施例中，细胞因子受体胞内结构域源自一种或多种细胞因子受体，该一种或多种细胞因子受体选自由以下组成的组：IL2Rα、IL7Rα、IL9R-1、IL9R-2、IL9R-3、IL12Rβ1、IL12Rβ2、IL15Rα、IL15Rβ-1、IL15Rβ-2、IL15Rβ-3、IL18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体及其组合。在一些实施例中，细胞因子受体胞内结构域源自选自以下的细胞因子受体：IL-7Rα、IL12Rβ1、IL12Rβ2、IL15Rα、IL15Rβ-1、IL15Rβ-2、IL15Rβ-3、IL-18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、IL9R-1、IL9R-2、IL9R-3、IL-7Rα-IL12Rβ1、IL-7Rα-IL15Rα、IL-7Rα-IL15Rβ-1、IL-7Rα-IL15Rβ-2、IL-7Rα-IL21R-1、IL-7Rα-IL21R-2、IL-7Rα-IL21R-3、IL-7Rα-IL23R-2、IL-7Rα-GMCSFRα、IL-7Rα-GM-CSFRβ-1、IL-7Rα-GM-CSFRβ-2、IL12Rβ1-IL15Rα、IL12Rβ1-IL15Rβ-1、IL12Rβ1-IL15Rβ-2、IL12Rβ1-IL-21R-1、IL12Rβ1-IL-21R-2、IL12Rβ1-IL-21R-3、IL12Rβ1-IL-23R-2、IL12Rβ1-GM-CSFRα、IL12Rβ1-GM-CSFRβ-1、IL12Rβ1-GM-CSFRβ-2、IL12Rβ2-IL15Rα、IL12Rβ2-IL15Rβ-1、IL12Rβ2-IL15Rβ-2、IL12Rβ2-IL-21R-1、IL12Rβ2-IL-21R-2、IL12Rβ2-IL-21R-3、IL12Rβ2-IL-23R-2、IL12Rβ2-GM-CSFRα、IL12Rβ2-GM-CSFRβ-1、IL12Rβ2-GM-CSFRβ-2、IL15Rα-IL-21R-1、IL15Rα-IL-21R-2、IL15Rα-IL-21R-3、IL15Rα-IL-23R-2、IL15Rα-GM-CSFRα、IL15Rα-GM-CSFRβ-1、IL15Rα-GM-CSFRβ-2、IL15Rβ-1-IL-21R-1、L15Rβ-1-IL-21R-2、IL15Rβ-1-IL-21R-3、IL15Rβ-1-IL-23R-2、IL15Rβ-1-GM-CSFRα、IL15Rβ-1-GM-CSFRβ-1、IL15Rβ-1-GM-CSFRβ-2、IL15Rβ-2-IL-21R-1、IL15Rβ-2-IL-21R-2、IL15Rβ-2-IL-21R-3、L15Rβ-2-IL-23R-2、IL15Rβ-2-GM-CSFRα、IL15Rβ-2-GM-CSFRβ-1、IL15Rβ-2-GM-CSFRβ-2、IL-21R-1-IL-23R-2、IL-21R-1-GM-CSFRα、IL-21R-1-GM-CSFRβ-1、IL-21R-1-GM-CSFRβ-2、IL-21R-2-IL-23R-2、IL-21R-2-GM-CSFRα、IL-21R-2-GM-CSFRβ-1、IL-21R-2-GM-CSFRβ-2、IL-21R-3-IL-23R-2、IL-21R-3-GM-CSFRα、IL-21R-3-GM-CSFRβ-1、IL-21R-3-GM-CSFRβ-2、IL-23R-2-GM-CSFRα、IL-23R-2-GM-CSFRβ-1、IL-23R-2-GM-CSFRβ-2、IL-7Rα-IL-9R-2、IL12Rβ1-IL-9R-2、IL12Rβ2-IL-9R-2、IL15Rα-IL-9R-2、IL15Rβ-1-IL-9R-2、IL15Rβ-2-IL-9R-2、IL-21R-1-IL-9R-2、IL-21R-2-IL-9R-2、IL-21R-3-IL-9R-2、IL-23R-2-IL-9R-2、GM-CSFRα-IL-9R-2、GM-CSFRβ-1-IL-9R-2、GM-CSFRβ-2-IL-9R-2、IL-7Rα-IL-12Rβ2、或其变体。在一些实施例中，细胞因子受体胞内结构域包含以下区域，该区域具有选自SEQ ID NO:8-28的氨基酸序列，或与选自SEQ IDNO:8-28的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施例中，细胞因子受体胞内结构域包含SEQ IDNO:8、10、14-17或20-28中的一个或多个氨基酸序列。
在一些实施例中，功能性外源受体是T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、嵌合TCR(cTCR)、或T细胞抗原偶联物(TAC)样嵌合受体。在一些实施例中，功能性外源受体是CAR。在其他实施例中，功能性外源受体是TCR。在一些实施例中，CAR是单CAR、双CAR、串联CAR或分离的CAR。在一些实施例中，CAR如第5.2.2部分所述。在一些特定实施例中，本文提供的CAR与肿瘤相关抗原结合。在一些特定实施例中，本文提供的CAR与GPC3、CD19或CD33结合。在一些更特定的实施例中，本文提供的CAR包含SEQ ID NO:29、135、141、143或149的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29、135、141、143或149具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，第二跨膜结构域源自选自由CD8、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。在一些实施例中，第二跨膜结构域来自CD8α或CD28。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施例中，初级胞内信号传导结构域来自CD3ζ。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域源自共刺激分子，该共刺激分子选自由以下组成的组：CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含CD28的胞内结构域和/或CD137的胞内结构域。
在一些实施例中，功能性外源受体进一步包含位于胞外抗原结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域来自CD8α。
在一些实施例中，嵌合细胞因子受体和/或功能性外源受体进一步包含位于嵌合细胞因子受体和/或功能性外源受体的N末端的信号肽。在一些实施例中，信号肽来自CD8α。
在一些实施例中，嵌合细胞因子受体和功能性外源受体通过肽接头彼此连接。在一些实施例中，肽接头为2A自切割肽，该2A自切割肽任选地选自由F2A、E2A、P2A、T2A或其变体组成的组。
在一些实施例中，多肽进一步包含一个或多个标签。在一些实施例中，标签与嵌合细胞因子受体和/或功能性外源受体连接。在一些实施例中，与嵌合细胞因子受体连接的标签不同于与功能性外源受体连接的标签。在一些实施例中，与嵌合细胞因子受体和/或功能性外源受体连接的标签包含SEQ ID NO:4、5或158-160的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:4、5或158-160的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本文提供了一种分离的核酸，该分离的核酸包含编码本文提供的多肽的核酸序列。在又一方面，本文提供了一种分离的核酸，该分离的核酸包含(i)编码嵌合细胞因子受体的第一区，该嵌合细胞因子受体包含(a)第一胞外抗原结合结构域，其中该第一胞外抗原结合结构域源自NKG2D、截短的NKG2D、靶向NKG2D配体的抗体或其抗原结合片段、TIGIT或SIRP-α、或其变体，(b)第一跨膜结构域，和(c)细胞因子受体胞内结构域；和(ii)任选地编码功能性外源受体的第二区，该功能性外源受体包含(a)第二胞外抗原结合结构域、(b)第二跨膜结构域和(c)胞内信号传导结构域。在又一方面，本文提供了一种包含本文提供的分离的核酸的载体。
在又一方面，本文提供了一种制备免疫效应细胞的方法，该方法包括向免疫细胞中引入本文提供的核酸或载体。在又一方面，本文提供了一种制备免疫效应细胞的方法，该方法包括向免疫细胞中引入组合物，该组合物包含(i)编码嵌合细胞因子受体的第一核酸，该嵌合细胞因子受体包含(a)第一胞外抗原结合结构域、(b)第一跨膜结构域和(c)细胞因子受体胞内结构域；和(ii)任选地编码功能性外源受体的第二核酸，该功能性外源受体包含(a)第二胞外抗原结合结构域、(b)第二跨膜结构域和(c)胞内信号传导结构域。
在又一方面，本文提供了一种根据本文提供的方法产生的免疫效应细胞。
在又一方面，本文提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本文提供的免疫效应细胞、多肽、核酸、或载体，以及药学上可接受的载剂。
在又一方面，本文提供了一种治疗受试者疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文提供的药物组合物。
在又一方面，本文提供了包含癌症、炎症性或自身免疫性疾病的疾病或病症。在一些实施例中，癌症是实体癌或血液学癌症。在一些实施例中，癌症是肝癌、淋巴瘤、急性髓系白血病(AML)或慢性髓细胞性白血病(CML)。
在另一方面，本文提供了嵌合细胞因子受体，该嵌合细胞因子受体包含：(a)胞外抗原结合结构域、(b)跨膜结构域、和(c)细胞因子受体胞内结构域。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域源自NKG2D、截短的NKG2D、靶向NKG2D配体的抗体或其抗原结合片段、TIGIT、SIRP-α、或其变体。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域源自NKG2D或其变体的胞外结构域，其中任选地，胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:6、156或157的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6、156或157具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在其他实施例中，胞外结构域包含与NKG2D配体结合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，胞外结构域包含与NKG2D配体结合的一个或多个scFv或一个或多个sdAb。在一些实施例中，NKG2D配体选自由MICA/B、ULBP-1、ULBP-2,5,6和ULBP-3组成的组。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域源自免疫检查点的胞外结构域。在一些实施例中，免疫检查点选自由PD-1、CTLA4、或其变体组成的组。在一些实施例中，免疫检查点是PD-1。在一些实施例中，免疫检查点是CTLA4。
在另一方面，本文提供了一种免疫效应细胞，该免疫效应细胞表达本文提供的嵌合细胞因子受体。
4.附图说明
图1A至1B显示了用NKG2D、截短的NKG2D或突变的NKG2D嵌合细胞因子受体装甲的CAR或TCR的示例性构建体。图1A显示了用NKG2D、截短的NKG2D或突变的NKG2D嵌合细胞因子受体装甲的CAR的示意图。图1B显示了用NKG2D、截短的NKG2D或突变的NKG2D嵌合细胞因子受体装甲的TCR的示意图。
图2A至2B显示了用嵌合细胞因子受体装甲的CAR或TCR的示例性构建体，该嵌合细胞因子受体包括靶向NKG2D配体的结合结构域。图2A显示了用嵌合细胞因子受体装甲的CAR的示意图，该嵌合细胞因子受体包括靶向NKG2D配体的结合结构域。图2B显示了用嵌合细胞因子受体装甲的TCR的示意图，该嵌合细胞因子受体包括靶向NKG2D配体的结合结构域。
图3A至3B显示了用不同细胞因子受体装甲的CAR或TCR的示例性构建体。图3A显示了用NKG2D或突变的NKG2D嵌合细胞因子受体装甲的CAR。图3B显示了用NKG2D或突变的NKG2D嵌合细胞因子受体装甲的TCR。
图4显示了NKG2D在HCC细胞系huh7上的配体表面表达。
图5显示了与huh7细胞共培养的抗GPC3 CAR细胞或NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的抗GPC3 CARγδT细胞的长期细胞毒性。
图6显示了抗GPC3 CAR T细胞或NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的抗GPC3CARγδT细胞与huh7细胞长期共培养的T细胞增殖。
图7显示了与huh7细胞共培养的NKG2D嵌合单细胞因子受体装甲的抗GPC3 CARγδT细胞的长期细胞毒性。
图8显示了NKG2D嵌合单细胞因子受体装甲的抗GPC3 CARγδT细胞与huh7细胞长期共培养的T细胞增殖。
图9显示了与huh7细胞共培养的NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的抗GPC3CARγδT细胞的长期细胞毒性。
图10显示了NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的抗GPC3 CARγδT细胞与huh7细胞长期共培养的T细胞增殖。
图11显示了与huh7细胞共培养的NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的抗GPC3CARγδT细胞的长期细胞毒性。
图12显示了NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的抗GPC3 CARγδT细胞与huh7细胞长期共培养的T细胞增殖。
图13显示了与huh7细胞共培养的NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的抗GPC3CARαβT细胞的长期细胞毒性。
图14显示了NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的抗GPC3 CARαβT细胞与huh7细胞长期共培养的T细胞增殖。
图15显示了与huh7细胞共培养的NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的抗GPC3CARαβT细胞的长期细胞毒性。
图16显示了NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的抗GPC3 CARαβT细胞与huh7细胞长期共培养的T细胞增殖。
图17显示了与huh7细胞共培养的截短的NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的抗GPC3 CARαβT细胞的长期细胞毒性。
图18显示了截短的NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的抗GPC3CARαβT细胞与huh7细胞长期共培养的T细胞增殖。
图19显示了与huh7细胞共培养的抗MIC-A/B scFv嵌合的两种细胞因子受体装甲的抗GPC3 CARγδT细胞的长期细胞毒性。
图20显示了抗MIC-A/B scFv嵌合的两种细胞因子受体装甲的抗GPC3CARγδT细胞与huh7细胞长期共培养的T细胞增殖。
图21显示了在huh7异种移植模型中，抗GPC3 CARγδT细胞或用NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的抗GPC3 CARγδT细胞的抗肿瘤效应。
图22显示了与huh7细胞共培养的NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的构建体185CARαβT细胞的长期细胞毒性。
图23显示了NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的构建体185CARαβT细胞与huh7细胞长期共培养的T细胞增殖。
图24显示了与Raji细胞共培养的NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的CTL-019CARγδT细胞的长期细胞毒性。
图25显示了与Raji细胞共培养的NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的CTL-019CARγδT细胞长期共培养的T细胞增殖。
图26显示了与Raji细胞共培养的NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的CTL-019CARαβT细胞的长期细胞毒性。
图27显示了与Raji细胞共培养的NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的CTL-019CARαβT细胞长期共培养的T细胞增殖。
图28显示了与U937细胞共培养的NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的AS67190CARαβT细胞的长期细胞毒性。
图29显示了与U937细胞共培养的NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的AS67190CARαβT细胞长期共培养的T细胞增殖。
图30显示了与huh7细胞共培养的TIGIT嵌合的两种细胞因子受体装甲的抗GPC3CARγδT细胞的长期细胞毒性。
图31显示了与huh7细胞共培养的TIGIT嵌合的两种细胞因子受体装甲的抗GPC3CARγδT细胞长期共培养的T细胞增殖。
图32显示了在huh7异种移植模型中，抗GPC3 CARγδT细胞或用TIGIT嵌合的两种细胞因子受体装甲的抗GPC3 CARγδT细胞的抗肿瘤效应。
图33显示了与U937细胞共培养的SIRP-α嵌合的两种细胞因子受体装甲的AS67190CARγδT细胞的长期细胞毒性。
图34显示了与U937细胞共培养的SIRP-α嵌合的两种细胞因子受体装甲的AS67190CARγδT细胞长期共培养的T细胞增殖。
图35显示了NKG2D CAR或BM CARαβT细胞在培养中的T细胞增殖。
图36显示了NKG2D或BM CARαβT细胞在培养物中的T细胞活力。
图37显示了与huh7细胞共培养的缺失的NKG2D或组成型活性嵌合的两种细胞因子受体装甲的BM CARαβT细胞的长期细胞毒性。
图38显示了与huh7细胞共培养的缺失的NKG2D或组成型活性嵌合的两种细胞因子受体装甲的BM CARαβT细胞长期共培养的T细胞增殖。
5.具体实施方式
本披露部分基于表达嵌合细胞因子受体的工程化免疫细胞的改善的功能和性质的令人惊讶的发现。
已经产生了经修饰的CAR-T细胞以分泌细胞因子来促进其存活和/或更大的活性。然而，组成性地或诱导性地分泌细胞因子的效应是系统性的，并非CAR-T细胞所特有。它们还诱导内源性免疫细胞的扩增，诸如NK细胞、NKT细胞、树突状细胞(DC)、巨噬细胞和内源性CD8 T细胞(参见Avanzi M.P.等人，Cell Rep.15；23(7):2130-2141(2015))。免疫系统的过度活化可能是致命的，因此需要更理想、更安全的工程化装甲。
本披露提供了遗传修饰免疫细胞以表达对配体有反应的嵌合细胞因子受体的组合物和方法，该嵌合细胞因子受体在肿瘤细胞中特异性表达。当嵌合细胞因子受体与配体结合时，下游胞内细胞因子信号激活并独特地提高经遗传修饰的免疫细胞的功能活性，从而避免免疫系统的广泛活化。本文提供的工程化细胞表现出增强的增殖和治疗例如癌症和感染性疾病的效力。
5.1.定义
本文描述或参考的技术和程序包括本领域技术人员使用常规方法总体上很好地理解和/或通常采用的那些，例如像，在以下中描述的广泛使用的方法：Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版2001)；Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人编辑,2003)；Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic(An编辑2009)；Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols(Albitar编辑2010)；和Antibody Engineering第1卷和第2卷(Kontermann和Dübel编辑,第2版2010)。除非本文另外定义，否则，本发明中使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下对术语的描述，并且在任何适当的时候，以单数形式使用的术语也将包括复数，反之亦然。在所陈述的术语的任何描述与通过援引并入本文的任何文献冲突的情况下，应以下文所陈述的术语的描述为准。
术语“抗体”、“免疫球蛋白”或“Ig”在本文中可互换使用，并以最广泛的含义使用，并且特别涵盖例如单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整单克隆抗体)、具有多表位或单表位特异性的抗体组合物、多克隆或单价抗体、多价抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们表现出所需的生物活性)、单链抗体、单域抗体(例如，VHH)及其片段(例如，结构域抗体)。抗体可以是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和/或亲和力成熟抗体，以及来自其他物种(例如，小鼠、兔、美洲驼等)的抗体。术语“抗体”旨在包括免疫球蛋白类多肽中的B细胞的多肽产物，其能够结合特定分子抗原并且由两对相同的多肽链组成，其中每对多肽链具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，每条链的每个氨基末端部分包括约100至约130或更多个氨基酸的可变区，并且每条链的每个羧基末端部分包括恒定区。参见例如，Antibody Engineering(Borrebaeck编辑,第2版1995)；以及Kuby,Immunology(第3版1997)。抗体还包括但不限于合成抗体、重组产生的抗体、包括来自骆驼科物种(例如，美洲驼或羊驼)的单域抗体或它们的人源化变体、内抗体、抗独特型(抗Id)抗体，以及上述任一种的功能片段(例如抗原结合片段)，这些功能片段是指抗体重链或轻链多肽的一部分，其保留了该片段所来源的抗体的一些或全部结合活性。功能片段(例如，抗原结合片段)的非限制性实例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性等)、Fab片段、F(ab')片段、F(ab)2片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和微型抗体。特别地，本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如，抗原结合结构域或含有结合抗原的抗原结合位点的分子(例如，抗体的一个或多个CDR)。这样的抗体片段可见于例如Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(1989)；Mol.Biology andBiotechnology:A Comprehensive Desk Reference(Myers编辑,1995)；Huston等人,1993,Cell Biophysics 22:189-224；Plückthun和Skerra,1989,Meth.Enzymol.178:497-515；以及Day,Advanced Immunochemistry(第2版,1990)。本文提供的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。抗体可以是激动性抗体或拮抗性抗体。抗体可以既不是激动性的也不是拮抗性的。
“抗原”是抗体可以选择性结合的结构。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在的或合成的化合物。在一些实施例中，靶抗原是多肽。在某些实施例中，抗原与细胞相关，例如，存在于细胞上或细胞中。
“完整”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可以包括人恒定区或其氨基酸序列变体。在某些实施例中，完整抗体具有一种或多种效应子功能。
“单链Fv”(也缩写为“sFv”或“scFv”)是包含连接到单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，scFv多肽进一步包含在VH与VL结构域之间的多肽接头，该多肽接头使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
如本文所用，“单域抗体”或“sdAb”是指单个单体可变抗体结构域并且能够结合抗原。单域抗体包括如本文所述的VHH结构域。单域抗体的实例包括但不限于天然缺乏轻链的抗体，例如来自骆驼科物种(例如，美洲驼)的抗体、源自常规4链抗体的单域抗体、工程化抗体和除源自抗体的那些以外的单域支架。单域抗体可源自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。例如，如本文所述，单域抗体可以源自骆驼科物种，例如骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼和原驼中产生的抗体。除骆驼科外的其他物种可产生天然缺乏轻链的重链抗体；源自这样的其它物种的VHH在本披露的范围内。在一些实施例中，本文提供的单域抗体(例如，VHH)具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构。单域抗体可以与如本文所述的另一种分子(例如，剂)进行基因融合或化学缀合。单域抗体可能是较大的结合分子(例如，多特异性抗体或嵌合抗原受体)的一部分。
术语“结合(binds或binding)”、“特异性结合”或“对……有特异性”是指可测量和可再现的相互作用，如靶点与抗体之间的结合，其决定了在异质分子(包括生物分子)群体存在时靶点的存在。例如，结合或特异性结合靶点(可以是表位)的抗体是与此靶点结合的抗体，其亲和力、亲合力(avidity)、就绪性和/或持续时间优于与其他靶点的结合。在一个实施例中，抗体与不相关靶点的结合程度小于例如通过放射免疫测定法(RIA)测量的抗体与靶点的结合的约10％。在某些实施例中，特异性结合靶点的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施例中，抗体特异性结合来自不同物种的蛋白质中保守的蛋白质表位。在一些实施例中，特异性结合可以包括但不要求排他性结合。在另一实施例中，术语“结合(binds或binding)”是指分子之间的相互作用，包括例如形成复合物。
如本文所用，“表位”是本领域中的术语，并且是指结合分子(例如，包含单链抗体序列的抗体)可以特异性结合的抗原的局部区域。表位可以是线性表位或构象、非线性或不连续表位。在多肽抗原的情况下，例如，表位可以是多肽的连续氨基酸(“线性”表位)，或者表位可以包含来自多肽的两个或更多个非连续区域的氨基酸(“构象”、“非线性”或“不连续”表位)。本领域技术人员将理解，一般来讲，线性表位可以依赖于或不依赖于二级、三级或四级结构。例如，在一些实施例中，结合分子与一组氨基酸结合，而不管它们是否折叠成天然三维蛋白结构。在其他实施例中，结合分子需要构成表位的氨基酸残基以表现出特定构象(例如，弯曲、扭曲、转弯或折叠)以识别和结合表位。
关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”及“同源性”定义为在比对序列及必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比后且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分时，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。可根据所属领域技能内的多种方式，使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件，实现比对，以确定氨基酸序列同一性百分比。本领域技术人员可确定用于量测比对的适当参数，包括实现所比较的全长序列上的最大比对所需的任何算法。
如本文所用的术语“嵌合细胞因子受体”或CCR是包含细胞因子受体内结构域跨膜和异源配体结合胞外结构域的分子。异源胞外结构域结合除细胞因子以外的配体，其中源自内结构域的细胞因子受体是选择性的。以这种方式，可以通过移植异源结合特异性来改变细胞因子受体的配体特异性。
在一些实施例中，包含跨膜结构域的CCR包含Janus激酶(JAK)结合结构域。在一些实施例中，JAK结合结构域源自由EPOR、GHR、TPOR或其变体组成的组。在一些实施例中，JAK结合结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
在一些实施例中，CCR包含源自细胞因子受体的胞内结构域或组合物中的细胞因子受体的胞内结构域，例如IL2Rα、IL7Rα、IL9R-1、IL9R-2、IL9R-3、IL12Rβ1、IL12Rβ2、IL15Rα、IL15Rβ-1、IL15Rβ-2、IL15Rβ-3、IL18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。嵌合细胞因子受体可以进一步包含胞外结构域和跨膜结构域。
在一些实施例中，CCR包含标签，该标签包含SEQ ID NO:4、5或158-160的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:4、5或158-160的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
如本文所用，术语“功能性外源受体”是指在引入免疫效应细胞(诸如T细胞)后保留其生物活性的外源受体(例如TCR，诸如重组或工程化TCR、cTCR、TAC样嵌合受体或CAR)。生物活性包括但不限于外源受体特异性结合分子、适当转导下游信号，诸如诱导细胞增殖、细胞因子产生和/或调节性或溶细胞效应子功能的执行的能力。
如本文所用，“嵌合抗原受体”或“CAR”是指可用于将一种或多种抗原特异性移植到免疫效应细胞诸如T细胞上的基因工程化受体。一些CAR也被称为“人工T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”或“嵌合免疫受体”。包括一个或多个抗原结合部分(例如单域抗体或scFv)和信号传导结构域(例如来自T细胞受体的信号传导结构域(例如，CD3ζ))的嵌合分子。典型地，CAR由抗原结合部分、跨膜结构域和胞内结构域组成。胞内结构域典型地包括具有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导链，例如CD3ζ或FcεRIγ。在一些情况下，胞内结构域进一步包括至少一个另外的共刺激结构域(例如CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、OX40(CD134)、CD27和/或造血细胞信号转导因子(DAP10))的胞内部分。在本申请的上下文中，术语“胞内结构域(cytoplasmic domain)”、“胞内结构域(intracellular domain)”和“胞内信号传导结构域(intracellular signaling domain)”是可互换的。在一些实施例中，CAR包含对一种或多种抗原(诸如肿瘤抗原)特异的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和T细胞和/或其他受体的胞内信号传导结构域。在一些实施例中，CAR是单CAR。在一些实施例中，CAR是双CAR。在一些实施例中，CAR是串联CAR。在一些实施例中，CAR是分离的CAR。“CAR-T细胞”是指表达CAR的T细胞。如本文所用，术语“单CAR”作为嵌合分子包括在内，该嵌合分子包括单抗原结合部分(例如单域抗体或scFv)和信号传导结构域(例如来自T细胞受体的信号传导结构域(例如，CD3ζ))。典型地，单CAR可以包含单特异性抗原结合部分、跨膜结构域和胞内结构域。
如本文所用，术语“串联CAR”作为嵌合分子包括在内，该嵌合分子包括多于一个抗原结合部分(例如2、4或6个单域抗体或scFv)和信号传导结构域(例如，来自T细胞受体的信号传导结构域(例如CD3ζ))。典型地，串联CAR可以包含单特异性的二价抗原结合部分(例如，两个相同的结合GPC3的VHH结构域)或多特异性(例如双特异性)二价抗原结合部分(例如，两个不同的结合GPC3的VHH结构域，或一个结合GPC3的VHH结构域和另一个结合除GPC3以外的其他分子的VHH结构域)，跨膜结构域和胞内结构域。在一些实施例中，本披露的串联CAR可以包括胞外抗原结合结构域，该胞外抗原结合结构域进一步包含与第二抗原结合的第二结合结构域，并且该第二抗原与GPC3不同。
如本文所用，术语“双CAR”作为以下包括在内：两个单独CAR(可以是双特异性的)，或两个串联CAR(每个CAR可以是单特异性或双特异性的)，或一个单CAR和一个串联CAR(可以是单特异性或双特性的)。双CAR可以具有第一CAR和第二CAR中的每个，其均具有共刺激结构域(例如CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、OX40(CD134)、CD27和DAP10)和信号传导结构域(例如，来自T细胞受体的信号传导结构域(例如CD3ζ))。双CAR可以是任何两个抗GPC3 CAR的组合，其中第一CAR和第二CAR中的每一个可以是单CAR或串联CAR，即单CAR/单CAR、单CAR/串联CAR、或串联CAR/串联CAR。双CAR T细胞信号传导的水平可以通过操作每个第一和第二CAR的胞内结构域来调节。例如，第一CAR和第二CAR中的每个的胞内结构域可以包含共刺激结构域(例如CD28、CD137(4-1BB)、ICOS、OX40(CD134)、CD27和/或DAP10)和/或来自T细胞受体的信号传导结构域(例如来自T细胞受体的信号传导结构域(例如，CD3ζ))。例如，本披露的双CAR可以包括第一CAR和第二CAR，其各自具有包含共刺激结构域和来自T细胞受体的信号传导结构域的胞内结构域。因此，当双CAR结合抗原(例如，双特异性的)时，T细胞信号可以通过来自T细胞受体的两个信号传导结构域传递。
如本文所用，术语“分离的CAR”不同于双CAR，在分离的CAR中，第一CAR可以包含共刺激结构域但缺乏来自T细胞受体的信号传导结构域；而第二CAR可以包含来自T细胞受体的信号传导结构域但缺乏共刺激结构域。在一些实施例中，本披露的分离的CAR系统可以包括包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域的第一胞内信号传导结构域、和包含共刺激信号传导结构域的第二胞内信号传导结构域。
如本文所用的术语“重组或工程化TCR”作为本文提供的一种功能性外源受体包括在内，并且是指在免疫细胞中表达的肽。重组或工程化TCR的功能可以包括例如重定向免疫细胞针对所需类型细胞的免疫活性，这些细胞诸如表面具有特定标记的癌症细胞和感染细胞。它可以取代内源性TCR或与内源性TCR共表达。在一些实施例中，这样的重组TCR是包含开放阅读框的单链TCR，其中可变Vα和Vβ结构域与蛋白质接头配对。这涉及到已知对所选择的抗原具有特异性的TCR基因的分子克隆。然后通常通过逆转录病毒载体将这些链引入T细胞。因此，克隆的TCRα和TCRβ基因的表达赋予转导的T细胞由这些新基因的配对确定的功能特异性。重组或工程化TCR的组分是TCR的任何功能亚基，如重组TCRα和TCRβ，由引入细胞中的外源多核苷酸序列编码。
在一些实施例中，本文提供的功能性外源受体是嵌合TCR(cTCR)，其同时具有抗原结合功能和T细胞活化功能。例如，cTCR可以包含：(a)胞外配体结合结构域，该胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如，GPC3、CD19或CLL1)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如，sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如，CD3ε)的任选的胞外结构域或其一部分；(d)包含第二TCR亚基(例如，CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如，CD3ε)的胞内信号传导结构域的胞内信号传导结构域；其中第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施例中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的(例如，全都是CD3ε)。在一些实施例中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施例中，cTCR进一步包含位于胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域源自CD8α。在一些实施例中，cTCR进一步包含位于cTCR的N末端处的信号肽，诸如源自CD8α的信号肽。
在一些实施例中，功能性外源受体是T细胞抗原偶联物(TAC)，例如，包含：(a)胞外配体结合结构域，该胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如，GPC3、CD19或CLL1)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如，sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如，CD3ε)的胞外结构域的胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如，CD4)的任选的胞外结构域或其一部分；(f)包含第二TCR共受体(例如，CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)包含第三TCR共受体(例如，CD4)的胞内信号传导结构域的任选的胞内信号传导结构域；其中该TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组。在一些实施例中，第一、第二和第三TCR共受体是相同的。在一些实施例中，第一、第二和第三TCR共受体是不同的。在一些实施例中，TAC进一步包含位于胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域源自CD8α。在一些实施例中，TAC进一步包含位于TAC的N末端处的信号肽，诸如源自CD8α的信号肽。在一些实施例中，胞外配体结合结构域在胞外TCR结合结构域的N末端处。在一些实施例中，胞外配体结合结构域在胞外TCR结合结构域的C末端处。
在一些实施例中，功能性外源受体是TAC样嵌合受体，例如，包含：(a)胞外配体结合结构域，该胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如，GPC3)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如，sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如，TCRα)的胞外结构域的胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如，CD3ε)的任选的胞外结构域或其一部分；(f)包含第三TCR亚基(例如，CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)包含第四TCR亚基(例如，CD3ε)的胞内信号传导结构域的任选的胞内信号传导结构域；其中第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施例中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施例中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施例中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的。在一些实施例中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的，但不同于第一TCR亚基。在一些实施例中，胞外配体结合结构域在胞外TCR结合结构域的N末端处。在一些实施例中，胞外配体结合结构域在胞外TCR结合结构域的C末端处。在一些实施例中，TAC样嵌合受体进一步包含位于胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域源自CD8α。在一些实施例中，TAC样嵌合受体进一步包含位于TAC样嵌合受体的N末端处的信号肽，诸如源自CD8α的信号肽。
术语“多肽”和“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直链或支链的，它可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已被天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，形成二硫键、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵或修饰。该定义还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括但不限于非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。应当理解，由于本披露的多肽可以基于抗体或免疫球蛋白超家族的其他成员，因此在某些实施例中，“多肽”可以作为单链或作为两条或更多条相关链存在。
如在本文中可互换使用的，“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸及其类似物。如本文所用，“寡核苷酸”是指短的、通常单链的、合成的多核苷酸，其长度通常(但不一定)小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。产生本披露的结合分子的细胞可以包括亲本杂交瘤细胞，以及已经将编码抗体的核酸引入其中的细菌和真核宿主细胞。
“分离的核酸”是这样的核酸(例如RNA、DNA或混合核酸)：其基本上与天然伴随天然序列的其他基因组DNA序列以及蛋白或复合物诸如核糖体和聚合酶分离。“分离的”核酸分子是与存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。此外，“分离的”核酸分子，诸如cDNA分子，当通过重组技术产生时，可以基本上不含其他细胞物质或培养基，或者当化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学物质。在特定实施例中，一种或多种编码如本文所述单链抗体或抗体的核酸分子被分离或纯化。该术语包括已从其天然存在的环境中去除的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或由异源系统生物合成的类似物。基本上纯的分子可以包括该分子的分离形式。特别地，本文所述的编码CAR或CAR装甲的CCR的“分离的”核酸分子是从至少一种污染物核酸分子鉴定和分离的核酸分子，该核酸分子通常在其产生的环境中与该至少一种污染物核酸分子缔合。
术语“载体”是指用于携带或包括核酸序列，包括例如编码如本文所述的结合分子(例如，抗体)的核酸序列，以将核酸序列引入至宿主细胞中的一种物质。适用的载体包括例如表达载体、质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，其可以包括选择序列或可稳定整合入宿主细胞染色体的标记。此外，载体可以包括一种或多种选择性标记基因和适当的表达控制序列。表达控制序列可以包括本领域熟知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当两个或更多个核酸分子待共表达时(例如抗体重链和轻链或抗体VH和VL)，可以将两个核酸分子插入，例如，单个表达载体或单独的表达载体中。对于单一载体表达，编码核酸可以可操作地连接至一种共同的表达控制序列或连接至不同的表达控制序列，比如一种诱导型启动子和一种组成型启动子。可以使用本领域熟知的方法来确认将核酸分子引入宿主细胞。这样的方法包括例如核酸分析，诸如mRNA的RNA印迹或聚合酶链式反应(PCR)扩增、用于基因产物表达的免疫印迹或测试引入的核酸序列或其相应基因产物表达的其他合适的分析方法。本领域技术人员应当理解，可以使用本领域公知的方法来优化表达水平以获得足够的表达。
如本文所用，术语“宿主”是指动物，诸如哺乳动物(例如，人)。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以用核酸分子转染的特定目标细胞以及这样的细胞的子代或潜在子代。由于在后续世代中可能发生的突变或环境影响或核酸分子整合到宿主细胞基因组中，这样的细胞的子代可能与用核酸分子转染的亲本细胞不相同。
如本文所用，术语“自体的”意在指源自同一个体的任何材料，其中该材料随后被重新引入该个体。
“同种异体的”是指源自相同物种的不同个体的移植物。
如本文所用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已使用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代目标细胞及其子代。
本文所用的术语“免疫应答”作为免疫系统的细胞(例如，B细胞、T细胞或单核细胞)对刺激的应答包括在内。在一些实施例中，应答对特定抗原具有特异性(“抗原特异性应答”)。在一些实施例中，免疫应答是T细胞应答，例如CD4+应答或CD8+应答。在另一实施例中，应答是B细胞应答，并且导致特异性抗体产生。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准，或在美国药典、欧洲药典或其他公认的药典中列出用于动物，并且更特别地用于人。在一个实施例中，每种组分在与药物配制品的其他成分相容的意义上是“药学上可接受的”，并且适用于与人和动物的组织或器官接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称。参见例如，Lippincott Williams&Wilkins:Philadelphia,PA,2005；Handbook of Pharmaceutical Excipients,第6版；Rowe等人编辑；The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association:2009；Handbook of Pharmaceutical Additives,第3版；Ash和Ash编辑；Gower PublishingCompany:2007；Pharmaceutical Preformulation and Formulation,第2版；Gibson编辑；CRC Press LLC:Boca Raton,FL,2009。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂在所采用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂是水性pH缓冲溶液。
“载剂”或“赋形剂”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂或包封材料。赋形剂包括例如包封材料或添加剂，诸如吸收促进剂、抗氧化剂、结合剂、缓冲剂、载剂、包衣剂、着色剂、稀释剂、崩解剂、乳化剂、增量剂、填充剂、调味剂、湿润剂、润滑剂、香料、防腐剂、推进剂、释放剂、灭菌剂、甜味剂、增溶剂、湿润剂以及它们的混合物。术语“赋形剂”还可以指稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全或不完全))或媒介物。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以产生所需结果的工程化免疫效应细胞或包含药剂和本文提供的工程化免疫效应细胞或药物组合物的治疗分子的量。
术语“受试者”和“患者”可互换使用。如本文所用，在某些实施例中，受试者是哺乳动物，诸如非灵长类动物或灵长类动物(例如，人)。在特定实施例中，受试者是人。在一个实施例中，受试者是被诊断患有疾病或病症的哺乳动物，例如人。在另一实施例中，受试者是处于发展疾病或病症的风险中的哺乳动物，例如人。
“施用(Administer或administration)”是指将存在于体外的物质注射或以其他方式物理递送到患者体内的行为，例如通过粘膜、皮内、静脉内、肌内递送和/或本文所述或本领域已知的任何其他物理递送方法。
如本文所用，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或改善由施用一种或多种疗法引起的疾病或病状的进展、严重程度和/或持续时间。治疗可以通过评估与潜在病症相关的一种或多种症状是否已经减少、缓解和/或减轻来确定，使得观察到患者的改善，尽管患者可能仍然患有潜在病症。术语“治疗”包括控制和改善疾病。
术语“控制(manage、managing、和management)”是指受试者从不一定导致疾病治愈的疗法中获得的有益效果。
术语“预防(prevent、preventing、和prevention)”是指降低疾病、病症、病状或相关症状(例如，癌症)发作(或复发)的可能性。
如本文所用，“延迟”癌症的发展是指推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定和/或延缓疾病的发展。该延迟可以具有不同的时间长度，其取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。对本领域技术人员显而易见的是，足够的或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为该个体没有患上该疾病。与不使用该方法相比，“延迟”癌症的发展的方法是在给定的时间范围内降低疾病发展的可能性和/或在给定的时间范围内降低疾病程度的方法。这样的比较典型地基于使用统计学上显著数量的个体进行的临床研究。可以使用标准方法来检测癌症发展，这些标准方法包括但不限于计算机化轴向断层成像(CAT扫描)、磁共振成像(MRI)、腹部超声、凝血试验、动脉造影术或活检。发展也可以指最初可能无法检测到的癌症进展，并且包括发生、复发和发作。
术语“约”和“大约”是指在给定值或范围的20％内、15％内、10％内、9％内、8％内、7％内、6％内、5％内、4％内、3％内、2％内、1％内或更少。
如在本披露和权利要求中所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”、和“该/所述”包括复数形式，除非上下文另外清楚地指明。
应当理解，在本文中任何地方用术语“包含”描述实施例，也提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的类似实施例。还应当理解，在本文中任何地方用短语“基本上由……组成”描述实施例，也提供了以“由……组成”描述的类似实施例。
在短语“在A和B之间”或“在A-B之间”中使用的术语“在…之间”是指包括A和B的范围。
如本文中在短语诸如“A和/或B”中使用的术语“和/或”旨在包括A和B；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样，在短语诸如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施例中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
5.2.工程化免疫效应细胞
如下文第6部分中显示，将嵌合细胞因子受体引入表达一种或多种功能性外源受体的免疫效应细胞中，可以显著改善免疫效应细胞的性质/功能。在一些实施例中，免疫效应细胞表达(i)嵌合细胞因子受体，该嵌合细胞因子受体包含(a)第一胞外抗原结合结构域，其中该第一胞外抗原结合结构域源自NKG2D、截短的NKG2D、靶向NKG2D配体的抗体或其抗原结合片段、TIGIT或SIRP-α、或其变体，(b)第一跨膜结构域，和(c)细胞因子受体胞内结构域；和(ii)任选地功能性外源受体，该功能性外源受体包含(a)第二胞外抗原结合结构域、(b)第二跨膜结构域和(c)胞内信号传导结构域。
因此，在一方面，本文提供了宿主细胞(诸如免疫效应细胞)，该宿主细胞包含嵌合细胞因子受体，该嵌合细胞因子受体包含(a)第一胞外抗原结合结构域、(b)第一跨膜结构域和(c)细胞因子受体胞内结构域。在一些实施例中，胞外结构域源自NKG2D或其变体的胞外结构域。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域源自截短的NKG2D。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域源自截短的NKG2D(氨基酸位置89-216，SEQ ID NO:157)。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域源自截短的NKG2D(氨基酸位置98-216，SEQ ID NO:156)。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:6、156或157具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在其他实施例中，胞外结构域包含与NKG2D配体结合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，胞外结构域包含与NKG2D配体结合的一个或多个scFv。在其他实施例中，胞外结构域包含与NKG2D配体结合的一个或多个sdAb(诸如一个或多个VHH结构域)。NKG2D配体可以选自(但不限于)由MICA/B、ULBP-1、ULBP-2,5,6和ULBP-3组成的组。
在一些实施例中，免疫效应细胞包含SEQ ID NO:29、135、141、143或149的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29、135、141、143或149具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，免疫效应细胞包含SEQ ID NO:30-134、136-140、142、144、146或148的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:30-134、136-140、142、144、146或148具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，免疫效应细胞包含SEQ ID NO:150或151的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:150或151具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
NKG2D是一种跨膜蛋白，属于C型凝集素样受体的NKG2家族，也称为KLRK1、CD314、D12S2489E、KLR、NKG2-D、NKG2自然杀伤组2D、杀伤细胞凝集素样受体K1和杀伤细胞凝集素样受体K1。NKG2D由KLRK1基因编码，该基因位于小鼠的6号染色体和人类的12号染色体上的NK基因复合物(NKC)中。在人类中，其由NK细胞、γδT细胞和CD8+αβT细胞表达。NKG2D识别来自MIC和RAET1/ULBP家族的诱导自体蛋白，这些蛋白出现在应激的、恶变的和感染细胞的表面。NKG2D配体是诱导自体蛋白，其在正常细胞表面完全不存在或仅以低水平存在，但它们被经感染、转化、衰老和应激细胞过表达。NKG2D序列在本领域中是已知的(参见，例如，OMIM:611817，同源基因：136440，基因卡：KLRK1)。
在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域源自TIGIT。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域源自SIRP-α。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列。
在一些实施例中，宿主细胞表达一种或多种功能性外源受体。功能性外源受体可以是例如嵌合抗原受体(CAR)、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合TCR(cTCR)、和T细胞抗原偶联物(TAC)样嵌合受体。在一些实施例中，功能性外源受体是CAR。在一些实施例中，功能性外源受体是TCR。在一些实施例中，功能性外源受体是cTCR。在其他实施例中，功能性外源受体是TAC。可以在本披露中使用任何能够执行免疫效应子功能的免疫效应细胞，包括但不限于外周血单个核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
在一些实施例中，本文提供了包含本文所述的(例如，如以下部分中提供的)多肽、多核苷酸或载体中的任一种的宿主细胞(诸如免疫效应细胞)。
5.2.1.嵌合细胞因子受体
在一方面，本文提供了一种嵌合细胞因子受体，该嵌合细胞因子受体包含源自一种或多种细胞因子受体的胞内结构域，即细胞因子受体胞内结构域。本文提供的嵌合细胞因子受体也包含胞外结构域和跨膜结构域。
细胞因子受体胞内结构域
在一些实施例中，本发明嵌合细胞因子受体中采用的细胞因子受体选自由以下组成的组：IL2Rα、IL7Rα、IL9R-1、IL9R-2、IL9R-3、IL12Rβ1、IL12Rβ2、IL15Rα、IL15Rβ-1、IL15Rβ-2、IL15Rβ-3、IL18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体及其组合。
在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL2Rα的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL7Rα的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL9R-1的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL9R-2的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL9R-3的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL12Rβ1的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL12Rβ2的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL15Rα的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL15Rβ-1的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL15Rβ-2的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL15Rβ-3的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL-18Rα的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL18Rβ的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL21R-1的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL21R-2的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL21R-3的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL-10R2的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL22R1的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL23R-1的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL23R-2的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL23R-3的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL-27Rα的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自gp130的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL31RA的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自OSMRβ的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL36R的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自IL1RAcP的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自GM-CSFRα的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自GM-CSFRβ-1的区域。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体包含胞内结构域，该胞内结构域包含源自GM-CSFRβ-2的区域。
在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含来自以下中的两个或更多个(诸如2、3、4、5或更多个)的序列：IL2Rα、IL7Rα、IL9R-1、IL9R-2、IL9R-3、IL12Rβ1、IL12Rβ2、IL15Rα、IL15Rβ-1、IL15Rβ-2、IL15Rβ-3、IL18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。
例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL2Rα的区域和源自以下的区域：IL7Rα、IL2Rα、IL9R-1、IL9R-2、IL9R-3、IL12Rβ1、IL12Rβ2、IL15Rα、IL15Rβ-1、IL15Rβ-2、IL15Rβ-3、IL18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL7Rα的区域和源自以下的区域：IL9R-1、IL9R-2、IL9R-3、IL12Rβ1、IL12Rβ2、IL15Rα、IL15Rβ-1、IL15Rβ-2、IL15Rβ-3、IL18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL9R-1的区域和源自以下的区域：IL9R-2、IL9R-3、IL12Rβ1、IL12Rβ2、IL15Rα、IL15Rβ-1、IL15Rβ-2、IL15Rβ-3、IL18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL9R-2的区域和源自以下的区域：IL9R-3、IL12Rβ1、IL12Rβ2、IL15Rα、IL15Rβ-1、IL15Rβ-2、IL15Rβ-3、IL18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL9R-3的区域和源自以下的区域：IL12Rβ1、IL12Rβ2、IL15Rα、IL15Rβ-1、IL15Rβ-2、IL15Rβ-3、IL18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL12Rβ1的区域和源自以下的区域：IL12Rβ2、IL15Rα、IL15Rβ-1、IL15Rβ-2、IL15Rβ-3、IL18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL12Rβ2的区域和源自以下的区域：IL15Rα、IL15Rβ-1、IL15Rβ-2、IL15Rβ-3、IL18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、或其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL15Rα的区域和源自以下的区域：IL15Rβ-1、IL15Rβ-2、IL15Rβ-3、IL18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL15Rβ-1的区域和源自以下的区域：IL15Rβ-2、IL15Rβ-3、IL18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL15Rβ-2的区域和源自以下的区域：IL15Rβ-3、IL18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL15Rβ-3的区域和源自以下的区域：IL18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL18Rα的区域和源自以下的区域：IL18R、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL18Rβ的区域和源自以下的区域：IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL21R-1的区域和源自以下的区域：IL21R-2、IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL21R-2的区域和源自以下的区域：IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL21R-3的区域和源自以下的区域：IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL10R2的区域和源自以下的区域：IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL22R1的区域和源自以下的区域：IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL22R1的区域和源自以下的区域：GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL23R-1的区域和源自以下的区域：IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL23R-2的区域和源自以下的区域：IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL23R-3的区域和源自以下的区域：IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL27Rα的区域和源自以下的区域：gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自gp130的区域和源自以下的区域：IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL31RA的区域和源自以下的区域：OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自OSMRβ的区域和源自以下的区域：IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL36R的区域和源自以下的区域：IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。例如，在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自IL1RAcP的区域和源自以下的区域：GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、其变体、或其组合。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自GM-CSFRβ-1的区域、和源自GM-CSFRβ-2或其变体的区域。
在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含源自以下的区域：IL-7Rα、IL12Rβ1、IL12Rβ2、IL15Rα、IL15Rβ-1、IL15Rβ-2、IL15Rβ-3、IL-18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、IL9R-1、IL9R-2、IL9R-3、IL-7Rα-IL12Rβ1、IL-7Rα-IL15Rα、IL-7Rα-IL15Rβ-1、IL-7Rα-IL15Rβ-2、IL-7Rα-IL21R-1、IL-7Rα-IL21R-2、IL-7Rα-IL21R-3、IL-7Rα-IL23R-2、IL-7Rα-GMCSFRα、IL-7Rα-GM-CSFRβ-1、IL-7Rα-GM-CSFRβ-2、IL12Rβ1-IL15Rα、IL12Rβ1-IL15Rβ-1、IL12Rβ1-IL15Rβ-2、IL12Rβ1-IL-21R-1、IL12Rβ1-IL-21R-2、IL12Rβ1-IL-21R-3、IL12Rβ1-IL-23R-2、IL12Rβ1-GM-CSFRα、IL12Rβ1-GM-CSFRβ-1、IL12Rβ1-GM-CSFRβ-2、IL12Rβ2-IL15Rα、IL12Rβ2-IL15Rβ-1、IL12Rβ2-IL15Rβ-2、IL12Rβ2-IL-21R-1、IL12Rβ2-IL-21R-2、IL12Rβ2-IL-21R-3、IL12Rβ2-IL-23R-2、IL12Rβ2-GM-CSFRα、IL12Rβ2-GM-CSFRβ-1、IL12Rβ2-GM-CSFRβ-2、IL15Rα-IL-21R-1、IL15Rα-IL-21R-2、IL15Rα-IL-21R-3、IL15Rα-IL-23R-2、IL15Rα-GM-CSFRα、IL15Rα-GM-CSFRβ-1、IL15Rα-GM-CSFRβ-2、IL15Rβ-1-IL-21R-1、L15Rβ-1-IL-21R-2、IL15Rβ-1-IL-21R-3、IL15Rβ-1-IL-23R-2、IL15Rβ-1-GM-CSFRα、IL15Rβ-1-GM-CSFRβ-1、IL15Rβ-1-GM-CSFRβ-2、IL15Rβ-2-IL-21R-1、IL15Rβ-2-IL-21R-2、IL15Rβ-2-IL-21R-3、L15Rβ-2-IL-23R-2、IL15Rβ-2-GM-CSFRα、IL15Rβ-2-GM-CSFRβ-1、IL15Rβ-2-GM-CSFRβ-2、IL-21R-1-IL-23R-2、IL-21R-1-GM-CSFRα、IL-21R-1-GM-CSFRβ-1、IL-21R-1-GM-CSFRβ-2、IL-21R-2-IL-23R-2、IL-21R-2-GM-CSFRα、IL-21R-2-GM-CSFRβ-1、IL-21R-2-GM-CSFRβ-2、IL-21R-3-IL-23R-2、IL-21R-3-GM-CSFRα、IL-21R-3-GM-CSFRβ-1、IL-21R-3-GM-CSFRβ-2、IL-23R-2-GM-CSFRα、IL-23R-2-GM-CSFRβ-1、IL-23R-2-GM-CSFRβ-2、IL-7Rα-IL-9R-2、IL12Rβ1-IL-9R-2、IL12Rβ2-IL-9R-2、IL15Rα-IL-9R-2、IL15Rβ-1-IL-9R-2、IL15Rβ-2-IL-9R-2、IL-21R-1-IL-9R-2、IL-21R-2-IL-9R-2、IL-21R-3-IL-9R-2、IL-23R-2-IL-9R-2、GM-CSFRα-IL-9R-2、GM-CSFRβ-1-IL-9R-2、GM-CSFRβ-2-IL-9R-2、IL-7Rα-IL-12Rβ2、或其变体。
当本文提供的嵌合细胞因子受体的胞内结构域包含来自两种或更多种细胞因子受体的序列时，这些序列可以是任何顺序。在一些实施例中，细胞因子受体胞内结构域包含以下区域，该区域具有选自SEQ ID NO:8-28的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:8-28的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在特定实施例中，细胞因子受体胞内结构域包含SEQ ID NO:8、10、14-17或20-28中的一个或多个氨基酸序列。
跨膜结构域
本披露的嵌合细胞因子受体包含可以直接或间接与胞外抗原结合结构域融合的跨膜结构域。跨膜结构域可源自天然或合成来源。如本文所用，“跨膜结构域”是指在细胞膜(例如，真核细胞膜)中热力学稳定的任何蛋白质结构。适用于本文所述的嵌合细胞因子受体的跨膜结构域可获自天然存在的蛋白质。替代性地，其可以是合成的、非天然存在的蛋白区段，例如，在细胞膜中热力学稳定的疏水蛋白区段。
根据跨膜结构域的三维结构对跨膜结构域进行分类。例如，跨膜结构域可形成α螺旋、多于一个α螺旋的复合物、β-桶状结构或能够跨越细胞磷脂双层的任何其他稳定结构。另外，跨膜结构域也可以或替代性地根据跨膜结构域拓扑结构进行分类，包括跨膜结构域穿过膜的次数和蛋白的取向。例如，单途径膜蛋白穿过细胞膜一次，而多途径膜蛋白穿过细胞膜至少两次(例如，2、3、4、5、6、7或更多次)。膜蛋白可以被定义为I型、II型或III型，这取决于它们的末端和一个或多个穿膜区段相对于细胞内部和外部的拓扑结构。I型膜蛋白具有单个跨膜区，并且其定向为使得蛋白的N末端存在于细胞的脂质双层的胞外侧，而该蛋白的C末端存在于胞内侧。II型膜蛋白也具有单个跨膜区，但其定向为使得蛋白的C末端存在于细胞的脂质双层的胞外侧，而该蛋白的N末端存在于胞内侧。III型膜蛋白具有多个跨膜区段，并且可根据跨膜区段的数量和N末端和C末端的位置进一步分类。
在一些实施例中，本文所述的嵌合细胞因子受体的跨膜结构域源自I型单途径膜蛋白。在一些实施例中，来自多途径膜蛋白的跨膜结构域也可以与用于本文所述的嵌合细胞因子受体相容。多途径膜蛋白可以包含复合物(至少2、3、4、5、6、7或更多)α螺旋或β折叠结构。在一些实施例中，多途径膜蛋白的N末端和C末端存在于脂质双层的相对侧，例如，蛋白的N末端存在于脂质双层的胞内侧，而该蛋白的C末端存在于胞外侧。
用于本文所述的嵌合细胞因子受体的跨膜结构域还可以包含合成的、非天然存在的蛋白区段的至少一部分。在一些实施例中，跨膜结构域是合成的、非天然存在的α螺旋或β折叠。在一些实施例中，蛋白区段为至少约20个氨基酸，例如，至少18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸。合成的跨膜结构域的实例是本领域已知的，例如在美国专利号7,052,906和PCT公开号WO 2000/032776中，其相关披露内容通过援引并入本文。
本文提供的跨膜结构域可以包含跨膜区和位于跨膜结构域的C末端侧的胞内区。跨膜结构域的胞内区可包含三个或更多个氨基酸，并且在一些实施例中，有助于使跨膜结构域在脂质双层中定向。在一些实施例中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的跨膜区中。在一些实施例中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的胞内区中。在一些实施例中，跨膜结构域的胞内区包含带正电荷的氨基酸。在一些实施例中，跨膜结构域的胞内区包含氨基酸精氨酸、丝氨酸和赖氨酸。
在一些实施例中，跨膜结构域的跨膜区包含疏水性氨基酸残基。在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的跨膜结构域包含人工疏水性序列。例如，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体可以存在于跨膜结构域的C末端处。在一些实施例中，跨膜区主要包含疏水性氨基酸残基，例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或缬氨酸。在一些实施例中，跨膜区是疏水性的。在一些实施例中，跨膜区包含聚亮氨酸-丙氨酸序列。蛋白或蛋白区段的亲水性或者疏水性或亲水性特征可以通过本领域已知的任何方法来评估，例如Kyte和Doolittle亲水性分析。
在一些实施例中，嵌合细胞因子受体的跨膜结构域包含选自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CDl la、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C的跨膜结构域。
在一些实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的跨膜结构域包含Janus激酶(JAK)结合结构域。在一些实施例中，JAK结合结构域源自由EPOR、GHR、TPOR或其变体组成的组。在一些实施例中，JAK结合结构域源自TPOR。在一些实施例中，JAK结合结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施例中，JAK结合结构域源自EPOR。在一些实施例中，JAK结合结构域源自GHR。在一些实施例中，除了上述的跨膜结构域之外，本发明嵌合细胞因子受体的跨膜结构域包含JAK结合结构域。
胞外结构域
在一些实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的胞外结构域与靶细胞(诸如肿瘤细胞或感染细胞)表面上表达的抗原结合。
本文所述嵌合细胞因子受体的胞外结构域包含一个或多个抗原结合结构域。本文提供的嵌合细胞因子受体的胞外结构域可以是任何形式，只要胞外结构域与其靶点的结合激活下游胞内细胞因子信号，例如，触发嵌合细胞因子受体的二聚化。在一些实施例中，胞外结构域源自天然存在的受体(例如，受体的ECD)。在其他实施例中，胞外结构域不是源自天然存在的受体。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域源自NKG2D或截短的NKG2D(诸如NKG2D或截短的NKG2D的ECD)或其变体。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:6、156或157的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6、156或157具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域源自截短的NKG2D(氨基酸位置89-216，SEQ IDNO:157)。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域源自截短的NKG2D(氨基酸位置98-216，SEQ ID NO:156)。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域源自TIGIT(诸如TIGIT的ECD)。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域源自SIRP-α(诸如SIRP-α的ECD)。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列。在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域源自靶向NKG2D配体或其变体的抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，NKG2D配体选自由MICA/B、ULBP-1、ULBP-2,5,6和ULBP-3组成的组。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含与NKG2D配体结合的一个或多个scFv或一个或多个sdAb。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域源自免疫检查点的胞外结构域。在一些实施例中，免疫检查点选自由PD-1、CTLA4、或其变体组成的组。在一些实施例中，免疫检查点是PD-1。在一些实施例中，免疫检查点是CTLA4。
在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞外抗原结合结构域是单特异性的。在其他实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞外抗原结合结构域是多特异性的。在其他实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞外抗原结合结构域是单价的。在其他实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体的胞外抗原结合结构域是多价的。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域包含两个或更多个抗原结合结构域，这些抗原结合结构域直接通过肽键或通过肽接头彼此融合。
在一些实施例中，胞外抗原结合结构域包含抗体或其片段。例如，结合结构域可以源自单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整单克隆抗体)、具有多表位或单表位特异性的抗体、多克隆或单价抗体、多价抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们表现出所需的生物活性)、单链抗体、单域抗体及其片段(例如，结构域抗体)。抗体可以是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和/或亲和力成熟抗体，以及来自其他物种(例如，小鼠、兔、美洲驼等)的抗体。在一些实施例中，抗体包括免疫球蛋白类多肽中的B细胞的多肽产物，其能够结合特定分子抗原并且由两对相同的多肽链组成，其中每对多肽链具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，每条链的每个氨基末端部分包括约100至约130或更多个氨基酸的可变区，并且每条链的每个羧基末端部分包括恒定区。参见例如，Antibody Engineering(Borrebaeck编辑,第2版1995)；以及Kuby,Immunology(第3版1997)。抗体还包括但不限于合成抗体、重组产生的抗体、包括来自骆驼科物种(例如，美洲驼或羊驼)的单域抗体或它们的人源化变体、内抗体、抗独特型(抗Id)抗体，以及上述任一种的功能片段(例如抗原结合片段)，这些功能片段是指抗体重链或轻链多肽的一部分，其保留了该片段所来源的抗体的一些或全部结合活性。功能片段(例如，抗原结合片段)的非限制性实例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性等)、Fab片段、F(ab')片段、F(ab)2片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和微型抗体。特别地，本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如，抗原结合结构域或含有结合抗原的抗原结合位点的分子(例如，抗体的一个或多个CDR)。这样的抗体片段可见于例如Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratory Manual(1989)；Mol.Biology and Biotechnology:A Comprehensive DeskReference(Myers编辑,1995)；Huston等人,1993,Cell Biophysics 22:189-224；Plückthun和Skerra,1989,Meth.Enzymol.178:497-515；以及Day,Advanced Immunochemistry(第2版,1990)。本文提供的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。抗体可以是激动性抗体或拮抗性抗体。抗体可以既不是激动性的也不是拮抗性的。
在特定实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的胞外抗原结合结构域包含单链Fv(sFv或scFv)。scFv是包含连接到单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，scFv多肽进一步包含在VH与VL结构域之间的多肽接头，该多肽接头使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。参见Pluckthun in The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
在另一特定实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的胞外抗原结合结构域包含一个或多个单域抗体(sdAb)。sdAb可以具有相同或不同的来源，并且具有相同或不同的大小。示例性sdAb包括但不限于来自仅有重链的抗体的重链可变结构域(例如，VHH或VNAR)、天然缺乏轻链的结合分子、源自常规4链抗体的单域(诸如VH或VL)、人源化的仅有重链的抗体、由表达人重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人单域抗体，以及工程化结构域和除源自抗体的那些外的单域支架。本领域已知的或由本披露开发的任何sdAb，包括在本披露中上述的单域抗体在内，可用于构建本文所述的嵌合细胞因子受体。sdAb可以源自任何物种，这些物种包括但不限于小鼠、大鼠、人、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。本文考虑的单域抗体还包括来自除骆驼科和鲨鱼外的物种的天然存在的单域抗体分子。
在一些实施例中，sdAb源自天然存在的单域抗原结合分子，其称为缺乏轻链的重链抗体(本文也称为“仅有重链的抗体”)。例如，这样的单域分子披露于WO 94/04678和Hamers-Casterman,C.等人Nature 363:446-448(1993)中。为清楚起见，源自天然缺乏轻链的重链分子的可变结构域在本文中称为VHH，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分开。这样的VHH分子可以源自骆驼科物种，例如骆驼、美洲驼、骆马、单峰骆驼、羊驼和原驼中产生的抗体。骆驼科以外的其它物种可以产生天然缺乏轻链的重链分子，并且这样的VHH在本披露的范围内。此外，还考虑VHH的人源化型式以及其它修饰和变体并在本披露的范围内。在一些实施例中，sdAb源自软骨鱼中发现的免疫球蛋白的可变区。例如，sdAb可源自鲨鱼血清中发现的称为新型抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型。产生源自NAR(“IgNAR”)的可变区的单域分子的方法描述于WO 03/014161和Streltsov,Protein Sci.14:2901-2909(2005)中。
在一些实施例中，天然存在的针对特定抗原或靶点的VHH结构域可以从骆驼科动物VHH序列的(原初或免疫)文库中获得。这样的方法可以涉及或可以不涉及使用所述抗原或靶点、或其至少一部分、片段、抗原决定簇或表位，使用一种或多种本领域已知的筛选技术来筛选这样的文库。这样的文库和技术例如描述于WO99/37681、WO 01/90190、WO 03/025020和WO 03/035694中。替代性地，可以使用源自(原初或免疫)VHH文库的改进的合成或半合成文库，诸如通过例如WO 00/43507中描述的技术诸如随机诱变和/或CDR改组从(原初或免疫)VHH文库获得的VHH文库。
在一些实施例中，sdAb是重组的、CDR移植的、人源化的、骆驼化的、去免疫的和/或体外产生的(例如，通过噬菌体展示选择的)。在一些实施例中，框架区的氨基酸序列可以通过框架区中特定氨基酸残基的“骆驼化”而改变。骆驼化是指来自常规4链抗体的(天然存在的)VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基被存在于重链抗体的VHH结构域中的一个或多个相应位置处的一个或多个氨基酸残基替换或取代。这可以以本领域已知的方式进行，该方式对于技术人员来说是清楚的。这样的“骆驼化”取代优选被插入在形成VH-VL界面和/或存在于该VH-VL界面的氨基酸位置处，和/或在所称的骆驼科标志残基处，如本文所定义(参见例如，WO 94/04678；Davies和Riechmann FEBS Letters 339:285-290(1994)；Davies和Riechmann,Protein Engineering 9(6):531-537(1996)；Riechmann,J.Mol.Biol.259:957-969(1996)；以及Riechmann和Muyldermans,J.Immunol.Meth.231:25-38(1999))。
在一些实施例中，sdAb是由表达人重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人单域抗体。参见例如，US20090307787、美国专利号8,754,287、US20150289489、US20100122358、和WO 2004049794。
在一些实施例中，单域抗体由常规四链抗体产生。参见例如，EP 0 368 684；Ward等人,Nature,341(6242):544-6(1989)；Holt等人,Trends Biotechnol.,21(11):484-490(2003)；WO 06/030220；以及WO 06/003388。
在一些实施例中，胞外抗原结合结构域包含人源化抗体或其片段。人源化抗体可以包含人框架区和人恒定区序列。
人源化抗体可以使用本领域已知的多种技术产生，包括但不限于CDR移植(欧洲专利号EP 239,400；国际公开号WO 91/09967；以及美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)、镶饰(veneering)或表面重塑(resurfacing)(欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka等人,1994,Protein Engineering 7(6):805-814；以及Roguska等人,1994,PNAS91:969-973)、链改组(美国专利号5,565,332)以及例如以下中披露的技术：美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、WO 93/17105、Tan等人,J.Immunol.169:111925(2002)、Caldas等人,ProteinEng.13(5):353-60(2000)、Morea等人,Methods 20(3):26779(2000)、Baca等人,J.Biol.Chem.272(16):10678-84(1997)、Roguska等人,Protein Eng.9(10):895 904(1996)、Couto等人,Cancer Res.55(23增刊):5973s-5977s(1995)、Couto等人,CancerRes.55(8):1717-22(1995)、Sandhu JS,Gene 150(2):409-10(1994)、以及Pedersen等人,J.Mol.Biol.235(3):959-73(1994)。还参见美国专利公开号US 2005/0042664A1(2005年2月24日)，其中每一个通过援引以其全文并入本文。用于人源化非人抗体的各种方法是本领域已知的。例如，人源化抗体可以具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，这些残基典型地取自“输入”可变结构域。例如，可以按照以下的方法，通过用高变区序列取代人抗体的相应序列进行人源化：Jones等人,1986,Nature 321:522-25；Riechmann等人,1988,Nature 332:323-27；以及Verhoeyen等人,1988,Science239:1534-36。
在一些情况下，人源化抗体通过CDR移植构建，其中亲本非人抗体(例如，啮齿动物)的六个CDR的氨基酸序列被移植到人抗体框架上。例如，Padlan等人确定CDR中只有约三分之一的残基实际接触抗原，并将这些称为“特异性决定残基”或SDR(Padlan等人,1995,FASEB J.9:133-39)。在SDR移植技术中，仅SDR残基被移植到人抗体框架上(参见例如，Kashmiri等人,2005,Methods 36:25-34)。
选择用于制备人源化抗体的人(轻链和重链)可变结构域对于降低抗原性可能很重要。例如，根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选非人(例如，啮齿动物)抗体的可变结构域的序列。可以选择最接近啮齿动物的人序列作为人源化抗体的人框架(Sims等人,1993,J.Immunol.151:2296-308；以及Chothia等人,1987,J.Mol.Biol.196:901-17)。另一种方法使用源自轻链或重链的特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-89；以及Presta等人,1993,J.Immunol.151:2623-32)。在一些情况下，框架源自最丰富的人亚类VL6亚组I(VL6I)和VH亚组III(VHIII)的共有序列。在另一种方法中，使用人种系基因作为框架区的来源。
在基于CDR比较的替代范例中，称为超人源化，FR同源性是不相关的。该方法由将非人序列与功能性人种系基因库进行比较组成。然后选择那些编码与鼠序列相同或密切相关的规范结构的基因。接下来，在与非人抗体共有规范结构的基因中，选择那些在CDR内具有最高同源性的基因作为FR供体。最后，将非人CDR移植到这些FR上(参见例如，Tan等人,2002,J.Immunol.169:1119-25)。
通常还希望将抗体人源化以保留它们对抗原的亲和力和其他有利的生物学性质。为了实现该目标，根据一种方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是通常可获得的并且是本领域技术人员所熟悉的。可以获得说明和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。这些包括例如WAM(Whitelegg和Rees,2000,Protein Eng.13:819-24)、Modeller(Sali和Blundell,1993,J.Mol.Biol.234:779-815)和Swiss PDBViewer(Guex和Peitsch,1997,Electrophoresis 18:2714-23)。检查这些显示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，例如分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体和输入序列中选择并组合FR残基，从而获得所需的抗体特征，诸如对一个或多个靶抗原的亲和力增加。通常，高变区残基直接且最显著地参与影响抗原结合。
抗体人源化的另一种方法是基于称为Human String Content(HSC)的抗体人性度量。该方法将小鼠序列与人种系基因库进行比较，并将差异评分为HSC。然后通过最大化其HSC而不是使用全局同一性测量来将靶序列人源化以产生多种不同的人源化变体(Lazar等人,2007,Mol.Immunol.44:1986-98)。
除了上述方法之外，经验方法也可用于产生和选择人源化抗体。这些方法包括那些基于产生大型人源化变体文库和使用富集技术或高通量筛选技术选择最佳克隆的方法。抗体变体可以从噬菌体、核糖体和酵母展示文库以及通过细菌菌落筛选来分离(参见例如，Hoogenboom,2005,Nat.Biotechnol.23:1105-16；Dufner等人,2006,TrendsBiotechnol.24:523-29；Feldhaus等人,2003,Nat.Biotechnol.21:163-70；以及Schlapschy等人,2004,Protein Eng.Des.Sel.17:847-60)。
在FR文库方法中，在FR中的特定位置引入一批残基变体，然后筛选文库以选择最佳支持移植的CDR的FR。待取代的残基可以包括被鉴定为可能有助于CDR结构的“游标”残基中的一些或全部(参见例如，Foote和Winter,1992,J.Mol.Biol.224:487-99)，或来自Baca等人(1997,J.Biol.Chem.272:10678-84)鉴定的更有限的一组靶残基。
在FR改组中，整个FR与非人CDR组合而不是创建所选残基变体的组合文库(参见例如，Dall'Acqua等人,2005,Methods 36:43-60)。可以在两步过程(首先是VL人源化，然后是VH)中筛选文库以进行结合。替代性地，可以使用一步FR改组过程。这样的方法已被证明比两步筛选更有效，因为所得抗体表现出改善的生物化学和物理化学性质，包括增强的表达、增加的亲和力和热稳定性(参见例如，Damschroder等人,2007,Mol.Immunol.44:3049-60)。
“人源化工程(humaneering)”方法基于基本最小特异性决定簇(minimumspecificity determinant，MSD)的实验鉴定，并基于将非人片段顺序替换到人FR文库中并评估结合。它从非人VH和VL链的CDR3区域开始，并逐渐取代非人抗体的其他区域进入人FR，包括VH和VL的CDR1和CDR2。该方法通常导致表位保留和鉴定来自具有不同人V区段CDR的多个亚类的抗体。人源化工程允许分离与人类种系基因抗体91％-96％同源的抗体(参见例如，Alfreito,Cambridge Healthtech Institute的第三届年度PEGS,The ProteinEngineering Summit,2007)。
“人工程化(human engineering)”方法涉及通过对抗体的氨基酸序列进行特异性改变来改变非人抗体或抗体片段(诸如小鼠或嵌合抗体或抗体片段)，从而产生在人中具有降低的免疫原性的经修饰的抗体，该经修饰的抗体仍然保留原始非人抗体的所需结合性质。通常，该技术涉及将非人(例如，小鼠)抗体的氨基酸残基分类为“低风险”、“中等风险”或“高风险”残基。使用总体风险/回报计算进行分类，该计算评估进行特定取代(例如，针对人的免疫原性)的预测益处与取代将影响所得抗体折叠的风险。可以通过将来自非人抗体可变区的氨基酸序列与特定或共有人抗体序列的相应区域进行比对来选择将在非人(例如，小鼠)抗体序列的给定位置(例如，低风险或中等风险)处被取代的特定人氨基酸残基。非人序列中低风险或中等风险位置的氨基酸残基可以根据比对取代人抗体序列中的相应残基。以下中更详细地描述了用于制备人工程化蛋白的技术：Studnicka等人,1994,Protein Engineering 7:805-14；美国专利号5,766,886、5,770,196、5,821,123和5,869,619；以及PCT公开WO 93/11794。
可以使用例如Composite Human AntibodyTM技术(Antitope Ltd.,Cambridge,United Kingdom)产生复合人抗体。为了产生复合人抗体，以避免T细胞表位的方式从多个人抗体可变区序列的片段设计可变区序列，从而使所得抗体的免疫原性最小化。这样的抗体可包含人恒定区序列，例如，人轻链和/或重链恒定区。
去免疫化抗体是其中T细胞表位已被去除的抗体。已经描述了用于制备去免疫化抗体的方法。参见例如，Jones等人,Methods Mol Biol.2009；525:405-23,xiv和De Groot等人,Cell.Immunol.244:148-153(2006)。去免疫化抗体包含T细胞表位缺失的可变区和人恒定区。简言之，对抗体的VH和VL进行克隆，随后通过在T细胞增殖测定中测试源自抗体VH和VL的重叠肽来鉴定T细胞表位。通过计算机方法鉴定T细胞表位以鉴定与人MHC II类结合的肽。在VH和VL中引入突变以消除与人MHC II类的结合。然后使用突变的VH和VL来产生去免疫化抗体。
在某些实施例中，胞外抗原结合结构域包含多个结合结构域。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域包含多特异性抗体或其片段，例如，胞外抗原结合结构域包含串联的多个结合结构域(例如，多个scFv)。在其他实施例中，胞外抗原结合结构域包含多价抗体或其片段。术语“特异性”是指抗原结合蛋白对抗原特定表位的选择性识别。如本文所用，术语“多特异性”表示抗原结合蛋白具有两个或更多个抗原结合位点，其中至少两个结合不同的抗原。如本文所用，术语“价”表示抗原结合蛋白中存在指定数目的结合位点。全长抗体具有两个结合位点并且是二价的。如此，术语“三价”、“四价”、“五价”和“六价”分别表示抗原结合蛋白中存在两个结合位点、三个结合位点、四个结合位点、五个结合位点和六个结合位点。
多特异性抗体诸如双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。用于制备多特异性抗体的方法是本领域已知的，诸如通过共表达两个免疫球蛋白重链-轻链对，其中两个重链具有不同的特异性(参见例如，Milstein和Cuello,1983,Nature 305:537-40)。关于产生多特异性抗体(例如，双特异性抗体)的进一步细节，参见例如，双特异性抗体(Kontermann编辑,2011)。
抗体可以是具有两个或更多个抗原结合位点的多价抗体(例如，四价抗体)，可以通过编码抗体的多肽链的核酸的重组表达很容易地产生该抗体。在某些实施例中，多价抗体包含三个至约八个抗原结合位点(或由三个至约八个抗原结合位点组成)。在一个这样的实施例中，多价抗体包含四个抗原结合位点(或由四个抗原结合位点组成)。多价抗体包含至少一条多肽链(例如，两条多肽链)，其中一条或多条多肽链包含两个或更多个可变结构域。例如，一条或多条多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2表示氨基酸或多肽，并且n是0或1。例如，一条或多条多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体可进一步包含至少两种(例如，四种)轻链可变结构域多肽。例如，本文中的多价抗体可包含约两种至约八种轻链可变结构域多肽。本文所考虑的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，并且任选地进一步包含CL结构域。
在本发明嵌合细胞因子受体的胞外抗原结合结构域中存在多个结合结构域的情况下。各种结构域可以通过肽接头彼此融合。在一些实施例中，结构域彼此直接融合而没有任何肽接头。肽接头可以相同或不同。取决于各种结构域的结构和/或功能特征，每个肽接头可以具有相同或不同的长度和/或序列。可以独立地选择和优化每个肽接头。嵌合细胞因子受体中使用的一个或多个肽接头的长度、柔性程度和/或其他性质可以对性质具有一些影响，包括但不限于对一种或多种特定抗原或表位的亲和力、特异性或亲合力。在一些实施例中，肽接头包含柔性残基(诸如甘氨酸和丝氨酸)，使得相邻结构域相对于彼此自由移动。例如，甘氨酸-丝氨酸双联体可以是合适的肽接头。
肽接头可具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，源自仅有重链的抗体的铰链区的序列可以用作接头。参见例如WO1996/34103。在一些实施例中，肽接头是柔性接头。示例性柔性接头包括但不限于甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n(SEQ ID NO:152)、(GSGGS)n(SEQ ID NO:153)、(GGGS)n(SEQ ID NO:154)和(GGGGS)n(SEQ ID NO:155)，其中n是至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头。例如，如以下中所述的本领域已知的其它接头也可以包括在本文提供的嵌合细胞因子受体中：WO 2016014789、WO 2015158671、WO 2016102965、US20150299317、WO 2018067992、US 7741465、Colcher等人,J.Nat.Cancer Inst.82:1191-1197(1990)、和Bird等人,Science 242:423-426(1988)，其中每个的披露内容通过援引并入本文。
在一些实施例中，本发明嵌合细胞因子受体中提供的胞外抗原结合结构域识别充当与特殊疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记的抗原。在一些实施例中，抗原是肿瘤抗原。肿瘤表达多种可作为免疫应答(尤其是T细胞介导的免疫应答)的靶抗原的蛋白质。嵌合细胞因子受体靶向的抗原可以是单个病变细胞上的抗原，或是在各自都会影响疾病的不同细胞上表达的抗原。嵌合细胞因子受体靶向的抗原可能直接或间接牵涉到疾病中。
在一些实施例中，靶细胞的抗原是癌细胞表面上的抗原。在一些实施例中，抗原是肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原或新生抗原。
在一些实施例中，靶细胞是癌细胞，例如以下癌症的细胞：肾上腺癌、肛门癌、阑尾癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食道癌、胆囊癌、妊娠滋养细胞癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、肠癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤(MM)、神经内分泌肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、窦癌、皮肤癌、软组织肉瘤、脊椎癌、胃癌、睾丸癌、咽喉癌、甲状腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌或外阴癌。在一些实施例中，癌症是肾上腺癌、肛门癌、阑尾癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食道癌、胆囊癌、妊娠滋养细胞癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、肠癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤(MM)、神经内分泌肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、窦癌、皮肤癌、软组织肉瘤、脊椎癌、胃癌、睾丸癌、咽喉癌、甲状腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌或外阴癌。
在一些实施例中，肾上腺癌是肾上腺皮质癌(ACC)、肾上腺皮质癌、嗜铬细胞瘤或神经母细胞瘤。在一些实施例中，肛门癌是鳞状细胞癌、泄殖腔源性癌、腺癌、基底细胞癌或黑色素瘤。在一些实施例中，阑尾癌是神经内分泌肿瘤(NET)、黏液腺癌、杯状细胞类癌、肠型腺癌或印戒细胞腺癌。在一些实施例中，胆管癌是肝外胆管癌、腺癌、肝门部胆管癌、肝门周胆管癌、远端胆管癌或肝内胆管癌。在一些实施例中，膀胱癌是移行细胞癌(TCC)、乳头状癌、扁平癌、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌或肉瘤。在一些实施例中，骨癌是原发性骨癌、肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨巨细胞瘤、脊索瘤或转移性骨癌。在一些实施例中，脑癌是星形细胞瘤、脑干胶质瘤、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、混合胶质瘤、垂体腺癌、垂体腺瘤、颅咽管瘤、生殖细胞肿瘤、松果体区肿瘤、髓母细胞瘤或原发性CNS淋巴瘤。在一些实施例中，乳腺癌是乳腺腺癌、浸润性乳腺癌、非浸润性乳腺癌、乳腺肉瘤、化生性癌、腺样囊性癌、叶状肿瘤、血管肉瘤、HER2阳性乳腺癌、三阴性乳腺癌或炎性乳腺癌。在一些实施例中，宫颈癌是鳞状细胞癌或腺癌。在一些实施例中，结直肠癌是结直肠腺癌、原发性结直肠淋巴瘤、胃肠道间质瘤、平滑肌肉瘤、类癌瘤、黏液腺癌、印戒细胞腺癌、胃肠道类癌瘤或黑色素瘤。在一些实施例中，食道癌是腺癌或鳞状细胞癌。在一些实施例中，胆囊癌是腺癌、乳头状腺癌、腺鳞癌、鳞状细胞癌、小细胞癌或肉瘤。在一些实施例中，妊娠滋养细胞疾病(GTD)是葡萄胎、妊娠滋养细胞肿瘤(GTN)、绒毛膜癌、胎盘部位滋养细胞肿瘤(PSTT)或上皮样滋养细胞肿瘤(ETT)。在一些实施例中，头颈癌是喉癌、鼻咽癌、下咽癌、鼻腔癌、鼻旁窦癌、唾液腺癌、口腔癌、口咽癌或扁桃体癌。在一些实施例中，霍奇金淋巴瘤是经典型霍奇金淋巴瘤，结节硬化型、混合细胞型、富于淋巴细胞型、淋巴细胞消减型或结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤(NLPHL)。在一些实施例中，肠癌是小肠癌(small intestine cancer)、小肠癌(small bowel cancer)、腺癌、肉瘤、胃肠道间质瘤、类癌瘤或淋巴瘤。在一些实施例中，肾癌是肾细胞癌(RCC)、透明细胞RCC、乳头状RCC、嫌色细胞RCC、集合管RCC、未分类RCC、移行细胞癌、尿路上皮癌、肾盂癌或肾肉瘤。在一些实施例中，白血病是急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓系白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)或骨髓增生异常综合征(MDS)。在特定实施例中，白血病是AML。在一些实施例中，肝癌是肝细胞癌(HCC)、纤维板层样HCC、胆管癌、血管肉瘤或肝转移。在一些实施例中，肺癌是小细胞肺癌、小细胞癌、组合小细胞癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞肺癌、大细胞未分化癌、肺结节、转移性肺癌、腺鳞癌、大细胞神经内分泌癌、唾液腺型肺癌、肺类癌、间皮瘤、肺肉瘤样癌或恶性颗粒细胞肺肿瘤。在一些实施例中，黑色素瘤是浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、无色素性黑色素瘤、结缔组织增生性黑色素瘤、眼黑色素瘤或转移性黑色素瘤。在一些实施例中，间皮瘤是胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤、围心间皮瘤或睾丸间皮瘤。在一些实施例中，多发性骨髓瘤是活动性骨髓瘤或冒烟性骨髓瘤。在一些实施例中，神经内分泌肿瘤是胃肠道神经内分泌肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤或肺神经内分泌肿瘤。在一些实施例中，非霍奇金淋巴瘤是间变性大细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、小细胞淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、前体T淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、成人T细胞淋巴瘤/白血病(ATLL)、毛细胞白血病、B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、结内边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、B细胞非霍奇金淋巴瘤、T细胞非霍奇金淋巴瘤、自然杀伤细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、Alibert-Bazin综合征、塞扎里综合征、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、全身性ALCL、肠病型T细胞淋巴瘤(EATL)或肝脾γ/δT细胞淋巴瘤。在一些实施例中，口腔癌是鳞状细胞癌、疣状癌、小唾液腺癌、淋巴瘤、良性口腔肿瘤、嗜酸性肉芽肿、纤维瘤、颗粒细胞瘤、角化棘皮瘤、平滑肌瘤、骨软骨瘤、脂肪瘤、神经鞘瘤、神经纤维瘤、乳头状瘤、尖锐湿疣、疣状黄瘤、化脓性肉芽肿、横纹肌瘤、牙源性肿瘤、白斑、红斑、鳞状细胞唇癌、基底细胞唇癌、口癌、牙龈癌或舌癌。在一些实施例中，卵巢癌是卵巢上皮癌、黏液性上皮卵巢癌、子宫内膜样上皮卵巢癌、透明细胞上皮卵巢癌、未分化上皮卵巢癌、卵巢低恶性潜能肿瘤、原发性腹膜癌、输卵管癌、生殖细胞瘤、畸胎瘤、无性细胞瘤、卵巢生殖细胞癌、内胚窦瘤、性索-间质瘤、性索-性腺间质瘤、卵巢间质瘤、颗粒细胞肿瘤、颗粒-卵泡膜细胞瘤、支持细胞-间质细胞瘤(Sertoli-Leydig tumor)、卵巢肉瘤、卵巢癌肉瘤、卵巢腺肉瘤、卵巢平滑肌肉瘤、卵巢纤维肉瘤、克鲁肯贝格瘤(Krukenberg tumor)或卵巢囊肿。在一些实施例中，胰腺癌是胰腺外泌腺癌、胰腺内分泌腺癌或胰腺腺癌、胰岛细胞瘤或神经内分泌肿瘤。在一些实施例中，前列腺癌是前列腺腺癌、前列腺肉瘤、移行细胞癌、小细胞癌或神经内分泌肿瘤。在一些实施例中，窦癌是鳞状细胞癌、粘膜细胞癌、腺样囊性细胞癌、腺泡细胞癌、鼻窦未分化癌、鼻腔癌、鼻旁窦癌、上颌窦癌、筛窦癌或鼻咽癌。在一些实施例中，皮肤癌是基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、默克尔细胞癌、卡波西肉瘤(KS)、光线性角化病、皮肤淋巴瘤或角化棘皮瘤。在一些实施例中，软组织癌是血管肉瘤、皮肤纤维肉瘤、上皮样肉瘤、尤因肉瘤、纤维肉瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、去分化脂肪肉瘤(DL)、黏液性/圆细胞脂肪肉瘤(MRCL)、高分化脂肪肉瘤(WDL)、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤(RMS)或滑膜肉瘤。在一些实施例中，脊椎癌是脊椎转移瘤。在一些实施例中，胃癌是胃腺癌、胃淋巴瘤、胃肠道间质瘤、类癌瘤、胃类癌瘤、I型ECL细胞类癌、II型ECL细胞类癌或III型ECL细胞类癌。在一些实施例中，睾丸癌是精原细胞瘤、非精原细胞瘤、胚胎癌、卵黄囊癌、绒毛膜癌、畸胎瘤、性腺间质瘤、睾丸间质细胞瘤或睾丸支持细胞瘤。在一些实施例中，咽喉癌是鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤、喉癌、咽癌、鼻咽癌、口咽癌、下咽癌、喉癌、喉鳞状细胞癌、喉腺癌、淋巴上皮瘤、梭形细胞癌、疣状癌、未分化癌或淋巴结癌。在一些实施例中，甲状腺癌是乳头状癌、滤泡状癌、Hürthle细胞癌、甲状腺髓样癌或间变性癌。在一些实施例中，子宫癌是子宫内膜癌、子宫内膜腺癌、子宫内膜样癌、浆液性腺癌、腺鳞癌、子宫癌肉瘤、子宫肉瘤、子宫平滑肌肉瘤、子宫内膜间质肉瘤或未分化肉瘤。在一些实施例中，阴道癌是鳞状细胞癌、腺癌、黑色素瘤或肉瘤。在一些实施例中，外阴癌是鳞状细胞癌或腺癌。
肿瘤抗原是由可引发免疫应答、特别是T细胞介导的免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质。示例性肿瘤抗原包括但不限于胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、前列腺素、PSMA、HER2/neu、存活蛋白和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
在一些实施例中，癌抗原是CEA、未成熟的层粘连蛋白受体、TAG-72、HPV E6、HPVE7、BING-4、钙活化的氯化物通道2、周期蛋白-B1、9D7、EpCAM、EphA3、Her2/neu、端粒酶、间皮素、SAP-1、存活蛋白、BAGE家族抗原、CAGE家族抗原、GAGE家族抗原、MAGE家族抗原、SAGE家族抗原、XAGE家族抗原、NY-ESO-1/LAGE-1、PRAME、SSX-2、Melan-A、MART-1、Gp100、pmel17、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、P.多肽、MC1R、前列腺特异性抗原、β-连环蛋白、BRCA1、BRCA2、CDK4、CML66、纤连蛋白、MART-2、p53、Ras、TGF-βRII或MUC1。
在一些实施例中，肿瘤抗原包含与恶性肿瘤相关的一个或多个抗原癌症表位。恶性肿瘤表达许多可用作免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，例如黑色素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和gp100，以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于转化相关分子组，如癌基因HER2/Neu/ErbB-2。又一组靶抗原是癌胚胎抗原，如癌胚抗原(CEA)。
在一些实施例中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA是肿瘤细胞所特有的，并且不存在于体内的其他细胞上。TAA相关抗原不是肿瘤细胞所特有的，相反，它也可以在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可以在使免疫系统能够对抗原作出应答的条件下发生。TAA可能是在胚胎发育期间在正常细胞上表达的抗原，此时免疫系统不成熟且不能作出应答，或者它们可能是在正常细胞上通常以极低的水平正常存在但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。
TSA或TAA抗原的非限制性实例包括：分化抗原，如MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原，如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5；过表达的胚胎抗原，如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因，如p53、Ras、HER2/neu；由染色体易位产生的独特肿瘤抗原，如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，如爱泼斯坦-巴尔病毒抗原EBVA及人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。
其他基于蛋白质的大抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环素C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
本文提供的嵌合细胞因子受体的其他非限制性示例性靶点包括GPC2、CD276、δ样蛋白配体3(DLL3)、NY-ESO-1、黑色素瘤相关抗原4；存活蛋白、滑膜肉瘤X断裂点蛋白2、CD3、表皮生长因子受体(EGFR)、erbb2酪氨酸激酶受体、HER2、CEA、CD66、CD66e、ROR1、ntrkr1酪氨酸激酶受体、GPC3、间皮素、谷氨酸羧肽酶II、PMSA、PD-L1、叶酸受体α、PSCA、粘蛋白1、HLA抗原(诸如HLA I类抗原A-2α、HLA I类抗原A-11α和HLA II类抗原)、c-Met、肝细胞生长因子受体、K-Ras GTP酶(KRAS)、IL-15受体、Kit酪氨酸激酶、PDGF受体β、RET酪氨酸激酶受体；Raf 1蛋白激酶、Raf B蛋白激酶、胸苷酸合成酶、拓扑异构酶II、Brachyury蛋白、Flt3酪氨酸激酶、VEGF、VEGF受体(VEGF-1受体、VEGF-2受体和VEGF-3受体)、雌激素受体、新生抗原、人乳头瘤病毒E6和热休克蛋白。
在一些特定实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是CD19。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是CD20。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是CD22。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是BCMA。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是VEGFR2。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是FAP。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是EpCam。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是GPC3。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是DLL3。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是CD133。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是IL13Ra。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是EGFRIII。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是EphA2。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是Muc1。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是CD70。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是CD123。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是ROR1。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是PSMA。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是CD5。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是GD2。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是GAP。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是CD33。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是CEA。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是PSCA。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是Her2。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的至少一种靶抗原是间皮素。
在一些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体与B细胞抗原结合。在一些实施例中，B细胞抗原是CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD2、CD5、CD6、CD9、CD11a、CD11b、CD11c、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD29、CD30、CD31、CD32a、CD32b、CD35、CD37、CD38、CD39、CD40、CD45、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、CD46、CD47、CD48、CD49b、CD49c、CD49d、CD50、CD52、CD53、CD54、CD55、CD58、CD60a、CD62L、CD63、CD68、CD69、CD70、CD72、CD73、CD74、CD75、CD75S、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85E、CD85I、CD85J、CD86、CD92、CD95、CD97、CD98、CD99、CD100、CD102、CD108、CD119、CD120a、CD120b、CD121b、CD122、CD124、CD125、CD126、CD130、CD132、CD137、CD138、CD139、CD147、CD148、CD150、CD152、CD162、CD164、CD166、CD167a、CD170、CD171、CD175、CD175s、CD180、CD184、CD185、CD192、CD196、CD197、CD200、CD205、CD201a、CDw210b、CD212、CD213a1、CD213a2、CD 215、CD217、CD218a、CD218b、CD220、CD221、CD222、CD224、CD225、CD226、CD227、CD229、CD230、CD232、CD252、CD252、CD254、CD255、CD256、CD257、CD258、CD259、CD260、CD261、CD262、CD263、CD264、CD267、CD268、CD269、CD270、CD272、CD274、CD275、CD277、CD279、CD283、CD289、CD290、CD295、CD298、CD300、CD300c、CD305、CD306、CD307a、CD307b、CD307c、CD307d、CD307e、CD314、CD215、CD316、CD317、CD319、CD321、CD327、CD328、CD329、CD338、CD351、CD352、CD353、CD354、CD355、CD356、CD357、CD358、CD360、CD361、CD362或CD363抗原。
在一个实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的靶点是病原体。在某些实施例中，靶细胞是包含病原体的细胞。
在一些实施例中，病原体引起选自由以下组成的组的感染性疾病：急性弛缓性脊髓炎(AFM)，边虫病，炭疽，巴贝西虫病，肉毒杆菌中毒，布鲁氏菌病，弯曲杆菌病，耐碳青霉烯感染，软下疳，基孔肯亚病毒感染，衣原体疾病，鱼肉毒，艰难梭菌感染，产气荚膜梭菌疾病、球孢子菌病真菌感染，冠状病毒感染，Covid-19(SARS-CoV-2)，克罗伊茨费尔特-雅各布病/传染性海绵状脑病，隐孢子虫病(Crypto)，环孢子虫病，1、2、3或4型登革热，白喉，大肠杆菌感染/产志贺毒素(STEC)，东方马脑炎，出血热(埃博拉)，埃立克体病，脑炎，虫媒病毒或副感染性疾病，非脊髓灰质炎肠道病毒，D68肠道病毒疾病(EV-D68)，贾第虫病，鼻疽病，淋球菌感染，腹股沟肉芽肿，B型流感嗜血杆菌病(Hib或H-流感)，汉坦病毒肺综合征(HPS)，溶血性尿毒症综合征(HUS)，甲型肝炎(Hep A)，乙型肝炎(Hep B)，丙型肝炎(Hep C)，丁型肝炎(Hep D)，戊型肝炎(Hep E)，疱疹，带状疱疹(Herpes Zoster/Shingles)，组织胞浆菌病感染，人类免疫缺陷病毒/艾滋病(HIV/AIDS)，人乳头瘤病毒(HPV)，流感(Flu)，军团杆菌病(军团病)，麻风(汉森氏病)，钩端螺旋体病，李斯特菌病(李斯特菌)，莱姆病，性病淋巴肉芽肿感染(LGV)，疟疾，麻疹，类鼻疽，脑膜炎(病毒性)，脑膜炎球菌病(脑膜炎(细菌性))，中东呼吸综合征冠状病毒疾病(MERS-CoV)，腮腺炎，诺如病毒疾病，虱病，盆腔炎性疾病(PID)，百日咳(顿咳)，鼠疫(腺鼠疫、败血病性鼠疫、肺炎性鼠疫)，肺炎球菌病(肺炎)，脊髓灰质炎(脊灰(Polio))，波瓦生，鹦鹉热，阴虱病，脓疱疹病(天花、猴痘、牛痘)，Q热，狂犬病，立克次体病(落基山斑疹热)，风疹(Rubella/German Measles)，沙门氏菌胃肠炎(沙门氏菌)，疥疮，鲭鱼中毒，脓毒症，严重急性呼吸综合征(SARS)，志贺菌病胃肠炎(志贺菌)，天花，耐甲氧西林葡萄球菌感染(MRSA)，葡萄球菌食物中毒肠毒素B中毒(葡萄球菌食物中毒)，万古霉素中度耐药性葡萄球菌感染(VISA)，万古霉素耐药性葡萄球菌感染(VRSA)，A组链球菌病(侵袭性)(Strep A(侵袭性))，B组链球菌病(Strep-B)，链球菌中毒性休克综合征STSS中毒性休克，梅毒(原发性、继发性、早期潜伏性、晚期潜伏性、先天性)，破伤风感染，滴虫病，旋毛虫病感染，结核病(TB)，潜伏性结核病(LTBI)，兔热病，D组伤寒症，阴道病，水痘(Varicella/Chickenpox)，霍乱弧菌疾病(霍乱)，弧菌病(弧菌)，埃博拉病毒出血热，拉沙病毒(Lasa Virus)出血热，马尔堡病毒出血热，西尼罗病毒，黄热病，耶尔森氏菌疾病和寨卡病毒感染。在一些实施例中，感染性疾病是急性弛缓性脊髓炎(AFM)。
在一些实施例中，病原体是细菌。在一些实施例中，细菌是芽孢杆菌属、巴尔通体属、鲍特菌属、包柔氏螺旋体属、布鲁氏菌属、弯曲杆菌属、衣原体属、类衣原体属、梭菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、埃希氏菌属、弗朗西丝菌属、嗜血杆菌属、螺杆菌属、军团杆菌属、钩端螺旋体属、李斯特菌属、分枝杆菌属、支原体属、奈瑟菌属、假单胞菌属、立克次氏体属、沙门氏菌属、志贺菌属、葡萄球菌属、链球菌属、密螺旋体属、脲原体属、弧菌属或耶尔森氏菌属的细菌。
在一些实施例中，病原体是寄生虫。在一些实施例中，寄生虫是原生动物、蠕虫或体外寄生虫。在一些实施例中，原生动物是内阿米巴虫、贾第虫、利什曼原虫、肠袋虫、疟原虫或隐孢子虫。在一些实施例中，蠕虫是吸虫、绦虫、棘头虫或蛔虫。在一些实施例中，体外寄生虫是节肢动物。
在一些实施例中，病原体是病毒。在一些实施例中，病毒是腺病毒科、沙粒病毒科、星状病毒科、布尼亚病毒科、杯状病毒科、冠状病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、嗜肝DNA病毒科、肝炎病毒科、正黏液病毒科、乳头瘤病毒科、副黏液病毒科、细小病毒科、小核糖核酸病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科、呼肠孤病毒科、逆转录病毒科、弹状病毒科或披膜病毒科的病毒。在一些实施例中，病毒是腺病毒、冠状病毒、柯萨奇病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒2型、巨细胞病毒、人类疱疹病毒8型、人类免疫缺陷病毒、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、风疹病毒或水痘-带状疱疹病毒。
在一些特定实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的胞外抗原结合结构域源自NKG2D或截短的NKG2D(诸如NKG2D或截短的NKG2D的ECD)。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:6、156或157的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6、156或157具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在其他特定的实施例中，本发明嵌合细胞因子受体的胞外抗原结合结构域包含与NKG2D配体结合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，胞外结构域包含与NKG2D配体结合的一个或多个scFv。在其他实施例中，胞外结构域包含与NKG2D配体结合的一个或多个sdAb(诸如一个或多个VHH结构域)。NKG2D配体可以选自(但不限于)由MICA/B、ULBP-1、ULBP-2,5,6和ULBP-3组成的组。在一些实施例中，NKG2D配体是MICA/B。在一些实施例中，NKG2D配体是ULBP-1。在一些实施例中，NKG2D配体是ULBP-2。在一些实施例中，NKG2D配体是ULBP-5。在一些实施例中，NKG2D配体是ULBP-6。在一些实施例中，NKG2D配体是ULBP-3。
可以使用数学算法来确定两个序列(例如，氨基酸序列或核酸序列)之间的同一性百分比。用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性实例是Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264 2268(1990)的算法，修改为Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873 5877(1993)。这样的算法被合并到Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST核苷酸程序参数集进行，例如，对于评分＝100，字长＝12，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可以用XBLAST程序参数集进行，例如，对于评分50，字长＝3，以获得与本文所述的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以使用如Altschul等人,Nucleic Acids Res.25:3389 3402(1997)中所述的GappedBLAST。替代性地，PSI BLAST可用于进行检测分子间距离关系的迭代搜索(Id.)。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI Blast程序时，可以使用(例如，XBLAST和NBLAST的)相应程序的默认参数(参见例如，万维网上的美国国家生物技术信息中心(NCBI)，ncbi.nlm.nih.gov)。用于序列比较的数学算法的另一个非限制性实例是Myers和Miller,CABIOS 4:11-17(1998)的算法。这样的算法被合并在ALIGN程序(2.0版)中，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序比对氨基酸序列时，可以使用PAM120重量残基表，空位长度罚分为12，并且空位罚分为4。
在一些实施例中，考虑了本文所述的多肽的一个或多个氨基酸序列修饰或变异。变异可以是编码多肽的一个或多个密码子的取代、缺失或插入，导致与原始多肽相比氨基酸序列发生改变。
氨基酸取代可以是用具有相似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸的结果，诸如用丝氨酸取代亮氨酸，例如保守氨基酸取代。本领域技术人员已知的标准技术可用于在编码本文提供的分子的核苷酸序列中引入突变，包括例如导致氨基酸取代的定点诱变和PCR介导的诱变。插入或缺失可任选地在约1至5个氨基酸的范围内。在某些实施例中，取代、缺失或插入包括相对于原始分子的少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。在特定实施例中，取代是在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行的保守氨基酸取代。所允许的变化可以通过在序列中系统地进行氨基酸的插入、缺失或取代并测试所得变体的亲本多肽表现出的活性来确定。
本披露包括通过保守氨基酸取代产生的多肽。在保守氨基酸取代中，氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基取代。如上所述，本领域已经定义了具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-支化侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。替代性地，可以沿着全部或部分编码序列随机引入突变，例如通过饱和诱变，并且可以筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体。诱变后，可以表达编码的蛋白并且可以确定蛋白的活性。可以进行保守(例如，在具有相似性质和/或侧链的氨基酸组内)取代，以便保持或不显著改变性质。
氨基酸可以根据它们的侧链的性质的相似性进行分组(参见例如Lehninger,Biochemistry 73-75(第2版,1975))：(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电的极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；和(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。替代性地，天然存在的残基可以根据共同的侧链性质进行分组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。例如，任何不参与维持肽的正确构象的半胱氨酸残基也可以例如用另一种氨基酸诸如丙氨酸或丝氨酸取代，以提高分子的氧化稳定性并防止异常交联。非保守取代将需要将这些类别中的一个的成员交换为另一个类别。
氨基酸序列插入包括氨基末端和/或羧基末端融合，长度在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的范围内，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。可以使用本领域已知的方法诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变来进行变化。可以对克隆的DNA进行定点诱变(参见例如，Carter,Biochem J.237:1-7(1986)；以及Zoller等人,Nucl.Acids Res.10:6487-500(1982))、盒式诱变(参见例如，Wells等人,Gene 34:315-23(1985))或其他已知技术以产生多肽变体DNA。
信号肽
在某些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体可以包含多肽的N末端处的信号肽(也称为信号序列)。通常，信号肽是使多肽靶向细胞中所需位点的肽序列。在一些实施例中，信号肽将效应分子靶向细胞的分泌途径，并允许效应分子整合和锚定到脂质双层中。适用于本文所述的CAR且包含天然存在的蛋白的信号序列或合成的、非天然存在的信号序列的信号肽对于本领域技术人员将是显而易见的。在一些实施例中，信号肽源自选自由CD8α、GM-CSF受体α和IgG1重链组成的组的分子。
在另一方面，本文提供了一种多核苷酸，该多核苷酸编码本文提供的嵌合细胞因子受体。在另一方面，本文提供了一种免疫细胞，该免疫细胞表达本文提供的嵌合细胞因子受体。
标签肽
在某些实施例中，本文提供的嵌合细胞因子受体可以包含标签。在一些实施例中，嵌合细胞因子受体可以包含两个或更多个标签。在一些实施例中，与嵌合细胞因子受体连接的标签不同于与功能性外源受体连接的标签。
5.2.2.功能性外源受体
在一些实施例中，本文提供的免疫效应细胞进一步包含一种或多种功能性外源受体。在一些实施例中，功能性外源受体是T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、嵌合TCR(cTCR)、或T细胞抗原偶联物(TAC)样嵌合受体。在一些实施例中，功能性外源受体是CAR。在其他实施例中，功能性外源受体是TCR。
任何功能性外源受体都包括在本披露中。嵌合抗原受体(CAR)在下文仅作为本文提供的示例性功能性外源受体进行更详细的描述，但不限制本披露的范围。
在一些实施例中，本发明的免疫效应细胞中的CAR包含多肽，该多肽包含：(a)胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内信号传导结构域。
胞外抗原结合结构域
本文所述CAR的胞外抗原结合结构域包含一个或多个抗原结合结构域。在一些实施例中，本文提供的CAR的胞外抗原结合结构域是单特异性的。在其他实施例中，本文提供的CAR的胞外抗原结合结构域是多特异性的。在其他实施例中，本文提供的CAR的胞外抗原结合结构域是单价的。在其他实施例中，本文提供的CAR的胞外抗原结合结构域是多价的。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域包含两个或更多个抗原结合结构域，这些抗原结合结构域直接通过肽键或通过肽接头彼此融合。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域包含抗体或其片段，如上述第5.2.1部分中嵌合细胞因子受体的胞外结构域的上下文中所述。在本发明CAR的胞外抗原结合结构域中存在多个结合结构域的情况下。各种结构域可以通过肽接头彼此融合。在一些实施例中，结构域彼此直接融合而没有任何肽接头。肽接头可以相同或不同。取决于各种结构域的结构和/或功能特征，每个肽接头可以具有相同或不同的长度和/或序列。可以独立地选择和优化每个肽接头。CAR中使用的一个或多个肽接头的长度、柔性程度和/或其他性质可以对性质具有一些影响，包括但不限于对一种或多种特定抗原或表位的亲和力、特异性或亲合力。在一些实施例中，肽接头包含柔性残基(诸如甘氨酸和丝氨酸)，使得相邻结构域相对于彼此自由移动。例如，甘氨酸-丝氨酸双联体可以是合适的肽接头。上述第5.2.1部分提供了本文中使用的适用接头的另外的描述。
在一些实施例中，本发明CAR中提供的胞外抗原结合结构域识别充当与特殊疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记的抗原。在一些实施例中，抗原是肿瘤抗原。肿瘤表达多种可作为免疫应答(尤其是T细胞介导的免疫应答)的靶抗原的蛋白质。CAR靶向的抗原可以是单个病变细胞上的抗原，或是在各自都会影响疾病的不同细胞上表达的抗原。CAR靶向的抗原可能直接或间接牵涉到疾病中。
在一些实施例中，上述第5.2.1部分提供了本文提供的CAR靶向的可能的抗原。在一些实施例中，靶细胞是癌细胞。在一个实施例中，本发明CAR的靶点是病原体。在某些实施例中，靶细胞是包含病原体的细胞。在一些实施例中，病原体引起感染性疾病。在一些实施例中，病原体是细菌。在一些实施例中，病原体是寄生虫。在一些实施例中，病原体是病毒。
跨膜结构域
本披露的CAR包含可以直接或间接与胞外抗原结合结构域融合的跨膜结构域。跨膜结构域可源自天然或合成来源。适用于本文所述的CAR的跨膜结构域可获自天然存在的蛋白。替代性地，其可以是合成的、非天然存在的蛋白区段，例如，在细胞膜中热力学稳定的疏水蛋白区段。
在一些实施例中，本文所述的CAR的跨膜结构域源自I型单途径膜蛋白。在一些实施例中，来自多途径膜蛋白的跨膜结构域也可以与用于本文所述的CAR相容。多途径膜蛋白可以包含复合物(至少2、3、4、5、6、7或更多)α螺旋或β折叠结构。在一些实施例中，多途径膜蛋白的N末端和C末端存在于脂质双层的相对侧，例如，蛋白的N末端存在于脂质双层的胞内侧，而该蛋白的C末端存在于胞外侧。
用于本文所述的CAR的跨膜结构域还可以包含合成的、非天然存在的蛋白区段的至少一部分。在一些实施例中，跨膜结构域是合成的、非天然存在的α螺旋或β折叠。在一些实施例中，蛋白区段为至少约20个氨基酸，例如，至少18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸。合成的跨膜结构域的实例是本领域已知的，例如在美国专利号7,052,906和PCT公开号WO 2000/032776中，其相关披露内容通过援引并入本文。
本文提供的跨膜结构域可以包含跨膜区和位于跨膜结构域的C末端侧的胞内区。跨膜结构域的胞内区可包含三个或更多个氨基酸，并且在一些实施例中，有助于使跨膜结构域在脂质双层中定向。在一些实施例中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的跨膜区中。在一些实施例中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的胞内区中。在一些实施例中，跨膜结构域的胞内区包含带正电荷的氨基酸。在一些实施例中，跨膜结构域的胞内区包含氨基酸精氨酸、丝氨酸和赖氨酸。
在一些实施例中，跨膜结构域的跨膜区包含疏水性氨基酸残基。在一些实施例中，本文提供的CAR的跨膜结构域包含人工疏水性序列。例如，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体可以存在于跨膜结构域的C末端处。在一些实施例中，跨膜区主要包含疏水性氨基酸残基，例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或缬氨酸。在一些实施例中，跨膜区是疏水性的。在一些实施例中，跨膜区包含聚亮氨酸-丙氨酸序列。蛋白或蛋白区段的亲水性或者疏水性或亲水性特征可以通过本领域已知的任何方法来评估，例如Kyte和Doolittle亲水性分析。
在一些实施例中，CAR的跨膜结构域包含选自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CDl la、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDlld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C的跨膜结构域。
在一些特定实施例中，跨膜结构域源自CD8。在一些特定实施例中，跨膜结构域源自CD8α。在其他特定实施例中，跨膜结构域源自CD28。
胞内信号传导结构域
本文提供的CAR内的胞内信号传导结构域负责活化表达CAR的免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的特殊功能。例如，T细胞的效应子功能可以是溶细胞活性或辅助活性(包括细胞因子的分泌)。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行特定功能的蛋白部分。虽然通常可以使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下不需要使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，可以使用这样的截短部分代替完整链，只要它转导效应子功能信号。因此，术语胞内信号传导结构域意指包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施例中，CAR包含基本上由免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域组成的胞内信号传导结构域。“初级胞内信号传导结构域”是指以刺激方式起作用以诱导免疫效应子功能的胞内信号传导序列。在一些实施例中，初级胞内信号传导结构域含有称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。如本文所用，“ITAM”是保守蛋白基序，其通常存在于许多免疫细胞中表达的信号传导分子的尾部。基序可以包含由6-8个氨基酸分开的氨基酸序列YxxL/I的两个重复，其中每个x独立地为任何氨基酸，产生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I。信号传导分子内的ITAM对于细胞内的信号转导很重要，该信号转导至少部分由信号传导分子活化后ITAM中的酪氨酸残基的磷酸化介导。ITAM也可以作为参与信号传导途径的其他蛋白的对接位点。示例性含有ITAM的初级胞内信号传导序列包括源自CD3z、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。
共刺激信号传导结构域
在一些实施例中，CAR包含至少一个共刺激信号传导结构域。如本文所用，术语“共刺激信号传导结构域”是指介导细胞内信号转导以诱导免疫应答(例如，效应子功能)的蛋白的至少一部分。除了刺激抗原特异性信号之外，许多免疫效应细胞还需要共刺激，以促进细胞增殖、分化和存活，以及活化细胞的效应子功能。
本文所述的嵌合受体的共刺激信号传导结构域可以是来自共刺激蛋白的胞内信号传导结构域，其转导信号并调节由免疫细胞诸如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞介导的反应。“共刺激信号传导结构域”可以是共刺激分子的胞内部分。术语“共刺激分子”是指免疫细胞(例如，T细胞)上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导免疫细胞的共刺激应答，例如但不限于增殖和存活。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含单个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含两个或更多个(例如，约2、3、4个或更多个中的任一个)共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含两个或更多个相同的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含来自不同共刺激蛋白(例如，本文所述的任两个或更多个共刺激蛋白)的两个或更多个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含初级胞内信号传导结构域(诸如CD3z的胞内信号传导结构域)和一个或多个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，一个或多个共刺激信号传导结构域和初级胞内信号传导结构域(诸如CD3z的胞内信号传导结构域)通过任选的肽接头彼此融合。初级胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结构域可以按任何合适的顺序排列。在一些实施例中，一个或多个共刺激信号传导结构域位于跨膜结构域与初级胞内信号传导结构域(诸如CD3z的胞内信号传导结构域)之间。多个共刺激信号传导结构域可提供累加或协同刺激作用。
宿主细胞(例如，免疫细胞)中共刺激信号传导结构域的活化可诱导细胞增加或减少细胞因子的产生和分泌、吞噬性质、增殖、分化、存活和/或细胞毒性。任何共刺激分子的共刺激信号传导结构域可适用于本文所述的CAR。共刺激信号传导结构域的一个或多个类型基于诸如效应分子将在其中表达的免疫效应细胞的类型(例如，T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞)和所需的免疫效应子功能(例如，ADCC效应)等因素来选择。用于CAR的共刺激信号传导结构域的实例可以是共刺激蛋白的胞内信号传导结构域，包括但不限于B7/CD28家族的成员(例如，B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC和PDCD6)；TNF超家族的成员(例如，4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α和TNF RII/TNFRSF1B)；SLAM家族的成员(例如，2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6和SLAM/CD150)；以及任何其他共刺激分子，例如CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I类、HLA-DR、Ikaros、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和NKG2C。在一些实施例中，一个或多个共刺激信号传导结构域选自由以下组成的组：CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性结合CD83的配体。
在一些实施例中，共刺激信号传导结构域是本文所述的任何共刺激信号传导结构域的变体，使得共刺激信号传导结构域能够调节免疫细胞的免疫应答。在一些实施例中，与野生型对照物相比，共刺激信号传导结构域包含多达10个氨基酸残基变异(例如，1个、2个、3个、4个、5个或8个)。包含一个或多个氨基酸变化的这样的共刺激信号传导结构域可称为变体。相对于不包含突变的共刺激信号传导结构域，共刺激信号传导结构域的氨基酸残基的突变可导致信号转导的增加和增强的对免疫应答的刺激。相对于不包含突变的共刺激信号传导结构域，共刺激信号传导结构域的氨基酸残基的突变可导致信号转导的减少和降低的对免疫应答的刺激。
信号肽
在某些实施例中，本文提供的CAR可以包含多肽的N末端处的信号肽(也称为信号序列)。通常，信号肽是使多肽靶向细胞中所需位点的肽序列。在一些实施例中，信号肽将效应分子靶向细胞的分泌途径，并允许效应分子整合和锚定到脂质双层中。适用于本文所述的CAR且包含天然存在的蛋白的信号序列或合成的、非天然存在的信号序列的信号肽对于本领域技术人员将是显而易见的。在一些实施例中，信号肽源自选自由CD8α、GM-CSF受体α和IgG1重链组成的组的分子。
铰链区
在一些实施例中，本文提供的CAR可以包含位于胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间的铰链结构域。铰链结构域是通常在蛋白的两个结构域之间发现的氨基酸区段，并且可以允许蛋白的柔性和一个或两个结构域相对于彼此的运动。可以使用提供胞外抗原结合结构域相对于效应分子的跨膜结构域的这样的柔性和运动的任何氨基酸序列。
抗体(诸如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体)的铰链结构域也适用于本文所述的pH依赖性嵌合受体系统。在一些实施例中，铰链结构域是连接抗体的恒定结构域CH1和CH2的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域是抗体的铰链结构域，并且包含抗体及该抗体的一个或多个恒定区的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域包含抗体及该抗体的CH3恒定区的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域包含抗体及该抗体的CH2和CH3恒定区的铰链结构域。在一些实施例中，抗体是IgG、IgA、IgM、IgE、或IgD抗体。在一些实施例中，抗体是IgG抗体。在一些实施例中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4抗体。在一些实施例中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区和CH2和CH3恒定区。在一些实施例中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区和CH3恒定区。
非天然存在的肽也可用作本文所述的嵌合受体的铰链结构域。在一些实施例中，Fc受体的胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域是肽接头，如(GxS)n接头，其中x和n可以独立地为介于3和12之间的整数，包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更大。
铰链结构域可以含有约10-100个氨基酸，例如，约15-75个氨基酸、20-50个氨基酸或30-60个氨基酸中的任一个。在一些实施例中，铰链结构域的长度可以是至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75个氨基酸中的任一个。
在一些实施例中，铰链结构域是天然存在的蛋白的铰链结构域。本领域已知的包含铰链结构域的任何蛋白的铰链结构域均适用于本文所述的嵌合受体。在一些实施例中，铰链结构域是天然存在的蛋白的铰链结构域的至少一部分，并且赋予嵌合受体柔性。
在一些特定实施例中，铰链结构域源自CD8α。在一些实施例中，铰链结构域是CD8α的铰链结构域的一部分，例如，含有CD8α的铰链结构域的至少15个(例如20、25、30、35或40个)连续氨基酸的片段。在其他实施例中，铰链结构域源自CD28α。在一些实施例中，铰链结构域是CD28α的铰链结构域的一部分，例如，含有CD28α的铰链结构域的至少15个(例如20、25、30、35或40个)连续氨基酸的片段。
标签肽
在一些实施例中，功能性外源受体可以包含标签。在一些实施例中，功能性外源受体可以包含两个或更多个标签。在一些实施例中，与嵌合细胞因子受体连接的标签不同于与功能性外源受体连接的标签。
示例性CAR
可以在本披露中使用任何CAR，包括但不限于本披露中的CAR。
在某些实施例中，本文提供的CAR包含相对于上述和下文第6部分中的示例性CAR中的任一种具有一定同一性百分比的氨基酸序列。在一些实施例中，本文提供了CAR，该CAR包含胞外结构域或由该胞外结构域组成，该胞外结构域与上述和下文第6部分中的CAR的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在一些实施例中，考虑了本文所述的CAR的一个或多个氨基酸序列修饰。例如，可能需要优化胞外结构域的结合亲和力和/或其他生物学性质，包括但不限于特异性、热稳定性、表达水平、效应子功能、糖基化、降低的免疫原性或溶解性。因此，除了本文所述的胞外结构域，预期还可以制备本文所述的结构域的变体。例如，可以通过将适当的核苷酸变化引入编码DNA中和/或通过合成所需的抗体或多肽来制备scFv变体。本领域技术人员理解氨基酸改变可改变抗体的翻译后过程。
变异可以是编码多肽的一个或多个密码子的取代、缺失或插入，导致与原始抗体或多肽相比氨基酸序列发生改变。取代诱变的目的位点包括CDR和FR。
氨基酸取代可以是用具有相似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸的结果，诸如用丝氨酸取代亮氨酸，例如保守氨基酸取代。本领域技术人员已知的标准技术可用于在编码本文提供的分子的核苷酸序列中引入突变，包括例如导致氨基酸取代的定点诱变和PCR介导的诱变。插入或缺失可任选地在约1至5个氨基酸的范围内。在某些实施例中，取代、缺失或插入包括相对于原始分子的少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。在特定实施例中，取代是在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行的保守氨基酸取代。所允许的变化可以通过在序列中系统地进行氨基酸的插入、缺失或取代并测试所得变体的亲本多肽表现出的活性来确定。
本披露包括通过保守氨基酸取代产生的多肽。可以进行保守(例如，在具有相似性质和/或侧链的氨基酸组内)取代，以便保持或不显著改变性质。
一种类型的取代变体涉及在本发明CAR的胞外抗原结合结构域中取代亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基或其片段。通常，选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体在某些生物学性质(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)方面具有修饰(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学性质。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以方便地产生，例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，诸如本文所述的那些。简而言之，一个或多个CDR残基突变并且变体抗体在噬菌体上展示并针对特定的生物活性(例如，结合亲和力)来筛选。
可以在CDR中进行改变(例如取代)，例如以提高抗体亲和力。可在CDR“热点”，即由在体细胞成熟过程中经历高频突变的密码子编码的残基(参见例如，Chowdhury,MethodsMol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中进行这样的改变，其中测试所得变体抗体或其片段的结合亲和力。通过从二级文库中构建和重新选择的亲和力成熟描述于例如，Hoogenboom等人Methods in Molecular Biology178:1-37中(O'Brien等人编辑,HumanPress,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施例中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建二级文库。然后筛选文库以鉴定具有所需的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及CDR导向的方法，其中将几个CDR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以特异性鉴定参与抗原结合的CDR残基，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模。
在一些实施例中，取代、插入或缺失可以发生在一个或多个CDR内，只要这样的改变基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在CDR中进行不显著降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)。在一些实施例中，每个CDR是未改变的或者含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
如Cunningham和Wells,Science,244:1081-1085(1989)所述，用于鉴定可以靶向诱变的抗体的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”。替代性地，或另外地，可以确定抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体与抗原之间的接触点。这样的接触残基和邻近残基可以作为取代候选物而被靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的性质。
氨基酸序列插入包括氨基末端和/或羧基末端融合，长度在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的范围内，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括将抗体的N末端或C末端与增加抗原结合结构域抗体的血清半衰期的酶(例如，对于ADEPT)或多肽融合。
可以使用本领域已知的方法诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变来进行变化。可以对克隆的DNA进行定点诱变(参见例如，Carter,Biochem J.237:1-7(1986)；以及Zoller等人,Nucl.Acids Res.10:6487-500(1982))、盒式诱变(参见例如，Wells等人,Gene 34:315-23(1985))或其他已知技术以产生抗体变体DNA。
本披露还包括免疫效应细胞，该免疫效应细胞包含两种或更多种功能性外源受体，诸如结合两个不同靶点的双CAR或串联CAR。
在一些特定实施例中，本文提供的CAR与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)结合。GPC3(一种由580个氨基酸组成的65-kDa蛋白)是一种通过糖基磷脂酰肌醇锚定到细胞膜的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。GPC3在肝细胞癌(HCC)、卵巢透明细胞癌(OCCC)、黑色素瘤、肺鳞状细胞癌、肝母细胞瘤、肾母细胞瘤(维尔姆斯瘤)和卵黄囊瘤以及某些胃癌(例如产生甲胎蛋白的胃癌)中表达。分泌型和膜锚定型GPC3在这些癌症中的确切功能尚不完全清楚，但已证明它与肿瘤转化有关，例如在HCC中(Shirakawa H.等人,Cancer Sci.2009；100:1403-1407)。引人注目的是，该蛋白在所有其他癌症形式中几乎不存在。GPC3序列是本领域已知的。在一些实施例中，GPC3包含选自以下GenBank登录号中的至少一者的氨基酸序列：NM_001164617和NP_001158089、NM_004484和NP_004475、NM_001164618和NP_001158090、以及NM_001164619和NP_001158091。在一些特定实施例中，本文提供的与GPC3结合的CAR包含SEQ ID NO:29或135的氨基酸序列。
5.2.3.免疫效应细胞
“免疫效应细胞”是指能发挥免疫效应子功能的免疫细胞。在一些实施例中，免疫效应细胞至少表达FcγRIII，并且发挥ADCC效应子功能。介导ADCC的免疫效应细胞的实例包括外周血单个核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞、嗜中性粒细胞、和嗜酸性粒细胞。
在一些实施例中，免疫效应细胞是T细胞。在一些实施例中，T细胞是CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+、CD4-/CD8-或其组合。在一些实施例中，T细胞在表达CAR并与靶细胞结合后产生IL-2、IFN和/或TNF。在一些实施例中，CD8+T细胞在表达CAR并与靶细胞结合后裂解抗原特异性靶细胞。
在一些实施例中，免疫效应细胞是NK细胞。在其他实施例中，免疫效应细胞可以是已建立的细胞系，例如NK-92细胞。
在一些实施例中，免疫效应细胞是从干细胞(如造血干细胞、多能干细胞、iPS、或胚胎干细胞)分化而来的。
工程化免疫效应细胞通过将本文提供的多肽引入免疫效应细胞诸如T细胞来制备。在一些实施例中，通过转染任何一种分离的核酸或任何一种上述载体将多肽引入免疫效应细胞。
将载体或分离的核酸引入哺乳动物细胞的方法是本领域已知的。所描述的载体可以通过物理、化学或生物方法转移到免疫效应细胞中。
将载体引入免疫效应细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生含有载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见，例如，Sambrook等人(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York。在一些实施例中，通过电穿孔将载体引入细胞中。
将载体引入免疫效应细胞的生物方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体已成为用于将基因插入哺乳动物例如人细胞的最广泛使用的方法。
用于将载体引入免疫效应细胞的化学方法包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
在一些实施例中，编码本文所述的任何多肽的RNA分子可以通过常规方法(例如，体外转录)制备，然后通过已知方法诸如mRNA电穿孔引入免疫效应细胞中。参见例如，Rabinovich等人,Human Gene Therapy 17:1027-1035(2006)。
在一些实施例中，将转导的或转染的免疫效应细胞在引入载体或分离的核酸后离体增殖。在一些实施例中，将转导的或转染的免疫效应细胞培养以繁殖至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中的任一个。在一些实施例中，进一步评估或筛选转导或转染的免疫效应细胞以选择工程化哺乳动物细胞。
报告基因可用于鉴定可能转染的细胞和评估调控序列的功能。通常，报告基因是在受体生物体或组织中不存在或不表达的基因，该报告基因编码多肽，该多肽的表达通过一些易于检测的特性(例如，酶活性)来表现。报告基因的表达在DNA被引入受体细胞后的合适的时间检测。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌性碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人FEBS Letters 479:79-82(2000))。合适的表达系统是熟知的，并且可以使用已知技术制备或从商业上获得。
证实工程化免疫效应细胞中存在编码多肽的核酸的其他方法包括例如本领域技术人员熟知的分子生物学测定，例如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；生物化学测定，如例如通过免疫学方法(如ELISA和蛋白印迹)来检测特定肽的存在或不存在。
5.2.4.T细胞来源
在一些实施例中，在对T细胞进行扩增和基因修饰之前，从受试者获得T细胞来源。T细胞可以获得自许多来源，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施例中，可以使用本领域可用的多种T细胞系。在一些实施例中，可以使用本领域技术人员已知的多种技术(例如，FicollTM分离)来从受试者收集的血液中获得T细胞。在一些实施例中，来自个体循环血的细胞是通过单采(apheresis)获得的。单采产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施例中，可以洗涤通过单采收集的细胞以除去血浆部分，并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在一些实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施例中，洗涤溶液缺乏钙，并且可能缺乏镁，或可能缺乏许多(如果不是全部)二价阳离子。在不存在钙的情况下的初始活化步骤可以导致放大的活化。本领域的普通技术人员很容易理解，洗涤步骤可以通过本领域已知的方法完成，如根据制造商说明使用半自动化“流动”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，如例如，无Ca2+、无Mg2+的PBS，PlasmaLyte A或者含或不含缓冲液的其他盐水溶液。替代性地，可以除去单采样品的不良组分，并将细胞直接重悬浮于培养基中。
在一些实施例中，通过例如，通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析来裂解红细胞并且消耗单核细胞来从外周血淋巴细胞分离T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一些实施例中，通过与抗CD3/抗CD28(即，3×28)缀合的珠(如M-450 CD3/CD28 T)孵育足以对所需的T细胞进行阳性选择的一段时间而分离T细胞。在一些实施例中，该时间段为约30分钟。在另一个实施例中，该时间段为30分钟至36小时或更长以及其间的所有整数值。在另一个实施例中，该时间段为至少1、2、3、4、5或6小时。在一些实施例中，该时间段为10到24小时。在一些实施例中，该孵育时间段为24小时。对于白血病患者的T细胞的分离，使用较长的孵育时间(如24小时)可以增加细胞产量。与其他细胞类型相比，在T细胞较少的任何情况下，如在从肿瘤组织或免疫受损个体中分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的情况下，可以使用较长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用较长的孵育时间可以增加CD8+T细胞的捕获效率。因此，在一些实施例中，通过简单地缩短或延长允许T细胞与CD3/CD28珠结合的时间和/或增加或减少珠与T细胞的比率，可以在培养开始时或在培养过程中的其他时间点优先选择或不选择T细胞的亚群。另外地，通过增加或减小珠或其他表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以在培养开始时或其他所需的时间点优先选择或不选择T细胞的亚群。本领域的技术人员会认识到，也可以使用多轮选择。在一些实施例中，可能希望进行选择程序，并在活化和扩增过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可以进行进一轮的选择。
通过阴性选择富集T细胞群可以通过结合针对阴性选择细胞特有的表面标记的抗体来实现。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该方法使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物典型地包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施例中，可能希望富集或正向选择调节性T细胞，这些细胞典型地表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+。替代性地，在某些实施例中，通过抗C25缀合的珠或其他类似的选择方法消耗T调节性细胞。
为了通过阳性或阴性选择而分离所需的细胞群，可以改变细胞和表面(例如，粒子(如珠))的浓度。在某些实施例中，可能希望显著减少珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施例中，使用20亿个细胞/mL的浓度。在一个实施例中，使用10亿个细胞/mL的浓度。在另一个实施例中，使用大于1亿个细胞/mL。在另一个实施例中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/mL的细胞浓度。在又一实施例中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/mL的细胞浓度。在其他实施例中，可以使用1.25或1.50亿个细胞/mL的浓度。使用高浓度可导致细胞产量、细胞活化和细胞扩增增加。此外，使用高浓度的细胞可允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)、或来自存在许多肿瘤细胞的样品(即，白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。这样的细胞群可能具有治疗价值，并且期望能够获得。在一些实施例中，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施例中，可能需要使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒，诸如珠)的混合物，使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这选择了表达大量结合颗粒的所需抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达更高水平的CD28，并且比稀释浓度的CD8+T细胞更有效地被捕获。在一些实施例中，使用的细胞的浓度为5×106个/mL。在一些实施例中，使用的浓度可以为约1×105个/mL至1×106个/mL，以及介于两者之间的任何整数值。
在一些实施例中，细胞可以在旋转器上以不同的速度在2℃-10℃或在室温下孵育不同的时间长度。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不受理论的束缚，冷冻和随后的解冻步骤可以通过去除细胞群中的粒细胞和在某种程度上去除单核细胞来提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数在本领域中是已知的并且在这种情况下是有用的，但是一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％ DMSO，或31.25％plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％ NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％ DMSO的培养基，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其他合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以1℃/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储存罐的气相中。可以使用其他受控冷冻方法以及立即在-20℃或在液氮中的不受控冷冻。
在一些实施例中，如本文所述将冷冻保存的细胞解冻和洗涤，并在活化前在室温下静置一小时。
在本披露中还考虑了在可能需要如本文所述的扩增的细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采产物。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩增的细胞来源，并分离和冷冻所需的细胞，诸如T细胞，以随后在T细胞疗法中用于将受益于T细胞疗法的多种疾病或病状，诸如本文所述的那些。在一个实施例中，血液样品或单采血液成分取自一般健康受试者。在某些实施例中，血液样品或单采血液成分取自处于患疾病风险但尚未患疾病的一般健康受试者，并且分离并冷冻目的细胞以备后用。在某些实施例中，T细胞可以扩增、冷冻并在以后使用。在某些实施例中，在诊断如本文所述的特定疾病之后不久但在任何治疗之前从患者收集样品。在另一个实施例中，在多种相关治疗模式之前从受试者的血液样品或单采血液成分分离细胞，这些相关治疗模式包括但不限于用药剂诸如那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、抗病毒剂、化学疗法、辐射、免疫抑制剂(诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体或其他免疫清除剂(immunoablativeagent)(诸如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺(cytoxan)、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228)和辐射进行治疗。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导很重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人,Cell 66:807-815(1991)；Henderson等人,Immun 73:316-321(1991)；Bierer等人,Curr.Opin.Immun.5:763-773(1993))。在另一个实施例中，分离患者的细胞并将其冷冻以供随后与骨髓或干细胞移植、使用化学治疗剂(诸如氟达拉滨)的T细胞清除疗法、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体(诸如OKT3或CAMPATH)结合使用(例如，之前、同时或之后)。在另一实施例中，在B细胞清除疗法(如与CD20反应的药剂，如利妥昔单抗(Rituxan))之前分离细胞，并可冷冻用于以后治疗使用。
在一些实施例中，在治疗或直接从患者中获得T细胞。在这方面，已经观察到，在某些癌症治疗后，特别是用损害免疫系统的药物治疗后，在当患者通常从治疗中恢复的时期，治疗后不久，获得的T细胞的质量可能是最佳的，或改善其离体扩增的能力。同样，在使用本文所述方法进行离体操作后，这些细胞可以处于增强植入和体内扩增的优选状态。因此，在本披露的上下文中预期在该恢复阶段收集血细胞，包括T细胞、树突状细胞、或其他造血系的细胞。此外，在某些实施例中，动员(例如，用GM-CSF动员)和调理方案可用于在受试者中创造条件，其中特别是在治疗后定义的时间窗口期间，有利于细胞类型的再填充、再循环、再生和/或扩增。说明性的细胞类型包括T细胞、B细胞、树突状细胞、和免疫系统的其他细胞。
5.2.5.T细胞的活化和扩增
在一些实施例中，在具有本文所述的CAR的T细胞的基因修饰之前或之后，T细胞都可以通常使用例如以下中所述的方法来活化并扩增：美国专利号6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041，和美国专利申请公开号20060121005。
通常，可以通过与附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的药剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触来扩增T细胞。特别地，可以如本文所述诸如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体接触，或通过与钙离子载体结合的蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑素)来刺激T细胞群。为了共刺激T细胞表面的辅助分子，可使用结合辅助分子的配体。例如，在适合刺激T细胞增殖的条件下，可以将T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD3抗体的实例包括UCHT1、OKT3、HIT3a(BioLegend,San Diego,US)，可以如本领域公知的其他方法那样使用(Graves J等人,J.Immunol.146:2102(1991)；Li B等人,Immunology 116:487(2005)；Rivollier A等人,Blood 104:4029(2004))。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)，如本领域公知的其他方法那样(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,(1998)；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63(1999))。
在一些实施例中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以通过不同的方案提供。例如，提供每个信号的药剂可以在溶液中或与表面偶联。当与表面偶联时，药剂可以与同一表面偶联(即，以“顺式”形式)或与单独的表面偶联(即，以“反式”形式)。替代性地，一种药剂可以在溶液中与表面和另一种药剂偶联。在一个实施例中，提供共刺激信号的药剂与细胞表面结合，提供初级活化信号的药剂在溶液中或与表面偶联。在某些实施例中，两种药剂都可以在溶液中。在另一实施例中，药剂可以是可溶形式，然后交联到表面，诸如表达Fc受体的细胞或抗体或其他将结合药剂的结合剂。在这方面，参见例如美国专利申请公开号20040101519和20060034810的人工抗原呈递细胞(aAPC)，它们在本披露的某些实施例中被考虑用于活化和扩增T细胞。
在一些实施例中，将T细胞与包被药剂的珠组合，随后分离珠和细胞，然后培养细胞。在一个替代性的实施例中，在培养之前，不分离包被药剂的珠和细胞，而是将它们一起培养。在另一个实施例中，首先通过施加力诸如磁力来浓缩珠和细胞，导致细胞表面标记的连接增加，从而诱导细胞刺激。
例如，细胞表面蛋白可以通过允许附着有抗CD3和抗CD28的顺磁珠(3×28珠)接触T细胞来连接。在一个实施例中，将细胞(例如，104至4×108个T细胞)和珠(例如，推荐滴度为1:100的抗CD3/CD28 MACSiBead颗粒)组合在缓冲液中，优选PBS(不含二价阳离子，诸如钙和镁)。本领域普通技术人员可以容易地理解，可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可能非常少，并且仅占样品的0.01％，或者整个样品(即100％)可以包含目的靶细胞。因此，任何细胞数目都在本披露的范围内。在某些实施例中，可能希望显著减少颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施例中，使用约20亿个细胞/mL的浓度。在另一实施例中，使用大于1亿个细胞/mL。在另一个实施例中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/mL的细胞浓度。在又一实施例中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/mL的细胞浓度。在其他实施例中，可以使用1.25或1.50亿个细胞/mL的浓度。使用高浓度可导致细胞产量、细胞活化和细胞扩增增加。此外，使用高细胞浓度可以允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞，诸如CD28阴性T细胞。这样的细胞群可以具有治疗价值，并且在某些实施例中期望能够获得。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱的CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施例中，混合物可以培养数小时(约3小时)至约14天或两者之间的任何小时整数值。在另一实施例中，混合物可以培养21天。在一个实施例中，珠和T细胞一起培养约八天。在另一实施例中，珠和T细胞一起培养2-3天。还可能需要几个刺激周期，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适于T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如，最低限度必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(Lonza))，其可以含有增殖和活力所必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。其他用于细胞生长的添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂，诸如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、X-Vivo 20、优化剂，添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或足以生长和扩增T细胞的量的一种或多种细胞因子。抗生素(例如青霉素和链霉素)仅包含在实验培养物中，而不包含在待输注到受试者体内的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％ CO2)。已经暴露于不同刺激时间的T细胞可以表现出不同的特征。例如，典型的血液或单采的外周血单个核细胞产物具有比细胞毒性或抑制性T细胞群(TC、CD8)更多的辅助性T细胞群(TH、CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体进行的T细胞离体扩增产生T细胞群，该T细胞群在约第8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约第8-9天之后，T细胞群包含越来越多的TC细胞群。因此，根据治疗目的，用主要包含TH细胞的T细胞群输注受试者可能是有利的。类似地，如果分离了TC细胞的抗原特异性亚群，则在更大程度上扩增该亚群可能是有益的。
此外，除了CD4和CD8标记之外，其他表型标记也有显著差异，但在很大程度上，在细胞扩增过程中可再现。因此，这样的再现性使得能够为特定目的定制活化的T细胞产品。
5.3.包含功能性外源受体和嵌合细胞因子受体的多肽
在另一方面，本文提供了一种多肽，该多肽包含至少一种功能性外源受体(诸如CAR、TCR和TAC)和本文提供的嵌合细胞因子受体。本发明的多肽中的嵌合细胞因子受体可以是上述第5.2.1部分中描述的任何一种。本发明的多肽中的功能性外源受体可以是上述第5.2.2部分中描述的任何一种。
在本发明多肽中，嵌合细胞因子受体可以在功能性外源受体的N末端，或者嵌合细胞因子受体可以在功能性外源受体的C末端。
在本文提供的各种多肽的一些实施例中，嵌合细胞因子受体和功能性外源受体通过肽接头彼此连接。在一些实施例中，肽接头是自切割肽，诸如2A自切割肽，使得嵌合细胞因子受体和功能性外源受体在细胞中切割后变成单独的多肽。
2A肽的成员以首次描述它们的病毒命名。例如，首次描述的2A肽F2A源自口蹄疫病毒。自切割18-22个氨基酸长的2A肽介导脯氨酸与甘氨酸残基之间的“核糖体跳跃”并抑制肽键形成而不影响下游翻译。这些肽允许多种蛋白编码为多蛋白，这些多蛋白在翻译时解离成组分蛋白。自切割肽存在于小核糖核酸病毒科病毒家族的成员中，包括口蹄疫病毒(aphthovirus)，诸如口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)、马鼻炎A型病毒(ERAV)、明脉扁刺蛾病毒(TaV)和猪捷申病毒-1(PTV-1)(参见Donnelly等人,J.Gen.Virol.,82:1027-101(2001)；Ryan等人,J.Gen.Virol.,72:2727-2732(2001))，以及心脏病毒，诸如泰勒病毒(例如，泰勒鼠脑脊髓炎)和脑心肌炎病毒。源自FMDV、ERAV、PTV-1和TaV的2A肽有时分别称为“F2A”、“E2A”、“P2A”和“T2A”，并且包括在本披露内容中，例如，如以下文献中所述：Donnelly等人,J.Gen.Virol.,78:13-21(1997)；Ryan和Drew,EMBO J.,13:928-933(1994)；Szymczak等人,Nature Biotech.,5:589-594(2004)；Hasegawa等人,Stem Cells,25(7):1707-12(2007)。在其他实施例中，本文使用内含肽介导的蛋白剪接系统，如Shah和Muir,Chem Sci.,5(1):446-461(2014)以及Topilina和Mills,Mobile DNA,5(5)(2014)中所述。本领域已知的其他方法也可用于本发明的构建体。
在一些实施例中，2A自切割肽选自由F2A、E2A、P2A、T2A或其变体组成的组。在一些实施例中，自切割肽为2A自切割肽P2A片段。在特定实施例中，自切割肽是T2A片段。
在另一方面，本文提供了一种编码上述多肽的核酸，该多肽包含本文提供的功能性外源受体(诸如CAR)、和功能性外源受体，其在下文中更详细地描述。
5.4.多核苷酸
在另一方面，本披露提供了编码本文提供的多肽的多核苷酸，包括上述第5.2部分和第5.3部分中描述的那些。
更特别地，在一些实施例中，本文提供了一种编码多肽的多核苷酸，该多肽包含嵌合抗原受体和功能性外源受体(诸如CAR)，其中该嵌合细胞因子受体和功能性外源受体通过肽接头(诸如2A自切割肽接头)彼此连接。
在又一方面，本文提供一种多核苷酸，该多核苷酸包含编码本文提供的嵌合细胞因子受体的区域(例如，如第5.2.1部分中所述的那些)和编码本文提供的功能性外源受体的区域(例如，如第5.2.2部分中所述的那些)。在一些实施例中，两个区域由同一启动子控制。例如，在一些实施例中，本文使用内部核糖体进入位点(IRES)来表达来自一个启动子的多个基因。在其他实施例中，这些区域由单独的启动子控制。
在又一方面，本文提供一种组合物，该组合物包含编码本文提供的嵌合细胞因子受体的第一多核苷酸(例如，如第5.2.1部分中所述的那些)和编码本文提供的功能性外源受体的第二多核苷酸(例如，如第5.2.2部分中所述的那些)。
本披露的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且可以是双链或单链，并且如果是单链，则可以是编码链或非编码(反义)链。在一些实施例中，多核苷酸是cDNA的形式。在一些实施例中，多核苷酸是合成多核苷酸。
本披露进一步涉及本文所述的多核苷酸的变体，其中该变体编码例如本披露的多肽的片段、类似物和/或衍生物。在某些实施例中，本披露提供了一种多核苷酸，该多核苷酸包含具有与编码本披露的多肽的多核苷酸至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、并且在一些实施例中至少约96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列的多核苷酸。如本文所用，短语“具有与参考核苷酸序列至少例如95％“同一性”的核苷酸序列的多核苷酸”旨在表示除了以下方面外，该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列具有同一性：在该参考核苷酸序列的每100个核苷酸中，该多核苷酸序列可以包括最多五个点突变。换句话说，为了获得具有与参考核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，可以删除或用另一个核苷酸取代参考序列中多达5％的核苷酸，或者可将参考序列中多达总核苷酸的5％的多个核苷酸插入参考序列中。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或那些末端位置之间的，散布在参考序列中的单个核苷酸之间或在参考序列内的一个或多个连续基团中的任何地方。
多核苷酸变体可以在编码区、非编码区或两者中含有改变。在一些实施例中，多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加或缺失但不改变编码的多肽的性质或活性的改变。在一些实施例中，多核苷酸变体包含沉默取代，其不导致多肽的氨基酸序列的改变(由于遗传密码的简并性)。可以出于多种原因产生多核苷酸变体，例如，为了优化特定宿主的密码子表达(即，将人mRNA中的密码子改变为细菌宿主如大肠杆菌所偏好的那些)。在一些实施例中，多核苷酸变体在序列的非编码或编码区中包含至少一个沉默突变。
在一些实施例中，产生了多核苷酸变体以调节或改变编码的多肽的表达(或表达水平)。在一些实施例中，产生了多核苷酸变体以增加编码的多肽的表达。在一些实施例中，产生了多核苷酸变体以减少编码的多肽的表达。在一些实施例中，与亲本多核苷酸序列相比，多核苷酸变体具有增加的编码的多肽的表达。在一些实施例中，与亲本多核苷酸序列相比，多核苷酸变体具有减少的编码的多肽的表达。
5.5.载体
还提供了包含本文所述的多核苷酸或核酸分子的载体。在一个实施例中，可以将核酸分子掺入重组表达载体中。
本披露提供了用于克隆和表达本文所述的多肽中的任一种的载体。在一些实施例中，载体适于在真核细胞诸如哺乳动物细胞中复制和整合。在一些实施例中，载体是病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物。病毒载体技术是本领域熟知的，并且描述于例如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,New York)以及其他病毒学和分子生物学手册中。
已经开发了用于将基因转移到哺乳动物细胞中的许多基于病毒的系统。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将异源核酸插入载体中并包装在逆转录病毒粒子中。然后可以分离重组病毒，并在体外或离体将其递送至工程化哺乳动物细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施例中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一些实施例中，使用慢病毒载体。在一些实施例中，使用自灭活的慢病毒载体。例如，携带免疫调节剂(诸如免疫检查点抑制剂)编码序列的自灭活慢病毒载体和/或携带嵌合抗原受体的自灭活慢病毒载体可以用本领域已知的方案包装。可以使用本领域已知的方法，将所得的慢病毒载体用于转导哺乳动物细胞(例如，原代人T细胞)。源自逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合及其在子代细胞中的繁殖。慢病毒载体还具有低免疫原性，并且可以转导非增殖细胞。
在一些实施例中，载体包含编码本文所述的多肽的核酸中的任一种。可以使用本领域任何已知的分子克隆方法将核酸克隆到载体中，包括例如使用限制性内切酶位点和一种或多种选择性标记。在一些实施例中，核酸可操作地连接到启动子。已经研究了用于哺乳动物细胞中的基因表达的多种启动子，并且本领域已知的任何启动子都可以用于本披露。启动子可大致分为组成型启动子或调节型启动子，如诱导型启动子。
在一些实施例中，编码多肽的核酸可操作地连接到组成型启动子。组成型启动子允许异源基因(也称为转基因)在宿主细胞中组成性地表达。本文考虑的示例性组成型启动子包括但不限于鼠干细胞病毒(MSCV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、人延伸因子-1α(hEF1α)、泛素C启动子(UbiC)、磷酸甘油激酶启动子(PGK)、猿猴病毒40早期启动子(SV40)以及与CMV早期增强子偶联的鸡β-肌动蛋白启动子(CAGG)。在许多研究中，已经广泛地比较了这样的组成型启动子对驱动转基因表达的效率。例如，Michael C.Milone等人比较了CMV、hEF1α、UbiC和PGK驱动原代人T细胞中嵌合抗原受体表达的效率，并得出结论，hEF1α启动子不仅诱导了最高水平的转基因表达，并且最优地维持在CD4和CD8人T细胞中(Molecular Therapy,17(8):1453-1464(2009))。在一些实施例中，编码CAR的核酸可操作地连接到hEF1α启动子。在一些实施例中，编码CAR的核酸可操作地连接到MSCV启动子。
在一些实施例中，编码多肽的核酸可操作地连接到诱导型启动子。诱导型启动子属于调节型启动子的类别。诱导型启动子可以由一种或多种条件诱导，例如物理条件、工程化免疫效应细胞的微环境或工程化免疫效应细胞的生理状态、诱导物(即，诱导剂)或它们的组合。
在一些实施例中，诱导条件不诱导工程化哺乳动物细胞和/或接受药物组合物的受试者中内源性基因的表达。在一些实施例中，诱导条件选自由以下组成的组：诱导物、辐射(例如，电离辐射、光)、温度(例如，热)、氧化还原状态、肿瘤环境和工程化哺乳动物细胞的活化状态。
在一些实施例中，载体还含有选择性标记基因或报告基因以从通过慢病毒载体转染的宿主细胞群中选择表达多肽的细胞。选择性标记和报告基因都可以侧接有适当的调控序列，以使得能够在宿主细胞中表达。例如，载体可以含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调控核酸序列表达的启动子。
5.6.制备方法
在又一方面，本文提供了一种用于制备工程化免疫效应细胞(例如，CAR-T细胞或TCR-T细胞或TAC-T细胞)的方法，该方法包括将本文提供的一种或多种多核苷酸或一种或多种载体(例如，如上述第5.4部分和第5.5部分所述)引入免疫效应细胞中(例如，T细胞)。
更特别地，在一些实施例中，本文提供的工程化免疫效应细胞可以通过将一种或多种编码第5.3部分所述多肽的核酸或一种或多种第5.4部分所述核酸引入T细胞中来产生。
嵌合细胞因子受体和功能性外源受体可以各自作为单独的多肽单独引入T细胞中。
替代性地，本文提供的工程化免疫效应细胞可以由包含多个区域的多核苷酸产生，例如编码CAR的区域、编码嵌合细胞因子受体的区域。不同的区域可以由相同的启动子控制。例如，在一些实施例中，本文使用内部核糖体进入位点(IRES)来表达来自一个启动子的多个基因。在其他实施例中，不同的区域由单独的启动子控制。
在又一方面，本文提供了一种根据本文提供的方法产生的工程化免疫效应细胞(例如，CAR-T细胞)。
上述在CAR-T细胞的背景下描述的方法也适用于产生其他免疫效应细胞(诸如TCR-T细胞和TAC-T细胞)。
5.7.药物组合物
在一方面，本披露进一步提供了包含本披露的工程化细胞的药物组合物。在一些实施例中，药物组合物包含治疗有效量的本披露的工程化T细胞，和药学上可接受的赋形剂。
在特定实施例中，术语“赋形剂”还可以指稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全或不完全))、载剂或媒介物。药物赋形剂可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐水溶液、右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体赋形剂。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以含有少量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释配制品等形式。合适的药物赋形剂的实例在Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.,Easton,PA中进行了描述。这样的组合物将含有预防或治疗有效量的本文提供的活性成分，诸如以纯化形式，以及合适量的赋形剂，以提供适合施用于患者的形式。该配制品应适合于施用方式。
在一些实施例中，赋形剂的选择部分地由特定细胞、和/或通过施用方法决定。因此，存在多种合适的配制品。
通常，可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对受体无毒，并且包括缓冲剂、抗氧化剂，包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、焦亚硫酸钠；防腐剂、等渗剂、稳定剂、金属复合物(例如，Zn-蛋白复合物)；螯合剂，诸如EDTA和/或非离子表面活性剂。
缓冲剂可用于将pH控制在优化治疗效果的范围内，特别是如果稳定性是pH依赖性的。适用于本披露的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐。例如，柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐。另外，缓冲液可以包含组氨酸和三甲胺盐，诸如Tris。
可以添加防腐剂以延缓微生物生长。适用于本披露的防腐剂包括十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎卤(例如，氯、溴、碘)、苄索氯铵；硫柳汞、苯酚、丁基或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇、3-戊醇和间甲酚。
可以存在张力剂(有时称为“稳定剂”)以调节或维持组合物中液体的张力。当与大的带电生物分子诸如蛋白和抗体一起使用时，它们通常被称为“稳定剂”，因为它们可以与氨基酸侧链的带电基团相互作用，从而降低分子间和分子内相互作用的可能性。示例性张力剂包括多羟糖醇、三羟或更高级糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。
另外的示例性赋形剂包括：(1)填充剂、(2)增溶剂、(3)稳定剂和(4)防止变性或粘附到容器壁的药剂。这样的赋形剂包括：多羟糖醇(上文列举的)；氨基酸，诸如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，诸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌糖(myoinisitose)、肌糖醇(myoinisitol)、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(例如，肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，诸如脲、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白，诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其他免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖)；二糖(例如，乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖，诸如棉子糖；以及多糖，诸如糊精或葡聚糖。
可以存在非离子表面活性剂或去污剂(也称为“湿润剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白免于搅动诱导的聚集，这也允许配制品暴露于剪切表面应力而不引起活性治疗蛋白或抗体的变性。合适的非离子表面活性剂包括例如聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(184、188等)、多元醇、/>聚氧乙烯脱水山梨醇单醚(-20、/>-80等)、聚桂醇400、硬脂酸聚烃氧40硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。可以使用的阴离子洗涤剂包括月桂基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子洗涤剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
施用途径根据已知的和可接受的方法，诸如通过单次或多次推注或以合适的方式长时间输注，例如，通过皮下、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、病灶内或关节内途径的注射或输注、局部施用、吸入或通过缓释或延释方式。
在另一实施例中，药物组合物可以作为控释或缓释系统提供。在一个实施例中，可以使用泵来实现控释或缓释(参见例如，Sefton,Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201-40(1987)；Buchwald等人,Surgery 88:507-16(1980)；和Saudek等人,N.Engl.J.Med.321:569-74(1989))。在另一实施例中，聚合材料可用于实现预防剂或治疗剂(例如，如本文所述的融合蛋白)或本文提供的组合物的控释或缓释(参见例如，Medical Applications ofControlled Release(Langer和Wise编辑,1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance(Smolen和Ball编辑,1984)；Ranger和Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61-126(1983)；Levy等人,Science 228:190-92(1985)；During等人,Ann.Neurol.25:351-56(1989)；Howard等人,J.Neurosurg.71:105-12(1989)；美国专利号5,679,377、5,916,597、5,912,015、5,989,463、和5,128,326；PCT公开号WO 99/15154和WO 99/20253)。用于缓释配制品的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一个实施例中，缓释配制品中使用的聚合物是惰性的、不含可浸出杂质、储存稳定、无菌且可生物降解的。在又一实施例中，可以将控释或缓释系统置于特定靶组织，例如鼻道或肺附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如，Goodson,Medical Applications of Controlled Release第2卷,115-38(1984))。控释系统例如由Langer,Science 249:1527-33(1990)讨论。本领域技术人员已知的任何技术可用于生产包含一种或多种如本文所述的药剂的缓释配制品(参见例如，美国专利号4,526,938、PCT公开号WO 91/05548和WO 96/20698、Ning等人,Radiotherapy&Oncology 39:179-89(1996)；Song等人,PDA J.of Pharma.Sci.&Tech.50:372-97(1995)；Cleek等人,Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-54(1997)；和Lam等人,Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-60(1997))。
本文所述的药物组合物还可以根据所治疗的特定适应症的需要含有多于一种活性化合物或活性剂。替代性地或另外，组合物可以包含细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂或生长抑制剂。这样的分子适当地以对预期目的有效的量组合存在。
活性成分也可以包封在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，包封在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或包封在粗乳液中。这样的技术披露于Remington's Pharmaceutical Sciences第18版中。
各种组合物和递送系统是已知的并且可以与本文提供的治疗剂一起使用，该组合物和递送系统包括但不限于包封在脂质体、微粒、微胶囊中，能够表达本文提供的单域抗体或治疗分子的重组细胞，构建作为逆转录病毒载体或其他载体的一部分的核酸等。
在一些实施例中，本文提供的药物组合物包含治疗或预防疾病或病症有效量的结合分子和/或细胞，诸如治疗有效量或预防有效量。在一些实施例中，治疗或预防功效通过定期评估治疗的受试者来监测。对于几天或更长的重复施用，取决于病状，重复进行治疗直至出现疾病症状的所需的遏制。然而，其他剂量方案可能是有用的并且可以确定。
5.8.方法和用途
本文披露的方法可以用于各种治疗目的。在一方面，本披露提供了用于治疗受试者的癌症的方法、降低受试者中肿瘤体积随时间增加的速率的方法、降低发生转移的风险的方法、或降低受试者中发生另外的转移的风险的方法。在一些实施例中，治疗可以停止、减慢、延缓或抑制癌症的进展。在一些实施例中，治疗可以导致受试者中癌症的一种或多种症状的数量、严重程度和/或持续时间降低。
如本文所用，在一些实施例中，本文提供的治疗延迟疾病或病症的发展，例如，延缓、阻碍、减缓、阻滞、稳定、抑制和/或推迟疾病(诸如癌症)的发展。该延迟可以具有不同的时间长度，其取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。如本领域技术人员显而易见的，充分或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体没有患上疾病或病症。例如，可能延迟晚期癌症(例如转移的发展)。在其他实施例中，本文提供的方法或用途预防疾病或病症。
在一些实施例中，本发明细胞疗法包含含有T细胞的疗法，这些T细胞表达本文所述的各种CAR、TCR、cTCR、TAC、TAC样嵌合受体、CAR和CCR、TCR和CCR、cTCR和CCR、TAC和CCR、TAC样嵌合体受体和CCR或其组合。在一些实施例中，本发明CAR-T细胞疗法用于治疗实体瘤癌症。在其他实施例中，本发明CAR-T细胞疗法用于治疗血癌。
在一些实施例中，受试者患有GPC3、AFP、密蛋白18.2、CD19、CD20、CD22、BCMA、GD2、DLL3、MSLN、CD30、CLL1或CD33阳性癌症。在一些实施例中，受试者患有肝癌(例如，肝细胞癌)、胶质瘤、肺癌、结直肠癌、头颈癌、胃癌、肾癌、尿路上皮癌、睾丸癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌和/或卵巢癌。在一些实施例中，受试者患有鳞状细胞肺癌或实体瘤。在一些实施例中，受试者患有CNS肿瘤、甲状腺癌、胃肠道癌、皮肤癌、肉瘤、泌尿生殖器癌和/或生殖细胞肿瘤。GPC3相关癌症可以在例如Moek,Kirsten L.等人,The American Journal ofPathology188.9(2018):1973-1981中发现，该文献通过援引以其全文并入本文。
在其他实施例中，疾病或病症是自身免疫性和炎症性疾病。在其他实施例中，疾病或病症是感染性疾病。在一些实施例中，炎症性或自身免疫性疾病选自由关节炎、结肠炎、银屑病、重度哮喘和中度至重度克罗恩病组成的组。
在一些实施例中，疾病或病症是血液学癌症，诸如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施例中，癌症选自由以下组成的组：霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、皮肤B细胞淋巴瘤、活化B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡中心性淋巴瘤、转化淋巴瘤、中度分化淋巴细胞性淋巴瘤、中间淋巴细胞性淋巴瘤(ILL)、弥漫性低分化淋巴细胞性淋巴瘤(PDL)、中心细胞淋巴瘤、弥漫性小裂解细胞淋巴瘤(DSCCL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、皮肤T细胞淋巴瘤、外套层淋巴瘤、低级别滤泡性淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性T细胞白血病、急性髓系白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性巨核细胞白血病、前体B急性淋巴母细胞性白血病、前体T急性淋巴母细胞性白血病、伯基特白血病(Burkitt’s leukemia)(伯基特淋巴瘤)、急性双表型白血病、慢性骨髓性淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病(CML)和慢性单核细胞白血病。在特定实施例中，疾病或病症是骨髓增生异常综合征(MDS)。在另一特定实施例中，疾病或病症是急性髓系白血病(AML)。在另一特定实施例中，疾病或病症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在又一特定实施例中，疾病或病症是多发性骨髓瘤(MM)。
在其他实施例中，疾病或病症是实体瘤癌症。在一些实施例中，实体瘤癌症选自由以下组成的组：癌、腺癌、肾上腺皮质癌、结肠腺癌、结直肠腺癌、结直肠癌、导管细胞癌、肺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌、肝癌和肺癌。
在一些实施例中，疾病或病症是由病原体引起的。在一些实施例中，病原体引起感染性疾病。在一些实施例中，病原体是细菌。在一些实施例中，病原体是寄生虫。在一些实施例中，病原体是病毒。
在其他实施例中，疾病或病症是免疫性或自身免疫性病症。在一些实施例中，疾病或病症是炎症性疾病。炎症在宿主防御和免疫介导疾病的进展中起着重要作用。炎症反应是对损伤(例如，创伤、缺血和外来颗粒)和感染(例如，细菌或病毒感染)的反应，通过包括化学介质(例如，细胞因子和前列腺素)和炎症细胞(例如，白细胞)在内的复杂级联事件而启动的。炎症反应的特点是血流量增加、毛细血管通透性增加和吞噬细胞的大量涌入。这些事件导致受伤或感染部位肿胀、发红、发热(热模式改变)和脓形成。
用于过继细胞疗法的细胞施用方法是已知的，如例如，在以下中所述：美国专利申请公开号2003/0170238；美国专利号4,690,915；Rosenberg,Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85(2011)；Themeli等人,Nat Biotechnol.31(10):928-933(2013)；Tsukahara等人,Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9(2013)；及Davila等人,PLoS ONE 8(4):e61338(2013)。这些方法可以与本文提供的方法和组合物结合使用。
在一些实施例中，细胞疗法(例如过继T细胞疗法)通过自体转移进行，其中细胞从待接受细胞疗法的受试者或源自这样的受试者的样品分离和/或以其他方式制备。因此，在一些方面，细胞源自需要治疗的受试者，并且在分离和处理后，将细胞施用于同一受试者。在其他实施例中，细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过同种异体转移进行，其中细胞从待接受或最终接受细胞疗法的受试者之外的受试者(例如第一受试者)分离和/或以其他方式制备。在这样的实施例中，然后将细胞施用于相同物种的不同受试者，例如，第二受试者。在一些实施例中，第一受试者和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施例中，第一受试者和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施例中，第二受试者表达与第一受试者相同的HLA类型或超型。
在一些实施例中，施用细胞、细胞群或组合物的受试者是灵长类动物，诸如人。受试者可以是男性或女性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、幼年、青少年、成人和老年受试者。在一些实施例中，受试者是用于疾病、过继细胞疗法和/或用于评估毒性结果的经过验证的动物模型。
本文提供的组合物可以通过任何合适的方式施用，例如通过注射，例如静脉内注射或皮下注射。在一些实施例中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内施用，并且如果需要局部治疗，则通过病灶内施用。
有效预防和/或治疗疾病或病状的本文提供的预防剂或治疗剂的量可以通过标准临床技术确定。有效剂量可以从得自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推。对于疾病的预防或治疗，结合分子或细胞的适当剂量可以取决于待治疗的疾病或病症的类型、结合分子的类型、疾病或病症的严重程度和病程、施用治疗剂是否用于预防或治疗目的、先前疗法、患者的临床病史和对药剂的反应，以及主治医师的判断。在一些实施例中，组合物、分子和细胞在一次或在一系列治疗中适当地施用于患者。可以间歇地施用多个剂量。可以施用初始较高的负荷剂量，随后施用一个或多个较低的剂量。
在基因工程化细胞的情况下，在一些实施例中，可以向受试者施用约一百万至约1千亿个细胞和/或每千克体重该量的细胞。在一些实施例中，其中该药物组合物包含本文所述的工程化免疫细胞中任一个，该药物组合物以至少约104、105、106、107、108、或109个细胞/kg个体体重中任一的剂量施用。剂量可以根据疾病或病症和/或患者和/或其他治疗的特定属性而变化。
在一些实施例中，施用一次药物组合物。在一些实施例中，施用多次(例如2、3、4、5、6或更多次中的任一个)药物组合物。在一些实施例中，药物组合物在给药周期中施用一次或多次。给药周期可以是例如1、2、3、4、5或更多周，或1、2、3、4、5或更多个月。针对特定患者的最佳剂量和治疗方案可以由医学领域的技术人员通过监测患者的疾病体征并相应地调整治疗来确定。
在一些实施例中，本文提供的组合物作为组合治疗的一部分施用，诸如与另一种治疗干预(诸如另一种抗体或工程化细胞或受体或药剂，诸如细胞毒性剂或治疗剂)同时或以任何顺序依次施用。
在某些实施例中，在将细胞施用于哺乳动物(例如，人)后，通过多种已知方法中的任一种测量工程化细胞群的生物活性。评估的参数包括体内(例如，通过成像)或离体(例如，通过ELISA或流式细胞术)工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合。在某些实施例中，工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用本领域已知的任何合适的方法来测量，诸如在例如Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)以及Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)中描述的细胞毒性测定法。在某些实施例中，细胞的生物活性还可以通过测定某些细胞因子诸如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF的表达和/或分泌来测量。在一些方面，生物活性通过评估临床结果诸如肿瘤负荷或负荷的减少来测量。
5.9.套件(试剂盒)和制品
还提供了包含本文所述的工程化免疫效应细胞中任一种的套件、单位剂量和制品。在一些实施例中，提供了含有本文所述的药物组合物中的任一种的套件，并且优选提供了其使用说明书。
本申请的套件在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐子、柔性包装(例如，密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。套件可以任选地提供其他组成部分，如缓冲液和解释信息。因此本申请还提供了制品，其包括小瓶(如密封的小瓶)、瓶、罐子、柔性包装等。
制品可以包含容器和该容器上或与该容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如，瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)形成。通常，容器容纳有效治疗本文所述的疾病或病症(例如，癌症)的组合物，并且可具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装插页指示组合物用于治疗个体的特定病状。标签或包装插页将进一步包含用于将组合物施用于个体的说明书。标签可指示用于重构和/或使用的指导。容纳药物组合物的容器可以是多次使用的小瓶，其允许重复施用(例如，2-6次施用)重构配制品。包装插页是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，这些说明书含有关于使用这样的治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。另外地，制品可进一步包含第二容器，该容器包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。其可以进一步包括从商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
套件或制品可包括多个单位剂量的药物组合物和使用说明书，其包装的数量足以在药房(例如，医院药房和配药药房)中储存和使用。
本披露在本文中总体上使用肯定性语言来描述多种实施例来披露。本披露还特别包括其中全部或部分排除特定主题的实施例，诸如物质或材料、方法步骤和条件、方案、程序、测定或分析。因此，即使本披露在本文中总体上未根据本披露不包括的内容来表达，但未明确包括在本披露中的方面仍然在本文中披露。
已经描述了本披露的多个实施例。然而，应当理解，在不脱离本披露的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，以下实例旨在说明而非限制权利要求中描述的披露范围。
6.实例
下文是对研究中使用的各种方法和材料的描述，并且目的在于向本领域普通技术人员提供完整的披露内容和如何制造和使用本披露的描述，并且不旨在限制发明人认为是其披露内容的范围，也不旨在表示进行以下实验并且是可以进行的所有实验。应当理解，不必执行以现在时态写的示例性描述，而是可以执行这些描述以生成与本披露的传授内容相关联的数据等。已努力确保所用数字(例如，量、百分比等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。
6.1.实例1—质粒构建、病毒制备、滴度评估
如图1A至1B、2A至2B和3A至3B以及SEQ ID NO:30-134、136-140、142、144、146、148、150和151中显示的设计用不同嵌合细胞因子受体装甲的CAR T细胞。为了产生包含编码本文披露的任何系统的多核酸的病毒颗粒，将包括pMDLg/pRRE(Addgene#11251)、pRSV-Rev(Addgene#11253)和pMD2.G(Addgene#11259)的慢病毒包装质粒混合物与PLVX-EF1A(包括靶系统)载体以预先优化的比率与聚醚酰亚胺(PEI)预混合，并在室温下孵育5分钟。将转染混合物逐滴添加滴至293-T细胞中并轻轻混合。将转染的293-T细胞在37℃和5％ CO2下孵育过夜。转染后二十四小时，收集上清液，并在4℃、500g下离心10min以去除任何细胞碎片。将离心后的上清液通过0.45μm PES过滤器过滤，通过超速离心浓缩病毒上清液。离心后，小心丢弃上清液，并用预冷的DPBS冲洗病毒沉淀。测量病毒的浓度。将病毒等分并储存在-80℃。通过T细胞系上的功能转导测定病毒滴度。
简而言之，使用pLVX-Puro(Clontech#632164)，通过将原始启动子替换为人类延伸因子1α启动子(hEF1α)并通过GenScript用EcoRI和BamHI去除嘌呤霉素抗性基因来修饰慢病毒载体。PLVX-EF1A进一步进行如上所述的慢病毒包装程序。
6.2.实例2—T细胞转导和转导的T细胞的FACS分析
通过向PBMC中添加5μM唑来膦酸盐和1000IU/mL IL-2来制备γδT细胞或αβT细胞，并培养14天，定期更换补充有1000IU/mL IL-2的培养基。替代性地，从PBMC或脐带血(UCB)中分离γδT细胞或αβT细胞，然后用抗γδTCR抗体或抗αβTCR抗体和抗CD3(OKT3)刺激，随后以1:2的比率与基于K562的人工抗原呈递细胞(aAPC)共孵育至少10天。
通过密度离心(lymphoprep)从白细胞去除术材料中分离PBMC并冷冻保存。将PBMC复苏并在补充有IL-2(1000IU/ml)和5％人AB血清的细胞培养基AIM-V中用唑来膦酸(5μΜ)激活，并且保存在加湿室(37℃，5％ CO2)中。激活后48小时，在MOI为5且存在5pg/ml聚凝胺下，用编码实例1的系统的慢病毒载体转导细胞。第二天重复这样的转导程序，随后在转导后第二天补充含有IL-2(1000IU/ml)的新鲜培养基。在加湿室中在补充有IL-2(1000IU/ml)的AIM-V中培养细胞，培养基的定期更换取决于培养基的pH，以进一步扩增。转导后10天收获细胞，并确定总数、纯度和转导效率。在将来应用或冷冻保存之前，用阴性TCRγ/δ+T细胞或TCRαβ+T细胞分离套件(Miltenyi Biotec)进一步富集细胞。
6.3.实例3—转基因表达的定量
在转导后第3天及之后(通常是第3、7和14天)，通过流式细胞术评估细胞中实例1的系统的表达。从培养物中收集细胞的等分试样，然后洗涤，沉淀并重悬于每个样品50-100μl以100的稀释倍数的PBS+0.5％ FBS中稀释的抗体(eBioscience)中。将重悬的细胞重悬在约50至100μl的溶液中。将细胞在4℃下孵育30分钟。根据制造商的说明还添加了活性染料eFluor780或SYTOX蓝活力染色剂。孵育后，将细胞在PBS中洗涤两次并重悬于100至200μlPBS中进行分析。通过流式细胞术定量系统的平均荧光。
如图35和36中显示的，与抗GPC3 CARαβT细胞相比，NKG2D CAR T细胞在培养过程中由于自杀或自相残杀而具有较差的增殖和活力。
对于抗GPC3 CAR-T染色，将细胞用PE抗DYKDDDDK标签抗体(Biolegend)染色。使用FlowJo(Tree Star,Inc.)进行流式细胞术所有实验的分析。
表1显示了表达不同CAR或具有装甲的病毒感染的T细胞的阳性率。
表1.示例性抗GPC3 CAR T细胞的转染效率
构建体 T细胞转染的阳性率
BM CAR(γδT细胞) 50.3％
BM NKG2D-IL-7Rα--IL12Rβ2(γδT细胞) 37.3％
6.4.实例4—配体在肿瘤细胞系上的表达定量
测定NKG2D在HCC细胞系huh7上的配体表面表达。Huh7细胞用抗MIC A/B抗体(Biolegend)、抗ULBP-1抗体(R&D)、抗ULBP-3抗体(R&D)、抗ULBP-2,5,6抗体(R&D)或抗CD155抗体(Biolegend)染色。
如图4中显示的，huh7细胞适度表达NKG2D配体、MIC A/B、ULBP-2,5,6。
6.5.实例5—体外细胞毒性测定
为了在体外快速评估CAR-T细胞(γδT细胞或αβT细胞)的抗肿瘤活性，进行了细胞毒性的FACS测定。转导后第8天，收获转导的T细胞，并与靶细胞(GPC3+HCC细胞系：Huh7和PLC-PRF-5，GPC3-HCC细胞系：SK-HEP-1)以3:1、1:1或0.3:1的E/T比(效应子：CAR-T/靶点：Huh7，PLC-PRF-5或SK-HEP-1)共孵育16小时。对靶细胞进行CFSE预染色。使用来自同一批次的未转导的T细胞(UNT)作为阴性对照。收获混合细胞并对其进行7-ADD染色。细胞毒性通过以下方程计算：7AAD+(E+T)：E/T共孵育中的7-ADD％，7AAD+(T)：仅靶点中的7-ADD％。所有抗GPC3 CAR T细胞(γδT细胞或αβT细胞)对huh7细胞显示出强大且相当的细胞毒性。细胞毒性计算如下：细胞毒性％＝(7AAD+(E+T)-7AAD+(T))/(1-7AAD+(T))×100。
6.6.实例6—通过HTRF检测IFN-γ、GM-CSF和TNF-α的分泌
为了测量效应T细胞的活化和增殖，测量了效应细胞因子如IFN-γ、GM-CSF和TNF-α的产生。收集来自体外细胞毒性测定的上清液以评估CAR诱导的细胞因子释放。根据制造商手册进行IFN-γ(Cisbio，Cat#62HIFNGPEH)、GM-CSF(Cisbio，Cat#62HGMCSFPEH)和TNFα(Cisbio，Cat#62HTNFAPEH)的HTRF测定。
所有抗GPC3 CAR T细胞(γδT细胞或αβT细胞)都表现出针对huh7细胞的有效杀伤活性，并应答于huh7细胞释放IFN-γ、GM-CSF和TNF-α。用NKG2D嵌合细胞因子受体装甲的CAR T细胞(γδT细胞或αβT细胞)显示出与裸CAR T细胞相似的TNF-α、IFN-γ和GM-CSF分泌水平。
6.7.实例7—长期细胞毒性测定
为了评估CAR T细胞(γδT细胞或αβT细胞)的长期杀伤功效，进行了长期共培养测定，其模拟体内的动态杀伤过程。在不存在外源细胞因子(IL-2)的情况下，将转导或未转导的T细胞(1×105个/孔)与肿瘤细胞系(huh7、Raji或U937细胞，1×105个/孔)以1:1的E:T比率在24孔板中共培养。2或3天的共培养后，收获这些细胞中的一部分并针对CD3进行染色。对于系列共培养测定，然后以相同的E:T比率用新鲜huh7细胞再次攻击剩余T细胞。进行共培养，直到肿瘤细胞长得超出。每个时间点的T细胞增殖率通过将该时间点的T细胞数除以起始时间点的T细胞数来计算。
图5、7、9、11、13和15显示了通过FACS检测，NKG2D嵌合的单个或两个细胞因子受体装甲的BM CARγδT细胞或αβT细胞的长期细胞毒性。图6、8、10、12、14和16显示了来自相同实验的经计算的T细胞增殖。数据表明NKG2D嵌合细胞因子受体装甲提高了BM CAR T细胞的细胞毒性和增殖。
图17显示了通过FACS检测，截短的NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的BM CARαβT细胞的长期细胞毒性。图18显示了来自相同实验的经计算的T细胞增殖。数据表明截短的NKG2D嵌合细胞因子受体装甲提高了BM CAR T细胞的细胞毒性和增殖。
图19显示了通过FACS检测，抗MIC-A/B scFv嵌合的两种细胞因子受体装甲的BMCARγδT细胞的长期细胞毒性。图20显示了来自相同实验的经计算的T细胞增殖。数据表明抗MIC-A/B scFv嵌合细胞因子受体装甲提高了BM CAR T细胞的细胞毒性和增殖。
图22显示了通过FACS检测，NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的构建体185CARαβT细胞(抗GPC3 CARαβT细胞)的长期细胞毒性。图23显示了来自相同实验的经计算的T细胞增殖。数据表明NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲提高了构建体185CARαβT细胞的细胞毒性和增殖。
图24和26显示了通过FACS检测，NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的CTL-019CAR(抗CD19 CAR)γδT细胞或αβT细胞的长期细胞毒性。图25和图27显示了来自相同实验的经计算的T细胞增殖。数据表明NKG2D嵌合细胞因子受体装甲提高了CTL-019CAR T细胞的细胞毒性和增殖。
图28显示了通过FACS检测，NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的AS67190 CARαβT细胞(抗CD33 CARαβT细胞)的长期细胞毒性。图29显示了来自相同实验的经计算的T细胞增殖。数据表明NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲提高了AS67190 CARαβT细胞的细胞毒性和增殖。
图30显示了通过FACS检测，TIGIT嵌合的两种细胞因子受体装甲的BM CARγδT细胞的长期细胞毒性。图31显示了来自相同实验的经计算的T细胞增殖。数据表明TIGIT嵌合细胞因子受体装甲提高了BM CAR T细胞的细胞毒性和增殖。
图33显示了通过FACS检测，SIRP-α嵌合的两种细胞因子受体装甲的AS67190 CARγδT细胞的长期细胞毒性。图34显示了来自相同实验的经计算的T细胞增殖。数据表明SIRP-α嵌合细胞因子受体装甲提高了AS67190 CAR T细胞的细胞毒性和增殖。
图37显示了通过FACS检测，缺失的NKG2D或组成型活性嵌合的两种细胞因子受体装甲的BM CARαβT细胞的长期细胞毒性。图38显示了来自相同实验的经计算的T细胞增殖。数据表明NKG2D对嵌合细胞因子受体装甲具有重要意义。
6.8.实例8—体内安全性和功效评估
在huh7异种移植模型中评估了示例性抗GPC3 CAR-T细胞(γδT细胞或αβT细胞)的体内抗肿瘤活性。简言之，在第0天，将3百万(3×106)个huh7细胞皮下植入NOD/SCID IL-2RγC null(NSG)小鼠中。肿瘤接种后十天，将小鼠进行如下处理：静脉内注射1×106个装甲的CAR-γδT或模拟T细胞或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。每周两次用卡尺测量肿瘤尺寸，并使用公式V＝1/2(长×宽2)计算肿瘤体积。当对照小鼠的平均肿瘤负荷达到2,000mm3时，将小鼠安乐死。此外，通过FACS分析从血液中抽取的血浆监测T细胞增殖。
对于毒性评估，每天观察临床症状，同时观察动物的体重。每周抽取血液(0.2mL)用于检测小鼠的人源化细胞因子谱(GM-CSF、IFN-γ和TNF-α)。
图21显示了在huh7异种移植模型中，抗GPC3 CARγδT细胞或用NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的抗GPC3 CARγδT细胞的抗肿瘤效果的结果。未装甲的CAR-γδT细胞和嵌合细胞因子受体装甲的CAR-γδT细胞一起抑制肿瘤生长。特别地，未装甲的CAR-γδT细胞处理的小鼠达到无肿瘤，但被缓慢排斥，而NKG2D嵌合的两种细胞因子受体装甲的CAR-γδT细胞处理的小鼠达到无肿瘤并保持健康和无肿瘤，直到实验观察结束。
图32显示了在huh7异种移植模型中，抗GPC3 CARγδT细胞或用TIGIT嵌合细胞因子受体装甲的抗GPC3 CARγδT细胞的抗肿瘤效果的结果。未装甲的CAR-γδT细胞和嵌合细胞因子受体装甲的CAR-γδT细胞一起抑制肿瘤生长。特别地，未装甲的CAR-γδT细胞处理的小鼠受到轻微抑制，而TIGIT嵌合的两种细胞因子受体装甲的CAR-γδT细胞处理的小鼠达到无肿瘤。
总之，嵌合细胞因子受体装甲的CAR-γδT细胞在治疗肿瘤方面被证明是有效和安全的，如体外功效、体内功效和安全性测试中所示。
从上文可以理解，尽管为了说明的目的在本文中描述了特定实施例，但是可以在不脱离本文所提供的精神和范围的情况下进行各种修改。上文提及的所有参考文献通过援引以其全文并入本文。
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Claims (78)

1.一种免疫效应细胞，所述免疫效应细胞表达：
(i)嵌合细胞因子受体，所述嵌合细胞因子受体包含：
(a)第一胞外抗原结合结构域，其中所述第一胞外抗原结合结构域源自NKG2D、截短的NKG2D、靶向NKG2D配体的抗体或其抗原结合片段、TIGIT或SIRP-α、或其变体，
(b)第一跨膜结构域，和
(c)细胞因子受体胞内结构域；以及
(ii)任选地功能性外源受体，所述功能性外源受体包含：
(a)第二胞外抗原结合结构域、
(b)第二跨膜结构域、和
(c)胞内信号传导结构域。
2.如权利要求1所述的免疫效应细胞，其中所述第一胞外抗原结合结构域与在肿瘤细胞的表面上表达的抗原结合。
3.如权利要求1或权利要求2所述的免疫效应细胞，
(i)其中所述第一胞外抗原结合结构域源自NKG2D或截短的NKG2D、或其变体，其中任选地，所述第一胞外抗原结合结构域源自NKG2D或截短的NKG2D的胞外结构域(ECD)，并且其中任选地，所述第一胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:6、156或157的氨基酸序列，或与SEQID NO:6、156或157具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
(ii)其中所述第一胞外抗原结合结构域包含与NKG2D配体或其变体结合的抗体或其抗原结合片段，其中任选地，所述NKG2D配体选自由MICA/B、ULBP-1、ULBP-2,5,6和ULBP-3组成的组，并且其中任选地，所述抗体或其抗原结合片段包含与所述NKG2D配体结合的一个或多个scFv或一个或多个sdAb；
(iii)其中所述第一胞外抗原结合结构域源自TIGIT或其变体，其中任选地，所述第一胞外抗原结构域源自TIGIT的ECD，并且其中任选地，所述第一胞外抗原结合结构域包含SEQID NO:145的氨基酸序列或与SEQ ID NO:145具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；或
(iv)其中所述第一胞外抗原结合结构域源自SIRP-α或其变体，其中任选地，所述第一胞外抗原结构域源自SIRP-α的ECD，并且其中任选地，所述第一胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列或与SEQ ID NO:147具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
4.如权利要求1至3中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述第一跨膜结构域包含Janus激酶(JAK)结合结构域。
5.如权利要求4所述的免疫效应细胞，其中所述JAK结合结构域源自由EPOR、GHR、TPOR或其变体组成的组。
6.如权利要求5所述的免疫效应细胞，其中所述JAK结合结构域源自TPOR，并且包含SEQID NO:7的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
7.如权利要求1至6中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述细胞因子受体胞内结构域源自一种或多种细胞因子受体，所述一种或多种细胞因子受体选自由以下组成的组：IL2Rα、IL7Rα、IL9R-1、IL9R-2、IL9R-3、IL12Rβ1、IL12Rβ2、IL15Rα、IL15Rβ-1、IL15Rβ-2、IL15Rβ-3、IL18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、或其变体及其组合。
8.如权利要求7所述的免疫效应细胞，其中所述细胞因子受体胞内结构域选自IL-7Rα、IL12Rβ1、IL12Rβ2、IL15Rα、IL15Rβ-1、IL15Rβ-2、IL15Rβ-3、IL-18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、IL9R-1、IL9R-2、IL9R-3、IL-7Rα-IL12Rβ1、IL-7Rα-IL15Rα、IL-7Rα-IL15Rβ-1、IL-7Rα-IL15Rβ-2、IL-7Rα-IL21R-1、IL-7Rα-IL21R-2、IL-7Rα-IL21R-3、IL-7Rα-IL23R-2、IL-7Rα-GMCSFRα、IL-7Rα-GM-CSFRβ-1、IL-7Rα-GM-CSFRβ-2、IL12Rβ1-IL15Rα、IL12Rβ1-IL15Rβ-1、IL12Rβ1-IL15Rβ-2、IL12Rβ1-IL-21R-1、IL12Rβ1-IL-21R-2、IL12Rβ1-IL-21R-3、IL12Rβ1-IL-23R-2、IL12Rβ1-GM-CSFRα、IL12Rβ1-GM-CSFRβ-1、IL12Rβ1-GM-CSFRβ-2、IL12Rβ2-IL15Rα、IL12Rβ2-IL15Rβ-1、IL12Rβ2-IL15Rβ-2、IL12Rβ2-IL-21R-1、IL12Rβ2-IL-21R-2、IL12Rβ2-IL-21R-3、IL12Rβ2-IL-23R-2、IL12Rβ2-GM-CSFRα、IL12Rβ2-GM-CSFRβ-1、IL12Rβ2-GM-CSFRβ-2、IL15Rα-IL-21R-1、IL15Rα-IL-21R-2、IL15Rα-IL-21R-3、IL15Rα-IL-23R-2、IL15Rα-GM-CSFRα、IL15Rα-GM-CSFRβ-1、IL15Rα-GM-CSFRβ-2、IL15Rβ-1-IL-21R-1、L15Rβ-1-IL-21R-2、IL15Rβ-1-IL-21R-3、IL15Rβ-1-IL-23R-2、IL15Rβ-1-GM-CSFRα、IL15Rβ-1-GM-CSFRβ-1、IL15Rβ-1-GM-CSFRβ-2、IL15Rβ-2-IL-21R-1、IL15Rβ-2-IL-21R-2、IL15Rβ-2-IL-21R-3、L15Rβ-2-IL-23R-2、IL15Rβ-2-GM-CSFRα、IL15Rβ-2-GM-CSFRβ-1、IL15Rβ-2-GM-CSFRβ-2、IL-21R-1-IL-23R-2、IL-21R-1-GM-CSFRα、IL-21R-1-GM-CSFRβ-1、IL-21R-1-GM-CSFRβ-2、IL-21R-2-IL-23R-2、IL-21R-2-GM-CSFRα、IL-21R-2-GM-CSFRβ-1、IL-21R-2-GM-CSFRβ-2、IL-21R-3-IL-23R-2、IL-21R-3-GM-CSFRα、IL-21R-3-GM-CSFRβ-1、IL-21R-3-GM-CSFRβ-2、IL-23R-2-GM-CSFRα、IL-23R-2-GM-CSFRβ-1、IL-23R-2-GM-CSFRβ-2、IL-7Rα-IL-9R-2、IL12Rβ1-IL-9R-2、IL12Rβ2-IL-9R-2、IL15Rα-IL-9R-2、IL15Rβ-1-IL-9R-2、IL15Rβ-2-IL-9R-2、IL-21R-1-IL-9R-2、IL-21R-2-IL-9R-2、IL-21R-3-IL-9R-2、IL-23R-2-IL-9R-2、GM-CSFRα-IL-9R-2、GM-CSFRβ-1-IL-9R-2、GM-CSFRβ-2-IL-9R-2、IL-7Rα-IL-12Rβ2、或其变体。
9.如权利要求7所述的免疫效应细胞，其中所述细胞因子受体胞内结构域包含选自SEQID NO:8-28的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:8-28的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的免疫效应细胞，其中所述细胞因子受体胞内结构域包含SEQ IDNO:8、10、14-17或20-28中的一个或多个氨基酸序列。
11.如权利要求1至10中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述功能性外源受体是T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、嵌合TCR(cTCR)、或T细胞抗原偶联物(TAC)样嵌合受体。
12.如权利要求11所述的免疫效应细胞，其中所述功能性外源受体是CAR，其中任选地，所述CAR是单CAR、双CAR、串联CAR或分离的CAR。
13.如权利要求12所述的免疫效应细胞，其中所述CAR与肿瘤相关抗原结合，其中任选地，所述肿瘤相关抗原选自由以下组成的组：GPC3、AFP、密蛋白18.2、CD19、CD20、CD22、BCMA、GD2、DLL3、MSLN、CD30、CLL1和CD33。
14.如权利要求11所述的免疫效应细胞，其中所述功能性外源受体是TCR。
15.如权利要求14所述的免疫效应细胞，其中所述TCR与肿瘤相关抗原结合，其中任选地，所述肿瘤相关抗原选自由以下组成的组：GPC3、AFP、密蛋白18.2、CD19、CD20、CD22、BCMA、GD2、DLL3、MSLN、CD30、CLL1或CD33。
16.如权利要求1至15中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述第二跨膜结构域源自选自由CD8、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。
17.如权利要求16所述的免疫效应细胞，其中所述第二跨膜结构域来自CD8α或CD28。
18.如权利要求1至17中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。
19.如权利要求18所述的免疫效应细胞，其中所述初级胞内信号传导结构域来自CD3ζ。
20.如权利要求1至19中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。
21.如权利要求20所述的免疫效应细胞，其中所述共刺激信号传导结构域源自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合。
22.如权利要求21所述的免疫效应细胞，其中所述共刺激信号传导结构域包含CD28的胞内结构域和/或CD137的胞内结构域。
23.如权利要求1至22中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述功能性外源受体进一步包含位于所述胞外抗原结合结构域的C末端与所述跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。
24.如权利要求23所述的免疫效应细胞，其中所述铰链结构域来自CD8α。
25.如权利要求1至24中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述嵌合细胞因子受体和/或所述功能性外源受体进一步包含信号肽。
26.如权利要求25所述的免疫效应细胞，其中所述信号肽来自CD8α。
27.如权利要求12、13和16至26中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述CAR包含SEQID NO:29、135、141、143或149的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:29、135、141、143或149具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
28.如权利要求1至27中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞包含SEQID NO:30-134、136-140、142、144、146或148的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:30-134、136-140、142、144、146或148具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
29.如权利要求1至28中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述嵌合细胞因子受体进一步包含标签，和/或所述功能性外源受体进一步包含标签。
30.如权利要求29所述的免疫效应细胞，其中与所述嵌合细胞因子受体连接的所述标签不同于与所述功能性外源受体连接的所述标签。
31.如权利要求29或30所述的免疫效应细胞，其中所述标签包含SEQ ID NO:4、5或158-160的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:4、5或158-160的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
32.如权利要求1至31中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK T细胞、巨噬细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、单核细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞。
33.如权利要求32所述的免疫效应细胞，其中所述T细胞是细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、自然杀伤T细胞、αβT细胞或γδT细胞。
34.一种多肽，所述多肽包含：
(i)嵌合细胞因子受体，所述嵌合细胞因子受体包含：
(a)第一胞外抗原结合结构域，其中所述第一胞外抗原结合结构域源自NKG2D、截短的NKG2D、靶向NKG2D配体的抗体或其抗原结合片段、TIGIT或SIRP-α、或其变体，
(b)第一跨膜结构域，和
(c)细胞因子受体胞内结构域；以及
(ii)任选地功能性外源受体，所述功能性外源受体包含：
(a)第二胞外抗原结合结构域、
(b)第二跨膜结构域、和
(c)胞内信号传导结构域。
35.如权利要求34所述的多肽，其中所述第一胞外抗原结合结构域与在肿瘤细胞的表面上表达的抗原结合。
36.如权利要求34或权利要求35所述的多肽，
(i)其中所述第一胞外抗原结合结构域源自NKG2D或截短的NKG2D、或其变体，其中任选地，所述第一胞外抗原结合结构域源自NKG2D或截短的NKG2D的ECD，并且其中任选地，所述第一胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:6、156或157的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6、156或157具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
(ii)其中所述第一胞外抗原结合结构域包含与NKG2D配体或其变体结合的抗体或其抗原结合片段，其中任选地，所述NKG2D配体选自由MICA/B、ULBP-1、ULBP-2,5,6和ULBP-3组成的组，并且其中任选地，所述抗体或其抗原结合片段包含与所述NKG2D配体结合的一个或多个scFv或一个或多个sdAb；
(iii)其中所述第一胞外抗原结合结构域源自TIGIT或其变体，其中任选地，所述第一胞外抗原结构域源自TIGIT的ECD，并且其中任选地，所述第一胞外抗原结合结构域包含SEQID NO:145的氨基酸序列；或
(iv)其中所述第一胞外抗原结合结构域源自SIRP-α或其变体，其中任选地，所述第一胞外抗原结构域源自SIRP-α的ECD，并且其中任选地，所述第一胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列。
37.如权利要求34至36中任一项所述的多肽，其中所述第一跨膜结构域包含Janus激酶(JAK)结合结构域。
38.如权利要求37所述的多肽，其中所述JAK结合结构域源自由EPOR、GHR、TPOR或其变体组成的组。
39.如权利要求38所述的多肽，其中所述JAK结合结构域源自TPOR，并且包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
40.如权利要求34至39中任一项所述的多肽，其中所述细胞因子受体胞内结构域源自一种或多种细胞因子受体，所述一种或多种细胞因子受体选自由以下组成的组：IL2Rα、IL7Rα、IL9R-1、IL9R-2、IL9R-3、IL12Rβ1、IL12Rβ2、IL15Rα、IL15Rβ-1、IL15Rβ-2、IL15Rβ-3、IL18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL10R2、IL22R1、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、IL27Rα、gp130、IL31RA、OSMRβ、IL36R、IL1RAcP、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、或其变体及其组合。
41.如权利要求40所述的多肽，其中所述细胞因子受体胞内结构域选自IL-7Rα、IL12Rβ1、IL12Rβ2、IL15Rα、IL15Rβ-1、IL15Rβ-2、IL15Rβ-3、IL-18Rα、IL18Rβ、IL21R-1、IL21R-2、IL21R-3、IL23R-1、IL23R-2、IL23R-3、GM-CSFRα、GM-CSFRβ-1、GM-CSFRβ-2、IL9R-1、IL9R-2、IL9R-3、IL-7Rα-IL12Rβ1、IL-7Rα-IL15Rα、IL-7Rα-IL15Rβ-1、IL-7Rα-IL15Rβ-2、IL-7Rα-IL21R-1、IL-7Rα-IL21R-2、IL-7Rα-IL21R-3、IL-7Rα-IL23R-2、IL-7Rα-GMCSFRα、IL-7Rα-GM-CSFRβ-1、IL-7Rα-GM-CSFRβ-2、IL12Rβ1-IL15Rα、IL12Rβ1-IL15Rβ-1、IL12Rβ1-IL15Rβ-2、IL12Rβ1-IL-21R-1、IL12Rβ1-IL-21R-2、IL12Rβ1-IL-21R-3、IL12Rβ1-IL-23R-2、IL12Rβ1-GM-CSFRα、IL12Rβ1-GM-CSFRβ-1、IL12Rβ1-GM-CSFRβ-2、IL12Rβ2-IL15Rα、IL12Rβ2-IL15Rβ-1、IL12Rβ2-IL15Rβ-2、IL12Rβ2-IL-21R-1、IL12Rβ2-IL-21R-2、IL12Rβ2-IL-21R-3、IL12Rβ2-IL-23R-2、IL12Rβ2-GM-CSFRα、IL12Rβ2-GM-CSFRβ-1、IL12Rβ2-GM-CSFRβ-2、IL15Rα-IL-21R-1、IL15Rα-IL-21R-2、IL15Rα-IL-21R-3、IL15Rα-IL-23R-2、IL15Rα-GM-CSFRα、IL15Rα-GM-CSFRβ-1、IL15Rα-GM-CSFRβ-2、IL15Rβ-1-IL-21R-1、L15Rβ-1-IL-21R-2、IL15Rβ-1-IL-21R-3、IL15Rβ-1-IL-23R-2、IL15Rβ-1-GM-CSFRα、IL15Rβ-1-GM-CSFRβ-1、IL15Rβ-1-GM-CSFRβ-2、IL15Rβ-2-IL-21R-1、IL15Rβ-2-IL-21R-2、IL15Rβ-2-IL-21R-3、L15Rβ-2-IL-23R-2、IL15Rβ-2-GM-CSFRα、IL15Rβ-2-GM-CSFRβ-1、IL15Rβ-2-GM-CSFRβ-2、IL-21R-1-IL-23R-2、IL-21R-1-GM-CSFRα、IL-21R-1-GM-CSFRβ-1、IL-21R-1-GM-CSFRβ-2、IL-21R-2-IL-23R-2、IL-21R-2-GM-CSFRα、IL-21R-2-GM-CSFRβ-1、IL-21R-2-GM-CSFRβ-2、IL-21R-3-IL-23R-2、IL-21R-3-GM-CSFRα、IL-21R-3-GM-CSFRβ-1、IL-21R-3-GM-CSFRβ-2、IL-23R-2-GM-CSFRα、IL-23R-2-GM-CSFRβ-1、IL-23R-2-GM-CSFRβ-2、IL-7Rα-IL-9R-2、IL12Rβ1-IL-9R-2、IL12Rβ2-IL-9R-2、IL15Rα-IL-9R-2、IL15Rβ-1-IL-9R-2、IL15Rβ-2-IL-9R-2、IL-21R-1-IL-9R-2、IL-21R-2-IL-9R-2、IL-21R-3-IL-9R-2、IL-23R-2-IL-9R-2、GM-CSFRα-IL-9R-2、GM-CSFRβ-1-IL-9R-2、GM-CSFRβ-2-IL-9R-2、IL-7Rα-IL-12Rβ2、或其变体。
42.如权利要求41所述的多肽，其中所述细胞因子受体胞内结构域包含选自SEQ IDNO:8-28的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:8-28的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
43.如权利要求42所述的多肽，其中所述细胞因子受体胞内结构域包含SEQ ID NO:8、10、14-17或20-28中的一个或多个氨基酸序列。
44.如权利要求34至43中任一项所述的多肽，其中所述功能性外源受体是T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、嵌合TCR(cTCR)、或T细胞抗原偶联物(TAC)样嵌合受体。
45.如权利要求44所述的多肽，其中所述功能性外源受体是CAR，其中任选地，所述CAR是单CAR、双CAR、串联CAR或分离的CAR。
46.如权利要求45所述的多肽，其中所述CAR与肿瘤相关抗原结合，其中任选地，所述肿瘤相关抗原选自由以下组成的组：GPC3、AFP、密蛋白18.2、CD19、CD20、CD22、BCMA、GD2、DLL3、MSLN、CD30、CLL1和CD33。
47.如权利要求44所述的多肽，其中所述功能性外源受体是TCR。
48.如权利要求47所述的多肽，其中所述TCR与肿瘤相关抗原结合，其中优选地，所述肿瘤相关抗原选自由以下组成的组：GPC3、AFP、密蛋白18.2、CD19、CD20、CD22、BCMA、GD2、DLL3、MSLN、CD30、CLL1和CD33。
49.如权利要求34至48中任一项所述的多肽，其中所述第二跨膜结构域源自选自由CD8、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1组成的组的分子。
50.如权利要求49所述的多肽，其中所述第二跨膜结构域来自CD8α或CD28。
51.如权利要求34至50中任一项所述的多肽，其中所述胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。
52.如权利要求51所述的多肽，其中所述初级胞内信号传导结构域来自CD3ζ。
53.如权利要求34至52中任一项所述的多肽，其中所述胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。
54.如权利要求53所述的多肽，其中所述共刺激信号传导结构域源自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体及其组合。
55.如权利要求54所述的多肽，其中所述共刺激信号传导结构域包含CD28的胞内结构域和/或CD137的胞内结构域。
56.如权利要求34至55中任一项所述的多肽，其中所述功能性外源受体进一步包含位于所述胞外抗原结合结构域的C末端与所述跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。
57.如权利要求56所述的多肽，其中所述铰链结构域来自CD8α。
58.如权利要求34至57中任一项所述的多肽，其中所述嵌合细胞因子受体和/或所述功能性外源受体进一步包含信号肽。
59.如权利要求58所述的多肽，其中所述信号肽来自CD8α。
60.如权利要求34至59中任一项所述的多肽，其中所述嵌合细胞因子受体和所述功能性外源受体通过肽接头彼此连接。
61.如权利要求60所述的多肽，其中所述肽接头是自切割肽接头。
62.如权利要求61所述的多肽，其中所述自切割肽接头是2A自切割肽。
63.如权利要求62所述的多肽，其中所述2A自切割肽选自由F2A、E2A、P2A、T2A和其变体组成的组。
64.如权利要求45、46和49至63中任一项所述的多肽，其中所述CAR包含SEQ ID NO:29、135、141、143或149的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:29、135、141、143或149具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
65.如权利要求34至64中任一项所述的多肽，其中所述免疫效应细胞包含SEQ ID NO:30-134、136-140、142、144、146或148的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:30-134、136-140、142、144、146或148具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
66.如权利要求34至65中任一项所述的多肽，其中所述嵌合细胞因子受体进一步包含标签，和/或所述功能性外源受体进一步包含标签。
67.如权利要求66所述的多肽，其中与所述嵌合细胞因子受体连接的所述标签不同于与所述功能性外源受体连接的所述标签。
68.如权利要求66所述的多肽，其中所述标签包含SEQ ID NO:4、5或158-160的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO:4、5或158-160的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
69.一种分离的核酸，所述分离的核酸包含编码如权利要求34至68中任一项所述的多肽的核酸序列。
70.一种分离的核酸，所述分离的核酸包含：
(i)编码嵌合细胞因子受体的第一区，所述嵌合细胞因子受体包含：
(a)第一胞外抗原结合结构域，其中所述第一胞外抗原结合结构域源自NKG2D、截短的NKG2D、靶向NKG2D配体的抗体或其抗原结合片段、TIGIT或SIRP-α、或其变体，
(b)第一跨膜结构域，和
(c)细胞因子受体胞内结构域；以及
(ii)任选地编码功能性外源受体的第二区，所述功能性外源受体包含：
(a)第二胞外抗原结合结构域、
(b)第二跨膜结构域、和
(c)胞内信号传导结构域。
71.一种载体，所述载体包含如权利要求69或权利要求70所述的核酸。
72.一种制备免疫效应细胞的方法，所述方法包括向免疫细胞中引入：
(i)如权利要求69或权利要求70所述的核酸或如权利要求71所述的载体；或
(ii)包含编码嵌合细胞因子受体的第一核酸和编码功能性外源受体的第二核酸的组合物，所述嵌合细胞因子受体包含(a)第一胞外抗原结合结构域、(b)第一跨膜结构域和(c)细胞因子受体胞内结构域；所述功能性外源受体包含(a)第二胞外抗原结合结构域、(b)第二跨膜结构域和(c)胞内信号传导结构域。
73.一种如权利要求72所述的方法产生的免疫效应细胞。
74.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1至33和73中任一项所述的免疫效应细胞、如权利要求34至68中任一项所述的多肽、如权利要求69或权利要求70所述的核酸、或如权利要求71所述的载体，以及药学上可接受的载剂。
75.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求74所述的药物组合物。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症、炎症性疾病或自身免疫性疾病。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述癌症是实体癌或血液学癌症。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述癌症是肝癌、淋巴瘤、急性髓系白血病(AML)或慢性髓细胞性白血病(CML)。
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