CN117083067A - 工程化的免疫细胞及其用途 - Google Patents

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张望
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Abstract

本申请提供了被工程化以表达功能性外源受体如用肿瘤归巢肽装甲的CAR的免疫效应细胞。这些免疫效应细胞具有增强的肿瘤浸润和抗肿瘤功效。

Description

工程化的免疫细胞及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年4月2日提交的标题为“ENGINEERED IMMUNE CELLS AND USESTHEREOF[工程化的免疫细胞及其用途]”的国际申请号PCT/CN2021/085325的优先权，其内容通过援引以其全文并入本文。
序列声明
以下以ASCII文本文件提交的内容通过援引以其全文并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：761422003840SEQLIST.TXT，记录日期：2022年3月30日，大小：185,862字节)。
技术领域
本披露涉及用于治疗和相关应用的遗传工程化的免疫细胞。特别地，本披露涉及包含功能性外源受体和外源肿瘤归巢肽的免疫效应细胞及其用途。
背景技术
过继细胞疗法(也称为细胞免疫疗法)是一种使用免疫系统的细胞治疗疾病(例如消除癌症)的治疗方式。细胞免疫疗法可以不同的方式展开，如肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)疗法、工程化T细胞受体(TCR)疗法、嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法和自然杀伤(NK)细胞疗法。
嵌合抗原受体(CAR)是合成受体，这些合成受体识别其同源靶配体并诱导T细胞内在信号传导。尽管CAR-T已经在血液癌中取得了显著的进展，但各种障碍仍然限制着CAR-T在实体瘤中的应用。关键挑战包括肿瘤运输、向肿瘤的浸润、在肿瘤中的活化和持久性以及肿瘤异质性。参见，Rafiq S,Hackett CS,Brentjens RJ.Engineering strategies toovercome the current roadblocks in CAR T cell therapy.Nat Rev Clin Oncol.2020年3月；17(3):147-167.doi:10.1038/s41571-019-0297-y.Epub 2019年12月17日PMID:31848460；PMCID:PMC7223338。因此，迫切需要新的设计来应对这些关键挑战，以提高CAR-T或其他细胞疗法在实体瘤中的临床功效。
本文中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过援引以其全文并入，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确且单独地表明通过援引以其全文并入。在本申请的任何参考文献的引用或标识不应承认这样的参考文献可用作针对本披露的现有技术。
发明内容
在一些方面，本申请提供了免疫效应细胞，其表达：(a)功能性外源受体，和(b)外源肿瘤归巢肽(THP)。
在免疫效应细胞的一些实施例中，功能性外源受体选自由嵌合抗原受体(CAR)、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合TCR(cTCR)、T细胞抗原偶联物(TAC)、TAC样嵌合受体及它们的组合组成的组。在一些实施例中，功能性外源受体是CAR。在一些实施例中，功能性外源受体是TCR。在一些实施例中，功能性外源受体是cTCR。在一些实施例中，功能性外源受体是TAC。在一些实施例中，功能性外源受体是TAC样嵌合受体。
在免疫效应细胞的一些实施例中，功能性外源受体是CAR，并且其中该CAR包含：(i)胞外抗原结合结构域、(ii)跨膜结构域、和(iii)胞内信号传导结构域。在一些实施例中，跨膜结构域衍生自选自由以下组成的组的分子：CD7、CD8、CD8α、CD4、CD28、CD137(4-1BB)、CD80、CD86、CD152、FasL、TR2和PD1。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施例中，初级胞内信号传导结构域来自CD3ζ。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自共刺激分子，该共刺激分子选自由CD27、CD28、CD137(4-1BB)、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组。在一些实施例中，免疫效应细胞进一步包含位于胞外抗原结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域来自CD8或CD28。在一些实施例中，免疫效应细胞进一步包含位于胞外抗原结合结构域的N末端的信号肽。在一些实施例中，信号肽来自CD8或CD28。
在免疫效应细胞的一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。在一些实施例中，免疫效应细胞是T细胞。
在免疫效应细胞的一些实施例中，CAR是抗DLL3 CAR。在一些实施例中，抗DLL3CAR包含第一VHH抗体部分和第二VHH抗体部分，该第一VHH抗体部分包含：CDR1，该CDR1包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；CDR2，该CDR2包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；和CDR3，该CDR3包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；该第二VHH抗体部分包含：CDR1，该CDR1包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；CDR2，该CDR2包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；和CDR3，该CDR3包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体。在一些实施例中，抗DLL3 CAR包含第一VHH抗体部分和第二VHH抗体部分，该第一VHH抗体部分包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，该第二VHH抗体部分包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗DLL3 CAR包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在免疫效应细胞的一些实施例中，CAR是抗MSLN CAR。在一些实施例中，抗MSLNCAR包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列或与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在免疫效应细胞的一些实施例中，CAR是抗GPC2 CAR。在一些实施例中，抗GPC2CAR包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列或与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在免疫效应细胞的一些实施例中，CAR是多特异性的。
在免疫效应细胞的一些实施例中，THP选自由基于精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的肽、基于天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(NGR)的肽及它们的组合组成的组。在一些实施例中，THP包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的RGD-4C肽。在一些实施例中，THP包含具有SEQ IDNO:38的氨基酸序列的NGR肽。
在免疫效应细胞的一些实施例中，THP与跨膜结构域和/或铰链结构域融合。在一些实施例中，跨膜结构域和/或铰链结构域来自CD8、CD8α、CD7、CD80、CD28、TR2或FasL。在一些实施例中，跨膜结构域和/或铰链结构域来自CD7。在一些实施例中，跨膜结构域包含SEQID NO:14的氨基酸序列，并且铰链结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域和/或铰链结构域来自TR2。
在免疫效应细胞的一些实施例中，THP与TGF-β显性负受体(TGF-βDNR)融合。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含：i)SEQ ID NO:55的氨基酸序列或与SEQID NO:55的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；ii)SEQ ID NO:57的氨基酸序列或与SEQ ID NO:57的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；iii)SEQ ID NO:54的氨基酸序列或与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；iv)SEQ ID NO:56的氨基酸序列或与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；v)SEQ ID NO:58的氨基酸序列或与SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；vi)SEQID NO:53的氨基酸序列或与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；或vii)SEQ ID NO:52的氨基酸序列或与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在免疫效应细胞的一些实施例中，THP与标签序列融合。在一些实施例中，THP与肽接头融合。在一些实施例中，THP与标签序列和肽接头融合。在一些实施例中，标签序列是包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的Flag标签，肽接头是(G4S)3、(G4S)2或G4S接头。在一些实施例中，THP与糖基磷脂酰肌醇(GPI)融合。
在免疫效应细胞的一些实施例中，THP与胞内结构域融合。在一些实施例中，THP未与胞内结构域融合。
在免疫效应细胞的一些实施例中，功能性外源受体是cTCR。在一些实施例中，cTCR是抗DLL3 cTCR。在一些实施例中，抗DLL3 cTCR包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列或与SEQID NO:35的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗DLL3 cTCR包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列或与SEQ ID NO:36具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在免疫效应细胞的一些实施例中，免疫效应细胞包含具有SEQ ID NO:10、11、19、21-26、35-37、39-40、42、43、45、46、49、50和52-58中任一个所示的氨基酸序列的多肽。
在其他方面，本文提供了多肽，该多肽包含：(a)功能性外源受体，和(b)外源THP。
在多肽的一些实施例中，功能性外源受体选自由嵌合抗原受体(CAR)、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合TCR(cTCR)、T细胞抗原偶联物(TAC)、TAC样嵌合受体及它们的组合组成的组。在一些实施例中，功能性外源受体是CAR。在一些实施例中，功能性外源受体是TCR。在一些实施例中，功能性外源受体是cTCR。在一些实施例中，功能性外源受体是TAC。在一些实施例中，功能性外源受体是TAC样嵌合受体。
在一些实施例中，功能性外源受体是CAR，并且其中该CAR包含：(i)胞外抗原结合结构域、(ii)跨膜结构域、和(iii)胞内信号传导结构域。在一些实施例中，跨膜结构域衍生自选自由以下组成的组的分子：CD7、CD8、CD8α、CD4、CD28、CD137(4-1BB)、CD80、CD86、CD152、FasL、TR2和PD1。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施例中，初级胞内信号传导结构域来自CD3ζ。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自共刺激分子，该共刺激分子选自由CD27、CD28、CD137(4-1BB)、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组。在一些实施例中，多肽进一步包含位于胞外抗原结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域来自CD28或CD8。在一些实施例中，多肽进一步包含位于胞外抗原结合结构域的N末端的信号肽。在一些实施例中，信号肽来自CD28或CD8。
在多肽的一些实施例中，CAR是抗DLL3 CAR。在一些实施例中，抗DLL3 CAR包含第一VHH抗体部分和第二VHH抗体部分，该第一VHH抗体部分包含：CDR1，该CDR1包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；CDR2，该CDR2包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；和CDR3，该CDR3包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；该第二VHH抗体部分包含：CDR1，该CDR1包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；CDR2，该CDR2包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；和CDR3，该CDR3包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体。在一些实施例中，抗DLL3 CAR包含第一VHH抗体部分和第二VHH抗体部分，该第一VHH抗体部分包含SEQID NO:27的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，该第二VHH抗体部分包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗DLL3 CAR包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在多肽的一些实施例中，CAR是抗MSLN CAR。在一些实施例中，抗MSLN CAR包含SEQID NO:41的氨基酸序列或与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在多肽的一些实施例中，CAR是抗GPC2 CAR。在一些实施例中，抗GPC2 CAR包含SEQID NO:44的氨基酸序列或与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在多肽的一些实施例中，CAR是多特异性的。
在多肽的一些实施例中，外源THP选自由基于RGD的肽、基于NGR的肽及它们的组合组成的组。在一些实施例中，THP包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的RGD-4C肽。在一些实施例中，THP包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的NGR肽。
在多肽的一些实施例中，THP与跨膜结构域和/或铰链结构域融合。在一些实施例中，跨膜结构域和/或铰链结构域来自CD8、CD8α、CD7、CD80、CD28、TR2或FasL。在一些实施例中，跨膜结构域和/或铰链结构域来自CD7。在一些实施例中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，并且铰链结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域和/或铰链结构域来自TR2。
在多肽的一些实施例中，THP与TGF-βDNR融合。在一些实施例中，多肽包含：i)SEQID NO:55的氨基酸序列或与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；ii)SEQ ID NO:57的氨基酸序列或与SEQ ID NO:57的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；iii)SEQ ID NO:54的氨基酸序列或与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；iv)SEQ ID NO:56的氨基酸序列或与SEQ IDNO:56的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；v)SEQ ID NO:58的氨基酸序列或与SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；vi)SEQ ID NO:53的氨基酸序列或与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；或vii)SEQ ID NO:52的氨基酸序列或与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在多肽的一些实施例中，THP与标签序列融合。在一些实施例中，THP与肽接头融合。在一些实施例中，THP与标签序列和肽接头融合。在一些实施例中，标签序列是包含SEQID NO:3的氨基酸序列的Flag标签，肽接头是(G4S)3、(G4S)2或G4S接头。在一些实施例中，THP与糖基磷脂酰肌醇(GPI)融合。
在多肽的一些实施例中，THP与胞内结构域融合。在多肽的一些实施例中，THP未与胞内结构域融合。
在多肽的一些实施例中，多肽进一步包含功能性外源受体和THP之间的自切割肽。在一些实施例中，自切割肽是P2A。在一些实施例中，自切割肽是T2A。
在多肽的一些实施例中，功能性外源受体位于外源肿瘤归巢肽的N末端或C末端。在一些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:10、11、19、21-26、35、36、37、39-40、42、43、45、46、49、50和52-58中任一个所示的氨基酸序列。
在另外的方面，本文提供了分离的核酸，该分离的核酸包含编码如前述实施例中任一项所述的多肽的核酸序列。
在另一方面，本文提供了包含如前述实施例所述的分离的核酸的载体。
在其他方面，本文提供包含如前述实施例所述的载体的宿主细胞。
在更进一步的方面，本文提供了制造如前述实施例中任一项所述的免疫效应细胞的方法，该方法包括向免疫效应细胞中引入：(i)如前述实施例所述的核酸或如前述实施例所述的载体；或(ii)包含两种核酸的组合物，所述两种核酸各自编码：(a)功能性外源受体，和(b)外源THP。在一些实施例中，本文提供了根据如前述实施例所述的方法产生的免疫效应细胞。
在其他方面，本文提供了药物组合物，其包含如前述实施例中任一项所述的免疫效应细胞、如前述实施例中任一项所述的多肽、如前述实施例所述的核酸或如前述实施例所述的载体、以及药学上可接受的载剂。
在其他方面，本文提供了治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的如前述实施例所述的药物组合物。在一些实施例中，疾病或病症选自由癌症、感染性疾病、炎症性疾病、自身免疫性疾病及它们的组合组成的组。在一些实施例中，癌症是实体瘤癌症或血液学癌症。在一些实施例中，癌症是小细胞肺癌(SCLC)、卵巢癌(OC)或神经母细胞瘤(NBL)。
附图说明
以下详细说明可以结合附图得以最好地理解，该详细说明通过举例给出但不旨在将本披露仅限于所描述的特定实施例。
图1显示了膜结合RGD(mbRGD)和抗DLL3 CAR在T细胞上的表达；该mbRGD包含CD28的跨膜结构域或FasL的跨膜结构域；通过抗Flag染色和FACS检测mbRGD表达，并通过抗DLL3单域抗体(sdAb)染色和FACS确定CAR表达。
图2显示了mbRGD的不同组分对T细胞上的表达的影响：通过eGFP检测mbRGD表达，并通过抗DLL3 sdAb染色和FACS确定CAR表达。
图3显示了mbRGD和CAR在T细胞上的表达；mbRGD包含CD80的跨膜结构域；通过抗Flag染色和FACS检测mbRGD表达，并通过抗DLL3 sdAb染色和FACS确定CAR表达。
图4显示了mbRGD和CAR在T细胞上的表达；mbRGD包含CD7的跨膜结构域；通过抗Flag染色和FACS检测mbRGD表达，并通过抗DLL3 sdAb染色和FACS确定CAR表达。
图5A-5B显示了mbRGD装甲的DLL3-CAR-T细胞或常规DLL3-CAR-T细胞与HUVEC细胞的黏附的代表性图像(图5A)和定量(图5B)。
图6A-6B显示了mbRGD装甲的DLL3-CAR-T细胞或非装甲的DLL3-CAR-T细胞针对SHP77(图6A)或HUVEC(图6B)细胞的细胞溶解作用。
图7A-7B显示了与SHP77(图7A)或HUVEC(图7B)细胞共孵育的mbRGD装甲的DLL3-CAR-T细胞或非装甲的DLL3-CAR-T细胞的IFN-γ分泌。
图8A-8B显示了mbRGD装甲的DLL3-CAR-T细胞或常规DLL3-CAR-T细胞在异种移植小鼠模型中的抗肿瘤功效；肿瘤生长曲线(图8A)和外周血中的CAR-T扩增(图8B)。
图9A-9B显示了mbRGD装甲的DLL3-CAR-T细胞或常规DLL3-CAR-T细胞在异种移植小鼠模型中的肿瘤浸润。通过sdAb的IHC染色检测肿瘤浸润。显示的结果是来自每组3只小鼠的汇总结果。
图10A-10B显示了不同表达水平的mbRGD装甲的DLL3-CAR-T细胞或常规DLL3-CAR-T细胞与HUVEC细胞的黏附的代表性图像(图10A)和定量(图10B)。
图11显示了mbRGD和ε-T细胞受体融合构建体(TRuC)在T细胞上的表达；mbRGD是基于CD7的跨膜结构域；通过抗Flag染色和FACS检测mbRGD表达，并通过抗DLL3 sdAb染色和FACS确定ε-TRuC表达。
图12A-12B显示了mbRGD装甲的DLL3-ε-TRuC-T细胞或常规DLL3-ε-TRuC-T细胞与HUVEC细胞的黏附的代表性图像(图12A)和定量(图12B)。
图13A-13B显示了mbRGD装甲的DLL3-ε-TRuC-T细胞或非装甲的DLL3-ε-TRuC-T细胞针对SHP77(图13A)或HUVEC(图13B)细胞的细胞溶解作用。
图14A-14B显示了与SHP77(图14A)或HUVEC(图14B)细胞共孵育的mbRGD装甲的DLL3-ε-TRuC-T细胞或非装甲的DLL3-ε-TRuC-T细胞的IFN-γ分泌。
图15显示了mbNGR和DLL3-CAR在T细胞上的表达；mbNGR是基于CD7的跨膜结构域；通过抗Flag染色和FACS检测mbNGR表达，并通过抗sdAb染色和FACS确定CAR表达。
图16A-16B显示了mbNGR装甲的DLL3-CAR-T细胞或常规DLL3-CAR-T细胞与HUVEC细胞的黏附的代表性图像(图16A)和定量(图16B)。
图17A-17B显示了mbNGR装甲的DLL3-CAR-T细胞或非装甲的DLL3-CAR-T细胞针对SHP77(图17A)或HUVEC(图17B)细胞的细胞溶解作用。
图18A-18B显示了与SHP77(图18A)或HUVEC(图18B)细胞共孵育的mbNGR装甲的DLL3-CAR-T细胞或非装甲的DLL3-CAR-T细胞的IFN-γ分泌。
图19显示了mbNGR和MSLN-CAR在T细胞上的表达；mbNGR是基于CD7的跨膜结构域；通过抗Flag染色和FACS检测mbNGR表达，并通过抗sdAb染色和FACS确定CAR表达。
图20A-20B显示了mbNGR装甲的MSLN-CAR-T细胞或常规MSLN-CAR-T细胞与HUVEC细胞的黏附的代表性图像(图20A)和定量(图20B)。
图21A-21B显示了mbNGR装甲的MSLN-CAR-T细胞或非装甲的MSLN-CAR-T细胞针对OVCAR3(图21A)或HUVEC(图21B)细胞的细胞溶解作用。
图22A-22B显示了与OVCAR3(图22A)或HUVEC(图22B)细胞共孵育的mbNGR装甲的MSLN-CAR-T细胞或非装甲的MSLN-CAR-T细胞的IFN-γ分泌。
图23显示了mbNGR和GPC2-CAR在T细胞上的表达；mbNGR是基于CD7的跨膜结构域；通过抗Flag染色和FACS检测mbNGR表达，并通过抗sdAb染色和FACS确定CAR表达。
图24A-24B显示了mbNGR装甲的GPC2-CAR-T细胞或常规GPC2-CAR-T细胞与HUVEC细胞的黏附的代表性图像(图24A)和定量(图24B)。
图25A-25B显示了mbNGR装甲的GPC2-CAR-T细胞或非装甲的GPC2-CAR-T细胞针对SH-SY5Y(图25A)或HUVEC(图25B)细胞的细胞溶解作用。
图26A-26B显示了与SH-SY5Y(图26A)或HUVEC(图26B)细胞共孵育的mbNGR装甲的GPC2-CAR-T细胞或非装甲的GPC2-CAR-T细胞的IFN-γ分泌。
图27显示了RGD嵌入的CAR-T细胞和mbRGD装甲的CAR-T细胞上CAR的表达；CAR表达通过抗sdAb染色和FACS确定。
图28A-28B显示了RGD嵌入的CAR-T细胞、mbRGD装甲的CAR-T细胞或常规CAR-T细胞与HUVEC细胞的黏附的代表性图像(图28A)和定量(图28B)。
图29A-29B显示了RGD嵌入的CAR-T细胞、mbRGD装甲的CAR-T细胞或常规CAR-T细胞针对SHP-77细胞(图29A)或HUVEC细胞(图29B)的细胞溶解作用。
图30A-30B显示了与SHP-77(图30A)或HUVEC(图30B)细胞共孵育的RGD嵌入的CAR-T细胞、mbRGD装甲的CAR-T细胞或常规CAR-T细胞的IFN-γ分泌。
图31A-31C显示了DLL3-CAR/mbRGD/mbNGR/TGFβRⅡ在mbRGD(图31A)/mbNGR(图31B和31C)组合的TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞上的表达。CAR表达通过抗sdAb染色和FACS确定，mbRGD/mbNGR表达通过抗Flag染色和FACS检测，TGF-βDNR表达通过抗TGF-βRⅡ染色和FACS检测。
图32A-32F显示了mbRGD/mbNGR组合的TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞、mbRGD/mbNGR装甲的CAR-T细胞、TGFβDNR装甲的CAR-T细胞或常规CAR-T细胞与HUVEC细胞的黏附的代表性图像(图32A、32C、32E)和定量(图32B、32D、32F)。
图33A-33C显示了dnTGF-βRII在mbRGD(图33A)/mbNGR(图33B和33C)组合的TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞上的表达通过SMAD2阻止TGF-β信号诱导。
图34A-34F显示了mbRGD/mbNGR组合的TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞、mbRGD/mbNGR装甲的CAR-T细胞、TGFβDNR装甲的CAR-T细胞或常规CAR-T细胞针对SHP-77(图34A、34C和34E)或HUVEC(图34B、34D和34F)细胞的细胞溶解作用。
图35A-35F显示了与SHP-77(图35A、35C和35E)或HUVEC(图35B、35D和35F)细胞共孵育的mbRGD/mbNGR组合的TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞、mbRGD/mbNGR装甲的CAR-T细胞、TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞或常规CAR-T细胞的IFN-γ分泌。
图36显示了在异种移植小鼠模型中mbRGD/mbNGR组合的TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞或TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞的肿瘤浸润。肿瘤浸润通过抗sdAb的IHC染色检测。显示的结果是来自每组3只小鼠的汇总结果。
具体实施方式
本披露部分基于令人惊讶的发现，即用肿瘤归巢肽装甲CAR T细胞可以带来改进，例如增强T细胞对新脉管系统的黏附，并增加抗肿瘤功效。
1.定义
本文描述或参考的技术和程序包括本领域技术人员使用常规方法总体上很好地理解和/或通常采用的那些，例如像，在以下中描述的广泛使用的方法：Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版2001)；Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人编辑,2003)；Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic(An编辑2009)；Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols(Albitar编辑2010)；和Antibody Engineering第1卷和第2卷(Kontermann和Dübel编辑,第2版2010)。除非本文另外定义，否则，本发明中使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下对术语的描述，并且在任何适当的时候，以单数形式使用的术语也将包括复数，反之亦然。在所陈述的术语的任何描述与通过援引并入本文的任何文献冲突的情况下，应以下文所陈述的术语的描述为准。
本申请通篇提供的所有实施例都是非限制性实施例，这些实施例仅出于说明目的给出并且不旨在以任何方式限制本披露。可以组合在本申请的相同或不同方面/部分中讨论的不同技术特征、技术方案和/或实施例以形成新的特征、方案或实施例，这些新的特征、方案或实施例也落入本披露的范围内。
应当理解，在本文中任何地方用术语“包含”描述实施例，也提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似实施例。
术语“约”和“大约”意指在给定值或范围的20％内、15％内、10％内、9％内、8％内、7％内、6％内、5％内、4％内、3％内、2％内、1％内或更少。
“抗原”是抗体可以选择性结合的结构。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在的或合成的化合物。在一些实施例中，靶抗原是多肽。在某些实施例中，抗原与细胞相关，例如，存在于细胞上或细胞中。
术语“抗体”或“抗体部分”在本申请的上下文中是可以互换的，并且它们以其最广泛的含义使用，并且涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、全长抗体和其抗原结合片段，只要它们表现出所希望的抗原结合活性即可。这些术语包括常规的四链抗体和单域抗体，如仅有重链的抗体或其片段，例如VHH。
全长四链抗体包含两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区负责抗原结合。可以分别将重链和轻链的可变结构域称为“VH”和“VL”。两种链中的可变区通常含有三个高度可变的环，称为互补决定区(CDR)(包括LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的轻链(LC)CDR，包括HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的重链(HC)CDR)。可以通过Kabat、Chothia或Al-Lazikani的公约来定义或鉴定本文披露的抗体和抗原结合片段的CDR边界(Al-Lazikani,1997,J.Mol.Biol.,273:927-948；Chothia1985,J.Mol Biol.,186:651-663；Chothia 1987,J.Mol.Biol.,196:901-917；Chothia 1989,Nature,342:877-883；Kabat 1987,Sequencesof Proteins ofImmunological Interest,第四版.US Govt.Printing Off.No.165-492；Kabat 1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版NIHPublication No.91-3242)。重链或轻链的三个CDR位于称为框架区(FR)的侧翼段之间，该框架区比CDR更高度保守并形成支架以支持高变环。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现各种效应子功能。基于抗体重链恒定区的氨基酸序列来对其分类。抗体的五个主要类别或同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征分别是存在α、δ、ε、γ和μ重链。几个主要的抗体类别被分成亚类，如lgG1(γ1重链)、lgG2(γ2重链)、lgG3(γ3重链)、lgG4(γ4重链)、lgA1(α1重链)或lgA2(α2重链)。
术语“仅重链抗体”或“HCAb”是指功能性抗体，其包含重链，但缺乏通常在4链抗体中发现的轻链。已知骆驼科动物(如骆驼、美洲驼或羊驼)产生HCAb。
术语“单域抗体”或“sdAb”是指具有三个互补决定区(CDR)的单抗原结合多肽。单独的sdAb能够与抗原结合而不与相应的含有CDR的多肽配对。在一些情况下，单域抗体由骆驼科HCAb工程化而成，并且其重链可变结构域在本文中称为“VHH”(重链抗体的重链的可变结构域)。骆驼科sdAb是已知最小的抗原结合抗体片段之一(参见，例如，Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-8(1993)；Greenberg等人,Nature 374:168-73(1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人,Nanomedicine(Lond),8:1013-26(2013))。基本的VHH从N末端至C末端具有以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分别是指框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3是指互补决定区1至3。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，包括例如双抗体、Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链Fv(scFv)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或结合抗原但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够结合与亲本抗体或亲本抗体片段(例如亲本scFv)结合的抗原相同的抗原。在一些实施例中，抗原结合片段可以包含移植到来自一种或多种不同人抗体的框架区的来自特定人抗体的一个或多个CDR。
“Fv”是最小抗体片段，其含有完整的抗原识别位点和抗原结合位点。此片段由紧密非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。这两个结构域的折叠产生六个高变环(重链和轻链各有3个环)，其为抗原结合贡献氨基酸残基并赋予该抗体抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包含三个对抗原有特异性的CDR的半个Fv)就具有识别并结合抗原的能力，虽然通常以比完整结合位点更低的亲和力进行。
“单链Fv”(也缩写为“sFv”或“scFv”)是包含连接到单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。在一些实施例中，scFv多肽进一步包含在VH与VL结构域之间的多肽接头，该多肽接头能够使scFv形成抗原结合所希望的结构。关于scFv的综述，参见Plückthun于ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
术语“双抗体”是指通过以下方式来制备的小抗体片段：典型地用在VH与VL结构域之间的短接头(如约5至约10个残基)构建scFv片段(参见前述段落)，从而实现V结构域链间而非链内的配对，产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”scFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体更全面地描述于，例如，EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。
如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”旨在意指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定区域已由以下描述：Kabat等人,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences ofproteins of immunological interest”(1991)；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.等人,J.Mol.Biol.,273:927-948(1997)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Lefranc M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；和Honegger与Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)，其中定义包括氨基酸残基相互比较时的重叠或子集。然而，应用任一定义来指代抗体或移植抗体或其变体的CDR旨在落入如本文定义和使用的术语的范围内。作为比较，下表中列出了涵盖上述引用的每个参考文献所定义的CDR的氨基酸残基。CDR预测算法和接口是本领域已知的，包括，例如，Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Ehrenmann F.等人,Nucleic Acids Res.,38:D301-D307(2010)；和Adolf-Bryfogle J.等人,Nucleic Acids Res.,43:D432-D438(2015)。此段落中引用的参考文献内容通过援引以其全文并入本文，以用于在本披露中使用并可能包含在本文的一条或多条权利要求中。除非另外定义，否则本文提供的CDR序列基于Kabat定义。
CDR定义
1残基编号遵循Kabat等人,同上的命名法
2残基编号遵循Chothia等人,同上的命名法
3残基编号遵循MacCallum等人,同上的命名法
4残基编号遵循Lefranc等人,同上的命名法
5残基编号遵循Honegger和Plückthun,同上的命名法
“框架”或“FR”残基是除如本文定义的CDR残基之外的那些可变结构域残基。
“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗体是嵌合抗体，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。在一个实施例中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体HVR的残基被来自非人物种(供体抗体)(如具有所希望的特异性、亲和力和/或能力的小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物)的HVR的残基替代。在一些实例中，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含未在受体抗体中或供体抗体中发现的残基。这些修饰可以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个、并且典型地两个可变结构域中的基本上全部，其中全部或基本上全部的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地人类免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。有关进一步的细节，参见例如，Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还参见例如，Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；以及美国专利第6,982,321号及第7,087,409号。
“人抗体”是这样一种抗体，其具有对应于由人类产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列和/或已经使用如本文披露的任何用于制造人抗体的技术来产生。人抗体的此定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)产生人抗体。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581(1991)。也可用于制备人单克隆抗体的是在Cole等人,MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,77(1985)；Boerner等人,J.Immunol.147(1):86-95(1991)中描述的方法。另请参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)。人抗体可以通过将抗原施用至已被修饰以响应抗原攻击而产生这样的抗体但其内源基因座已失效的转基因动物(例如，已免疫的异种小鼠(xenomice))来制备(参见，例如，有关XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584)。关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，还参见例如Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:3557-3562(2006)。
如本文所用的，术语“结合”、“特异性结合”或“对……具有特异性”是指可测量和可再现的相互作用，如靶点与抗体之间的结合，其决定了在异质分子(包括生物分子)群存在时靶点的存在。例如，结合或特异性结合靶点(可以是表位)的抗体是与此靶点结合的抗体，其亲和力、亲合力(avidity)、就绪性和/或持续时间优于与其他靶点的结合。在一个实施例中，抗体与不相关靶点的结合程度小于例如通过放射免疫测定法(RIA)测量的抗体与靶点的结合的约10％。在某些实施例中，特异性结合靶点的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施例中，抗体特异性结合来自不同物种的蛋白质中保守的蛋白质表位。在另一实施例中，特异性结合可以包括但不要求排他性结合。
术语“特异性”是指抗原结合蛋白(如嵌合受体或抗体构建体)对抗原特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。如本文所用，术语“多特异性”表示抗原结合蛋白具有两个或更多个抗原结合位点，其中至少两个结合不同的抗原或表位。如本文所用，“双特异性”表示抗原结合蛋白具有两种不同的抗原结合特异性。如本文所用，术语“单特异性”表示具有一个或多个结合位点的抗原结合蛋白，每个结合位点结合相同的抗原或表位。
如本文所用，术语“功能性外源受体”是指在引入免疫效应细胞(诸如T细胞)后保留其生物活性的外源受体(例如TCR，诸如重组或工程化TCR、cTCR、T细胞抗原偶联物(TAC)、TAC样嵌合受体或CAR)。生物活性包括但不限于外源受体特异性结合分子、适当转导下游信号，诸如诱导细胞增殖、细胞因子产生和/或调节性或溶细胞效应子功能的执行的能力。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指含有结合部分的人工构建的杂合蛋白质或多肽(例如，抗体)，该结合部分与免疫细胞(例如，T细胞)信号传导或活化结构域连接。CAR可以是将T细胞重新靶向至肿瘤表面抗原的合成受体(Sadelain等人.,Nat.Rev.Cancer 3(l):35-45(2003)；Sadelain等人,Cancer Discovery3(4):388-398(2013))。CAR可以向免疫细胞(如T细胞)提供抗原结合和免疫细胞活化功能。CAR具有以非MHC限制的方式将T细胞特异性和反应性重定向至选择的靶点的能力(利用单克隆抗体的抗原结合特性)。非MHC限制的抗原识别可以给予表达CAR的T细胞识别抗原的能力(不依赖于抗原加工)，因此绕过了肿瘤逃逸的机制。“CAR-T细胞”是指表达CAR的T细胞。
如本文所用，“T细胞受体”或“TCR”是指包含胞外抗原结合结构域的内源或经修饰的T细胞受体，该胞外抗原结合结构域与MHC分子中结合的特异性抗原肽结合。在一些实施例中，TCR包含TCRα多肽链和TCRβ多肽链。在一些实施例中，TCR包含TCRγ多肽链和TCRδ多肽链。在一些实施例中，TCR特异性结合肿瘤抗原。“TCR-T”是指表达重组TCR的T细胞。
如本文所用，“T细胞抗原偶联物受体”或“TAC受体”是指包含与特异性抗原结合的胞外抗原结合结构域和T细胞受体(TCR)结合结构域、跨膜结构域及共受体分子的胞内结构域的工程化受体。TAC受体指定表达TAC受体的T细胞的内源TCR以引发针对靶细胞的抗原特异性T细胞应答。
如本文所用，术语“重组或工程化TCR”作为本文提供的一种功能性外源受体包括在内，并且是指在免疫细胞中表达的肽。重组或工程化TCR的功能可以包括例如重定向免疫细胞针对所需类型细胞的免疫活性，这些细胞诸如表面具有特定标记的癌症细胞和感染细胞。它可以替代内源TCR或与内源TCR共表达。在一些实施例中，这样的重组TCR是包含开放阅读框的单链TCR，其中可变Vα和Vβ结构域与蛋白质接头配对。这涉及到已知对所选择的抗原具有特异性的TCR基因的分子克隆。然后通常通过逆转录病毒载体将这些链引入T细胞。因此，克隆的TCRα和TCRβ基因的表达赋予转导的T细胞由这些新基因的配对确定的功能特异性。重组或工程化TCR的组分是TCR的任何功能亚基，如重组TCRα和TCRβ，由引入细胞中的外源多核苷酸序列编码。
如本文所用，“嵌合T细胞受体”或“cTCR”是指包含与特定抗原结合的胞外抗原结合结构域、TCR复合物的第一亚基的跨膜结构域或其部分和TCR复合物的第二亚基的胞内信号传导结构域或其部分的工程化受体，其中该TCR复合物的第一或第二亚基是TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ε、CD3δ或CD3γ。cTCR的跨膜结构域和胞内信号传导结构域可以衍生自TCR复合物的相同亚基或TCR复合物的不同亚基。胞内结构域可以是全长胞内信号传导结构域或天然存在的TCR亚基的胞内结构域的一部分。在一些实施例中，cTCR包含TCR亚基的胞外结构域或其部分。在一些实施例中，cTCR不包含TCR亚基的胞外结构域。与“ε-TRuC”互换使用的“εTCR”是指包含CD3ε胞外结构域的cTCR。
在一些实施例中，本文提供的功能性外源受体是cTCR，其同时具有抗原结合功能和T细胞活化功能。例如，cTCR可以包含：(a)胞外配体结合结构域，该胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如，DLL3)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如，sdAb、scFv)；(b)任选的接头；(c)第一TCR亚基(例如，CD3ε)的任选的胞外结构域或其部分；(d)包含第二TCR亚基(例如，CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(e)包含第三TCR亚基(例如，CD3ε)的胞内信号传导结构域的胞内信号传导结构域；其中第一、第二和第三TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施例中，第一、第二和第三TCR亚基是相同的(例如，全都是CD3ε)。在一些实施例中，第一、第二和第三TCR亚基是不同的。在一些实施例中，cTCR进一步包含位于胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域衍生自CD8α。在一些实施例中，cTCR进一步包含位于cTCR的N末端处的信号肽，诸如衍生自CD8α的信号肽。
在一些实施例中，功能性外源受体是T细胞抗原偶联物(TAC)，例如，包含：(a)胞外配体结合结构域，该胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如，DLL3)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如，sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别TCR亚基(例如，CD3ε)的胞外结构域的胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第一TCR共受体(例如，CD4)的任选的胞外结构域或其部分；(f)包含第二TCR共受体(例如，CD4)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)包含第三TCR共受体(例如，CD4)的胞内信号传导结构域的任选的胞内信号传导结构域；其中该TCR亚基选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组；并且其中第一、第二和第三TCR共受体全都选自由CD4、CD8和CD28组成的组。在一些实施例中，第一、第二和第三TCR共受体是相同的。在一些实施例中，第一、第二和第三TCR共受体是不同的。在一些实施例中，TAC进一步包含位于胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域衍生自CD8α。在一些实施例中，TAC进一步包含位于TAC的N末端处的信号肽，诸如衍生自CD8α的信号肽。在一些实施例中，胞外配体结合结构域在胞外TCR结合结构域的N末端处。在一些实施例中，胞外配体结合结构域在胞外TCR结合结构域的C末端处。
在一些实施例中，功能性外源受体是TAC样嵌合受体，例如，包含：(a)胞外配体结合结构域，该胞外配体结合结构域包含特异性识别肿瘤抗原(例如，DLL3)的一个或多个表位的抗原结合片段(例如，sdAb、scFv)；(b)任选的第一接头；(c)特异性识别第一TCR亚基(例如，TCRα)的胞外结构域的胞外TCR结合结构域；(d)任选的第二接头；(e)第二TCR亚基(例如，CD3ε)的任选的胞外结构域或其部分；(f)包含第三TCR亚基(例如，CD3ε)的跨膜结构域的跨膜结构域；以及(g)包含第四TCR亚基(例如，CD3ε)的胞内信号传导结构域的任选的胞内信号传导结构域；其中第一、第二、第三和第四TCR亚基全都选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组。在一些实施例中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施例中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是相同的。在一些实施例中，第一、第二、第三和第四TCR亚基是不同的。在一些实施例中，第二、第三和第四TCR亚基是相同的，但不同于第一TCR亚基。在一些实施例中，胞外配体结合结构域在胞外TCR结合结构域的N末端处。在一些实施例中，胞外配体结合结构域在胞外TCR结合结构域的C末端处。在一些实施例中，TAC样嵌合受体进一步包含位于胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域衍生自CD8α。在一些实施例中，TAC样嵌合受体进一步包含位于TAC样嵌合受体的N末端处的信号肽，诸如衍生自CD8α的信号肽。
“肿瘤归巢肽(THP)”是一种可能通过肿瘤血管上表达的特定配体特异性靶向肿瘤基质(特别是肿瘤脉管系统)的肽。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽和天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(NGR)肽是两种众所周知的THP。出于本申请的目的，“肿瘤归巢肽”是指任何具有“归巢”至肿瘤脉管系统或肿瘤基质的功能的肽。
关于多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并且引入空位(如果需要的话)以实现最大序列同一性百分比之后，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分，候选序列中氨基酸残基与特定的多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。可根据所属领域技能内的多种方式，例如，使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件，实现比对，以确定氨基酸序列同一性百分比。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括需要在被比较序列的全长范围实现最大比对的任何算法。例如，考虑了与本文所述的特定多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％同一性并且优选地表现出基本相同功能的多肽，以及编码这样的多肽的多核苷酸。
术语“多肽”和“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已被天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，形成二硫键、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵或修饰。该定义还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括但不限于非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。应当理解，由于本披露的多肽可以基于抗体或免疫球蛋白超家族的其他成员，因此在某些实施例中，“多肽”可以作为单链或作为两条或更多条相关链存在。
如在本文中可互换使用的，“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸及其类似物。如本文所用，“寡核苷酸”是指短的、通常单链的、合成的多核苷酸，其长度通常(但不一定)小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。
“分离的核酸”是这样的核酸(例如RNA、DNA或混合核酸)：其基本上与天然伴随天然序列的其他基因组DNA序列以及蛋白或复合物诸如核糖体和聚合酶分离。此外，“分离的”核酸分子，诸如cDNA分子，当通过重组技术产生时，可以基本上不含其他细胞物质或培养基，或者当化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学物质。该术语包括已从其天然存在的环境中去除的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或由异源系统生物合成的类似物。
术语“表达”是指核酸翻译成蛋白质。蛋白质可以被表达并保留在胞内，成为细胞表面膜的组分，或被分泌到胞外基质或培养基中。
如本文所用，术语“外源性”旨在意指将参考分子或其他材料引入或非天然地引入细胞、组织、生物体或系统中。例如，可通过将编码核酸引入宿主遗传材料(如通过整合到宿主染色体中)或作为非染色体遗传材料(如质粒)引入分子。
例如，在多肽与另一多肽融合的上下文中，术语“与...融合(fuse with或fusedwith)”意指两个实体通过肽键或通过肽接头连接。对于核酸融合也是类似的。例如，如果RGD-4C序列与铰链结构域融合，则它们可以通过肽键直接连接，或者可以有其他一个或多个肽在它们之间并连接它们，例如标签序列和/或(GxS)n接头，其中x和n可以独立地是1与20之间、优选3与12之间的整数，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或更大。
如本文所用，术语“可操作地连接的”和类似短语(例如，遗传融合的)，当用于指核酸或氨基酸时，分别是指核酸序列或氨基酸序列的可操作连接，它们彼此处于功能关系。例如，可操作地连接的启动子、增强子元件、开放阅读框、5'和3'UTR以及终止子序列引起核酸分子(例如RNA)的准确产生。在一些实施例中，可操作地连接的核酸元件导致开放阅读框的转录并最终导致多肽的产生(即，开放阅读框的表达)。作为另一个实例，可操作地连接的肽是其中功能结构域以适当距离彼此放置以赋予每个结构域的预期功能的肽。
术语“载体”是指用于携带或包括核酸序列，包括例如编码如本文所述的结合分子(例如，抗体)的核酸序列，以将核酸序列引入至宿主细胞中的物质。适用的载体包括例如表达载体、质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，其可以包括选择序列或可稳定整合入宿主细胞染色体的标记。表达控制序列可以包括本领域熟知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当两个或更多个核酸分子待共表达时(例如抗体重链和轻链或抗体VH和VL)，可以将两个核酸分子插入，例如，单个表达载体或单独的表达载体中。对于单一载体表达，编码核酸可以可操作地连接至一种共同的表达控制序列或连接至不同的表达控制序列，比如一种诱导型启动子和一种组成型启动子。可以使用本领域熟知的方法来确认将核酸分子引入宿主细胞。这样的方法包括例如核酸分析，诸如mRNA的RNA印迹或聚合酶链式反应(PCR)扩增、用于基因产物表达的免疫印迹或测试引入的核酸序列或其相应基因产物表达的其他合适的分析方法。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以用核酸分子转染的特定目标细胞以及这样的细胞的子代或潜在子代。由于后续世代中可能发生的突变或环境影响或核酸分子整合到宿主细胞基因组中，这样的细胞的子代可能与用该核酸分子转染的亲本细胞不同。
如本文所用，术语“自体的”意在指衍生自同一个体的任何材料，其中该材料随后被重新引入该个体。
“同种异体的”是指衍生自相同物种的不同个体的移植物。
如本文所用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代目标细胞及其子代。
如本文所用，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的监管机构批准，或在美国药典、欧洲药典或其他公认的药典中列出用于动物，并且更特别地用于人。
“赋形剂”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂或包封材料。在一个实施例中，每种组分在与药物配制品的其他成分相容的意义上是“药学上可接受的”，并且适用于与人和动物的组织或器官接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂在所采用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。药学上可接受的载剂或赋形剂优选地满足毒理学和制造测试的要求标准和/或包括在美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)编制的Inactive IngredientGuide中。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以产生所需结果的工程化免疫效应细胞或包含药剂和本文提供的工程化免疫效应细胞或药物组合物的治疗分子的量。
术语“受试者”和“患者”可互换使用。如本文所用，在某些实施例中，受试者是哺乳动物，诸如非灵长类动物或灵长类动物(例如，人)。在特定实施例中，受试者是人。在一个实施例中，受试者是被诊断患有疾病或病症的哺乳动物，例如人。在另一实施例中，受试者是处于发展疾病或病症的风险中的哺乳动物，例如人。
“施用(Administer或administration)”是指将存在于体外的物质注射或以其他方式物理递送到患者体内的行为，例如通过粘膜、皮内、静脉内、肌内递送和/或本文所述或本领域已知的任何其他物理递送方法。
如本文所用，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或改善由施用一种或多种疗法引起的疾病或病状的进展、严重程度和/或持续时间。治疗可以通过评估与潜在病症相关的一种或多种症状是否已经减少、缓解和/或减轻来确定，使得观察到患者的改善，尽管患者可能仍然患有潜在病症。术语“治疗”包括控制和改善疾病。术语“控制(manage、managing、和management)”是指受试者从不一定导致疾病治愈的疗法中获得的有益效果。
2.工程化免疫效应细胞
本披露的一方面提供了遗传工程化的免疫效应细胞，其包含一种或多种功能性外源工程化受体(例如CAR、TCR、cTCR、TAC受体或TAC样嵌合受体)和肿瘤归巢肽(“THP”；例如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽或天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(NGR)肽)。在一些实施例中，THP是RGD肽。在一些实施例中，THP是NGR肽。在一些实施例中，工程化受体包含特异性结合抗原(例如，肿瘤抗原)的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含初级胞内信号传导结构域和/或共刺激结构域。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含TCR共受体的胞内信号传导结构域。在一些实施例中，工程化受体由可操作地连接至启动子(如组成型启动子或诱导型启动子)的异源核酸编码。工程化受体可增强经修饰的治疗细胞的功能，如通过靶向经修饰的治疗细胞(例如，经修饰的免疫细胞)、通过转导信号、和/或通过增强经修饰的治疗细胞(例如，经修饰的免疫细胞)的细胞毒性。
肿瘤归巢肽可以被视为工程化受体的装甲，使得如装甲CAR的装甲工程化受体与没有装甲的工程化受体相比具有增强的特性。THP优选是膜结合的。增强的特性包括如增加的向肿瘤的运输和浸润，以及增加的细胞毒性功效。
简言之，本披露中的THP不是CAR本身的一部分，也不是任何其他功能性外源受体的一部分，即CAR的组成部分之内不包含肿瘤归巢肽。功能性外源受体和肿瘤归巢肽可以由两种或更多种不同的核酸表达，或者替代性地，它们可以由一种单一核酸表达。在后一种情况下，THP仍然不在CAR的组成部分之内；且优选地，所得的一种单一多肽随后被切割以产生两种单独的实体，即功能性外源受体和THP。不受任何理论的束缚，但是在CAR的组成部分之内包括THP的方法可能会产生比期望的更多的细胞毒性，并且它还可能与其他副作用相关，例如影响CAR-T细胞针对靶细胞或内皮细胞的细胞毒性。
另外，根据本披露的THP被遗传工程化至免疫效应细胞，例如通过在细胞膜上表达编码THP的核酸，而不是通过使用化学方法，例如通过化学偶联物将THP化学缀合或化学附接至细胞。不受任何理论的束缚，除其他缺点之外，将THP分子化学附接着至细胞(例如细胞表面)增加了治疗性细胞制造的复杂性。
实体瘤的CAR-T疗法中的主要障碍之一是CAR-T向肿瘤的运输的缺乏。异常的血管生长和功能是癌症的标志，非粘附性和异常的肿瘤血管导致肿瘤浸润不良。肿瘤脉管系统的常见特征，诸如曲折性、渗漏性和缺乏适当的周细胞覆盖，有助于肿瘤进展(Potente M,Gerhardt H,Carmeliet P.Basic and therapeutic aspects ofangiogenesis.Cell.2011年9月16日；146(6):873-87.doi:10.1016/j.cell.2011.08.039.PMID:21925313)。此外，来自新脉管系统的内皮细胞很少表达白细胞黏附分子，例如胞内黏附分子1/2(ICAM-1/2)(Griffioen AW,Damen CA,Martinotti S,Blijham GH,Groenewegen G.Endothelial intercellular adhesion molecule-1expression is suppressed in human malignancies:the role of angiogenicfactors.Cancer Res.1996年3月1日；56(5):1111-17.PMID:8640769)和血管细胞黏附分子1(VCAM-1)(Piali L,Fichtel A,Terpe HJ,Imhof BA,Gisler RH.Endothelial vascularcell adhesion molecule 1expression is suppressed by melanoma and carcinoma.JExp Med.1995年2月1日；181(2):811-6.doi:10.1084/jem.181.2.811.PMID:7530765；PMCID:PMC2191895)，其表型在各种类型癌症中也被称为内皮细胞无反应性(Zhang J,Endres S,Kobold S.Enhancing tumor T cell infiltration to enable cancer immunotherapy.Immunotherapy.2019年2月；11(3):201-213.doi:10.2217/imt-2018-0111.PMID:30730277)。所有这些因素使得T细胞难以运输和浸润到肿瘤中。
为了解决上述和其他问题，在本披露中，利用THP来引导T细胞归巢至肿瘤新脉管系统，例如，以增强T细胞向肿瘤的浸润，从而提高CAR-T对实体瘤的临床功效。特别地，膜结合形式的RGD肽(mbRGD)和NGR(mbNGR)被用来引导T细胞归巢至肿瘤。mbRGD包含胞外RGD结构域，优选跨膜区和铰链结构域，具有或不具有胞内结构域。mbNGR包含胞外NGR结构域，优选跨膜区和铰链结构域，具有或不具有胞内结构域。对T细胞进行遗传工程化后，mbRGD和mbNGR可以提高T细胞对肿瘤新脉管系统的黏附。此外，mbRGD和mbNGR装甲的CAR-T细胞在体外和体内均表现出增强的抗肿瘤功效。
根据本披露的一方面，提供了表达(a)功能性外源受体和(b)外源肿瘤归巢THP的工程化免疫效应细胞。
这样的工程化免疫效应细胞可以通过使用任何适当的分子克隆和遗传工程方法和手段来生成。例如，可以通过将编码两种组分(即功能性外源受体和THP)的一种或多种核酸引入免疫效应细胞来生成工程化免疫效应细胞。所述两种组分可以被翻译为一种多肽，或者替代性地，它们可以被翻译为两种多肽。
因此，本披露的一方面提供了组合物，其包含(a)功能性外源受体，和(b)外源THP；或编码功能性外源受体和THP的一种或多种核酸。
在一些实施例中，组合物包含功能性外源受体和THP。在一些实施例中，组合物包含一种多肽或由该一种多肽组成，该多肽包含功能性外源受体和THP。在一些实施例中，多肽包含功能性外源受体和THP之间的自切割肽接头。在一些实施例中，组合物包含两种多肽或由该两种多肽组成，该两种多肽各自分别包含功能性外源受体和THP。
在一些实施例中，组合物包含一种或多种(例如一种或两种)核酸，该核酸编码功能性外源受体和THP。在一些实施例中，组合物包含一种核酸，该核酸编码功能性外源受体和THP。在一些实施例中，组合物包含两种核酸，该两种核酸各自分别编码功能性外源受体和THP。
在一些实施例中，功能性外源受体选自由嵌合抗原受体(CAR)、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合TCR(cTCR)、T细胞抗原偶联物(TAC)、TAC样嵌合受体及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，功能性外源受体是CAR，并且其中该CAR包含：(i)胞外抗原结合结构域、(ii)跨膜结构域、和(iii)胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，跨膜结构域衍生自选自由以下组成的组的分子：CD7、CD8、CD8α、CD4、CD28、CD137(4-1BB)、CD80、CD86、CD152、FasL、TR2和PD1。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施例中，初级胞内信号传导结构域来自CD3ζ。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自共刺激分子，该共刺激分子选自由CD27、CD28、CD137(4-1BB)、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域来自CD8。在一些实施例中，铰链结构域来自CD7。在一些实施例中，铰链结构域来自CD28。
在一些实施例中，CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的N末端的信号肽。在一些实施例中，信号肽来自CD8。
在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。在一些实施例中，免疫效应细胞是T细胞。
在一些实施例中，CAR是抗DLL3、抗MSLN CAR或抗GPC2 CAR。
在一些实施例中，CAR是抗DLL3 CAR。在一些实施例中，抗DLL3 CAR包含第一VHH抗体部分和第二VHH抗体部分，该第一VHH抗体部分包含：CDR1，该CDR1包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；CDR2，该CDR2包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；和CDR3，该CDR3包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；该第二VHH抗体部分包含：CDR1，该CDR1包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；CDR2，该CDR2包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；和CDR3，该CDR3包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体。
在一些实施例中，抗DLL3 CAR包含第一VHH抗体部分和第二VHH抗体部分，该第一VHH抗体部分包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，该第二VHH抗体部分包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗DLL3 CAR包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，CAR是抗MSLN CAR。在一些实施例中，抗MSLN CAR包含SEQ IDNO:41的氨基酸序列或与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，CAR是抗GPC2 CAR。在一些实施例中，抗GPC2 CAR包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列或与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，CAR是多特异性CAR。在一些实施例中，CAR是双特异性CAR。
在一些实施例中，外源THP选自由基于RGD的肽、基于NGR的肽及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，THP包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的RGD-4C肽。在一些实施例中，THP包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的RGD-4C肽。在一些实施例中，THP包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的NGR肽。在一些实施例中，THP包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的NGR肽。
在一些实施例中，THP与跨膜结构域或铰链结构域融合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域融合。在一些实施例中，THP与铰链结构域融合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域和铰链结构域融合。在一些实施例中，跨膜结构域来自CD7、CD8、CD8α、CD80、CD28、TR2或FasL。在一些实施例中，铰链结构域来自CD7、CD8、CD8α、CD80、CD28、TR2或FasL。在一些实施例中，跨膜结构域来自CD7。在一些实施例中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施例中，铰链结构域来自CD7。在一些实施例中，铰链结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，并且铰链结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域来自CD28。在一些实施例中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施例中，铰链结构域来自CD28。在一些实施例中，铰链结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且铰链结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域来自CD8α。在一些实施例中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在一些实施例中，铰链结构域来自CD8α。在一些实施例中，铰链结构域包含SEQ IDNO:47的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，并且铰链结构域包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。
在一些实施例中，THP与TGF-β融合。在一些实施例中，THP直接与TGF-β融合。在一些实施例中，THP间接与TGF-β融合。在一些实施例中，TGF-β是TGF-β显性负受体(TGF-βDNR，例如dnTGF-βRII)。
在一些实施例中，THP与标签序列或肽接头融合。在一些实施例中，THP与标签序列融合。在一些实施例中，标签序列是Flag标签，该Flag标签包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施例中，THP与肽接头融合。在一些实施例中，肽接头是G4S接头。在一些实施例中，肽接头是(G4S)2接头。在一些实施例中，肽接头是(G4S)3接头。在一些实施例中，THP与标签序列和肽接头融合。在一些实施例中，标签序列是包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的Flag标签，肽接头是(G4S)3接头。在一些实施例中，THP与膜锚定序列融合。在一些实施例中，膜锚定序列是锚定糖基磷脂酰肌醇(GPI)的肽序列。在一些实施例中，锚定GPI的肽序列附接至GPI接头。
在一些实施例中，THP未与胞内结构域融合。在一些实施例中，THP与胞内结构域融合。
在一些实施例中，免疫效应细胞包含具有SEQ ID NO:10、11、19、21-26、35-37、39-40、42、43、45、46、49、50和52-58中任一个所示的氨基酸序列的氨基酸。
在一些实施例中，提供了包含功能性外源受体和外源THP的免疫效应细胞。在一些实施例中，功能性外源受体选自由CAR、TCR、cTCR、TAC、TAC样嵌合受体及它们的组合组成的组。在一些实施例中，功能性外源受体是多特异性外源受体。在一些实施例中，功能性外源受体特异性结合DLL3、MSLN、GPC2或其组合。在一些实施例中，THP是基于RGD的THP、基于NGR的THP或其组合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域融合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域和铰链结构域融合。在一些实施例中，THP与标签序列、肽接头和/或膜锚定序列融合。在一些实施例中，THP任选地通过肽接头与TGF-β显性负受体(TGF-βDNR，例如dnTGF-βRII)融合。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗DLL3功能性外源受体和外源RGD的免疫效应细胞，其中该免疫效应细胞包含多肽，该多肽从N末端到C末端包含：RGD-4C(SEQ ID NO:2)、(G4S)3接头、抗DLL3单域抗体(sdAb)、来自CD8α的铰链结构域(SEQ ID NO:47)和跨膜结构域(SEQ ID NO:48)、4-1BB和来自CD3ζ的胞内信号传导结构域。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:49具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％、或99％中的任一个)序列同一性的其变体。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗DLL3功能性外源受体和外源RGD的免疫效应细胞，其中该免疫效应细胞包含多肽，该多肽从N末端到C末端包含：抗DLL3 sdAb、(G4S)3接头、RGD-4C(SEQ ID NO:2)、来自CD8α的铰链结构域(SEQ ID NO:47)和跨膜结构域(SEQ ID NO:48)、4-1BB和来自CD3ζ的胞内信号传导结构域。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:50具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％、或99％中的任一个)序列同一性的其变体。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含CAR和外源THP的免疫效应细胞，该CAR包含：(i)胞外抗原结合结构域、(ii)跨膜结构域、和(iii)胞内信号传导结构域。在一些实施例中，CAR是多特异性CAR。在一些实施例中，CAR是抗DLL3 CAR、抗MSLN CAR或抗GPC2 CAR。在一些实施例中，CAR的胞外抗原结合结构域包含串联VHH抗体部分。在一些实施例中，CAR的跨膜结构域衍生自选自由以下组成的组的分子：CD7、CD8、CD8α、CD4、CD28、CD137(4-1BB)、CD80、CD86、CD152、FasL、TR2和PD1。在一些实施例中，CAR的跨膜结构域衍生自CD7。在一些实施例中，CAR的跨膜结构域衍生自CD8。在一些实施例中，CAR的跨膜结构域衍生自TR2。在一些实施例中，CAR的胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施例中，CAR的胞内信号传导结构域来自CD3ζ。在一些实施例中，CAR的胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自共刺激分子，该共刺激分子选自由CD27、CD28、CD137(4-1BB)、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组。在一些实施例中，CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域来自CD8。在一些实施例中，CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的N末端的信号肽。在一些实施例中，信号肽来自CD8。在一些实施例中，THP是基于RGD的THP、基于NGR的THP或其组合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域融合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域和铰链结构域融合。在一些实施例中，THP与标签序列、肽接头和/或膜锚定序列融合。在一些实施例中，THP任选地通过肽接头与TGF-β显性负受体(TGF-βDNR，例如dnTGF-βRII)融合。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含CAR和与锚定GPI的肽序列融合的膜结合THP的免疫效应细胞。在一些实施例中，CAR是多特异性CAR。在一些实施例中，CAR是抗DLL3 CAR、抗MSLN CAR或抗GPC2 CAR。在一些实施例中，THP是基于RGD的THP、基于NGR的THP或其组合。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗DLL3 CAR和外源THP的免疫效应细胞，该抗DLL3CAR包含：(i)胞外DLL3结合结构域、(ii)跨膜结构域、和(iii)胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞外抗原结合结构域包含串联VHH抗体部分。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的跨膜结构域衍生自选自由以下组成的组的分子：CD7、CD8、CD8α、CD4、CD28、CD137(4-1BB)、CD80、CD86、CD152、FasL、TR2和PD1。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的跨膜结构域衍生自CD7。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的跨膜结构域衍生自CD8。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的跨膜结构域衍生自TR2。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞内信号传导结构域来自CD3ζ。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自共刺激分子，该共刺激分子选自由CD27、CD28、CD137(4-1BB)、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组。在一些实施例中，抗DLL3 CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域来自CD8。在一些实施例中，抗DLL3 CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的N末端的信号肽。在一些实施例中，信号肽来自CD8。在一些实施例中，THP是基于RGD的THP、基于NGR的THP或其组合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域融合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域和铰链结构域融合。在一些实施例中，THP与标签序列、肽接头和/或膜锚定序列融合。在一些实施例中，THP任选地通过肽接头与TGF-β显性负受体(TGF-βDNR，例如dnTGF-βRII)融合。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗DLL3 CAR和外源THP的免疫效应细胞，该抗DLL3CAR包含：(i)胞外DLL3结合结构域、(ii)CD7跨膜结构域、和(iii)胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞外抗原结合结构域包含串联VHH抗体部分。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞内信号传导结构域来自CD3ζ。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自共刺激分子，该共刺激分子选自由CD27、CD28、CD137(4-1BB)、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组。在一些实施例中，THP是基于RGD的THP、基于NGR的THP或其组合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域融合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域和铰链结构域融合。在一些实施例中，THP与标签序列、肽接头和/或膜锚定序列融合。在一些实施例中，THP任选地通过肽接头与TGF-β显性负受体(TGF-βDNR，例如dnTGF-βRII)融合。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗DLL3 CAR和外源THP的免疫效应细胞，该抗DLL3CAR包含：(i)胞外DLL3结合结构域、(ii)TR2跨膜结构域、和(iii)胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞外抗原结合结构域包含串联VHH抗体部分。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞内信号传导结构域来自CD3ζ。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自共刺激分子，该共刺激分子选自由CD27、CD28、CD137(4-1BB)、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组。在一些实施例中，THP是基于RGD的THP、基于NGR的THP或其组合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域融合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域和铰链结构域融合。在一些实施例中，THP与标签序列、肽接头和/或膜锚定序列融合。在一些实施例中，THP任选地通过肽接头与TGF-β显性负受体(TGF-βDNR，例如dnTGF-βRII)融合。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗DLL3 CAR和外源THP的免疫效应细胞，该抗DLL3CAR包含：(i)胞外DLL3结合结构域、(ii)CD8跨膜结构域、和(iii)胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞外抗原结合结构域包含串联VHH抗体部分。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞内信号传导结构域来自CD3ζ。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自共刺激分子，该共刺激分子选自由CD27、CD28、CD137(4-1BB)、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组。在一些实施例中，THP是基于RGD的THP、基于NGR的THP或其组合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域融合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域和铰链结构域融合。在一些实施例中，THP与标签序列、肽接头和/或膜锚定序列融合。在一些实施例中，THP任选地通过肽接头与TGF-β显性负受体(TGF-βDNR，例如dnTGF-βRII)融合。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗DLL3 CAR和外源THP的免疫效应细胞，该抗DLL3CAR包含：(i)胞外DLL3结合结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)胞内信号传导结构域，其中该抗DLL3 CAR包含第一VHH抗体部分和第二VHH抗体部分，该第一VHH抗体部分包含：CDR1，该CDR1包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；CDR2，该CDR2包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；和CDR3，该CDR3包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；该第二VHH抗体部分包含：CDR1，该CDR1包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；CDR2，该CDR2包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；和CDR3，该CDR3包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的跨膜结构域衍生自选自由以下组成的组的分子：CD7、CD8、CD8α、CD4、CD28、CD137(4-1BB)、CD80、CD86、CD152、FasL、TR2和PD1。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的跨膜结构域衍生自CD7。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的跨膜结构域衍生自CD8。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的跨膜结构域衍生自TR2。在一些实施例中，抗DLL3CAR的胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞内信号传导结构域来自CD3ζ。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自共刺激分子，该共刺激分子选自由CD27、CD28、CD137(4-1BB)、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组。在一些实施例中，抗DLL3 CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域来自CD8。在一些实施例中，抗DLL3 CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的N末端的信号肽。在一些实施例中，信号肽来自CD8。在一些实施例中，THP是基于RGD的THP、基于NGR的THP或其组合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域融合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域和铰链结构域融合。在一些实施例中，THP与标签序列、肽接头和/或膜锚定序列融合。在一些实施例中，THP任选地通过肽接头与TGF-β显性负受体(TGF-βDNR，例如dnTGF-βRII)融合。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗DLL3 CAR和外源THP的免疫效应细胞，该抗DLL3CAR包含：(i)胞外DLL3结合结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)胞内信号传导结构域，其中该抗DLL3 CAR包含第一VHH抗体部分和第二VHH抗体部分，该第一VHH抗体部分包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，该第二VHH抗体部分包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的跨膜结构域衍生自选自由以下组成的组的分子：CD7、CD8、CD8α、CD4、CD28、CD137(4-1BB)、CD80、CD86、CD152、FasL、TR2和PD1。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的跨膜结构域衍生自CD7。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的跨膜结构域衍生自CD8。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的跨膜结构域衍生自TR2。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞内信号传导结构域来自CD3ζ。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自共刺激分子，该共刺激分子选自由CD27、CD28、CD137(4-1BB)、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组。在一些实施例中，抗DLL3 CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域来自CD8。在一些实施例中，抗DLL3 CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的N末端的信号肽。在一些实施例中，信号肽来自CD8。在一些实施例中，THP是基于RGD的THP、基于NGR的THP或其组合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域融合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域和铰链结构域融合。在一些实施例中，THP与标签序列、肽接头和/或膜锚定序列融合。在一些实施例中，THP任选地通过肽接头与TGF-β显性负受体(TGF-βDNR，例如dnTGF-βRII)融合。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗DLL3 CAR和外源THP的免疫效应细胞，该抗DLL3CAR包含：(i)胞外DLL3结合结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)胞内信号传导结构域，其中该抗DLL3 CAR包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的跨膜结构域衍生自选自由以下组成的组的分子：CD7、CD8、CD8α、CD4、CD28、CD137(4-1BB)、CD80、CD86、CD152、FasL、TR2和PD1。在一些实施例中，抗DLL3CAR的跨膜结构域衍生自CD7。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的跨膜结构域衍生自CD8。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的跨膜结构域衍生自TR2。在一些实施例中，抗DLL3CAR的胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞内信号传导结构域来自CD3ζ。在一些实施例中，抗DLL3 CAR的胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自共刺激分子，该共刺激分子选自由CD27、CD28、CD137(4-1BB)、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组。在一些实施例中，抗DLL3 CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域来自CD8。在一些实施例中，抗DLL3 CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的N末端的信号肽。在一些实施例中，信号肽来自CD8。在一些实施例中，抗DLL3 CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的N末端的信号肽。在一些实施例中，信号肽来自CD8。在一些实施例中，抗DLL3 CAR包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施例中，THP是基于RGD的THP、基于NGR的THP或其组合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域融合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域和铰链结构域融合。在一些实施例中，THP与标签序列、肽接头和/或膜锚定序列融合。在一些实施例中，THP任选地通过肽接头与TGF-β显性负受体(TGF-βDNR，例如dnTGF-βRII)融合。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗DLL3 CAR和外源膜结合RGD的免疫效应细胞。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽从N末端至C末端包含：抗DLL3 CAR(SEQ IDNO:8)、RGD-4C(SEQ ID NO:2)、(G4S)3接头、以及来自CD7的铰链结构域(SEQ ID NO:13)和跨膜结构域(SEQ ID NO:14)。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:26具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％、或99％中的任一个)序列同一性的其变体。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗DLL3 CAR和外源膜结合NGR的免疫效应细胞。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽从N末端至C末端包含：抗DLL3 CAR(SEQ IDNO:8)、NGR(SEQ ID NO:38)、(G4S)2接头、以及来自CD7的铰链结构域(SEQ ID NO:13)和跨膜结构域(SEQ ID NO:14)。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:39具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％、或99％中的任一个)序列同一性的其变体。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗DLL3 CAR和与TGF-βDNR融合的外源膜结合RGD的免疫效应细胞，其中该免疫效应细胞包含多肽，该多肽从N末端到C末端包含：抗DLL3 CAR(SEQ ID NO:8)、CD28信号肽、RGD-4C(SEQ ID NO:2)、G4S接头和TGF-βDNR(例如，dnTGF-βRII)。在一些实施例中，TGF-βDNR经由TR2的跨膜结构域锚定至膜。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:52具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％、或99％中的任一个)序列同一性的其变体。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗DLL3 CAR和与TGF-βDNR(例如，dnTGF-βRII)融合的外源膜结合NGR的免疫效应细胞，其中该免疫效应细胞包含多肽，该多肽从N末端到C末端包含：抗DLL3 CAR(SEQ ID NO:8)、CD28信号肽、NGR(SEQ ID NO:38)、G4S接头和TGF-βDNR(例如，dnTGF-βRII)。在一些实施例中，TGF-βDNR经由TR2的跨膜结构域锚定至膜。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:54具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％、或99％中的任一个)序列同一性的其变体。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗DLL3 CAR和与TGF-βDNR(例如，dnTGF-βRII)融合的外源膜结合NGR的免疫效应细胞，其中该免疫效应细胞包含多肽，该多肽从N末端到C末端包含：抗DLL3 CAR(SEQ ID NO:8)、TGF-βDNR(例如dnTGF-βRII)、P2A、NGR(SEQ ID NO:38)、以及来自CD7的铰链结构域(SEQ ID NO:13)和跨膜结构域(SEQ ID NO:14)。在一些实施例中，TGF-βDNR经由TR2的跨膜结构域锚定至膜。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:55具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％、或99％中的任一个)序列同一性的其变体。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗DLL3 CAR和与TGF-βDNR(例如，dnTGF-βRII)融合的外源膜结合NGR的免疫效应细胞，其中该免疫效应细胞包含多肽，该多肽从N末端到C末端包含：抗DLL3 CAR(SEQ ID NO:8)、NGR(SEQ ID NO:38)、G4S接头、NGR(SEQ ID NO:38)以及来自CD7的铰链结构域(SEQ ID NO:13)和跨膜结构域(SEQ ID NO:14)、T2A、和TGF-βDNR(例如dnTGF-βRII)。在一些实施例中，TGF-βDNR经由TR2的跨膜结构域锚定至膜。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:57具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％、或99％中的任一个)序列同一性的其变体。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗MSLN CAR和外源THP的免疫效应细胞，该抗MSLNCAR包含：(i)胞外MSLN结合结构域、(ii)跨膜结构域、和(iii)胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗MSLN CAR的胞外抗原结合结构域包含串联VHH抗体部分。在一些实施例中，抗MSLN CAR的跨膜结构域衍生自选自由以下组成的组的分子：CD7、CD8、CD8α、CD4、CD28、CD137(4-1BB)、CD80、CD86、CD152、FasL、TR2和PD1。在一些实施例中，抗MSLN CAR的跨膜结构域衍生自CD7。在一些实施例中，抗MSLN CAR的跨膜结构域衍生自CD8。在一些实施例中，抗MSLN CAR的跨膜结构域衍生自TR2。在一些实施例中，抗MSLN CAR的胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗MSLN CAR的胞内信号传导结构域来自CD3ζ。在一些实施例中，抗MSLN CAR的胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自共刺激分子，该共刺激分子选自由CD27、CD28、CD137(4-1BB)、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组。在一些实施例中，抗MSLN CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域来自CD8。在一些实施例中，抗MSLN CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的N末端的信号肽。在一些实施例中，信号肽来自CD8。在一些实施例中，THP是基于RGD的THP、基于NGR的THP或其组合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域融合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域和铰链结构域融合。在一些实施例中，THP与标签序列、肽接头和/或膜锚定序列融合。在一些实施例中，THP任选地通过肽接头与TGF-β显性负受体(TGF-βDNR，例如dnTGF-βRII)融合。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗MSLN CAR和外源THP的免疫效应细胞，该抗MSLNCAR包含：(i)胞外MSLN结合结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)胞内信号传导结构域，其中该抗MSLN CAR包含第一VHH抗体部分，该第一VHH抗体部分包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列或与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗MSLN CAR的胞外抗原结合结构域包含串联VHH抗体部分。在一些实施例中，抗MSLN CAR的跨膜结构域衍生自选自由以下组成的组的分子：CD7、CD8、CD8α、CD4、CD28、CD137(4-1BB)、CD80、CD86、CD152、FasL、TR2和PD1。在一些实施例中，抗MSLN CAR的跨膜结构域衍生自CD7。在一些实施例中，抗MSLNCAR的跨膜结构域衍生自CD8。在一些实施例中，抗MSLN CAR的跨膜结构域衍生自TR2。在一些实施例中，抗MSLN CAR的胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗MSLN CAR的胞内信号传导结构域来自CD3ζ。在一些实施例中，抗MSLN CAR的胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自共刺激分子，该共刺激分子选自由CD27、CD28、CD137(4-1BB)、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组。在一些实施例中，抗MSLN CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域来自CD8。在一些实施例中，抗MSLN CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的N末端的信号肽。在一些实施例中，信号肽来自CD8。在一些实施例中，THP是基于RGD的THP、基于NGR的THP或其组合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域融合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域和铰链结构域融合。在一些实施例中，THP与标签序列、肽接头和/或膜锚定序列融合。在一些实施例中，THP任选地通过肽接头与TGF-β显性负受体(TGF-βDNR，例如dnTGF-βRII)融合。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗MSLN CAR和外源膜结合NGR的免疫效应细胞。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽从N末端至C末端包含：抗MSLN CAR(SEQ IDNO:41)、NGR(SEQ ID NO:38)、(G4S)2接头、以及来自CD7的铰链结构域(SEQ ID NO:13)和跨膜结构域(SEQ ID NO:14)。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ IDNO:42的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:42具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％、或99％中的任一个)序列同一性的其变体。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗GPC2 CAR和外源THP的免疫效应细胞，该抗GPC2CAR包含：(i)胞外GPC2结合结构域、(ii)跨膜结构域、和(iii)胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗GPC2 CAR的胞外抗原结合结构域包含串联VHH抗体部分。在一些实施例中，抗GPC2 CAR的跨膜结构域衍生自选自由以下组成的组的分子：CD7、CD8、CD8α、CD4、CD28、CD137(4-1BB)、CD80、CD86、CD152、FasL、TR2和PD1。在一些实施例中，抗GPC2 CAR的跨膜结构域衍生自CD7。在一些实施例中，抗GPC2 CAR的跨膜结构域衍生自CD8。在一些实施例中，抗GPC2 CAR的跨膜结构域衍生自TR2。在一些实施例中，抗GPC2 CAR的胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗GPC2 CAR的胞内信号传导结构域来自CD3ζ。在一些实施例中，抗GPC2 CAR的胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自共刺激分子，该共刺激分子选自由CD27、CD28、CD137(4-1BB)、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组。在一些实施例中，抗GPC2 CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域来自CD8。在一些实施例中，抗GPC2 CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的N末端的信号肽。在一些实施例中，信号肽来自CD8。在一些实施例中，THP是基于RGD的THP、基于NGR的THP或其组合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域融合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域和铰链结构域融合。在一些实施例中，THP与标签序列、肽接头和/或膜锚定序列融合。在一些实施例中，THP任选地通过肽接头与TGF-β显性负受体(TGF-βDNR，例如dnTGF-βRII)融合。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗GPC2 CAR和外源THP的免疫效应细胞，该抗GPC2CAR包含：(i)胞外GPC2结合结构域、(ii)跨膜结构域和(iii)胞内信号传导结构域，其中该抗GPC2 CAR包含第一VHH抗体部分，该第一VHH抗体部分包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列或与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗GPC2 CAR的胞外抗原结合结构域包含串联VHH抗体部分。在一些实施例中，抗GPC2 CAR的跨膜结构域衍生自选自由以下组成的组的分子：CD7、CD8、CD8α、CD4、CD28、CD137(4-1BB)、CD80、CD86、CD152、FasL、TR2和PD1。在一些实施例中，抗GPC2 CAR的跨膜结构域衍生自CD7。在一些实施例中，抗GPC2CAR的跨膜结构域衍生自CD8。在一些实施例中，抗GPC2CAR的跨膜结构域衍生自TR2。在一些实施例中，抗GPC2 CAR的胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗GPC2 CAR的胞内信号传导结构域来自CD3ζ。在一些实施例中，抗GPC2 CAR的胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域衍生自共刺激分子，该共刺激分子选自由CD27、CD28、CD137(4-1BB)、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83的配体以及它们的组合组成的组。在一些实施例中，抗GPC2 CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域。在一些实施例中，铰链结构域来自CD8。在一些实施例中，抗GPC2 CAR进一步包含位于胞外抗原结合结构域的N末端的信号肽。在一些实施例中，信号肽来自CD8。在一些实施例中，THP是基于RGD的THP、基于NGR的THP或其组合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域融合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域和铰链结构域融合。在一些实施例中，THP与标签序列、肽接头和/或膜锚定序列融合。在一些实施例中，THP任选地通过肽接头与TGF-β显性负受体(TGF-βDNR，例如dnTGF-βRII)融合。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗GPC2 CAR和外源膜结合NGR的免疫效应细胞。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽从N末端至C末端包含：抗GPC2 CAR(SEQ IDNO:44)、NGR(SEQ ID NO:38)、(G4S)2接头、以及来自CD7的铰链结构域(SEQ ID NO:13)和跨膜结构域(SEQ ID NO:14)。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ IDNO:45的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:45具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％、或99％中的任一个)序列同一性的其变体。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含cTCR和外源THP的免疫效应细胞。在一些实施例中，cTCR是ε-T细胞受体融合构建体(“ε-TruC”)。在一些实施例中，cTCR是抗DLL3 cTCR、抗MSLNcTCR或抗GPC2 cTCR。在一些实施例中，THP是基于RGD的THP、基于NGR的THP或其组合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域融合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域和铰链结构域融合。在一些实施例中，THP与标签序列、肽接头和/或膜锚定序列融合。在一些实施例中，THP任选地通过肽接头与TGF-β显性负受体(TGF-βDNR，例如dnTGF-βRII)融合。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗DLL3 cTCR(即DLL3-TRuC)和外源THP的免疫效应细胞。在一些实施例中，抗DLL3 cTCR包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:35具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％、或99％中的任一个)序列同一性的其变体。在一些实施例中，THP是基于RGD的THP、基于NGR的THP或其组合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域融合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域和铰链结构域融合。在一些实施例中，THP与标签序列、肽接头和/或膜锚定序列融合。在一些实施例中，THP任选地通过肽接头与TGF-β显性负受体(TGF-βDNR，例如dnTGF-βRII)融合。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，提供了包含抗DLL3 cTCR(即DLL3-TRuC)和外源膜结合RGD的免疫效应细胞。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽从N末端至C末端包含：DLL3-ε-TRuC(SEQ ID NO:35)、P2A接头(SEQ ID NO:9)、RGD-4C肽(SEQ ID NO:2)、(G4S)3接头、以及来自CD7的铰链结构域(SEQ ID NO:13)和跨膜结构域(SEQ ID NO:14)。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:36具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％、或99％中的任一个)序列同一性的其变体。在一些实施例中，免疫效应细胞包含多肽，该多肽包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，如本文所述，提供了免疫效应细胞，其包含外源功能性受体中任一个(如CAR、TCR、cTCR、TAC或TAC样嵌合受体中任一个)的组合，和/或外源THP(如基于RGD的肽或基于NGR的肽)中的任一个的组合。例如，在一些实施例中，免疫效应细胞包含CAR以及RGD和NGR的组合。在一些实施例中，免疫效应细胞包含cTCR以及RGD和NGR的组合。在一些实施例中，第一多肽包含第一功能性受体和一种或多种THP，并且第二多肽包含第二功能性受体和一种或多种THP。第一多肽和第二多肽均可在表达功能性受体和/或THP的组合的免疫效应细胞中表达。在一些实施例中，第一多肽上表达的功能性受体不同于第二多肽上表达的功能性受体。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽包含相同类型的功能性受体，并且第一多肽上的功能性受体靶向的抗原与第二多肽上的功能性受体靶向的抗原不同。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽包含相同THP。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽包含不同THP。在一些实施例中，与第二多肽相比，第一多肽包含不同的功能性受体或THP。在一些实施例中，与第二多肽相比，第一多肽包含不同的功能性受体和THP。
根据本披露的其他方面，还提供了表达或包含上述组合物的工程化免疫效应细胞；药物组合物，其包含该组合物或工程化免疫效应细胞以及药学上可接受的载剂；通过将该组合物引入免疫效应细胞来制造工程化免疫效应细胞的方法；以及治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的药物组合物。
2.1免疫效应细胞
“免疫效应细胞”是指能发挥免疫效应子功能的免疫细胞。在一些实施例中，免疫效应细胞至少表达FcγRIII，并且发挥ADCC效应子功能。
在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
在一些实施例中，免疫效应细胞是T细胞。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、γδT细胞、肿瘤浸润性T细胞和DC激活的T细胞组成的组。在一些实施例中，T细胞是CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+、CD4-/CD8-或它们的组合。在一些实施例中，T细胞在表达CAR并与靶细胞结合后产生IL-2、IFN和/或TNF。在一些实施例中，CD8+T细胞在表达CAR并与靶细胞结合后裂解抗原特异性靶细胞。
在一些实施例中，免疫效应细胞是NK细胞。在其他实施例中，免疫效应细胞可以是已建立的细胞系，例如NK-92细胞。
免疫细胞亚群可以通过本领域已知的一种或多种细胞表面标志物(例如，CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD11c、CD123、CD56、CD34、CD14、CD33等)的存在或不存在来定义。在一些实施例中，本文所述的免疫效应细胞可以存在于包含多个工程化免疫效应细胞的组合物(例如药物组合物)中。在一些实施例中，工程化免疫效应细胞可以是免疫细胞类型的特定亚群、免疫细胞类型的亚群的组合、或两种或更多种免疫细胞类型的组合。在一些实施例中，免疫效应细胞存在于同质免疫细胞群中。在一些实施例中，免疫效应细胞存在于可在免疫效应细胞中增强的异质免疫细胞群中。在一些实施例中，工程化免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施例中，工程化免疫细胞不是淋巴细胞。在一些实施例中，工程化免疫细胞适用于过继免疫疗法。
在一些实施例中，免疫效应细胞衍生自原代细胞。在一些实施例中，免疫效应细胞是从个体分离的原代细胞。在一些实施例中，免疫效应细胞从分离自个体的原代细胞繁殖(如增殖和/或分化)。在一些实施例中，原代细胞获自胸腺。在一些实施例中，原代细胞获自淋巴或淋巴结(如肿瘤引流淋巴结)。在一些实施例中，原代细胞获自脾。在一些实施例中，原代细胞获自骨髓。在一些实施例中，原代细胞获自血液，如外周血。在一些实施例中，原代细胞是外周血单个核细胞(PBMC)。在一些实施例中，原代细胞衍生自血浆。在一些实施例中，原代细胞衍生自肿瘤。在一些实施例中，原代细胞获自粘膜免疫系统。在一些实施例中，原代细胞获自活检样品。
在一些实施例中，免疫效应细胞衍生自细胞系。在一些实施例中，免疫效应细胞获自商业细胞系。在一些实施例中，免疫效应细胞从分离自个体的原代细胞建立的细胞系繁殖(如，增殖和/或分化)而来。在一些实施例中，细胞系是非永生(mortal)细胞系。在一些实施例中，细胞系是永生化细胞系。在一些实施例中，细胞系是肿瘤细胞系，如白血病或淋巴瘤细胞系。在一些实施例中，细胞系是衍生自PBMC的细胞系。在一些实施例中，细胞系是干细胞系。在一些实施例中，细胞系是NK-92。
在一些实施例中，免疫效应细胞衍生自干细胞。在一些实施例中，干细胞是胚胎干细胞(ESC)。在一些实施例中，干细胞是造血干细胞(HSC)。在一些实施例中，干细胞是间质干细胞。在一些实施例中，干细胞是经诱导的多能干细胞(iPSC)。
2.2嵌合抗原受体(CAR)
在本披露的一方面，本文提供了CAR或CAR-T细胞。在一些实施例中，包含CAR或CAR-T细胞的免疫细胞进一步包含THP。
已经开发了几“代”CAR。第一代CAR T细胞利用TCR的CD3ζ-链的胞内结构域，提供所谓的‘信号1’，并诱导对靶细胞的细胞毒性。经由CD3ζ链的接合和信号传导是T细胞刺激和增殖所必需的，但在缺乏第二信号或‘信号2’的情况下，通常不足以实现持续增殖和活性。二代CAR被开发用于增强再输注到受试者后体内的功效和持久性，并且含有第二共刺激信号传导结构域(CD28或4-1BB)胞内结构域，该胞内结构域的功能是提供‘信号2’以减轻一代CAR T细胞中所见的无反应性和活化诱导的细胞死亡。三代CAR通过使用串联的两个不同共刺激结构域(例如CD28/4-1BB/CD3ζ或CD28/OX-40/CD3ζ)进一步优化。(参见例如，Yeku等人,2016,Armored CAR T-cells:utilizing cytokines and pro-inflammatory ligandsto enhance CAR T-cell anti-tumor efficacy.Biochem Soc Trans.44(2):412)。CAR已被进一步优化或“装甲”以分泌活性细胞因子或表达共刺激配体，从而进一步改善功效和持久性。本披露中使用的CAR可以是一代、二代、三代或“装甲的”CAR。
在一些实施例中，CAR对DLL3、MSLN或GPC2具有特异性。在一些实施例中，CAR对DLL3具有特异性。在一些实施例中，CAR对MSLN具有特异性。在一些实施例中，CAR对GPC2具有特异性。在一些实施例中，CAR对DLL3、MSLN或GPC2具有特异性，并且用THP装甲。在一些实施例中，CAR是用THP装甲的抗DLL3 CAR。在一些实施例中，CAR是用THP装甲的抗MSLN CAR。在一些实施例中，CAR是用THP装甲的抗GPC2 CAR。在一些实施例中，THP是基于RGD的肽。在一些实施例中，THP是基于NGR的肽。
在一些实施例中，CAR对DLL3具有特异性，即它是抗DLL3 CAR。已发现DLL3蛋白(δ样蛋白3)在临床上与多种增生性病症相关，这些增生性病症包括展现神经内分泌特征的肿瘤，如小细胞肺癌(SCLC)、卵巢癌(OC)或神经母细胞瘤(NBL)。如本文所用，术语DLL3包括人DLL3的变体、同种型、物种同源物(例如，来自啮齿动物或其他非人哺乳动物)以及与DLL3具有至少一个共同表位的类似物。在一些实施例中，CAR对人DLL3具有特异性。
人DLL3的示例性氨基酸序列披露于UniProtKB-Q9NYJ7(DLL3_HUMAN)。在一些实施例中，人DLL3的变体可以与UniProtKB-Q9NYJ7的人DLL3在氨基酸序列中至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些实施例中，CAR对UniProtKB-Q9NYJ7的人DLL3具有特异性。
起源于神经内分泌祖细胞的SCLC大约占所有肺癌的15％，且具有最低的5年存活率之一(存活率为6％)(Alvarado-Luna等人,2016,Transl Lung Cancer Res5:26-38；Siegel等人,2017,CA Cancer J Clin 67:7-30)。这是因为其具有高度侵袭性，约三分之二的患者在诊断时患有转移性疾病，且为常规治疗(例如基于铂的化学疗法)极难医治的。
在一些实施例中，抗DLL3 CAR包含：(a)特异性结合DLL3(尤其是鼠或人DLL3)的胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内信号传导结构域。
可用于本披露的抗DLL3 CAR或靶向一个或多个其他抗原的CAR可在其胞外抗原结合结构域中具有一个或多个抗原结合部分。例如，CAR可以在胞外抗原结合结构域中具有两个串联的VHH部分。
在一些实施例中，抗DLL3 CAR包含第一VHH抗体部分和第二VHH抗体部分，该第一VHH抗体部分包含：CDR1，该CDR1包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；CDR2，该CDR2包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；和CDR3，该CDR3包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；该第二VHH抗体部分包含：CDR1，该CDR1包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；CDR2，该CDR2包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；和CDR3，该CDR3包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体。
在一些实施例中，抗DLL3 CAR包含第一VHH抗体部分和第二VHH抗体部分，该第一VHH抗体部分包含含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3，该第二VHH抗体部分包含含有SEQ IDNO:32的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR3。在一些实施例中，所述第一VHH抗体部分和第二VHH抗体部分通过(G4S)n接头连接，其中该接头可以是任何适当的长度，例如n可以是1至20之间、优选3至12之间的任何整数，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更大。
在一些实施例中，抗DLL3 CAR包含第一VHH抗体部分和第二VHH抗体部分，该第一VHH抗体部分包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列(即，AS63997VH5VHH)或与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，该第二VHH抗体部分包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列(即，AS64380VH5 VHH)或与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗DLL3CAR抗体包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的第一VHH抗体部分和含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的第二VHH抗体部分。在一些实施例中，所述第一VHH抗体部分和第二VHH抗体部分通过(G4S)3接头连接。
在一些实施例中，抗DLL3 CAR包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗DLL3 CAR包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一些实施例中，CAR对MSLN具有特异性，即它是抗MSLN CAR。如本文所用，术语MSLN包括人MSLN的变体、同种型、物种同源物(例如，来自啮齿动物或其他非人哺乳动物)以及与MSLN具有至少一个共同表位的类似物。在一些实施例中，CAR对人MSLN具有特异性。人MSLN的示例性氨基酸序列披露于UniProtKB-H3BR90(H3BR90_HUMAN)。在一些实施例中，人MSLN的变体可以与UniProtKB-H3BR90的人MSLN在氨基酸序列中至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些实施例中，CAR对UniProtKB-H3BR90的人MSLN具有特异性。
在一些实施例中，抗MSLN CAR包含：(a)特异性结合MSLN(尤其是鼠或人MSLN)的胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗MSLN CAR包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列或与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗MSLN CAR包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
在一些实施例中，CAR对GPC2具有特异性，即它是抗GPC2 CAR。如本文所用，术语GPC2包括人GPC2的变体、同种型、物种同源物(例如，来自啮齿动物或其他非人哺乳动物)以及与GPC2具有至少一个共同表位的类似物。在一些实施例中，CAR对人GPC2具有特异性。人GPC2的示例性氨基酸序列披露于UniProtKB-Q8N158(GPC2_HUMAN)。在一些实施例中，人GPC2的变体可以与UniProtKB-Q8N158的人GPC2在氨基酸序列中至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些实施例中，CAR对UniProtKB-Q8N158的人GPC2具有特异性。
在一些实施例中，抗GPC2 CAR包含：(a)特异性结合GPC2(尤其是鼠或人GPC2)的胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗GPC2 CAR包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列或与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗GPC2 CAR包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
2.2.1CAR的胞外抗原结合结构域
在本申请中，术语“胞外抗原结合结构域”、“抗原结合片段”、“抗原识别部分”和类似的表达可与CAR或TCR互换使用。抗原结合结构域有多种形式。非限制性实例包括双特异性受体(Zakaria Grada等人TanCAR:A Novel Bispecific Chimeric Antigen Receptorfor Cancer Immunotherapy.Molecular Therapy,2013,2,e105)、基于CAR的单域VHH(DeMeyer T,等人,VHH-based products as research and diagnostic tools.TrendsBiotechnol.2014年5月；32(5):263-70)、和“通用”CAR，这些通用CAR包含与掺入生物素的任何抗原受体结合的亲和素(Huan Shi,等人Chimeric antigen receptor for adoptiveimmunotherapy of cancer:latest research and future prospects.MolecularCancer,2014,13:219)。
在一些实施例中，抗原结合结构域选自由以下组成的组：Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、单域抗体(sdAb)和与靶分子特异性结合的肽配体。
在一些实施例中，抗原结合结构域是抗体部分。在一些实施例中，抗体部分是单特异性的。在一些实施例中，抗体部分是多特异性的。在一些实施例中，抗体部分是双特异性的。在一些实施例中，抗体部分是串联scFv、双抗体(Db)、单链双抗体(scDb)、双重亲和力重靶向(DART)抗体、双可变结构域(DVD)抗体、化学交联抗体、异多聚体抗体或异源缀合抗体。在一些实施例中，抗体部分是scFv。在一些实施例中，抗体部分是单域抗体(sdAb)。在一些实施例中，抗体部分是VHH。在一些实施例中，抗体部分包含串联VHH。在一些实施例中，抗体部分是全人的、用人抗体框架区半合成的或人源化的。
在某些实施例中，抗原结合结构域是多特异性的，如双特异性的或三特异性的。术语“多特异性”在本披露中以更广泛的意义使用，即，如果抗原结合结构域可以靶向同一抗原上的多于一个表位或可以靶向多于一个抗原，则该抗原结合结构域是多特异性的。在一些实施例中，抗原结合结构域包含串联VHH结构域。串联VHH可以例如通过将两个串联VHH结构域融合至铰链结构域和Fc结构域来生成。
在大多数人癌症中都发现了抗原，这些癌症包括伯基特淋巴瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、骨肉瘤、肾细胞癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌。肿瘤相关的抗原(TAA)包括但不限于GPC2、CD19、CD20、CD22、CD24、CD33、CD38、CD123、CD228、CD138、BCMA、GPC3、CEA、叶酸受体(FRα)、间皮素(MSLN)、DLL3、CD276、gp100、5T4、GD2、EGFR、MUC-1、PSMA、EpCAM、MCSP、SM5-1、MICA、MICB、ULBP和HER-2。TAA进一步包括新生抗原、肽/MHC复合物和HSP/肽复合物。
2.2.2CAR的胞内信号传导结构域
胞内信号传导结构域(ICD)包含免疫细胞(如T细胞)的初级胞内信号传导结构域。在某些实施例中，初级胞内信号传导结构域衍生自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。在某些实施例中，初级胞内信号传导结构域衍生自CD3ζ(即，“CD3ζ胞内信号传导结构域”)。在某些实施例中，胞内信号传导结构域包含胞内共刺激序列。在某些实施例中，胞内信号传导结构域同时包含初级胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ胞内信号传导结构域)和胞内共刺激结构域。在某些实施例中，胞内信号传导结构域包含初级胞内信号传导结构域，但不包含胞内共刺激结构域。在某些实施例中，胞内信号传导结构域包含胞内共刺激序列，但不包含初级胞内信号传导结构域。
2.2.3共刺激结构域
如本文所用，“共刺激结构域”(CSD)是指CAR中增强记忆细胞增殖、存活和/或发育的部分。本披露的CAR可以包含一个或多个共刺激结构域。每个共刺激结构域包含以下中的任何一个或多个的共刺激结构域：例如TNFR超家族成员、CD28、CD137(4-lBB)、CD134(OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD1 la/CD18)、ICOS(CD278)、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40及它们的组合。与本披露一起使用的其他共刺激结构域包含以下中的一种或多种：2B4/CD244/SLAMF4、4-1BB/TNFSF9/CD137、B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BAFF-R/TNFRSF13C、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BLAME/SLAMF8、BTLA/CD272、CD100(SEMA4D)、CD103、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD150、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD2、CD200、CD229/SLAMF3、CD27配体/TNFSF7、CD27/TNFRSF7、CD28、CD29、CD2F-10/SLAMF9、CD30配体/TNFSF8、CD30/TNFRSF8、CD300a/LMIR1、CD4、CD40配体/TNFSF5、CD40/TNFRSF5、CD48/SLAMF2、CD49a、CD49D、CD49f、CD53、CD58/LFA-3、CD69、CD7、CD8、CD8α、CD8β、CD82/Kai-1、CD84/SLAMF5、CD90/Thy1、CD96、CDS、CEACAM1、CRACC/SLAMF7、CRTAM、CTLA-4、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DNAM1(CD226)、DPPIV/CD26、DR3/TNFRSF25、EphB6、GADS、Gi24/VISTA/B7-H5、GITR配体/TNFSF18、GITR/TNFRSF18、HLA I类、HLA-DR、HVEM/TNFRSF14、IA4、ICAM-1、ICOS/CD278、Ikaros、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整联蛋白α4/CD49d、整联蛋白α4β1、整联蛋白α4β7/LPAM-1、IPO-3、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAG-3、LAT、LIGHT/TNFSF14、LTBR、Ly108、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、淋巴毒素-α/TNF-β、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、NTB-A/SLAMF6、OX40配体/TNFSF4、OX40/TNFRSF4、PAG/Cbp、PD-1、PDCD6、PD-L2/B7-DC、PSGL1、RELT/TNFRSF19L、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1)、SLAM/CD150、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TACI/TNFRSF13B、TCL1A、TCL1B、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TL1A/TNFSF15、TNF RII/TNFRSF1B、TNF-α、TRANCE/RANKL、TSLP、TSLPR、VLA1、TR2和VLA-6。
在某些实施例中，胞内信号传导结构域包含衍生自共刺激分子的胞内共刺激结构域。在一些实施例中，共刺激分子选自由以下组成的组：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD40、PD-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、TNFRSF9、TNFRSF4、TNFRSF8、CD40LG、ITGB2、KLRC2、TNFRSF18、TNFRSF14、HAVCR1、LGALS9、DAP10、DAP12、CD83、CD83配体及它们的组合。在一些实施例中，共刺激分子包含CD7。在一些实施例中，共刺激分子包含CD28。
2.2.4跨膜结构域
在一些实施例中，本披露的CAR包含跨膜结构域。在CAR中，如本文所用，“跨膜结构域”(TMD或TM)是指CAR穿过质膜的区域。本披露的CAR的跨膜结构域是跨膜蛋白(例如I型跨膜蛋白)、人工疏水序列或其组合的跨膜区域。尽管跨膜的主要功能是将CAR锚定在T细胞膜中，但在某些实施例中，跨膜结构域影响CAR功能。在一些实施例中，CAR的跨膜结构域包含选自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C的跨膜结构域。
在某些实施例中，跨膜结构域来自CD7、CD8、CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152、FasL、TR2和PD1或ICOS。Gueden等人将ICOS跨膜结构域的使用与增加CAR T细胞持久性和整体抗肿瘤功效相关联(Guedan S.等人,Enhancing CAR T cell persistencethrough ICOS and 4-1BB costimulation.JCI Insight.2018；3:96976)。在实施例中，跨膜结构域包含跨细胞膜的疏水α螺旋。对于本领域技术人员而言，其他跨膜结构域是显而易见的，并且可以与本披露的替代实施例结合使用。在某些实施例中，跨膜结构域是人跨膜结构域。在某些实施例中，跨膜结构域包含CD8跨膜结构域。在某些实施例中，跨膜结构域包含人CD8α跨膜结构域。在某些实施例中，跨膜结构域包含人CD28跨膜结构域。在某些实施例中，跨膜结构域包含CD7跨膜结构域。在某些实施例中，跨膜结构域包含TR2跨膜结构域。在某些实施例中，跨膜结构域包含FasL跨膜结构域。
2.2.5铰链区
本申请的嵌合受体可以包含位于胞外结构域与跨膜结构域之间的铰链结构域。铰链结构域是通常在蛋白的两个结构域之间发现的氨基酸区段，并且可以允许蛋白的柔性和一个或两个结构域相对于彼此的运动。可以使用提供胞外结构域相对于效应分子的跨膜结构域的这种柔性和运动的任何氨基酸序列。铰链结构域可以含有约10-100个氨基酸，例如，约15-75个氨基酸、20-50个氨基酸或30-60个氨基酸中的任一个。在一些实施例中，铰链结构域的长度可以是至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75个氨基酸中的任一个。
在某些实施例中，铰链结构域是天然存在的蛋白的铰链结构域。本领域已知的包含铰链结构域的任何蛋白的铰链结构域均适用于本文所述的嵌合受体。在某些实施例中，铰链结构域是天然存在的蛋白的铰链结构域的至少一部分，并且赋予嵌合受体柔性。在某些实施例中，铰链结构域衍生自CD8，如CD8α。在某些实施例中，铰链结构域是CD8α的铰链结构域的一部分，例如，含有CD8α的铰链结构域的至少15个(例如20、25、30、35或40个)连续氨基酸的片段。在某些实施例中，铰链结构域衍生自CD28。在某些实施例中，铰链结构域衍生自CD7。
抗体(如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体)的铰链结构域也适用于本文所述的嵌合受体系统。在某些实施例中，铰链结构域是连接抗体的恒定结构域CH1和CH2的铰链结构域。在某些实施例中，铰链结构域是抗体的铰链结构域，并且包含抗体及该抗体的一个或多个恒定区的铰链结构域。在某些实施例中，铰链结构域包含抗体及该抗体的CH3恒定区的铰链结构域。在某些实施例中，铰链结构域包含抗体及该抗体的CH2和CH3恒定区的铰链结构域。在某些实施例中，抗体是IgG、IgA、IgM、IgE、或IgD抗体。在某些实施例中，抗体是IgG抗体。在一些实施例中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4抗体。在某些实施例中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区和CH2和CH3恒定区。在某些实施例中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区和CH3恒定区。
非天然存在的肽也可用作本文所述的嵌合受体的铰链结构域。在某些实施例中，Fc受体的胞外配体-结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域是肽接头，如(GxS)n接头，其中x和n可以独立地是1与20之间、优选3与12之间的整数，包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更大。
2.2.6信号肽
本申请的嵌合受体可以包含多肽的N末端处的信号肽(也称为前导肽)。通常，前导肽是将多肽靶向细胞中所希望的位点的肽序列。包括天然存在的蛋白质的信号序列或合成的、非天然存在的信号序列的前导肽可兼容用于本文所述的嵌合受体。在一些实施例中，前导肽衍生自选自由CD8、GM-CSF受体α和IgG1重链组成的组的分子。在一些实施例中，信号肽衍生自CD8，如CD8α。在一些实施例中，信号肽衍生自CD28。
2.3T细胞受体(TCR)和嵌合TCR(cTCR)
在一些实施例中，功能性外源受体是重组T细胞受体(TCR)。在一些实施例中，重组TCR对肿瘤抗原具有特异性。在一些实施例中，肿瘤抗原是DLL3、MSLN、GPC2、CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR(如EGFRvIII)、GD2、HER2、IGF1R、PSMA、ROR1、WT1或具有临床意义的其他肿瘤抗原。在一些实施例中，肿瘤抗原衍生自肿瘤细胞的胞内蛋白质。在一些实施例中，TCR对DLL3具有特异性。在一些实施例中，TCR对MSLN具有特异性。在一些实施例中，TCR对GPC2具有特异性。本领域已知的任何TCR可用于本申请。在一些实施例中，TCR对肿瘤抗原具有增强的亲和力。例如在US5830755和Kessels等人Immunotherapy through TCR gene transfer.Nat.Immunol.2,957-961(2001)中描述了示例性TCR和用于将这些TCR引入免疫效应细胞中的方法。在一些实施例中，免疫效应细胞是TCR-T细胞或嵌合TCR(cTCR)-T细胞。
TCR受体复合物是由可变TCR受体α和β链(在γδT细胞情况下为γ和δ链)与三个二聚体信号传导模块CD3δ/ε、CD3γ/ε和CD247(T细胞表面糖蛋白CD3ζ链)ζ/ζ或ζ/η形成的八聚体复合物。每个亚基的跨膜结构域中的可电离残基形成将复合物保持在一起的相互作用的极性网络。TCR复合物具有激活T细胞中信号传导级联的功能。
在一些实施例中，功能性外源受体是嵌合TCR(“cTCR”)。在一些实施例中，功能性外源受体是包含一个或多个cTCR的工程化TCR。示例性的cTCR已经在例如US20170166622A1中进行了描述，其通过援引以其全文并入本文。cTCR典型地包含与全长或部分TCR亚基，如TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3γ、CD3ε和CD3δ直接或间接连接(例如，融合)的嵌合受体(CR)抗原结合结构域。融合多肽可以与其他TCR亚基一起并入功能性TCR复合物中，并赋予该TCR复合物抗原特异性。在一些实施例中，结合结构域直接或间接地连接(例如融合)全长或部分CD3ε亚基(称为“εTCR”)。cTCR的胞内信号传导结构域可以衍生自TCR亚基的胞内信号传导结构域。cTCR的跨膜结构域还可以衍生自TCR亚基。在一些实施例中，cTCR的胞内信号传导结构域和跨膜结构域衍生自同一TCR亚基。在一些实施例中，cTCR的胞内信号传导结构域和跨膜结构域衍生自CD3ε。在一些实施例中，结合结构域可以与TCR亚基(或其部分)经由接头(如GS接头)融合。在一些实施例中，cTCR进一步包括TCR亚基的胞外结构域或其部分，该TCR亚基可以与胞内信号传导结构域和/或跨膜结构域所衍生的TCR亚基相同或不同。
在一些实施例中，cTCR的跨膜结构域衍生自选自由以下组成的组的TCR亚基的跨膜结构域：TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3γ、CD3ε和CD3δ。在一些实施例中，cTCR包含跨膜结构域，该跨膜结构域包含CD3εTCR亚基(例如，εTCR或ε-TRuC)的跨膜结构域。
在一些实施例中，cTCR的跨膜结构域和胞内信号传导结构域衍生自同一TCR亚基。在一些实施例中，cTCR进一步包含TCR亚基的胞外序列的至少一部分，并且在一些实施例中，TCR胞外序列可以衍生自与跨膜结构域和/或胞内信号传导结构域相同的TCR亚基。在一些实施例中，cTCR包含全长TCR亚基。例如，在一些实施例中，cTCR包含与TCR亚基(例如，CD3ε)的N末端融合(直接或间接)的结合结构域。
在一些实施例中，cTCR的胞内信号传导结构域衍生自选自由以下组成的组的TCR亚基的胞内信号传导结构域：TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3γ、CD3ε和CD3δ。在一些实施例中，cTCR的胞内信号传导结构域衍生自CD3ε的胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，cTCR包含TCR亚基和抗原结合结构域，该TCR亚基包含TCR胞外结构域的至少一部分和含有来自CD3ε的胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR胞内结构域；其中该TCR亚基与该抗原结合结构域可操作地连接，并且其中当在免疫效应细胞(例如T细胞)中表达时，将该cTCR掺入TCR中。在一些实施例中，抗原结合结构域对DLL3、MSLN、GPC2或其组合具有特异性。在一些实施例中，抗原结合结构域对DLL3具有特异性。
在一些实施例中，cTCR是ε-T细胞受体融合构建体(“ε-TruC”)。在一些实施例中，ε-TruC包含TCR亚基和抗原结合结构域，该TCR亚基包含TCR胞外结构域的至少一部分和含有来自CD3ε的胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR胞内结构域；其中该TCR亚基与该抗原结合结构域可操作地连接，并且其中当在免疫效应细胞(例如T细胞)中表达时，将该cTCR掺入TCR中。在一些实施例中，ε-TruC用外源THP装甲。在一些实施例中，cTCR是抗DLL3cTCR、抗MSLN cTCR或抗GPC2 cTCR。在一些实施例中，THP是基于RGD的THP、基于NGR的THP或其组合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域融合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域和铰链结构域融合。在一些实施例中，THP与标签序列、肽接头和/或膜锚定序列融合。
在一些实施例中，cTCR是抗DLL3 cTCR(即DLL3-TRuC)。在一些实施例中，抗DLL3cTCR包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:35具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％、或99％中的任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施例中，cTCR是用外源膜结合RGD装甲的抗DLL3 cTCR(即DLL3-TRuC)。在一些实施例中，cTCR从N末端到C末端包含：DLL3-ε-TRuC(SEQ ID NO:35)、P2A接头(SEQ IDNO:9)、RGD-4C肽(SEQ ID NO:2)、(G4S)3接头、以及来自CD7的铰链结构域(SEQ ID NO:13)和跨膜结构域(SEQ ID NO:14)。在一些实施例中，免疫效应细胞包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:36具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％、或99％中的任一个)序列同一性的其变体。
2.4T细胞抗原偶联物(TAC)和TAC样嵌合受体
在一些实施例中，功能性外源受体是T细胞抗原偶联物(TAC)受体。例如在US20160368964 A1中描述了示例性TAC受体，将其通过援引并入本文。在一些实施例中，TAC包含靶向结构域、特异性结合与TCR复合物相关的蛋白质的TCR结合结构域和TCR信号传导结构域。在一些实施例中，靶向结构域是特异性结合肿瘤抗原的抗体片段，如scFv或VHH。在一些实施例中，靶向结构域是设计的锚蛋白重复序列(DARPin)多肽。在一些实施例中，重组TCR对肿瘤抗原具有特异性。在一些实施例中，肿瘤抗原是DLL3、MSLN、GPC2、CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR(如EGFRvIII)、GD2、HER2、IGF1R、PSMA、ROR1、WT1或具有临床意义的其他肿瘤抗原。在一些实施例中，肿瘤抗原衍生自肿瘤细胞的胞内蛋白质。在一些实施例中，TAC的靶向结构域对DLL3具有特异性。在一些实施例中，TAC的靶向结构域对MSLN具有特异性。在一些实施例中，TAC的靶向结构域对GPC2具有特异性。
在一些实施例中，该与TCR复合物相关的蛋白质是CD3，如CD3ε。在一些实施例中，TCR结合结构域是单链抗体，如scFv或VHH。在一些实施例中，TCR结合结构域衍生自UCHT1。在一些实施例中，TAC受体包含胞质结构域和跨膜结构域。在一些实施例中，TCR信号传导结构域包含衍生自TCR共受体的胞质结构域。示例性TCR共受体包括但不限于CD4、CD7、CD8、CD28、CD45、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137(4-1BB)和CD154。在一些实施例中，TAC受体包含衍生自CD4的跨膜结构域和胞质结构域。在一些实施例中，TAC受体包含衍生自CD8(如CD8α)的跨膜结构域和的胞质结构域。
T细胞共受体在T细胞上表达为膜蛋白。它们可以稳定TCR:肽:MHC复合物并促进信号转导。T细胞共受体的两种亚型(CD4和CD8)对特定MHC类型表现出强特异性。CD4共受体仅可以稳定TCR:MHC II复合物，而CD8共受体仅可以稳定TCR:MHC I复合物。CD4和CD8在不同T细胞类型上的差异表达导致不同的T细胞功能亚群。CD8+T细胞是细胞毒性T细胞。
CD4是在免疫细胞(例如，辅助T细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞)的表面上表达的糖蛋白。CD4具有暴露于胞外细胞表面的四个免疫球蛋白结构域(D1至D4)。CD4在其短胞内(cytoplasmic/intracellular)尾上含有特定的氨基酸序列，其允许CD4尾募集酪氨酸激酶Lck并与该酪氨酸激酶Lck相互作用。当TCR复合物和CD4各自结合MHC II分子的不同区域时，TCR复合物与CD4之间的紧密接近允许与CD4的胞内尾结合的Lck对CD3的胞内结构域上的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)进行酪氨酸磷酸化，从而扩增TCR产生的信号。
CD8是由两条α链组成的同源二聚体(较不常见)或由一条α链和一条β链组成的异二聚体(较常见)的糖蛋白，它们各自包含通过细柄(thin stalk)与膜连接的免疫球蛋白可变(IgV)样胞外结构域和胞内尾。CD8主要在细胞毒性T细胞的表面上表达，但也可以在自然杀伤细胞、皮质胸腺细胞和树突细胞上发现。CD8胞内尾与Lck相互作用，一旦TCR结合其特异性抗原就会使TCR复合物的胞内CD3和ζ链磷酸化。胞内CD3和ζ链上的酪氨酸磷酸化引发磷酸化级联，最终导致基因转录。
2.5肿瘤归巢肽(THP)
“肿瘤归巢肽(THP)”是一种可能通过肿瘤血管上表达的特定配体特异性靶向肿瘤基质(特别是肿瘤脉管系统)的肽。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽和天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(NGR)肽是两种众所周知的THP。在一些实施例中，RGD肽可包含一个或多个RGD基序，例如1、2、3或更多个RGD基序中的任一种。在一些实施例中，NGR肽可包含一个或多个NGR基序，例如1、2、3或更多个NGR基序中的任一种。在一些实施例中，THP同时包含RGD肽基序和NGR肽基序。在一些实施例中，THP包含一个或多个RGD肽基序和一个或多个NGR肽基序。在一些实施例中，本文所述的THP可包含本领域已知的任何合适的THP。在一些实施例中，THP是本文所述的THP的组合。
在一些实施例中，THP是膜结合的。在一些实施例中，THP是膜结合RGD(mbRGD)。在一些实施例中，THP是膜结合NGR(mbNGR)。
实体瘤由两个不同但相互依赖的区室组成：恶性细胞本身(实质)和它们诱导并分散在其中的支持结缔组织(基质)。肿瘤基质与正常结缔组织显著不同。血管就是一个例子。肿瘤血管在组织、结构和功能方面不同于其正常对应物。与正常脉管系统不同，肿瘤血管不是以分层模式排列，而是间隔不规则且结构异质。它们对血浆和血浆蛋白也是高渗透性的，可能缺乏周细胞，并且由活跃分裂的内皮细胞排列。参见，Dvorak HF.Rous-Whipple AwardLecture.How tumors make bad blood vessels and stroma.Am J Pathol.2003年6月；162(6):1747-57.doi:10.1016/s0002-9440(10)64309-x.PMID:12759232；PMCID:PMC1868128。
肿瘤基质主要由基底膜、成纤维细胞、胞外基质、免疫细胞和脉管系统组成。参见,Roy M.Bremnes,等人.The Role of Tumor Stroma in Cancer Progression andPrognosis:Emphasis on Carcinoma-Associated Fibroblasts and Non-small CellLung Cancer.Journal of Thoracic Oncology,Volume 6,Issue 1,2011,Pages 209-217。
THP通常是序列长度为3至15个氨基酸的短肽。自1998年引入肿瘤归巢概念以来，通过体外和体内噬菌体展示技术鉴定了大量的THP。THP具有一些常见的基序(例如RGD、NGR)，它们特异性地结合肿瘤细胞或肿瘤脉管系统上的表面分子。例如，RGD肽与α整联蛋白结合，以及NGR与存在于肿瘤内皮细胞表面的受体氨肽酶N结合。由于其肿瘤归巢能力，THP被用于癌症诊断和治疗。参见,Sharma,A.,Kapoor,P.,Gautam,A.等人Computationalapproach for designing tumor homing peptides.Sci Rep 3,1607(2013).https://doi.org/10.1038/srep01607。
肿瘤归巢是许多细胞所用的、使其从远处位置移动至肿瘤的复杂的多步骤过程。出于本申请的目的，术语“肿瘤归巢”是指涉及从远处位置移动至肿瘤的任何动作。本披露中使用的肿瘤归巢肽可以引导分子或细胞群，以被富集或浸润到肿瘤中。THP本身不必在肿瘤细胞表面有靶点，但可以利用富集所需的其他过程。例如，我们利用整联蛋白αvβ5的高表达(肿瘤血管生成内皮细胞的一个特征)来恢复CAR-T细胞完成跨内皮迁移的能力，这是CAR-T在实体瘤中发挥作用所需的。正如我们之前的测试所显示，整联蛋白αvβ5在我们使用的肿瘤细胞中不表达。在一些实施例中，本披露中使用的肿瘤归巢肽不是导致与肿瘤细胞直接接触的肿瘤靶向肽，因此需要使靶点直接暴露在肿瘤细胞上。
可用于本披露的THP包括但不限于基于RGD的肽，即包含RGD基序的THP，和基于NGR的肽，即包含NGR基序的THP。基于RGD的肽也称为RGD肽，与基于NGR的肽类似。在一些实施例中，THP选自由基于RGD的肽、基于NGR的肽及它们的组合组成的组。在一些实施例中，THP选自由以下组成的组：RGD、RGD-4C和iRGD。在一些实施例中，THP是RGD-4C。在一些实施例中，THP包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少90％序列同一性，如与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性中任一个。在一些实施例中，THP具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施例中，THP是NGR。在一些实施例中，THP包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少90％序列同一性，如与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性中任一个。在一些实施例中，THP具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
RGD肽可以结合多个整联蛋白，结合特异性由RGD的侧翼序列确定。RGD-4C是两侧侧接半胱氨酸-天冬氨酸/苯丙氨酸-半胱氨酸残基的RGD肽，对整联蛋白αvβ5表现出特异性，整联蛋白αvβ5仅在肿瘤细胞或新脉管系统内皮上表达。参见,Nagel H,Maag S,TassisA,NestléFO,Greber UF,Hemmi S.Theαvβ5integrin of hematopoietic andnonhematopoietic cells is a transduction receptor of RGD-4C fiber-modifiedadenoviruses.Gene Ther.2003年9月；10(19):1643-53.PMID:12923563。
iRGD(CRGDKGPDC)肽在RGD肽的基础上开发，由九个氨基酸组成。它首先与在肿瘤细胞和血管上表达的αv整联蛋白结合。随后，它被蛋白酶切割，以暴露出结合神经毡蛋白-1(NRP-1)的CRGDK/R，这有效地触发肿瘤渗透过程。iRGD的科学意义特别是源于它与NRP-1的结合，因为这会引发外渗。此外，iRGD特异性渗透到血管生成的血管和肿瘤组织中。由于这种新颖的递送系统和对正常细胞的低毒性，iRGD引起了广泛关注。参见,Yin,H.,Yang,J.,Zhang,Q.,Wang,H.,Xu,J.,Zheng,J."iRGD as a tumor-penetrating peptide forcancer therapy(Review)".Molecular Medicine Reports 15.5(2017):2925-2930。
在各种归巢装置中，含有NGR三肽序列的肽代表了选择性识别肿瘤细胞表面CD13受体同种型的有前景的方法。含有可特异性识别肿瘤细胞上的CD13受体同种型的NGR三肽基序的几种肽，已成功用于将各种化合物和化疗药物递送至肿瘤血管。参见，Tripodi,A.A.P.,I.,Biri-Kovács,B.等人In Vivo Tumor Growth Inhibition andAntiangiogenic Effect of Cyclic NGR Peptide-Daunorubicin Conjugates Developedfor Targeted Drug Delivery.Pathol.Oncol.Res.26,1879-1892(2020)。
2.6TGF-β显性负受体(TGF-βDNR)
TGF-β已成为几项旨在增强抗肿瘤免疫力的研究中的靶点。特别地，肿瘤微环境内的TGF-β信号传导可以用TGF-β显性负受体(TGF-βDNR，例如dnTGF-βRII)来靶向。TGF-βDNR可能会使免疫效应细胞(如CAR、TCR、cTCR或TAC转导的用THP装甲的T细胞)对TGF-β无应答。免疫效应细胞向肿瘤的归巢和浸润可能会增加，同时保护邻近的免疫细胞免受TGF-β的抑制作用。在一些实施例中，本文提供的免疫效应细胞被工程化以在TGF-β存在下保留细胞溶解活性。
在一些实施例中，本文提供的功能性外源受体用TGF-βDNR(例如，dnTGF-βRII)装甲。在一些实施例中，功能性外源受体选自由CAR、TCR、cTCR、TAC、和TAC样嵌合受体组成的组。在一些实施例中，功能性外源受体是CAR，如本文提供的CAR中任一种。在一些实施例中，功能性外源受体是cTCR，如本文提供的cTCR中任一种。在一些实施例中，TGF-βDNR直接与功能性外源受体融合。在一些实施例中，TGF-βDNR间接与功能性外源受体融合。在一些实施例中，TGF-βDNR与功能性外源受体的N末端融合。在一些实施例中，TGF-βDNR与功能性外源受体的C末端融合。
在一些实施例中，本文提供的功能性外源受体用TGF-βDNR(例如，dnTGF-βRII)和THP装甲。在一些实施例中，TGF-βDNR直接与THP融合。在一些实施例中，TGF-βDNR间接与THP融合。在一些实施例中，TGF-βDNR与THP的N末端融合。在一些实施例中，TGF-βDNR与THP的C末端融合。在一些实施例中，功能性外源受体选自由CAR、TCR、cTCR、TAC、和TAC样嵌合受体组成的组。在一些实施例中，功能性外源受体是CAR，如本文提供的CAR中任一种。在一些实施例中，功能性外源受体是cTCR，如本文提供的cTCR中任一种。在一些实施例中，THP是基于RGD的肽、基于NGR的肽或其组合。在一些实施例中，本文提供了用TGF-βDNR和THP装甲的CAR。在一些实施例中，CAR是抗DLL3 CAR。
在一些实施例中，抗DLL3 CAR用TGF-βDNR(例如，dnTGF-βRII)和RGD装甲。在一些实施例中，用TGF-βDNR和RGD装甲的抗DLL3 CAR从N末端到C末端包含：抗DLL3 CAR(SEQ IDNO:8)、CD28信号肽、RGD-4C(SEQ ID NO:2)、G4S接头和TGF-βDNR。在一些实施例中，用TGF-βDNR和RGD装甲的抗DLL3 CAR包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:52具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％、或99％中的任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施例中，抗DLL3 CAR用TGF-βDNR(例如，dnTGF-βRII)和RGD装甲。在一些实施例中，用TGF-βDNR和RGD装甲的抗DLL3 CAR从N末端到C末端包含：抗DLL3 CAR(SEQ IDNO:8)、CD5信号肽、RGD-4C(SEQ ID NO:2)、G4S接头和TGF-βDNR。在一些实施例中，用TGF-βDNR和RGD装甲的抗DLL3 CAR包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:53具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％、或99％中的任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施例中，抗DLL3 CAR用TGF-βDNR(例如，dnTGF-βRII)和NGR装甲。在一些实施例中，用TGF-βDNR和NGR装甲的抗DLL3 CAR从N末端到C末端包含：抗DLL3 CAR(SEQ IDNO:8)、CD28信号肽、NGR、G4S接头和TGF-βDNR。在一些实施例中，用TGF-βDNR和NGR装甲的抗DLL3 CAR包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:54具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％、或99％中的任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施例中，用TGF-βDNR和NGR装甲的抗DLL3 CAR从N末端到C末端包含：抗DLL3 CAR(SEQ ID NO:8)、TGF-βDNR、P2A、NGR(SEQ ID NO:38)、以及来自CD7的铰链结构域(SEQ ID NO:13)和跨膜结构域(SEQ ID NO:14)。在一些实施例中，用TGF-βDNR和NGR装甲的抗DLL3 CAR包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:55具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％、或99％中的任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施例中，用TGF-βDNR和NGR装甲的抗DLL3 CAR从N末端到C末端包含：抗DLL3 CAR(SEQ ID NO:8)、TGF-βDNR、P2A、NGR(SEQ ID NO:38)、Flag(SEQ ID NO:3)、以及来自CD7的铰链结构域(SEQ ID NO:13)和跨膜结构域(SEQ ID NO:14)。在一些实施例中，用TGF-βDNR和NGR装甲的抗DLL3CAR包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:56具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％、或99％中的任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施例中，用TGF-βDNR和NGR装甲的抗DLL3 CAR从N末端到C末端包含：抗DLL3 CAR(SEQ ID NO:8)、NGR(SEQ ID NO:38)、G4S接头、NGR(SEQ ID NO:38)、以及来自CD7的铰链结构域(SEQ ID NO:13)和跨膜结构域(SEQ ID NO:14)、T2A、和TGF-βDNR。在一些实施例中，用TGF-βDNR和NGR装甲的抗DLL3 CAR包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列、或与SEQ IDNO:57具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％、或99％中的任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施例中，用TGF-βDNR和NGR装甲的抗DLL3 CAR从N末端到C末端包含：抗DLL3 CAR(SEQ ID NO:8)、NGR(SEQ ID NO:38)、G4S接头、NGR(SEQ ID NO:38)、Flag(SEQ IDNO:3)、来自CD7的铰链结构域(SEQ ID NO:13)和跨膜结构域(SEQ ID NO:14)、T2A、和TGF-βDNR。在一些实施例中，用TGF-βDNR和NGR装甲的抗DLL3 CAR包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:58具有至少约95％(例如，至少约96％、97％、98％、或99％中的任一个)序列同一性的其变体。
2.7包含功能性外源受体和外源肿瘤归巢肽的多肽
在本披露的一方面，提供了包含功能性外源受体和外源THP的多肽。在一些实施例中，功能性外源受体是CAR、TCR、cTCR、TAC或TAC样嵌合受体。在一些实施例中，THP是RGD-肽和NGR-肽或其组合。在一些实施例中，THP是膜结合的。
在一些实施例中，包含功能性外源性受体和THP的多肽的功能性外源受体是CAR。在一些实施例中，多肽的功能性外源受体是CAR，该CAR包含：(i)胞外抗原结合结构域、(ii)跨膜结构域、和(iii)胞内信号传导结构域。在一些实施例中，CAR是抗DLL3 CAR、抗MSLNCAR或抗GPC2 CAR。
在一些实施例中，包含抗DLL3 CAR和THP的多肽的抗DLL3 CAR包含第一VHH抗体部分和第二VHH抗体部分，该第一VHH抗体部分包含：CDR1，该CDR1包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；CDR2，该CDR2包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；和CDR3，该CDR3包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；该第二VHH抗体部分包含：CDR1，该CDR1包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；CDR2，该CDR2包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；和CDR3，该CDR3包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体。在一些实施例中，所述第一VHH抗体部分和第二VHH抗体部分通过(G4S)n接头连接，其中该接头可以是任何适当的长度，例如n可以是1至20之间、优选3至12之间的任何整数，例如3、4、5、6、7、8、9、10和更大。
在一些实施例中，包含抗DLL3 CAR和THP的多肽的抗DLL3 CAR包含第一VHH抗体部分和第二VHH抗体部分，该第一VHH抗体部分包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列(即，AS63997VH5 VHH)或与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，该第二VHH抗体部分包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列(即，AS64380VH5 VHH)或与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，包含抗DLL3 CAR和THP的多肽的抗DLL3 CAR包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，包含功能性外源受体和THP的多肽的CAR是抗MSLN CAR。在一些实施例中，抗MSLN CAR包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列或与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，包含功能性外源受体和THP的多肽的CAR是抗GPC2CAR。在一些实施例中，抗GPC2 CAR包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列或与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，外源THP选自由基于精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的肽、基于天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(NGR)的肽及它们的组合组成的组。在一些实施例中，THP包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的RGD-4C肽。
在一些实施例中，THP与跨膜结构域融合。在一些实施例中，THP与跨膜结构域和铰链结构域融合。在一些实施例中，跨膜结构域和/或铰链结构域来自CD7、CD80、CD28、TR2或FasL。在一些实施例中，跨膜结构域和/或铰链结构域来自CD7。在一些实施例中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，并且铰链结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
在一些实施例中，THP与肽接头(如(GxS)n接头)融合，其中x和n独立地可以是1与20之间、优选3与12之间的整数，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更大。在一些实施例中，THP与(G4S)n接头融合，其中n如上文所定义。例如，在一些实施例中，THP与(G4S)3接头融合。在一些实施例中，THP与标签序列(如Flag标签)融合。在一些实施例中，THP(如RGD-4C肽)从N末端到C末端顺序地与Flag标签、(G4S)3接头、铰链区和跨膜结构域融合。跨膜结构域和铰链结构域各自独立地选自由CD7、CD8、CD80、CD28、TR2和FasL组成的组。优选地，跨膜结构域和铰链结构域来自CD7。
在一些实施例中，本披露的多肽从N末端到C末端包含抗DLL3 CAR、P2A自切割接头、前导肽(例如来自CD28)、RGD-4C、Flag、(G4S)3接头、铰链区和跨膜结构域。在一些实施例中，跨膜结构域和铰链结构域各自独立地选自由CD7、CD8、CD8α、CD80、TR2、CD28和FasL组成的组。优选地，跨膜结构域和铰链结构域来自CD7。
在一些实施例中，本披露的多肽从N末端到C末端包含抗DLL3 CAR、P2A自切割接头、跨膜结构域、铰链区、Flag标签、(G4S)3接头、和RGD-4C。在一些实施例中，跨膜结构域和铰链结构域各自独立地选自由CD7、CD8、CD8α、CD80、CD28、TR2和FasL组成的组。
在一些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:10、11、19、21-26、35、36、37、39-40、42、43、45、46、49、50和52-58中任一个所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10、11、19、21-26、35、36、37、39-40、42、43、45、46、49、50和52-58中任一个的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，多肽包含编码抗DLL3 CAR的氨基酸序列。在一些实施例中，抗DLL3 CAR包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含编码RGD-4C的氨基酸序列。在一些实施例中，RGD-4C包含SEQID NO:2中列出的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:26中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含编码NGR的氨基酸序列。在一些实施例中，NGR包含SEQ ID NO:38中列出的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:39中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，多肽包含编码TGF-β(例如，TGF-βDNR，如dnTGF-βRII)的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽进一步包含编码抗DLL3 CAR的氨基酸序列。在一些实施例中，抗DLL3 CAR包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含编码NGR的氨基酸序列。在一些实施例中，NGR包含SEQ IDNO:38中列出的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:54中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:55中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:56中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:57中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:57的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:58中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含编码RGD-4C的氨基酸序列。在一些实施例中，RGD-4C包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含SEQ IDNO:52中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:53中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，多肽包含编码抗MSLN CAR的氨基酸序列。在一些实施例中，抗MSLN CAR包含SEQ ID NO:41中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含编码RGD-4C的氨基酸序列。在一些实施例中，RGD-4C包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含编码NGR的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:42中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:42的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:43中列出的氨基酸序列或与SEQ IDNO:43的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，多肽包含编码抗GPC2 CAR的氨基酸序列。在一些实施例中，抗GPC2 CAR包含SEQ ID NO:44中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含编码RGD-4C的氨基酸序列。在一些实施例中，RGD-4C包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含编码NGR的氨基酸序列。在一些实施例中，NGR包含SEQ ID NO:38中列出的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含SEQID NO:45中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:46中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，多肽包含编码cTCR的氨基酸序列。在一些实施例中，cTCR是抗DLL3 cTCR、抗MSLN cTCR或抗GPC2 cTCR。在一些实施例中，cTCR是εTCR(即ε-TRuC)。在一些实施例中，ε-TRuC是抗DLL3ε-TRuC、抗MSLNε-TRuC或抗GPC2ε-TRuC。在一些实施例中，多肽进一步包含编码THP的氨基酸序列。在一些实施例中，THP是基于RGD的肽、基于NGR的肽或其组合。
在一些实施例中，多肽包含编码抗DLL3-ε-TRuC(即抗DLL3 cTCR，即抗DLL3εTCR)的氨基酸序列。在一些实施例中，抗DLL3-ε-TRuC包含SEQ ID NO:35中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:36中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:36的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:37中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，多肽包含编码单域抗体(sdAb)的氨基酸序列。在一些实施例中，sdAb是抗DLL3 sdAb、抗MSLN sdAb或抗GPC2 sdAb。在一些实施例中，多肽包含编码CD8α铰链结构域(例如SEQ ID NO:47)的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含编码CD8α跨膜结构域(例如SEQ ID NO:48)的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽进一步包含编码THP的氨基酸序列。在一些实施例中，THP是基于RGD的肽、基于NGR的肽或其组合。在一些实施例中，多肽包含编码RGD-4C的氨基酸序列。在一些实施例中，RGD-4C包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含编码NGR的氨基酸序列。在一些实施例中，NGR包含SEQID NO:38中列出的氨基酸序列。
在一些实施例中，多肽包含编码抗DLL3 sdAb的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:49中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包含SEQ ID NO:50中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
可以使用各种密码子优化技术从本文讨论的多肽获得优化的氨基酸序列。例如，可能需要改善抗原结合结构域或其他部分的结合亲和力和/或其他生物特性。氨基酸序列变体可通过将适当的修饰引入编码多肽的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。这样的修饰包括例如氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终的构建体，条件是最终的构建体具有所希望的特征，例如抗原结合或信号转换。
在一些实施例中，考虑了包含一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的抗体结合结构域部分或其他多肽部分。突变变化目标位点包括抗体结合域重链和轻链可变区(VR)和框架(FR)。可以将氨基酸取代引入目的结合结构域，并针对所希望的活性(例如保留/改善的抗原结合或降低的免疫原性)筛选产物。在某些实施例中，可将氨基酸取代引入一个或多个初级共刺激受体结构域(胞外或胞内)、次级共刺激受体结构域或胞外共受体结构域。
因此，本披露涵盖本文特别讨论的多肽以及与本文特别讨论的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽。当提及特定序列时，术语“相似性百分比”、“同一性百分比”和“同源性百分比”如威斯康星大学GCG软件程序BestFit中所示使用。可以使用其他算法，例如BLAST、psiBLAST或TBLASTN(其使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:405-410的方法)、FASTA(其使用Pearson和Lipman(1988)PNASUSA 85:2444-2448的方法)。
3.核酸
在一方面，本披露提供了编码本发明的多肽(如本文所述的任何多肽)的分离的核酸。
如本文所用，术语“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”旨在彼此同义。本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸可以编码相同的多肽。此外，应当理解，技术人员可以使用常规技术制造不影响由其中描述的多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映有待表达多肽的任何特定宿主生物体的密码子使用，例如密码子优化。根据本披露的核酸可以包含DNA或RNA。它们可以是单链的或双链的。它们也可以是多核苷酸，其中包括合成的或修饰的核苷酸。本领域已知许多不同类型的寡核苷酸修饰。这些修饰包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架、在分子的3'和/或5'末端添加吖啶或聚赖氨酸链。为了本披露的目的，应理解的是，多核苷酸可通过本领域可用的任何方法进行修饰。可进行这样的修饰以增强目的多核苷酸的体内活性或寿命。
核酸序列可以由允许两个或更多个核酸序列共表达的序列连接。例如，构建体可以包含内部启动子。可以使用例如另外的启动子、内部核糖体进入序列(IRES)序列或编码切割位点的序列，来通过一个多核苷酸表达多种多肽。切割位点可以是自切割的，这样当多肽产生时，它立即被切割成离散的蛋白质，而不需要任何外部切割活性。已知各种自切割位点，包括口蹄疫病毒(FMDV)和2A自切割肽(例如P2A、T2A)。共表达序列可以是内部核糖体进入序列(IRES)。共表达序列可以是内部启动子。
如本文所用，术语“可操作地连接的”和类似短语，当用于指核酸或氨基酸时，分别是指核酸序列或氨基酸序列的可操作连接，它们彼此处于功能关系。例如，可操作地连接的启动子、增强子元件、开放阅读框、5'和3'UTR以及终止子序列引起核酸分子(例如RNA)的准确产生。在一些实施例中，可操作地连接的核酸元件导致开放阅读框的转录并最终导致多肽的产生(即，开放阅读框的表达)。
4.载体
在本披露的另一方面，提供了包含根据本披露的分离的核酸的载体。
载体可用于将一个或多个核酸序列或一个或多个核酸构建体引入宿主细胞中，以使其表达根据本披露的一方面的一个或多个多肽，以及任选地一个或更多个其他目的蛋白(POI)。例如，载体可以是质粒或病毒载体(如逆转录病毒载体或慢病毒载体)或基于转座子的载体或合成mRNA。
衍生自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许一个或多个转基因的长期、稳定整合及其在子细胞中的繁殖。载体能够转染或转导淋巴细胞。
在一些实施例中，将本披露中讨论的核酸插入载体。两个核酸可以插入一个载体或两个分开的载体中。根据本披露的组合的表达可以通过将编码该组合的一个元件的核酸可操作地连接至启动子，并将编码该组合的其他元件的其他核酸可操作地连接至其他启动子并将构建体掺入一个或多个表达载体来实现。在一些实施例中，表达载体的遗传修饰策略用于使表达所述载体的工程化免疫细胞对敌对细胞环境具有抗性。例如，可以将编码信号转换器或显性负性受体的核酸可操作地连接至启动子，可以将编码功能性外源受体(如CAR、TCR、cTCR、TAC或TAC样嵌合受体)核酸连接到另一个启动子，然后将两个构建体掺入一个或两个表达载体中，并将该一个或两个载体引入免疫细胞(如T细胞)中用于表达。如本文所用，术语“信号转换器”是指将免疫细胞抑制信号转换成刺激信号的序列。示例性显性负性受体包括TGF-β，其是肿瘤广泛使用的免疫逃避策略，因为它促进肿瘤生长，同时显著抑制肿瘤特异性细胞免疫。实现这样的表达的另一种方法是将两种或多于两种的核酸置于一个启动子的控制下。用于表达目的蛋白质的各种方法在本领域技术人员的知识范围内。
另外的启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。典型地，这些位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，使得当元件相对于彼此反向或移动时能保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加至50bp。
这些载体可以适用于在真核细胞中复制和整合。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、启动序列、以及用于调控所希望的核酸序列的表达的启动子。病毒载体技术是本领域熟知的并且描述于例如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)，以及其他病毒学和分子生物学手册中，还参见WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。在一些实施例中，本披露的核酸构建体是包含两个启动子的多顺反子构建体。在一些实施例中，本披露的双启动子构建体是单向的。在其他实施例中，本披露的双启动子构建体是双向的。为了评估多肽的表达，要引入细胞的表达载体也可以含有可选择的标记基因或报道基因或同时包含可选择的标记基因和报道基因，以促进从寻求通过病毒载体转染或转导的细胞群中识别和选择表达细胞。
5.药物组合物
本文还提供了包含本文所述的免疫效应细胞(如T细胞)的免疫效应细胞组合物(如药物组合物，在本文中也称为配制品)。在一方面，本披露还提供了包含根据本披露的免疫效应细胞、多肽、核酸或载体的药物组合物。
在一些实施例中，提供了免疫效应细胞组合物，其包含相同细胞类型的免疫效应细胞(如工程化T细胞)的同质细胞群，并表达相同功能性外源受体和任选地相同THP。在一些实施例中，免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。在一些实施例中，免疫效应细胞是T细胞。在一些实施例中，免疫效应细胞是选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞组成的组。在一些实施例中，免疫效应细胞组合物是药物组合物。
在一些实施例中，药物组合物包含治疗上有效量的根据本披露的免疫效应细胞、多肽、核酸或载体以及药学上可接受的赋形剂。
在特定实施例中，术语“赋形剂”还可以指稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全或不完全))、载剂或媒介物。药物赋形剂可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐水溶液、右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体赋形剂。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以含有少量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释配制品等形式。合适的药物赋形剂的实例在Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.,Easton,PA中进行了描述。这样的组合物将含有预防或治疗有效量的本文提供的活性成分，诸如以纯化形式，以及合适量的赋形剂，以提供适合施用于患者的形式。配制品应适合于施用方式。
在一些实施例中，赋形剂的选择部分地由特定细胞、和/或通过施用方法决定。因此，存在多种合适的配制品。典型地，可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对受体无毒，并且包括缓冲剂、抗氧化剂，包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、焦亚硫酸钠；防腐剂、等渗剂、稳定剂、金属复合物(例如，Zn-蛋白复合物)；螯合剂，诸如EDTA和/或非离子表面活性剂。
施用途径根据已知的和可接受的方法，诸如通过单次或多次推注或以合适的方式长时间输注，例如，通过皮下、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、病灶内或关节内途径的注射或输注、局部施用、吸入或通过缓释或延释方式。
在一些实施例中，本文提供的药物组合物包含治疗或预防疾病或病症有效量的结合分子和/或细胞，诸如治疗有效量或预防有效量。在一些实施例中，治疗或预防功效通过定期评估治疗的受试者来监测。对于几天或更长的重复施用，取决于病状，重复进行治疗直至出现疾病症状的所需的遏制。然而，其他剂量方案可能是有用的并且可以确定。
在一些实施例中，药物组合物适用于施用于个体，如人类个体。在一些实施例中，药物组合物适用于注射。在一些实施例中，药物组合物适用于输注。在一些实施例中，药物组合物基本上不含细胞培养基。在一些实施例中，药物组合物基本上不含内毒素或过敏蛋白。在一些实施例中，“基本上不含”是小于药物组合物的总体积或重量的约10％、5％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、1ppm或更少中的任一个。在一些实施例中，药物组合物不含支原体、微生物剂和/或传染病病原。
本申请人的药物组合物可以包含任何数量的免疫效应细胞。在一些实施例中，药物组合物包含免疫效应细胞的单一拷贝。在一些实施例中，药物组合物包含至少约1、10、100、1000、104、105、106、107、108或更多个拷贝中任一个的免疫效应细胞。在一些实施例中，药物组合物包含免疫效应细胞的单一拷贝。在一些实施例中，药物组合物包含至少两种类型的免疫效应细胞，其中不同类型的免疫效应细胞的区别在于其细胞来源、细胞类型、表达的功能性外源受体、THP和/或启动子等。
在组合物制备过程中的各个点，冷冻保存细胞可能是必要的或有益的。术语“冷冻(frozen/freezing)”和“冷冻保存(cryopreserved/cryopreserving)”可互换使用。冷冻包括冷冻干燥。
在一些实施例中，可以从培养基中收获细胞，并以治疗有效量将其洗涤并浓缩到载剂中。示例性载剂包括盐水、缓冲盐水、生理盐水、水、汉克斯(Hanks')溶液、林格氏(Ringer's)溶液、Nonnosol-R(Abbott Labs)、血浆溶解液A(R)(Baxter Laboratories,Inc.,Morton Grove,IL)、甘油、乙醇、及它们的组合。
在一些实施例中，载剂可以补充有人血清白蛋白(HSA)或其他人血清组分或胎牛血清。在特定的实施例中，用于输注的载剂包括含有5％HAS或右旋糖的缓冲盐水。另外的等渗剂包括多羟糖醇，这些多羟糖醇包括三羟或更高级糖醇，如甘油(glycerin)、赤藓糖醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇或甘露醇。
载剂可以包括缓冲剂，如柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、富马酸盐缓冲剂、葡萄糖酸盐缓冲剂、草酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和/或三甲基胺盐。
稳定剂是指广泛的赋形剂，其功能范围从膨胀剂到有助于防止细胞粘附于容器壁的添加剂。典型的稳定剂可以包括多羟糖醇；氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸和苏氨酸；有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油和环多醇，如肌醇；PEG；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如脲、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即，<10个残基)；蛋白质如HSA、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；单糖如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖如棉子糖和多糖如葡聚糖。
如有必要或有益时，组合物可以包括局部麻醉剂(如利多卡因)以减轻注射部位的疼痛。
示例性防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯甲烃铵卤化物、氯化六甲铵、对羟基苯甲酸烷基酯(如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
组合物中细胞的治疗有效量可以是大于102个细胞、大于103个细胞、大于104个细胞、大于105个细胞、大于106个细胞、大于107个细胞、大于108个细胞、大于109个细胞、大于1010个细胞或大于1011个细胞(包括这些值之间的任何值和范围)。
在本文披露的组合物和配制品中，细胞的体积通常为一升或更少、500ml或更少、250ml或更少或100ml或更少。因此，施用的细胞密度典型地大于104个细胞/ml、107个细胞/ml或108个细胞/ml。
本文还提供了核酸组合物(例如药物组合物，本文也称为配制品)，其包含编码本文所述功能性外源受体、THP和/或TGF-β(例如TGF-βDNR，例如dnTGF-βRII)的任何多肽。在一些实施例中，核酸组合物是药物组合物。在一些实施例中，核酸组合物进一步包含等渗剂、赋形剂、稀释剂、增稠剂、稳定剂、缓冲剂和/或防腐剂中的任一种；和/或水性媒介物，如纯化水、糖水溶液、缓冲剂溶液、生理盐水、聚合物水溶液或无RNA酶的水。可以根据核酸组合物的使用形式来适当地选择待添加的这样的添加剂和水性媒介物的量。
本文披露的组合物和配制品可以通过例如注射、输液、灌注或灌洗来制备用于施用。组合物和配制品可以进一步配制用于骨髓、静脉内、皮内、动脉内、结内、淋巴管内、腹膜内、病灶内、前列腺内、阴道内、直肠内、局部、鞘内、肿瘤内、肌内、囊内和/或皮下注射。
用于体内施用的配制品必须是无菌的。这可以通过例如穿过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
6.赋形剂
本申请的药物组合物可用于治疗目的。因此，与包含免疫效应细胞(如表达功能性外源受体、THP和/或TGF-β(例如TGF-βDNR，如dnTGF-βRII)的生产细胞)的其他组合物不同，本申请的药物组合物包含适用于施用于个体的药学上可接受的赋形剂。
合适的药学上可接受的赋形剂可以包含缓冲剂，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂包含自体血清。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂包含人血清。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂是无毒的、生物相容的、非免疫原性的、可生物降解的，并且可以避免被宿主的防御机制识别。赋形剂还可以含有佐剂，如防腐稳定剂、润湿剂、乳化剂等。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂增强免疫效应细胞或其分泌的抗体或其他治疗蛋白的稳定性。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂减少由免疫效应细胞分泌的抗体或其他治疗蛋白的聚集。最终形式可以是无菌的，并且还可以容易地穿过注射装置，例如空心针。通过恰当地选择赋形剂可以实现和维持适当的粘度。
在一些实施例中，将药物组合物配制成具有约4.5至约9.0范围内的pH，包括例如约5.0至约8.0、约6.5至约7.5或约6.5至约7.0中的任一个的pH范围。在一些实施例中，还可以通过添加合适的张力改性剂(如甘油)使药物组合物与血液等渗。
在一些实施例中，药物组合物适用于施用于人。在一些实施例中，药物组合物适用于通过肠胃外施用来施用于人。适用于肠胃外施用的配制品包括水性和非水性等渗无菌注射溶液(其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使配制品与预期接受体的血液相容的溶质)，以及水性和非水性无菌悬浮液(其包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。配制品可以存在于单位剂量或多剂量密封容器(如安瓿和小瓶)中，并且可以在临使用前储存在仅需要添加用于注射的本文所述的治疗方法、施用方法和剂量方案的无菌液体赋形剂(即水)的条件下。在一些实施例中，药物组合物包含在单次使用的小瓶(如单次使用的密封小瓶)中。在一些实施例中，药物组合物包含在多次使用的小瓶中。在一些实施例中，药物组合物以散装包含在容器中。在一些实施例中，将药物组合物冷冻保存。
在一些实施例中，将药物组合物配制成用于静脉内施用。在一些实施例中，将药物组合物配制成用于皮下施用。在一些实施例中，将药物组合物配制用于对肿瘤部位进行局部施用。在一些实施例中，将药物组合物配制用于瘤内注射。
在一些实施例中，药物组合物必须满足用于向个体施用的某些标准。例如，美国食品与药品管理局已经发布了为基于细胞的免疫治疗产品设定标准的监管指南，包括21CFR610和21CFR 610.13。本领域已知评估药物组合物的外观、特性、纯度、安全性和/或效力的方法。在一些实施例中，药物组合物基本上不含能够产生过敏作用的外来蛋白质，例如细胞培养中使用的除工程化哺乳动物免疫细胞之外的动物来源的蛋白质。在一些实施例中，“基本上不含”是小于药物组合物的总体积或重量的约10％、5％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、1ppm或更少中的任一个。在一些实施例中，药物组合物在GMP级工作间(GMP-levelworkshop)中制备。在一些实施例中，对于肠胃外施用，药物组合物包含小于约5EU/kg体重/小时的内毒素。在一些实施例中，对于静脉内施用，药物组合物中至少约70％的工程化免疫细胞是活的。在一些实施例中，当使用如美国药典(USP)中所述的14天直接接种测试方法评估时，药物组合物具有“无生长”结果。在一些实施例中，在施用药物组合物之前，同时包括工程化免疫细胞和药学上可接受的赋形剂的样品应在最终收获前约48-72小时(或与培养物的最后再补料(re-feeding)同时)取出用于无菌测试。在一些实施例中，药物组合物不含支原体污染。在一些实施例中，药物组合物不含可检测的微生物剂。在一些实施例中，药物组合物不含传染病病原，如HIV I型、HIV II型、HBV、HCV、人嗜T淋巴细胞病毒I型；和人嗜T淋巴细胞病毒II型。
7.制备方法
工程化免疫效应细胞可以通过将本文提供的一种或多种多肽引入免疫效应细胞如T细胞来制备。在一些实施例中，通过转移任何一种分离的核酸或任何一种本文所述载体将多肽引入免疫效应细胞。将载体或分离的核酸引入哺乳动物细胞的方法是本领域熟知的。例如，所述的载体可以通过物理、化学或生物方法转移到免疫效应细胞中。
因此，根据一方面，本披露提供了制造本发明的工程化免疫效应细胞的方法，该方法包括向免疫效应细胞中引入：本披露的核酸或载体，或包含各自编码功能性外源受体和外源肿瘤归巢肽(THP)的两种核酸的组合物。
7.1T细胞来源
在一些实施例中，在对T细胞进行扩增和遗传修饰之前，从受试者获得T细胞来源。T细胞可以获得自许多来源，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施例中，可以使用本领域可用的多种T细胞系。在一些实施例中，可以使用本领域技术人员已知的多种技术(例如，FicollTM分离)来从受试者收集的血液单位中获得T细胞。在一些实施例中，来自个体循环血的细胞是通过单采(apheresis)获得的。单采产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施例中，可以洗涤通过单采收集的细胞以除去血浆部分，并将细胞置于适当的缓冲剂或培养基中用于后续处理步骤。在一些实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施例中，洗涤溶液缺乏钙，并且可能缺乏镁，或可能缺乏许多(如果不是全部)二价阳离子。在不存在钙的情况下的初始活化步骤可以导致放大的活化。本领域的普通技术人员很容易理解，洗涤步骤可以通过本领域已知的方法完成，如根据制造商的说明使用半自动化“流动”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲剂中，如例如，无Ca2+、无Mg2+的PBS，血浆溶解物A或者含或不含缓冲剂的其他盐水溶液。替代性地，可以除去单采样品的不良组分，并将细胞直接重悬浮于培养基中。
在一些实施例中，通过例如，通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析来裂解红细胞并且消耗单核细胞来从外周血淋巴细胞分离T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一些实施例中，通过与抗CD3/抗CD28(即，3×28)缀合的珠(如M-450CD3/CD28 T)孵育足以对所需的T细胞进行阳性选择的一段时间而分离T细胞。在一些实施例中，该时间段为约30分钟。在另一个实施例中，该时间段为30分钟至36小时或更长以及其间的所有整数值。在另一个实施例中，该时间段为至少1、2、3、4、5或6小时。在一些实施例中，该时间段为10到24小时。在一些实施例中，该孵育时间段为24小时。对于白血病患者的T细胞的分离，使用较长的孵育时间(如24小时)可以增加细胞产量。与其他细胞类型相比，在T细胞较少的任何情况下，如在从肿瘤组织或免疫受损个体中分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的情况下，可以使用较长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用较长的孵育时间可以增加CD8+T细胞的捕获效率。因此，在一些实施例中，通过简单地缩短或延长允许T细胞与CD3/CD28珠结合的时间和/或增加或减少珠与T细胞的比率，可以在培养开始时或在培养过程中的其他时间点优先选择或不选择T细胞的亚群。另外地，通过增加或减小珠或其他表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以在培养开始时或其他所需的时间点优先选择或不选择T细胞的亚群。本领域的技术人员会认识到，也可以使用多轮选择。在一些实施例中，可能希望进行选择程序，并在活化和扩增过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可以进行进一轮的选择。
通过阴性选择富集T细胞群可以通过结合针对阴性选择细胞特有的表面标记的抗体来实现。一种方法是通过负免疫磁性粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该方法使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物典型地包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施例中，可能希望富集或阳性选择典型地表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。替代性地，在某些实施例中，通过抗C25缀合的珠或其他类似的选择方法消耗T调节性细胞。
为了通过阳性或阴性选择而分离所需的细胞群，可以改变细胞和表面(例如，粒子(如珠))的浓度。在某些实施例中，可能希望显著减少珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施例中，使用20亿个细胞/mL的浓度。在一个实施例中，使用10亿个细胞/mL的浓度。在另一个实施例中，使用大于1亿个细胞/mL。在另一个实施例中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/mL的细胞浓度。在又一实施例中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/mL的细胞浓度。在其他实施例中，可以使用1.25或1.50亿个细胞/mL的浓度。使用高浓度可导致细胞产量、细胞活化和细胞扩增增加。此外，使用高浓度的细胞可允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)、或来自存在许多肿瘤细胞的样品(即，白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。这样的细胞群可能具有治疗价值，并且期望能够获得。在一些实施例中，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施例中，可能需要使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒，如珠)的混合物，使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这选择了表达大量结合颗粒的所需抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达更高水平的CD28，并且比稀释浓度的CD8+T细胞更有效地被捕获。在一些实施例中，使用的细胞的浓度为5×106个/mL。在一些实施例中，使用的浓度可以为约1×105/mL至1×106/mL，以及介于两者之间的任何整数值。
在一些实施例中，细胞可以在旋转器上以不同的速度在2℃-10℃或在室温下孵育不同的时间长度。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不受理论的束缚，冷冻和随后的解冻步骤可以通过去除细胞群中的粒细胞和在某种程度上去除单核细胞来提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数在本领域中是已知的并且在这种情况下是有用的，但是一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO，或31.25％血浆溶解物-A(plasmalyte-A)、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有例如Hespan和血浆溶解物A的其他合适的细胞冷冻培养基。然后将细胞以1℃每分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储存罐的气相中。可以使用其他受控冷冻方法以及立即在-20℃或在液氮中的不受控冷冻。
在一些实施例中，如本文所述将冷冻保存的细胞解冻和洗涤，并在活化前在室温下静置一小时。
在本披露中还考虑了在可能需要如本文所述的扩增的细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采产物。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩增的细胞来源，并分离和冷冻所需的细胞，诸如T细胞，以随后在T细胞疗法中用于将受益于T细胞疗法的多种疾病或病状，诸如本文所述的那些。在一个实施例中，血液样品或单采血液成分取自一般健康受试者。在某些实施例中，血液样品或单采血液成分取自处于患疾病风险但尚未患疾病的一般健康受试者，并且分离并冷冻目的细胞以备后用。在某些实施例中，T细胞可以扩增、冷冻并在以后使用。在某些实施例中，在诊断如本文所述的特定疾病之后不久但在任何治疗之前从患者收集样品。在另一个实施例中，在多种相关治疗模式之前从受试者的血液样品或单采血液成分分离细胞，这些相关治疗模式包括但不限于用药剂诸如那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、抗病毒剂、化学疗法、辐射、免疫抑制剂(诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体或其他免疫清除剂(immunoablativeagent)(诸如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺(cytoxan)、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228)和辐射进行治疗。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导很重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人.,Cell 66:807-815(1991)；Henderson等人,Immun 73:316-321(1991)；Bierer等人,Curr.Opin.Immun.5:763-773(1993))。在另一个实施例中，分离患者的细胞并将其冷冻以供随后与骨髓或干细胞移植、使用化学治疗剂(诸如氟达拉滨)的T细胞清除疗法、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体(诸如OKT3或CAMPATH)结合使用(例如，之前、同时或之后)。在另一实施例中，在B细胞清除疗法(如与CD20反应的药剂，如利妥昔单抗(Rituxan))之前分离细胞，并可冷冻用于以后治疗使用。
在一些实施例中，在治疗之后直接从患者中获得T细胞。在这方面，已经观察到，在某些癌症治疗后，特别是用损害免疫系统的药物治疗后，在当患者通常从治疗中恢复的时期，治疗后不久，获得的T细胞的质量可能是最佳的，或改善其离体扩增的能力。同样，在使用本文所述方法进行离体操作后，这些细胞可以处于增强植入和体内扩增的优选状态。因此，在本披露的上下文中预期在该恢复阶段收集血细胞，包括T细胞、树突细胞、或其他造血系的细胞。此外，在某些实施例中，动员(例如，用GM-CSF动员)和调理方案可用于在受试者中创造条件，其中特别是在治疗后定义的时间窗口期间，有利于细胞类型的再填充、再循环、再生和/或扩增。说明性的细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞、和免疫系统的其他细胞。
7.2T细胞的活化和扩增
在一些实施例中，在用本文所述的CAR、TCR、cTCR、TAC、TAC样嵌合受体、CAR和THP、TCR和THP、cTCR和THP、TAC和THP、TAC样嵌合受体和THP或它们的组合对T细胞进行遗传修饰之前或之后，T细胞通常可以使用例如如下所述的方法来激活和扩增：美国专利号6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041，和美国专利申请公开号20060121005。
通常，可以通过与附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的药剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触来扩增T细胞。特别地，可以如本文所述诸如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体接触，或通过与结合有钙离子载体的蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑素)接触来刺激T细胞群。为了共刺激T细胞表面的辅助分子，可使用结合辅助分子的配体。例如，在适合刺激T细胞增殖的条件下，可以将T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD3抗体的实例包括UCHT1、OKT3、HIT3a(BioLegend,San Diego,US)，可以如本领域公知的其他方法那样使用(Graves J等人,J.Immunol.146:2102(1991)；Li B,等人.,Immunology 116:487(2005)；Rivollier A,等人,Blood 104:4029(2004))。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)，可以如本领域公知的其他方法那样使用(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977(1998)；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328(1999)；Garland等人,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63(1999))。
在一些实施例中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以通过不同的方案提供。例如，提供每个信号的药剂可以在溶液中或与表面偶联。当与表面偶联时，药剂可以与同一表面偶联(即，以“顺式”形式)或与单独的表面偶联(即，以“反式”形式)。替代性地，一种药剂可以在溶液中与表面和另一种药剂偶联。在一个实施例中，提供共刺激信号的药剂与细胞表面结合，提供初级活化信号的药剂在溶液中或与表面偶联。在某些实施例中，两种药剂都可以在溶液中。在另一实施例中，药剂可以是可溶形式，然后交联到表面，诸如表达Fc受体的细胞或将与这些药剂结合的抗体或其他结合剂。在这方面，参见例如美国专利申请公开号20040101519和20060034810的人工抗原呈递细胞(aAPC)，它们在本披露的某些实施例中被考虑用于活化和扩增T细胞。
在一些实施例中，将T细胞与药剂包被的珠组合，随后分离珠和细胞，然后培养细胞。在一个替代性的实施例中，在培养之前，不分离药剂包被的珠和细胞，而是将它们一起培养。在另一个实施例中，首先通过施加力诸如磁力来浓缩珠和细胞，导致细胞表面标记的连接增加，从而诱导细胞刺激。
例如，细胞表面蛋白可以通过允许附着有抗CD3和抗CD28的顺磁珠(3×28珠)接触T细胞来连接。在一个实施例中，将细胞(例如，104至4×108个T细胞)和珠(例如，推荐滴度为1:100的抗CD3/CD28 MACSiBead颗粒)组合在缓冲剂中，优选PBS(不含二价阳离子，诸如钙和镁)。本领域普通技术人员可以容易地理解，可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可能非常少，并且仅占样品的0.01％，或者整个样品(即100％)可以包含目的靶细胞。因此，任何细胞数目都在本披露的范围内。在某些实施例中，可能希望显著减少颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施例中，使用约20亿个细胞/mL的浓度。在另一实施例中，使用大于1亿个细胞/mL。在另一个实施例中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/mL的细胞浓度。在又一实施例中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/mL的细胞浓度。在其他实施例中，可以使用1.25或1.50亿个细胞/mL的浓度。使用高浓度可导致细胞产量、细胞活化和细胞扩增增加。此外，使用高细胞浓度可以允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞，诸如CD28阴性T细胞。这样的细胞群可以具有治疗价值，并且在某些实施例中期望能够获得。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱的CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施例中，混合物可以培养数小时(约3小时)至约14天或两者之间的任何小时整数值。在另一实施例中，混合物可以培养21天。在一个实施例中，珠和T细胞一起培养约八天。在另一实施例中，珠和T细胞一起培养2-3天。还可能需要几个刺激周期，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适于T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如，最低限度必需培养基、RPMI培养基1640或X-vivo15(Lonza))，其可以含有增殖和活力所必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF-β和TNF-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。其他用于细胞生长的添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂，诸如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、优化剂，添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或足以使T细胞生长和扩增的一定量细胞因子。抗生素(例如青霉素和链霉素)仅包含在实验培养物中，而不包含在待输注到受试者体内的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％CO2)。已经暴露于不同刺激时间的T细胞可以表现出不同的特征。例如，典型的血液或单采血液成分的外周血单个核细胞产物具有比细胞毒性或抑制性T细胞群(TC、CD8)更多的辅助T细胞群(TH、CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体进行的T细胞离体扩增产生T细胞群，该T细胞群在约第8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约第8-9天之后，T细胞群包含越来越多的TC细胞群。因此，根据治疗目的，用主要包含TH细胞的T细胞群输注受试者可能是有利的。类似地，如果分离了TC细胞的抗原特异性亚群，则在更大程度上扩增该亚群可能是有益的。
此外，除了CD4和CD8标记之外，其他表型标记也有显著差异，但在很大程度上，在细胞扩增过程中可再现。因此，这样的再现性使得能够为特定目的定制活化的T细胞产品。
基于病毒和非病毒的遗传工程工具可用于生成CAR-T细胞，如本文所述的任何CAR-T细胞(例如，表达CAR和THP的T细胞)、表达本文所述的其他功能性外源受体的T细胞(例如，表达TCR、cTCR、TAC、TAC样嵌合受体的T细胞、表达TCR和THP的T细胞、表达cTCR和THP的T细胞、表达TAC和THP的T细胞、表达TAC样嵌合受体和THP的T细胞或它们的组合)，导致治疗基因的永久或瞬时表达。基于逆转录病毒的基因递送是成熟的、特征明确的技术，该技术已被用于将CAR永久整合到宿主细胞基因组中(Scholler J.,等人Decade-long safetyand function of retroviral-modified chimeric antigen receptor Tcells.Sci.Transl.Med.2012；4:132ra53；Rosenberg S.A.等人,Gene transfer intohumans—immunotherapy of patients with advanced melanoma,using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral genetransduction.N.Engl.J.Med.1990；323:570-578)。
也可以使用非病毒DNA转染方法。例如，Singh等人描述了为工程化CAR T细胞而开发的睡美人(Sleeping Beauty(SB))转座子系统的用途(Singh H.,等人,Redirectingspecificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beautysystem.Cancer Res.2008；68:2961-2971)，并正在临床试验中使用(参见例如，ClinicalTrials.gov:NCT00968760和NCT01653717)。相同的技术可应用于根据本披露的工程化T细胞等。
8治疗方法和应用
在一方面，本披露提供了用于在受试者中治疗疾病的方法，该方法包括向该受试者施用本文所述的工程化免疫效应细胞或药物组合物，其中该疾病选自由以下组成的组：癌症、感染性疾病、炎症、免疫相关疾病及它们的组合。
在另一方面，本文提供用于使用本文提供的工程化细胞的方法和这些细胞的用途，例如CAR-T细胞，如本文所述的任何CAR-T细胞(例如，表达CAR和THP的T细胞)、表达本文所述的其他功能性外源受体的T细胞(例如，表达TCR、cTCR、TAC、TAC样嵌合受体的T细胞、表达TCR和THP的T细胞、表达cTCR和THP的T细胞、表达TAC和THP的T细胞、表达TAC样嵌合受体和THP的T细胞或它们的组合)。这样的方法和用途包括治疗方法和用途，例如，涉及将细胞或含有细胞的组合物施用于患有疾病或病症的受试者。在一些实施例中，细胞以有效量施用以实现疾病或病症的治疗。用途包括细胞在这样的方法和治疗中的用途，以及在制备药物以进行这些治疗方法中的用途。在一些实施例中，这些方法通过将细胞或包含这些细胞的组合物施用于患有或怀疑患有疾病或病状的受试者来进行。在一些实施例中，这些方法由此治疗受试者的疾病或病症。
在一些实施例中，本文提供的治疗导致疾病或病症或与其相关的症状、副作用或结果或表型的完全或部分改善或减少。治疗的理想效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。这些术语包括但不暗示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结果的一个或多个影响。
如本文所用，在一些实施例中，本文提供的治疗延迟疾病或病症的发展，例如，延缓、阻碍、减缓、阻滞、稳定、抑制和/或推迟疾病(诸如癌症)的发展。该延迟可以具有不同的时间长度，其取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。如本领域技术人员显而易见的，充分或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体没有患上疾病或病症。例如，可能延迟晚期癌症(例如转移的发展)。在其他实施例中，本文提供的方法或用途预防疾病或病症。
在一些实施例中，本发明细胞疗法用于治疗实体瘤癌症。在其他实施例中，本发明细胞疗法用于治疗血液癌症。在其他实施例中，疾病或病症是自身免疫性和炎症性疾病。在其他实施例中，疾病或病症是感染性疾病。在一些实施例中，本发明的细胞疗法包含含有T细胞的疗法，这些T细胞表达本文所述的各种CAR、TCR、cTCR、TAC、TAC样嵌合受体、CAR和THP、TCR和THP、cTCR和THP、TAC和THP、TAC样嵌合受体和THP或它们的组合。
在一些实施例中，疾病或病症选自由以下组成的组：膀胱癌、脑癌、乳腺癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、结直肠癌、食道癌、肝细胞癌、淋巴母细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T细胞或B细胞来源的淋巴细胞恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌和脾脏癌。在一些实施例中，疾病或病症是展现出神经内分泌特征的肿瘤，如小细胞肺癌(SCLC)、卵巢癌(OC)或神经母细胞瘤(NBL)。
在一些实施例中，疾病或病症是与DLL3相关的癌症，如表达DLL3的癌症。在一些实施例中，抗DLL3功能性外源受体(例如，CAR、TCR、cTCR、TAC、TAC样受体或它们的组合)与表达DLL3的细胞(例如，癌细胞)特异性结合。在一些实施例中，抗DLL3 CAR(如本文所述的任何抗DLL3 CAR)与表达DLL3的细胞(例如，癌细胞)特异性结合。在一些实施例中，抗DLL3cTCR(如本文所述的任何抗DLL3 cTCR)与表达DLL3的细胞(例如，癌细胞)特异性结合。
在一些实施例中，疾病或病症是与MSLN相关的癌症，如表达MSLN的癌症。在一些实施例中，抗MSLN功能性外源受体(例如，CAR、TCR、cTCR、TAC、TAC样受体或它们的组合)与表达MSLN的细胞(例如，癌细胞)特异性结合。在一些实施例中，抗MSLN CAR(如本文所述的任何抗MSLN CAR)与表达MSLN的细胞(例如，癌细胞)特异性结合。
在一些实施例中，疾病或病症是与GPC2相关的癌症，如表达GPC2的癌症。在一些实施例中，抗GPC2功能性外源受体(例如，CAR、TCR、cTCR、TAC、TAC样受体或它们的组合)与表达GPC2的细胞(例如，癌细胞)特异性结合。在一些实施例中，抗GPC2 CAR(如本文所述的任何抗GPC2 CAR)与表达GPC2的细胞(例如，癌细胞)特异性结合。
在一些实施例中，疾病或病症是血液癌症，诸如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施例中，癌症选自由以下组成的组：霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、皮肤B细胞淋巴瘤、活化B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡中心性淋巴瘤、转化淋巴瘤、中度分化淋巴细胞性淋巴瘤、中间淋巴细胞性淋巴瘤(ILL)、弥漫性低分化淋巴细胞性淋巴瘤(PDL)、中心细胞淋巴瘤、弥漫性小裂解细胞淋巴瘤(DSCCL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、皮肤T细胞淋巴瘤、外套层淋巴瘤、低级别滤泡性淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性T细胞白血病、急性髓系白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性巨核细胞白血病、前体B急性淋巴母细胞性白血病、前体T急性淋巴母细胞性白血病、伯基特白血病(Burkitt’s leukemia)(伯基特淋巴瘤)、急性双表型白血病、慢性骨髓性淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病(CML)和慢性单核细胞白血病。在特定实施例中，疾病或病症是骨髓增生异常综合征(MDS)。在另一特定实施例中，疾病或病症是急性髓系白血病(AML)。在另一特定实施例中，疾病或病症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在又一特定实施例中，疾病或病症是多发性骨髓瘤(MM)。
在其他实施例中，疾病或病症是实体瘤癌症。在一些实施例中，实体瘤癌症选自由以下组成的组：癌、腺癌、肾上腺皮质癌、结肠腺癌、结直肠腺癌、结直肠癌、导管细胞癌、肺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌、肝癌和肺癌。
在一些实施例中，疾病或病症是由病原体引起的。在一些实施例中，病原体引起感染性疾病。在一些实施例中，病原体是细菌。在一些实施例中，病原体是寄生虫。在一些实施例中，病原体是病毒。
在其他实施例中，疾病或病症是免疫性或自身免疫性病症。在一些实施例中，疾病或病症是炎症性疾病。炎症在宿主防御和免疫介导疾病的进展中起着重要作用。炎症反应是对损伤(例如，创伤、缺血和外来颗粒)和感染(例如，细菌或病毒感染)的反应，通过包括化学介质(例如，细胞因子和前列腺素)和炎症细胞(例如，白细胞)在内的复杂级联事件而启动的。炎症反应的特点是血流量增加、毛细血管通透性增加和吞噬细胞的大量涌入。这些事件导致受伤或感染部位肿胀、发红、发热(热模式改变)和脓形成。
用于过继细胞疗法的细胞施用方法是已知的，如例如，在以下中所述：美国专利申请公开号2003/0170238；美国专利号4,690,915；Rosenberg,Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85(2011)；Themeli等人,Nat Biotechnol.31(10):928-933(2013)；Tsukahara等人,Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9(2013)；及Davila等人,PLoS ONE 8(4):e61338(2013)。这些方法可以与本文提供的方法和组合物结合使用。
在一些实施例中，细胞疗法(例如过继T细胞疗法)通过自体转移进行，其中细胞从待接受细胞疗法的受试者或衍生自这样的受试者的样品分离和/或以其他方式制备。因此，在一些方面，细胞衍生自需要治疗的受试者，并且在分离和处理后，将细胞施用于同一受试者。在其他实施例中，细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过同种异体转移进行，其中细胞从待接受或最终接受细胞疗法的受试者之外的受试者(例如第一受试者)分离和/或以其他方式制备。在这样的实施例中，然后将细胞施用于相同物种的不同受试者，例如，第二受试者。在一些实施例中，第一受试者和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施例中，第一受试者和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施例中，第二受试者表达与第一受试者相同的HLA类型或超型。
在一些实施例中，施用细胞、细胞群或组合物的受试者是灵长类动物，诸如人。受试者可以是男性或女性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、幼年、青少年、成人和老年受试者。在一些实例中，受试者是用于疾病、过继细胞疗法和/或用于评估毒性结果的经过验证的动物模型。
本文提供的组合物可以通过任何合适的方式施用，例如通过注射，例如静脉内注射或皮下注射。在一些实施例中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内施用，并且如果需要局部治疗，则通过病灶内施用。
有效预防和/或治疗疾病或病状的本文提供的预防剂或治疗剂的量可以通过标准临床技术确定。有效剂量可以从得自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推。对于疾病的预防或治疗，结合分子或细胞的适当剂量可以取决于待治疗的疾病或病症的类型、结合分子的类型、疾病或病症的严重程度和病程、施用治疗剂是否用于预防或治疗目的、先前疗法、患者的临床病史和对药剂的反应，以及主治医师的判断。在一些实施例中，组合物、分子和细胞在一次或在一系列治疗中适当地施用于患者。可以间歇地施用多个剂量。可以施用初始较高的负荷剂量，随后施用一个或多个较低的剂量。
在遗传工程化细胞的上下文中，在一些实施例中，可以向受试者施用约一百万至约1千亿个细胞和/或每千克体重该量的细胞。在一些实施例中，其中该药物组合物包含本文所述的工程化免疫细胞中任一个，该药物组合物以至少约104、105、106、107、108、或109个细胞/kg个体体重中任一的剂量施用。剂量可以根据疾病或病症和/或患者和/或其他治疗的特定属性而变化。
在一些实施例中，施用一次药物组合物。在一些实施例中，施用多次(例如2、3、4、5、6或更多次中的任一个)药物组合物。在一些实施例中，药物组合物在给药周期中施用一次或多次。给药周期可以是例如1、2、3、4、5或更多周，或1、2、3、4、5或更多个月。针对特定患者的最佳剂量和治疗方案可以由医学领域的技术人员通过监测患者的疾病体征并相应地调整治疗来确定。
在一些实施例中，本文提供的组合物作为组合治疗的一部分施用，诸如与另一种治疗干预(诸如另一种抗体或工程化细胞或受体或药剂，诸如细胞毒性剂或治疗剂)同时或以任何顺序依次施用。
在某些实施例中，在将细胞施用于哺乳动物(例如，人)后，通过多种已知方法中的任一种测量工程化细胞群的生物活性。评估的参数包括体内(例如，通过成像)或离体(例如，通过ELISA或流式细胞术)工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合。在某些实施例中，工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用本领域已知的任何合适的方法来测量，诸如在例如Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)以及Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)中描述的细胞毒性测定法。在某些实施例中，细胞的生物活性还可以通过测定某些细胞因子诸如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF的表达和/或分泌来测量。在一些方面，生物活性通过评估临床结果诸如肿瘤负荷或负荷的减少来测量。
9套件(试剂盒)和制品
还提供了包含本文所述的工程化免疫效应细胞中任一种的套件、单位剂量和制品。在一些实施例中，提供了含有本文所述的药物组合物中的任一种的套件，并且优选提供了其使用说明书。
本申请的套件在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、软质包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。套件可以任选地提供另外的组分，如缓冲剂和解释信息。因此本申请还提供了制品，其包括小瓶(如密封的小瓶)、瓶、罐子、柔性包装等。
制品可以包含容器和该容器上或与该容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如，瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)形成。通常，容器容纳有效治疗本文所述的疾病或病症(例如，癌症)的组合物，并且可具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装插页指示组合物用于治疗个体的特定病状。标签或包装插页将进一步包含用于将组合物施用于个体的说明书。标签可指示用于重构和/或使用的指导。容纳药物组合物的容器可以是多次使用的小瓶，其允许重复施用(例如，2-6次施用)重构配制品。包装插页是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，这些说明书含有关于使用这样的治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。另外地，制品可进一步包含第二容器，该容器包含药学上可接受的缓冲剂，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。其可以进一步包括从商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
套件或制品可包括多个单位剂量的药物组合物和使用说明书，其包装的数量足以在药房(例如，医院药房和配药药房)中储存和使用。
为简明起见，本文使用了某些缩写。一个实例是表示氨基酸残基的单字母缩写。氨基酸及其相应的三字母和单字母缩写如下：
丙氨酸 Ala (A)
精氨酸 Arg (R)
天冬酰胺 Asn (N)
天冬氨酸 Asp (D)
半胱氨酸 Cys (C)
谷氨酸 Glu (E)
谷氨酰胺 Gln (Q)
甘氨酸 Gly (G)
组氨酸 His (H)
异亮氨酸 Ile (I)
亮氨酸 Leu (L)
赖氨酸 Lys (K)
甲硫氨酸 Met (M)
苯丙氨酸 Phe (F)
脯氨酸 Pro (P)
丝氨酸 Ser (S)
苏氨酸 Thr (T)
色氨酸 Trp (W)
酪氨酸 Tyr (Y)
缬氨酸 Val (V)
已经描述了本披露的多个实施例。然而，应当理解，在不脱离本披露的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，以下实例旨在说明而非限制权利要求中描述的披露范围。
实例
本文所述的实例不意欲表示以下实验均进行或只进行这些实验。尽管已经努力确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另外指示，否则份为重量份，分子量为重量平均分子量，温度为摄氏度，并且压力为大气压或接近大气压。
实例1：用膜结合精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)融合蛋白装甲的CAR和CAR-T细胞的生成
mbRGD装甲的CAR构建体的克隆
为了增强T细胞向肿瘤的归巢和浸润，将肿瘤归巢肽与跨膜结构域融合，并以膜结合形式发挥作用，使其能够锚定在T细胞膜上。
首先，我们设计了几种包含CD28的铰链和跨膜结构域的膜结合形式的RGD(mbRGD)，并将其用作对DLL3特异性CAR-T细胞的装甲。mbRGD装甲的CAR中的一个由DLL3-CAR(SEQ ID NO:8)、P2A(SEQ ID NO:9)、CD28的前导肽(SEQ ID NO:1)、RGD-4C肽(SEQ IDNO:2)、Flag标签(SEQ ID NO:3)、(G4S)3接头、CD28铰链区(SEQ ID NO:4)和CD28的跨膜结构域(SEQ ID NO:5)组成。该构建体被命名为DLL3-RGD-Flag-CD28(SEQ ID NO:10)。mbRGD装甲的CAR中的另一个由DLL3-CAR(SEQ ID NO:8)、P2A(SEQ ID NO:9)、CD28的前导肽(SEQID NO:1)、RGD-4C肽(SEQ ID NO:2)、Flag标签(SEQ ID NO:3)、(G4S)3接头、FasL铰链区(SEQ ID NO:6)和FasL的跨膜结构域(SEQ ID NO:7)组成。该构建体被命名为DLL3-FasL-Flag-RGD(SEQ ID NO:11)。表1中显示了相关元件和CAR的序列。
表1 mbRGD装甲的CAR的模式和序列
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mbRGD装甲的CAR-T细胞的生成
1.慢病毒的制备
编码如上所述的RGD装甲的DLL3-CAR的序列由GenScript进行密码子优化和合成。然后通过标准分子克隆方法将序列掺入到第二代慢病毒载体中。所有质粒序列均通过测序验证。然后将质粒与慢病毒包装质粒共转染到HEK293细胞中，以产生慢病毒。从上清液中收集病毒颗粒，并通过PEG沉淀或超速离心进行浓缩。将浓缩的慢病毒颗粒用于转导T细胞。
2.T细胞转导
使用pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,130096535)从健康供体PBMC(HemaCare)中分离T细胞。分离的T细胞在含有5％FBS(Gibco,10099141)的AIMV(Gibco,31035025)培养基中培养，并在37℃、5％CO2培养箱中以2:1的比率由CD3/CD28活化珠(Miltenyi Biotec,130091442)进一步活化。在初始活化后48或72小时，在8μg/ml聚凝胺(SIGMA-ALDRICH,H9268-10G)的存在下，用表达DLL3靶向CAR的慢病毒以合适的感染复数(MOI)转导T细胞。补充另外的IL-2至最终浓度为300IU/ml。慢病毒感染后24小时，更换新鲜培养基。将感染的T细胞维持在含有5％FBS和300IU/ml IL-2的AIMV培养基下，细胞密度在5×105至1×106个细胞/ml之间。转导后4天，通过FACS确定细胞表面上的CAR和RGD的表达。特别地，通过300g离心5min收集1×105个经转导的T细胞或未经转导的T细胞(unT)。然后用含有2μl BV421缀合的抗Flag抗体(Biolegend,US)或iFlour488-抗-sdAb(GenScript,China)的100μl PBS重悬细胞。Flag阳性率代表T细胞上的RGD比率，并且sdAb阳性率代表CAR比率。如图1中显示，DLL3-CAR、DLL3-FasL-Flag-RGD和DLL3-RGD-Flag-CD28上的CAR阳性率为41.4％、32.5％和39.8％。而DLL3-FasL-Flag-RGD和DLL3-RGD-Flag-CD28表面上表达的mbRGD仅为2.6％和4.8％。这些结果表明这些mbRGD结构在T细胞上表达较差。
3.CAR结构的优化
然后我们试图确定哪个模块导致了mbRGD的低表达。通过替换mbRGD的铰链、胞内或跨膜结构域设计了几种构建体。表2中显示了序列和结构。首先，为了确定胞内结构域的添加是否能够稳定mbRGD，将eGFP(SEQ ID NO:12)序列与mbRGD的跨膜结构域缀合，其被命名为DLL3-RGD-Flag-CD28-eGFP(SEQ ID NO:19)。然后构建缺少Flag(DLL3-RGD-CD28-eGFP(SEQ ID NO:21))或RGD(DLL3-Flag-CD28-eGFP(SEQ ID NO:20))的mbRGD以确定这些模块是否影响mbRGD的表达。如实例1中所述生成CAR-T细胞。如图2中显示，这些mbRGD都没有在CAR-T细胞上成功表达。这些结果表明CD28的跨膜结构域可能导致mbRGD的低表达。然后我们试图确定用CD7或CD80替换mbRGD的CD28跨膜结构域是否可以增强CAR-T上的mbRGD表达。特别地，构建了DLL3-RGD-Flag-CD7(SEQ ID NO:22)和DLL3-RGD-CD7(SEQ ID NO:26)，其包含CD7的铰链(SEQ ID NO:13)和跨膜结构域(SEQ ID NO:14)；构建DLL3-RGD-Flag-CD80S(SEQ ID NO:23)、DLL3-RGD-Flag-CD80M(SEQ ID NO:24)和DLL3-RGD-Flag-CD80L(SEQ IDNO:25)，其包含CD80的跨膜结构域(SEQ ID NO:18)，具有CD80的短铰链结构域(SEQ ID NO:15)、中等铰链结构域(SEQ ID NO:16)或长铰链结构域(SEQ ID NO:17)。表2中显示了相关序列。这些构建体被包装到慢病毒中，并转导到原代T细胞中。如图3中显示，DLL3-RGD-Flag-CD80S、DLL3-RGD-Flag-CD80M和DLL3-RGD-Flag-CD80L显示了最低水平的mbRGD表达。如图4中显示，DLL3-RGD-Flag-CD7显示比其他构建体相对更高的mbRGD表达。这些结果表明，CD7跨膜和铰链结构域可能促进mbRGD的表达。因此，我们随后利用DLL3-RGD-CD7(SEQID NO:26)进行细胞功能测定。
表2 mbRGD装甲的CAR的模式和序列
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实例2：mbRGD增强CAR-T细胞与内皮细胞的黏附
为了研究mbRGD是否可以改善T细胞对新生血管内皮细胞的黏附，进行了内皮细胞黏附测定。在此测定中，使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)代表新生血管内皮细胞。首先，检测HUVEC表面上的整联蛋白αv和整联蛋白β5(都是RGD肽的受体)的表达。然后制备了RGD装甲的DLL3 CAR，特别是DLL3-RGD-CD7，并研究了它们对HUVEC的黏附。简而言之，将1×105个HUVEC细胞接种到24孔板的底部以形成单层。第二天，用CFSE标记3×105个DLL3-RGD-CD7、DLL3-CAR和未转导的T细胞(unT)，并将其分别添加到单一HUVEC层。孵育30min后，用新鲜培养基小心地漂洗出未结合的T细胞。在荧光显微镜上对结合的细胞进行成像并计数。如图5A和5B中显示，DLL3-RGD-CD7比DLL3-CAR或unT细胞对HUVEC具有显著更高的细胞黏附。这些结果表明mbRGD可以增强T细胞对新生血管内皮细胞的黏附。
实例3：mbRGD对CAR-T细胞针对靶细胞和内皮细胞的细胞毒性和细胞因子分泌的影响
为了研究mbRGD是否影响CAR-T细胞针对靶细胞或内皮细胞的细胞毒性，使用HUVEC和DLL3阳性细胞SHP77来评估有或没有mbRGD的DLL3-CAR-T细胞的细胞毒性和细胞因子分泌。特别地，将SHP77细胞与DLL3-RGD-CD7、DLL3-CAR和unT共孵育22h。然后，测量LDH(乳酸脱氢酶)水平。如图6A-6B中显示，mbRGD装甲的CAR-T针对SHP77和HUVEC的细胞毒性水平与常规CAR-T细胞相当。这些结果表明，mbRGD对CAR-T细胞针对靶细胞的细胞毒性没有影响；同时mbRGD装甲的CAR-T细胞不会对内皮细胞产生细胞毒性。然后取共培养物的上清液通过HTFR方法进行IFN-γ测量。如图7A-7B中显示，所有CAR-T细胞的IFN-γ分泌通过SHP77共培养物被高度激活。并且在与SHP77共培养后DLL3-RGD-CD7比DLL3-CAR-T细胞分泌更高水平的IFN-γ(图7A)。尽管DLL3-RGD-CD7的IFN-γ基础水平高于DLL3-CAR-T细胞，但与基础水平相比，与HUVEC共培养后，没有任何CAR-T细胞表现出IFN-γ分泌增加(CAR-T细胞与HUVEC共培养)。这些结果表明，mbRGD装甲的CAR-T细胞对内皮细胞是安全的。
实例4：mbRGD装甲的CAR-T细胞在体内表现出优异的抗肿瘤功效
为了研究mbRGD是否可以增强CAR-T细胞的抗肿瘤功效，在SHP77异种移植NCG小鼠模型上进行了体内研究。特别地，将SHP77细胞皮下植入至NCG小鼠，并使SHP77肿瘤生长至100-160mm3。为了比较抗肿瘤功效，使用了次优剂量的DLL3-CAR-T，在该模型中几乎没有显示抗肿瘤效果。特别地，将0.15M的DLL3-RGD-CD7、DLL3-CAR和未转导的T细胞(“unT”)静脉输注至小鼠中。每周监测肿瘤体积两次，且每周监测外周血中CAR-T的百分比一次。如图8A-8B中显示，DLL3-RGD-CD7显示出明显优于非装甲的CAR-T细胞的抗肿瘤功效(图8A)和CAR-T细胞扩增(图8B)。这些结果表明mbRGD可增强CAR-T细胞在活体内的抗肿瘤功效。
实例5：mbRGD装甲的CAR-T细胞在体内表现出优异的肿瘤浸润
为了研究mbRGD装甲的CAR-T的增强的抗肿瘤功效是否至少部分归因于增强的肿瘤浸润，我们进行了体内测定以确定不同CAR-T的肿瘤浸润。首先，将SHP77细胞皮下植入至NCG小鼠。使肿瘤生长至250-300mm3。然后静脉内输注3M的DLL3-CAR或DLL3-RGD-CD7 CAR-T细胞。输注后3天和7天对小鼠实施安乐死并切除肿瘤。通过免疫组织化学(IHC)将切除的肿瘤用于抗DLL3 sdAb染色，以观察肿瘤中CAR-T浸润的水平。
如图9A-9B中显示，DLL3-RGD-CD7 CAR-T细胞在第3天和第7天都显示比DLL3-CAR更高的对DLL3阳性细胞的肿瘤浸润。这些结果表明mbRGD可以增强CAR-T细胞的肿瘤浸润。
实例6：mbRGD的表达与CAR-T细胞与内皮细胞的黏附呈正相关
为了研究mbRGD的表达是否会影响CAR-T细胞与内皮细胞的黏附，进行了内皮细胞黏附测定。在此测定中，使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)代表新生血管内皮细胞。制备了RGD装甲的DLL3 CAR-T并研究了它们对HUVEC的黏附。简而言之，将1×105个HUVEC细胞接种到24孔板的底部以形成单层。第二天，用CFSE标记3×105个DLL3-RGD-CD7、DLL3-RGD-Flag-CD7、DLL3-CAR、DLL3-RGD-Flag-CD28、DLL3-FasL-Flag-RGD、DLL3-RGD-Flag-CD80S、DLL3-RGD-Flag-CD80M、DLL3-RGD-Flag-CD80L和未转导的T细胞(unT)，并将其分别添加到单一HUVEC层。孵育30min后，用新鲜培养基小心地漂洗出未结合的T细胞。在荧光显微镜上对结合的细胞进行成像并计数。如图10A和10B中显示，DLL3-RGD-CD7和DLL3-RGD-Flag-CD7比其他CAR或unT细胞对HUVEC具有显著更高的细胞黏附。这些结果表明，mbRGD的表达与CAR-T细胞与内皮细胞的黏附呈正相关。
实例7：用膜结合精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)融合蛋白装甲的ε-TRuC和ε-TRuC-T细胞的生成
mbRGD装甲的ε-TRuC构建体的克隆
为了增强T细胞向肿瘤的归巢和浸润，将肿瘤归巢肽与跨膜结构域融合，并以膜结合形式发挥作用，使其能够锚定在T细胞膜上。
我们设计了几种基于CD7的铰链和跨膜结构域的膜结合形式的RGD(mbRGD)，并将其用作对DLL3特异性ε-T细胞受体融合构建体(即ε-TruC，也称为εTCR)细胞的装甲。mbRGD装甲的ε-TRuC中的一个由DLL3-ε-TRuC(SEQ ID NO:35)、P2A(SEQ ID NO:9)、RGD-4C肽(SEQID NO:2)、(G4S)3接头、CD7铰链(SEQ ID NO:13)和CD7的跨膜结构域(SEQ ID NO:14)组成。该构建体被命名为DLL3-ε-TRuC-RGD-CD7(SEQ ID NO:36)。mbRGD装甲的ε-TRuC中的另一个由DLL3-ε-TRuC(SEQ ID NO:35)、P2A(SEQ ID NO:9)、RGD-4C肽(SEQ ID NO:2)、Flag标签(SEQ ID NO:3)、(G4S)3接头、CD7铰链(SEQ ID NO:13)和CD7的跨膜结构域(SEQ ID NO:14)组成。该构建体被命名为DLL3-ε-TRuC-RGD-Flag-CD7(SEQ ID NO:37)。表1、2和3中显示了相关元件和ε-TRuC的序列。
表3mbRGD装甲的ε-TRuC的模式和序列
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mbRGD装甲的ε-TRuC-T细胞的生成
1.慢病毒的制备
编码如上所述的RGD装甲的DLL3-ε-TRuC的序列由GenScript进行密码子优化和合成。然后通过标准分子克隆方法将序列掺入到第二代慢病毒载体中。所有质粒序列均通过测序验证。然后将质粒与慢病毒包装质粒共转染到HEK293细胞中，以产生慢病毒。从上清液中收集病毒颗粒，并通过PEG沉淀或超速离心进行浓缩。将浓缩的慢病毒颗粒用于转导T细胞。
2.T细胞转导
使用pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,130096535)从健康供体PBMC(HemaCare)中分离T细胞。分离的T细胞在含有5％FBS(Gibco,10099141)的AIMV(Gibco,31035025)培养基中培养，并在37℃、5％CO2培养箱中以2:1的比率由CD3/CD28活化珠(Miltenyi Biotec,130091442)进一步活化。在初始活化后48或72小时，在8μg/ml聚凝胺(SIGMA-ALDRICH,H9268-10G)的存在下，用表达DLL3靶向ε-TRuC的慢病毒以合适的感染复数(MOI)转导T细胞。补充另外的IL-2至最终浓度为300IU/ml。慢病毒感染后24小时，更换新鲜培养基。将感染的T细胞维持在含有5％FBS和300IU/ml IL-2的AIMV培养基下，细胞密度在5×105至1×106个细胞/ml之间。转导后4天，通过FACS确定细胞表面上的ε-TRuC和RGD的表达。特别地，通过300g离心5min收集1×105个经转导的T细胞或未经转导的T细胞(unT)。然后用含有PE缀合的抗Flag抗体(Biolegend,US)或iFlour488-抗-sdAb(GenScript,China)的100μl PBS重悬细胞。Flag阳性率代表T细胞上的RGD比率，并且sdAb阳性率代表ε-TRuC比率。如图11中显示，在DLL3-ε-TRuC、DLL3-ε-TRuC-RGD-CD7和DLL3-ε-TRuC-RGD-Flag-CD7上的ε-TRuC阳性率为60.6％、37.5％和45.3％。DLL3-ε-TRuC-RGD-Flag-CD7表面上表达的mbRGD为32.9％。
实例8：mbRGD增强ε-TRuC-T细胞与内皮细胞的黏附
为了研究mbRGD是否可以改善T细胞对新生血管内皮细胞的黏附，进行了内皮细胞黏附测定。在此测定中，使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)代表新生血管内皮细胞。制备DLL3-ε-TRuC-RGD-CD7和DLL3-ε-TRuC-RGD-Flag-CD7并研究它们对HUVEC的黏附。简而言之，将1×105个HUVEC细胞接种到24孔板的底部以形成单层。第二天，用CFSE标记3×105个DLL3-ε-TRuC-RGD-CD7和DLL3-ε-TRuC-RGD-Flag-CD7、DLL3-ε-TRuC和未转导的T细胞(unT)，并将其分别添加到单一HUVEC层。孵育30min后，用新鲜培养基小心地漂洗出未结合的T细胞。在荧光显微镜上对结合的细胞进行成像并计数。如图12A和12B中显示，DLL3-ε-TRuC-RGD-CD7和DLL3-ε-TRuC-RGD-Flag-CD7比DLL3-ε-TRuC或unT细胞对HUVEC具有显著更高的细胞黏附。这些结果表明mbRGD可以增强DLL3-ε-TRuC-T细胞对新生血管内皮细胞的黏附。
实例9：mbRGD对DLL3-ε-TRuC-T细胞针对靶细胞和内皮细胞的细胞毒性和细胞因子分泌的影响
为了研究mbRGD是否影响DLL3-ε-TRuC-T细胞针对靶细胞或内皮细胞的细胞毒性，使用HUVEC和DLL3阳性细胞SHP77来评估有或没有mbRGD的DLL3-ε-TruC-T细胞的细胞毒性和细胞因子分泌。特别地，将SHP77细胞与DLL3-ε-TRuC-RGD-CD7、和DLL3-ε-TRuC-RGD-Flag-CD7、DLL3-ε-TRuC和unT共孵育22h。然后，测量LDH(乳酸脱氢酶)水平。如图13A-13B中显示，mbRGD装甲的ε-TRuC针对SHP77和HUVEC的细胞毒性水平与常规ε-TRuC-T细胞相当。这些结果表明，mbRGD对ε-TRuC-T细胞针对靶细胞的细胞毒性没有影响；同时mbRGD装甲的ε-TRuC-T细胞不会对内皮细胞产生细胞毒性。然后取共培养物的上清液通过HTFR方法进行IFN-γ测量。如图14A-14B中显示，ε-TRuC-T细胞的IFN-γ分泌通过SHP77共培养被高度激活(图14A)。与ε-TRuC-T细胞相比，与HUVEC共培养后，没有任何ε-TRuC-T细胞表现出IFN-γ分泌增加。这些结果表明，mbRGD装甲的ε-TRuC-T细胞对内皮细胞是安全的。
实例10：用膜结合天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(NGR)融合蛋白装甲的CAR和CAR-T细胞的生成
mbNGR装甲的CAR构建体的克隆
为了增强T细胞向肿瘤的归巢和浸润，将肿瘤归巢肽与跨膜结构域融合，并以膜结合形式发挥作用，使其能够锚定在T细胞膜上。
我们设计了几种基于CD7的铰链和跨膜结构域的膜结合形式的NGR(mbNGR)，并将其用作对DLL3特异性CAR-T细胞的装甲。mbNGR装甲的DLL3CAR中的一个由DLL3-CAR(SEQ IDNO:8)、P2A(SEQ ID NO:9)、NGR肽(SEQ ID NO:38)、(G4S)3接头、CD7铰链(SEQ ID NO:13)和CD7的跨膜结构域(SEQ ID NO:14)组成。并且该构建体被命名为DLL3-CAR-NGR-CD7(SEQ IDNO:39)。mbNGR装甲的DLL3 CAR中的另一个由DLL3 CAR(SEQ ID NO:8)、P2A(SEQ ID NO:9)、NGR肽(SEQ ID NO:38)、Flag标签(SEQ ID NO:3)、(G4S)3接头、CD7铰链(SEQ ID NO:13)和CD7的跨膜结构域(SEQ ID NO:14)组成。该构建体被命名为DLL3-CAR-NGR-Flag-CD7(SEQID NO:40)。表1、2和4中显示了相关元件和CAR的序列。
表4mbNGR装甲的DLL3 CAR的模式和序列
为了证明mbNGR装甲可用于不同肿瘤模型，我们设计了几种包含CD7的铰链和跨膜结构域的膜结合形式的NGR(mbNGR)，并将其用作对MSLN/GPC2特异性CAR-T细胞的装甲。mbNGR装甲的CAR中的一个由MSLN-CAR(SEQ ID NO:41)、P2A(SEQ ID NO:9)、NGR肽(SEQ IDNO:38)、(G4S)3接头、CD7铰链(SEQ ID NO:13)和CD7的跨膜结构域(SEQ ID NO:14)组成。该构建体被命名为MSLN-CAR-NGR-CD7(SEQ ID NO:42)。mbNGR装甲的CAR中的另一个由MSLNCAR(SEQ ID NO:41)、P2A(SEQ ID NO:9)、NGR肽(SEQ ID NO:38)、Flag标签(SEQ ID NO:3)、(G4S)3接头、CD7铰链(SEQ ID NO:13)和CD7的跨膜结构域(SEQ ID NO:14)组成。该构建体被命名为MSLN-CAR-NGR-Flag-CD7(SEQ ID NO:43)。mbNGR装甲的CAR中的一个由GPC2-CAR(SEQ ID NO:44)、P2A(SEQ ID NO:9)、NGR肽(SEQ ID NO:38)、(G4S)3接头、CD7铰链(SEQ IDNO:13)和CD7的跨膜结构域(SEQ ID NO:14)组成。该构建体被命名为GPC2-CAR-NGR-CD7(SEQ ID NO:45)。mbNGR装甲的CAR中的另一个由GPC2 CAR(SEQ ID NO:43)、P2A(SEQ IDNO:9)、NGR肽(SEQ ID NO:38)、Flag标签(SEQ ID NO:3)、(G4S)3接头、CD7铰链(SEQ ID NO:13)和CD7的跨膜结构域(SEQ ID NO:14)组成。该构建体被命名为GPC2-CAR-NGR-Flag-CD7(SEQ ID NO:46)。表1、2、4和5中显示了相关元件和CAR的序列。
表5 mbNGR装甲的MSLN/GPC2 CAR的模式和序列
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mbNGR装甲的CAR-T细胞的生成
1.慢病毒的制备
编码如上所述的NGR装甲的DLL3/MSLN/GPC2 CAR的序列由GenScript进行密码子优化和合成。然后通过标准分子克隆方法将序列掺入到第二代慢病毒载体中。所有质粒序列均通过测序验证。然后将质粒与慢病毒包装质粒共转染到HEK293细胞中，以产生慢病毒。从上清液中收集病毒颗粒，并通过PEG沉淀或超速离心进行浓缩。将浓缩的慢病毒颗粒用于转导T细胞。
2.T细胞转导
使用pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,130096535)从健康供体PBMC(HemaCare)中分离T细胞。分离的T细胞在含有5％FBS(Gibco,10099141)的AIMV(Gibco,31035025)培养基中培养，并在37℃、5％CO2培养箱中以2:1的比率由CD3/CD28活化珠(Miltenyi Biotec,130091442)进一步活化。在初始活化后48或72小时，在8μg/ml聚凝胺(SIGMA-ALDRICH,H9268-10G)的存在下，用表达DLL3/MSLN/GPC2靶向CAR的慢病毒以合适的感染复数(MOI)转导T细胞。补充另外的IL-2至最终浓度为300IU/ml。慢病毒感染后24小时，更换新鲜培养基。将感染的T细胞维持在含有5％FBS和300IU/ml IL-2的AIMV培养基下，细胞密度在5×105至1×106个细胞/ml之间。转导4天后，通过FACS确定细胞表面上的CAR和NGR的表达。特别地，通过300g离心5min收集1×105个经转导的T细胞或未经转导的T细胞(unT)。然后用含有PE缀合的抗Flag抗体(Biolegend,US)或iFlour488-抗-sdAb(GenScript,China)的100μl PBS重悬细胞。Flag阳性率代表T细胞上的NGR比率，并且sdAb阳性率代表CAR比率。如图15中显示，在DLL3-CAR、DLL3-CAR-NGR-CD7、和DLL3-CAR-NGR-Flag-CD7上的CAR阳性率为41.3％、37.3％和44.6％。DLL3-CAR-NGR-Flag-CD7表面上表达的mbNGR为37.9％。如图19中显示，MSLN-CAR、MSLN-CAR-NGR-CD7和MSLN-CAR-NGR-Flag-CD7上的CAR阳性率为63.7％、49.8％和51.9％。MSLN-CAR-NGR-Flag-CD7表面上表达的mbNGR为48.1％。如图23中显示，在GPC2-CAR、GPC2-CAR-NGR-CD7和GPC2-CAR-NGR-Flag-CD7上的CAR阳性率为79.3％、74％和69.8％。GPC2-CAR-NGR-Flag-CD7表面上表达的mbNGR为75.9％。
实例11：mbNGR增强DLL3/MSLN/GPC2 CAR-T细胞与内皮细胞的黏附
为了研究mbNGR是否可以改善MSLN CAR-T细胞对新生血管内皮细胞的黏附，进行了内皮细胞黏附测定。在此测定中，使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)代表新生血管内皮细胞。制备MSLN-CAR-NGR-CD7和MSLN-CAR-NGR-Flag-CD7并研究它们对HUVEC的黏附。简而言之，将1×105个HUVEC细胞接种到24孔板的底部以形成单层。第二天，用CFSE标记3×105个MSLN-CAR-NGR-CD7、MSLN-CAR-NGR-Flag-CD7、MSLN-CAR和未转导的T细胞(unT)，并将其分别添加到单一HUVEC层。孵育30min后，用新鲜培养基小心地漂洗出未结合的T细胞。在荧光显微镜上对结合的细胞进行成像并计数。如图20A和20B中显示，MSLN-CAR-NGR-CD7和MSLN-CAR-NGR-Flag-CD7比MSLN CAR或unT细胞对HUVEC具有显著更高的细胞黏附。这些结果表明mbNGR可以增强MSLN CAR-T细胞对新生血管内皮细胞的黏附。
为了研究mbNGR是否可以改善GPC2 CAR-T细胞对新生血管内皮细胞的黏附，进行了内皮细胞黏附测定。在此测定中，使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)代表新生血管内皮细胞。制备GPC2-CAR-NGR-CD7和GPC2-CAR-NGR-Flag-CD7并研究它们对HUVEC的黏附。简而言之，将1×105个HUVEC细胞接种到24孔板的底部以形成单层。第二天，用CFSE标记3×105个GPC2-CAR-NGR-CD7、GPC2-CAR-NGR-Flag-CD7、GPC2-CAR和未转导的T细胞(unT)，并将其分别添加到单一HUVEC层。孵育30min后，用新鲜培养基小心地漂洗出未结合的T细胞。在荧光显微镜上对结合的细胞进行成像并计数。如图24A和24B中显示，GPC2-CAR-NGR-CD7和GPC2-CAR-NGR-Flag-CD7比GPC2 CAR或unT细胞对HUVEC具有显著更高的细胞黏附。这些结果表明mbNGR可以增强GPC2 CAR-T细胞对新生血管内皮细胞的黏附。
实例12：mbNGR对DLL3/MSLN/GPC2 CAR-T细胞针对靶细胞和内皮细胞的细胞毒性和细胞因子分泌的影响
为了研究mbNGR是否影响DLL3 CAR-T细胞针对靶细胞或内皮细胞的细胞毒性，使用HUVEC和DLL3阳性细胞SHP77来评估有或没有mbNGR的DLL3-CAR-T细胞的细胞毒性和细胞因子分泌。特别地，将SHP77细胞与DLL3-CAR-NGR-CD7、DLL3-CAR-NGR-Flag-CD7、DLL3-CAR和unT共孵育22h。然后，测量LDH(乳酸脱氢酶)水平。如图17A-17B中显示，mbNGR装甲的CAR-T针对SHP77和HUVEC的细胞毒性水平与常规CAR-T细胞相当。这些结果表明，mbNGR对CAR-T细胞针对靶细胞的细胞毒性没有影响；同时mbNGR装甲的CAR-T细胞不会对内皮细胞产生细胞毒性。然后取共培养物的上清液通过HTFR方法进行IFN-γ测量。如图18A-18B中显示，所有的DLL3 CAR-T细胞的IFN-γ分泌通过SHP77共培养被高度激活(图18A)。与仅DLL3 CAR-T细胞相比，与HUVEC共培养后，没有任何DLL3 CAR-T细胞表现出IFN-γ分泌增加。这些结果表明，mbNGR装甲的DLL3 CAR-T细胞对内皮细胞是安全的。为了研究mbNGR是否可以改善DLL3CAR-T细胞对新生血管内皮细胞的黏附，进行了内皮细胞黏附测定。在此测定中，使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)代表新生血管内皮细胞。制备DLL3-CAR-NGR-CD7和DLL3-CAR-NGR-Flag-CD7并研究它们对HUVEC的黏附。简而言之，将1×105个HUVEC细胞接种到24孔板的底部以形成单层。第二天，用CFSE标记3×105个DLL3-CAR-NGR-CD7、DLL3-CAR-NGR-Flag-CD7、DLL3-CAR和未转导的T细胞(unT)，并将其分别添加到单一HUVEC层。孵育30min后，用新鲜培养基小心地漂洗出未结合的T细胞。在荧光显微镜上对结合的细胞进行成像并计数。如图16A和16B中显示，DLL3-CAR-NGR-CD7和DLL3-CAR-NGR-Flag-CD7比DLL3 CAR或unT细胞对HUVEC具有显著更高的细胞黏附。这些结果表明mbNGR可以增强DLL3 CAR-T细胞对新生血管内皮细胞的黏附。
为了研究mbNGR是否影响MSLN CAR-T细胞针对靶细胞或内皮细胞的细胞毒性，使用HUVEC和MSLN阳性细胞OVCAR3来评估有或没有mbNGR的MSLN-CAR-T细胞的细胞毒性和细胞因子分泌。特别地，将OVCAR3细胞与MSLN-CAR-NGR-CD7、MSLN-CAR-NGR-Flag-CD7、MSLN-CAR和unT共孵育22h。然后，测量LDH(乳酸脱氢酶)水平。如图21A-21B中显示，mbNGR装甲的CAR-T针对OVCAR3和HUVEC的细胞毒性水平与常规CAR-T细胞相当。这些结果表明，mbNGR对CAR-T细胞针对靶细胞的细胞毒性没有影响；同时mbNGR装甲的CAR-T细胞不会对内皮细胞产生细胞毒性。然后取共培养物的上清液通过HTFR方法进行IFN-γ测量。如图22A-22B中显示，所有的MSLN CAR-T细胞的IFN-γ分泌通过OVCAR3共培养被高度激活(图22A)。与仅MSLNCAR-T细胞相比，与HUVEC共培养后，没有任何MSLN CAR-T细胞表现出IFN-γ分泌增加。这些结果表明，mbNGR装甲的MSLN CAR-T细胞对内皮细胞是安全的。
为了研究mbNGR是否影响GPC2 CAR-T细胞针对靶细胞或内皮细胞的细胞毒性，使用HUVEC和GPC2阳性细胞SH-SY5Y来评估有或没有mbNGR的GPC2-CAR-T细胞的细胞毒性和细胞因子分泌。特别地，将SH-SY5Y细胞与GPC2-CAR-NGR-CD7、GPC2-CAR-NGR-Flag-CD7、GPC2-CAR和unT共孵育22h。然后，测量LDH(乳酸脱氢酶)水平。如图25A-25B中显示，mbNGR装甲的CAR-T针对SH-SY5Y和HUVEC的细胞毒性水平与常规CAR-T细胞相当。这些结果表明，mbNGR对CAR-T细胞针对靶细胞的细胞毒性没有影响；同时mbNGR装甲的CAR-T细胞不会对内皮细胞产生细胞毒性。然后取共培养物的上清液通过HTFR方法进行IFN-γ测量。如图26A-26B中显示，所有的GPC2 CAR-T细胞的IFN-γ分泌通过SH-SY5Y共培养被高度激活(图26A)。与仅GPC2 CAR-T细胞相比，与HUVEC共培养后，没有任何GPC2 CAR-T细胞表现出IFN-γ分泌增加。这些结果表明，mbNGR装甲的GPC2 CAR-T细胞对内皮细胞是安全的。
实例13：RGD嵌入的CAR和CAR-T细胞的生成
RGD嵌入的CAR构建体的克隆
为了分析RGD嵌入的CAR-T和mbRGD装甲的CAR-T细胞功能之间的相似性和差异，我们设计了几种RGD嵌入的DLL3特异性CAR-T细胞。它们是RGD-(G4S)3-DLL3 sdAb-CD8α铰链-CD8αTM-4-1BB-CD3z(SEQ ID NO:49)和DLL3sdAb-(G4S)3-RGD-CD8α铰链-CD8αTM-4-1BB-CD3z(SEQ ID NO:50)。表6中显示了相关CAR的序列。
表6 RGD嵌入的CAR的模式和序列
RGD嵌入的CAR-T细胞的生成
1.慢病毒的制备
编码如上所述的RGD嵌入的DLL3-CAR的序列由GenScript进行密码子优化和合成。然后通过标准分子克隆方法将序列掺入到第三代慢病毒载体中。所有质粒序列均通过测序验证。然后将质粒与慢病毒包装质粒共转染到HEK293细胞中，以产生慢病毒。从上清液中收集病毒颗粒，并通过PEG沉淀或超速离心进行浓缩。将浓缩的慢病毒颗粒用于转导T细胞。
2.T细胞转导
使用pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,130096535)从健康供体PBMC(HemaCare)中分离T细胞。分离的T细胞在含有5％FBS(Gibco,10099141)的AIMV(Gibco,31035025)培养基中培养，并在37℃、5％CO2培养箱中以2:1的比率由CD3/CD28活化珠(Miltenyi Biotec,130091442)进一步活化。在初始活化后48或72小时，在8μg/ml聚凝胺(SIGMA-ALDRICH,H9268-10G)的存在下，用表达DLL3靶向CAR的慢病毒以合适的感染复数(MOI)转导T细胞。补充另外的IL-2至最终浓度为300IU/ml。慢病毒感染后24小时，更换新鲜培养基。将感染的T细胞维持在含有5％FBS和300IU/ml IL-2的AIMV培养基下，细胞密度在5×105至1×106个细胞/ml之间。转导4天后，通过FACS确定细胞表面上的CAR的表达。特别地，通过300g离心5min收集1×105个经转导的T细胞或未经转导的T细胞(unT)。然后用含有iFlour488-抗-sdAb(GenScript,China)的100μl PBS重悬细胞。sdAb阳性率代表CAR比率。如图27中显示，DLL3-CAR、DLL3-RGD-CD7、RGD-(G4S)3-DLL3sdAb-CD8铰链-CD8TM-4-1BB-CD3z和DLL3 sdAb-(G4S)3-RGD-CD8铰链-CD8TM-4-1BB-CD3z的CAR阳性率为27.5％、29.3％、24.0％和12.4％。
实例14：RGD嵌入的CAR增强CAR-T细胞与内皮细胞的黏附
为了研究RGD嵌入的CAR是否可以改善T细胞对新生血管内皮细胞的黏附，进行了内皮细胞黏附测定。在此测定中，使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)代表新生血管内皮细胞。制备DLL3-RGD-CD7、RGD-(G4S)3-DLL3 sdAb-CD8铰链-CD8 TM-4-1BB-CD3z和DLL3 sdAb-(G4S)3-RGD-CD8铰链-CD8 TM-4-1BB-CD3z并研究了它们对HUVEC的黏附。简而言之，将1×105个HUVEC细胞接种到24孔板的底部以形成单层。第二天，用CFSE标记3×105个DLL3-CAR、DLL3-RGD-CD7、RGD-(G4S)3-DLL3 sdAb-CD8铰链-CD8TM-4-1BB-CD3z、DLL3sdAb-(G4S)3-RGD-CD8铰链-CD8 TM-4-1BB-CD3z和未转导的T细胞(unT)，并将其分别添加到单一HUVEC层中。孵育30min后，用新鲜培养基小心地漂洗出未结合的T细胞。在荧光显微镜上对结合的细胞进行成像并计数。如图28A和28B中显示，RGD-(G4S)3-DLL3 sdAb-CD8铰链-CD8TM-4-1BB-CD3z、DLL3sdAb-(G4S)3-RGD-CD8铰链-CD8TM-4-1BB-CD3z和DLL3-RGD-CD7比DLL3 CAR或unT细胞对HUVEC具有显著更高的细胞黏附。这些结果表明RGD嵌入的CAR和mbRGD装甲的CAR都可以增强CAR-T细胞对新生血管内皮细胞的黏附。
实例15：RGD嵌入的CAR对CAR-T细胞针对靶细胞和内皮细胞的细胞毒性和细胞因子分泌的影响
为了研究RGD嵌入的CAR是否影响CAR-T细胞针对靶细胞或内皮细胞的细胞毒性，使用HUVEC和DLL3阳性细胞SHP77来评估DLL3-CAR-T、RGD嵌入的CAR-T和mbRGD装甲的CAR-T细胞的细胞毒性和细胞因子分泌。特别地，将SHP77细胞与RGD-(G4S)3-DLL3 sdAb-CD8铰链-CD8 TM-4-1BB-CD3z、DLL3sdAb-(G4S)3-RGD-CD8铰链-CD8 TM-4-1BB-CD3z、DLL3-RGD-CD7、DLL3-CAR和unT共孵育22h。然后，测量LDH(乳酸脱氢酶)水平。如图29A-29B中显示，RGD嵌入的CAR-T针对SHP77的细胞毒性水平与mbRGD装甲的CAR-T和常规CAR-T细胞相当。RGD嵌入的CAR-T对HUVEC的细胞毒性水平高于mbRGD装甲的CAR-T和常规CAR-T细胞的细胞毒性水平。这些结果表明，RGD嵌入的CAR对CAR-T细胞针对靶细胞的细胞毒性没有影响；但RGD嵌入的CAR-T细胞引起对内皮细胞的细胞毒性。然后取共培养物的上清液通过HTFR方法进行IFN-γ测量。如图30A-30B中显示，所有的DLL3 CAR-T细胞的IFN-γ分泌通过SHP77共培养被高度激活(图30A)。与仅DLL3 CAR-T细胞相比，与HUVEC共培养后，RGD嵌入的CAR-T细胞表现出IFN-γ分泌增加。这些结果表明，RGD嵌入的CAR-T细胞对内皮细胞是不安全的。
实例16：mbRGD/mbNGR组合TGF-βDNR装甲的CAR和CAR-T细胞的生成
mbRGD/mbNGR组合TGF-βDNR装甲的CAR构建体的克隆
由于TGF-β在肿瘤微环境中的抑制作用，其已成为几项旨在增强抗肿瘤免疫的研究中的靶点。我们使用TGF-β显性负受体(TGF-βDNR)更特别地靶向肿瘤微环境内的TGF-β信号传导，这使得转导的肿瘤特异性T细胞对TGF-β无应答。为了增强CAR-T细胞向肿瘤的归巢和浸润，同时通过使CAR-T细胞在TGF-β存在的情况下保留细胞溶解活性，保护邻近的免疫细胞免受TGF-β的抑制作用，我们设计了几种mbRGD/mbNGR组合TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞。它们是DLL3-CAR-CD28SP-RGD-(G4S)-dnTGFβRII(SEQ ID NO:52)、DLL3-CAR-CD5SP-RGD-(G4S)-dnTGFβRII(SEQ ID NO:53)、DLL3-CAR-CD28SP-NGR-(G4S)-dnTGFβRII(SEQ ID NO:54)、DLL3-CAR-dnTGFβRII-P2A-NGR-CD7(SEQ ID NO:55)、DLL3-CAR-dnTGFβRII-P2A-NGR-Flag-CD7(SEQ ID NO:56)、DLL3-CAR-NGR-(G4S)-NGR-CD7-T2A-dnTGFβRII(SEQ ID NO:57)和DLL3-CAR-NGR-(G4S)-NGR-Flag-CD7-T2A-dnTGFβRII(SEQ ID NO:58)。表7中显示了相关CAR的序列。
表7mbRGD/mbNGR组合TGF-βDNR装甲CAR的模式和序列
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mbRGD/mbNGR组合TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞的生成
1.慢病毒的制备
编码如上所述的mbRGD/mbNGR组合TGF-βDNR装甲的CAR的序列由GenScript进行密码子优化和合成。然后通过标准分子克隆方法将序列掺入到第三代慢病毒载体中。所有质粒序列均通过测序验证。然后将质粒与慢病毒包装质粒共转染到HEK293细胞中，以产生慢病毒。从上清液中收集病毒颗粒，并通过PEG沉淀或超速离心进行浓缩。将浓缩的慢病毒颗粒用于转导T细胞。
2.T细胞转导
使用pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,130096535)从健康供体PBMC(HemaCare)中分离T细胞。分离的T细胞在含有5％FBS(Gibco,10099141)的AIMV(Gibco,31035025)培养基中培养，并在37℃、5％CO2培养箱中以2:1的比率由CD3/CD28活化珠(Miltenyi Biotec,130091442)进一步活化。在初始活化后48或72小时，在8μg/ml聚凝胺(SIGMA-ALDRICH,H9268-10G)的存在下，用表达DLL3靶向CAR的慢病毒以合适的感染复数(MOI)转导T细胞。补充另外的IL-2至最终浓度为300IU/ml。慢病毒感染后24小时，更换新鲜培养基。将感染的T细胞维持在含有5％FBS和300IU/ml IL-2的AIMV培养基下，细胞密度在5×105至1×106个细胞/ml之间。转导4天后，通过FACS确定细胞表面上的CAR的表达。特别地，通过300g离心5min收集1×105个经转导的T细胞或未经转导的T细胞(unT)。然后用含有iFlour488-抗-sdAb(GenScript,China)、PE-抗-Flag(Biolegend,US)或APC-抗-TGF-βRII(Abcam,UK)的100μl PBS重悬细胞。sdAb阳性率代表T细胞上的CAR比率，Flag阳性率代表T细胞上的mbNGR比率，TGF-βRⅡ阳性率代表CAR阳性T细胞上的TGF-βDNR比率。如图31A中显示，DLL3-CAR、DLL3-CAR-dnTGFβRII、DLL3-RGD-CD7、DLL3-CAR-CD28SP-RGD-(G4S)-dnTGFβRII和DLL3-CAR-CD28SP-RGD-(G4S)-dnTGFβRII上的CAR阳性率为18.9％、13.6％、17.6％、12.7％和12.1％。DLL3-CAR-dnTGFβRII、DLL3-CAR-CD28SP-RGD-(G4S)-dnTGFβRII和DLL3-CAR-CD28SP-RGD-(G4S)-dnTGFβRIICAR阳性T细胞表面上表达的TGFβRII为91.2％、82.1％和90.6％。如图31B中显示，在DLL3-CAR、DLL3-CAR-dnTGFβRII、DLL3-CAR-NGR-CD7和DLL3-CAR-CD28SP-NGR-(G4S)-dnTGFβRII上的CAR阳性率为7.58％、14.8％、15.1％和15.9％。DLL3-CAR-dnTGFβRII和DLL3-CAR-CD28SP-NGR-(G4S)-dnTGFβRIICAR阳性T细胞表面上表达的TGFβRII为88.6％和89.2％。如图31C中显示，DLL3-CAR、DLL3-CAR-dnTGFβRII、DLL3-CAR-NGR-CD7、DLL3-CAR-NGR-Flag-CD7、DLL3-CAR-dnTGFβRII-P2A-NGR-CD7、DLL3-CAR-dnTGFβRII-P2A-NGR-Flag-CD7、DLL3-CAR-NGR-(G4S)-NGR-CD7-T2A-dnTGFβRII和DLL3-CAR-NGR-(G4S)-NGR-Flag-CD7-T2A-dnTGFβRII上的CAR阳性率为15.5％、17.7％、20.7％、24.5％、19.9％、23.8％、13.6％和14.1％。在DLL3-CAR-NGR-Flag-CD7、DLL3-CAR-dnTGFβRII-P2A-NGR-Flag-CD7和DLL3-CAR-NGR-(G4S)-NGR-Flag-CD7-T2A-dnTGFβRII表面上表达的mbNGR为31.3％、8.3％和39.5％。在DLL3-CAR-dnTGFβRII、DLL3-CAR-dnTGFβRII-P2A-NGR-CD7、DLL3-CAR-dnTGFβRII-P2A-NGR-Flag-CD7、DLL3-CAR-NGR-(G4S)-NGR-CD7-T2A-dnTGFβRII和DLL3-CAR-NGR-(G4S)-NGR-Flag-CD7-T2A-dnTGFβRIICAR阳性T细胞表面上表达的TGFβRII为90.6％、86.8％、76.3％、84.9％和86.7％。
实例17：mbRGD/mbNGR增强mbRGD/mbNGR组合TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞与内皮细胞的黏附
为了研究mbRGD是否可以改善mbRGD组合TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞对新生血管内皮细胞的黏附，进行了内皮细胞黏附测定。在此测定中，使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)代表新生血管内皮细胞。制备DLL3-CAR-CD28SP-RGD-(G4S)-dnTGFβRII和DLL3-CAR-CD28SP-RGD-(G4S)-dnTGFβRII并研究它们对HUVEC的黏附。简而言之，将1×105个HUVEC细胞接种到24孔板的底部以形成单层。第二天，用CFSE标记3×105个DLL3-CAR-CD28SP-RGD-(G4S)-dnTGFβRII、DLL3-CAR-CD28SP-RGD-(G4S)-dnTGFβRII、DLL3-CAR-dnTGFβRII、DLL3-RGD-CD7、DLL3-CAR和未转导的T细胞(unT)，并将其分别添加到单一HUVEC层。孵育30min后，用新鲜培养基小心地漂洗出未结合的T细胞。在荧光显微镜上对结合的细胞进行成像并计数。如图32A和32B中显示，DLL3-CAR-CD28SP-RGD-(G4S)-dnTGFβRII、DLL3-CAR-CD28SP-RGD-(G4S)-dnTGFβRII和DLL3-RGD-CD7比DLL3-CAR-dnTGFβRII、DLL3 CAR或unT细胞对HUVEC具有显著更高的细胞黏附。这些结果表明mbRGD可以增强mbRGD组合TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞对新生血管内皮细胞的黏附。
为了研究mbNGR是否可以改善mbNGR组合TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞对新生血管内皮细胞的黏附，进行了内皮细胞黏附测定。在此测定中，使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)代表新生血管内皮细胞。制备DLL3-CAR-CD28SP-NGR-(G4S)-dnTGFβRII、DLL3-CAR-dnTGFβRII-P2A-NGR-CD7和DLL3-CAR-NGR-(G4S)-NGR-CD7-T2A-dnTGFβRII并研究其与HUVEC的黏附。简而言之，将1×105个HUVEC细胞接种到24孔板的底部以形成单层。第二天，用CFSE标记3×105个DLL3-CAR-CD28SP-NGR-(G4S)-dnTGFβRII、DLL3-CAR-dnTGFβRII-P2A-NGR-CD7、DLL3-CAR-NGR-(G4S)-NGR-CD7-T2A-dnTGFβRII、DLL3-CAR-dnTGFβRII、DLL3-CAR-NGR-CD7、DLL3-CAR和未转导的T细胞(unT)，并将其分别添加到单一HUVEC层。孵育30min后，用新鲜培养基小心地漂洗出未结合的T细胞。在荧光显微镜上对结合的细胞进行成像并计数。如图32C-32F中显示，DLL3-CAR-CD28SP-NGR-(G4S)-dnTGFβRII、DLL3-CAR-dnTGFβRII-P2A-NGR-CD7、DLL3-CAR-NGR-(G4S)-NGR-CD7-T2A-dnTGFβRII和DLL3-CAR-NGR-CD7比DLL3-CAR-dnTGFβRII、DLL3 CAR或unT细胞对HUVEC具有显著更高的细胞黏附。这些结果表明mbNGR可以增强mbNGR组合TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞对新生血管内皮细胞的黏附。
实例18：在mbRGD/mbNGR组合TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞上的dnTGF-βRII的表达，通过SMAD2阻止TGF-β信号诱导
为了研究dnTGF-βRII是否可以通过SMAD2阻止mbRGD组合TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞TGF-β信号诱导，通过胞内流式细胞术进行磷蛋白的分析。特别地，将DLL3-CAR-CD28SP-RGD-(G4S)-dnTGFβRII、DLL3-CAR-CD28SP-RGD-(G4S)-dnTGFβRII、DLL3-CAR-dnTGFβRII、DLL3-RGD-CD7和DLL3-CAR静置在无细胞因子培养基过夜，用iFlour488-抗-sdAb抗体染色，将细胞用10％福尔马林固定，然后用冰冷的甲醇透化，并添加重组人TGF-β1蛋白(R&D，US)刺激30分钟，用PE磷酸-SMAD2 mAb抗体(CST,US)染色。然后，通过流式细胞术分析mbRGD组合TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞群内的SMAD2的磷酸化。如图33A中显示，与DLL3-RGD-CD7和DLL3-CAR相比，DLL3-CAR-CD28SP-RGD-(G4S)-dnTGFβRII、DLL3-CAR-CD28SP-RGD-(G4S)-dnTGFβRII和DLL3-CAR-dnTGFβRII对磷酸-SMAD2的阻止显著更强。这些结果表明dnTGFβRII可以通过SMAD2阻止mbRGD组合TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞TGF-β信号诱导。
为了研究dnTGF-βRII是否可以通过SMAD2阻止mbNGR组合TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞TGF-β信号诱导，通过胞内流式细胞术进行磷蛋白的分析。特别地，将DLL3-CAR-CD28SP-NGR-(G4S)-dnTGFβRII、DLL3-CAR-dnTGFβRII-P2A-NGR-CD7、DLL3-CAR-NGR-(G4S)-NGR-CD7-T2A-dnTGFβRII、DLL3-CAR-dnTGFβRII、DLL3-CAR-NGR-CD7和DLL3-CAR静置在无细胞因子培养基过夜，用iFlour488-抗-sdAb抗体染色，将细胞用10％福尔马林固定，然后用冰冷的甲醇透化，并添加重组人TGF-β1蛋白(R&D，US)刺激30分钟，用PE磷酸-SMAD2 mAb抗体(CST,US)染色。然后，通过流式细胞术分析mbNGR组合TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞群内的SMAD2的磷酸化。如图33B-33C中显示，与DLL3-CAR-NGR-CD7和DLL3-CAR相比，DLL3-CAR-CD28SP-NGR-(G4S)-dnTGFβRII、DLL3-CAR-dnTGFβRII-P2A-NGR-CD7、DLL3-CAR-NGR-(G4S)-NGR-CD7-T2A-dnTGFβRII和DLL3-CAR-dnTGFβRII对磷酸-SMAD2的阻止显著更强。这些结果表明dnTGFβRII可以通过SMAD2阻止mbNGR组合TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞TGF-β信号诱导。
实例19：mbRGD/mbNGR组合TGF-βDNR装甲的CAR对CAR-T细胞针对靶细胞和内皮细胞的细胞毒性和细胞因子分泌的影响
为了研究mbRGD组合TGF-βDNR装甲的CAR是否影响CAR-T细胞针对靶细胞或内皮细胞的细胞毒性，使用HUVEC和DLL3阳性细胞SHP77评估DLL3-CAR-CD28SP-RGD-(G4S)-dnTGFβRII、DLL3-CAR-CD28SP-RGD-(G4S)-dnTGFβRII、DLL3-CAR-dnTGFβRII、DLL3-RGD-CD7和DLL3-CAR的细胞毒性和细胞因子分泌。特别地，将SHP77细胞与CAR-T和unT共孵育22h。然后，测量LDH(乳酸脱氢酶)水平。如图34A-34B中显示，mbRGD组合TGF-βDNR装甲的CAR针对SHP77和HUVEC的细胞毒性水平与常规CAR-T细胞相当。这些结果表明，mbRGD组合TGF-βDNR装甲对CAR-T细胞针对靶细胞的细胞毒性没有影响；同时mbRGD组合TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞不会对内皮细胞产生细胞毒性。然后取共培养物的上清液通过HTFR方法进行IFN-γ测量。如图35A-35B中显示，所有CAR-T细胞的IFN-γ分泌通过SHP77共培养物被高度激活。与仅CAR-T细胞相比，与HUVEC共培养后，没有任何mbRGD组合TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞表现出IFN-γ分泌增加。这些结果表明，mbRGD组合TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞对内皮细胞是安全的。
为了研究mbNGR组合TGF-βDNR装甲的CAR是否影响CAR-T细胞针对靶细胞或内皮细胞的细胞毒性，使用HUVEC和DLL3阳性细胞SHP77评估DLL3-CAR-CD28SP-NGR-(G4S)-dnTGFβRII、DLL3-CAR-dnTGFβRII-P2A-NGR-CD7、DLL3-CAR-NGR-(G4S)-NGR-CD7-T2A-dnTGFβRII、DLL3-CAR-dnTGFβRII、DLL3-CAR-NGR-CD7和DLL3-CAR的细胞毒性和细胞因子分泌。特别地，将SHP77细胞与CAR-T和unT共孵育22h。然后，测量LDH(乳酸脱氢酶)水平。如图34C-34F中显示，mbNGR组合TGF-βDNR装甲的CAR针对SHP77和HUVEC的细胞毒性水平与常规CAR-T细胞相当。这些结果表明，mbNGR组合TGF-βDNR装甲对CAR-T细胞针对靶细胞的细胞毒性没有影响；同时mbNGR组合TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞不会对内皮细胞产生细胞毒性。然后取共培养物的上清液通过HTFR方法进行IFN-γ测量。如图35C-35F中显示，所有CAR-T细胞的IFN-γ分泌通过SHP77共培养物被高度激活。与仅CAR-T细胞相比，与HUVEC共培养后，没有任何mbNGR组合TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞表现出IFN-γ分泌增加。这些结果表明，mbNGR组合TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞对内皮细胞是安全的。
实例20：mbRGD/mbNGR组合TGF-βDNR装甲的CAR-T细胞在体内表现出优异的肿瘤浸润
为了研究mbRGD/mbNGR组合TGF-βDNR装甲的CAR-T是否具有增强的肿瘤浸润，我们进行了体内测定以确定不同CAR-T的肿瘤浸润。首先，将NCI-H82细胞皮下植入至NCG小鼠。使肿瘤生长至280-330mm3。然后静脉内输注2M的DLL3-CAR-dnTGFβRII、DLL3-CAR-CD28SP-RGD-(G4S)-dnTGFβRII、DLL3-CAR-CD28SP-NGR-(G4S)-dnTGFβRII或DLL3-CAR-NGR-(G4S)-NGR-CD7-T2A-dnTGFβRIICAR-T细胞。输注后5天，对小鼠实施安乐死并切除肿瘤。通过免疫组织化学(IHC)将切除的肿瘤用于sdAb染色，以观察肿瘤中CAR-T浸润的水平。
如图36中显示，在第5天，DLL3-CAR-CD28SP-RGD-(G4S)-dnTGFβRII、DLL3-CAR-CD28SP-NGR-(G4S)-dnTGFβRII和DLL3-CAR-NGR-(G4S)-NGR-CD7-T2A-dnTGFβRIICAR-T细胞均显示比DLL3-CAR-dnTGFβRII更高的sdAb阳性细胞肿瘤浸润。这些结果表明mbRGD/mbNGR组合TGF-βDNR可以增强CAR-T细胞的肿瘤浸润。
***
虽然如上详细描述了本披露的优选实施例，应理解上述段落定义的本披露并不局限于上述说明书中的特定细节，原因是其许多明显变化是可能的而并不背离本披露的主旨或范围。
序列表
<110> 南京传奇生物有限公司（NANJING LEGEND BIOTECH CO., LTD.）
<120> 工程化的免疫细胞及其用途
<130> 76142-20038.40
<140> 尚未指定
<141> 与本文同时
<150> PCT/CN2021/085325
<151> 2021-04-02
<160> 58
<170> Windows 4.0版的FastSEQ
<210> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
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Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly Leu Cys Leu Leu Val Met
1 5 10 15
Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly Leu Gly Leu Gly Met Phe
20 25 30
<210> 8
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
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1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
20 25 30
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Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Tyr Ser Ser
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
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Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成构建体
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1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
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65 70 75 80
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Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
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Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Tyr Ser Ser
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
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Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln
405 410 415
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Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
435 440 445
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
450 455 460
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545 550 555 560
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys
565 570 575
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
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1 5 10 15
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50 55 60
Gly Leu Glu Gly Val Ala Ala Ile Thr Val Gly Ser Gly Asn Thr Tyr
65 70 75 80
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Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Tyr Ser Ser
180 185 190
Asn Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu
195 200 205
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210 215 220
Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
225 230 235 240
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
245 250 255
Cys Ala Ala Ser Ser Arg His Arg Leu Gly Leu Asn Asn Pro Arg Asp
260 265 270
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
325 330 335
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
340 345 350
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
355 360 365
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
370 375 380
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
385 390 395 400
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
420 425 430
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
435 440 445
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
450 455 460
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485 490 495
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500 505 510
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530 535 540
Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly Leu Gly Leu
545 550 555 560
Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
565 570 575
Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
580 585 590
Ser Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys
595 600
<210> 12
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
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1 5 10 15
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20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
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115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 13
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Pro Pro Arg Ala Ser Ala Leu Pro Ala Pro Pro Thr Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Pro Asp Pro Gln Thr Ala Ser Ala Leu Pro Asp Pro Pro Ala Ala Ser
20 25 30
Ala Leu Pro
35
<210> 14
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Ala Ala Leu Ala Val Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Val
1 5 10 15
Ala Cys Val Leu Ala
20
<210> 15
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Asp Asn
1
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn
1 5 10
<210> 17
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile
1 5 10 15
Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu
20 25 30
Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp
35 40 45
Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met
50 55 60
Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg
65 70 75 80
Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro
85 90 95
Asp Asn
<210> 18
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe
1 5 10 15
Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg
20 25 30
Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val
35 40 45
<210> 19
<211> 888
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Phe Ser
35 40 45
Gly Tyr Gly Val Ser Thr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Gly Val Ala Ala Ile Thr Val Gly Ser Gly Asn Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
85 90 95
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Val Gly Tyr Leu Ser Gly Gly Ser Trp Asp
115 120 125
Val Pro Gly Arg Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
130 135 140
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Tyr Ser Ser
180 185 190
Asn Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu
195 200 205
Val Ala Val Ile Tyr Thr Arg Gly Gly His Thr Tyr Tyr Val Asp Ser
210 215 220
Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
225 230 235 240
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245 250 255
Cys Ala Ala Ser Ser Arg His Arg Leu Gly Leu Asn Asn Pro Arg Asp
260 265 270
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr
275 280 285
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
290 295 300
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
305 310 315 320
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
325 330 335
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
340 345 350
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
355 360 365
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
370 375 380
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
385 390 395 400
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
420 425 430
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
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Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
450 455 460
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
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Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
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515 520 525
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530 535 540
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys
565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr
675 680 685
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Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser
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Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly
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Gly Tyr Gly Val Ser Thr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Gly Val Ala Ala Ile Thr Val Gly Ser Gly Asn Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
85 90 95
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Val Gly Tyr Leu Ser Gly Gly Ser Trp Asp
115 120 125
Val Pro Gly Arg Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
130 135 140
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Tyr Ser Ser
180 185 190
Asn Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu
195 200 205
Val Ala Val Ile Tyr Thr Arg Gly Gly His Thr Tyr Tyr Val Asp Ser
210 215 220
Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
225 230 235 240
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
245 250 255
Cys Ala Ala Ser Ser Arg His Arg Leu Gly Leu Asn Asn Pro Arg Asp
260 265 270
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr
275 280 285
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
290 295 300
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
305 310 315 320
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
325 330 335
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
340 345 350
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
355 360 365
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
370 375 380
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
385 390 395 400
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
420 425 430
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
435 440 445
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
450 455 460
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
465 470 475 480
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
485 490 495
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly
500 505 510
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
515 520 525
Pro Gly Pro Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys
530 535 540
Cys Pro Tyr Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser
545 550 555 560
His Phe Cys Ser Gly Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Gly
565 570 575
Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Pro Ser Ile Ser Asp
580 585 590
Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr Ser
595 600 605
Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu Glu
610 615 620
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625 630 635 640
Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr Asn His Ser
645 650 655
Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn Gln Thr Phe
660 665 670
Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Leu Leu Pro
675 680 685
Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile Cys
690 695 700
Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg Asn
705 710 715 720
Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val
725 730
<210> 26
<211> 635
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
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Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Phe Ser
35 40 45
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65 70 75 80
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130 135 140
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
165 170 175
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180 185 190
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275 280 285
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305 310 315 320
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
325 330 335
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
340 345 350
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
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Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
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Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
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1 5 10 15
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Thr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
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<211> 125
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Asn
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Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu Val
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
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Gly
<210> 31
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
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1 5 10 15
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
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<211> 17
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<220>
<223> 合成构建体
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1 5 10 15
Gly
<210> 34
<211> 16
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
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1 5 10 15
<210> 35
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Phe
35 40 45
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100 105 110
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Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
165 170 175
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Tyr Ser
180 185 190
Ser Asn Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
195 200 205
Glu Val Ala Val Ile Tyr Thr Arg Gly Gly His Thr Tyr Tyr Val Asp
210 215 220
Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Ser
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Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
245 250 255
Tyr Cys Ala Ala Ser Ser Arg His Arg Leu Gly Leu Asn Asn Pro Arg
260 265 270
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275 280 285
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Gly
290 295 300
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305 310 315 320
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340 345 350
Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser
355 360 365
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370 375 380
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Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val
405 410 415
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420 425 430
Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala
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Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro
450 455 460
Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser
465 470 475 480
Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
485
<210> 36
<211> 613
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Phe
35 40 45
Ser Gly Tyr Gly Val Ser Thr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Ala Ile Thr Val Gly Ser Gly Asn Thr
65 70 75 80
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Val Gly Tyr Leu Ser Gly Gly Ser Trp
115 120 125
Asp Val Pro Gly Arg Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
130 135 140
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
165 170 175
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Tyr Ser
180 185 190
Ser Asn Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
195 200 205
Glu Val Ala Val Ile Tyr Thr Arg Gly Gly His Thr Tyr Tyr Val Asp
210 215 220
Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Ser
225 230 235 240
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
245 250 255
Tyr Cys Ala Ala Ser Ser Arg His Arg Leu Gly Leu Asn Asn Pro Arg
260 265 270
Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Gly
290 295 300
Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile
305 310 315 320
Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu
325 330 335
Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp
340 345 350
Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser
355 360 365
Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys
370 375 380
Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu
385 390 395 400
Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val
405 410 415
Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser
420 425 430
Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala
435 440 445
Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro
450 455 460
Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser
465 470 475 480
Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu
485 490 495
Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Pro Met
500 505 510
Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly Met Leu Val
515 520 525
Ala Ser Cys Leu Gly Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Gly
530 535 540
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Pro Arg
545 550 555 560
Ala Ser Ala Leu Pro Ala Pro Pro Thr Gly Ser Ala Leu Pro Asp Pro
565 570 575
Gln Thr Ala Ser Ala Leu Pro Asp Pro Pro Ala Ala Ser Ala Leu Pro
580 585 590
Ala Ala Leu Ala Val Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Val
595 600 605
Ala Cys Val Leu Ala
610
<210> 37
<211> 621
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
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1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Phe
35 40 45
Ser Gly Tyr Gly Val Ser Thr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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115 120 125
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130 135 140
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
165 170 175
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Tyr Ser
180 185 190
Ser Asn Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
195 200 205
Glu Val Ala Val Ile Tyr Thr Arg Gly Gly His Thr Tyr Tyr Val Asp
210 215 220
Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Ser
225 230 235 240
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
245 250 255
Tyr Cys Ala Ala Ser Ser Arg His Arg Leu Gly Leu Asn Asn Pro Arg
260 265 270
Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Gly
290 295 300
Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile
305 310 315 320
Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu
325 330 335
Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp
340 345 350
Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser
355 360 365
Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys
370 375 380
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385 390 395 400
Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val
405 410 415
Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser
420 425 430
Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala
435 440 445
Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro
450 455 460
Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser
465 470 475 480
Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu
485 490 495
Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Pro Met
500 505 510
Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly Met Leu Val
515 520 525
Ala Ser Cys Leu Gly Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Gly
530 535 540
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys
545 550 555 560
Asp Asp Asp Asp Lys Pro Pro Arg Ala Ser Ala Leu Pro Ala Pro Pro
565 570 575
Thr Gly Ser Ala Leu Pro Asp Pro Gln Thr Ala Ser Ala Leu Pro Asp
580 585 590
Pro Pro Ala Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Leu Ala Val Ile Ser Phe
595 600 605
Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Val Ala Cys Val Leu Ala
610 615 620
<210> 38
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Cys Asn Gly Arg Cys Gly
1 5
<210> 39
<211> 617
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Phe Ser
35 40 45
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50 55 60
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Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Tyr Ser Ser
180 185 190
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<220>
<223> 合成构建体
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435 440 445
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Val Leu Ala
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<220>
<223> 合成构建体
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1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
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1 5 10 15
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20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
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<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
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Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
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Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly
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Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
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Gly Pro Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile
530 535 540
Gln Val Thr Gly Cys Asn Gly Arg Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Thr
545 550 555 560
Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr
565 570 575
Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
580 585 590
Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
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Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val
610 615 620
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
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Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
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Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
660 665 670
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
675 680 685
Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln Val
690 695 700
Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val Ile
705 710 715 720
Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser
725 730 735
<210> 55
<211> 852
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
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850
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<211> 860
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
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Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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<210> 57
<211> 863
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
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1 5 10 15
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20 25 30
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325 330 335
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370 375 380
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530 535 540
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545 550 555 560
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595 600 605
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Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser
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<210> 58
<211> 871
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Phe Ser
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835 840 845
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850 855 860
Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser
865 870

Claims (68)

1.一种免疫效应细胞，其表达：
(a)功能性外源受体，以及
(b)外源肿瘤归巢肽(THP)。
2.如权利要求1所述的免疫效应细胞，其中所述功能性外源受体选自由嵌合抗原受体(CAR)、工程化T细胞受体(TCR)、嵌合TCR(cTCR)、T细胞抗原偶联物(TAC)、TAC样嵌合受体及它们的组合组成的组。
3.如权利要求2所述的免疫效应细胞，其中所述功能性外源受体是CAR，并且其中所述CAR包含：(i)胞外抗原结合结构域、(ii)跨膜结构域、和(iii)胞内信号传导结构域，任选地，所述CAR进一步包含铰链结构域。
4.如权利要求3所述的免疫效应细胞，其中所述胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。
5.如权利要求4所述的免疫效应细胞，其中所述初级胞内信号传导结构域来自CD3ζ。
6.如权利要求3至5中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。
7.如权利要求3至6中任一项所述的免疫效应细胞，其进一步包含信号肽，其中所述信号肽来自CD8或CD28。
8.如权利要求1至7中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、可以分化出淋巴样细胞的干细胞及它们的组合组成的组。
9.如权利要求8所述的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞是T细胞。
10.如权利要求3至9中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述CAR是抗DLL3CAR。
11.如权利要求10所述的免疫效应细胞，其中所述抗DLL3 CAR包含第一VHH抗体部分和第二VHH抗体部分，所述第一VHH抗体部分包含：CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；和CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；所述第二VHH抗体部分包含：CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；和CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体。
12.如权利要求10或权利要求11所述的免疫效应细胞，其中所述抗DLL3 CAR包含第一VHH抗体部分和第二VHH抗体部分，所述第一VHH抗体部分包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述第二VHH抗体部分包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
13.如权利要求10所述的免疫效应细胞，其中所述抗DLL3 CAR包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
14.如权利要求3至9中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述CAR是抗MSLN CAR。
15.如权利要求14所述的免疫效应细胞，其中所述抗MSLN CAR包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列或与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
16.如权利要求3至9中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述CAR是抗GPC2CAR。
17.如权利要求16所述的免疫效应细胞，其中所述抗GPC2 CAR包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列或与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
18.如权利要求1至17中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述THP选自由基于精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的肽、基于天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(NGR)的肽及它们的组合组成的组。
19.如权利要求1至18中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述THP包含具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的RGD-4C肽。
20.如权利要求1至18中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述THP包含具有SEQ IDNO:38的氨基酸序列的NGR肽。
21.如权利要求3至20中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述THP与跨膜结构域和/或铰链结构域融合。
22.如权利要求21所述的免疫效应细胞，其中所述跨膜结构域和/或所述铰链结构域来自CD7或TR2。
23.如权利要求22所述的免疫效应细胞，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，并且所述铰链结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
24.如权利要求1至23中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述THP与TGF-β显性负受体(TGF-βDNR)融合。
25.如权利要求24所述的免疫效应细胞，所述免疫效应细胞包含多肽，所述多肽包含：
i)SEQ ID NO:55的氨基酸序列或与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
ii)SEQ ID NO:57的氨基酸序列或与SEQ ID NO:57的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
iii)SEQ ID NO:54的氨基酸序列或与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
iv)SEQ ID NO:56的氨基酸序列或与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
v)SEQ ID NO:58的氨基酸序列或与SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
vi)SEQ ID NO:53的氨基酸序列或与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；或
vii)SEQ ID NO:52的氨基酸序列或与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
26.如权利要求1至25中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述THP与GPI融合。
27.如权利要求1或2所述的免疫效应细胞，其中所述功能性外源受体是cTCR。
28.如权利要求27所述的免疫效应细胞，其中所述cTCR是抗DLL3 cTCR。
29.如权利要求28所述的免疫效应细胞，其中所述抗DLL3 cTCR包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列或与SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
30.如权利要求1-29中任一项所述的免疫效应细胞，其包含
(i)具有SEQ ID NO:10、11、19、21-26、36、37、39-40、42、43、45、46、49、50和52-58中任一个所示的氨基酸序列的多肽；或
(ii)与SEQ ID NO:10、11、19、21-26、36、37、39-40、42、43、45、46、49、50和52-58中任一个具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽。
31.一种多肽，其包含：
(a)功能性外源受体，以及
(b)外源THP。
32.如权利要求31所述的多肽，其中所述功能性外源受体选自由CAR、工程化TCR、cTCR、TAC、TAC样嵌合受体及它们的组合组成的组。
33.如权利要求32所述的多肽，其中所述功能性外源受体是CAR，并且其中所述CAR包含：(i)胞外抗原结合结构域、(ii)跨膜结构域、和(iii)胞内信号传导结构域，任选地，所述CAR进一步包含铰链结构域。
34.如权利要求33所述的多肽，其中所述胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。
35.如权利要求34所述的多肽，其中所述初级胞内信号传导结构域来自CD3ζ。
36.如权利要求33至35中任一项所述的多肽，其中所述胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。
37.如权利要求33至36中任一项所述的多肽，其进一步包含信号肽，其中所述信号肽来自CD28或CD8。
38.如权利要求33至37中任一项所述的多肽，其中所述CAR是抗DLL3 CAR。
39.如权利要求38所述的多肽，其中所述抗DLL3 CAR包含第一VHH抗体部分和第二VHH抗体部分，所述第一VHH抗体部分包含：CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；和CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；所述第二VHH抗体部分包含：CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体；和CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列或其包含多达大约3个氨基酸取代的变体。
40.如权利要求38或39所述的多肽，其中所述抗DLL3 CAR包含第一VHH抗体部分和第二VHH抗体部分，所述第一VHH抗体部分包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述第二VHH抗体部分包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与SEQID NO:28的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
41.如权利要求38所述的多肽，其中所述抗DLL3 CAR包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
42.如权利要求33至37中任一项所述的多肽，其中所述CAR是抗MSLN CAR。
43.如权利要求42所述的多肽，其中所述抗MSLN CAR包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列或与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
44.如权利要求33至37中任一项所述的多肽，其中所述CAR是抗GPC2 CAR。
45.如权利要求44所述的多肽，其中所述抗GPC2 CAR包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列或与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
46.如权利要求31至45中任一项所述的多肽，其中所述外源THP选自由基于RGD的肽、基于NGR的肽及它们的组合组成的组。
47.如权利要求31至46中任一项所述的多肽，其中所述THP包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的RGD-4C肽。
48.如权利要求31至46中任一项所述的多肽，其中所述THP包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的NGR肽。
49.如权利要求31至48中任一项所述的多肽，其中所述THP与跨膜结构域和/或铰链结构域融合。
50.如权利要求49所述的多肽，其中所述跨膜结构域和/或所述铰链结构域来自CD7。
51.如权利要求50所述的多肽，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，并且所述铰链结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
52.如权利要求51所述的多肽，其中所述跨膜结构域和/或所述铰链结构域来自TR2。
53.如权利要求31至52中任一项所述的多肽，其中所述THP与TGF-βDNR融合。
54.如权利要求53所述的多肽，其包含：
i)SEQ ID NO:55的氨基酸序列或与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
ii)SEQ ID NO:57的氨基酸序列或与SEQ ID NO:57的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
iii)SEQ ID NO:54的氨基酸序列或与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
iv)SEQ ID NO:56的氨基酸序列或与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
v)SEQ ID NO:58的氨基酸序列或与SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
vi)SEQ ID NO:53的氨基酸序列或与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；或
vii)SEQ ID NO:52的氨基酸序列或与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
55.如权利要求31至54中任一项所述的多肽，其中所述功能性外源受体位于所述外源THP的N末端或C末端。
56.如权利要求31至32中任一项所述的多肽，其中所述功能性外源受体是cTCR。
57.如权利要求56所述的多肽，其中所述cTCR是抗DLL3 cTCR，并且所述抗DLL3 cTCR包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列或与SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
58.如权利要求31至57中任一项所述的多肽，其包含
(i)SEQ ID NO:10、11、19、21-26、36、37、39-40、42、43、45、46、49、50和52-58中任一个所示的氨基酸序列；或
(ii)与SEQ ID NO:10、11、19、21-26、36、37、39-40、42、43、45、46、49、50和52-58中任一个具有至少75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
59.一种分离的核酸，其包含编码如权利要求31至58中任一项所述的多肽的核酸序列。
60.一种载体，其包含如权利要求59所述的分离的核酸。
61.一种宿主细胞，其包含如权利要求60所述的载体。
62.一种制造如权利要求1至30中任一项所述的免疫效应细胞的方法，所述方法包括向免疫效应细胞中引入：
(a)如权利要求59所述的核酸或如权利要求60所述的载体；或
(b)包含两种核酸的组合物，所述两种核酸各自编码：
(i)功能性外源受体，以及
(ii)外源THP。
63.一种根据如权利要求62所述的方法产生的免疫效应细胞。
64.一种药物组合物，其包含如权利要求1至30中任一项所述的免疫效应细胞、如权利要求31至58中任一项所述的多肽、如权利要求59所述的核酸、或如权利要求60所述的载体，以及药学上可接受的载剂。
65.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求64所述的药物组合物。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述疾病或病症选自由癌症、感染性疾病、炎症性疾病、自身免疫性疾病及它们的组合组成的组。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述癌症是实体瘤癌症或血液癌症。
68.如权利要求66或67所述的方法，其中所述癌症是小细胞肺癌(SCLC)、卵巢癌(OC)或神经母细胞瘤(NBL)。
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