TW202328435A - 表現ｔｌｒ受體之經修飾的免疫細胞 - Google Patents
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Abstract
本申請提供了表現TLR受體的經修飾的免疫細胞。在一些實施方式中，該經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）。本申請還提供了使用本文所述之經修飾的免疫細胞用於癌症治療之方法和藥物組成物。
Description
本申請關於表現TLR受體的經修飾的免疫細胞，以及使用其用於治療疾病或病症如癌症之方法。
嵌合抗原受體（CAR）T細胞係已經被修飾以產生工程化T細胞受體從而引發免疫反應的細胞。例如，CAR-T細胞可以被設計成更有效地識別癌細胞，用於改善癌症療法。儘管CAR-T療法取得了成功，但該等方法通常存在體內T細胞擴增和衰竭不佳的問題，從而導致患有血液惡性腫瘤（例如，急性髓性白血病）的患者臨床緩解的持久性降低。仍然需要高效的基於細胞的癌症免疫療法。
NKG2D係一種跨膜蛋白，屬於C型凝集素樣受體的NKG2家族。在人類中，其由NK細胞、γδ T細胞和CD8+ αβ T細胞表現。NKG2D配位基係來自MIC和RAET1/ULBP家族的誘導自體蛋白，其在正常細胞表面上完全不存在或僅以低水平存在，但它們被經感染、轉化、衰老和應激細胞過量表現（Zingoni, A等人, 2018, Front Immunol. 9:476）。
Toll樣受體（TLR）係檢測入侵病原體並活化先天和適應性免疫反應的模式識別受體。TLR作為T細胞上的有效共刺激分子，並在活化的T細胞（例如，記憶CD4+和CD8+ T細胞）的細胞表面上表現。因此，T細胞上TLR的活化直接增強了T細胞受體（TCR）信號誘導的T細胞活化、功能和存活（Gelman, AE等人, 2004, 172(10): 6065-6073）。鑒於它們在免疫系統中的關鍵作用，TLR活化已被用於增強免疫反應。相反，TLR活化的抑制劑可以減少自體免疫和其他不希望的免疫反應（Lu, H, 2014, Front. in Immunol. 5:83）。研究顯示，表現CAR的工程化免疫細胞如T細胞可以用toll/白細胞介素-1（IL-1）受體（TIR）結構域裝甲，以提供增強的抗腫瘤活性。參見，例如Manavalan, B等人, 2011, Front. Physiol. 2:41。
本文提到的所有出版物、專利、專利申請和公開的專利申請的揭露內容藉由援引以其全文特此併入本文。
[相關申請的交叉引用]
本申請要求2021年8月18日提交的國際申請案號PCT/CN2021/113239、2021年9月30日提交的國際申請案號PCT/CN2021/122129、2021年11月25日提交的國際申請案號PCT/CN2021/133061和2022年8月15日提交的國際申請案號PCT/CN2022/112578的優先權，將其內容藉由援引以其全文併入本文。
[序列表以ASCII文字檔提交]
以下以ASCII文字檔提交的內容藉由援引以其全文併入本文：電腦可讀形式（CRF）的序列表（檔案名：P22062TW_SequenceList_FV.xml，記錄日期：2022年12月13日，大小：129 KB）。
本申請提供了表現TLR受體的經修飾的免疫細胞，以及使用其用於治療疾病或病症如癌症之方法。
本申請的一方面提供了經修飾的免疫細胞，其包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域；其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。
在根據經修飾的免疫細胞的一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合多聚體靶分子的亞基。在一些實施方式中，多聚體靶分子的亞基相同。在一些實施方式中，多聚體靶分子的亞基不同。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二結合結構域結合相同的靶分子。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二結合結構域各自結合靶分子上的相同靶位點。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域相同。
本申請的另一方面提供了根據經修飾的免疫細胞的經修飾的免疫細胞，其中第一靶結合結構域和第二結合結構域結合上述相同的靶分子，其中第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合單個靶分子上不同的非重疊靶位點。
在根據上述經修飾的免疫細胞中任一個的一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域和第一TLR傳訊結構域衍生自相同TLR分子。在一些實施方式中，第二TLR跨膜結構域和第二TLR傳訊結構域衍生自相同TLR分子。在一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域和第二TLR跨膜結構域相同。在一些實施方式中，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相同。在一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域和/或第一TLR傳訊結構域衍生自TLR4。在一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域和第二TLR跨膜結構域不同。在一些實施方式中，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域不同。在一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域和/或第一TLR傳訊結構域衍生自TLR2。在一些實施方式中，第二TLR跨膜結構域和/或第一TLR傳訊結構域衍生自TLR6。在一些實施方式中，第二TLR跨膜結構域和/或第二TLR傳訊結構域衍生自TLR1。
在根據上述經修飾的免疫細胞中任一個的一些實施方式中，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係抗體部分或其抗原結合片段。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係scFv或sdAb。在一些實施方式中，scFv或sdAb特異性結合CD33、CLL1、CD123、CD19、CD20、CD22、BCMA、GPRC5D和GPC3。
在根據上述經修飾的免疫細胞中任一個的一些實施方式中，靶分子係免疫檢查點蛋白。在一些實施方式中，靶分子選自由以下組成之群組：PD-1、CD70、CD27、SIRPα和TIGIT。
在根據上述經修飾的免疫細胞中任一個的一些實施方式中，靶分子係在免疫細胞上表現的天然蛋白質。在一些實施方式中，靶分子係NKG2D。在一些實施方式中，靶分子係突變的NKG2D。在一些實施方式中，突變的NKG2D包含截短的序列和/或胺基酸取代、突變、添加和/或缺失。
在一些實施方式中，靶分子係NKG2D的細胞外抗原結合結構域。在一些實施方式中，靶分子係NKG2D的全長序列。
在根據上述經修飾的免疫細胞中任一個的一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞係NK細胞。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞係細胞毒性T細胞。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含工程化受體。在一些實施方式中，工程化受體係嵌合抗原受體（CAR）。在一些實施方式中，工程化受體係經修飾的T細胞受體（TCR）。在一些實施方式中，工程化受體係T細胞抗原偶聯劑（TAC）受體。
本申請的另一方面提供了根據上述經修飾的免疫細胞中任一個的經修飾的免疫細胞，其中工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域。在一些實施方式中，工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子上的非重疊靶位點的細胞外結構域。在一些實施方式中，工程化受體包含特異性識別CD19、CLL1、BCMA和GPC3中任一種的細胞外結構域。
在根據上述經修飾的免疫細胞中任一個的一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含編碼第一多肽的第一核酸和編碼第二多肽的第二核酸。
在根據上述經修飾的免疫細胞中任一個的一些實施方式中，第一多肽和第二多肽相同，並且經修飾的免疫細胞包含編碼第一多肽和第二多肽的第一核酸。
在根據上述經修飾的免疫細胞中任一個的一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含編碼工程化受體的第三核酸。在一些實施方式中，第一核酸和第二核酸可操作地連接至同一啟動子。在一些實施方式中，第一核酸和第二核酸可操作地連接至分開的啟動子。在一些實施方式中，第一核酸和第三核酸可操作地連接至同一啟動子。在一些實施方式中，第一核酸和第三核酸可操作地連接至分開的啟動子。在一些實施方式中，第一核酸、第二核酸和第三核酸可操作地連接至同一啟動子。
在根據上述經修飾的免疫細胞中任一個的一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域特異性識別CD20的亞基。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域特異性識別CD33的亞基。在一些實施方式中，第一靶結合結構域特異性識別CD33的V亞基，並且第二靶結合結構域特異性識別CD33的C2亞基。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域特異性識別BCMA的亞基。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域特異性識別GPRC5D的亞基。
在根據上述經修飾的免疫細胞中任一個的一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域。在一些實施方式中，第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的第二細胞內結構域。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，並且第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的第二細胞內結構域。在一些實施方式中，第一細胞內結構域和第二細胞內結構域相同。在一些實施方式中，第一細胞內結構域和第二細胞內結構域不同。在一些實施方式中，第一細胞介素受體選自由以下組成之群組：GM-CSF受體、IL-18受體、IL-21受體、IL-15受體和IL-23受體。在一些實施方式中，第二細胞介素受體選自由以下組成之群組：GM-CSF受體、IL-18受體、IL-21受體、IL-15受體和IL-23受體。在一些實施方式中，第一細胞介素受體的第一細胞內結構域包含基於免疫受體酪胺酸的活化模體（ITAM）。在一些實施方式中，第二細胞介素受體的第二細胞內結構域包含基於免疫受體酪胺酸的活化模體（ITAM）。在一些實施方式中，第一細胞介素受體的第一細胞內結構域和第二細胞介素受體的第二細胞內結構域包含基於免疫受體酪胺酸的活化模體（ITAM）。在一些實施方式中，第一細胞介素受體的第一細胞內結構域的C-末端與第一TLR傳訊結構域的N-末端融合。在一些實施方式中，第二細胞介素受體的第二細胞內結構域的C-末端與第二TLR傳訊結構域的N-末端融合。在一些實施方式中，第一細胞介素受體的第一細胞內結構域的C-末端與第一TLR傳訊結構域的N-末端融合；並且，第二細胞介素受體的第二細胞內結構域的C-末端與第二TLR傳訊結構域的N-末端融合。在一些實施方式中，第一細胞介素受體的第一細胞內結構域的N-末端與TLR傳訊結構域的C-末端融合。在一些實施方式中，第二細胞介素受體的第二細胞內結構域的N-末端與TLR傳訊結構域的C-末端融合。在一些實施方式中，第一細胞介素受體的第一細胞內結構域的N-末端與TLR傳訊結構域的C-末端融合；並且，第二細胞介素受體的第二細胞內結構域的N-末端與TLR傳訊結構域的C-末端融合。
本申請的一方面提供了產生經修飾的免疫細胞之方法，該方法包括：將編碼第一多肽的第一核酸和視需要的編碼第二多肽的第二核酸引入前驅免疫細胞（precursor immune cell）中。
在根據上述產生方法中任一個的一些實施方式中，前驅免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、NK細胞、NK-T細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。在一些實施方式中，前驅免疫細胞包含工程化受體。在一些實施方式中，該產生方法進一步包括將編碼工程化受體的第三核酸引入前驅免疫細胞中。在一些實施方式中，工程化受體係嵌合抗原受體（CAR）、經修飾的T細胞受體（TCR）或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。
在根據上述產生方法中任一個的一些實施方式中，第一核酸、第二核酸和/或第三核酸在同一載體上。在一些實施方式中，載體係病毒載體。在一些實施方式中，病毒載體選自由腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、單純皰疹病毒載體及其衍生物組成之群組。
在根據上述產生方法中任一個的一些實施方式中，該方法進一步包括分離或富集包含第一核酸、第二核酸和/或第三核酸的免疫細胞。
還提供了藉由根據上述產生方法中任一個之方法產生的經修飾的免疫細胞。
還提供了藥物組成物，其包含根據上述經修飾的免疫細胞中任一個的經修飾的免疫細胞和藥學上可接受的載劑。
本申請的另一個方面提供了治療個體的疾病之方法，該方法包括向該個體投與有效量的根據上述藥物組成物中任一個的藥物組成物。在一些實施方式中，該疾病係癌症。在一些實施方式中，該個體係人。
還提供了包含該等經修飾的免疫細胞中任一個的組成物、用途、套件和製品。
本申請提供了包含Toll樣受體（TLR）共刺激分子（例如，TLR多肽）的經修飾的免疫細胞，以及使用其用於治療癌症之方法。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含含有第一TLR多肽和第二TLR多肽的基於TLR的多聚體，與不表現所述多肽的經修飾的免疫細胞相比，該等經修飾的免疫細胞具有有效且持久的腫瘤溶解活性和改善的衰竭特徵。在一些實施方式中，第一TLR多肽包含：i) 第一靶結合結構域（例如，抗體部分或其片段），ii) 第一TLR跨膜結構域，和iii) 第一TLR傳訊結構域；並且第二TLR多肽包含：i) 第二靶結合結構域（例如，抗體部分或其片段），ii) 第二TLR跨膜結構域，和iii) 第二TLR傳訊結構域。在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞係T細胞。
在一些實施方式中，經修飾的細胞進一步表現特異性識別感興趣的靶抗原的嵌合抗原受體（CAR）。本文所述之TLR多肽增加CAR-T細胞增殖並增強抗腫瘤活性。
TLR多肽上的TLR傳訊的活化係靶依賴性的，並且藉由二聚化或多聚化的TLR多肽以及TLR多肽與相應靶分子結合後TLR傳訊部分的形成而起始。本申請提供了用於誘導TLR傳訊部分形成的多種策略。在第一種策略中，第一多肽的第一靶結合結構域和第二多肽的第二結合結構域各自結合多聚體靶分子的亞基。在靶結合結構域與其同源靶亞基結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成TLR傳訊部分。在第二種策略中，第一多肽的第一靶結合結構域和第二多肽的第二結合結構域各自結合靶分子上不同的非重疊靶位點。在靶結合結構域與其同源靶分子結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成TLR傳訊部分。在第三種策略中，當免疫細胞包含含有細胞外結構域的工程化受體時，細胞外結構域和第一或第二靶結合結構域各自結合同一靶分子上不同的非重疊靶側。不受理論的束縛，據信在工程化受體的細胞外結構域與靶分子結合時，在工程化受體周圍形成了免疫突觸。第一和第二多肽被募集至相同的免疫突觸，這允許第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合，從而形成TLR傳訊部分。在另一種策略中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合相同的單體靶分子（例如，在相同的靶位點上），並且第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與靶分子的結合允許第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合，從而形成TLR傳訊部分。
因此，本申請的一方面提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域（例如，抗體部分或其片段)，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域（例如，抗體部分或其片段），ii)第二TLR跨膜結構域，和iii) 第二TLR傳訊結構域，其中第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合多聚體靶分子的亞基，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二結合結構域結合相同的靶分子。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二結合結構域各自結合靶分子上的相同靶位點。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體、經修飾的T細胞受體或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。
本申請的另一方面提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域（例如，抗體部分或其片段)，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域（例如，抗體部分或其片段），ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中第一靶結合結構域和第二結合結構域結合相同的靶分子，並且其中第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合單個靶分子上不同的非重疊靶位點，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、經修飾的T細胞受體或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。
本申請的另一方面提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域（例如，抗體部分或其片段)，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域（例如，抗體部分或其片段），ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，和c)工程化受體（例如，CAR），其中工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子上的非重疊靶位點的細胞外結構域。
還提供了包含該等經修飾的免疫細胞的組成物（如藥物組成物）、套件和製品，以及使用本文所述之經修飾的免疫細胞治療疾病或病症（例如，癌症）之方法。
I. 定義
如本文所用，「治療（treatment或treating）」係用於獲得有益的或所希望的結果（包括臨床結果）之方法。出於本揭露之目的，有益的或所希望的臨床結果包括但不限於以下中的一種或多種：緩解由疾病引起的一種或多種症狀、減弱疾病的程度、穩定疾病（例如，預防或延遲疾病的惡化）、預防或延遲疾病的擴散（例如，轉移）、預防或延遲疾病的復發、延遲或減緩疾病的進展、改善疾病狀態、提供疾病的緩解（部分或全部）、減少治療疾病所需的一種或多種其他藥物的劑量、延遲疾病的進展、提高生活品質、和/或延長生存期。「治療」還涵蓋減少疾病（例如，癌症）的病理後果。本申請之方法考慮了該等治療方面中的任一個或多個。
術語「預防（prevent）」和如「預防（prevented、preventing）」等類似詞語表示用於預防、抑制或降低疾病或病症（例如，癌症）復發的可能性之方法。它還指延遲疾病或病症的復發或延遲疾病或病症的症狀的復發。如本文所用，「預防（prevention）」和類似詞語還包括在疾病或病症復發之前降低疾病或病症的強度、作用，減少症狀和/或負擔。
如本文所用，「延遲」癌症的發展係指推遲、阻礙、減緩、減慢、穩定和/或延緩疾病的發展。這種延遲可以具有不同的時間長度，其取決於疾病的歷史和/或被治療的個體。與不使用該方法相比，「延遲」癌症的發展之方法係在給定的時間範圍內降低疾病發展的可能性和/或在給定的時間範圍內降低疾病程度之方法。此類比較通常基於使用統計學上顯著數量的個體進行的臨床研究。可以使用標準方法來檢測癌症發展，該等標準方法包括但不限於電腦化軸向斷層掃描（CAT掃描）、核磁共振成像（MRI）、腹部超音波、凝血試驗、動脈造影術或生檢。發展也可以指最初可能無法檢測到的癌症進展，並且包括發生、復發和發作。
本文所用的術語「有效量」係指足以治療特定障礙、病症或疾病如以改善、減輕、減少和/或延遲其一種或多種症狀的藥劑或藥劑組合的量。關於癌症，有效量包括足以引起腫瘤縮小和/或降低腫瘤的生長速率（如抑制腫瘤生長）或者預防或延遲其他不希望的細胞增殖的量。在一些實施方式中，有效量係足以延遲疾病發展的量。在一些實施方式中，有效量係足以預防或延遲復發的量。有效量能夠以一次或多次投與來進行投與。藥物或組成物的有效量可以：(i)減少癌細胞的數量；(ii)減小腫瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、減慢、減緩並且較佳的是阻止癌細胞浸潤到外周器官中；(iv)抑制（即，在一定程度上減慢並且較佳的是阻止）腫瘤轉移；(v)抑制腫瘤生長；(vi)預防或延遲腫瘤的發生和/或復發；和/或 (vii)在一定程度上緩解與癌症相關的一種或多種症狀。
如本文所用，「個體」或「受試者」係指哺乳動物，包括但不限於人、牛、馬、貓、犬、齧齒動物或靈長類動物。在一些實施方式中，該個體係人。
「分離的」核酸係指已經從其天然環境的組分中分離的核酸分子。分離的核酸包括通常包含核酸分子的細胞中所含的該核酸分子，但是該核酸分子存在於染色體外或與其天然染色體位置不同的染色體位置。
如本文所用，術語「載體」係指能夠繁殖與其連接的另一核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製核酸結構的載體，以及摻入已引入載體的宿主細胞基因組中的載體。某些載體能夠引導與其可操作地連接的核酸的表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。
如本文所用，術語「轉染的」或「轉化的」或「轉導的」係指將異源核酸轉移或引入宿主細胞中的過程。「轉染的」或「轉化的」或「轉導的」細胞係已經用異源核酸轉染、轉化或轉導的細胞。該細胞包括原代目標細胞及其子代。
將關於本文鑒定的多肽序列的「胺基酸序列一致性百分比（%）」定義為在比對序列（將任何保守取代作為序列一致性的一部分）後，候選序列中與所比較多肽中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分比。出於確定胺基酸序列一致性百分比的目的，可以用本領域技術中的多種方式來實現比對，例如使用公眾可得的電腦軟體，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign（DNASTAR）或MUSCLE軟體。熟悉該項技術者可以確定用於測量比對的適當參數，包括需要在被比較序列的全長範圍實現最大比對的任何演算法。然而，出於本文的目的，使用序列比較電腦程式MUSCLE生成胺基酸序列一致性%值（Edgar, R.C.,
Nucleic Acids Research32(5):1792-1797, 2004；Edgar, R.C.,
BMC Bioinformatics5(1):113, 2004）。
如本文所用，「嵌合抗原受體」或「CAR」係指將一種或多種抗原特異性移植到細胞如T細胞上的基因工程化受體。CAR也被稱為「人工T細胞受體」、「嵌合T細胞受體」或「嵌合免疫受體」。在一些實施方式中，CAR包含對腫瘤抗原有特異性的抗體的細胞外可變結構域和T細胞或其他受體的細胞內傳訊結構域，如一個或多個共刺激結構域。「CAR-T」係指表現CAR的T細胞。如本文所用，「CLL1 CAR」係指特異性識別CLL1的CAR，「CD19 CAR」係指特異性識別CD19的CAR，「GPC3 CAR」係指特異性識別GPC3的CAR，並且「BCMA CAR」係指特異性識別BCMA的CAR。
如本文所用，「T細胞受體」或「TCR」係指包含細胞外抗原結合結構域的內源或經修飾的T細胞受體，該細胞外抗原結合結構域與MHC分子中結合的特異性抗原肽結合。在一些實施方式中，TCR包含TCRα多肽鏈和TCRβ多肽鏈。在一些實施方式中，TCR包含TCRγ多肽鏈和TCRδ多肽鏈。在一些實施方式中，TCR特異性結合腫瘤抗原。「TCR-T」係指表現重組TCR的T細胞。
如本文所用，「T細胞抗原偶聯物受體」或「TAC受體」係指包含與特異性抗原結合的細胞外抗原結合結構域和T細胞受體（TCR）結合結構域、跨膜結構域及共受體分子的細胞內結構域的工程化受體。TAC受體指定表現TAC受體的T細胞的內源TCR以引發針對靶細胞的抗原特異性T細胞反應。
本文中術語「抗體」以最廣泛的含義使用，並且涵蓋多種抗體結構，該等抗體結構包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體（例如，雙特異性抗體）和抗體片段，只要它們表現出所希望的抗原結合活性即可。術語抗體包括但不限於能夠結合抗原的片段，如Fv、單鏈Fv(scFv)、Fab、Fab’和(Fab’)
2。術語抗體包括常規的四鏈抗體和單域抗體，如僅有重鏈的抗體或其片段，例如V
HH。
如本文所用的，術語「結合」、「特異性結合」或「對……有特異性」係指可測量和可再現的相互作用，如標靶與抗體之間的結合，其決定了在異質分子（包括生物分子）群體存在時標靶的存在。例如，結合或特異性結合標靶（可以是表位）的抗體係與此標靶結合的抗體，其親和力、親合力（avidity）、就緒性和/或持續時間優於與其他標靶的結合。在一個實施方式中，抗體與不相關標靶的結合程度小於例如藉由放射免疫測定法（RIA）測量的抗體與標靶的結合的約10%。在某些實施方式中，特異性結合標靶的抗體具有≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM或≤ 0.1 nM的解離常數（Kd）。在某些實施方式中，抗體特異性結合來自不同物種的蛋白質中保守的蛋白質表位。在另一實施方式中，特異性結合可以包括但不要求排他性結合。
術語「細胞」包括原代目標細胞及其子代。
應當理解，本文所述之本揭露之實施方式包括「由實施方式組成」和/或「基本上由實施方式組成」。
本文對「約」值或參數的提及包括（並描述）針對該值或參數本身的變化。例如，涉及「約X」的描述包括「X」的描述。
如本文所用，對「不是」值或參數的提及通常意指並描述「不同於」值或參數。例如，方法不是用於治療X型癌症，意味著該方法用於治療不同於X型的癌症。
本文使用的術語「約X-Y」具有與「約X至約Y」相同的含義。
如本文和所附請求項中所用，單數形式「一個/種（a/an）」和「該等/該（the）」包括複數指代物，除非上下文明確地指示其他的情況。
應理解的是，為清楚起見，在單獨的實施方式的背景下描述的本揭露之某些特徵也可以在單個實施方式中組合提供。相反，為簡潔起見，在單個實施方式的背景下描述的本揭露之不同特徵也可以單獨地或以任何合適的子組合提供。涉及本文所述之經修飾的免疫細胞和治療方法的實施方式的所有組合均明確涵蓋於本申請中，並且就如同每個組合被個別且明確地揭露一樣揭露在本文中。此外，在描述此類變數的實施方式中列出的經修飾的免疫細胞的所有子組合也均明確涵蓋於本申請中，並且就如同蛋白質的每個這種子組合在本文中被個別且明確地揭露一樣揭露在本文中。
II. 經修飾的免疫細胞
本申請的一方面提供了包含第一多肽和第二多肽的經修飾的免疫細胞，其中第一多肽和第二多肽各自編碼包含TLR傳訊結構域的TLR多肽（例如，TLR共刺激多肽）。在一些實施方式中，在TLR多肽與其相應的靶結合時，第一和第二多肽的TLR傳訊結構域相互締合以形成TLR傳訊部分，其中TLR傳訊部分誘導TLR傳訊，從而導致強抗腫瘤效果。第一多肽和第二多肽可以相同或不同。
在一些實施方式中，與不包含所述TLR多肽的經修飾的免疫細胞相比，包含第一和第二TLR多肽的經修飾的免疫細胞具有增加的T細胞受體（TCR）信號誘導的T細胞活化、功能和/或存活。在一些實施方式中，與不包含所述TLR多肽的經修飾的免疫細胞相比，TLR多肽藉由經修飾的免疫細胞誘導增加的腫瘤細胞殺傷功效。在一些實施方式中，與不包含所述TLR多肽的經修飾的免疫細胞相比，TLR多肽誘導增加的腫瘤細胞殺傷功效，如增加至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、12倍、14倍、16倍、20倍、25倍、30倍、40倍或更多中的任一個。在一些實施方式中，與不包含所述TLR多肽的經修飾的免疫細胞相比，TLR多肽對經修飾的免疫細胞賦予持久功效，例如像增加至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更多中的任一個。在一些實施方式中，與包含TLR多肽的經修飾的免疫細胞相比，當投與至個體時，經修飾的免疫細胞具有降低的體內毒性。在一些實施方式中，與包含TLR多肽的經修飾的免疫細胞相比，當投與至個體時，經修飾的免疫細胞減少了體內衰竭。在一些實施方式中，TLR多肽係共刺激分子。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域和第一TLR傳訊結構域衍生自相同TLR分子。在一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域和第一TLR傳訊結構域衍生自不同TLR分子。在一些實施方式中，第二TLR跨膜結構域和第二TLR傳訊結構域衍生自相同TLR分子。在一些實施方式中，第二TLR跨膜結構域和第二TLR傳訊結構域衍生自不同TLR分子。在一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域和第二TLR跨膜結構域相同。在一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域和第二TLR跨膜結構域不同。在一些實施方式中，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域不同。在一些實施方式中，該一個或多個TLR分子選自由以下組成之群組：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9，如TLR1、TLR2、TLR4或TLR6。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分，並且其中第一TLR跨膜結構域、第一TLR傳訊結構域、第二TLR跨膜結構域和第二TLR傳訊結構域衍生自TLR4。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分；其中第一TLR跨膜結構域和第一TLR傳訊結構域衍生自TLR2，並且其中第二TLR跨膜結構域和第二TLR傳訊結構域衍生自TLR1，或者其中第一TLR跨膜結構域和第一TLR傳訊結構域衍生自TLR1，並且其中第二TLR跨膜結構域和第二TLR傳訊結構域衍生自TLR2。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分；其中第一TLR跨膜結構域和第一TLR傳訊結構域衍生自TLR6，並且其中第二TLR跨膜結構域和第二TLR傳訊結構域衍生自TLR2，或者其中第一TLR跨膜結構域和第一TLR傳訊結構域衍生自TLR2，並且其中第二TLR跨膜結構域和第二TLR傳訊結構域衍生自TLR6。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分，並且其中第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係抗體部分或其抗原結合片段。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域係抗體部分或其抗原結合片段。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係scFv或sdAb。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域特異性結合CD33、CLL1、CD123、CD19、CD20、CD22、BCMA、GPRC5D、NKG2D或GPC3。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域相同。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域不同。在一些實施方式中，第一多肽和/或第二多肽的靶分子係免疫檢查點蛋白。在一些實施方式中，第一多肽和/或第二多肽的靶分子選自由以下組成之群組：PD-1、CD70、CD27、SIRPα和TIGIT。在根據上述經修飾的免疫細胞中任一個的一些實施方式中，靶分子係在免疫細胞上表現的天然蛋白質。在一些實施方式中，靶分子係NKG2D。在一些實施方式中，靶分子係突變的NKG2D。在一些實施方式中，突變的NKG2D包含截短的序列和/或胺基酸取代、突變、添加和/或缺失。在一些實施方式中，靶分子係NKG2D的細胞外抗原結合結構域。在一些實施方式中，靶分子係NKG2D的全長序列。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分，並且其中第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合多聚體靶分子的亞基。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係抗體部分或其抗原結合片段。在一些實施方式中，多聚體靶分子的亞基不同。在一些實施方式中，第一靶結合結構域特異性識別CD33的V亞基，並且第二靶結合結構域特異性識別CD33的C2亞基。在一些實施方式中，多聚體靶分子的亞基相同。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域特異性識別CD20的亞基。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域特異性識別CD33的亞基。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域特異性識別BCMA的亞基。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域特異性識別NKG2D的亞基。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域特異性識別GPRC5D的亞基。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域特異性識別NKG2D的亞基。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體。在一些實施方式中，工程化受體包含特異性識別CD19、CLL1、BCMA或GPC3中任一種的細胞外結構域。在一些實施方式中，工程化受體係CAR，如CD19 CAR、CLL1 CAR、GPC3 CAR或BCMA CAR（例如，單個BCMA CAR或串聯BCMA CAR）。在一些實施方式中，工程化受體係工程化TCR。在一些實施方式中，工程化受體係TAC受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分，並且其中第一靶結合結構域和第二結合結構域各自結合靶分子上的相同靶位點。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係抗體部分或其抗原結合片段。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域特異性識別CD20的亞基。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域特異性識別CD33的亞基。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域特異性識別BCMA的亞基。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域特異性識別NKG2D的亞基。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域特異性識別GPRC5D的亞基。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域特異性識別NKG2D的亞基。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體。在一些實施方式中，工程化受體包含特異性識別CD19、CLL1、GPC3和BCMA中任一種的細胞外結構域。在一些實施方式中，工程化受體係CAR，如CD19 CAR、CLL1 CAR、GPC3 CAR或BCMA CAR（例如，單個BCMA CAR或串聯BCMA CAR）。在一些實施方式中，工程化受體係工程化TCR。在一些實施方式中，工程化受體係TAC受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞，其包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR4跨膜結構域，和iii)第一TLR4傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR4跨膜結構域，和iii)第二TLR4傳訊結構域；其中第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合多聚體靶分子的亞基，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR4傳訊結構域和第二TLR4傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自係NKG2D的細胞外NKG2D結合結構域。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係抗體部分或其抗原結合片段。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係scFv或sdAb。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽相同。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自係特異性結合CD20的scFv。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域特異性識別CD33的亞基。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自係特異性結合GPRC5D的scFv。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自係特異性結合BCMA的sdAb。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不同。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞，其包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR2跨膜結構域，和iii)第一TLR2傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR1跨膜結構域，和iii)第二TLR1傳訊結構域；其中第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合多聚體靶分子的亞基，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR2傳訊結構域和第二TLR1傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係抗體部分或其抗原結合片段。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係scFv或sdAb。在一些實施方式中，第一靶結合結構域係抗體部分或其抗原結合片段。在一些實施方式中，第一靶結合結構域特異性識別CD33的V亞基，並且第二靶結合結構域特異性識別CD33的C2亞基。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中第一多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且第二多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR4傳訊結構域和第二TLR4傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中第一多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗NKG2D細胞外結構域（ECD）、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且第二多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR4傳訊結構域和第二TLR4傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中第一多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且第二多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR4傳訊結構域和第二TLR4傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中第一多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗BCMA sdAb、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且第二多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗BCMA sdAb、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR4傳訊結構域和第二TLR4傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中第一多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且第二多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR4傳訊結構域和第二TLR4傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中第一多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD33 V結構域sdAb、TLR2跨膜結構域和TLR2傳訊結構域（例如，TLR2的胞內部分），並且第二多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD33 C2結構域sdAb、TLR1跨膜結構域和TLR1傳訊結構域（例如，TLR1的胞內部分），其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，其中第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中第一靶結合結構域和第二結合結構域結合相同的靶分子，其中第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合單個靶分子上不同的非重疊靶位點，並且其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自係NKG2D的細胞外NKG2D結合結構域。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係抗體部分或其抗原結合片段。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係scFv或sdAb。在一些實施方式中，多聚體靶分子的亞基相同。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域特異性識別CD20的亞基。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自係特異性結合GPRC5D的scFv。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自係特異性結合BCMA的sdAb。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自係特異性結合CD33的sdAb。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體。在一些實施方式中，工程化受體包含特異性識別CD19、CLL1、GPC3和BCMA中任一種的細胞外結構域。在一些實施方式中，工程化受體係CAR，如CD19 CAR、CLL1 CAR、GPC3 CAR或BCMA CAR（例如，單個BCMA CAR或串聯BCMA CAR）。在一些實施方式中，工程化受體係工程化TCR。在一些實施方式中，工程化受體係TAC受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR4跨膜結構域，和iii)第一TLR4傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR4跨膜結構域，和iii)第二TLR4傳訊結構域；其中第一靶結合結構域和第二結合結構域結合相同的靶分子，其中第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合單個靶分子上不同的非重疊靶位點，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR4傳訊結構域和第二TLR4傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自係NKG2D的細胞外NKG2D結合結構域。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係抗體部分或其抗原結合片段。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係scFv或sdAb。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽相同。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自係特異性結合CD20的scFv。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自係特異性結合GPRC5D的scFv。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自係特異性結合BCMA的sdAb。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自係特異性結合CD33的sdAb。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不同。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞，其包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR2跨膜結構域，和iii)第一TLR2傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR1跨膜結構域，和iii)第二TLR1傳訊結構域；其中第一靶結合結構域和第二結合結構域結合相同的靶分子，其中第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合單個靶分子上不同的非重疊靶位點，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR2傳訊結構域和第二TLR1傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係抗體部分或其抗原結合片段。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係scFv或sdAb。在一些實施方式中，第一靶結合結構域係抗體部分或其抗原結合片段。在一些實施方式中，第一靶結合結構域特異性識別CD33的V亞基，並且第二靶結合結構域特異性識別CD33的C2亞基。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中第一靶結合結構域和第二結合結構域結合相同的靶分子，其中第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合單個靶分子上不同的非重疊靶位點，其中第一多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且第二多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR4傳訊結構域和第二TLR4傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中第一靶結合結構域和第二結合結構域結合相同的靶分子，其中第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合單個靶分子上不同的非重疊靶位點，其中第一多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且第二多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR4傳訊結構域和第二TLR4傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中第一靶結合結構域和第二結合結構域結合相同的靶分子，其中第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合單個靶分子上不同的非重疊靶位點，其中第一多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗BCMA sdAb、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且第二多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗BCMA sdAb、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR4傳訊結構域和第二TLR4傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中第一靶結合結構域和第二結合結構域結合相同的靶分子，其中第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合單個靶分子上不同的非重疊靶位點，其中第一多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且第二多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR4傳訊結構域和第二TLR4傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中第一靶結合結構域和第二結合結構域結合相同的靶分子，其中第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合單個靶分子上不同的非重疊靶位點，其中第一多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且第二多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR4傳訊結構域和第二TLR4傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中第一靶結合結構域和第二結合結構域結合相同的靶分子，其中第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合單個靶分子上不同的非重疊靶位點，其中第一多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD33 V結構域sdAb、TLR2跨膜結構域和TLR2傳訊結構域（例如，TLR2的胞內部分），並且第二多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD33 C2結構域sdAb、TLR1跨膜結構域和TLR1傳訊結構域（例如，TLR1的胞內部分），並且其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域；和c)工程化受體，其中工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域，並且其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，工程化受體包含特異性識別與第一多肽和第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域。在一些實施方式中，工程化受體包含特異性識別與第一多肽相同的靶分子（其不同於第二多肽的靶分子）的細胞外結構域。在一些實施方式中，工程化受體包含特異性識別與第二多肽相同的靶分子（其不同於第一多肽的靶分子）的細胞外結構域。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係抗體部分或其抗原結合片段。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合多聚體靶分子的亞基。在一些實施方式中，多聚體靶分子的亞基不同。在一些實施方式中，第一靶結合結構域特異性識別CD33的V亞基，並且第二靶結合結構域特異性識別CD33的C2亞基。在一些實施方式中，多聚體靶分子的亞基相同。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域特異性識別CD20的亞基。在一些實施方式中，工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子上的非重疊靶位點的細胞外結構域。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，工程化受體包含特異性識別CD19、CLL1、GPC3和BCMA中任一種的細胞外結構域。在一些實施方式中，工程化受體係CAR，如CD19 CAR、CLL1 CAR、GPC3 CAR或BCMA CAR。在一些實施方式中，工程化受體係工程化TCR。在一些實施方式中，工程化受體係TAC受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR4跨膜結構域，和iii)第一TLR4傳訊結構域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR4跨膜結構域，和iii)第二TLR4傳訊結構域；和c)工程化受體，其中工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域，其中工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域，並且其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR4傳訊結構域和第二TLR4傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自係NKG2D的細胞外NKG2D結合結構域。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係抗體部分或其抗原結合片段。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係scFv或sdAb。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽相同。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自係特異性結合CD20的scFv。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自係特異性結合GPRC5D的scFv。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自係特異性結合BCMA的sdAb。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自係特異性結合CD33的sdAb。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不同。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，工程化受體係嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR2跨膜結構域，和iii)第一TLR2傳訊結構域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR1跨膜結構域，和iii)第二TLR1傳訊結構域；和c)工程化受體，其中工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域，其中工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域，並且其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR2傳訊結構域和第二TLR1傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係抗體部分或其抗原結合片段。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係scFv或sdAb。在一些實施方式中，第一靶結合結構域係抗體部分或其抗原結合片段。在一些實施方式中，第一靶結合結構域特異性識別CD33的V亞基，並且第二靶結合結構域特異性識別CD33的C2亞基。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，工程化受體係嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii) 第一TLR傳訊結構域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域；和c)工程化受體，其中工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域，其中工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域，其中第一多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且第二多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR4傳訊結構域和第二TLR4傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，工程化受體係嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域；和c)工程化受體，其中工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域，其中工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域，其中第一多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且第二多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR4傳訊結構域和第二TLR4傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，工程化受體係嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域；和c)工程化受體，其中工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域，其中工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域，其中第一多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且第二多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR4傳訊結構域和第二TLR4傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，工程化受體係嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域；和c)工程化受體，其中工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域，其中工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域，其中第一多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗BCMA sdAb、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且第二多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗BCMA sdAb、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR4傳訊結構域和第二TLR4傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，工程化受體係嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域；和c)工程化受體，其中工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域，其中工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域，其中第一多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且第二多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分），並且其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR4傳訊結構域和第二TLR4傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，工程化受體係嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了經修飾的免疫細胞（例如，T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域；和c)工程化受體，其中工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域，其中工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域，其中第一多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD33 V結構域sdAb、TLR2跨膜結構域和TLR2傳訊結構域（例如，TLR2的胞內部分），並且第二多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD33 C2結構域sdAb、TLR1跨膜結構域和TLR1傳訊結構域（例如，TLR1的胞內部分），並且其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，工程化受體係嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了表現CAR的免疫細胞（例如，CAR-T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合多聚體靶分子的亞基。在一些實施方式中，多聚體靶分子的亞基不同。在一些實施方式中，多聚體靶分子的亞基相同。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二結合結構域結合相同的靶分子。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二結合結構域各自結合靶分子上的相同靶位點。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域相同。在一些實施方式中，其中第一靶結合結構域和第二結合結構域結合相同的靶分子，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合單個靶分子上不同的非重疊靶位點。在一些實施方式中，CAR包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域。在一些實施方式中，CAR包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子上的非重疊靶位點的細胞外結構域。在一些實施方式中，CAR包含特異性識別CD19、CLL1、GPC3和BCMA中任一種的細胞外結構域（例如，單個BCMA CAR或串聯BCMA CAR）。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了表現TCR的免疫細胞（例如，TCR-T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合多聚體靶分子的亞基。在一些實施方式中，多聚體靶分子的亞基不同。在一些實施方式中，多聚體靶分子的亞基相同。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二結合結構域結合相同的靶分子。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二結合結構域各自結合靶分子上的相同靶位點。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域相同。在一些實施方式中，其中第一靶結合結構域和第二結合結構域結合相同的靶分子，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合單個靶分子上不同的非重疊靶位點。在一些實施方式中，TCR包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域。在一些實施方式中，TCR包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子上的非重疊靶位點的細胞外結構域。在一些實施方式中，TCR包含特異性識別CD19、CLL1、GPC3和BCMA中任一種的細胞外結構域（例如，單個BCMA TCR或串聯BCMA TCR）。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了表現TAC的免疫細胞（例如，TAC-T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合多聚體靶分子的亞基。在一些實施方式中，多聚體靶分子的亞基不同。在一些實施方式中，多聚體靶分子的亞基相同。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二結合結構域結合相同的靶分子。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二結合結構域各自結合靶分子上的相同靶位點。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域相同。在一些實施方式中，其中第一靶結合結構域和第二結合結構域結合相同的靶分子，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合單個靶分子上不同的非重疊靶位點。在一些實施方式中，TAC包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域。在一些實施方式中，TAC包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子上的非重疊靶位點的細胞外結構域。在一些實施方式中，TAC包含特異性識別CD19、CLL1、GPC3和BCMA中任一種的細胞外結構域（例如，單個BCMA TAC或串聯BCMA TAC）。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了表現CAR的免疫細胞（例如，CAR-T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域（例如，抗體部分或其抗原結合片段），ii)第一TLR4跨膜結構域，和iii)第一TLR4傳訊結構域，和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域（例如，抗體部分或其抗原結合片段），ii)第二TLR4跨膜結構域，和iii)第二TLR4傳訊結構域，其中在靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR4傳訊結構域和第二TLR4傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR4傳訊的TLR4傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含訊息肽（例如，前導序列）。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽相同。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分）。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗BCMA sdAb、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分）。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分）。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分）。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分）。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞表現抗CD19 CAR。在一些實施方式中，抗CD19 CAR從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，抗CD19 CAR包含與SEQ ID NO: 2具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗CD19 CAR包含SEQ ID NO: 2。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞表現抗CLL1 CAR。在一些實施方式中，抗CLL1 CAR從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CLL1 sdAb、CD28α鉸鏈結構域、CD28α跨膜（TM）結構域、CD28共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，抗CLL1 CAR包含與SEQ ID NO: 4具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗CLL1 CAR包含SEQ ID NO: 4。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞表現抗BCMA CAR（例如，單個抗BCMA CAR或串聯抗BCMA CAR）。在一些實施方式中，抗BCMA CAR從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，抗BCMA CAR包含與SEQ ID NO: 67具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗BCMA CAR包含SEQ ID NO: 67。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自包含與SEQ ID NO: 40具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自包含SEQ ID NO: 40。在一些實施方式中，抗BCMA CAR從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，抗BCMA CAR包含與SEQ ID NO: 66具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗BCMA CAR包含SEQ ID NO: 66。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞表現抗GPC3 CAR。在一些實施方式中，抗GPC3 CAR從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPC3 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，抗GPC3 CAR包含與SEQ ID NO: 56具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗GPC3 CAR包含SEQ ID NO: 56。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自包含與SEQ ID NO: 40具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自包含SEQ ID NO: 40。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗CD19 CAR和抗CD20 TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 1具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 1。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗CLL1 CAR和抗CD33 TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CLL1 sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 71具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 71。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗CD19 CAR和抗NKG2D TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 59具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 59。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 60具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 60。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗GPC3 CAR和抗NKG2D TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPC3 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 57具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 57。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPC3 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 58具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 58。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗BCMA CAR（例如，單個抗BCMA CAR或串聯抗BCMA CAR）和抗BCMA TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、單個抗BCMA sdAb、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 62具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 62。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 63具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 63。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD28α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 64具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 64。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 61具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 61。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗BCMA CAR（例如，單個抗BCMA CAR或串聯抗BCMA CAR）和抗GPRC5D TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 65具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 65。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗GPRC5D scFv、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 72具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 72。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗GPRC5D scFv、CD28α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 73具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 73。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了表現CAR的免疫細胞（例如，CAR-T細胞），其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域（例如，抗體部分或其抗原結合片段），ii)TLR2跨膜結構域，和iii)第一TLR2傳訊結構域，和b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域（例如，抗體部分或其抗原結合片段），ii)TLR1跨膜結構域，和iii)TLR1傳訊結構域，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，TLR1傳訊結構域和TLR2傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，第一多肽和/或第二多肽進一步包含訊息肽（例如，前導序列）。在一些實施方式中，第一多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD33 V結構域sdAb、TLR2跨膜結構域和TLR2傳訊結構域（例如，TLR2的胞內部分），並且第二多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD33 C2結構域sdAb、TLR1跨膜結構域和TLR1傳訊結構域（例如，TLR1的胞內部分）。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞表現抗CLL1 CAR。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞表現抗CLL1/CD33雙CAR。在一些實施方式中，抗CLL1/CD33雙CAR從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CLL1 sdAb、抗CD33 V結構域sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，抗CLL1/CD33雙CAR包含與SEQ ID NO: 43具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗CLL1/CD33雙CAR包含SEQ ID NO: 43。在一些實施方式中，第一多肽包含與SEQ ID NO: 41具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，第一多肽包含SEQ ID NO: 41。在一些實施方式中，第二多肽包含與SEQ ID NO: 42具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，第二多肽包含SEQ ID NO: 42。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗CLL1 CAR和抗CD33（例如，抗CD33 V結構域和/或抗CD33 C2結構域）TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CLL1 sdAb、CD28α鉸鏈結構域、CD28α跨膜（TM）結構域、CD28共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗CD33 V結構域sdAb、TLR2跨膜結構域、TLR2傳訊結構域（例如，TLR2的胞內部分）、P2A切割位點、訊息肽、抗CD33 C2結構域sdAb、TLR1跨膜結構域和TLR1傳訊結構域（例如，TLR的胞內部分）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 3具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 3。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
免疫細胞
經修飾的免疫細胞可衍生自多種細胞類型和細胞來源。本文考慮了來自任何哺乳動物物種的細胞，包括但不限於小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴和人。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞係人細胞。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞與接受者個體係同種異體的（即，來自相同的物種，但不同的捐贈者）。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞係自體的（即，捐贈者和接受者係相同的）。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞係同基因的（即，捐贈者和接受者係不同的個體，但是為同卵雙胞胎）。
在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞衍生自原代細胞。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞係從個體分離的原代細胞。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞從分離自個體的原代細胞繁殖（如增殖和/或分化）。在一些實施方式中，原代細胞係造血譜系的細胞。在一些實施方式中，原代細胞獲自胸腺。在一些實施方式中，原代細胞獲自淋巴或淋巴結（如腫瘤引流淋巴結）。在一些實施方式中，原代細胞獲自脾。在一些實施方式中，原代細胞獲自骨髓。在一些實施方式中，原代細胞獲自血液，如外周血。在一些實施方式中，原代細胞係外周血單核細胞（PBMC）。在一些實施方式中，原代細胞衍生自血漿。在一些實施方式中，原代細胞衍生自腫瘤。在一些實施方式中，原代細胞獲自黏膜免疫系統。在一些實施方式中，原代細胞獲自生檢樣本。
在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞衍生自細胞系。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞獲自商業細胞系。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞係從分離自個體的原代細胞建立的細胞系。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞從細胞系繁殖（如增殖和/或分化）。在一些實施方式中，細胞系係非永生（mortal）細胞系。在一些實施方式中，細胞系係永生化細胞系。在一些實施方式中，細胞系係腫瘤細胞系，如白血病或淋巴瘤細胞系。在一些實施方式中，細胞系係衍生自PBMC的細胞系。在一些實施方式中，細胞系係幹細胞系。在一些實施方式中，細胞系選自由HEK293-6E細胞、NK-92細胞和Jurkat細胞組成之群組。
可用於本申請的示例性免疫細胞包括但不限於樹突狀細胞（包括未成熟樹突狀細胞和成熟樹突狀細胞）、T淋巴細胞（如初始T細胞、效應T細胞、記憶T細胞、細胞毒性T淋巴細胞、T輔助細胞、自然殺傷T細胞、Treg細胞、腫瘤浸潤性淋巴細胞（TIL）和淋巴因子活化的殺傷（LAK）細胞）、B細胞、自然殺傷（NK）細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、粒細胞、及其組合。免疫細胞亞群可以藉由本領域已知的一種或多種細胞表面標誌物（例如，CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD11c、CD123、CD56、CD34、CD14、CD33等）的存在或不存在來定義。在藥物組成物包含多個經修飾的免疫細胞的情況下，該等經修飾的免疫細胞可以是免疫細胞類型的特定亞群、免疫細胞類型的亞群的組合、或者兩種或更多種免疫細胞類型的組合。在一些實施方式中，免疫細胞存在於同質細胞群中。在一些實施方式中，免疫細胞存在於在免疫細胞中增強的異質細胞群中。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞係淋巴細胞。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞不是淋巴細胞。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞適用於過繼免疫療法。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞係PBMC。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞係衍生自PBMC的免疫細胞。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞係T細胞。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞係CD4
+T細胞。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞係CD8
+T細胞。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞係B細胞。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞係NK細胞。
在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞衍生自幹細胞。在一些實施方式中，幹細胞係全能幹細胞。在一些實施方式中，幹細胞係多能幹細胞。在一些實施方式中，幹細胞係單能幹細胞。在一些實施方式中，幹細胞係祖細胞。在一些實施方式中，幹細胞係胚胎幹細胞。在一些實施方式中，幹細胞係造血幹細胞。在一些實施方式中，幹細胞係間充質幹細胞。在一些實施方式中，幹細胞係誘導多能幹細胞（iPSC）。
經修飾的免疫細胞可以包含任何數量（如1、2、3、4、5、10、50、100、1000或更多個中任一個）的異源核酸序列（包括第一和第二核酸序列）。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含單拷貝的第一和/或第二異源核酸序列。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含多拷貝的第一和/或第二異源核酸序列。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞還包含至少一個另外的異源核酸序列，例如，編碼免疫調節劑如細胞介素、趨化因子和/或免疫檢查點抑制劑的異源核酸序列。
可以將包含本文所述之一個或多個異源核酸序列的一種或多種核酸瞬時或穩定摻入經修飾的免疫細胞中。在一些實施方式中，一種或多種核酸在經修飾的免疫細胞中瞬時表現。例如，一種或多種核酸可以以染色體外陣列的形式存在於經修飾的免疫細胞的細胞核中。可以使用本領域已知的任何轉染或轉導方法（包括病毒或非病毒方法），將一種或多種核酸引入經修飾的免疫細胞中。示例性非病毒轉染方法包括但不限於基於化學的轉染，如使用磷酸鈣、樹狀聚合物、脂質體、或陽離子聚合物（例如，DEAE-葡聚糖或聚乙烯亞胺）；非化學方法，如電穿孔、細胞擠壓、聲孔效應、光學轉染、刺穿染、原生質體融合、水動力遞送或轉座子；基於粒子之方法，如使用基因槍、磁轉染或磁輔助轉染、粒子轟擊；和混合方法，如核轉染。
在一些實施方式中，一個或多個異源核酸序列存在於經修飾的免疫細胞的基因組中。例如，可以藉由本領域已知的任何方法將包含一個或多個異源核酸序列的一種或多種核酸整合到經修飾的免疫細胞的基因組中，該等方法包括但不限於病毒介導的整合、隨機整合、同源重組方法和定點整合方法，如使用位點特異性重組酶或整合酶、轉座酶、轉錄活化因子樣效應物核酸酶（TALEN
®）、CRISPR/Cas9和鋅指核酸酶。在一些實施方式中，將一個或多個異源核酸序列整合到經修飾的免疫細胞基因組的特定設計的基因座中。在一些實施方式中，將一個或多個異源核酸序列整合到經修飾的免疫細胞基因組的整合熱點中。在一些實施方式中，將異源核酸（序列）整合到經修飾的免疫細胞基因組的隨機基因座中。在單個經修飾的免疫細胞中存在多拷貝的一個或多個異源核酸序列的情況下，可以將異源核酸序列整合到經修飾的免疫細胞基因組的多個基因座中。
TLR多肽
本文所述之經修飾的免疫細胞表現toll樣受體（TLR）多肽（例如，第一TLR多肽和第二TLR多肽；在本文中也分別稱為第一多肽和第二多肽）。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞表現至少一種TLR多肽。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞表現兩種TLR多肽。本申請還提供了TLR多肽及其組成物。在一些實施方式中，本文提供的TLR多肽藉由在抗原刺激後誘導TLR傳訊來提供強共刺激抗腫瘤效果。
TLR多肽衍生自TLR分子。TLR係I型跨膜糖蛋白，其特徵在於存在含有富含白胺酸重複序列（LRR）的細胞外結構域，該細胞外結構域負責介導配位基識別。細胞外結構域之後是單個跨膜螺旋和細胞內Toll樣/白細胞介素-1（IL-1）受體（TIR）結構域。在一些實施方式中，TIR結構域負責下游傳訊（例如，誘導TLR傳訊）。TLR的結構域和功能係本領域熟知的。參見例如，Jin等人, 2008 29(2):182-91;
在一些實施方式中，該等TLR分子選自由以下組成之群組：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10。在一些實施方式中，TLR多肽衍生自TLR1。在一些實施方式中，TLR多肽衍生自TLR2。在一些實施方式中，TLR多肽衍生自TLR4。在一些實施方式中，TLR多肽衍生自TLR6。
在一些實施方式中，TLR多肽在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時二聚化，這導致第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，TLR多肽形成同源二聚體（例如，兩個相同TLR分子的二聚化）。同源二聚體可以與衍生自TLR3、TLR4、TLR5或TLR9的TLR多肽形成。在一些實施方式中，第一和第二TLR多肽各自包含TLR3跨膜結構域和TLR3傳訊結構域。在一些實施方式中，第一和第二TLR多肽各自包含TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域。在一些實施方式中，第一和第二TLR多肽各自包含TLR5跨膜結構域和TLR5傳訊結構域。在一些實施方式中，第一和第二TLR多肽各自包含TLR9跨膜結構域和TLR9傳訊結構域。
在一些實施方式中，TLR多肽形成異源二聚體（例如，兩種不同TLR多肽的二聚化）。異源二聚體可以與衍生自TLR1/ TLR2、TLR1/TLR4、TLR2/TLR6、TLR2/TLR10或TLR4/TLR5的TLR多肽形成。在一些實施方式中，第一TLR多肽包含TLR1跨膜結構域和TLR1傳訊結構域，並且第二TLR多肽包含TLR2跨膜結構域和TLR2傳訊結構域；或者第一TLR多肽包含TLR2跨膜結構域和TLR2傳訊結構域，並且第二TLR多肽包含TLR1跨膜結構域和TLR1傳訊結構域。在一些實施方式中，第一TLR多肽包含TLR1跨膜結構域和TLR1傳訊結構域，並且第二TLR多肽包含TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域；或者第一TLR多肽包含TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域，並且第二TLR多肽包含TLR1跨膜結構域和TLR1傳訊結構域。在一些實施方式中，第一TLR多肽包含TLR2跨膜結構域和TLR2傳訊結構域，並且第二TLR多肽包含TLR6跨膜結構域和TLR6傳訊結構域；或者第一TLR多肽包含TLR6跨膜結構域和TLR6傳訊結構域，並且第二TLR多肽包含TLR2跨膜結構域和TLR2傳訊結構域。在一些實施方式中，第一TLR多肽包含TLR2跨膜結構域和TLR2傳訊結構域，並且第二TLR多肽包含TLR10跨膜結構域和TLR10傳訊結構域；或者第一TLR多肽包含TLR10跨膜結構域和TLR10傳訊結構域，並且第二TLR多肽包含TLR2跨膜結構域和TLR2傳訊結構域。在一些實施方式中，第一TLR多肽包含TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域，並且第二TLR多肽包含TLR5跨膜結構域和TLR5傳訊結構域；或者第一TLR多肽包含TLR5跨膜結構域和TLR5傳訊結構域，並且第二TLR多肽包含TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域。
示例性TLR分子列出於下表1中。
[表1].示例性Toll樣受體序列。
| 名稱 | UniProt ID | NCBI GeneID | 胺基酸序列（ 跨膜結構域帶雙底線； TIR 結構域帶底線） | SEQ ID NO. |
| TLR1 | Q15399 | 7096 | MTSIFHFAIIFMLILQIRIQLSEESEFLVDRSKNGLIHVPKDLSQKTTILNISQNYISELWTSDILSLSKLRILIISHNRIQYLDISVFKFNQELEYLDLSHNKLVKISCHPTVNLKHLDLSFNAFDALPICKEFGNMSQLKFLGLSTTHLEKSSVLPIAHLNISKVLLVLGETYGEKEDPEGLQDFNTESLHIVFPTNKEFHFILDVSVKTVANLELSNIKCVLEDNKCSYFLSILAKLQTNPKLSNLTLNNIETTWNSFIRILQLVWHTTVWYFSISNVKLQGQLDFRDFDYSGTSLKALSIHQVVSDVFGFPQSYIYEIFSNMNIKNFTVSGTRMVHMLCPSKISPFLHLDFSNNLLTDTVFENCGHLTELETLILQMNQLKELSKIAEMTTQMKSLQQLDISQNSVSYDEKKGDCSWTKSLLSLNMSSNILTDTIFRCLPPRIKVLDLHSNKIKSIPKQVVKLEALQELNVAFNSLTDLPGCGSFSSLSVLIIDHNSVSHPSADFFQSCQKMRSIKAGDNPFQCTCELGEFVKNIDQVSSEVLEGWPDSYKCDYPESYRGTLLKDFHMSELSCNIT LLIVTIVATMLVLAVTVTSLCSYLDLPWYLRMVCQWTQTRRRARNIPLEELQRN LQFHAFISYSGHDSFWVKNELLPNLEKEGMQICLHERNFVPGKSIVENIITCIEKSYKSIFVLSPNFVQSEWCHYELYFAHHNLFHEGSNSLILILLEPIPQYSIPSSYHKLKSLMARRTYLEWPKEKSKRGLFWANLRAAINIKLTEQAKK | 30 |
| TLR2 | O60603 | 7097 | MPHTLWMVWVLGVIISLSKEESSNQASLSCDRNGICKGSSGSLNSIPSGLTEAVKSLDLSNNRITYISNSDLQRCVNLQALVLTSNGINTIEEDSFSSLGSLEHLDLSYNYLSNLSSSWFKPLSSLTFLNLLGNPYKTLGETSLFSHLTKLQILRVGNMDTFTKIQRKDFAGLTFLEELEIDASDLQSYEPKSLKSIQNVSHLILHMKQHILLLEIFVDVTSSVECLELRDTDLDTFHFSELSTGETNSLIKKFTFRNVKITDESLFQVMKLLNQISGLLELEFDDCTLNGVGNFRASDNDRVIDPGKVETLTIRRLHIPRFYLFYDLSTLYSLTERVKRITVENSKVFLVPCLLSQHLKSLEYLDLSENLMVEEYLKNSACEDAWPSLQTLILRQNHLASLEKTGETLLTLKNLTNIDISKNSFHSMPETCQWPEKMKYLNLSSTRIHSVTGCIPKTLEILDVSNNNLNLFSLNLPQLKELYISRNKLMTLPDASLLPMLLVLKISRNAITTFSKEQLDSFHTLKTLEAGGNNFICSCEFLSFTQEQQALAKVLIDWPANYLCDSPSHVRGQQVQDVRLSVSECHRT ALVSGMCCALFLLILLTGVLCHRFHGLWYMKMMWAWLQAKRKPRKAPSRNI CYDAFVSYSERDAYWVENLMVQELENFNPPFKLCLHKRDFIPGKWIIDNIIDSIEKSHKTVFVLSENFVKSEWCKYELDFSHFRLFDENNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVNLRAAIKS | 31 |
| TLR3 | O15455 | 7098 | MRQTLPCIYFWGGLLPFGMLCASSTTKCTVSHEVADCSHLKLTQVPDDLPTNITVLNLTHNQLRRLPAANFTRYSQLTSLDVGFNTISKLEPELCQKLPMLKVLNLQHNELSQLSDKTFAFCTNLTELHLMSNSIQKIKNNPFVKQKNLITLDLSHNGLSSTKLGTQVQLENLQELLLSNNKIQALKSEELDIFANSSLKKLELSSNQIKEFSPGCFHAIGRLFGLFLNNVQLGPSLTEKLCLELANTSIRNLSLSNSQLSTTSNTTFLGLKWTNLTMLDLSYNNLNVVGNDSFAWLPQLEYFFLEYNNIQHLFSHSLHGLFNVRYLNLKRSFTKQSISLASLPKIDDFSFQWLKCLEHLNMEDNDIPGIKSNMFTGLINLKYLSLSNSFTSLRTLTNETFVSLAHSPLHILNLTKNKISKIESDAFSWLGHLEVLDLGLNEIGQELTGQEWRGLENIFEIYLSYNKYLQLTRNSFALVPSLQRLMLRRVALKNVDSSPSPFQPLRNLTILDLSNNNIANINDDMLEGLEKLEILDLQHNNLARLWKHANPGGPIYFLKGLSHLHILNLESNGFDEIPVEVFKDLFELKIIDLGLNNLNTLPASVFNNQVSLKSLNLQKNLITSVEKKVFGPAFRNLTELDMRFNPFDCTCESIAWFVNWINETHTNIPELSSHYLCNTPPHYHGFPVRLFDTSSCKDSAPFEL FFMINTSILLIFIFIVLLIHFEGWRISFYWNVSVHRVLGFKEIDRQTEQ FEYAAYIIHAYKDKDWVWEHFSSMEKEDQSLKFCLEERDFEAGVFELEAIVNSIKRSRKIIFVITHHLLKDPLCKRFKVHHAVQQAIEQNLDSIILVFLEEIPDYKLNHALCLRRGMFKSHCILNWPVQKERIGAFRHKLQVALGSK NSVH | 32 |
| TLR4 | O00206 | 7099 | MMSASRLAGTLIPAMAFLSCVRPESWEPCVEVVPNITYQCMELNFYKIPDNLPFSTKNLDLSFNPLRHLGSYSFFSFPELQVLDLSRCEIQTIEDGAYQSLSHLSTLILTGNPIQSLALGAFSGLSSLQKLVAVETNLASLENFPIGHLKTLKELNVAHNLIQSFKLPEYFSNLTNLEHLDLSSNKIQSIYCTDLRVLHQMPLLNLSLDLSLNPMNFIQPGAFKEIRLHKLTLRNNFDSLNVMKTCIQGLAGLEVHRLVLGEFRNEGNLEKFDKSALEGLCNLTIEEFRLAYLDYYLDDIIDLFNCLTNVSSFSLVSVTIERVKDFSYNFGWQHLELVNCKFGQFPTLKLKSLKRLTFTSNKGGNAFSEVDLPSLEFLDLSRNGLSFKGCCSQSDFGTTSLKYLDLSFNGVITMSSNFLG LEQLEHLDFQHSNLKQMSEFSVFLSLRNLIYLDISHTHTRVAFNGIFNGLSSLEVLKMAGNSFQENFLPDIFTELRNLTFLDLSQCQLEQLSPTAFNSLSSLQVLNMSHNNFFSLDTFPYKCLNSLQVLDYSLNHIMTSKKQELQHFPSSLAFLNLTQNDFACTCEHQSFLQWIKDQRQLLVEVERMECATPSDKQGMPVLSLNITCQMNK TIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLLAGCIKYGRGENI YDAFVIYSSQDEDWVRNELVKNLEEGVPPFQLCLHYRDFIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRAGIIFIVLQKVEKTLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRRLRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI | 33 |
| TLR5 | O60602 | 7100 | MGDHLDLLLGVVLMAGPVFGIPSCSFDGRIAFYRFCNLTQVPQVLNTTERLLLSFNYIRTVTASSFPFLEQLQLLELGSQYTPLTIDKEAFRNLPNLRILDLGSSKIYFLHPDAFQGLFHLFELRLYFCGLSDAVLKDGYFRNLKALTRLDLSKNQIRSLYLHPSFGKLNSLKSIDFSSNQIFLVCEHELEPLQGKTLSFFSLAANSLYSRVSVDWGKCMNPFRNMVLEILDVSGNGWTVDITGNFSNAISKSQAFSLILAHHIMGAGFGFHNIKDPDQNTFAGLARSSVRHLDLSHGFVFSLNSRVFETLKDLKVLNLAYNKINKIADEAFYGLDNLQVLNLSYNLLGELYSSNFYGLPKVAYIDLQKNHIAIIQDQTFKFLEKLQTLDLRDNALTTIHFIPSIPDIFLSGNKLVTLPKINLTANLIHLSENRLENLDILYFLLRVPHLQILILNQNRFSSCSGDQTPSENPSLEQLFLGENMLQLAWETELCWDVFEGLSHLQVLYLNHNYLNSLPPGVFSHLTALRGLSLNSNRLTVLSHNDLPANLEILDISRNQLLAPNPDVFVSLSVLDITHNKFICECELSTFINWLNHTNVTIAGPPADIYCVYPDSFSGVSLFSLSTEGCDEEEVLKSLK FSLFIVCTVTLTLFLMTILTVTKFRGFCFICYKTAQRLVFKDHPQGTEPDM YKYDAYLCFSSKDFTWVQNALLKHLDTQYSDQNRFNLCFEERDFVPGENRIANIQDAIWNSRKIVCLVSRHFLRDGWCLEAFSYAQGRCLSDLNSALIMVVVGSLSQYQLMKHQSIRGFVQKQQYLRWPEDFQDVGWFLHKLSQQILKKEKEKKKDNNIPLQTVATIS | 34 |
| TLR6 | Q9Y2C9 | 10333 | MTKDKEPIVKSFHFVCLMIIIVGTRIQFSDGNEFAVDKSKRGLIHVPKDLPLKTKVLDMSQNYIAELQVSDMSFLSELTVLRLSHNRIQLLDLSVFKFNQDLEYLDLSHNQLQKISCHPIVSFRHLDLSFNDFKALPICKEFGNLSQLNFLGLSAMKLQKLDLLPIAHLHLSYILLDLRNYYIKENETESLQILNAKTLHLVFHPTSLFAIQVNISVNTLGCLQLTNIKLNDDNCQVFIKFLSELTRGSTLLNFTLNHIETTWKCLVRVFQFLWPKPVEYLNIYNLTIIESIREEDFTYSKTTLKALTIEHITNQVFLFSQTALYTVFSEMNIMMLTISDTPFIHMLCPHAPSTFKFLNFTQNVFTDSIFEKCSTLVKLETLILQKNGLKDLFKVGLMTKDMPSLEILDVSWNSLESGRHKENCTWVESIVVLNLSSNMLTDSVFRCLPPRIKVLDLHSNKIKSVPKQVVKLEALQELNVAFNSLTDLPGCGSFSSLSVLIIDHNSVSHPSADFFQSCQKMRSIKAGDNPFQCTCELREFVKNIDQVSSEVLEGWPDSYKCDYPESYRGSPLKDFHMSELSCNITL LIVTIGATMLVLAVTVTSLCIYLDLPWYLRMVCQWTQTRRRARNIPLEELQRN LQFHAFISYSEHDSAWVKSELVPYLEKEDIQICLHERNFVPGKSIVENIINCIEKSYKSIFVLSPNFVQSEWCHYELYFAHHNLFHEGSNNLILILLEPIPQNSIPNKYHKLKALMTQRTYLQWPKEKSKRGLFWANIRAAFNMKLTLVTENNDVKS | 35 |
| TLR7 | Q9NYK1 | 51284 | MVFPMWTLKRQILILFNIILISKLLGARWFPKTLPCDVTLDVPKNHVIVDCTDKHLTEIPGGIPTNTTNLTLTINHIPDISPASFHRLDHLVEIDFRCNCVPIPLGSKNNMCIKRLQIKPRSFSGLTYLKSLYLDGNQLLEIPQGLPPSLQLLSLEANNIFSIRKENLTELANIEILYLGQNCYYRNPCYVSYSIEKDAFLNLTKLKVLSLKDNNVTAVPTVLPSTLTELYLYNNMIAKIQEDDFNNLNQLQILDLSGNCPRCYNAPFPCAPCKNNSPLQIPVNAFDALTELKVLRLHSNSLQHVPPRWFKNINKLQELDLSQNFLAKEIGDAKFLHFLPSLIQLDLSFNFELQVYRASMNLSQAFSSLKSLKILRIRGYVFKELKSFNLSPLHNLQNLEVLDLGTNFIKIANLSMFKQFKRLKVIDLSVNKISPSGDSSEVGFCSNARTSVESYEPQVLEQLHYFRYDKYARSCRFKNKEASFMSVNESCYKYGQTLDLSKNSIFFVKSSDFQHLSFLKCLNLSGNLISQTLNGSEFQPLAELRYLDFSNNRLDLLHSTAFEELHKLEVLDISSNSHYFQSEGITHMLNFTKNLKVLQKLMMNDNDISSSTSRTMESESLRTLEFRGNHLDVLWREGDNRYLQLFKNLLKLEELDISKNSLSFLPSGVFDGMPPNLKNLSLAKNGLKSFSWKKLQCLKNLETLDLSHNQLTTVPERLSNCSRSLKNLILKNNQIRSLTKYFLQDAFQLRYLDLSSNKIQMIQKTSFPENVLNNLKMLLLHHNRFLCTCDAVWFVWWVNHTEVTIPYLATDVTCVGPGAHKGQSVISLDLYTCELDLTN LILFSLSISVSLFLMVMMTASHLYFWDVWYIYHFCKAKIKGYQRLISPD CCYDAFIVYDTKDPAVTEWVLAELVAKLEDPREKHFNLCLEERDWLPGQPVLENLSQSIQLSKKTVFVMTDKYAKTENFKIAFYLSHQRLMDEKVDVIILIFLEKPFQKSKFLQLRKRLCGSSVLEWPTNPQAHPYFWQCLKNALATDNHVAYSQVFKETV | 36 |
| TLR8 | Q9NR97 | 51311 | VGKYVTELDLSDNFITHITNESFQGLQNLTKINLNHNPNVQHQNGNPGIQSNGLNITDGAFLNLKNLRELLLEDNQLPQIPSGLPESLTELSLIQNNIYNITKEGISRLINLKNLYLAWNCYFNKVCEKTNIEDGVFETLTNLELLSLSFNSLSHVPPKLPSSLRKLFLSNTQIKYISEEDFKGLINLTLLDLSGNCPRCFNAPFPCVPCDGGASINIDRFAFQNLTQLRYLNLSSTSLRKINAAWFKNMPHLKVLDLEFNYLVGEIASGAFLTMLPRLEILDLSFNYIKGSYPQHINISRNFSKLLSLRALHLRGYVFQELREDDFQPLMQLPNLSTINLGINFIKQIDFKLFQNFSNLEIIYLSENRISPLVKDTRQSYANSSSFQRHIRKRRSTDFEFDPHSNFYHFTRPLIKPQCAAYGKALDLSLNSIFFIGPNQFENLPDIACLNLSANSNAQVLSGTEFSAIPHVKYLDLTNNRLDFDNASALTELSDLEVLDLSYNSHYFRIAGVTHHLEFIQNFTNLKVLNLSHNNIYTLTDKYNLESKSLVELVFSGNRLDILWNDDDNRYISIFKGLKNLTRLDLSLNRLKHIPNEAFLNLPASLTELHINDNMLKFFNWTLLQQFPRLELLDLRGNKLLFLTDSLSDFTSSLRTLLLSHNRISHLPSGFLSEVSSLKHLDLSSNLLKTINKSALETKTTTKLSMLELHGNPFECTCDIGDFRRWMDEHLNVKIPRLVDVICASPGDQRGKSIVSLELTTCVSDVT AVILFFFTFFITTMVMLAALAHHLFYWDVWFIYNVCLAKVKGYRSLSTSQ TFYDAYISYDTKDASVTDWVINELRYHLEESRDKNVLLCLEERDWDPGLAIIDNLMQSINQSKKTVFVLTKKYAKSWNFKTAF YLALQRLMDENMDVIIFILLEPVLQHSQYLRLRQRICKSSILQWPDNPKAEGLFWQTLRNVVLTENDSRYNNMYVDSIKQY | 37 |
| TLR9 | Q9NR96 | 54106 | MGFCRSALHPLSLLVQAIMLAMTLALGTLPAFLPCELQPHGLVNCNWLFLKSVPHFSMAAPRGNVTSLSLSSNRIHHLHDSDFAHLPSLRHLNLKWNCPPVGLSPMHFPCHMTIEPSTFLAVPTLEELNLSYNNIMTVPALPKSLISLSLSHTNILMLDSASLAGLHALRFLFMDGNCYYKNPCRQALEVAPGALLGLGNLTHLSLKYNNLTVVPRNLPSSLEYLLLSYNRIVKLAPEDLANLTALRVLDVGGNCRRCDHAPNPCMECPRHFPQLHPDTFSHLSRLEGLVLKDSSLSWLNASWFRGLGNLRVLDLSENFLYKCITKTKAFQGLTQLRKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLVALKELDMHGIFFRSLDETTLRPLARLPMLQTLRLQMNFINQAQLGIFRAFPGLRYVDLSDNRISGASELTATMGEADGGEKVWLQPGDLAPAPVDTPSSEDFRPNCSTLNFTLDLSRNNLVTVQPEMFAQLSHLQCLRLSHNCISQAVNGSQFLPLTGLQVLDLSHNKLDLYHEHSFTELPRLEALDLSYNSQPFGMQGVGHNFSFVAHLRTLRHLSLAHNNIHSQVSQQLCSTSLRALDFSGNALGHMWAEGDLYLHFFQGLSGLIWLDLSQNRLHTLLPQTLRNLPKSLQVLRLRDNYLAFFKWWSLHFLPKLEVLDLAGNQLKALTNGSLPAGTRLRRLDVSCNSISFVAPGFFSKAKELRELNLSANALKTVDHSWFGPLASALQILDVSANPLHCACGAAFMDFLLEVQAAVPGLPSRVKCGSPGQLQGLSIFAQDLRLCLDEALSWDC FALSLLAVALGLGVPMLHHLCGWDLWYCFHLCLAWLPWRGRQSGRDEDA LPYDAFVVFDKTQSAVADWVYNELRGQLEECRGRWALRLCLEERDWLPGKTLFENLWASVYGSRKTLFVLAHTDRVSGLLRASFLLAQQRLLEDRKDVVVLVILSPDGRRSRYVRLRQRLCRQSVLLWPHQPSGQRSFWAQLGMALTRDNHHFYNRNFCQGPTAE | 38 |
| TLR10 | Q9BXR5 | 81793 | MRLIRNIYIFCSIVMTAEGDAPELPEERELMTNCSNMSLRKVPADLTPATTTLDLSYNLLFQLQSSDFHSVSKLRVLILCHNRIQQLDLKTFEFNKELRYLDLSNNRLKSVTWYLLAGLRYLDLSFNDFDTMPICEEAGNMSHLEILGLSGAKIQKSDFQKIAHLHLNTVFLGFRTLPHYEEGSLPILNTTKLHIVLPMDTNFWVLLRDGIKTSKILEMTNIDGKSQFVSYEMQRNLSLENAKTSVLLLNKVDLLWDDLFLILQFVWHTSVEHFQIRNVTFGGKAYLDHNSFDYSNTVMRTIKLEHVHFRVFYIQQDKIYLLLTKMDIENLTISNAQMPHMLFPNYPTKFQYLNFANNILTDELFKRTIQLPHLKTLILNGNKLETLSLVSCFANNTPLEHLDLSQNLLQHKNDENCSWPETVVNMNLSYNKLSDSVFRCLPKSIQILDLNNNQIQTVPKETIHLMALRELNIAFNFLTDLPGCSHFSRLSVLNIEMNFILSPSLDFVQSCQEVKTLNAGRNPFRCTCELKNFIQLETYSEVMMVGWSDSYTCEYPLNLRGTRLKDVHLHELSCNT ALLIVTIVVIMLVLGLAVAF CCLHFDLPWYLRMLGQCTQTWHRVRKTTQEQLKRN VRFHAFISYSEHDSLWVKNELIPNLEKEDGSILICLYESYFDPGKSISENIVSFIEKSYKSIFVLSPNFVQNEWCHYEFYFAHHNLFHENSDHIILILLEPIPFYCIPTRYHKLKALLEKKAYLEWPKDRRKCGLFWANLRAAINVNVLATREMYELQTFTELNEESRGSTISLMRTDCL | 39 |
在一些實施方式中，與不包含所述TLR受體結構域的經修飾的免疫細胞相比，TLR多肽藉由經修飾的免疫細胞誘導針對靶細胞的細胞毒性增加，如增加至少約10%、20%、30%、40%、2倍、4倍、6倍或更多中的任一個。在一些實施方式中，與不包含所述TLR受體結構域的經修飾的免疫細胞相比，TLR受體結構域藉由經修飾的免疫細胞誘導針對靶細胞的細胞毒性增加，如增加不超過約6倍、4倍、2倍、40%、30%、20%、10%或更少中的任一個。在一些實施方式中，藉由乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性測定和/或與靶腫瘤細胞的共培養測定來測量細胞毒性。在一些實施方式中，在基於細胞的測定中測量細胞毒性和腫瘤細胞殺傷能力。在一些實施方式中，在體內測量細胞毒性和腫瘤細胞殺傷能力。
在一些實施方式中，與不包含所述TLR受體結構域的經修飾的免疫細胞相比，TLR多肽藉由經修飾的免疫細胞誘導炎性細胞介素分泌水平降低，如降低至少約10%、20%、30%、40%、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、12倍、14倍、16倍、18倍、20倍、30倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更多中的任一個。在一些實施方式中，與不包含所述TLR多肽的經修飾的免疫細胞相比，TLR多肽藉由經修飾的免疫細胞誘導炎性細胞介素分泌水平降低，如降低不超過約1000倍、500倍、200倍、100倍、50倍、30倍、20倍、18倍、16倍、14倍、12倍、10倍、8倍、6倍、4倍、50%、40%、30%、20%、10%或更少中的任一個。在一些實施方式中，與不包含所述TLR多肽的經修飾的免疫細胞相比，TLR多肽藉由經修飾的免疫細胞誘導炎性細胞介素分泌水平降低，如降低約10%-50%、2-1000倍、2-50倍、50-100倍、100-1000倍、50-500倍、10-100倍、10-50倍或50-200倍中的任一個之間。示例性炎性細胞介素包括但不限於，例如IFN-γ、TNF-α和GM-CSF。在一些實施方式中，藉由在血清免疫測定（如酶聯免疫吸附測定（ELISA）、化學發光免疫測定（CIA）或流動式細胞測量術）中測量炎性細胞介素的分泌水平。在一些實施方式中，在基於細胞的測定中測量炎性細胞介素分泌水平。在一些實施方式中，在體內測量炎性細胞介素分泌水平。
在一些實施方式中，TLR多肽係共刺激分子。在一些實施方式中，TLR多肽共刺激分子係誘導型共刺激分子，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。
在一些實施方式中，誘導型共刺激分子經由自切割肽（如P2A）與工程化受體（例如，本文所述之工程化受體中的任一種）連接。在一些實施方式中，工程化受體係嵌合抗原受體（CAR）。在一些實施方式中，TLR多肽包含跨膜結構域和傳訊結構域。在一些實施方式中，TLR多肽係共刺激分子，並且包含TLR跨膜結構域和TLR傳訊結構域。在一些實施方式中，傳訊結構域係細胞內結構域，如細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，TLR多肽包含：(a)靶結合結構域，(b)跨膜結構域；和 (c)傳訊結構域（例如，細胞內傳訊結構域）。視需要，TLR多肽進一步包含傳訊肽。
在一些實施方式中，TLR多肽包含與TLR傳訊結構域直接或間接融合的跨膜結構域。在一些實施方式中，TLR多肽包含與靶結合結構域（例如，第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域）直接或間接融合的跨膜結構域。在一些實施方式中，TLR多肽包含同時與靶結合結構域和TLR傳訊結構域直接或間接融合的跨膜結構域。在一些實施方式中，TLR多肽包含來自TLR分子的TLR跨膜結構域。在一些實施方式中，TLR分子選自由以下組成之群組：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10。在一些實施方式中，TLR跨膜結構域衍生自TLR1。在一些實施方式中，TLR跨膜結構域衍生自TLR2。在一些實施方式中，TLR跨膜結構域衍生自TLR4。在一些實施方式中，TLR跨膜結構域衍生自TLR6。
在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含第一多肽和第二多肽。在一些實施方式中，第一多肽包含第一靶結合結構域、第一TLR跨膜結構域和第一TLR傳訊結構域。在一些實施方式中，第二多肽包含第二靶結合結構域、第二TLR跨膜結構域和第二TLR傳訊結構域。
在一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域和第一TLR傳訊結構域衍生自相同TLR分子。在一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域和/或第一TLR傳訊結構域衍生自由以下組成之群組：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10。在一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域和/或第一TLR傳訊結構域衍生自由以下組成之群組：TLR1、TLR2、TLR4和TLR6。在一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域和/或第一TLR傳訊結構域衍生自TLR1。在一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域和/或第一TLR傳訊結構域衍生自TLR4。
在一些實施方式中，第二TLR跨膜結構域和第二TLR傳訊結構域衍生自相同TLR分子。在一些實施方式中，第二TLR跨膜結構域和/或第二TLR傳訊結構域衍生自由以下組成之群組：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10。在一些實施方式中，第二TLR跨膜結構域和/或第二TLR傳訊結構域衍生自由以下組成之群組：TLR1、TLR2、TLR4和TLR6。在一些實施方式中，第二TLR跨膜結構域和/或第一TLR傳訊結構域衍生自TLR2。
在一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域和第二TLR跨膜結構域相同。在一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域衍生自TLR1，並且第二TLR跨膜結構域衍生自TLR1。在一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域衍生自TLR2，並且第二TLR跨膜結構域衍生自TLR2。在一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域衍生自TLR4，並且第二TLR跨膜結構域衍生自TLR4。在一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域衍生自TLR6，並且第二TLR跨膜結構域衍生自TLR6。
在一些實施方式中，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相同。在一些實施方式中，第一TLR傳訊結構域衍生自TLR1，並且第二TLR傳訊結構域衍生自TLR1。在一些實施方式中，第一TLR傳訊結構域衍生自TLR2，並且第二TLR傳訊結構域衍生自TLR2。在一些實施方式中，第一TLR傳訊結構域衍生自TLR4，並且第二TLR傳訊結構域衍生自TLR4。在一些實施方式中，第一TLR傳訊結構域衍生自TLR6，並且第二TLR傳訊結構域衍生自TLR6。
在一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域和第二TLR跨膜結構域不同。在一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域衍生自TLR2，並且第二TLR跨膜結構域衍生自TLR1。在一些實施方式中，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域不同。在一些實施方式中，第一TLR傳訊結構域衍生自TLR2，並且第二TLR傳訊結構域衍生自TLR1。在一些實施方式中，第一TLR跨膜結構域衍生自TLR2，第一TLR傳訊結構域衍生自TLR2，第二TLR跨膜結構域衍生自TLR1，並且第二TLR傳訊結構域衍生自TLR1。
在一些實施方式中，本文所述之TLR多肽包含靶結合結構域。在一些實施方式中，靶結合結構域不是衍生自受體或配位基。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不是衍生自TGFβ。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不是TGFβ。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ細胞外結構域。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的細胞外TGFβ結合結構域（例如，TGFβR1和/或TGFβR2）。在一些實施方式中，靶結合結構域不包含TGFβR1的細胞外TGFβ結合結構域。在一些實施方式中，靶結合結構域不包含TGFβR2的細胞外TGFβ結合結構域。在一些實施方式中，靶結合結構域不是細胞外TGFβ結合結構域。在一些實施方式中，靶結合結構域不是TGFβR2的細胞外TGFβ結合結構域。在一些實施方式中，靶結合結構域不是TGFβRl的細胞外TGFβ結合結構域。在一些實施方式中，TLR多肽（例如，第一多肽和/或第二多肽）不是WO 2018/094244 A1中描述的嵌合TGFβ受體CTBR信號變換器，該文獻藉由援引以其全文併入本文。
在一些實施方式中，本文提供的經修飾的免疫細胞包含第一和第二TLR多肽，其中第一TLR多肽包含第一靶結合結構域，並且第二TLR多肽包含第二靶結合結構域。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域相同。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二靶結合結構域不同。
在一些實施方式中，TLR多肽的靶結合結構域係抗體或抗體片段，如scFv、Fv、Fab、(Fab’)
2、單域抗體（sdAb）、或V
HH結構域。在一些實施方式中，該多肽係靶分子的受體的配位基或細胞外部分。在一些實施方式中，靶分子係腫瘤抗原。在一些實施方式中，TLR多肽的靶結合結構域特異性結合單個腫瘤抗原。在一些實施方式中，腫瘤抗原選自由以下組成之群組：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CLL1、CD38、CEA、EGFR（如EGFRvIII）、GD2、HER2、IGF1R、間皮素、PSMA、ROR1、WT1、和具有臨床意義的其他腫瘤抗原、及其組合。在一些實施方式中，TLR多肽特異性結合選自由以下組成之群組的靶抗原：NKG2D、GPRC5D、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、AFP、CD4、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD70、CD123、CEA、EGFR（如EGFRvIII）、GD2、GPC-2、GPC3、CLDN18.2、HER2、LILRB4、IL-13Rα2、IGF1R、間皮素、PSMA、ROR1、WT1、NKG2D、CLL1、TGFaRII、TGFbRII、CCR5、CXCR4、CCR4、HPV相關抗原和EBV相關抗原（例如，LMP1或LMP2）。在一些實施方式中，靶結合結構域特異性結合CD33、CLL1、CD123、CD19、CD20、CD22、BCMA、NKG2D、GPRC5D或GPC3。
在一些實施方式中，靶分子係免疫檢查點蛋白。在一些實施方式中，靶分子選自由以下組成之群組：PD-1、CD70、CD27、SIRPα和TIGIT。
在一些實施方式中，靶分子係在免疫細胞上表現的天然蛋白質。在一些實施方式中，靶分子係NKG2D。在一些實施方式中，靶分子係突變的NKG2D。在一些實施方式中，突變的NKG2D包含截短的序列和/或胺基酸取代、突變、添加和/或缺失。在一些實施方式中，靶分子係NKG2D的細胞外抗原結合結構域（本文也稱為「NKG2D ECD」）。在一些實施方式中，靶分子係NKG2D的全長序列。在一些實施方式中，NKG2D包含與SEQ ID NO: 54具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，第二多肽包含SEQ ID NO: 54。在一些實施方式中，NKG2D包含NKG2D的ECD全長序列的位置81-216處的胺基酸（SEQ ID NO: 54）。在一些實施方式中，NKG2D包含與SEQ ID NO: 51具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，第二多肽包含SEQ ID NO: 51。在一些實施方式中，NKG2D包含NKG2D的ECD全長序列位置89-216處的胺基酸（SEQ ID NO: 54）。在一些實施方式中，NKG2D包含與SEQ ID NO: 52具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，第二多肽包含SEQ ID NO: 52。在一些實施方式中，NKG2D包含NKG2D的ECD全長序列位置98-216處的胺基酸（SEQ ID NO: 54）。在一些實施方式中，NKG2D包含與SEQ ID NO: 53具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，第二多肽包含SEQ ID NO: 53。
在一些實施方式中，TLR多肽進一步包含訊息肽，該訊息肽將TLR多肽標靶細胞（例如，ER）的分泌途徑，並將允許TLR多肽整合和錨定到宿主細胞的脂質雙層中。適用於本文所述之TLR多肽且包含天然存在的蛋白的訊息序列或合成的、非天然存在的訊息序列的訊息肽對於熟悉該項技術者將是顯而易見的。在一些實施方式中，訊息肽來源於選自以下群組的分子，該群組由以下組成：CD8α、GM-CSF受體α、IL-3、和IgG1重鏈。在一些實施方式中，訊息肽源自CD8α。
TLR多肽可以包含位於不同結構域之間的一個或多個肽連接子（linker）。例如，靶結合結構域和TLR跨膜結構域和/或TLR跨膜結構域和TLR傳訊結構域可以經由肽鍵或經由肽連接子彼此融合。連接不同結構域的肽連接子可以相同或不同。每個肽連接子可以單獨優化。肽連接子可以具有任何合適的長度。在一些實施方式中，肽連接子的長度為至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50個或更多個胺基酸中的任一個。在一些實施方式中，肽連接子的長度為不多於約50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5個或更少個胺基酸中的任一個。在一些實施方式中，肽連接子的長度為以下中的任一個：約1個胺基酸至約10個胺基酸、約1個胺基酸至約20個胺基酸、約1個胺基酸至約30個胺基酸、約5個胺基酸至約15個胺基酸、約10個胺基酸至約25個胺基酸、約5個胺基酸至約30個胺基酸、約10個胺基酸至約30個胺基酸長、約30個胺基酸至約50個胺基酸、或約1個胺基酸至約50個胺基酸。
肽連接子可具有天然存在的序列或非天然存在的序列。在一些實施方式中，肽連接子係柔性連接子。示例性柔性連接子包括甘胺酸聚合物(G)
n、甘胺酸-絲胺酸聚合物（包括例如(GS)
n（SEQ ID NO: 27）、(GSGGS)
n（SEQ ID NO: 28）和(GGGS)
n（SEQ ID NO: 29），其中n係至少1的整數）、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物和本領域已知的其他柔性連接子。在一些實施方式中，肽連接子具有SEQ ID NO: 25或26的胺基酸序列。
在一些實施方式中，TLR多肽包含衍生自相同TLR分子的跨膜結構域和傳訊結構域。在一些實施方式中，TLR多肽包含TLR1跨膜結構域和TLR1傳訊結構域。在一些實施方式中，TLR多肽包含TLR2跨膜結構域和TLR2傳訊結構域。在一些實施方式中，TLR多肽包含TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域。在一些實施方式中，TLR多肽包含TLR6跨膜結構域和TLR6傳訊結構域。在一些實施方式中，TLR多肽進一步包含訊息肽（例如，前導序列）。在一些實施方式中，TLR多肽進一步包含細胞介素受體的細胞內結構域。
在一些實施方式中，包含衍生自相同TLR分子的跨膜結構域和傳訊結構域的TLR多肽進一步包含靶結合結構域。在一些實施方式中，靶結合結構域係特異性結合NKG2D、CD33、CLL1、CD123、CD19、CD20、CD22、BCMA、GPRC5D或GPC3的scFv或sdAb。在一些實施方式中，包含衍生自相同TLR分子的跨膜結構域和傳訊結構域的TLR多肽進一步包含特異性結合CD33的靶結合結構域。在一些實施方式中，包含衍生自相同TLR分子的跨膜結構域和傳訊結構域的TLR多肽進一步包含特異性結合CD33的V結構域的靶結合結構域。在一些實施方式中，TLR多肽包含TLR2跨膜結構域、衍生的TLR2傳訊結構域和特異性結合CD33的V結構域的靶結合結構域。在一些實施方式中，包含衍生自相同TLR分子的跨膜結構域和傳訊結構域的TLR多肽進一步包含特異性結合CD33的C2結構域的靶結合結構域。在一些實施方式中，TLR多肽包含TLR1跨膜結構域、衍生的TLR1傳訊結構域和特異性結合CD33的C2結構域的靶結合結構域。在一些實施方式中，TLR多肽包含跨膜結構域，並且衍生自相同TLR分子的傳訊結構域進一步包含特異性結合CD20的靶結合結構域。在一些實施方式中，TLR多肽包含TLR4跨膜結構域、衍生的TLR4傳訊結構域和特異性結合CD20的靶結合結構域。在一些實施方式中，包含衍生自相同TLR分子的跨膜結構域和傳訊結構域的TLR多肽進一步包含特異性結合CD33的靶結合結構域。在一些實施方式中，TLR多肽包含TLR4跨膜結構域、衍生的TLR4傳訊結構域和特異性結合CD33的靶結合結構域。在一些實施方式中，包含衍生自相同TLR分子的跨膜結構域和傳訊結構域的TLR多肽進一步包含特異性結合NKG2D的靶結合結構域。在一些實施方式中，TLR多肽包含TLR4跨膜結構域、衍生的TLR4傳訊結構域和特異性結合NKG2D的靶結合結構域。在一些實施方式中，包含衍生BCMA相同TLR分子的跨膜結構域和傳訊結構域的TLR多肽進一步包含特異性結合BCMA的靶結合結構域。在一些實施方式中，TLR多肽包含TLR4跨膜結構域、衍生的TLR4傳訊結構域和特異性結合BCMA的靶結合結構域。在一些實施方式中，包含衍生自相同TLR分子的跨膜結構域和傳訊結構域的TLR多肽進一步包含特異性結合GPRC5D的靶結合結構域。在一些實施方式中，TLR多肽包含TLR4跨膜結構域、衍生的TLR4傳訊結構域和特異性結合GPRC5D的靶結合結構域。在一些實施方式中，TLR多肽進一步包含訊息肽（例如，前導序列）。
在一些實施方式中，TLR多肽進一步包含細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，TLR多肽包含一個或多個細胞介素受體的兩個或更多個細胞內結構域。在一些實施方式中，細胞介素受體的細胞內結構域的C-末端與TLR傳訊結構域的N-末端融合。在一些實施方式中，細胞介素受體的細胞內結構域的C-末端與TLR結構域的N-末端直接融合。在一些實施方式中，細胞介素受體的細胞內結構域的C-末端與TLR結構域的N-末端間接融合，如經由連接子（例如，經由柔性肽連接子）或經由另一個結構域。在一些實施方式中，TLR多肽從N-末端到C-末端包含：i)靶結合結構域，ii)細胞介素受體的細胞內結構域，iii)TLR跨膜結構域，和iv)TLR傳訊結構域。
在一些實施方式中，細胞介素受體的細胞內結構域的N-末端與TLR傳訊結構域的C-末端融合。在一些實施方式中，細胞介素受體的細胞內結構域的N-末端與TLR傳訊結構域的C-末端直接融合。在一些實施方式中，細胞介素受體的細胞內結構域的N-末端與TLR傳訊結構域的C-末端間接融合，如經由連接子（例如，經由柔性肽連接子）或經由另一個結構域。在一些實施方式中，TLR多肽從N-末端到C-末端包含：i)靶結合結構域，ii)TLR跨膜結構域，iii)TLR傳訊結構域，和iv)細胞介素受體的細胞內結構域。
在一些實施方式中，細胞介素受體衍生的細胞內結構域對一個或多個TLR多肽賦予改善的TLR傳訊（例如，抗腫瘤作用）。在一些實施方式中，細胞介素受體衍生的細胞內結構域選自由以下組成之群組：GM-CSF受體、IL-18受體、IL-21受體、IL-15受體和IL-23受體。在一些實施方式中，細胞介素受體衍生的細胞內結構域包含基於免疫受體酪胺酸的活化模體（ITAM）。
本文所述之經修飾的免疫細胞包含第一TLR多肽和第二TLR多肽。在一些實施方式中，第一TLR多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域。在一些實施方式中，第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的第二細胞內結構域。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，並且第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的第二細胞內結構域。在一些實施方式中，第一細胞介素受體的第一細胞內結構域和第二細胞介素受體的第二細胞內結構域相同。在一些實施方式中，第一細胞介素受體的第一細胞內結構域和第二細胞介素受體的第二細胞內結構域不同。在一些實施方式中，第一細胞介素受體選自由以下組成之群組：GM-CSF受體、IL-18受體、IL-21受體、IL-15受體和IL-23受體。在一些實施方式中，第二細胞介素受體選自由以下組成之群組：GM-CSF受體、IL-18受體、IL-21受體、IL-15受體和IL-23受體。在一些實施方式中，第一細胞介素受體和第二細胞介素受體各自選自由以下組成之群組：GM-CSF受體、IL-18受體、IL-21受體、IL-15受體和IL-23受體。在一些實施方式中，第一細胞介素受體的第一細胞內結構域包含基於免疫受體酪胺酸的活化模體（ITAM）。在一些實施方式中，第二細胞介素受體的第二細胞內結構域包含基於免疫受體酪胺酸的活化模體（ITAM）。在一些實施方式中，第一細胞介素受體的第一細胞內結構域和第二細胞介素受體的第二細胞內結構域包含基於免疫受體酪胺酸的活化模體（ITAM）。在一些實施方式中，第一細胞介素受體的第一細胞內結構域的C-末端與第一TLR傳訊結構域的N-末端融合。在一些實施方式中，第二細胞介素受體的第二細胞內結構域的C-末端與第二TLR傳訊結構域的N-末端融合。在一些實施方式中，第一細胞介素受體的第一細胞內結構域的C-末端與第一TLR傳訊結構域的N-末端融合；並且，第二細胞介素受體的第二細胞內結構域的C-末端與第二TLR傳訊結構域的N-末端融合。在一些實施方式中，第一細胞介素受體的第一細胞內結構域的N-末端與TLR傳訊結構域的C-末端融合。在一些實施方式中，第二細胞介素受體的第二細胞內結構域的N-末端與TLR傳訊結構域的C-末端融合。在一些實施方式中，第一細胞介素受體的第一細胞內結構域的N-末端與TLR傳訊結構域的C-末端融合；並且，第二細胞介素受體的第二細胞內結構域的N-末端與TLR傳訊結構域的C-末端融合。
在一些實施方式中，本文所述之TLR多肽包含在經修飾的免疫細胞中。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗CD19 CAR分子和抗CD20 TLR多肽。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分）。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞表現抗CD19 CAR。在一些實施方式中，抗CD19 CAR從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，抗CD19 CAR包含與SEQ ID NO: 2具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗CD19 CAR包含SEQ ID NO: 2。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自包含與SEQ ID NO: 40具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自包含SEQ ID NO: 40。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 1具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 1。在一些實施方式中，TLR多肽編碼序列缺少推定的上游起始密碼子中的一些或全部的序列。在一些實施方式中，TLR多肽可以包含某些胺基酸突變，而不影響第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域之間形成TLR傳訊部分的締合，從而不影響TLR傳訊的誘導。
在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗CD19 CAR分子和抗NKG2D TLR多肽。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分）。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞表現抗CD19 CAR。在一些實施方式中，抗CD19 CAR從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，抗CD19 CAR包含與SEQ ID NO: 2具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗CD19 CAR包含SEQ ID NO: 2。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自包含與SEQ ID NO: 40具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自包含SEQ ID NO: 40。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 59具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 59。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 60具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 60。在一些實施方式中，TLR多肽編碼序列缺少推定的上游起始密碼子中的一些或全部的序列。在一些實施方式中，TLR多肽可以包含某些胺基酸突變，而不影響第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域之間形成TLR傳訊部分的締合，從而不影響TLR傳訊的誘導。
在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗GPC3 CAR分子和抗NKG2D TLR多肽。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分）。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞表現抗GPC3 CAR。在一些實施方式中，抗GPC3 CAR從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPC3 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，抗GPC3 CAR包含與SEQ ID NO: 56具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗GPC3 CAR包含SEQ ID NO: 56。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自包含與SEQ ID NO: 40具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自包含SEQ ID NO: 40。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPC3 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 57具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 57。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPC3 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 58具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 58。在一些實施方式中，TLR多肽編碼序列缺少推定的上游起始密碼子中的一些或全部的序列。在一些實施方式中，TLR多肽可以包含某些胺基酸突變，而不影響第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域之間形成TLR傳訊部分的締合，從而不影響TLR傳訊的誘導。
在一些實施方式中，本文所述之TLR多肽包含在經修飾的免疫細胞中。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗CLL1 CAR分子和抗CD33 TLR多肽。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分）。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞表現抗CLL1 CAR。在一些實施方式中，抗CLL1 CAR從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CLL1 sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CLL1 sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 71具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 71。在一些實施方式中，TLR多肽編碼序列缺少推定的上游起始密碼子中的一些或全部的序列。在一些實施方式中，TLR多肽可以包含某些胺基酸突變，而不影響第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域之間形成TLR傳訊部分的締合，從而不影響TLR傳訊的誘導。
在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗BCMA CAR分子（例如，單個抗BCMA CAR或串聯抗BCMA CAR）和抗BCMA TLR多肽。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分）。在一些實施方式中，抗BCMA CAR從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，抗BCMA CAR包含與SEQ ID NO: 67具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗BCMA CAR包含SEQ ID NO: 67。在一些實施方式中，抗BCMA CAR從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，抗BCMA CAR包含與SEQ ID NO: 66具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗BCMA CAR包含SEQ ID NO: 66。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自包含與SEQ ID NO: 40具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自包含SEQ ID NO: 40。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、單個抗BCMA sdAb、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 62具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 62。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 63具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 63。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD28α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 64具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 64。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 61具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 61。在一些實施方式中，TLR多肽編碼序列缺少推定的上游起始密碼子中的一些或全部的序列。在一些實施方式中，TLR多肽可以包含某些胺基酸突變，而不影響第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域之間形成TLR傳訊部分的締合，從而不影響TLR傳訊的誘導。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗BCMA CAR分子（例如，單個抗BCMA CAR或串聯抗BCMA CAR）和抗GPRC5D TLR多肽。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分）。在一些實施方式中，抗BCMA CAR從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，抗BCMA CAR包含與SEQ ID NO: 66具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗BCMA CAR包含SEQ ID NO: 66。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自包含與SEQ ID NO: 40具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自包含SEQ ID NO: 40。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗BCMA CAR（例如，單個抗BCMA CAR或串聯抗BCMA CAR）和抗GPRC5D TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 65具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 65。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗GPRC5D scFv、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 72具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 72。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗GPRC5D scFv、CD28α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 73具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 73。在一些實施方式中，TLR多肽編碼序列缺少推定的上游起始密碼子中的一些或全部的序列。在一些實施方式中，TLR多肽可以包含某些胺基酸突變，而不影響第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域之間形成TLR傳訊部分的締合，從而不影響TLR傳訊的誘導。
在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗CLL1 CAR和抗CD33（例如，抗CD33 V結構域和/或抗CD33 C2結構域）TLR多肽。在一些實施方式中，第一多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD33 V結構域sdAb、TLR2跨膜結構域和TLR2傳訊結構域（例如，TLR2的胞內部分），並且第二多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD33 C2結構域sdAb、TLR1跨膜結構域和TLR1傳訊結構域（例如，TLR1的胞內部分）。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞表現抗CLL1 CAR。在一些實施方式中，抗CLL1 CAR從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CLL1 sdAb、CD28α鉸鏈結構域、CD28α跨膜（TM）結構域、CD28共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，抗CLL1 CAR包含與SEQ ID NO: 4具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗CLL1 CAR包含SEQ ID NO: 4。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞表現抗CLL1/CD33雙CAR。在一些實施方式中，抗CLL1/CD33雙CAR從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CLL1 sdAb、抗CD33 V結構域sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，抗CLL1/CD33雙CAR包含與SEQ ID NO: 43具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗CLL1/CD33雙CAR包含SEQ ID NO: 43。在一些實施方式中，第一多肽包含與SEQ ID NO: 41具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，第一多肽包含SEQ ID NO: 41。在一些實施方式中，第二多肽包含與SEQ ID NO: 42具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，第二多肽包含SEQ ID NO: 42。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗CLL1 CAR和抗CD33（例如，抗CD33 V結構域和/或抗CD33 C2結構域）TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CLL1 sdAb、CD28α鉸鏈結構域、CD28α跨膜（TM）結構域、CD28共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗CD33 V結構域sdAb、TLR2跨膜結構域、TLR2傳訊結構域（例如，TLR2的胞內部分）、P2A切割位點、訊息肽、抗CD33 C2結構域sdAb、TLR1跨膜結構域和TLR1傳訊結構域（例如，TLR1的胞內部分）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 3具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，TLR多肽編碼序列缺少推定的上游起始密碼子中的一些或全部的序列。在一些實施方式中，TLR多肽可以包含某些胺基酸突變，而不影響第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域之間形成TLR傳訊部分的締合，從而不影響TLR傳訊的誘導。
本文所述之TLR結構域（例如，TLR跨膜結構域和/或TLR傳訊結構域）中任一種的變體也在本揭露之範圍內，使得TLR結構域能夠調節免疫細胞的免疫反應。在一些實施方式中，與野生型對照物相比，共刺激傳訊結構域包含多達10個胺基酸殘基變異（例如，1、2、3、4、5或8個）。包含一個或多個胺基酸變異的此類TLR結構域可以稱為變體。相對於不包含突變的共刺激傳訊結構域，TLR傳訊結構域的胺基酸殘基的突變可以導致訊息傳導的增加和增強的對免疫反應的刺激。相對於不包含突變的共刺激傳訊結構域，TLR傳訊結構域的胺基酸殘基的突變可以導致訊息傳導的減少和降低的對免疫反應的刺激。
在一些實施方式中，TLR多肽包含本文所述TLR結構域（例如，TLR跨膜結構域和/或TLR傳訊結構域）的胺基酸序列變體。在一些實施方式中，TLR多肽包含本文所述TLR分子（例如，TLR分子的TLR跨膜結構域和/或TLR傳訊結構域）的胺基酸序列變體。例如，可能希望調節TLR多肽的生物學特性。可以藉由向編碼TLR分子的核苷酸序列中引入適當的修飾或藉由肽合成來製備其TLR分子（如其TLR分子的跨膜結構域和/或傳訊結構域）的胺基酸序列變體。此類修飾包括例如，TLR分子的胺基酸序列內的殘基的缺失和/或插入和/或取代。可以進行缺失、插入和取代的任何組合以得到最終的構建體，條件係最終的構建體具有所希望的特徵，例如TLR結合和/或促炎活性。
在一些實施方式中，與本文所述之TLR分子中任一個的序列相比，TLR分子包含一個或多個（例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20個胺基酸或更多）保守取代。在一些實施方式中，TLR分子與本文所述之TLR分子中任一個的序列具有至少約80%序列一致性，如至少約85%、87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性中的任一個。如同本文所述之TLR多肽，包含修飾TLR分子的TLR多肽變體具有相似的抗腫瘤活性和低毒性。
保守取代顯示於下表A中。
[
表 A]
： 保守取代
胺基酸可以根據共同的側鏈特性分成不同的類別：
a.疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
b.中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
c.酸性：Asp、Glu；
d.鹼性：His、Lys、Arg；
e.影響鏈取向的殘基：Gly、Pro；
f.芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代將需要將該等類別中的一個的成員交換為另一個類別。
| 原始 殘基 | 示例性 取代 | 較佳的 取代 |
| Ala（A） | Val；Leu；Ile | Val |
| Arg（R） | Lys；Gln；Asn | Lys |
| Asn（N） | Gln；His；Asp、Lys；Arg | Gln |
| Asp（D） | Glu；Asn | Glu |
| Cys（C） | Ser；Ala | Ser |
| Gln（Q） | Asn；Glu | Asn |
| Glu（E） | Asp；Gln | Asp |
| Gly（G） | Ala | Ala |
| His（H） | Asn；Gln；Lys；Arg | Arg |
| Ile（I） | Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 | Leu |
| Leu（L） | 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe | Ile |
| Lys（K） | Arg；Gln；Asn | Arg |
| Met（M） | Leu；Phe；Ile | Leu |
| Phe（F） | Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr | Tyr |
| Pro（P） | Ala | Ala |
| Ser（S） | Thr | Thr |
| Thr（T） | Val；Ser | Ser |
| Trp（W） | Tyr；Phe | Tyr |
| Tyr（Y） | Trp；Phe；Thr；Ser | Phe |
| Val（V） | Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 | Leu |
熟悉該項技術者將認識到，可使用任何合適之方法在目的基因中產生突變，包括誘變、聚合酶鏈反應、同源重組或熟悉該項技術者已知的任何其他基因工程技術。突變可涉及單個核苷酸（如點突變，其涉及DNA序列內單個核苷酸鹼基的去除、添加或取代）或者可涉及大量核苷酸的插入或缺失。突變可由於如DNA複製的保真度錯誤等事件而自發產生，或在暴露於化學或物理誘變劑後被誘導。也可以藉由使用熟悉該項技術者熟知的特定標靶方法進行定點突變。
如Cunningham和Wells (1989)
Science, 244:1081-1085所述，用於鑒定可以標靶誘變的多肽的殘基或區域的有用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」。在此方法中，鑒定靶殘基的殘基或殘基組（例如，帶電荷的殘基，如arg、asp、his、lys和glu），並用中性或帶負電荷的胺基酸（例如，丙胺酸或聚丙胺酸）替換，以確定多肽試劑與其標靶（例如，第一TLR傳訊結構域與第二TLR傳訊結構域）的相互作用是否受到影響。可以在胺基酸位置引入另外的取代，證明對初始取代的功能敏感性。可以篩選變體以確定它們是否含有所希望的特性。
胺基酸序列插入包括胺基末端和/或羧基末端融合，長度在一個殘基至含有一百個或更多個殘基的多肽的範圍內，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。
在一些實施方式中，可以包括肽標籤（通常是能夠被可獲得的抗血清或化合物識別的短肽序列）用於隨後TLR多肽的表現和運輸。多種標籤肽可用於本文所述之TLR多肽，但不限於PK標籤、FLAG八肽、MYC標籤、HIS標籤（通常為4至10個組胺酸殘基的一段）和e-標籤（US 6,686,152）。當使用幾個標籤時，一個或多個標籤肽可以獨立地位於蛋白質的N-末端、其C-末端、內部或該等位置中的任一處。可以使用抗標籤抗體藉由免疫檢測測定法檢測標籤肽。
工程化受體
上述任何經修飾的免疫細胞可以進一步表現工程化受體。示例性工程化受體包括但不限於CAR、工程化TCR和TAC受體。在一些實施方式中，工程化受體包含特異性結合抗原（例如，腫瘤抗原）的細胞外結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域包含初級細胞內傳訊結構域和/或共刺激結構域。在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域包含TCR共受體的細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，工程化受體由可操作地連接至啟動子（如組成型啟動子或誘導型啟動子）的第三核酸編碼。在一些實施方式中，藉由將蛋白質插入細胞膜中同時使細胞通過微流體系統（如CELL SQUEEZE
®），將工程化受體引入經修飾的免疫細胞中（參見例如，美國專利申請公開號20140287509）。工程化受體可以增強經修飾的免疫細胞的功能，如藉由標靶經修飾的免疫細胞、藉由轉導信號和/或藉由增強經修飾的免疫細胞的細胞毒性。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞不表現工程化受體，如CAR、TCR或TAC受體。
在一些實施方式中，工程化受體包含標靶至少一種腫瘤抗原的一個或多個特異性結合結構域，和一個或多個細胞內效應結構域，如一個或多個初級細胞內傳訊結構域和/或共刺激結構域。
在一些實施方式中，工程化受體係嵌合抗原受體（CAR）。許多嵌合抗原受體係本領域已知的並且可以適用於本申請的經修飾的免疫細胞。也可以藉由使用例如抗體分子的抗原結合片段或抗體可變結構域將CAR構建為對任何細胞表面標誌物具有特異性。本文可以使用產生CAR的任何方法。參見例如，US 6,410,319、US 7,446, 191、US 7,514,537、US 9765342 B2、WO 2002/077029、WO 2015/142675、US 2010/065818、US 2010/025177、US 2007/059298、WO 2017025038 A1以及Berger C.等人, J. Clinical Investigation 118: 1 294-308 (2008)，將該等文獻藉由援引特此併入。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞係CAR-T細胞。
本申請的CAR包含細胞外結構域、跨膜結構域和細胞內傳訊結構域，該細胞外結構域包含特異性結合至少一種腫瘤抗原的至少一個標靶結構域。在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域產生促進含CAR細胞（例如，CAR-T細胞）的免疫效應子功能的信號。「免疫效應子功能或免疫效應子反應」係指例如免疫效應子細胞的功能或反應，其增強或促進靶細胞的免疫攻擊。例如，免疫效應子功能或反應可以指T或NK細胞促進殺死或抑制靶細胞生長或增殖的特性。免疫效應子功能的實施例，例如在CAR-T細胞中，包括細胞溶解活性（如抗體依賴性細胞毒性，或ADCC）和輔助活性（如細胞介素的分泌）。在一些實施方式中，CAR具有細胞內傳訊結構域，其具有減弱的免疫效應子功能。在一些實施方式中，與具有全長和野生型CD3ζ以及視需要的一個或多個共刺激結構域的CAR相比，該CAR具有不超過約90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或更少中任一個的免疫效應子功能（如針對靶細胞的細胞溶解功能）的細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域產生促進含CAR細胞增殖和/或存活的信號。在一些實施方式中，CAR包含一個或多個選自CD28、CD137、CD3、CD27、CD40、ICOS、GITR和OX40的傳訊結構域的細胞內傳訊結構域。天然存在的分子的傳訊結構域可包含分子或其片段或衍生物的整個細胞內（即胞內）部分或整個天然細胞內傳訊結構域。
在一些實施方式中，CAR的細胞內傳訊結構域包含初級細胞內傳訊結構域。「初級細胞內傳訊結構域」係指以刺激性方式起作用以誘導免疫效應子功能的胞內傳訊序列。在一些實施方式中，初級細胞內傳訊結構域含有稱為基於免疫受體酪胺酸的活化模體或ITAM的傳訊模體。在一些實施方式中，初級細胞內傳訊結構域包含選自由CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、常見FcRγ（FCER1G）、FcRβ（FcεRib）、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10和DAP 12組成之群組的蛋白質的功能性傳訊結構域。在一些實施方式中，初級細胞內傳訊結構域包含選自由CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、常見FcRγ（FCER1G）、FcRβ（FcεRib）、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10和DAP 12組成之群組的蛋白質的非功能性或減弱的傳訊結構域。非功能性或減弱的傳訊結構域可以是具有減弱或消除一種或多種免疫效應子功能（如細胞溶解活性或輔助活性，包括抗體依賴性細胞毒性（ADCC））的點突變、插入或缺失的突變傳訊結構域。在一些實施方式中，CAR包含非功能性或減弱的CD3ζ（即，CD3ζ或CD3z）傳訊結構域。在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域不包含初級細胞內傳訊結構域。與具有相同構建體但具有野生型初級細胞內傳訊結構域的CAR相比，減弱的初級細胞內傳訊結構域可誘導不超過約90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或更少中任一個的免疫效應子功能（如針對靶細胞的細胞溶解功能）。
在一些實施方式中，CAR的細胞內傳訊結構域包含一個或多個（如1、2、3個或更多個中的任一個）共刺激結構域。「共刺激結構域」可以是共刺激分子的細胞內部分。術語「共刺激分子」係指免疫細胞（如T細胞）上的同源結合配偶體，其與共刺激配位基特異性結合，從而介導免疫細胞的共刺激反應，如但不限於增殖和存活。共刺激分子係除抗原受體或其配位基以外的有助於高效免疫反應的細胞表面分子。共刺激分子可表示為以下蛋白質家族：TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整合素、傳訊淋巴細胞活化分子（SLAM蛋白）和活化性NK細胞受體。共刺激分子包括但不限於MHC I類分子、BTLA和Toll配位基受體、以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1（CD11a/CD18）、ICOS（CD278）和4-1BB（CD137）。此類共刺激分子的另外的實施例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM（LIGHTR）、SLAMF7、NKp80（KLRF1）、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TGFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1（CD226）、SLAMF4（CD244、2B4）、CD84、CD96（Tactile）、CEACAM1、CRTAM、Ly9（CD229）、CD160（BY55）、PSGL1、CDIOO（SEMA4D）、CD69、SLAMF6（NTB-A、Lyl08）、SLAM（SLAMF1、CD150、IPO-3）、BLAME（SLAMF8）、SELPLG（CD162）、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和特異性結合CD83的配位基。
在一些實施方式中，CAR包含單個共刺激結構域。在一些實施方式中，CAR包含兩個或更多個共刺激結構域。在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域包含功能性初級細胞內傳訊結構域和一個或多個共刺激結構域。在一些實施方式中，CAR不包含功能性初級細胞內傳訊結構域（如CD3ζ）。在一些實施方式中，CAR包含由一個或多個共刺激結構域組成或基本上由一個或多個共刺激結構域組成的細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，CAR包含由非功能性或減弱的初級細胞內傳訊結構域（如突變CD3ζ）和一個或多個共刺激結構域組成、或基本上由非功能性或減弱的初級細胞內傳訊結構域（如突變CD3ζ）和一個或多個共刺激結構域組成的細胞內傳訊結構域。在標靶結構域與腫瘤抗原結合後，CAR的共刺激結構域可轉導信號以增強具有CAR的工程化免疫細胞（如T細胞）的增殖、存活和分化，並抑制活化誘導的細胞死亡。在一些實施方式中，該一個或多個共刺激傳訊結構域衍生自選自由以下組成之群組的一個或多個分子：CD27、CD28、4-1BB（即CD137）、OX40、CD30、CD40、CD3、淋巴細胞功能相關抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特異性結合CD83的配位基。
在一些實施方式中，CAR的細胞內傳訊結構域包含衍生自CD28的共刺激傳訊結構域。在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域包含CD3ζ的胞內傳訊結構域和CD28的共刺激傳訊結構域。在一些實施方式中，本申請的嵌合受體中的細胞內傳訊結構域包含衍生自4-1BB（即CD137）的共刺激傳訊結構域。在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域包含CD3ζ的胞內傳訊結構域和4-1BB的共刺激傳訊結構域。
在一些實施方式中，CAR的細胞內傳訊結構域包含CD28的共刺激傳訊結構域和4-1BB的共刺激傳訊結構域。在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域包含CD3ζ的胞內傳訊結構域、CD28的共刺激傳訊結構域和4-1BB的共刺激傳訊結構域。在一些實施方式中，細胞內傳訊結構域包含多肽，該多肽從N-末端至C-末端包含：CD28的共刺激傳訊結構域、4-1BB的共刺激傳訊結構域和CD3ζ的胞內傳訊結構域。
在一些實施方式中，CAR的標靶結構域係抗體或抗體片段，如scFv、Fv、Fab、(Fab’)
2、單域抗體（sdAb）、或V
HH結構域。在一些實施方式中，CAR的標靶結構域係特異性結合腫瘤抗原的受體的配位基或細胞外部分。在一些實施方式中，CAR的一個或多個標靶結構域特異性結合單個腫瘤抗原。在一些實施方式中，CAR係具有結合兩種或更多種腫瘤抗原的標靶結構域的雙特異性或多特異性CAR。在一些實施方式中，腫瘤抗原選自由以下組成之群組：CD19、NKG2D、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR（如EGFRvIII）、GD2、HER2、IGF1R、間皮素、PSMA、ROR1、WT1、和具有臨床意義的其他腫瘤抗原、及其組合。在一些實施方式中，CAR特異性結合選自由以下組成之群組的靶抗原：BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、AFP、CD4、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD70、CD123、CEA、EGFR（如EGFRvIII）、GD2、GPC-2、GPC3、CLDN18.2、HER2、LILRB4、IL-13Rα2、IGF1R、間皮素、PSMA、ROR1、WT1、NKG2D、CLL1、TGFaRII、TGFbRII、CCR5、CXCR4、CCR4、HPV相關抗原和EBV相關抗原（例如，LMP1或LMP2）。
在一些實施方式中，CAR係抗CD19 CAR。多種抗原結合結構域序列可用作CAR的標靶結構域。參見例如，WO 2012/079000，將該文獻以其全文併入本文。在一些實施方式中，抗CD19 CAR從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，抗CD19 scFv包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗CD19 CAR包含與SEQ ID NO: 2具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗CD19 CAR包含SEQ ID NO: 2。
在一些實施方式中，抗CD19 CAR係CAR系統（例如，CAR融合構建體）的一部分，其中CAR融合構建體包含抗CD19 CAR分子和抗CD20 TLR多肽。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分）。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自包含與SEQ ID NO: 40具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自包含SEQ ID NO: 40。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 1具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 1。
在一些實施方式中，抗CD19 CAR係CAR系統（例如，CAR融合構建體）的一部分，其中CAR融合構建體包含抗CD19 CAR分子和抗NKG2D TLR多肽。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分）。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自包含與SEQ ID NO: 40具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自包含SEQ ID NO: 40。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 59具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 59。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 60具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 60。
在一些實施方式中，CAR係抗CLL1 CAR。多種抗原結合結構域序列可用作CAR的標靶結構域。參見例如，WO 2012/079000，將該文獻以其全文併入本文。在一些實施方式中，抗CLL1 CAR從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CLL1 sdAb、CD28α鉸鏈結構域、CD28α跨膜（TM）結構域、CD28共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，抗CLL1 sdAb包含SEQ ID NO: 14的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗CLL1 CAR包含與SEQ ID NO: 4具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗CLL1 CAR包含SEQ ID NO: 4。
在一些實施方式中，CAR係抗CLL1/CD33雙CAR。多種抗原結合結構域序列可用作CAR的標靶結構域。參見例如，WO 2012/079000，將該文獻以其全文併入本文。在一些實施方式中，抗CLL1/CD33雙CAR從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CLL1 sdAb、抗CD33 V結構域sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，抗CLL1 sdAb包含SEQ ID NO: 14的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗CD33 V結構域sdAb包含SEQ ID NO: 21的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗CLL1/CD33雙CAR包含與SEQ ID NO: 43具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗CLL1/CD33雙CAR包含SEQ ID NO: 43。
在一些實施方式中，抗CLL1 CAR係CAR系統（例如，CAR融合構建體）的一部分，其中CAR融合構建體包含抗CLL1 CAR和抗CD33 TLR多肽。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜結構域和TLR4傳訊結構域（例如，TLR4的胞內部分）。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自包含與SEQ ID NO: 40具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，第一多肽和第二多肽各自包含SEQ ID NO: 40。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CLL1 sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 71具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 71。
在一些實施方式中，抗CLL1 CAR係CAR系統（例如，CAR融合構建體）的一部分，其中CAR融合構建體包含抗CLL1 CAR和抗CD33（例如，抗CD33 V結構域和/或抗CD33 C2結構域）TLR多肽。在一些實施方式中，第一多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD33 V結構域sdAb、TLR2跨膜結構域和TLR2傳訊結構域（例如，TLR2的胞內部分），並且第二多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD33 C2結構域sdAb、TLR1跨膜結構域和TLR1傳訊結構域（例如，TLR1的胞內部分）。在一些實施方式中，第一多肽包含與SEQ ID NO: 41具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，第一多肽包含SEQ ID NO: 41。在一些實施方式中，第二多肽包含與SEQ ID NO: 42具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，第二多肽包含SEQ ID NO: 42。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CLL1 sdAb、CD28α鉸鏈結構域、CD28α跨膜（TM）結構域、CD28共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗CD33 V結構域sdAb、TLR2跨膜結構域、TLR2傳訊結構域（例如，TLR2的胞內部分）、P2A切割位點、訊息肽、抗CD33 C2結構域sdAb、TLR1跨膜結構域和TLR1傳訊結構域（例如，TLR1的胞內部分）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 3具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，CAR係抗GPC3 CAR。多種抗原結合結構域序列可用作CAR的標靶結構域。參見例如，WO 2012/079000，將該文獻以其全文併入本文。在一些實施方式中，抗GPC3 CAR從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPC3 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，抗GPC3 scFv包含SEQ ID NO: 55的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗GPC3 CAR包含與SEQ ID NO: 56具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，抗GPC3 CAR包含SEQ ID NO: 56。
在一些實施方式中，抗GPC3 CAR係CAR系統（例如，CAR融合構建體）的一部分，其中CAR融合構建體包含抗GPC3 CAR和抗NKG2D TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPC3 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 57具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 57。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPC3 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 58具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 58。
在一些實施方式中，CAR係抗BCMA CAR（例如，單個抗BCMA CAR或串聯抗BCMA CAR）。在一些實施方式中，抗BCMA CAR係單個抗BCMA CAR。在一些實施方式中，抗BCMA CAR係串聯抗BCMA CAR。多種抗原結合結構域序列可用作CAR的標靶結構域。參見例如，WO 2012/079000，將該文獻以其全文併入本文。在一些實施方式中，單個抗BCMA CAR從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，單個抗BCMA sdAb包含SEQ ID NO: 68的胺基酸序列。在一些實施方式中，單個抗BCMA CAR包含與SEQ ID NO: 67具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，單個抗BCMA CAR包含SEQ ID NO: 67。在一些實施方式中，串聯抗BCMA CAR從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域。在一些實施方式中，串聯抗BCMA sdAb包含SEQ ID NO: 44的胺基酸序列。在一些實施方式中，串聯抗BCMA CAR包含與SEQ ID NO: 66具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，串聯抗BCMA CAR包含SEQ ID NO: 66。
在一些實施方式中，抗BCMA CAR係CAR系統（例如，CAR融合構建體）的一部分，其中CAR融合構建體包含抗BCMA CAR（例如，單個抗BCMA CAR或串聯抗BCMA CAR）和抗BCMA TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、單個抗BCMA sdAb、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 62具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 62。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 63具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 63。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD28α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 64具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 64。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 61具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 61。
在一些實施方式中，抗BCMA CAR係CAR系統（例如，CAR融合構建體）的一部分，其中CAR融合構建體包含抗BCMA CAR（例如，單個抗BCMA CAR或串聯抗BCMA CAR）和抗GPRC5D TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 65具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 65。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗GPRC5D scFv、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 72具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 72。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗GPRC5D scFv、CD28α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 73具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 73。
在一些實施方式中，CAR的跨膜結構域包含選自以下的跨膜結構域：T細胞受體的α、β或ζ鏈，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154，KIRDS2，OX40，CD2，CD27，LFA-1（CD11a、CD18），ICOS（CD278），4-1BB（CD137），GITR，CD40，BAFFR，HVEM（LIGHTR），SLAMF7，NKp80（KLRFl），CD160，CD19，IL-2Rβ，IL-2Rγ，IL-7R a，ITGA1，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TGFR2，DNAM1（CD226），SLAMF4（CD244、2B4），CD84，CD96（觸覺），CEACAM1，CRT AM，Ly9（CD229），CD160（BY55），PSGL1，CDIOO（SEMA4D），SLAMF6（NTB-A、Lyl08），SLAM（SLAMF1、CD150、IPO-3），BLAME（SLAMF8），SELPLG（CD162），LTBR，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46，NKG2D和/或NKG2C的跨膜結構域。在一些實施方式中，CAR的跨膜結構域係CD4、CD3、CD8α或CD28跨膜結構域。在一些實施方式中，CAR的跨膜結構域包含CD8α的跨膜結構域。
在一些實施方式中，細胞外結構域藉由鉸鏈區與跨膜結構域連接。在一個實施方式中，鉸鏈區包含CD8α的鉸鏈區。
在一些實施方式中，CAR包含訊息肽，如CD8αSP。
在一些實施方式中，工程化受體係經修飾的T細胞受體。在一些實施方式中，工程化TCR對腫瘤抗原有特異性。在一些實施方式中，腫瘤抗原選自由以下組成之群組：CD19、CLL1、GPC3、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR（如EGFRvIII）、GD2、HER2、IGF1R、間皮素、PSMA、ROR1、WT1和具有臨床意義的其他腫瘤抗原。在一些實施方式中，腫瘤抗原衍生自腫瘤細胞的細胞內蛋白質。已經描述了許多對腫瘤抗原（包括腫瘤相關抗原）有特異性的TCR，包括例如NY-ESO-1癌-睾丸抗原，p53腫瘤抑制抗原，針對黑素瘤（例如，MARTI、gp 100）、白血病（例如，WT1、次要組織相容性抗原）和乳腺癌（例如，HER2、NY-BR1）中腫瘤抗原的TCR。本領域已知的任何TCR可用於本申請。在一些實施方式中，TCR對腫瘤抗原具有增強的親和力。例如在US 5830755和Kessels等人 Immunotherapy through TCR gene transfer.
Nat. Immunol.2, 957-961 (2001) 中描述了示例性TCR和用於將該等TCR引入免疫細胞中之方法。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞係TCR-T細胞。
TCR受體複合體係由可變TCR受體α和β鏈（在γδ T細胞情況下為γ和δ鏈）與三個二聚體傳訊模組CD3δ/ε、CD3γ/ε和CD247（T細胞表面糖蛋白CD3ζ鏈）ζ/ζ或ζ/η形成的八聚體複合體。每個亞基的跨膜結構域中的可電離殘基形成將複合體保持在一起的相互作用的極性網路。TCR複合體具有活化T細胞中傳訊級聯的功能。
在一些實施方式中，工程化受體係包含一種或多種T細胞受體（TCR）融合蛋白（TFP）的工程化TCR。例如在US 20170166622 A1中描述了示例性TFP，該文獻藉由援引併入本文。在一些實施方式中，TFP包含TCR亞基的細胞外結構域，該TCR亞基包含選自由以下組成之群組的蛋白質的細胞外結構域或其部分：TCRα鏈、TCRβ鏈、CD3εTCR亞基、CD3γTCR亞基、CD3δTCR亞基、其功能性片段及其具有至少一個但不超過20個修飾的胺基酸序列。在一些實施方式中，TFP包含跨膜結構域，該跨膜結構域包含選自由以下組成之群組的蛋白質的跨膜結構域：TCRα鏈、TCRβ鏈、CD3εTCR亞基、CD3γTCR亞基、CD3δTCR亞基、其功能性片段及其具有至少一個但不超過20個修飾的胺基酸序列。在一些實施方式中，TFP包含跨膜結構域，該跨膜結構域包含選自由以下組成之群組的蛋白質的跨膜結構域：TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRζ鏈、CD3εTCR亞基、CD3γTCR亞基、CD3δTCR亞基、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其功能性片段、及其具有至少一個但不超過20個修飾的胺基酸序列。
在一些實施方式中，TFP包含TCR亞基和抗原結合結構域，該TCR亞基包含TCR細胞外結構域的至少一部分和含有來自CD3ε的細胞內傳訊結構域的刺激結構域的TCR細胞內結構域；其中該TCR亞基與該抗原結合結構域可操作地連接，並且其中當在T細胞中表現時，將該TFP摻入TCR中。
在一些實施方式中，TFP包含TCR亞基和抗原結合結構域，該TCR亞基包含TCR細胞外結構域的至少一部分和含有來自CD3γ的細胞內傳訊結構域的刺激結構域的TCR細胞內結構域；其中該TCR亞基與該抗原結合結構域可操作地連接，並且其中當在T細胞中表現時，將該TFP摻入TCR中。
在一些實施方式中，TFP包含TCR亞基和抗原結合結構域，該TCR亞基包含TCR細胞外結構域的至少一部分和含有來自CD3δ的細胞內傳訊結構域的刺激結構域的TCR細胞內結構域；其中該TCR亞基與該抗原結合結構域可操作地連接，並且其中當在T細胞中表現時，將該TFP摻入TCR中。
在一些實施方式中，TFP包含TCR亞基和抗原結合結構域，該TCR亞基包含TCR細胞外結構域的至少一部分和含有來自TCRα的細胞內傳訊結構域的刺激結構域的TCR細胞內結構域；其中該TCR亞基與該抗原結合結構域可操作地連接，並且其中當在T細胞中表現時，將該TFP摻入TCR中。
在一些實施方式中，TFP包含TCR亞基和抗原結合結構域，該TCR亞基包含TCR細胞外結構域的至少一部分和含有來自TCRβ的細胞內傳訊結構域的刺激結構域的TCR細胞內結構域；其中該TCR亞基與該抗原結合結構域可操作地連接，並且其中當在T細胞中表現時，將該TFP摻入TCR中。
在一些實施方式中，工程化受體係T細胞抗原偶聯劑（TAC）受體。例如在US 20160368964 A1中描述了示例性TAC受體，該文獻藉由援引併入本文。在一些實施方式中，TAC包含標靶結構域、特異性結合與TCR複合體相關的蛋白質的TCR結合結構域和T細胞受體傳訊結構域。在一些實施方式中，標靶結構域係特異性結合腫瘤抗原的抗體片段，如scFv或V
HH。在一些實施方式中，標靶結構域係設計的錨蛋白重複序列（DARPin）多肽。在一些實施方式中，腫瘤抗原選自由以下組成之群組：CD19、GPC3、CLL1、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR（如EGFRvIII）、GD2、HER2、IGF1R、間皮素、PSMA、ROR1、WT1和具有臨床意義的其他腫瘤抗原。在一些實施方式中，與TCR複合體相關的蛋白質係CD3，如CD3ε。在一些實施方式中，TCR結合結構域係單鏈抗體，如scFv或V
HH。在一些實施方式中，TCR結合結構域衍生自UCHT1。在一些實施方式中，TAC受體包含胞質結構域和跨膜結構域。在一些實施方式中，T細胞受體傳訊結構域包含衍生自TCR共受體的胞質結構域。示例性TCR共受體包括但不限於CD4、CD8、CD28、CD45、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在一些實施方式中，TAC受體包含跨膜結構域和衍生自CD4的胞質結構域。在一些實施方式中，TAC受體包含跨膜結構域和衍生自CD8（如CD8α）的胞質結構域。
T細胞共受體在T細胞上表現為膜蛋白。它們可以提供TCR:肽: MHC複合物的穩定性並促進訊息傳導。T細胞共受體的兩種亞型CD4和CD8對特定MHC類型表現出強特異性。CD4共受體僅可以穩定TCR: MHC II複合物，而CD8共受體僅可以穩定TCR: MHC I複合物。CD4和CD8在不同T細胞類型上的差異表現導致不同的T細胞功能亞群。CD8+T細胞係細胞毒性T細胞。
CD4係在免疫細胞（如輔助性T細胞、單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞）的表面上表現的糖蛋白。CD4具有暴露於細胞外細胞表面的四個免疫球蛋白結構域（D
1至D
4）。CD4在其短胞內/細胞內尾上含有特定的胺基酸序列，其允許CD4尾募集酪胺酸激酶Lck並與該酪胺酸激酶Lck相互作用。當TCR複合體和CD4各自結合MHC II分子的不同區域時，TCR複合體與CD4之間的緊密接近允許與CD4的胞內尾結合的Lck對CD3的胞內結構域上的免疫受體酪胺酸活化模體（ITAM）進行酪胺酸磷酸化，從而擴增TCR產生的信號。
CD8係由兩條α鏈組成的同源二聚體（較不常見）或由一條α鏈和一條β鏈組成的異源二聚體（較常見）的糖蛋白，它們各自包含藉由細柄（thin stalk）與膜連接的免疫球蛋白可變（IgV）樣細胞外結構域和細胞內尾。CD8主要在細胞毒性T細胞的表面上表現，但也可以在自然殺傷細胞、皮質胸腺細胞和樹突狀細胞上發現。CD8胞內尾與Lck相互作用，一旦TCR結合其特異性抗原就會使TCR複合體的胞內CD3和ζ鏈磷酸化。胞內CD3和ζ鏈上的酪胺酸磷酸化引發磷酸化級聯，最終導致基因轉錄。
在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞表現多於一種工程化受體，如CAR、TCR、TAC受體的任何組合。
在一些實施方式中，由經修飾的免疫細胞表現的工程化受體（如CAR、TCR或TAC）標靶一種或多種腫瘤抗原。腫瘤抗原係由可引發免疫反應、特別是T細胞介導的免疫反應的腫瘤細胞產生的蛋白質。本揭露之標靶抗原的選擇將取決於待治療的癌症的特定類型。示例性腫瘤抗原包括例如神經膠質瘤相關抗原、癌胚抗原（CEA）、β-人絨毛膜促性腺激素、甲型胎兒蛋白（AFP）、凝集素反應性AFP、甲狀腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2（AS）、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特異性抗原（PSA）、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、CLL1、BCMA、GPC3、CD19、前列腺素、PSMA、HER2/neu、存活蛋白和端粒酶、前列腺癌腫瘤抗原-1（PCTA-1）、MAGE、ELF2M、中性粒細胞彈性蛋白酶、肝配蛋白B2（ephrinB2）、CD22、胰島素生長因子（IGF）-I、IGF-II、IGF-I受體和間皮素。
在一些實施方式中，腫瘤抗原包含與惡性腫瘤相關的一個或多個抗原癌症表位。惡性腫瘤表現許多可用作免疫攻擊的靶抗原的蛋白質。該等分子包括但不限於組織特異性抗原，如黑素瘤中的MART-1、酪胺酸酶和gp100以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶（PAP）和前列腺特異性抗原（PSA）。其他靶分子屬於轉化相關分子組，如癌基因HER2/Neu/ErbB-2。另一組靶抗原係癌胚胎抗原，如癌胚抗原（CEA）。在B細胞淋巴瘤中，腫瘤特異性獨特型免疫球蛋白構成個體腫瘤所特有的真正的腫瘤特異性免疫球蛋白抗原。B細胞分化抗原（如CD19、CD20和CD37）係B細胞淋巴瘤中靶抗原的其他候選物。
在一些實施方式中，腫瘤抗原係腫瘤特異性抗原（TSA）或腫瘤相關抗原（TAA）。TSA係腫瘤細胞所特有的，並且不存在於體內的其他細胞上。TAA相關抗原不是腫瘤細胞所特有的，相反，它也可以在不能誘導對抗原的免疫耐受狀態的條件下在正常細胞上表現。抗原在腫瘤上的表現可以在使免疫系統能夠對抗原作出反應的條件下發生。TAA可能是在胚胎發育期間在正常細胞上表現的抗原，此時免疫系統不成熟且不能作出反應，或者它們可能是在正常細胞上通常以極低的水平存在但在腫瘤細胞上以高得多的水平表現的抗原。
TSA或TAA抗原的非限制性實例包括以下：分化抗原，如MART-1/MelanA（MART-I）、gp 100（Pmel 17）、酪胺酸酶、TRP-1、TRP-2和腫瘤特異性多譜系抗原，如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5；過表現的胚胎抗原，如CEA；過表現的癌基因和突變的腫瘤抑制基因，如p53、Ras、HER2/neu；由染色體易位產生的獨特腫瘤抗原，如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，如艾伯斯坦-巴爾病毒抗原EBVA及人乳頭瘤病毒（HPV）抗原E6和E7。其他基於蛋白質的大抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-連環蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲型胎兒蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2結合蛋白\親環素C相關蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
核酸
本文所述之經修飾的免疫細胞包含編碼本文所述之TLR多肽（例如，第一多肽和/或第二多肽）和/或工程化受體中任一種的一個或多個異源核酸序列。
在一些實施方式中，提供了分離的核酸，其包含編碼本文所述之多肽（例如，TLR多肽）中任一種的核酸序列。在一些實施方式中，提供了分離的核酸，其包含編碼本文所述之工程化受體中任一種的核酸序列。在一些實施方式中，核酸係DNA。在一些實施方式中，核酸係RNA。在一些實施方式中，核酸係線性的。在一些實施方式中，核酸係環狀的。
編碼第一多肽、第二多肽的核酸序列和/或編碼工程化受體的核酸可以可操作地連接至一個或多個調節序列。控制編碼序列的轉錄和/或翻譯的示例性調節序列係本領域已知的，並且可以包括但不限於啟動子；用於轉錄的適當起始、調節和/或終止（例如，聚A轉錄終止序列），mRNA轉運（例如，核定位元訊息序列）、加工（例如，剪接信號）、穩定性（例如，內含子和非編碼5'和3'序列）、翻譯（例如，起始Met、三聯體前導序列、IRES核糖體結合位點、訊息肽等）的另外的元件；以及用於將插入物引入病毒載體中的插入位點。在一些實施方式中，調節序列係啟動子、轉錄增強子和/或允許TLR多肽和/或工程化受體正確表現的序列。
術語「調節序列」或「控制序列」係指影響與其可操作地連接的編碼序列的表現的DNA序列。此類調節序列的性質根據宿主生物體而不同。在原核生物中，調節序列通常包括啟動子、核糖體結合位點和終止子。在真核生物中，調節序列包括啟動子、終止子和在一些情況下的增強子、反式活化因子或轉錄因子。
術語「可操作地連接」係指其中該組分處於允許它們以其預期方式起作用的關係中的並置。與編碼序列「可操作地連接」的調節序列以這樣的方式連接，使得編碼序列的表現在與調節序列相容的條件下完成。
如本文所用，「啟動子」或「啟動子區」係指控制與其可操作地連接的DNA或RNA的轉錄的DNA或RNA區段。啟動子區包括涉及RNA聚合酶識別、結合和轉錄起始的特定序列。此外，啟動子包括調節RNA聚合酶的識別、結合和轉錄起始活性（即，一種或多種轉錄因子的結合）的序列。該等序列可以是順式作用的，或可以對反式作用因子有反應。根據調節的性質，啟動子可以是組成型啟動子或調節型啟動子。調節型啟動子可以是誘導型或對環境有反應的（例如，對如pH、厭氧條件、滲壓劑、溫度、光或細胞密度等誘因有反應）。許多這樣的啟動子序列係本領域已知的。參見例如，美國專利號4,980,285；5,631,150；5,707,928；5,759,828；5,888,783；5,919,670和Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Press (1989)。
在一些實施方式中，編碼第一多肽的核酸序列可操作地連接至第一啟動子。在一些實施方式中，編碼第二多肽的核酸序列可操作地連接至第二啟動子。在一些實施方式中，第一多肽與第二多肽相同，並且第一核酸同時編碼第一多肽和第二多肽。在一些實施方式中，編碼第一多肽的核酸序列和編碼第二多肽的核酸序列可操作地連接至同一啟動子。在一些實施方式中，編碼第一多肽的核酸序列和編碼第二多肽的核酸序列可操作地連接至分開的啟動子。
在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含編碼工程化受體的第三核酸。在一些實施方式中，第一核酸和第三核酸可操作地連接至同一啟動子。在一些實施方式中，第一核酸和第三核酸可操作地連接至分開的啟動子。在一些實施方式中，第二核酸和第三核酸可操作地連接至同一啟動子。在一些實施方式中，第二核酸和第三核酸可操作地連接至分開的啟動子。在一些實施方式中，第一核酸、第二核酸和第三核酸可操作地連接至同一啟動子。在一些實施方式中，第一核酸、第二核酸和第三核酸可操作地連接至分開的啟動子。
在一些實施方式中，啟動子係內源啟動子。例如，可以使用本領域已知的任何方法（如CRISPR/Cas9方法），將編碼第一多肽、第二多肽和/或工程化受體的核酸敲入內源啟動子下游的經修飾的免疫細胞的基因組中。在一些實施方式中，內源啟動子係豐度蛋白如β-肌動蛋白的啟動子。在一些實施方式中，內源啟動子係誘導型啟動子，例如，可由經修飾的免疫細胞的內源活化信號誘導。在一些實施方式中，其中經修飾的免疫細胞係T細胞，啟動子係T細胞活化依賴性啟動子（如IL-2啟動子、NFAT啟動子或NFκB啟動子）。在一些實施方式中，啟動子係異源啟動子。
已經探索了各種啟動子以在哺乳動物細胞中進行基因表現，並且本領域已知的任何啟動子都可以用於本申請。啟動子可以大致分為組成型啟動子或調節型啟動子，如誘導型啟動子。在一些實施方式中，編碼第一多肽、第二多肽和/或工程化受體的異源核酸序列可操作地連接至組成型啟動子。在一些實施方式中，編碼第一多肽、第二多肽和/或工程化受體的異源核酸序列可操作地連接至誘導型啟動子。在一些實施方式中，第一組成型啟動子可操作地連接至編碼第一多肽的核酸序列，第二組成型啟動子可操作地連接至編碼第二多肽的核酸序列，並且誘導型啟動子可操作地連接至編碼工程化受體的核酸序列。在一些實施方式中，第一組成型啟動子可操作地連接至編碼第一多肽的核酸序列，第二組成型啟動子可操作地連接至編碼第二多肽的核酸序列，並且第三組成型啟動子可操作地連接至編碼工程化受體的核酸序列。在一些實施方式中，第一組成型啟動子可操作地連接至編碼第一多肽的核酸序列，第二組成型啟動子可操作地連接至編碼第二多肽的核酸序列，並且誘導型啟動子可操作地連接至編碼工程化受體的核酸序列。在一些實施方式中，第一組成型啟動子可操作地連接至編碼第一多肽的核酸序列，第二組成型啟動子可操作地連接至編碼工程化受體的核酸序列，並且誘導型啟動子可操作地連接至編碼第二多肽的核酸序列。在一些實施方式中，第一組成型啟動子可操作地連接至編碼第二多肽的核酸序列，第二組成型啟動子可操作地連接至編碼工程化受體的核酸序列，並且誘導型啟動子可操作地連接至編碼第一多肽的核酸序列。在一些實施方式中，第一組成型啟動子可操作地連接至編碼第一多肽的核酸序列，第一誘導型啟動子可操作地連接至編碼工程化受體的核酸序列，並且第二誘導型啟動子可操作地連接至編碼第二多肽的核酸序列。在一些實施方式中，第一組成型啟動子可操作地連接至編碼第二多肽的核酸序列，第一誘導型啟動子可操作地連接至編碼工程化受體的核酸序列，並且第二誘導型啟動子可操作地連接至編碼第一多肽的核酸序列。在一些實施方式中，第一組成型啟動子可操作地連接至編碼工程化受體的核酸序列，第一誘導型啟動子可操作地連接至編碼第二多肽的核酸序列，並且第二誘導型啟動子可操作地連接至編碼第一多肽的核酸序列。
在一些實施方式中，第一誘導型啟動子可操作地連接至編碼第一多肽的核酸序列，第二誘導型啟動子可操作地連接至編碼第二多肽的核酸序列，並且第三誘導型啟動子可操作地連接至編碼工程化受體的核酸序列。在一些實施方式中，第一誘導型啟動子可操作地連接至編碼第一多肽的核酸序列，第二誘導型啟動子可操作地連接至編碼第二多肽的核酸序列，並且組成型啟動子可操作地連接至編碼工程化受體的核酸序列。在一些實施方式中，第一誘導型啟動子可操作地連接至編碼第一多肽的核酸序列，第二誘導型啟動子可操作地連接至編碼工程化受體的核酸序列，並且組成型啟動子可操作地連接至編碼第二多肽的核酸序列。在一些實施方式中，第一誘導型啟動子可操作地連接至編碼第二多肽的核酸序列，第二誘導型啟動子可操作地連接至編碼工程化受體的核酸序列，並且組成型啟動子可操作地連接至編碼第一多肽的核酸序列。在一些實施方式中，第一誘導型啟動子可操作地連接至編碼第一多肽的核酸序列，第一組成型啟動子可操作地連接至編碼工程化受體的核酸序列，並且第二組成型啟動子可操作地連接至編碼第二多肽的核酸序列。在一些實施方式中，第一誘導型啟動子可操作地連接至編碼第二多肽的核酸序列，第一組成型啟動子可操作地連接至編碼工程化受體的核酸序列，並且第二組成型啟動子可操作地連接至編碼第一多肽的核酸序列。在一些實施方式中，第一誘導型啟動子可操作地連接至編碼工程化受體的核酸序列，第一組成型啟動子可操作地連接至編碼第二多肽的核酸序列，並且第二組成型啟動子可操作地連接至編碼第一多肽的核酸序列。
在一些實施方式中，第一誘導型啟動子可由第一誘導條件誘導，第二誘導型啟動子可由第二誘導條件誘導，並且第三誘導型啟動子可由第三誘導條件誘導。在一些實施方式中，第一誘導條件與第二誘導條件相同。在一些實施方式中，第一誘導條件與第三誘導條件相同。在一些實施方式中，第二誘導條件與第三誘導條件相同。在一些實施方式中，第一誘導條件、第二誘導條件和第三誘導條件都相同。在一些實施方式中，同時誘導第一誘導型啟動子和第二誘導型啟動子。在一些實施方式中，同時誘導第一誘導型啟動子和第三誘導型啟動子。在一些實施方式中，同時誘導第二誘導型啟動子和第三誘導型啟動子。在一些實施方式中，同時誘導第一誘導型啟動子、第二誘導型啟動子和第三誘導型啟動子。在一些實施方式中，順序誘導第一誘導型啟動子、第二誘導型啟動子和第三誘導型啟動子，例如，在第二誘導型啟動子之前誘導第一誘導型啟動子並且在第三誘導型啟動子之前誘導第二誘導型啟動子，在第二誘導型啟動子之後誘導第一誘導型啟動子並且在第三誘導型啟動子之前誘導第二誘導型啟動子，或者在第二誘導型啟動子之後誘導第一誘導型啟動子並且在第三誘導型啟動子之後誘導第二誘導型啟動子。
組成型啟動子允許異源基因（也稱為轉基因）在宿主細胞中組成性地表現。本文考慮的示例性組成型啟動子包括但不限於巨細胞病毒（CMV）啟動子、人延伸因子-1α（hEF1α）、泛素C啟動子（UbiC）、磷酸甘油激酶啟動子（PGK）、猿猴病毒40早期啟動子（SV40）以及與CMV早期增強子偶聯的雞β-肌動蛋白啟動子（CAGG）。在許多研究中，已經廣泛地比較了此類組成型啟動子對驅動轉基因表現的效率。在一些實施方式中，啟動子係hEF1α啟動子。
在一些實施方式中，啟動子係誘導型啟動子。誘導型啟動子屬於調節型啟動子的類別。誘導型啟動子可以由一種或多種條件誘導，如物理條件、經修飾的免疫細胞的微環境或經修飾的免疫細胞的生理狀態、誘導物（即，誘導劑）或其組合。在一些實施方式中，誘導條件不誘導經修飾的免疫細胞和/或接受藥物組成物的受試者中內源基因的表現。在一些實施方式中，誘導條件選自由以下組成之群組：誘導物、輻射（如電離輻射、光）、溫度（如熱）、氧化還原狀態、腫瘤環境和經修飾的免疫細胞的活化狀態。
在一些實施方式中，啟動子可由誘導物誘導。在一些實施方式中，誘導物係小分子，如化學化合物。在一些實施方式中，小分子選自由強力黴素、四環素、醇、金屬或類固醇組成之群組。化學誘導的啟動子得到了最廣泛的探索。這樣的啟動子包括其轉錄活性受存在或不存在小分子化學物質（如強力黴素、四環素、醇、類固醇、金屬和其他化合物）調節的啟動子。具有反向四環素控制的反式活化因子（rtTA）和四環素反應元件啟動子（TRE）的強力黴素誘導型系統係目前最成熟的系統。WO 9429442描述了四環素反應啟動子對真核細胞中基因表現的嚴格控制。WO 9601313揭露了四環素調節的轉錄調節劑。另外，例如在TetSystems.com的網站上描述了Tet技術（如Tet-開系統）。任何已知的化學調節的啟動子可用於驅動本申請的治療蛋白的表現。
在一些實施方式中，誘導物係多肽，如生長因子、激素或細胞表面受體的配位基，例如特異性結合腫瘤抗原的多肽。在一些實施方式中，該多肽由經修飾的免疫細胞表現。在一些實施方式中，該多肽由異源核酸中的核酸編碼。許多多肽誘導物也是本領域已知的，並且它們可以適用於本申請。例如，基於蛻皮激素受體的基因開關、基於孕酮受體的基因開關和基於雌激素受體的基因開關屬於使用類固醇受體衍生的反式活化因子的基因開關（WO 9637609和WO 9738117等）。
在一些實施方式中，誘導物同時包含小分子組分和一種或多種多肽。例如，依賴於多肽二聚化的誘導型啟動子係本領域已知的，並且可以適用於本申請。1993年開發的第一個小分子CID系統使用FK1012（藥物FK506的衍生物）誘導FKBP的同源二聚化。藉由使用類似的策略，Wu等人藉由使用Rapalog/FKPB-FRB*和赤黴素（Gibberelline）/GID1-GAI二聚化依賴性基因開關成功地使CAR-T細胞可藉由打開開關（ON-switch）方式滴定（C.-Y. Wu等人, Science 350, aab4077 (2015)）。其他二聚化依賴性開關系統包括香豆黴素/GyrB-GyrB（Nature 383 (6596): 178-81）和HaXS/Snap-tag-HaloTag（Chemistry and Biology 20 (4): 549-57）。
在一些實施方式中，啟動子係光誘導型啟動子，並且誘導條件係光。用於在哺乳動物細胞中調節基因表現的光誘導型啟動子也是本領域熟知的（參見例如，Science 332, 1565-1568 (2011); Nat. Methods 9, 266-269 (2012); Nature 500: 472-476 (2013); Nature Neuroscience 18:1202-1212 (2015)）。基於這樣的基因調節系統對 (1) DNA結合或 (2) 轉錄活化結構域募集到DNA結合蛋白的調節，這樣的基因調節系統可大致分為兩類。例如，在哺乳動物細胞中開發並測試了基於視黑蛋白的合成哺乳動物藍光控制轉錄系統，該系統反應於藍光（480 nm）而觸發細胞內鈣增加，從而導致鈣調磷酸酶介導的NFAT動員。最近，Motta-Mena等人描述了從天然存在的EL222轉錄因子開發的新的誘導型基因表現系統，該系統在人細胞系和斑馬魚胚胎中賦予對轉錄起始的高水平且藍光敏感性控制（Nat. Chem. Biol. 10(3):196-202 (2014)）。另外，利用紅光誘導的阿拉伯芥（
Arabidopsis thaliana）的光感受器光敏色素B（PhyB）和光敏色素相互作用因子6（PIF6）的相互作用進行紅光觸發的基因表現調節。此外，還開發了紫外線B（UVB）誘導型基因表現系統並證明其在哺乳動物細胞中的靶基因轉錄中是有效的（Gene and Cell Therapy: Therapeutic Mechanisms and Strategies, 第25章, 第四版, CRC Press, 2015年1月20日）。本文所述之任何光誘導型啟動子可以用於驅動本申請的治療蛋白的表現。
在一些實施方式中，啟動子係由光誘導型分子和光的組合誘導的光誘導型啟動子。例如，化學誘導物上的可光切割的光籠化基團（photocaged group）保持誘導物無活性，除非藉由輻射或其他方式去除該光籠化基團。這樣的光誘導型分子包括小分子化合物、寡核苷酸和蛋白質。例如，已經開發了籠化蛻皮素、與lac操縱子一起使用的籠化IPTG、用於核酶介導的基因表現的籠化豐加黴素、與Tet-開系統一起使用的籠化強力黴素以及用於光介導的FKBP/FRB二聚化的籠化Rapalog（參見例如，Curr Opin Chem Biol. 16(3-4): 292-299 (2012)）。
在一些實施方式中，啟動子係輻射誘導型啟動子，並且誘導條件係輻射，如電離輻射。輻射誘導型啟動子也是本領域已知的，用以控制轉基因表現。輻射細胞後發生基因表現的改變。例如，一組稱為「立即早期基因（immediate early gene）」的基因可在電離輻射後迅速反應。示例性立即早期基因包括但不限於Erg-1、p21/WAF-1、GADD45α、t-PA、c-Fos、c-Jun、NF-κB和AP1。立即早期基因在其啟動子區包含輻射反應序列。共有序列CC(A/T)
6GG已在Erg-1啟動子中發現，並且被稱為血清反應元件或被稱為CArG元件。已經深入研究了輻射誘導型啟動子和轉基因的組合，並證明其具有高效的治療益處。參見例如，Cancer Biol Ther. 6(7):1005-12 (2007)和Gene and Cell Therapy: Therapeutic Mechanisms and Strategies, 第25章, 第四版, CRC Press, 2015年1月20日。
在一些實施方式中，啟動子係熱誘導型啟動子，並且誘導條件係熱。本領域還廣泛研究了驅動轉基因表現的熱誘導型啟動子。包括Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40、Hsp10等在內的熱休克或應激蛋白（HSP）在熱或其他物理和化學應激下在保護細胞方面起著重要作用。已經在臨床前研究中嘗試了幾種熱誘導型啟動子，包括熱休克蛋白（HSP）啟動子以及生長停滯和DNA損傷（GADD）153啟動子。1985年首次描述的人
hsp70B基因的啟動子似乎係最高效的熱誘導型啟動子之一。Huang等人報告，在引入
hsp70B-EGFP、
hsp70B-TNFα和
hsp70B-IL12編碼序列後，腫瘤細胞在熱處理後表現極高的轉基因表現，而在沒有熱處理的情況下，未檢測到轉基因的表現。在IL12轉基因加熱處理的小鼠組中，體內腫瘤生長顯著延遲（Cancer Res. 60:3435 (2000)）。另一組科學家將
HSV-tk自殺基因與hsp70B啟動子連接，並在攜帶小鼠乳腺癌的裸鼠中測試該系統。與未進行熱處理的對照相比，向其腫瘤投與了
hsp70B-HSVtk編碼序列並進行了熱處理的小鼠顯示出腫瘤消退和顯著的存活率（Hum. Gene Ther.[人類基因療法] 11:2453 (2000)）。本領域已知的另外的熱誘導型啟動子可以在例如Gene and Cell Therapy: Therapeutic Mechanisms and Strategies, 第25章, 第四版, CRC Press, 2015年1月20日中找到。本文討論的任何熱誘導型啟動子可以用於驅動本申請的治療蛋白的表現。
在一些實施方式中，啟動子可由氧化還原狀態誘導。可由氧化還原狀態誘導的示例性啟動子包括誘導型啟動子和低氧誘導型啟動子。例如，Post DE等人開發了低氧誘導型因子（HIF）反應啟動子，其特異性且強烈地誘導HIF活性腫瘤細胞中的轉基因表現（Gene Ther. 8: 1801-1807 (2001)；Cancer Res. 67: 6872-6881 (2007)）。
在一些實施方式中，啟動子可由經修飾的免疫細胞的生理狀態（如內源活化信號）誘導。在一些實施方式中，其中經修飾的免疫細胞係T細胞，啟動子係T細胞活化依賴性啟動子，其可由經修飾的T細胞的內源活化信號誘導。在一些實施方式中，經修飾的T細胞被誘導物（如佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA）、離子黴素或植物凝集素）活化。在一些實施方式中，藉由經由工程化受體（如CAR、TCR或TAC）識別腫瘤細胞上的腫瘤抗原來活化經修飾的T細胞。在一些實施方式中，T細胞活化依賴性啟動子係IL-2啟動子。在一些實施方式中，T細胞活化依賴性啟動子係NFAT啟動子。在一些實施方式中，T細胞活化依賴性啟動子係NFκB啟動子。
本文所述之一個或多個異源核酸序列可存在於異源基因表現卡匣中，該異源基因表現卡匣包含一個或多個蛋白質編碼序列和視需要的一個或多個啟動子。在一些實施方式中，異源基因表現卡匣包含單個蛋白質編碼序列。在一些實施方式中，異源基因表現卡匣包含由單個啟動子驅動的兩個或更多個蛋白質編碼序列（即，多順反子）。在一些實施方式中，異源基因表現卡匣還包含一個或多個調節序列（如5'UTR、3'UTR、增強子序列、IRES、轉錄終止序列）、重組位點、一個或多個選擇標記（如抗生素抗性基因、報告基因等）、訊息序列或其組合。
在一些實施方式中，提供了包含編碼本文所述之第一多肽和/或工程化受體的核酸中任一種的載體。在一些實施方式中，提供了包含編碼本文所述之第一多肽中任一種的第一核酸序列和編碼本文所述之工程化受體中任一種的第二核酸序列的載體。在一些實施方式中，編碼第一多肽的第一核酸序列經由編碼可自切割的連接子（如P2A、T2A、E2A或F2A肽）的第三核酸序列與編碼工程化受體的第二核酸序列融合。在一些實施方式中，P2A序列係GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（SEQ ID NO: 24）。在一些實施方式中，提供了包含第一載體和第二載體的組成物，該第一載體包含編碼本文所述之第一多肽中任一種的第一核酸序列，該第二載體包含編碼本文所述之工程化受體中任一種的第二核酸序列。在一些實施方式中，提供了包含編碼CAR（例如，CD19 CAR或CLL1 CAR）的第一核酸序列和編碼第一多肽的第二核酸序列的載體，其中該第一核酸序列經由編碼可自切割的連接子（如P2A）的第三核酸序列與該第二核酸序列融合。在一些實施方式中，載體包含編碼SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的核酸序列。
在一些實施方式中，提供了包含編碼本文所述之第一多肽、第二多肽和/或工程化受體的核酸中任一種的載體。在一些實施方式中，提供了包含編碼本文所述之第一多肽中任一種的第一核酸序列、編碼本文所述之第二多肽中任一種的第二核酸序列和編碼本文所述之工程化受體中任一種的第三核酸序列的載體。在一些實施方式中，編碼第一多肽的第一核酸序列經由編碼可自切割的連接子（如P2A、T2A、E2A或F2A肽）的第四核酸序列與編碼工程化受體的第二核酸序列融合。在一些實施方式中，編碼第一多肽的第一核酸序列經由編碼可自切割的連接子（如P2A、T2A、E2A或F2A肽）的第五核酸序列另外地與編碼第二多肽的第三核酸序列融合。在一些實施方式中，P2A序列係GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（SEQ ID NO: 24）。在一些實施方式中，提供了包含第一載體、第二載體和第三載體的組成物，該第一載體包含編碼本文所述之第一多肽中任一種的第一核酸序列，該第二載體包含編碼本文所述之第二多肽中任一種的第二核酸序列，該第三載體包含編碼本文所述之工程化受體中任一種的第三核酸序列。在一些實施方式中，提供了載體，其包含編碼CAR（例如，CD19 CAR或CLL1 CAR）的第一核酸序列、編碼第一多肽的第二核酸序列和編碼第二多肽的第三核酸序列，其中第一核酸序列經由編碼可自切割的連接子（如P2A）的第四核酸序列與第二核酸序列融合，並且其中第二核酸序列經由編碼可自切割的連接子（如P2A）的第五核酸序列與第三核酸序列融合。在一些實施方式中，載體包含編碼SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的核酸序列。
「載體」係一種物質組成物，其包含分離的核酸，並可以用於將分離的核酸遞送至細胞內部。本領域已知許多載體，包括但不限於線性多核苷酸、與離子或兩親化合物相關的多核苷酸、質體和病毒。通常，合適的載體含有在至少一種生物體中起作用的複製起點、啟動子序列、方便的限制性內切核酸酶位點和一種或多種可選擇的標記。術語「載體」也應被解釋為包括促進核酸轉移到細胞中的非質體和非病毒化合物，例如像聚離胺酸化合物、脂質體等。
在一些實施方式中，載體係病毒載體。病毒載體的實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、逆轉錄病毒載體、牛痘載體、單純皰疹病毒載體及其衍生物。病毒載體技術係本領域熟知的，並且描述於例如Sambrook等人（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）以及其他病毒學和分子生物學手冊中。
已經開發了用於將基因轉移到哺乳動物細胞中的許多基於病毒的系統。例如，逆轉錄病毒為基因遞送系統提供了便利的平臺。可以使用本領域已知的技術將異源核酸插入載體中並包裝在逆轉錄病毒粒子中。然後可以分離重組病毒，並在體外或離體將其遞送至經修飾的免疫細胞。許多逆轉錄病毒系統係本領域已知的。在一些實施方式中，使用腺病毒載體。在一些實施方式中，使用慢病毒載體。在一些實施方式中，使用自滅活的慢病毒載體。例如，可以用本領域已知的方案包裝自滅活的慢病毒載體。可以使用本領域已知之方法，將所得的慢病毒載體用於轉導哺乳動物細胞（如人T細胞）。
在一些實施方式中，載體係非病毒載體（如質體）或游離型表現載體。
在一些實施方式中，載體係表現載體。「表現載體」係可用於轉化所選宿主並提供編碼序列在該所選宿主中表現的構建體。表現載體可以是例如選殖載體、二元載體或整合載體。表現包括較佳的是將核酸分子轉錄成可翻譯的mRNA。確保在真核細胞中表現的調節元件係熟悉該項技術者熟知的。在真核細胞的情況下，它們通常包含確保轉錄起始的啟動子以及視需要的確保轉錄終止和轉錄物穩定的聚A信號。允許在真核宿主細胞中表現的調節元件的實例係酵母中的AOX1或GAL1啟動子或者哺乳動物和其他動物細胞中的CMV-、SV40-、RSV-啟動子（勞斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus））、CMV-增強子、SV40-增強子或珠蛋白內含子。此外，根據所使用的表現系統，可以將能夠將多肽引導至細胞區室或將其分泌到介質中的訊息肽（例如，前導序列）添加到該核酸序列的編碼序列中，並且該等訊息肽係本領域熟知的。將一個或多個訊息肽在適當的階段與翻譯、起始和終止序列組裝在一起，並且較佳的是，能夠將翻譯蛋白或其一部分的分泌引導到周質空間或細胞外介質中的訊息肽。視需要，核酸序列可以編碼融合蛋白，該融合蛋白包括賦予所希望的特性（例如，表現的重組產物的穩定化或簡化純化）的N-末端鑒定肽。合適的表現載體係本領域已知的，如Okayama-Berg cDNA表現載體pcDV1（Pharmacia）、pEF-Neo、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3（Invitrogen）、pEF-DHFR和pEF-ADA（Raum等人, Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150）或pSPORT1（GIBCO BRL）。
[製備方法]
本申請還提供了製備本文所述之經修飾的免疫細胞中任一種之方法。
在一些實施方式中，提供了產生經修飾的免疫細胞之方法，該方法包括：將編碼第一多肽的第一核酸和視需要的編碼第二多肽的第二核酸引入前驅免疫細胞中。在一些實施方式中，前驅免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK-T細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。在一些實施方式中，前驅免疫細胞係細胞毒性T細胞。在一些實施方式中，前驅免疫細胞係γδT細胞。在一些實施方式中，前驅免疫細胞係腫瘤浸潤性T細胞或DC活化的T細胞。在一些實施方式中，前驅免疫細胞包含本文所述之工程化受體中的任一種。在一些實施方式中，該方法進一步包括將編碼本文所述之工程化受體中任一種的第三核酸引入前驅免疫細胞中。
在一些實施方式中，工程化受體係嵌合抗原受體（CAR）。在一些實施方式中，工程化受體係經修飾的T細胞受體（TCR）。在一些實施方式中，工程化受體係T細胞抗原偶聯劑（TAC）受體。在一些實施方式中，第一核酸序列、視需要的第二核酸序列和第三核酸序列可操作地連接至同一啟動子。在一些實施方式中，第一核酸序列、視需要的第二核酸序列和第三核酸序列可操作地連接至分開的啟動子。在一些實施方式中，第一核酸和視需要的第二核酸和/或第三核酸序列在同一載體上。在一些實施方式中，第一核酸和視需要的第二核酸和/或第三核酸序列在分開的載體上。在一些實施方式中，載體係病毒載體。在一些實施方式中，病毒載體選自由腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、單純皰疹病毒載體及其衍生物組成之群組。在一些實施方式中，載體係非病毒載體。在一些實施方式中，載體係游離型表現載體。在一些實施方式中，該方法進一步包括分離或富集包含第一核酸序列和/或第二核酸序列的免疫細胞。在一些實施方式中，該方法進一步包括與至少一種藥學上可接受的載劑一起配製經修飾的免疫細胞。
在一些實施方式中，提供了包含本文所述之核酸或載體中任一種的分離的宿主細胞。宿主細胞可用於第一多肽、第二多肽和/或工程化受體、編碼第一多肽、第二多肽和/或工程化受體的核酸或載體的表現或選殖。合適的宿主細胞可包括但不限於原核細胞、真菌細胞、酵母細胞或高等真核細胞（如哺乳動物細胞）。在一些實施方式中，宿主細胞包含編碼第一多肽的第一載體、編碼第二多肽的第二載體和編碼第三多肽（例如，工程化受體）的第三載體。在一些實施方式中，宿主細胞包含含有編碼第一多肽、第二多肽和第三多肽的分離的核酸的單個載體。
可以使用本領域已知的多種方法製備前驅免疫細胞。例如，原代免疫細胞（如T細胞）可獲自多種來源，包括外周血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位的組織、腹水、胸腔積液、脾組織和腫瘤。在一些實施方式中，可以使用本領域已知的多種技術（如FICOLL™分離）從收集自個體的血液單位獲得免疫細胞（如T細胞）。在一些實施方式中，來自個體循環血的細胞係藉由單採（apheresis）獲得的。單採產物典型地含有淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其他有核白血球、紅血球和血小板。在一些實施方式中，可以洗滌藉由單採收集的細胞以除去血漿部分，並將細胞置於適當的緩衝液或培養基中用於後續處理步驟。在一些實施方式中，將細胞用磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）或缺乏二價陽離子（如鈣和鎂）的洗滌溶液洗滌。如熟悉該項技術者將容易理解的，洗滌步驟可以藉由熟悉該項技術者已知之方法完成，如根據製造商的說明藉由使用半自動化「流通式（flow-through）」離心機（例如，Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5）。洗滌後，可將細胞重懸於各種生物相容性緩衝液中，例如像無Ca
2+、無Mg
2+的PBS，勃脈力A（PlasmaLyte A）或者含或不含緩衝液的其他鹽水溶液。可替代地，可以除去單採樣本的不希望組分，並將細胞直接重懸浮於培養基中。
在一些實施方式中，例如藉由PERCOLL™梯度離心或藉由逆流離心淘析來裂解紅血球並消耗單核細胞以從外周血淋巴細胞分離原代T細胞。可以藉由陽性或陰性選擇技術進一步分離T細胞的特定亞群，如CD3
+、CD28
+、CD4
+、CD8
+、CD45RA和CD45RO細胞。例如，在一個實施方式中，藉由與抗CD3/抗CD28（即，3×28）軛合的珠如DYNABEADS
®M-450 CD3/CD28 T一起孵育足以陽性選擇所希望的T細胞的時間段來分離T細胞。
在一些實施方式中，可以使用針對陰性選擇的細胞特有的表面標誌物的抗體的組合藉由陰性選擇進一步富集T細胞群。例如，一種方法涉及經由陰性磁性免疫黏附或流動式細胞測量術進行細胞分選和/或選擇，該方法使用針對陰性選擇的細胞上存在的細胞表面標誌物的單株抗體的混合物。例如，為了藉由陰性選擇富集CD4
+細胞，單株抗體混合物通常包括針對CD14、CD20、CD1lb、CD16、HLA-DR和CD8的抗體。在某些實施方式中，可能希望富集或陽性選擇通常表現CD4
+、CD25
+、CD62L
hi、GITR
+和FoxP3
+的調節T細胞。可替代地，在某些實施方式中，藉由抗C25軛合的珠或其他類似的選擇方法消耗T調節細胞。
將載體或核酸引入宿主細胞（如前驅免疫細胞）之方法係本領域已知的。可以藉由物理、化學或生物方法將載體或核酸轉移到宿主細胞中。
用於將一個或多個載體或一個或多個核酸引入宿主細胞中的物理方法包括磷酸鈣沈澱、脂質轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔等。產生含有載體和/或外源核酸的細胞之方法係本領域熟知的。參見例如，Sambrook等人 (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York。在一些實施方式中，藉由電穿孔將載體引入細胞中。
用於將一個或多個載體或一個或多個核酸引入宿主細胞中的生物方法包括使用DNA和RNA載體。病毒載體已成為用於將基因插入哺乳動物例如人細胞的最廣泛使用之方法。
用於將一個或多個載體或一個或多個核酸引入宿主細胞中的化學方法包括膠體分散系統，如大分子複合物、奈米膠囊、微球、珠和基於脂質的系統，包括水包油乳液、膠束、混合膠束和脂質體。用作體外遞送媒介物的示例性膠體系統係脂質體（例如，人工膜囊泡）。
在一些實施方式中，將轉導的或轉染的前驅免疫細胞在引入一個或多個異源核酸後離體繁殖。在一些實施方式中，將轉導的或轉染的前驅免疫細胞培養以繁殖至少約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中的任一個。在一些實施方式中，將轉導的或轉染的前驅免疫細胞培養不超過約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中的任一個。在一些實施方式中，進一步評價或篩選轉導的或轉染的前驅免疫細胞以選擇經修飾的免疫細胞。
報告基因可用於鑒定可能轉染的細胞和評估調控序列的功能。通常，報告基因係在受體生物體或組織中不存在或不表現的基因，該報告基因編碼多肽，該多肽的表現藉由一些易於檢測的特性（例如，酶活性）來表現。報告基因的表現在DNA被引入受體細胞後的合適的時間檢測。合適的報告基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌性鹼性磷酸酶的基因或綠色螢光蛋白基因（例如，Ui-Tei等人FEBS Letters 479: 79-82 (2000)）。
證實前驅免疫細胞中存在一個或多個異源核酸的其他方法包括例如熟悉該項技術者熟知的分子生物學測定，如DNA印跡法和RNA印跡法、RT-PCR和PCR；生物化學測定，如藉由免疫學方法（如ELISA和蛋白印跡）來檢測特定肽的存在或不存在。
III. 治療方法
本申請的一方面關於治療個體的疾病或病症（例如，癌症）之方法，該等方法包括向該個體投與有效量的本文所述之經修飾的免疫細胞中的任一種。本申請考慮了經修飾的免疫細胞，其可以單獨投與或與另一種療法以任何組合投與，並且在至少一些方面，與藥學上可接受的載劑或賦形劑一起投與。在一些實施方式中，在投與之前，可以將經修飾的免疫細胞與本領域熟知的合適的藥物載劑和賦形劑組合。
在一些實施方式中，提供了治療個體（例如，人）中的癌症（例如，實體癌）之方法，該方法包括向該個體投與有效量的藥物組成物，該藥物組成物包含經修飾的免疫細胞（例如，CAR-T細胞）和藥學上可接受的載劑，其中經修飾的免疫細胞包含：a) 第一多肽，其包含：i) 第一靶結合結構域，ii) 第一TLR跨膜結構域，和iii) 第一TLR傳訊結構域；和b) 第二多肽，其包含：i) 第二靶結合結構域，ii) 第二TLR跨膜結構域，和iii) 第二TLR傳訊結構域，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分，並且其中第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合多聚體靶分子的亞基。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二結合結構域結合相同的靶分子。在一些實施方式中，第一靶結合結構域和第二結合結構域各自結合靶分子上的相同靶位點。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含CAR和TLR多肽（例如，與CAR融合的兩個或更多個TLR多肽）。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗CD19 CAR和抗CD20 TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 1具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 1。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗CD19 CAR和抗NKG2D TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 59具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 59。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 60具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 60。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗GPC3 CAR和抗NKG2D TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPC3 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 57具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 57。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPC3 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 58具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 58。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗BCMA CAR（例如，單個抗BCMA CAR或串聯抗BCMA CAR）和抗BCMA TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含單個抗BCMA CAR和抗BCMA TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、單個抗BCMA sdAb、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 62具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 62。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 63具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 63。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD28α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 64具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 64。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含串聯抗BCMA CAR和抗BCMA TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 61具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 61。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗BCMA CAR（例如，單個抗BCMA CAR或串聯抗BCMA CAR）和抗GPRC5D TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 65具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 65。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗GPRC5D scFv、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 72具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 72。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗GPRC5D scFv、CD28α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 73具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 73。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗CLL1 CAR和抗CD33（例如，抗CD33 V結構域和/或抗CD33 C2結構域）TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CLL1 sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 71具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 71。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CLL1 sdAb、CD28α鉸鏈結構域、CD28α跨膜（TM）結構域、CD28共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗CD33 V結構域sdAb、TLR2跨膜結構域、TLR2傳訊結構域（例如，TLR2的胞內部分）、P2A切割位點、訊息肽、抗CD33 C2結構域sdAb、TLR1跨膜結構域和TLR1傳訊結構域（例如，TLR1的胞內部分）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 3具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 3。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了治療個體（例如，人）中的癌症（例如，實體癌）之方法，該方法包括向該個體投與有效量的藥物組成物，該藥物組成物包含經修飾的免疫細胞（例如，CAR-T細胞）和藥學上可接受的載劑，其中經修飾的免疫細胞包含：a) 第一多肽，其包含：i) 第一靶結合結構域，ii) 第一TLR跨膜結構域，和iii) 第一TLR傳訊結構域；和b) 第二多肽，其包含：i) 第二靶結合結構域，ii) 第二TLR跨膜結構域，和iii) 第二TLR傳訊結構域，其中第一靶結合結構域和第二結合結構域結合相同的靶分子，並且其中第一靶結合結構域和第二靶結合結構域各自結合單個靶分子上不同的非重疊靶位點，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞進一步包含工程化受體，如嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含CAR和TLR多肽（例如，與CAR融合的兩個或更多個TLR多肽）。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗CD19 CAR和抗CD20 TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 1具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 1。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗CD19 CAR和抗NKG2D TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 59具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 59。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 60具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 60。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗GPC3 CAR和抗NKG2D TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPC3 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 57具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 57。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPC3 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 58具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 58。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗BCMA CAR（例如，單個抗BCMA CAR或串聯抗BCMA CAR）和抗BCMA TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含單個抗BCMA CAR和抗BCMA TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、單個抗BCMA sdAb、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 62具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 62。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 63具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 63。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD28α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 64具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 64。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含串聯抗BCMA CAR和抗BCMA TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 61具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 61。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗BCMA CAR（例如，單個抗BCMA CAR或串聯抗BCMA CAR）和抗GPRC5D TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 65具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 65。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗GPRC5D scFv、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 72具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 72。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗GPRC5D scFv、CD28α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 73具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 73。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗CLL1 CAR和抗CD33（例如，抗CD33 V結構域和/或抗CD33 C2結構域）TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CLL1 sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 71具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 71。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CLL1 sdAb、CD28α鉸鏈結構域、CD28α跨膜（TM）結構域、CD28共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗CD33 V結構域sdAb、TLR2跨膜結構域、TLR2傳訊結構域（例如，TLR2的胞內部分）、P2A切割位點、訊息肽、抗CD33 C2結構域sdAb、TLR1跨膜結構域和TLR1傳訊結構域（例如，TLR1的胞內部分）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 3具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，提供了治療個體（例如，人）中的癌症（例如，實體癌）之方法，該方法包括向該個體投與有效量的藥物組成物，該藥物組成物包含經修飾的免疫細胞（例如，CAR-T細胞）和藥學上可接受的載劑，其中經修飾的免疫細胞包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域；和c)工程化受體，其中工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域，其中在第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，第一TLR傳訊結構域和第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。在一些實施方式中，工程化受體包含特異性識別與第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子上的非重疊靶位點的細胞外結構域。在一些實施方式中，工程化受體係嵌合抗原受體（CAR）、工程化TCR或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含CAR和TLR多肽（例如，與CAR融合的兩個或更多個TLR多肽）。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗CD19 CAR和抗CD20 TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 1具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 1。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗CD19 CAR和抗NKG2D TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 59具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 59。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CD19 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 60具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 60。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗GPC3 CAR和抗NKG2D TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPC3 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 57具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 57。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗GPC3 scFv、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗NKG2D ECD、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 58具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 58。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗BCMA CAR（例如，單個抗BCMA CAR或串聯抗BCMA CAR）和抗BCMA TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含單個抗BCMA CAR和抗BCMA TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、單個抗BCMA sdAb、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 62具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 62。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 63具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 63。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、單個抗BCMA sdAb、CD28α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 64具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 64。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含串聯抗BCMA CAR和抗BCMA TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 61具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 61。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗BCMA CAR（例如，單個抗BCMA CAR或串聯抗BCMA CAR）和抗GPRC5D TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 65具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 65。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗GPRC5D scFv、CD8α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 72具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 72。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、串聯抗BCMA sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗GPRC5D scFv、CD28α鉸鏈結構域、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 73具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 73。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞包含CAR系統（例如，CAR融合構建體），其中CAR融合構建體包含抗CLL1 CAR和抗CD33（例如，抗CD33 V結構域和/或抗CD33 C2結構域）TLR多肽。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CLL1 sdAb、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜（TM）結構域、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜（TM）區和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 71具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 71。在一些實施方式中，CAR融合構建體從N-末端到C-末端包含：訊息肽、抗CLL1 sdAb、CD28α鉸鏈結構域、CD28α跨膜（TM）結構域、CD28共刺激傳訊結構域的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域、P2A切割位點、訊息肽、抗CD33 V結構域sdAb、TLR2跨膜結構域、TLR2傳訊結構域（例如，TLR2的胞內部分）、P2A切割位點、訊息肽、抗CD33 C2結構域sdAb、TLR1跨膜結構域和TLR1傳訊結構域（例如，TLR1的胞內部分）。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含與SEQ ID NO: 3具有至少約85%（例如，至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高中的任一個）序列一致性的胺基酸序列。在一些實施方式中，CAR融合構建體包含SEQ ID NO: 3。在一些實施方式中，第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的細胞內結構域，和/或第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的細胞內結構域。在一些實施方式中，經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
在一些實施方式中，治療癌症之方法具有一種或多種以下生物活性：(1)殺傷癌細胞；(2)抑制癌細胞的增殖；(3)誘導外周T細胞的重新分佈；(4)在腫瘤中誘導免疫反應；(5)減小腫瘤尺寸；(6)緩解患有癌症的個體的一種或多種症狀；(7)抑制腫瘤轉移；(8)延長存活；(9)延長至癌症進展時間；(10)預防、抑制或降低癌症復發的可能性；(11)改善個體的生活品質；(12)促進腫瘤中的T細胞浸潤以及 (13)降低先存腫瘤轉移（如轉移至淋巴結）的發生率或負擔。在一些實施方式中，該方法實現至少約40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高中任一個的腫瘤細胞死亡率。在一些實施方式中，該方法減小至少約10%（包括例如，至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%或100%中的任一個）的腫瘤尺寸。在一些實施方式中，該方法抑制至少約10%（包括例如，至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%或100%中的任一個）的轉移。在一些實施方式中，該方法將個體的存活延長至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24或更多個月中的任一個。在一些實施方式中，該方法將至癌症進展時間延長至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24或更多個月中的任一個。
本文所述之方法適用於治療多種癌症，包括實體癌和液體癌兩者。該等方法可應用於所有階段的癌症，包括早期癌症、非轉移性癌症、原發性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、轉移性癌症或緩解期癌症。本文所述之方法可以在輔助治療或新輔助治療中用作第一療法、第二療法、第三療法或與本領域已知的其他類型的癌症療法（如化學療法、手術、激素療法、輻射、基因療法、免疫療法（如T細胞療法）、骨髓移植、幹細胞移植、標靶療法、冷凍療法、超音波療法、光動力療法、射頻消融等）的組合療法（即，該方法可以在基本療法/針對性療法之前進行）。在一些實施方式中，該方法用於治療先前已被治療的個體。在一些實施方式中，癌症對於先前療法係難治的。在一些實施方式中，該方法用於治療先前未被治療的個體。
在一些實施方式中，該個體具有低腫瘤負荷。可以根據實性瘤（RECIST）1.1指南中的反應評價標準測量實性瘤的腫瘤負荷。參見，Eisenhauer EA等人, European Journal of Cancer 45 (2009) 228-247。例如，可以基於以下來評估治療基線時可測量腫瘤的腫瘤負荷：(1) 腫瘤病變（例如，藉由CT掃描、藉由臨床檢查的卡尺測量和/或胸部X射線）和 (2) 惡性淋巴結。例如，實體癌的腫瘤負荷可以量化為5個靶病變（每個器官最多2個）的直徑之和。根據由放射科醫師評估的Cheson 2007標準，可以將液體癌的腫瘤負荷測量為最多6個指數病變的產物直徑之和。參見，Cheson BD等人, J. Clin. Oncol., 2007; 25(5): 579-586。在一些實施方式中，具有低腫瘤負荷的個體的腫瘤負荷不超過約4 × 10
3、3 × 10
3、2 × 10
3、1 × 10
3、5 × 10
2、2 × 10
2、1 × 10
2或更小mm
2中任一個。
在一些實施方式中，該個體在接受治療後沒有經歷3級或4級不良副作用。不良事件的分級根據不良事件通用術語標準v3.0（CTCAE）進行。在一些實施方式中，該個體在接受治療後沒有經歷細胞介素風暴。
在本文所述之方法中投與的經修飾的免疫細胞的有效量將取決於許多因素，如所治療的癌症的特定類型和階段、投與途徑、第一多肽、第二多肽和/或工程化受體的活性等。適當的劑量方案可由醫師基於臨床因素確定，該等臨床因素包括患者的體型、體表面積、年齡、待投與的特定化合物、性別、投與時間和途徑、一般健康狀況以及同時投與的其他藥物。在一些實施方式中，藥物組成物的該有效量低於誘導毒理學效應（即，高於臨床上可接受的毒性水平的效應）的水平，或在將藥物組成物投與於個體時處於可以控制或耐受潛在副作用的水平。在一些實施方式中，藥物組成物的有效量包含約10
5至約10
10個經修飾的免疫細胞。
在一些實施方式中，將藥物組成物投與一次（例如，單次快速注射）。在一些實施方式中，投與多次（如2、3、4、5、6或更多次中的任一個）藥物組成物。如果係多次投與，則它們可以藉由相同或不同的途徑進行，並且可以在相同部位或替代部位進行。藥物組成物可以以合適的頻率投與，如從每天到每年一次。藉由監測患者的疾病體徵並相應調整治療，醫學領域的技術人員可以容易地確定針對特定患者的最佳劑量和治療方案。
在一些實施方式中，待治療的個體係哺乳動物。哺乳動物的實例包括但不限於人、猴、大鼠、小鼠、倉鼠、豚鼠、狗、貓、兔、豬、綿羊、山羊、馬、牛等。在一些實施方式中，該個體係人。
藥物組成物
本申請還提供了藥物組成物，其包含本文所述之經修飾的免疫細胞中的任一種和視需要的藥學上可接受的載劑。
本申請人的藥物組成物可以包含任何數量的經修飾的免疫細胞。在一些實施方式中，藥物組成物包含單個拷貝的經修飾的免疫細胞。在一些實施方式中，藥物組成物包含至少約1、10、100、1000、10
4、10
5、10
6、10
7、10
8或更多個拷貝中任一個的經修飾的免疫細胞。在一些實施方式中，藥物組成物包含單一類型的經修飾的免疫細胞。在一些實施方式中，藥物組成物包含至少兩種類型的經修飾的免疫細胞，其中不同類型的經修飾的免疫細胞的區別在於其細胞來源、細胞類型、表現的嵌合受體和/或啟動子等。
如本文所用，「載劑」包括在所採用的劑量和濃度下對暴露於其的細胞或個體無毒的藥學上可接受的載劑、賦形劑或穩定劑。生理學上可接受的載劑通常是pH緩衝水溶液。合適的藥物載劑的實例係本領域熟知的，並且包括磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液如油/水乳液、各種類型的潤濕劑、無菌溶液等。可接受的載劑、賦形劑或穩定劑在所採用的劑量和濃度下對接受者無毒。
包含這樣的載劑的藥物組成物可藉由熟知的常規方法配製。溶劑或稀釋劑較佳的是等滲的、低滲的或弱高滲的，並且具有相對低的離子強度。代表性實例包括無菌水，生理鹽水（例如，氯化鈉），林格氏溶液，葡萄糖、海藻糖或蔗糖溶液，漢克氏溶液（Hank's solution）和其他生理平衡鹽水溶液（參見，例如最新版的Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkins）。
本文所述之藥物組成物可以經由任何合適的途徑投與。在一些實施方式中，將藥物組成物腸胃外、經皮（進入真皮）、腔內、動脈內（進入動脈）、肌內（進入肌肉）、鞘內或靜脈內投與。在一些實施方式中，將藥物組成物皮下（在皮膚下）投與。在一些實施方式中，將藥物組成物靜脈內投與。在一些實施方式中，將藥物組成物經由輸注或注射向個體投與。在一些實施方式中，將藥物組成物直接投與至靶部位，例如藉由基因槍遞送至內部或外部靶部位或者藉由導管投與至動脈中的部位。在一些實施方式中，將藥物組成物局部（例如，瘤內）投與。投與可以使用常規的注射器和針頭或本領域可獲得的能夠促進或改善一種或多種活性劑在受試者中的遞送的任何化合物或裝置。
用於腸胃外投與的製劑包括無菌水溶液或非水溶液、懸浮液和乳液。非水性溶劑的實例係丙二醇、聚乙二醇、植物油（如橄欖油）和可注射的有機酯（如油酸乙酯）。水性載劑包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。腸胃外媒介物包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格氏溶液或固定油。靜脈內媒介物包括流體和營養補充劑、電解質補充劑（如基於林格氏右旋糖的那些）等。也可以存在防腐劑和其他添加劑，例如像抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。此外，本揭露之藥物組成物可以包含蛋白質載劑，像例如血清白蛋白或免疫球蛋白，較佳的是人來源的。本領域可獲得呈冷凍、液體形式或凍乾形式的各種病毒配製物（例如，WO 98/02522、WO 01/66137、WO 03/053463、WO 2007/056847和WO 2008/114021等）。固體（例如，乾粉固體或凍乾固體）組成物可藉由涉及真空乾燥和冷凍乾燥之方法獲得（參見，例如WO 2014/053571）。設想本揭露之藥物組成物除本文所述之經修飾的免疫細胞外還可包含其他生物活性劑，這取決於藥物組成物的預期用途。
在一些實施方式中，藥物組成物被適當地緩衝以供人使用。合適的緩衝液包括但不限於磷酸鹽緩衝液（例如，PBS）、碳酸氫鹽緩衝液和/或能夠維持生理或弱鹼性pH（例如，約pH 7至約pH 9）的Tris緩衝液。在一些實施方式中，還可以藉由添加合適的張力改質劑（如甘油）使藥物組成物與血液等滲。
在一些實施方式中，藥物組成物包含在單次使用的小瓶（如單次使用的密封小瓶）中。在一些實施方式中，藥物組成物包含在多次使用的小瓶中。在一些實施方式中，藥物組成物以散裝包含在容器中。
在一些實施方式中，藥物組成物必須滿足用於向個體投與的某些標準。例如，美國食品與藥品管理局已經發佈了為基於細胞的免疫治療產品設定標準的監管指南，包括21 CFR 610和21 CFR 610.13。本領域已知評估藥物組成物的外觀、特性、純度、安全性和/或效力之方法。在一些實施方式中，藥物組成物基本上不含能夠產生過敏作用的外來蛋白質，如細胞培養中使用的除經修飾的免疫細胞之外的動物來源的蛋白質。在一些實施方式中，「基本上不含」係小於藥物組成物的總體積或重量的約10%、5%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、1 ppm或更少中的任一個。在一些實施方式中，藥物組成物在GMP級工作間（GMP-level workshop）中製備。在一些實施方式中，對於腸胃外投與，藥物組成物包含小於約5 EU/kg體重/小時的內毒素。在一些實施方式中，對於靜脈內投與，藥物組成物中至少約70%的經修飾的免疫細胞係活的。在一些實施方式中，當使用如美國藥典（USP）中所述之14天直接接種測試方法評估時，藥物組成物具有「無生長」結果。在一些實施方式中，在投與藥物組成物之前，包括經修飾的免疫細胞和藥學上可接受的賦形劑兩者的樣本應在最終收穫前約48-72小時（或與培養物的最後再補料（re-feeding）同時）取出用於無菌測試。在一些實施方式中，藥物組成物不含支原體污染。在一些實施方式中，藥物組成物不含可檢測的微生物劑。在一些實施方式中，藥物組成物不含傳染病病原，如HIV I型、HIV II型、HBV、HCV、人嗜T淋巴細胞病毒I型；和人嗜T淋巴細胞病毒II型。
IV. 套件和製品
還提供了包含本文所述之經修飾的免疫細胞中任一種或組成物（例如，藥物組成物）的套件、單位劑量和製品。在一些實施方式中，提供了含有本文所述之藥物組成物中的任一種的套件，並且較佳的是提供了其使用說明書。在一些實施方式中，除了經修飾的免疫細胞之外，套件還包含第二癌症療法，如化學療法、激素療法和/或免疫療法。一個或多個套件可以針對個體的特定癌症進行定制，並且包含針對個體的相應的第二癌症療法。
套件可以包含一種或多種另外的組分，如容器、試劑、培養基、誘導物、細胞介素、緩衝液、抗體等，以允許增殖或誘導經修飾的免疫細胞。套件還可以包含用於將藥物組成物局部投與（如腫瘤內注射）至腫瘤部位的裝置。
本申請的套件在合適的包裝中。合適的包裝包括但不限於小瓶、瓶、罐、軟質包裝（例如，密封的聚酯薄膜或塑膠袋）等。套件可以視需要提供其他組成部分，如緩衝液和解釋資訊。因此本申請還提供了製品，其包括小瓶（如密封的小瓶）、瓶、罐子、柔性包裝等。套件的一些組分可以以水性介質或以凍乾形式包裝。
該製品可以包括容器和該容器上或與該容器相關的標籤或包裝插頁。合適的容器包括例如，瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多種材料（如玻璃或塑膠）形成。通常，容器容納有效治療本文所述之疾病或病症（如癌症）的組成物，並且可具有無菌進入口（例如，容器可以是靜脈內溶液袋或具有可被皮下注射針頭刺穿的塞子的小瓶）。標籤或包裝插頁指示組成物用於治療個體的特定病狀。標籤或包裝插頁將進一步包括用於將組成物投與於個體的說明書。標籤可指示用於重構和/或使用的指導。容納藥物組成物的容器可以是多次使用的小瓶，其允許重複投與（例如，2-6次投與）重構配製物。包裝插頁係指通常包括在治療產品的商業包裝中的說明書，該等說明書含有關於使用此類治療產品的適應症、用法、劑量、投與、禁忌症和/或警告的資訊。另外地，製品可進一步包含第二容器，該容器包含藥學上可接受的緩衝液，如抑菌性注射用水（BWFI）、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液和右旋糖溶液。其可以進一步包括從商業和使用者角度所希望的其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。
套件或製品可包括多個單位劑量的藥物組成物和使用說明書，其包裝的數量足以在藥房（例如，醫院藥房和配藥藥房）中儲存和使用。
實施例
以下實施例僅旨在作為本揭露之示例，並因此不應視為以任何方式限制本揭露。以下實施例和詳細描述係作為說明而不是作為限制而提供的。
實施例1：表現外源引入的CD19和CD20 toll樣受體（TLR）結構域的CAR-T細胞的製備
此實施例顯示了表現外源引入的toll樣受體（TLR）結構域的示例性裝甲的CAR-T細胞的構建。特別地，此實施例顯示了表現CD19和/或CD20的CAR-T細胞的構建。
1.1.嵌合抗原受體（CAR）的構建
為了構建CD19-共CD20 CAR（SEQ ID NO: 1），對編碼CAR骨架多肽的CAR骨架序列進行密碼子優化和化學合成，該CAR骨架多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗CD19 scFv（SEQ ID NO: 6）、CD8α鉸鏈結構域（SEQ ID NO: 7）、CD8α跨膜（TM）結構域（SEQ ID NO: 8）、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域（SEQ ID NO: 9）的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域（SEQ ID NO: 10）。還對誘導型共刺激分子的序列進行密碼子優化和化學合成，該誘導型共刺激分子從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗CD20 scFv（SEQ ID NO: 11）、TLR4跨膜（TM）區（SEQ ID NO: 12）和TLR4的胞內部分（SEQ ID NO: 13），並經由P2A切割位點（SEQ ID NO: 24）連接至CAR骨架序列。此構建體顯示於圖1中。將CAR骨架和共刺激分子選殖到慢病毒載體（例如，第二代慢病毒載體）中，下游並可操作地連接至組成型hEF1α啟動子用於體外轉錄。參考如
Blood(2006) 108 (12): 3890-3897中所示例的，產生瞬時逆轉錄病毒上清液。
如上所述製備包含4-1BB作為共刺激結構域的第二CD19 CAR骨架（「CD19 BM CAR」），其從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗CD19 scFv（SEQ ID NO: 6）、CD8α鉸鏈結構域（SEQ ID NO: 7）、CD8α跨膜（TM）結構域（SEQ ID NO: 8）、4-1BB共刺激傳訊結構域（SEQ ID NO: 9）和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域（SEQ ID NO: 10），並用於比較分析。
1.2. CAR-T細胞的構建
病毒製備
包括pCMV-ΔR-8.47和pMD2.G的慢病毒包裝質體混合物購自Addgene，並且與適當的CAR編碼質體以預先優化的比率與聚乙烯亞胺混合。將HEK293細胞用慢病毒和CAR構建體的混合物轉染，並且培養過夜。過夜培養後，收集上清液。將上清液離心以進一步去除細胞碎片，並通過0.45 µm PES過濾器過濾。將病毒粒子沈澱，並且用預冷的DPBS沖洗。將病毒等分並立即儲存在-80°C下，並且藉由使用流動式細胞測量術測定來測量supT1細胞系轉導效率來確定病毒滴定度。
T細胞的病毒轉導
藉由單採自健康供體收集白血球。使用FICOLL-PAQUE
™PLUS培養基分離外周血單核細胞（PBMC），並且使用Pan T細胞分離套件（Miltenyi）從PMBC中純化人T細胞。隨後將純化的T細胞用人T細胞活化/擴增套件（Miltenyi）預活化48小時。預活化後，以1 : 2的珠與細胞比率添加抗CD3/CD28 MACSiBead
TM粒子以擴增T細胞。
在8 µg/mL聚凝胺存在下將預先活化的T細胞用慢病毒轉導。將細胞在6孔組織培養板中以4 × 10
6個T細胞/孔培養，在37°C下持續大約48小時。將轉導的細胞離心，除去上清液，並將沈澱的細胞以0.5 × 10
6個細胞/mL重懸於補充有300 IU/ml IL-2的新鮮培養基中用於培養。每2至3天將細胞濃度調節至0.5 × 10
6個細胞/mL。
藉由將蛋白L和兔-抗sdAb與CAR培養的細胞混合來檢測T細胞上的CAR表現，以分別檢測細胞表面scFv和sdAb。
實施例2：CD19-共CD20 CAR-T細胞的體外細胞毒性評價
此實施例顯示了CD19-共CD20 CAR-T細胞的體外抗腫瘤活性。
2.1乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性
為了在體外快速評價工程化T細胞（例如，CD19 BM CAR-T和CD19-共CD20 CAR-T細胞）的抗腫瘤活性，進行了細胞毒性的乳酸脫氫酶（LDH）測定。在轉導後的第5天或第9天，收穫CD19-共CD20 CAR轉導的T細胞（SEQ ID NO: 1），並分別與靶細胞（表現CD19和CD20的BLL腫瘤Raji細胞）以1 : 1、1 : 0.3的E/T比率（效應物 : CAR-T/靶比率）共孵育20小時。將CD19 BM CAR-T細胞（SEQ ID NO: 2）用作陽性對照，將來自同一批次的未轉導的T細胞（「UnT」）用作陰性對照。按照製造商手冊（Roche）進行測定。
體外細胞毒性藉由以下公式計算（[LDH]
E+T：從E/T共孵育釋放的LDH，[LDH]
E：僅從效應物釋放的LDH，[LDH]
max：從用Triton X-100處理的靶細胞釋放的LDH，[LDH]
min：從未處理的靶細胞釋放的LDH）：
所有測試的CAR構建體（例如，CD19-共CD20 CAR-T、CD19 BM CAR-T和UnT細胞）都有效轉導了人T細胞，CAR表現率在25%和60%之間。在同一批次的實驗中，相對於未轉導的T細胞，轉導的細胞的細胞生長和生存力沒有受到影響。如圖2所示，CD19 BM CAR-T和CD19-共CD20 CAR-T細胞在體外以劑量依賴性方式誘導靶細胞裂解。此外，在低E/T比率下，CD19-共CD20 CAR-T細胞表現出比CD19 BM CAR-T更強的針對靶細胞的細胞毒性。
2.2 藉由均相時間分辨螢光（HTRF）的細胞介素分泌
效應T細胞活化和增殖的另一個量度係效應細胞介素如IFNγ和TNFα的產生。收集來自體外細胞毒性測定的上清液以評估CAR誘導的細胞介素釋放，並且根據製造商手冊進行IFN-γ（Cisbio）的均相時間分辨螢光（HTRF）測定。
將CAR-T細胞（例如，CD19 BM CAR-T、CD19-共CD20 CAR-T和未轉導的「unT」CAR-T細胞）與Raji靶細胞共培養。24 h後收集培養上清液以評估IFNγ和TNFα的釋放，作為T細胞活化的量度。如圖3和4所示，與靶細胞共培養的CD19-共CD20 CAR-T細胞分泌顯著量的TNFα和IFNγ。此外，TNFα分泌水平高於陽性對照CD19 BM CAR-T細胞。
2.3 長期共培養測定
為了評價CD19-共CD20 CAR-T細胞的長期殺傷功效，進行了長期共培養測定以模擬體內的動態殺傷過程。在不存在外源細胞介素（例如，IL-2）的情況下，將轉導的（例如，CD19 BM CAR-T或CD19-共CD20 CAR-T）或未轉導的（例如，unT）T細胞（1 × 10
5個/孔）與Raji靶細胞（4 × 10
5個/孔）以1 : 4的E : T比率在24孔板中共培養。共培養2或3天後，收穫該等細胞中的一部分並針對CD3進行染色。藉由CD3和CAR信號鑒定CAR-T細胞。對於系列共培養測定，然後以相同的E : T比率用新鮮Raji靶細胞再次攻擊剩餘T細胞。進行共培養，直到腫瘤細胞長得超出孔體積。每個時間點的T細胞增殖率藉由將該時間點的T細胞數除以T細胞的初始數來計算。
各種CAR-T細胞在重複腫瘤刺激測定中的殺傷功效顯示於圖5中。CD19 BM CAR-T細胞在5輪腫瘤刺激後耗盡（例如，不能殺死另外的靶腫瘤細胞，如藉由CD3%所測量），而CD19-共CD20 CAR-T細胞持續殺死靶腫瘤細胞至7輪腫瘤刺激。此外，CD19-共CD20 CAR-T細胞在體外增殖並表現出比CD19 BM CAR-T細胞更好的長期擴增（圖6）。該等結果表明，TLR4傳訊活化使CAR-T細胞抵抗衰竭，並增強其體外殺死靶腫瘤細胞的能力，由此解決了這類治療劑進展的主要障礙。
實施例3：表現外源引入的CLL1和CD33 toll樣受體（TLR）結構域的CAR-T細胞的製備
此實施例顯示了表現外源引入的toll樣受體（TLR）結構域的示例性裝甲的CAR-T細胞的構建。特別地，此實施例顯示了表現CLL1和/或CD33的CAR-T細胞的構建。
3.1.嵌合抗原受體（CAR）的構建
此實施例包含兩種CAR構建體。對命名為CLL1-共CD33 CAR（SEQ ID NO: 3）的第一CAR構建體進行密碼子優化和化學合成，該第一CAR構建體係編碼CAR骨架多肽的CAR骨架序列，該CAR骨架多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗CLL1 sdAb（SEQ ID NO: 14）、CD28α鉸鏈結構域（SEQ ID NO: 15）、CD28跨膜（TM）結構域（SEQ ID NO: 16）、CD28分子（SEQ ID NO: 17）的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域（SEQ ID NO: 10）。還對第一誘導型共刺激分子的序列進行密碼子優化和化學合成，該第一誘導型共刺激分子從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗CD33 V結構域sdAb（SEQ ID NO: 21）、TLR2跨膜（TM）區（SEQ ID NO: 22）和TLR2的胞內部分（SEQ ID NO: 23），並經由P2A切割位點（SEQ ID NO: 24）連接至CAR骨架序列。還對第二誘導型共刺激分子的序列進行密碼子優化和化學合成，該第二誘導型共刺激分子從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗CD33 C2結構域sdAb（SEQ ID NO: 18）、TLR1跨膜（TM）區（SEQ ID NO: 19）和TLR1的胞內部分（SEQ ID NO: 20），並經由P2A切割位點（SEQ ID NO: 24）連接至第一誘導型共刺激分子。此構建體顯示於圖7中。
對命名為CLL1-共CD33-2 CAR（SEQ ID NO: 71）的第二CAR構建體進行密碼子優化和化學合成，該第二CAR構建體係編碼CAR骨架多肽的CAR骨架序列，該CAR骨架多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗CLL1 sdAb（SEQ ID NO: 14）、CD8α鉸鏈結構域（SEQ ID NO: 7）、CD8α跨膜（TM）結構域（SEQ ID NO: 8）、4-1BB（CD137）分子（SEQ ID NO: 9）的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域（SEQ ID NO: 10）。還對誘導型共刺激分子的序列進行密碼子優化和化學合成，該誘導型共刺激分子從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗CD33 sdAb（SEQ ID NO: 21）、TLR4跨膜（TM）區（SEQ ID NO: 12）和TLR4的胞內部分（SEQ ID NO: 13），並經由P2A切割位點（SEQ ID NO: 24）連接至CAR骨架序列。此構建體顯示於圖7中。
將CAR骨架和共刺激分子選殖到慢病毒載體（例如，第二代慢病毒載體）中，下游並可操作地連接至組成型hEF1α啟動子用於體外轉錄。參考如
Blood(2006) 108 (12): 3890-3897中所示例的，產生瞬時逆轉錄病毒上清液。
還如上所述製備了編碼抗CLL1基準CAR（CLL1 BM CAR）的構建體用於比較分析（SEQ ID NO: 4）。
還如上所述製備了編碼抗CLL1/CD33雙CAR（CLL1/CD33雙CAR）的構建體用於比較分析（SEQ ID NO: 43）。
3.2. T細胞的病毒製備和轉導
如實施例1所述製備慢病毒。根據實施例1中描述之方法收集T細胞淋巴細胞並用慢病毒轉導。
實施例4：CLL1-共CD33 CAR-T細胞的體外細胞毒性測定
此實施例顯示了CLL1-共CD33 CAR-T和CLL1-共CD33-2 CAR-T細胞的體外抗腫瘤活性。
4.1乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性
如實施例2.1所述，在培養24 h後進行LDH測定以測量細胞毒性。將表現CLL1和CD33的AML細胞系U937用作靶細胞。如圖8所示，CLL1 BM CAR-T細胞、CLL1-共CD33 CAR-T和CLL1-共CD33-2 CAR-T細胞顯示出針對U937靶細胞的相當的體外細胞毒性。
4.2 藉由均相時間分辨螢光（HTRF）的細胞介素分泌
收集來自體外細胞毒性測定的上清液以評估CAR誘導的細胞介素釋放，並且根據製造商手冊和實施例2.2進行IFN-γ（Cisbio）的均相時間分辨螢光（HTRF）測定。
將CAR-T細胞（例如，CLL1 BM CAR-T細胞、CLL1-共CD33 CAR-T和CLL1-共CD33-2 CAR-T以及未轉導的「unT」CAR-T細胞）與U937靶細胞共培養。24 h後收集培養上清液以評估IFNγ和TNFα的釋放，作為T細胞活化的量度。如圖9和10所示，與靶細胞共培養的CLL1-共CD33 CAR-T和CLL1-共CD33-2 CAR-T細胞分泌顯著量的TNFα和IFNγ。此外，TNFα和IFNγ分泌水平都高於陽性對照CLL1 BM CAR-T細胞。
4.3 長期共培養測定
為了評價CLL1-共CD33 CAR-T細胞的長期殺傷功效，進行了長期共培養測定以模擬體內的動態殺傷過程。在不存在外源細胞介素（例如，IL-2）的情況下，將轉導的（例如，CLL1 BM CAR-T、CLL1-共CD33 CAR-T或CLL1-共CD33-2 CAR-T）或未轉導的（例如，unT）T細胞（1 × 10
5個/孔）與U937靶細胞（4 × 10
5個/孔）以1 : 4的E : T比率在24孔板中共培養。共培養2或3天後，收穫該等細胞中的一部分並針對CD3進行染色。藉由CD3和CAR信號鑒定CAR-T細胞。對於系列共培養測定，然後以相同的E : T比率用新鮮U937靶細胞再次攻擊剩餘T細胞。進行共培養，直到腫瘤細胞長得超出孔體積。每個時間點的T細胞增殖率藉由將該時間點的T細胞數除以T細胞的初始數來計算。
各種CAR-T細胞在重複腫瘤刺激測定中的殺傷功效顯示於圖11中。CLL1 BM CAR-T細胞在再次攻擊第15天後不能殺死靶腫瘤細胞，而CLL1-共CD33 CAR-T和CLL1-共CD33-2 CAR-T細胞持續殺死靶腫瘤細胞至腫瘤刺激的第20天。此外，CLL1-共CD33 CAR-T和CLL1-共CD33-2 CAR-T細胞在體外增殖並表現出比CLL1 BM CAR-T細胞更好的長期擴增（圖12）。該等結果表明，嵌合TLR可以提供有效的共刺激信號，在CAR傳訊的背景下增強T細胞存活並增加T細胞增殖。
實施例5：CLL1-共CD33 CAR-T體內小鼠模型的評價
根據圖13中所示的方案，在U937-Luc異種移植小鼠模型中體內評估了裝甲的TLR CAR-T細胞的抗腫瘤活性。在第0天，將2 × 10
6個具有螢火蟲螢光素酶報告基因表現的U937-Luc細胞皮下植入NOD/SCID IL-2RγCnull（NSG）小鼠中。腫瘤接種後每週或每兩週進行生物發光成像（BLI），以監測模型的發展。基於BLI光子數和動物體重對動物進行隨機分組。隨機分組後，靜脈內輸注單一劑量的CAR-T細胞或UnT細胞。每週進行BLI成像以記錄腫瘤生長。生物發光成像（BLI）顯示，與CLL1 BM CAR T和CLL1/CD33雙CAR T細胞相比，在輸注了TLR裝甲的CAR T細胞的小鼠中存在降低的腫瘤負荷（圖14）。一致地，與CLL1 BM CAR和CLL1/CD33雙CAR T細胞相比，在用TLR裝甲的CAR T細胞處理的小鼠中，CAR T細胞在外周血單核細胞（PBMC）中的百分比顯著更高（圖14）。因此，CLL1-共CD33 CAR-T比CLL1 BM或CLL1/CD33雙CAR T細胞在體內殺傷U937-GL細胞方面更有效。
實施例6：CLL1-共CD33 CAR- γδ T的評價
γδT（γδT）淋巴細胞主要在胸腺中發育，並藉由V(D)J重組產生其γδ T細胞受體，並且為快速功能做好準備，包括對癌細胞的細胞毒性。γδ T細胞的另一個潛在優勢係，與αβ T細胞不同，它們不局限於MHC，因此利用表現CAR轉基因的工程化同種異體供體來源的γδ T細胞理論上可以用作現成的通用產品，儘管這種應用將限於免疫功能非常低下的患者。因此，我們還評估了TLR裝甲的CAR（例如，CLL1-共CD33和CLL1-共CD33-2）修飾的γδ T的功效。
如實施例5所述，在U937-Luc異種移植小鼠模型中評價CLL1-共CD33 CAR γδ T細胞的體內功效。如圖15所示，在所有小鼠中，用CLL1-共CD33 CAR γδ T處理的小鼠顯示持續的U937腫瘤清除。然而，CLL1 BM CAR和CLL1/CD33雙CAR γδ T組都經歷腫瘤復發。一致地，與CLL1 BM CAR和CLL1/CD33雙CAR γδ T細胞相比，在用CLL1-共CD33或CLL1-共CD33-2 CAR γδ T細胞處理的小鼠中，CAR γδ T細胞在外周血單核細胞（PBMC）中的百分比顯著更高。
實施例7：表現外源引入的GPC3和NKG2D CD8 TLR4嵌合受體的CAR γδ T細胞的製備
此實施例顯示了表現外源引入的NKG2D CD8 TLR4嵌合受體的示例性裝甲的CAR γδ T細胞的構建。特別地，此實施例顯示了表現GPC3的CAR γδ T細胞的構建。
7.1.嵌合抗原受體（CAR）的構建
為了構建抗GPC3裝甲的NKG2D TLR4嵌合受體（SEQ ID NO: 57），對編碼CAR骨架多肽的CAR骨架序列進行密碼子優化和化學合成，該CAR骨架多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗GPC3 scFv（SEQ ID NO: 55）、CD8α鉸鏈結構域（SEQ ID NO: 7）、CD8跨膜（TM）結構域（SEQ ID NO: 8）、4-1BB分子（SEQ ID NO: 9）的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域（SEQ ID NO: 10）。對NKG2D TLR4嵌合受體的序列進行密碼子優化和化學合成，該NKG2D TLR4嵌合受體從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、NKG2D ECD（SEQ ID NO: 51）、TLR4跨膜（TM）區（SEQ ID NO: 12）和TLR4的胞內部分（SEQ ID NO: 13），並經由P2A切割位點（SEQ ID NO: 24）連接至CAR骨架序列。
為了構建抗GPC3裝甲的NKG2D CD8 TLR4嵌合受體（SEQ ID NO: 58），對編碼CAR骨架多肽的CAR骨架序列進行密碼子優化和化學合成，該CAR骨架多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗GPC3 scFv（SEQ ID NO: 55）、CD8α鉸鏈結構域（SEQ ID NO: 7）、CD8跨膜（TM）結構域（SEQ ID NO: 8）、4-1BB分子（SEQ ID NO: 9）的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域（SEQ ID NO: 10）。還對NKG2D CD8 TLR4嵌合受體的序列進行密碼子優化和化學合成，該NKG2D CD8 TLR4嵌合受體從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、NKG2D ECD（SEQ ID NO: 51）、CD8α鉸鏈（SEQ ID NO: 7）、TLR4跨膜（TM）區（SEQ ID NO: 12）和TLR4的胞內部分（SEQ ID NO: 13），並經由P2A切割位點（SEQ ID NO: 24）連接至CAR骨架序列。此構建體顯示於圖16A中。
將CAR骨架和NKG2D TLR4/ NKG2D CD8 TLR4嵌合受體選殖到慢病毒載體（例如，第二代慢病毒載體）中，下游並可操作地連接至組成型hEF1α啟動子用於體外轉錄。參考如Blood (2006) 108 (12): 3890-3897中所示例的，產生瞬時逆轉錄病毒上清液。
還如上所述製備了編碼抗GPC3 CAR（GPC3 CAR）的構建體用於比較分析（SEQ ID NO: 56）。
7.2.病毒製備
如實施例1所述製備慢病毒。
7.3. γδ T細胞的轉導
藉由向PBMC中添加5 μM唑來膦酸鹽和1000 IU/mL IL-2來製備γδ T細胞，並培養9天，定期更換補充有1000 IU/mL IL-2的培養基。可替代地，從PBMC或臍帶血（UCB）中分離γδ T細胞，然後用抗γδ TCR抗體和抗CD3（OKT3）刺激，隨後以1 : 2的比率與基於K562的人工抗原呈遞細胞（aAPC）共孵育至少10天。
藉由密度離心（lymphoprep）從白血球去除術材料中分離PBMC並冷凍保存。將PBMC復蘇並在補充有IL-2（1000 IU/ml）和5%人AB血清的細胞培養基AIM-V中用唑來膦酸（5 μΜ）活化，並且保存在加濕室（37°C，5% CO
2）中。活化後48小時，在MOI為5且存在5 pg/ml聚凝胺下，用編碼實施例1的系統的慢病毒載體轉導細胞。第二天重複這種轉導程序，隨後在轉導後第二天補充含有IL-2（1000 IU/ml）的新鮮培養基。在加濕室中在補充有IL-2（1000 IU/ml）的AIM-V中培養細胞，培養基的定期更換取決於培養基的pH，以進一步擴增。轉導後10天收穫細胞，並確定細胞的總數、純度和轉導效率。在將來應用或冷凍保存之前，用陰性TCRγ/δ
+T細胞分離套件（Miltenyi Biotec）進一步富集細胞。
實施例8：用NKG2D CD8 TLR4嵌合受體裝甲的抗GPC3 CAR γδ T細胞的體外細胞毒性測定
此實施例顯示了用NKG2D CD8 TLR4嵌合受體裝甲的抗GPC3 CAR γδ T細胞的體外抗腫瘤活性。
8.1 長期共培養測定
為了評價CAR γδ T細胞的長期殺傷功效，我們進行了長期共培養測定，其模擬體內的動態殺傷過程。在不存在外源細胞介素（IL-2）的情況下，將轉導或未轉導的T細胞（1 × 10
5個/孔）與腫瘤細胞系（Huh7細胞，1 × 10
5個/孔）以1 : 1的E : T比率在24孔板中共培養。2或3天的共培養後，收穫該等細胞中的一部分並針對CD3進行染色。對於系列共培養測定，然後以相同的E : T比率用新鮮Huh7細胞再次攻擊剩餘T細胞。進行共培養，直到腫瘤細胞長得超出。每個時間點的T細胞增殖率藉由將該時間點的T細胞數除以前一時間點的T細胞數來計算。
藉由FACS檢測的長期共培養測定的代表性結果顯示於圖19中。來自相同實驗的經計算的T細胞增殖顯示於圖20中。數據表明NKG2D CD8 TLR4嵌合受體裝甲的抗GPC3 CAR γδ T細胞比抗GPC3 CAR γδ T細胞具有更好的細胞毒性和體外增殖。
8.2 藉由HTRF檢測的IFN-γ分泌
效應T細胞活化和增殖的另一個量度係效應細胞介素如IFN-γ的產生。收集來自第1輪至第3輪體外細胞毒性測定的上清液，以評估CAR誘導的細胞介素釋放。根據製造商手冊進行IFN-γ（Cisbio，目錄號62HIFNGPEH）的HTRF測定。
相應的細胞介素釋放結果顯示於圖21中。兩種抗GPC3 γδ CAR T細胞都表現出針對Huh7細胞的有效殺傷活性，並反應於Huh7細胞而釋放IFN-γ。用NKG2D CD8 TLR4嵌合受體裝甲的CAR T細胞比裸CAR T細胞顯示更高水平的IFN-γ分泌。
實施例9：表現外源引入的CD19和NKG2D CD8 TLR4嵌合受體的CAR αβ T細胞的製備
此實施例顯示了表現外源引入的NKG2D CD8 TLR4嵌合受體的示例性裝甲的CAR αβ T細胞的構建。特別地，此實施例顯示了表現CD19的CAR αβ T細胞的構建。
9.1.嵌合抗原受體（CAR）的構建
為了構建抗CD19裝甲的NKG2D TLR4嵌合受體（SEQ ID NO: 59），對編碼CAR骨架多肽的CAR骨架序列進行密碼子優化和化學合成，該CAR骨架多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗CD19 scFv（SEQ ID NO: 6）、CD8α鉸鏈結構域（SEQ ID NO: 7）、CD8跨膜（TM）結構域（SEQ ID NO: 8）、4-1BB分子（SEQ ID NO: 9）的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域（SEQ ID NO: 10）。還對NKG2D TLR4嵌合受體的序列進行密碼子優化和化學合成，該NKG2D TLR4嵌合受體從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、NKG2D ECD（SEQ ID NO: 51）、TLR4跨膜（TM）區（SEQ ID NO: 12）和TLR4的胞內部分（SEQ ID NO: 13），並經由P2A切割位點（SEQ ID NO: 24）連接至CAR骨架序列。
為了構建抗CD19裝甲的NKG2D CD8 TLR4嵌合受體（SEQ ID NO: 60），對編碼CAR骨架多肽的CAR骨架序列進行密碼子優化和化學合成，該CAR骨架多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗CD19 scFv（SEQ ID NO: 6）、CD8α鉸鏈結構域（SEQ ID NO: 7）、CD8跨膜（TM）結構域（SEQ ID NO: 8）、4-1BB分子（SEQ ID NO: 9）的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域（SEQ ID NO: 10）。還對NKG2D CD8 TLR4嵌合受體的序列進行密碼子優化和化學合成，該NKG2D CD8 TLR4嵌合受體從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、NKG2D ECD（SEQ ID NO: 51）、CD8α鉸鏈（SEQ ID NO: 7）、TLR4跨膜（TM）區（SEQ ID NO: 12）和TLR4的胞內部分（SEQ ID NO: 13），並經由P2A切割位點（SEQ ID NO: 24）連接至CAR骨架序列。此構建體顯示於圖16A中。
將CAR骨架和NKG2D TLR4/ NKG2D CD8 TLR4嵌合受體選殖到慢病毒載體（例如，第二代慢病毒載體）中，下游並可操作地連接至組成型hEF1α啟動子用於體外轉錄。參考如Blood (2006) 108 (12): 3890-3897中所示例的，產生瞬時逆轉錄病毒上清液。
還如上所述製備了編碼抗CD19 CAR（CD19 BM CAR）的構建體用於比較分析（SEQ ID NO: 2）。
9.2. T細胞的病毒製備和轉導
如實施例1所述製備慢病毒。根據實施例1中描述之方法收集T細胞淋巴細胞並用慢病毒轉導。
實施例10：用NKG2D CD8 TLR4嵌合受體裝甲的抗CD19 CAR αβ T細胞的體外細胞毒性測定
此實施例顯示了用NKG2D CD8 TLR4嵌合受體裝甲的抗CD19 CAR αβ T細胞的體外抗腫瘤活性。
長期共培養測定
為了評價CAR αβ T細胞的長期殺傷功效，我們進行了長期共培養測定。在不存在外源細胞介素（IL-2）的情況下，將轉導或未轉導的T細胞（1 × 10
5個/孔）與腫瘤細胞系（Raji細胞，1 × 10
5個/孔）以1 : 1的E : T比率在24孔板中共培養。2或3天的共培養後，收穫該等細胞中的一部分並針對CD3進行染色。
對於系列共培養測定，然後以相同的E : T比率用新鮮Raji細胞再次攻擊剩餘T細胞。進行共培養，直到腫瘤細胞長得超出。每個時間點的T細胞增殖率藉由將該時間點的T細胞數除以前一時間點的T細胞數來計算。
藉由FACS檢測的長期共培養測定的代表性結果顯示於圖22中。來自相同實驗的經計算的T細胞增殖顯示於圖23中。數據表明NKG2D CD8 TLR4嵌合受體裝甲提高了抗CD19 CAR αβ T細胞的細胞毒性和增殖。
實施例11：用NKG2D CD8 TLR4嵌合受體裝甲的抗GPC3 CAR γδ T細胞的體內功效評價
此實施例顯示了用NKG2D CD8 TLR4嵌合受體裝甲的抗GPC3 CAR γδ T細胞的體內抗腫瘤活性。
在Huh7異種移植模型中評估了示例性抗GPC3 CAR-γδ T細胞的體內抗腫瘤活性。簡言之，在第0天，將3百萬（3 × 10
6）個Huh7細胞皮下植入NOD/SCID IL-2RγC null（NSG）小鼠中。腫瘤接種後十天，將小鼠進行如下處理：靜脈內注射1 × 10
6個裝甲的CAR-γδ T或模擬T細胞或磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）。每週兩次用卡尺測量腫瘤尺寸，並使用公式V = 1/2（長 × 寬
2）計算腫瘤體積。當對照小鼠的平均腫瘤負荷達到2,000 mm
3時，將小鼠安樂死。
在Huh7異種移植模型中，抗GPC3 CAR γδT細胞或用NKG2D CD8 TLR4嵌合受體裝甲的抗GPC3 CAR γδT細胞的抗腫瘤效果的結果顯示於圖24中。未裝甲的CAR-γδ T細胞和NKG2D CD8 TLR4嵌合受體裝甲的CAR-γδ T細胞一起抑制腫瘤生長。具體地，未裝甲的CAR-γδ T細胞處理的小鼠達到無腫瘤，但被緩慢排斥，而NKG2D CD8 TLR4嵌合受體裝甲的CAR-γδ T細胞處理的小鼠達到無腫瘤並保持健康和無腫瘤，直到實驗觀察結束。
實施例12：具有串聯、單個抗BCMA sdAb或抗GPRC5D scFv的表現外源引入的toll樣受體4（TLR4）細胞內結構域的CAR-T細胞的製備
此實施例顯示了表現外源引入的toll樣受體（TLR）結構域的示例性裝甲的CAR-T細胞的構建。特別地，此實施例顯示了具有串聯、單個sdAb或抗GPRC5D scFv的抗BCMA CAR-T細胞的構建。
12.1.嵌合抗原受體（CAR）的構建
為了構建串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR（SEQ ID NO: 61），對編碼CAR骨架多肽的CAR骨架序列進行密碼子優化和化學合成，該CAR骨架多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、串聯抗BCMA sdAb（SEQ ID NO: 44）、CD8α鉸鏈結構域（SEQ ID NO: 7）、CD8α跨膜（TM）結構域（SEQ ID NO: 8）、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域（SEQ ID NO: 9）的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域（SEQ ID NO: 10）。還對誘導型共刺激分子的序列進行密碼子優化和化學合成，該誘導型共刺激分子從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、串聯抗BCMA sdAb（SEQ ID NO: 44）、TLR4跨膜（TM）區（SEQ ID NO: 12）和TLR4的胞內部分（SEQ ID NO: 13），並經由P2A切割位點（SEQ ID NO: 24）連接至CAR骨架序列。
為了構建單個抗BCMA-共抗BCMA CAR（SEQ ID NO: 62），對編碼CAR骨架多肽的CAR骨架序列進行密碼子優化和化學合成，該CAR骨架多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗BCMA sdAb（SEQ ID NO: 68）、CD8α鉸鏈結構域（SEQ ID NO: 7）、CD8α跨膜（TM）結構域（SEQ ID NO: 8）、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域（SEQ ID NO: 9）的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域（SEQ ID NO: 10）。還對誘導型共刺激分子的序列進行密碼子優化和化學合成，該誘導型共刺激分子從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗BCMA sdAb（SEQ ID NO: 69）、TLR4跨膜（TM）區（SEQ ID NO: 12）和TLR4的胞內部分（SEQ ID NO: 13），並經由P2A切割位點（SEQ ID NO: 24）連接至CAR骨架序列。
為了構建單個抗BCMA-共抗BCMA-CD8 CAR（SEQ ID NO: 63），對編碼CAR骨架多肽的CAR骨架序列進行密碼子優化和化學合成，該CAR骨架多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗BCMA sdAb（SEQ ID NO: 68）、CD8α鉸鏈結構域（SEQ ID NO: 7）、CD8α跨膜（TM）結構域（SEQ ID NO: 8）、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域（SEQ ID NO: 9）的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域（SEQ ID NO: 10）。還對誘導型共刺激分子的序列進行密碼子優化和化學合成，該誘導型共刺激分子從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗BCMA sdAb（SEQ ID NO: 69）、CD8α鉸鏈結構域（SEQ ID NO: 7）、TLR4跨膜（TM）區（SEQ ID NO: 12）和TLR4的胞內部分（SEQ ID NO: 13），並經由P2A切割位點（SEQ ID NO: 24）連接至CAR骨架序列。
為了構建單個抗BCMA-共抗BCMA-CD28 CAR（SEQ ID NO: 64），對編碼CAR骨架多肽的CAR骨架序列進行密碼子優化和化學合成，該CAR骨架多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗BCMA sdAb（SEQ ID NO: 68）、CD8α鉸鏈結構域（SEQ ID NO: 7）、CD8α跨膜（TM）結構域（SEQ ID NO: 8）、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域（SEQ ID NO: 9）的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域（SEQ ID NO: 10）。還對誘導型共刺激分子的序列進行密碼子優化和化學合成，該誘導型共刺激分子從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗BCMA sdAb（SEQ ID NO: 69）、CD28鉸鏈結構域（SEQ ID NO: 15）、TLR4跨膜（TM）區（SEQ ID NO: 12）和TLR4的胞內部分（SEQ ID NO: 13），並經由P2A切割位點（SEQ ID NO: 24）連接至CAR骨架序列。
為了構建串聯抗BCMA-共抗GPRC5D CAR（SEQ ID NO: 65），對編碼CAR骨架多肽的CAR骨架序列進行密碼子優化和化學合成，該CAR骨架多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、串聯抗BCMA sdAb（SEQ ID NO: 44）、CD8α鉸鏈結構域（SEQ ID NO: 7）、CD8α跨膜（TM）結構域（SEQ ID NO: 8）、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域（SEQ ID NO: 9）的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域（SEQ ID NO: 10）。還對誘導型共刺激分子的序列進行密碼子優化和化學合成，該誘導型共刺激分子從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗GPRC5D scFv（SEQ ID NO: 70）、TLR4跨膜（TM）區（SEQ ID NO: 12）和TLR4的胞內部分（SEQ ID NO: 13），並經由P2A切割位點（SEQ ID NO: 24）連接至CAR骨架序列。
為了構建串聯抗BCMA-共抗GPRC5D-CD8 CAR（SEQ ID NO: 72），對編碼CAR骨架多肽的CAR骨架序列進行密碼子優化和化學合成，該CAR骨架多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、串聯抗BCMA sdAb（SEQ ID NO: 44）、CD8α鉸鏈結構域（SEQ ID NO: 7）、CD8α跨膜（TM）結構域（SEQ ID NO: 8）、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域（SEQ ID NO: 9）的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域（SEQ ID NO: 10）。還對誘導型共刺激分子的序列進行密碼子優化和化學合成，該誘導型共刺激分子從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗GPRC5D scFv（SEQ ID NO: 70）、CD8α鉸鏈結構域（SEQ ID NO: 7）、TLR4跨膜（TM）區（SEQ ID NO: 12）和TLR4的胞內部分（SEQ ID NO: 13），並經由P2A切割位點（SEQ ID NO: 24）連接至CAR骨架序列。
為了構建串聯抗BCMA-共抗GPRC5D-CD28 CAR（SEQ ID NO: 73），對編碼CAR骨架多肽的CAR骨架序列進行密碼子優化和化學合成，該CAR骨架多肽從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、串聯抗BCMA sdAb（SEQ ID NO: 44）、CD8α鉸鏈結構域（SEQ ID NO: 7）、CD8α跨膜（TM）結構域（SEQ ID NO: 8）、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域（SEQ ID NO: 9）的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域（SEQ ID NO: 10）。還對誘導型共刺激分子的序列進行密碼子優化和化學合成，該誘導型共刺激分子從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗GPRC5D scFv（SEQ ID NO: 70）、CD28鉸鏈結構域（SEQ ID NO: 15）、TLR4跨膜（TM）區（SEQ ID NO: 12）和TLR4的胞內部分（SEQ ID NO: 13），並經由P2A切割位點（SEQ ID NO: 24）連接至CAR骨架序列。
將CAR骨架和共刺激分子選殖到慢病毒載體（例如，第二代慢病毒載體）中，下游並可操作地連接至組成型hEF1α啟動子用於體外轉錄。參考如
Blood(2006) 108 (12): 3890-3897中所示例的，產生瞬時逆轉錄病毒上清液。
分別地，構建串聯抗BCMA CAR（SEQ ID NO: 66）和單個抗BCMA CAR（SEQ ID NO: 67），從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、串聯抗BCMA sdAb（SEQ ID NO: 44）或第一單個抗BCMA sdAb（SEQ ID NO: 68）、CD8α鉸鏈結構域（SEQ ID NO: 7）、CD8α跨膜（TM）結構域（SEQ ID NO: 8）、4-1BB共刺激傳訊結構域（SEQ ID NO: 9）和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域（SEQ ID NO: 10），如上所述製備並用於比較分析。
12.2. CAR-T細胞的構建
病毒製備
如實施例1所述製備慢病毒。
γδT細胞的活化
藉由向PBMC中添加5 μM唑來膦酸鹽和1000 IU/mL IL-2來製備γδ T細胞，並培養14天，定期更換補充有1000 IU/mL IL-2的培養基。可替代地，從PBMC或臍帶血（UCB）中分離γδ T細胞，然後用抗γδ TCR抗體和抗CD3（OKT3）刺激，隨後以1 : 2的比率與基於K562的人工抗原呈遞細胞（aAPC）共孵育至少10天。
藉由密度離心（lymphoprep）從白血球去除術材料中分離PBMC並冷凍保存。將PBMC復蘇並在補充有IL-2（1000 IU/ml）和5%人AB血清的細胞培養基AIM-V中用唑來膦酸（5 μΜ）活化，並且保存在加濕室（37°C，5% CO
2）中。活化後48小時，在MOI為2且存在5 pg/ml聚凝胺下，用編碼此實施例的系統的慢病毒載體轉導細胞。在加濕室中在補充有IL-2（1000 IU/ml）的AIM-V中培養細胞，培養基的定期更換取決於培養基的pH，以進一步擴增。轉導後10天收穫細胞，並確定細胞的總數、純度和轉導效率。在將來應用或冷凍保存之前，用陰性TCRγ/δ
+T細胞分離套件（Miltenyi Biotec）進一步富集細胞。
T細胞的病毒轉導
藉由單採自健康供體收集白血球。使用FICOLL-PAQUE
™PLUS培養基分離外周血單核細胞（PBMC），並且使用Pan T細胞分離套件（Miltenyi）從PMBC中純化人T細胞。隨後將純化的T細胞用人T細胞活化/擴增套件（Miltenyi）預活化48小時。預活化後，以1 : 2的珠與細胞比率添加抗CD3/CD28 MACSiBead
TM粒子以擴增T細胞。
在8 µg/mL聚凝胺存在下將預先活化的T細胞用慢病毒轉導。將細胞在6孔組織培養板中以4 × 10
6個T細胞/孔培養，在37°C下持續大約48小時。將轉導的細胞離心，除去上清液，並將沈澱的細胞以0.5 × 10
6個細胞/mL重懸於補充有300 IU/ml IL-2的新鮮培養基中用於培養。每2至3天將細胞濃度調節至0.5 × 10
6個細胞/mL。
藉由兔抗sdAb與CAR培養的細胞來檢測T細胞上的CAR表現，以檢測細胞表面sdAb。
實施例13：體外細胞毒性
此實施例顯示了抗BCMA-共抗BCMA CAR-T細胞的體外抗腫瘤活性。
13.1 乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性
為了在體外快速評價工程化T細胞（例如，抗BCMA CAR-γδT和抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT細胞）的抗腫瘤活性，進行了細胞毒性的乳酸脫氫酶（LDH）測定。在轉導後的第7天，收穫串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR（SEQ ID NO: 61）和單個抗BCMA-共抗BCMA CAR（SEQ ID NO: 62）轉導的γδT細胞，並分別與靶細胞（表現BCMA的NCI-H929或RPMI-8226腫瘤細胞）以0.25 : 1、0.125 : 1、0.0625 : 1、0.03125 : 1和0 : 1的E/T比率（效應物: CAR-T/靶比率）共孵育20小時。將串聯抗BCMA CAR（SEQ ID NO: 66）和單個抗BCMA CAR（SEQ ID NO: 67）轉導的γδT細胞都用作陽性對照，來自同一批次的未轉導的γδT細胞（「Un-γδT」）用作陰性對照。按照製造商手冊（Roche）進行測定。
體外細胞毒性藉由以下公式計算（[LDH]
E+T：從E/T共孵育釋放的LDH，[LDH]
E：僅從效應物釋放的LDH，[LDH]
max：從用Triton X-100處理的靶細胞釋放的LDH，[LDH]
min：從未處理的靶細胞釋放的LDH）：
所有測試的CAR構建體都有效轉導了人γδT細胞，CAR表現率在25%和80%之間。在同一批次的實驗中，相對於未轉導的T細胞，轉導的細胞的細胞生長和生存力沒有受到影響。如圖26所示，對照串聯或單個CAR-γδT和串聯或單個抗BCMA-共抗BCMA-CAR-γδT細胞在體外以劑量依賴性方式對測試的NCI-H929和RPMI-8226腫瘤細胞都誘導靶細胞裂解。此外，對於串聯和單個設計，抗BCMA-共抗BCMA-CAR-γδT細胞表現出比抗BCMA CAR-γδT更強的針對靶細胞的細胞毒性。
13.2 藉由均相時間分辨螢光（HTRF）的細胞介素分泌
效應γδT細胞活化的另一個量度係效應細胞介素如IFN-γ、TNF-α和GM-CSF的產生。收集來自體外細胞毒性測定的上清液以評估CAR誘導的細胞介素釋放，並且根據製造商手冊進行IFN-γ、TNF-α和GM-CSF（Cisbio）的均相時間分辨螢光（HTRF）測定。
將CAR-γδT細胞（例如，單個/串聯抗BCMA CAR-γδT和單個/串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT細胞和未轉導的γδT細胞）與NCI-H929或RPMI-8226靶細胞共培養。20 h後收集培養上清液以評估IFN-γ、TNF-α和GM-CSF的釋放，作為γδT細胞活化的量度。如圖27所示，與靶腫瘤細胞共培養的單個抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT細胞和串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT細胞分泌顯著量的IFN-γ、TNF-α和GM-CSF，類似於單個和串聯sdAb設計的抗BCMA-CAR-γδT細胞。這表明添加抗BCMA-共CAR不影響CAR介導的抗腫瘤細胞毒性。最有可能的是，TLR4傳訊有助於增強靶接合後CAR-γδT細胞的持久性。為了測試這一假設，使該等細胞經受如下所述之長期共培養測定。
13.3 長期共培養測定
為了評價抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT和抗BCMA-共抗GPRC5D CAR-γδT細胞的長期殺傷功效和持久性，進行了長期共培養測定以模擬體內的動態殺傷過程。在不存在外源細胞介素（例如，IL-2）的情況下，將轉導的（例如，串聯抗BCMA CAR-γδT、串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT細胞、單個抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT細胞、單個抗BCMA-共抗BCMA-CD8 CAR-γδT細胞、單個抗BCMA-共抗BCMA-CD28 CAR-γδT細胞和串聯抗BCMA-共抗GPRC5D CAR-γδT細胞）或未轉導的（例如，Un-γδT）T細胞（1×10
5個/孔）與NCI-H929靶細胞（4 × 10
5個/孔）以1 : 3的E : T比率在24孔板中共培養。共培養2或3天後，收穫該等細胞中的一部分並針對CD3進行染色。藉由CD3和CAR信號鑒定CAR-γδT細胞。對於系列共培養測定，然後以相同的E : T比率用新鮮NCI-H929靶細胞再次攻擊剩餘γδT細胞。進行共培養，直到腫瘤細胞長得超出孔體積。每個時間點的γδT細胞增殖率藉由將該時間點的γδT細胞數除以γδT細胞的初始數來計算。
各種CAR-T細胞在重複腫瘤刺激測定中的殺傷功效顯示於圖28中。串聯抗BCMA CAR-γδT細胞在4輪腫瘤刺激後耗盡（例如，不能殺死另外的靶腫瘤細胞，如藉由CD3%所測量），而串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT細胞、單個抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT細胞、單個抗BCMA-共抗BCMA-CD8 CAR-γδT細胞、單個抗BCMA-共抗BCMA-CD28 CAR-γδT細胞、串聯抗BCMA-共抗GPRC5D CAR-γδT細胞和串聯抗BCMA-共抗GPRC5D-CD8 CAR-γδT細胞持續殺死靶腫瘤細胞至8輪腫瘤刺激。此外，我們發現串聯抗BCMA-共抗GPRC5D CAR-γδT細胞在體外增殖並表現出比串聯抗BCMA CAR-γδT細胞更好的長期持久性。此外，在8輪重複刺激後，串聯抗BCMA-共抗GPRC5D CAR-γδT細胞、串聯抗BCMA-共抗GPRC5D-CD8 CAR-γδT細胞和單個抗BCMA-共抗BCMA-CD28 CAR-γδT細胞顯示出比串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT細胞好得多的增殖（圖28）。
綜上所述，該等結果表明，TLR4傳訊活化使CAR-T細胞抵抗衰竭，並增強其體外殺死靶腫瘤細胞的能力，由此解決了這類治療劑進展的主要障礙。具體地，我們證明了由串聯或單個抗BCMA sdAb觸發的TLR4傳訊在增強CAR-γδT細胞的抗腫瘤細胞毒性和持久性方面同樣效果良好。此外，可以用抗GPRC5D scFv或不同的鉸鏈設計（如但不限於CD28）進一步改善細胞毒性和持久性。
實施例14：同種異體環境中的體外持久性
此實施例顯示了串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR-T細胞在同種異體環境中的體外持久性。
14.1 三向混合淋巴細胞反應（MLR）測定
為了測試串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT細胞作為同種異體細胞治療的「現成」產品的潛力，我們藉由在同一系統中使用CAR-γδT、HCI-H929腫瘤細胞和同種異體PBMC（使用自體PBMC作為對照）的共培養進行三向MLR測定來模擬體外同種異體環境。具體地，將該等細胞以γδT : PBMC : 腫瘤 = 1 : 60 : 1的比率共培養，初始γδT細胞數量為每孔4 × 10
5個細胞。共培養3、6和9天後，記錄γδT細胞的數量，以確定在同種異體PBMC存在下的增殖。另一方面，在第9天，記錄αβT和NK細胞數量，以確定該等具有同種異體性質的主要效應細胞是否受到γδT細胞的刺激。如圖29所示，在同種異體PBMC的存在下，與串聯抗BCMA CAR-γδT細胞相比，串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT展示出更高的增殖水平。另一方面，非常清楚的是，與對照串聯抗BCMA CAR-γδT細胞相比，串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT細胞的同種異體αβT和NK細胞在此系統中的增殖少得多。
因此，我們證明了配備有配位基誘導的TLR4傳訊的串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT細胞係「現成」同種異體細胞治療劑的可行候選物，因為它甚至在同種異體細胞的存在下也展示出優異的持久性。
實施例15：體內功效和安全性
此實施例顯示了示例性串聯抗BCMA CAR-T細胞和串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR-T細胞在同種異體環境中的體內功效和安全性。
15.1 RPMI-8226異種移植模型中的體內功效和安全性
在RPMI-8226異種移植模型中對示例性串聯抗BCMA CAR-T的抗腫瘤活性進行了體內評估。簡言之，在第0天，將一百萬（1 × 10
6）個穩定表現螢火蟲螢光素酶報告基因的RPMI-8226細胞皮下/靜脈內植入NOD/SCID IL-2RγCnull（NSG）小鼠中。腫瘤接種後十四天，將小鼠進行如下處理：靜脈內注射1 × 10
6個裝甲的CAR- γδT或模擬T細胞或磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）。每週一次藉由生物發光成像（BLI）監測腫瘤進展。此外，經由FACS分析從血液中抽取的血漿監測T細胞增殖。
對於毒性評價，每天觀察臨床症狀，同時每週測量動物的體重和由腫瘤-Luc細胞觸發的螢光強度。每週抽取血液（0.2 mL）用於檢測小鼠的人源化細胞介素譜（IFN-γ、TNF-α和GM-CSF）。
在低腫瘤負荷和每隻小鼠1M CAR-γδT細胞劑量的第一個實驗中，我們發現串聯抗BCMA CAR-γδT和串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT細胞都可以抑制腫瘤生長。然而，很明顯，串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT比串聯抗BCMA CAR-γδT細胞展示出更好的抗腫瘤活性，因為只有用串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT細胞處理的小鼠保持無腫瘤，而另一個實驗組在實驗快結束時復發（圖30）。此外，來自小鼠血液的FACS分析的藥物動力學結果表明，串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT組在外周血中CAR-γδT細胞的擴增比串聯抗BCMA CAR-γδT組高得多，進一步證實了串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT細胞更好的體內功效（圖30）。
在另一個具有較高初始腫瘤負荷和每隻小鼠0.3M CAR-γδT細胞的較低劑量的實驗中，我們發現串聯抗BCMA-共抗GPRC5D-CD8 CAR-γδT細胞仍然能夠分化多發性骨髓瘤腫瘤細胞，由此確立了BCMA和GPRC5D雙標靶的可行性和不同鉸鏈設計（如但不限於CD8）的潛在有用性（圖30）。
此外，在所有測試組之間沒有發現顯著的體重變化。此外，串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT處理的小鼠外周血中的IFN-γ、TNF-α和GM-CSF水平與串聯抗BCMA CAR-γδT處理的小鼠相似。該等發現與在體外共培養測定中得到的觀察結果相當（圖31A和B）。該等結果表明，串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT療法在體內係安全的。
總之，我們在體內多發性骨髓瘤模型中確定了配備有抗BCMA觸發的TLR4傳訊的抗BCMA CAR-γδ T細胞係安全的，並且比單純的第二代抗BCMA CAR-γδ T更有效。
序列表
SEQ ID NO: 1. CD19-共CD20-CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSLVYSDGNTYLSWLQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQATQFPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSITTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHPSYGSGSPNFDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDTIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLLAGCIKYGRGENIYDAFVIYSSQDEDWVRNELVKNLEEGVPPFQLCLHYRDFIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRAGIIFIVLQKVEKTLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRRLRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI
SEQ ID NO: 2. CD19 BM CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 3. CLL1-共CD33 CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVESGGGSVQAGGALSLSCAASGYTVRIDYMGWYRQTPGKGREPVATIASNGGTAYADSVEGRFTISQDNAKNSVYLQMNTLKPGDTAMYYCAAGTWPTLTYFGQGTQVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTYSINCMGWFRQAPGKEREGVAVISTGGGRTDYRDSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAGKTTYPGYGCGLGRSAYNYWGQGTQVTVSSLSVSECHRTALVSGMCCALFLLILLTGVLCHRFHGLWYMKMMWAWLQAKRKPRKAPSRNICYDAFVSYSERDAYWVENLMVQELENFNPPFKLCLHKRDFIPGKWIIDNIIDSIEKSHKTVFVLSENFVKSEWCKYELDFSHFRLFDENNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVNLRAAIKSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGNVFRFNIMGWYRQAPGNQRELVASIDDGGDRSYADSVEGRFTISRENGKKIMYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGLGTYLNGRVSMATNYWGQGTQVTVSSLSCNITLLIVTIVATMLVLAVTVTSLCSYLDLPWYLRMVCQWTQTRRRARNIPLEELQRNLQFHAFISYSGHDSFWVKNELLPNLEKEGMQICLHERNFVPGKSIVENIITCIEKSYKSIFVLSPNFVQSEWCHYELYFAHHNLFHEGSNSLILILLEPIPQYSIPSSYHKLKSLMARRTYLEWPKEKSKRGLFWANLRAAINIKLTEQAKK
SEQ ID NO: 4. CLL1 BM CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVESGGGSVQAGGALSLSCAASGYTVRIDYMGWYRQTPGKGREPVATIASNGGTAYADSVEGRFTISQDNAKNSVYLQMNTLKPGDTAMYYCAAGTWPTLTYFGQGTQVTVSSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 5. 訊息肽（例如，前導序列）
MALPVTALLLPLALLLHAARP
SEQ ID NO: 6. CD19 scFv
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO: 7. CD8α鉸鏈
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
SEQ ID NO: 8. CD8α TM
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
SEQ ID NO: 9. 4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQ ID NO: 10. CD3ζ初級細胞內傳訊結構域
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 11. CD20 scFv
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSLVYSDGNTYLSWLQQRPGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQATQFPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSITTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHPSYGSGSPNFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 12. TLR4 TM
TIIGVSVLSVLVVSVVAVLVY
SEQ ID NO: 13. TLR4初級細胞內傳訊結構域
KFYFHLMLLAGCIKYGRGENIYDAFVIYSSQDEDWVRNELVKNLEEGVPPFQLCLHYRDF
SEQ ID NO: 14. CLL1 sdAb
QVQLVESGGGSVQAGGALSLSCAASGYTVRIDYMGWYRQTPGKGREPVATIASNGGTAYADSVEGRFTISQDNAKNSVYLQMNTLKPGDTAMYYCAAGTWPTLTYFGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 15. CD28α鉸鏈
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP
SEQ ID NO: 16. CD28α TM
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
SEQ ID NO: 17. CD28初級細胞內傳訊結構域
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
SEQ ID NO: 18. CD33 C2結構域sdAb
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAS
GNVFRFNIMGWYRQAPGNQRELVA
SIDDGGDRSYADSVEGRFTISRENGKKIMYLQMNSLKPEDTAVYYCAA
GLGTYLNGRVSMATNYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 19. TLR1 TM
LLIVTIVATMLVLAVTVTSLC
SEQ ID NO: 20. TLR1初級細胞內傳訊結構域
SYLDLPWYLRMVCQWTQTRRRARNIPLEELQRNLQFHAFISYSGHDSFWVKNELLPNLEK
EGMQICLHERNFVPGKSIVENIITCIEKSYKSIFVLSPNFVQSEWCHYELYFAHHNLFHE
GSNSLILILLEPIPQYSIPSSYHKLKSLMARRTYLEWPKEKSKRGLFWANLRAAINIKLT
EQAKK
SEQ ID NO: 21. CD33 V結構域sdAb
EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTYSINCMGWFRQAPGKEREGVAVISTGGGRTDYRDSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAGKTTYPGYGCGLGRSAYNYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 22. TLR2 TM
ALVSGMCCALFLLILLTGVLC
SEQ ID NO: 23. TLR2初級細胞內傳訊結構域
HRFHGLWYMKMMWAWLQAKRKPRKAPSRNICYDAFVSYSERDAYWVENLMVQELENFNPP
SEQ ID NO: 24. P2A
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
SEQ ID NO: 25. GS連接子1
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 26. GS連接子2
GGGGS
SEQ ID NO: 27. GS連接子3
(GS)
nSEQ ID NO: 28. GS連接子4
(GSGGS)
nSEQ ID NO: 29. GS連接子5
(GGGS)
nSEQ ID NO: 30. TLR1
MTSIFHFAIIFMLILQIRIQLSEESEFLVDRSKNGLIHVPKDLSQKTTILNISQNYISELWTSDILSLSKLRILIISHNRIQYLDISVFKFNQELEYLDLSHNKLVKISCHPTVNLKHLDLSFNAFDALPICKEFGNMSQLKFLGLSTTHLEKSSVLPIAHLNISKVLLVLGETYGEKEDPEGLQDFNTESLHIVFPTNKEFHFILDVSVKTVANLELSNIKCVLEDNKCSYFLSILAKLQTNPKLSNLTLNNIETTWNSFIRILQLVWHTTVWYFSISNVKLQGQLDFRDFDYSGTSLKALSIHQVVSDVFGFPQSYIYEIFSNMNIKNFTVSGTRMVHMLCPSKISPFLHLDFSNNLLTDTVFENCGHLTELETLILQMNQLKELSKIAEMTTQMKSLQQLDISQNSVSYDEKKGDCSWTKSLLSLNMSSNILTDTIFRCLPPRIKVLDLHSNKIKSIPKQVVKLEALQELNVAFNSLTDLPGCGSFSSLSVLIIDHNSVSHPSADFFQSCQKMRSIKAGDNPFQCTCELGEFVKNIDQVSSEVLEGWPDSYKCDYPESYRGTLLKDFHMSELSCNITLLIVTIVATMLVLAVTVTSLCSYLDLPWYLRMVCQWTQTRRRARNIPLEELQRNLQFHAFISYSGHDSFWVKNELLPNLEKEGMQICLHERNFVPGKSIVENIITCIEKSYKSIFVLSPNFVQSEWCHYELYFAHHNLFHEGSNSLILILLEPIPQYSIPSSYHKLKSLMARRTYLEWPKEKSKRGLFWANLRAAINIKLTEQAKK
SEQ ID NO: 31. TLR2
MPHTLWMVWVLGVIISLSKEESSNQASLSCDRNGICKGSSGSLNSIPSGLTEAVKSLDLSNNRITYISNSDLQRCVNLQALVLTSNGINTIEEDSFSSLGSLEHLDLSYNYLSNLSSSWFKPLSSLTFLNLLGNPYKTLGETSLFSHLTKLQILRVGNMDTFTKIQRKDFAGLTFLEELEIDASDLQSYEPKSLKSIQNVSHLILHMKQHILLLEIFVDVTSSVECLELRDTDLDTFHFSELSTGETNSLIKKFTFRNVKITDESLFQVMKLLNQISGLLELEFDDCTLNGVGNFRASDNDRVIDPGKVETLTIRRLHIPRFYLFYDLSTLYSLTERVKRITVENSKVFLVPCLLSQHLKSLEYLDLSENLMVEEYLKNSACEDAWPSLQTLILRQNHLASLEKTGETLLTLKNLTNIDISKNSFHSMPETCQWPEKMKYLNLSSTRIHSVTGCIPKTLEILDVSNNNLNLFSLNLPQLKELYISRNKLMTLPDASLLPMLLVLKISRNAITTFSKEQLDSFHTLKTLEAGGNNFICSCEFLSFTQEQQALAKVLIDWPANYLCDSPSHVRGQQVQDVRLSVSECHRTALVSGMCCALFLLILLTGVLCHRFHGLWYMKMMWAWLQAKRKPRKAPSRNICYDAFVSYSERDAYWVENLMVQELENFNPPFKLCLHKRDFIPGKWIIDNIIDSIEKSHKTVFVLSENFVKSEWCKYELDFSHFRLFDENNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVNLRAAIKS
SEQ ID NO: 32. TLR3
MRQTLPCIYFWGGLLPFGMLCASSTTKCTVSHEVADCSHLKLTQVPDDLPTNITVLNLTHNQLRRLPAANFTRYSQLTSLDVGFNTISKLEPELCQKLPMLKVLNLQHNELSQLSDKTFAFCTNLTELHLMSNSIQKIKNNPFVKQKNLITLDLSHNGLSSTKLGTQVQLENLQELLLSNNKIQALKSEELDIFANSSLKKLELSSNQIKEFSPGCFHAIGRLFGLFLNNVQLGPSLTEKLCLELANTSIRNLSLSNSQLSTTSNTTFLGLKWTNLTMLDLSYNNLNVVGNDSFAWLPQLEYFFLEYNNIQHLFSHSLHGLFNVRYLNLKRSFTKQSISLASLPKIDDFSFQWLKCLEHLNMEDNDIPGIKSNMFTGLINLKYLSLSNSFTSLRTLTNETFVSLAHSPLHILNLTKNKISKIESDAFSWLGHLEVLDLGLNEIGQELTGQEWRGLENIFEIYLSYNKYLQLTRNSFALVPSLQRLMLRRVALKNVDSSPSPFQPLRNLTILDLSNNNIANINDDMLEGLEKLEILDLQHNNLARLWKHANPGGPIYFLKGLSHLHILNLESNGFDEIPVEVFKDLFELKIIDLGLNNLNTLPASVFNNQVSLKSLNLQKNLITSVEKKVFGPAFRNLTELDMRFNPFDCTCESIAWFVNWINETHTNIPELSSHYLCNTPPHYHGFPVRLFDTSSCKDSAPFELFFMINTSILLIFIFIVLLIHFEGWRISFYWNVSVHRVLGFKEIDRQTEQFEYAAYIIHAYKDKDWVWEHFSSMEKEDQSLKFCLEERDFEAGVFELEAIVNSIKRSRKIIFVITHHLLKDPLCKRFKVHHAVQQAIEQNLDSIILVFLEEIPDYKLNHALCLRRGMFKSHCILNWPVQKERIGAFRHKLQVALGSKNSVH
SEQ ID NO: 33. TLR4
MMSASRLAGTLIPAMAFLSCVRPESWEPCVEVVPNITYQCMELNFYKIPDNLPFSTKNLDLSFNPLRHLGSYSFFSFPELQVLDLSRCEIQTIEDGAYQSLSHLSTLILTGNPIQSLALGAFSGLSSLQKLVAVETNLASLENFPIGHLKTLKELNVAHNLIQSFKLPEYFSNLTNLEHLDLSSNKIQSIYCTDLRVLHQMPLLNLSLDLSLNPMNFIQPGAFKEIRLHKLTLRNNFDSLNVMKTCIQGLAGLEVHRLVLGEFRNEGNLEKFDKSALEGLCNLTIEEFRLAYLDYYLDDIIDLFNCLTNVSSFSLVSVTIERVKDFSYNFGWQHLELVNCKFGQFPTLKLKSLKRLTFTSNKGGNAFSEVDLPSLEFLDLSRNGLSFKGCCSQSDFGTTSLKYLDLSFNGVITMSSNFLGLEQLEHLDFQHSNLKQMSEFSVFLSLRNLIYLDISHTHTRVAFNGIFNGLSSLEVLKMAGNSFQENFLPDIFTELRNLTFLDLSQCQLEQLSPTAFNSLSSLQVLNMSHNNFFSLDTFPYKCLNSLQVLDYSLNHIMTSKKQELQHFPSSLAFLNLTQNDFACTCEHQSFLQWIKDQRQLLVEVERMECATPSDKQGMPVLSLNITCQMNKTIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLLAGCIKYGRGENIYDAFVIYSSQDEDWVRNELVKNLEEGVPPFQLCLHYRDFIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRAGIIFIVLQKVEKTLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRRLRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI
SEQ ID NO: 34. TLR5
MGDHLDLLLGVVLMAGPVFGIPSCSFDGRIAFYRFCNLTQVPQVLNTTERLLLSFNYIRTVTASSFPFLEQLQLLELGSQYTPLTIDKEAFRNLPNLRILDLGSSKIYFLHPDAFQGLFHLFELRLYFCGLSDAVLKDGYFRNLKALTRLDLSKNQIRSLYLHPSFGKLNSLKSIDFSSNQIFLVCEHELEPLQGKTLSFFSLAANSLYSRVSVDWGKCMNPFRNMVLEILDVSGNGWTVDITGNFSNAISKSQAFSLILAHHIMGAGFGFHNIKDPDQNTFAGLARSSVRHLDLSHGFVFSLNSRVFETLKDLKVLNLAYNKINKIADEAFYGLDNLQVLNLSYNLLGELYSSNFYGLPKVAYIDLQKNHIAIIQDQTFKFLEKLQTLDLRDNALTTIHFIPSIPDIFLSGNKLVTLPKINLTANLIHLSENRLENLDILYFLLRVPHLQILILNQNRFSSCSGDQTPSENPSLEQLFLGENMLQLAWETELCWDVFEGLSHLQVLYLNHNYLNSLPPGVFSHLTALRGLSLNSNRLTVLSHNDLPANLEILDISRNQLLAPNPDVFVSLSVLDITHNKFICECELSTFINWLNHTNVTIAGPPADIYCVYPDSFSGVSLFSLSTEGCDEEEVLKSLKFSLFIVCTVTLTLFLMTILTVTKFRGFCFICYKTAQRLVFKDHPQGTEPDMYKYDAYLCFSSKDFTWVQNALLKHLDTQYSDQNRFNLCFEERDFVPGENRIANIQDAIWNSRKIVCLVSRHFLRDGWCLEAFSYAQGRCLSDLNSALIMVVVGSLSQYQLMKHQSIRGFVQKQQYLRWPEDFQDVGWFLHKLSQQILKKEKEKKKDNNIPLQTVATIS
SEQ ID NO: 35. TLR6
MTKDKEPIVKSFHFVCLMIIIVGTRIQFSDGNEFAVDKSKRGLIHVPKDLPLKTKVLDMSQNYIAELQVSDMSFLSELTVLRLSHNRIQLLDLSVFKFNQDLEYLDLSHNQLQKISCHPIVSFRHLDLSFNDFKALPICKEFGNLSQLNFLGLSAMKLQKLDLLPIAHLHLSYILLDLRNYYIKENETESLQILNAKTLHLVFHPTSLFAIQVNISVNTLGCLQLTNIKLNDDNCQVFIKFLSELTRGSTLLNFTLNHIETTWKCLVRVFQFLWPKPVEYLNIYNLTIIESIREEDFTYSKTTLKALTIEHITNQVFLFSQTALYTVFSEMNIMMLTISDTPFIHMLCPHAPSTFKFLNFTQNVFTDSIFEKCSTLVKLETLILQKNGLKDLFKVGLMTKDMPSLEILDVSWNSLESGRHKENCTWVESIVVLNLSSNMLTDSVFRCLPPRIKVLDLHSNKIKSVPKQVVKLEALQELNVAFNSLTDLPGCGSFSSLSVLIIDHNSVSHPSADFFQSCQKMRSIKAGDNPFQCTCELREFVKNIDQVSSEVLEGWPDSYKCDYPESYRGSPLKDFHMSELSCNITLLIVTIGATMLVLAVTVTSLCIYLDLPWYLRMVCQWTQTRRRARNIPLEELQRNLQFHAFISYSEHDSAWVKSELVPYLEKEDIQICLHERNFVPGKSIVENIINCIEKSYKSIFVLSPNFVQSEWCHYELYFAHHNLFHEGSNNLILILLEPIPQNSIPNKYHKLKALMTQRTYLQWPKEKSKRGLFWANIRAAFNMKLTLVTENNDVKS
SEQ ID NO: 36. TLR7
MVFPMWTLKRQILILFNIILISKLLGARWFPKTLPCDVTLDVPKNHVIVDCTDKHLTEIPGGIPTNTTNLTLTINHIPDISPASFHRLDHLVEIDFRCNCVPIPLGSKNNMCIKRLQIKPRSFSGLTYLKSLYLDGNQLLEIPQGLPPSLQLLSLEANNIFSIRKENLTELANIEILYLGQNCYYRNPCYVSYSIEKDAFLNLTKLKVLSLKDNNVTAVPTVLPSTLTELYLYNNMIAKIQEDDFNNLNQLQILDLSGNCPRCYNAPFPCAPCKNNSPLQIPVNAFDALTELKVLRLHSNSLQHVPPRWFKNINKLQELDLSQNFLAKEIGDAKFLHFLPSLIQLDLSFNFELQVYRASMNLSQAFSSLKSLKILRIRGYVFKELKSFNLSPLHNLQNLEVLDLGTNFIKIANLSMFKQFKRLKVIDLSVNKISPSGDSSEVGFCSNARTSVESYEPQVLEQLHYFRYDKYARSCRFKNKEASFMSVNESCYKYGQTLDLSKNSIFFVKSSDFQHLSFLKCLNLSGNLISQTLNGSEFQPLAELRYLDFSNNRLDLLHSTAFEELHKLEVLDISSNSHYFQSEGITHMLNFTKNLKVLQKLMMNDNDISSSTSRTMESESLRTLEFRGNHLDVLWREGDNRYLQLFKNLLKLEELDISKNSLSFLPSGVFDGMPPNLKNLSLAKNGLKSFSWKKLQCLKNLETLDLSHNQLTTVPERLSNCSRSLKNLILKNNQIRSLTKYFLQDAFQLRYLDLSSNKIQMIQKTSFPENVLNNLKMLLLHHNRFLCTCDAVWFVWWVNHTEVTIPYLATDVTCVGPGAHKGQSVISLDLYTCELDLTNLILFSLSISVSLFLMVMMTASHLYFWDVWYIYHFCKAKIKGYQRLISPDCCYDAFIVYDTKDPAVTEWVLAELVAKLEDPREKHFNLCLEERDWLPGQPVLENLSQSIQLSKKTVFVMTDKYAKTENFKIAFYLSHQRLMDEKVDVIILIFLEKPFQKSKFLQLRKRLCGSSVLEWPTNPQAHPYFWQCLKNALATDNHVAYSQVFKETV
SEQ ID NO: 37. TLR8
VGKYVTELDLSDNFITHITNESFQGLQNLTKINLNHNPNVQHQNGNPGIQSNGLNITDGAFLNLKNLRELLLEDNQLPQIPSGLPESLTELSLIQNNIYNITKEGISRLINLKNLYLAWNCYFNKVCEKTNIEDGVFETLTNLELLSLSFNSLSHVPPKLPSSLRKLFLSNTQIKYISEEDFKGLINLTLLDLSGNCPRCFNAPFPCVPCDGGASINIDRFAFQNLTQLRYLNLSSTSLRKINAAWFKNMPHLKVLDLEFNYLVGEIASGAFLTMLPRLEILDLSFNYIKGSYPQHINISRNFSKLLSLRALHLRGYVFQELREDDFQPLMQLPNLSTINLGINFIKQIDFKLFQNFSNLEIIYLSENRISPLVKDTRQSYANSSSFQRHIRKRRSTDFEFDPHSNFYHFTRPLIKPQCAAYGKALDLSLNSIFFIGPNQFENLPDIACLNLSANSNAQVLSGTEFSAIPHVKYLDLTNNRLDFDNASALTELSDLEVLDLSYNSHYFRIAGVTHHLEFIQNFTNLKVLNLSHNNIYTLTDKYNLESKSLVELVFSGNRLDILWNDDDNRYISIFKGLKNLTRLDLSLNRLKHIPNEAFLNLPASLTELHINDNMLKFFNWTLLQQFPRLELLDLRGNKLLFLTDSLSDFTSSLRTLLLSHNRISHLPSGFLSEVSSLKHLDLSSNLLKTINKSALETKTTTKLSMLELHGNPFECTCDIGDFRRWMDEHLNVKIPRLVDVICASPGDQRGKSIVSLELTTCVSDVTAVILFFFTFFITTMVMLAALAHHLFYWDVWFIYNVCLAKVKGYRSLSTSQTFYDAYISYDTKDASVTDWVINELRYHLEESRDKNVLLCLEERDWDPGLAIIDNLMQSINQSKKTVFVLTKKYAKSWNFKTAFYLALQRLMDENMDVIIFILLEPVLQHSQYLRLRQRICKSSILQWPDNPKAEGLFWQTLRNVVLTENDSRYNNMYVDSIKQY
SEQ ID NO: 38. TLR9
MGFCRSALHPLSLLVQAIMLAMTLALGTLPAFLPCELQPHGLVNCNWLFLKSVPHFSMAAPRGNVTSLSLSSNRIHHLHDSDFAHLPSLRHLNLKWNCPPVGLSPMHFPCHMTIEPSTFLAVPTLEELNLSYNNIMTVPALPKSLISLSLSHTNILMLDSASLAGLHALRFLFMDGNCYYKNPCRQALEVAPGALLGLGNLTHLSLKYNNLTVVPRNLPSSLEYLLLSYNRIVKLAPEDLANLTALRVLDVGGNCRRCDHAPNPCMECPRHFPQLHPDTFSHLSRLEGLVLKDSSLSWLNASWFRGLGNLRVLDLSENFLYKCITKTKAFQGLTQLRKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLVALKELDMHGIFFRSLDETTLRPLARLPMLQTLRLQMNFINQAQLGIFRAFPGLRYVDLSDNRISGASELTATMGEADGGEKVWLQPGDLAPAPVDTPSSEDFRPNCSTLNFTLDLSRNNLVTVQPEMFAQLSHLQCLRLSHNCISQAVNGSQFLPLTGLQVLDLSHNKLDLYHEHSFTELPRLEALDLSYNSQPFGMQGVGHNFSFVAHLRTLRHLSLAHNNIHSQVSQQLCSTSLRALDFSGNALGHMWAEGDLYLHFFQGLSGLIWLDLSQNRLHTLLPQTLRNLPKSLQVLRLRDNYLAFFKWWSLHFLPKLEVLDLAGNQLKALTNGSLPAGTRLRRLDVSCNSISFVAPGFFSKAKELRELNLSANALKTVDHSWFGPLASALQILDVSANPLHCACGAAFMDFLLEVQAAVPGLPSRVKCGSPGQLQGLSIFAQDLRLCLDEALSWDCFALSLLAVALGLGVPMLHHLCGWDLWYCFHLCLAWLPWRGRQSGRDEDALPYDAFVVFDKTQSAVADWVYNELRGQLEECRGRWALRLCLEERDWLPGKTLFENLWASVYGSRKTLFVLAHTDRVSGLLRASFLLAQQRLLEDRKDVVVLVILSPDGRRSRYVRLRQRLCRQSVLLWPHQPSGQRSFWAQLGMALTRDNHHFYNRNFCQGPTAE
SEQ ID NO: 39. TLR10
MRLIRNIYIFCSIVMTAEGDAPELPEERELMTNCSNMSLRKVPADLTPATTTLDLSYNLLFQLQSSDFHSVSKLRVLILCHNRIQQLDLKTFEFNKELRYLDLSNNRLKSVTWYLLAGLRYLDLSFNDFDTMPICEEAGNMSHLEILGLSGAKIQKSDFQKIAHLHLNTVFLGFRTLPHYEEGSLPILNTTKLHIVLPMDTNFWVLLRDGIKTSKILEMTNIDGKSQFVSYEMQRNLSLENAKTSVLLLNKVDLLWDDLFLILQFVWHTSVEHFQIRNVTFGGKAYLDHNSFDYSNTVMRTIKLEHVHFRVFYIQQDKIYLLLTKMDIENLTISNAQMPHMLFPNYPTKFQYLNFANNILTDELFKRTIQLPHLKTLILNGNKLETLSLVSCFANNTPLEHLDLSQNLLQHKNDENCSWPETVVNMNLSYNKLSDSVFRCLPKSIQILDLNNNQIQTVPKETIHLMALRELNIAFNFLTDLPGCSHFSRLSVLNIEMNFILSPSLDFVQSCQEVKTLNAGRNPFRCTCELKNFIQLETYSEVMMVGWSDSYTCEYPLNLRGTRLKDVHLHELSCNTALLIVTIVVIMLVLGLAVAFCCLHFDLPWYLRMLGQCTQTWHRVRKTTQEQLKRNVRFHAFISYSEHDSLWVKNELIPNLEKEDGSILICLYESYFDPGKSISENIVSFIEKSYKSIFVLSPNFVQNEWCHYEFYFAHHNLFHENSDHIILILLEPIPFYCIPTRYHKLKALLEKKAYLEWPKDRRKCGLFWANLRAAINVNVLATREMYELQTFTELNEESRGSTISLMRTDCL
SEQ ID NO: 40. 示例性TLR多肽1（TLR4）
TIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLLAGCIKYGRGENIYDAFVIYSSQDEDWVRNELVKNLEEGVPPFQLCLHYRDFIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRAGIIFIVLQKVEKTLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRRLRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI
SEQ ID NO: 41. 示例性TLR多肽2（TLR2）
LSVSECHRTALVSGMCCALFLLILLTGVLCHRFHGLWYMKMMWAWLQAKRKPRKAPSRNICYDAFVSYSERDAYWVENLMVQELENFNPPFKLCLHKRDFIPGKWIIDNIIDSIEKSHKTVFVLSENFVKSEWCKYELDFSHFRLFDENNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVNLRAAIKS
SEQ ID NO: 42. 示例性TLR多肽3（TLR1）
LSCNITLLIVTIVATMLVLAVTVTSLCSYLDLPWYLRMVCQWTQTRRRARNIPLEELQRNLQFHAFISYSGHDSFWVKNELLPNLEKEGMQICLHERNFVPGKSIVENIITCIEKSYKSIFVLSPNFVQSEWCHYELYFAHHNLFHEGSNSLILILLEPIPQYSIPSSYHKLKSLMARRTYLEWPKEKSKRGLFWANLRAAINIKLTEQAKK
SEQ ID NO: 43. CLL1/CD33雙CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVESGGGSVQAGGALSLSCAASGYTVRIDYMGWYRQTPGKGREPVATIASNGGTAYADSVEGRFTISQDNAKNSVYLQMNTLKPGDTAMYYCAAGTWPTLTYFGQGTQVTVSSGGGGSEVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTYSINCMGWFRQAPGKEREGVAVISTGGGRTDYRDSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAGKTTYPGYGCGLGRSAYNYWGQGTQVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTY
DALHMQALPPRSEQ ID NO: 44. 串聯抗BCMA sdAb
AVQLVESGGGLVQAGDSLRLTCTASGRAFSTYFMAWFRQAPGKEREFVAGIAWSGGSTAYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCASRGIEVEEFGAWGQGTQVTVSSGGGGSQVQLEESGGGSVQAGGSLRLSCAYTYSTYSNYYMGWFREAPGKARTSVAIISSDTTITYKDAVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDSAMYRCAAWTSDWSVAYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 45. GM-CSF訊息肽
MWLQSLLLLGTVACSIS
SEQ ID NO: 46. IL-15訊息肽
MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEA
SEQ ID NO: 47. FLAG標籤
DYKDDDDK
SEQ ID NO: 48. HA標籤
YPYDVPDYA
SEQ ID NO: 49. c-Myc標籤
EQKLISEEDL
SEQ ID NO: 50. CD28 4-1BB細胞內傳訊結構域
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQ ID NO: 51. NKG2D 81-216
SLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
SEQ ID NO: 52. NKG2D 89-216
IPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
SEQ ID NO: 53. NKG2D 98-216
PCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
SEQ ID NO: 54. NKG2D 1-216
MGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
SEQ ID NO: 55. GPC3 scFv
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNANTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 56. 抗GPC3 4-1BB CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKDVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNANTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 57. 用NKG2D TLR4嵌合受體裝甲的抗GPC3 4-1BB CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKDVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNANTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLLAGCIKYGRGENIYDAFVIYSSQDEDWVRNELVKNLEEGVPPFQLCLHYRDFIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRAGIIFIVLQKVEKTLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRRLRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI
SEQ ID NO: 58. 用NKG2D CD8 TLR4嵌合受體裝甲的抗GPC3 4-1BB CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKDVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNANTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDTIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLLAGCIKYGRGENIYDAFVIYSSQDEDWVRNELVKNLEEGVPPFQLCLHYRDFIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRAGIIFIVLQKVEKTLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRRLRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI
SEQ ID NO: 59. 用NKG2D TLR4嵌合受體裝甲的抗CD19 4-1BB CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLLAGCIKYGRGENIYDAFVIYSSQDEDWVRNELVKNLEEGVPPFQLCLHYRDFIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRAGIIFIVLQKVEKTLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRRLRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI
SEQ ID NO: 60. 用NKG2D CD8 TLR4嵌合受體裝甲的抗CD19 4-1BB CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDTIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLLAGCIKYGRGENIYDAFVIYSSQDEDWVRNELVKNLEEGVPPFQLCLHYRDFIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRAGIIFIVLQKVEKTLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRRLRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI
SEQ ID NO: 61. 串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPAVQLVESGGGLVQAGDSLRLTCTASGRAFSTYFMAWFRQAPGKEREFVAGIAWSGGSTAYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCASRGIEVEEFGAWGQGTQVTVSSGGGGSQVQLEESGGGSVQAGGSLRLSCAYTYSTYSNYYMGWFREAPGKARTSVAIISSDTTITYKDAVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDSAMYRCAAWTSDWSVAYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPAVQLVESGGGLVQAGDSLRLTCTASGRAFSTYFMAWFRQAPGKEREFVAGIAWSGGSTAYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCASRGIEVEEFGAWGQGTQVTVSSGGGGSQVQLEESGGGSVQAGGSLRLSCAYTYSTYSNYYMGWFREAPGKARTSVAIISSDTTITYKDAVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDSAMYRCAAWTSDWSVAYWGQGTQVTVSSTSQMNKTIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLLAGCIKYGRGENIYDAFVIYSSQDEDWVRNELVKNLEEGVPPFQLCLHYRDFIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRAGIIFIVLQKVEKTLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRRLRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI
SEQ ID NO: 62. 單個抗BCMA-共抗BCMA CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPAVQLVESGGGLVQAGDSLRLTCTASGRAFSTYFMAWFRQAPGKEREFVAGIAWSGGSTAYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCASRGIEVEEFGAWGQGTQVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLEESGGGSVQAGGSLRLSCAYTYSTYSNYYMGWFREAPGKARTSVAIISSDTTITYKDAVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDSAMYRCAAWTSDWSVAYWGQGTQVTVSSTSQMNKTIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLLAGCIKYGRGENIYDAFVIYSSQDEDWVRNELVKNLEEGVPPFQLCLHYRDFIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRAGIIFIVLQKVEKTLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRRLRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI
SEQ ID NO: 63. 單個抗BCMA-共抗BCMA-CD8 CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPAVQLVESGGGLVQAGDSLRLTCTASGRAFSTYFMAWFRQAPGKEREFVAGIAWSGGSTAYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCASRGIEVEEFGAWGQGTQVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLEESGGGSVQAGGSLRLSCAYTYSTYSNYYMGWFREAPGKARTSVAIISSDTTITYKDAVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDSAMYRCAAWTSDWSVAYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDTIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLLAGCIKYGRGENIYDAFVIYSSQDEDWVRNELVKNLEEGVPPFQLCLHYRDFIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRAGIIFIVLQKVEKTLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRRLRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI
SEQ ID NO: 64. 單個抗BCMA-共抗BCMA-CD28 CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPAVQLVESGGGLVQAGDSLRLTCTASGRAFSTYFMAWFRQAPGKEREFVAGIAWSGGSTAYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCASRGIEVEEFGAWGQGTQVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLEESGGGSVQAGGSLRLSCAYTYSTYSNYYMGWFREAPGKARTSVAIISSDTTITYKDAVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDSAMYRCAAWTSDWSVAYWGQGTQVTVSSTSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPTIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLLAGCIKYGRGENIYDAFVIYSSQDEDWVRNELVKNLEEGVPPFQLCLHYRDFIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRAGIIFIVLQKVEKTLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRRLRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI
SEQ ID NO: 65. 串聯抗BCMA-共抗GPRC5D CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPAVQLVESGGGLVQAGDSLRLTCTASGRAFSTYFMAWFRQAPGKEREFVAGIAWSGGSTAYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCASRGIEVEEFGAWGQGTQVTVSSGGGGSQVQLEESGGGSVQAGGSLRLSCAYTYSTYSNYYMGWFREAPGKARTSVAIISSDTTITYKDAVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDSAMYRCAAWTSDWSVAYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPQSVVTQPPSMSAAPGQQVTISCSGGNSNIERNYVSWYLQLPGTAPKLVIFDNDRRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLRGWVFGGGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAEVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMNWVRQAPGKGLEWVSTINGRGSSTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCARYISRGLGDSWGQGTLVTVTIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLLAGCIKYGRGENIYDAFVIYSSQDEDWVRNELVKNLEEGVPPFQLCLHYRDFIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRAGIIFIVLQKVEKTLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRRLRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI
SEQ ID NO: 66. 串聯抗BCMA CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPAVQLVESGGGLVQAGDSLRLTCTASGRAFSTYFMAWFRQAPGKEREFVAGIAWSGGSTAYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCASRGIEVEEFGAWGQGTQVTVSSGGGGSQVQLEESGGGSVQAGGSLRLSCAYTYSTYSNYYMGWFREAPGKARTSVAIISSDTTITYKDAVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDSAMYRCAAWTSDWSVAYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 67. 單個抗BCMA CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPAVQLVESGGGLVQAGDSLRLTCTASGRAFSTYFMAWFRQAPGKEREFVAGIAWSGGSTAYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCASRGIEVEEFGAWGQGTQVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 68. 第一單個抗BCMA sdAb
AVQLVESGGGLVQAGDSLRLTCTASGRAFSTYFMAWFRQAPGKEREFVAGIAWSGGSTAYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCASRGIEVEEFGAWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 69. 第二單個抗BCMA sdAb
QVQLEESGGGSVQAGGSLRLSCAYTYSTYSNYYMGWFREAPGKARTSVAIISSDTTITYKDAVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDSAMYRCAAWTSDWSVAYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO: 70. 抗GPRC5D scFv
QSVVTQPPSMSAAPGQQVTISCSGGNSNIERNYVSWYLQLPGTAPKLVIFDNDRRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLRGWVFGGGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAEVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMNWVRQAPGKGLEWVSTINGRGSSTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCARYISRGLGDSWGQGTLVTV
SEQ ID NO: 71. CLL1-共CD33-2 CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVESGGGSVQAGGALSLSCAASGYTVRIDYMGWYRQTPGKGREPVATIASNGGTAYADSVEGRFTISQDNAKNSVYLQMNTLKPGDTAMYYCAAGTWPTLTYFGQGTQVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTYSINCMGWFRQAPGKEREGVAVISTGGGRTDYRDSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAGKTTYPGYGCGLGRSAYNYWGQGTQVTVSSQMNKTIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLLAGCIKYGRGENIYDAFVIYSSQDEDWVRNELVKNLEEGVPPFQLCLHYRDFIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRAGIIFIVLQKVEKTLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRRLRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI
SEQ ID NO: 72. 串聯抗BCMA-共抗GPRC5D-CD8 CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPAVQLVESGGGLVQAGDSLRLTCTASGRAFSTYFMAWFRQAPGKEREFVAGIAWSGGSTAYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCASRGIEVEEFGAWGQGTQVTVSSGGGGSQVQLEESGGGSVQAGGSLRLSCAYTYSTYSNYYMGWFREAPGKARTSVAIISSDTTITYKDAVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDSAMYRCAAWTSDWSVAYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPQSVVTQPPSMSAAPGQQVTISCSGGNSNIERNYVSWYLQLPGTAPKLVIFDNDRRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLRGWVFGGGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAEVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMNWVRQAPGKGLEWVSTINGRGSSTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCARYISRGLGDSWGQGTLVTVTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDTTIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLLAGCIKYGRGENIYDAFVIYSSQDEDWVRNELVKNLEEGVPPFQLCLHYRDFIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRAGIIFIVLQKVEKTLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRRLRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI
SEQ ID NO: 73. 串聯抗BCMA-共抗GPRC5D-CD28 CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPAVQLVESGGGLVQAGDSLRLTCTASGRAFSTYFMAWFRQAPGKEREFVAGIAWSGGSTAYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCASRGIEVEEFGAWGQGTQVTVSSGGGGSQVQLEESGGGSVQAGGSLRLSCAYTYSTYSNYYMGWFREAPGKARTSVAIISSDTTITYKDAVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDSAMYRCAAWTSDWSVAYWGQGTQVTVSSTSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPQSVVTQPPSMSAAPGQQVTISCSGGNSNIERNYVSWYLQLPGTAPKLVIFDNDRRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLRGWVFGGGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAEVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMNWVRQAPGKGLEWVSTINGRGSSTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCARYISRGLGDSWGQGTLVTVIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPTIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLLAGCIKYGRGENIYDAFVIYSSQDEDWVRNELVKNLEEGVPPFQLCLHYRDFIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRAGIIFIVLQKVEKTLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRRLRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI
無
[圖1]顯示了包含抗CD19-CAR和抗CD20 TLR多肽（CD19-共CD20 CAR；SEQ ID NO: 1）的CAR融合構建體之雙順反子表現設計。從N-末端到C-末端，CAR骨架的序列符合以下模式：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗CD19 scFv（SEQ ID NO: 6）、CD8α鉸鏈結構域（SEQ ID NO: 7）、CD8α跨膜（TM）結構域（SEQ ID NO: 8）、4-1BB（CD137）共刺激傳訊結構域（SEQ ID NO: 9）的胞內部分和CD3ζ初級細胞內傳訊結構域（SEQ ID NO: 10），其與誘導型共刺激分子連接，該共刺激分子從N-末端到C-末端包含：訊息肽（SEQ ID NO: 5）、抗CD20 scFv（SEQ ID NO: 11）、TLR4跨膜（TM）區（SEQ ID NO: 12）和TLR4的胞內部分（例如，TLR4初級細胞內傳訊結構域）（SEQ ID NO: 13），經由P2A切割位點（SEQ ID NO: 24）。
[圖2]顯示了用TLR4裝甲的CD19 BM CAR-T和CD19-共CD20 CAR-T細胞之體外細胞毒性作用。特別地，圖2顯示CD19 BM CAR-T和CD19-共CD20 CAR T細胞在體外以劑量依賴性方式誘導Raji靶細胞裂解。未轉導的T細胞（即，「unT」）在此實驗中用作對照。
[圖3]顯示了與Raji靶細胞共培養的用TLR4裝甲的CD19 BM CAR-T和CD19-共CD20 CAR-T細胞之體外IFNγ細胞介素切片。未轉導的T細胞（即，「unT」）在此實驗中用作對照。
[圖4]顯示了與Raji靶細胞共培養的用TLR4裝甲的CD19 BM CAR-T和CD19-共CD20 CAR-T細胞之體外TNFα細胞介素切片。未轉導的T細胞（即，「unT」）在此實驗中用作對照。
[圖5]顯示了在用Raji靶細胞進行的重複腫瘤刺激測定中，用TLR4裝甲的CD19 BM CAR-T和CD19-共CD20 CAR-T細胞之體外殺傷功效。未轉導的T細胞（即，「UNT」）在此實驗中用作對照。
[圖6]顯示了與Raji靶細胞一起孵育後，用TLR4裝甲的CD19 BM CAR-T和CD19-共CD20 CAR-T細胞之體外增殖（例如，擴增倍數）。
[圖7]顯示了包含抗CLL1-CAR和抗CD33 TLR多肽（CLL1-共CD33 CAR；SEQ ID NO: 3和CLL1-共CD33-2 CAR-T；SEQ ID NO: 71）的CAR融合構建體之雙順反子表現設計。
[圖8]顯示了用TLR2和TLR1裝甲的CLL1 BM CAR-T、CLL1-共CD33 CAR-T細胞和用TLR4裝甲的CLL1-共CD33-2 CAR-T細胞之體外細胞毒性作用。特別地，圖8顯示CLL1 BM CAR-T、CLL1-共CD33 CAR-T和CLL1-共CD33-2 CAR-T細胞在體外以劑量依賴性方式誘導U937靶細胞裂解。未轉導的T細胞（即，「unT」）在此實驗中用作對照。
[圖9]顯示了與U937靶細胞共培養的用TLR2和TLR1裝甲的CLL1 BM CAR-T、CLL1-共CD33 CAR-T細胞和用TLR4裝甲的CLL1-共CD33-2 CAR-T之體外IFNγ細胞介素切片。未轉導的T細胞（即，「unT」）在此實驗中用作對照。
[圖10]顯示了與U937靶細胞共培養的用TLR2和TLR1裝甲的CLL1 BM CAR-T、CLL1-共CD33 CAR-T細胞和用TLR4裝甲的CLL1-共CD33-2 CAR-T之體外TNFα細胞介素切片。未轉導的T細胞（即，「unT」）在此實驗中用作對照。
[圖11]顯示了在用U937靶細胞進行的重複腫瘤刺激測定中，用TLR2和TLR1裝甲的CLL1 BM CAR-T、CLL1-共CD33 CAR-T細胞和用TLR4裝甲的CLL1-共CD33-2 CAR-T之體外殺傷功效。未轉導的T細胞（即，「UNT」）在此實驗中用作對照。
[圖12]顯示了在與U937靶細胞一起孵育後，用TLR2和TLR1裝甲的CLL1 BM CAR-T、CLL1-共CD33 CAR-T細胞和用TLR4裝甲的CLL1-共CD33-2 CAR-T之體外增殖（例如，擴增倍數）。
[圖13]顯示了在U937-Luc異種移植小鼠模型中，示例性CLL1-共CD33 CAR αβT和CLL1-共CD33 CAR γδT治療的體內功效研究之示意圖。
[圖14]顯示了在U937-Luc異種移植小鼠模型中，CLL1-共CD33 CAR αβT細胞之體內功效。
[圖15]顯示了在U937-Luc異種移植小鼠模型中，CLL1-共CD33 CAR γδT細胞和CLL1-共CD33-2 CAR γδT細胞之體內功效。
[圖16A-16B]顯示了用NKG2D或突變的NKG2D TLR嵌合受體裝甲的CAR或TCR之示例性構建體。圖16A顯示了用NKG2D或突變的NKG2D TLR嵌合受體裝甲的CAR之示意圖。圖16B顯示了用NKG2D或突變的NKG2D TLR嵌合受體裝甲的TCR之示意圖。
[圖17A-17B]顯示了用嵌合受體裝甲的CAR或TCR之示例性構建體，該嵌合受體包括標靶NKG2D配位基的結合結構域、TLR跨膜結構域和細胞內效應結構域。圖17A顯示了用嵌合受體裝甲的CAR之示意圖，該嵌合受體包括標靶NKG2D配位基的結合結構域、TLR跨膜結構域和細胞內效應結構域。圖17B顯示了用嵌合受體裝甲的TCR之示意圖，該嵌合受體包括標靶NKG2D配位基的結合結構域、TLR跨膜結構域和細胞內效應結構域。
[圖18A-18B]顯示了用NKG2D或突變的NKG2D TLR4嵌合受體裝甲的CAR或TCR之示例性構建體。圖18A顯示了用NKG2D或突變的NKG2D TLR4嵌合受體裝甲之第二代CAR。圖18B顯示了用NKG2D或突變的NKG2D TLR4嵌合受體裝甲之TCR。
[圖19]顯示了在用Huh7靶細胞進行的重複腫瘤刺激測定中，用NKG2D-TLR4或NKG2D-CD8-TLR4嵌合受體裝甲的抗GPC3 CAR-T和抗GPC3 CAR-T細胞之體外殺傷功效。未轉導的T細胞（即，「UNT」）在此實驗中用作對照。
[圖20]顯示了在與Huh7靶細胞一起孵育後，用NKG2D-TLR4或NKG2D-CD8-TLR4嵌合受體裝甲的抗-GPC3 CAR-T和抗-GPC3 CAR-T細胞之體外增殖。
[圖21]顯示了與Huh7靶細胞共培養的用NKG2D-TLR4或NKG2D-CD8-TLR4嵌合受體裝甲的抗-GPC3 CAR-T和抗-GPC3 CAR-T細胞之體外IFNγ細胞介素切片。未轉導的T細胞（即，「UNT」）在此實驗中用作對照。
[圖22]顯示了在用Raji靶細胞進行的重複腫瘤刺激測定中，用NKG2D-TLR4或NKG2D-CD8-TLR4嵌合受體裝甲的抗CD19 CAR-T和抗CD19 CAR-T細胞之體外殺傷功效。未轉導的T細胞（即，「UNT」）在此實驗中用作對照。
[圖23]顯示了在與Raji靶細胞一起孵育後，用NKG2D-TLR4或NKG2D-CD8-TLR4嵌合受體裝甲的抗CD19 CAR-T和抗CD19 CAR-T細胞之體外增殖。
[圖24]顯示了在Huh7異種移植模型中，用NKG2D-CD8-TLR4嵌合受體裝甲的抗GPC3 CAR-T細胞和抗GPC3 CAR-T細胞之體內功效。
[圖25]顯示了CAR融合構建體之雙順反子表現設計，該CAR融合構建體包含串聯抗BCMA-共抗BCMA CAR（SEQ ID NO: 61）或單個抗BCMA-共抗BCMA CAR（SEQ ID NO: 62）、單個抗BCMA-共抗BCMA-CD8 CAR（SEQ ID NO: 63）、單個抗BCMA-共抗BCMA-CD28 CAR（SEQ ID NO: 64），以及串聯抗BCMA-共抗GPRC5D CAR（SEQ ID NO: 65）、串聯抗BCMA-共抗GPRC5D-CD8 CAR（SEQ ID NO: 72）、串聯抗BCMA-共抗GPRC5D-CD28 CAR（SEQ ID NO: 73）。
[圖26]顯示了用TLR4細胞內傳訊裝甲的抗BCMA-CAR-γδT和抗BCMA-共抗BCMA-γδT細胞之體外細胞毒性作用。未轉導的γδT細胞（即，「Un-γδT」）在此實驗中用作對照。
[圖27]顯示了與BCMA陽性NCI-H929靶腫瘤細胞共培養的用TLR4細胞內傳訊裝甲的抗BCMA- CAR-γδT和抗BCMA-共抗BCMA-γδT細胞之體外IFN-γ、TNF-α和GM-CSF細胞介素分泌。未轉導的γδT細胞（即，「Un-γδT」）在此實驗中用作對照。
[圖28]顯示了在用BCMA陽性NCI-H929靶腫瘤細胞進行的重複腫瘤刺激測定中，串聯抗BCMA-CAR-γδT、串聯抗BCMA-共抗BCMA-CAR γδT、單個抗BCMA-共抗BCMA CAR γδT、單個抗BCMA-共抗BCMA-CD8 CAR γδT、單個抗BCMA-共抗BCMA-CD28 CAR γδT、串聯抗BCMA-共抗GPRC5D- CAR γδT和串聯抗BCMA-共抗GPRC5D-CD8 CAR-γδT細胞之體外殺傷功效和持久性。未轉導的γδT細胞（即，「Un-γδT」）在此實驗中用作對照。
[圖29]顯示了用TLR4細胞內傳訊裝甲的串聯抗BCMA-CAR-γδT和串聯抗BCMA-共抗BCMA-γδT細胞在同種異體環境中之持久性，其中γδT細胞、同種異體PBMC和BCMA陽性NCI-H929靶腫瘤細胞以1 : 60 : 1的比率共孵育。
[圖30]顯示了在BCMA陽性RPMI-8226荷瘤異種移植模型中，用TLR4細胞內傳訊裝甲的串聯抗BCMA-CAR-γδT、串聯抗BCMA-共抗BCMA-γδT細胞和串聯抗BCMA-共抗GPRC5D-CD8-γδT細胞之體內殺傷功效和持久性。未轉導的γδT細胞（即，「Un-γδT」）和媒介物HBSS在此實驗中用作對照。
[圖31A-31B]顯示了在BCMA陽性RPMI-8226荷瘤異種移植模型中，用TLR4細胞內傳訊裝甲的串聯抗BCMA-CAR-γδT和串聯抗BCMA-共抗BCMA-γδT細胞的體重變化以及IFN-γ、TNF-α和GM-CSF細胞介素分泌。未轉導的γδT細胞（即，「Un-γδT」）和媒介物HBSS在此實驗中用作對照。
無
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Claims (71)
- 一種經修飾的免疫細胞，其包含： a)第一多肽，其包含：i)第一靶結合結構域，ii)第一TLR跨膜結構域，和iii)第一TLR傳訊結構域；和 b)第二多肽，其包含：i)第二靶結合結構域，ii)第二TLR跨膜結構域，和iii)第二TLR傳訊結構域； 其中在該第一靶結合結構域和第二靶結合結構域與其相應的靶結合時，該第一TLR傳訊結構域和該第二TLR傳訊結構域相互締合以形成能夠誘導TLR傳訊的TLR傳訊部分。
- 如請求項1所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一靶結合結構域和該第二靶結合結構域各自結合多聚體靶分子的亞基。
- 如請求項2所述之經修飾的免疫細胞，其中該多聚體靶分子的亞基相同。
- 如請求項2所述之經修飾的免疫細胞，其中該多聚體靶分子的亞基不同。
- 如請求項1或2所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一靶結合結構域和該第二結合結構域結合相同的靶分子。
- 如請求項5所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一靶結合結構域和該第二結合結構域各自結合該靶分子上的相同靶位點。
- 如請求項1-3和5-6中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一靶結合結構域和該第二靶結合結構域相同。
- 如請求項5所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一靶結合結構域和該第二靶結合結構域各自結合單個靶分子上不同的非重疊靶位點。
- 如請求項1-8中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一TLR跨膜結構域和該第一TLR傳訊結構域衍生自相同TLR分子。
- 如請求項1-9中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該第二TLR跨膜結構域和該第二TLR傳訊結構域衍生自相同TLR分子。
- 如請求項1-10中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一TLR跨膜結構域和該第二TLR跨膜結構域相同。
- 如請求項1-11中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一TLR傳訊結構域和該第二TLR傳訊結構域相同。
- 如請求項11或請求項12所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一TLR跨膜結構域和/或第一TLR傳訊結構域衍生自TLR4。
- 如請求項1-10中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一TLR跨膜結構域和該第二TLR跨膜結構域不同。
- 如請求項1-11和14中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一TLR傳訊結構域和該第二TLR傳訊結構域不同。
- 如請求項14或請求項15所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一TLR跨膜結構域和/或第一TLR傳訊結構域衍生自TLR2。
- 如請求項14或請求項15所述之經修飾的免疫細胞，其中該第二TLR跨膜結構域和/或第二TLR傳訊結構域衍生自TLR6。
- 如請求項14-17中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該第二TLR跨膜結構域和/或第二TLR傳訊結構域衍生自TLR1。
- 如請求項1-18中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一靶結合結構域和/或該第二靶結合結構域係抗體部分或其抗原結合片段。
- 如請求項19所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一靶結合結構域和/或第二靶結合結構域係scFv或sdAb。
- 如請求項20所述之經修飾的免疫細胞，其中該scFv或sdAb特異性結合CD33、CLL1、CD123、CD19、CD20、CD22、BCMA、GPRC5D和GPC3。
- 如請求項5-18中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該靶分子係免疫檢查點蛋白。
- 如請求項22所述之經修飾的免疫細胞，其中該靶分子選自由以下組成之群組：PD-1、CD70、CD27、SIRPα和TIGIT。
- 如請求項5-18中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該靶分子係在免疫細胞上表現的天然蛋白質。
- 如請求項24所述之經修飾的免疫細胞，其中該靶分子係NKG2D。
- 如請求項24或25所述之經修飾的免疫細胞，其中該靶分子係NKG2D的全長序列。
- 如請求項24或25所述之經修飾的免疫細胞，其中該靶分子係突變的NKG2D。
- 如請求項27所述之經修飾的免疫細胞，其中該突變的NKG2D包含截短的序列和/或胺基酸取代、突變、添加和/或缺失。
- 如請求項24或25所述之經修飾的免疫細胞，其中該靶分子係NKG2D的細胞外抗原結合結構域。
- 如請求項1-29中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該經修飾的免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺傷（NK）細胞、NK細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
- 如請求項30所述之經修飾的免疫細胞，其中該經修飾的免疫細胞係NK細胞。
- 如請求項30所述之經修飾的免疫細胞，其中該經修飾的免疫細胞係細胞毒性T細胞。
- 如請求項1-32中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該經修飾的免疫細胞包含工程化受體。
- 如請求項33所述之經修飾的免疫細胞，其中該工程化受體係嵌合抗原受體（CAR）。
- 如請求項33所述之經修飾的免疫細胞，其中該工程化受體係經修飾的T細胞受體（TCR）。
- 如請求項33所述之經修飾的免疫細胞，其中該工程化受體係T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。
- 如請求項33-36中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該工程化受體包含特異性識別與該第一多肽和/或該第二多肽相同的靶分子的細胞外結構域。
- 如請求項37所述之經修飾的免疫細胞，其中該工程化受體包含特異性識別與該第一多肽和/或該第二多肽相同的靶分子上的非重疊靶位點的細胞外結構域。
- 如請求項33-38中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該工程化受體包含特異性識別CD19、CLL1、BCMA和GPC3中任一種的細胞外結構域。
- 如請求項39所述之經修飾的免疫細胞，其中該工程化受體包含與SEQ ID NO: 1、3、57-60、61-65、71-73中任一個的胺基酸序列具有至少約95%序列一致性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO: 1、3、57-60、61-65、71-73中任一個的胺基酸序列。
- 如請求項1-40中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該經修飾的免疫細胞包含編碼該第一多肽的第一核酸和編碼該第二多肽的第二核酸。
- 如請求項1-3、5-7、9-13和19-32中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一多肽和該第二多肽相同，並且其中該經修飾的免疫細胞包含編碼該第一多肽和該第二多肽的第一核酸。
- 如請求項33-42中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該經修飾的免疫細胞包含編碼該工程化受體的第三核酸。
- 如請求項41-43中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一核酸和該第二核酸可操作地連接至同一啟動子。
- 如請求項41或43所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一核酸和該第二核酸可操作地連接至分開的啟動子。
- 如請求項43-45中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一核酸和該第三核酸可操作地連接至同一啟動子。
- 如請求項43-45中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一核酸和該第三核酸可操作地連接至分開的啟動子。
- 如請求項43、44和46中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一核酸、該第二核酸和該第三核酸可操作地連接至同一啟動子。
- 如請求項19-21中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一靶結合結構域和該第二靶結合結構域特異性識別CD20的亞基。
- 如請求項8-48中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中(1) 該第一靶結合結構域特異性識別CD33的C2亞基，並且該第二靶結合結構域特異性識別CD33的V亞基；或 (2) 該第一靶結合結構域特異性識別CD33的V亞基，並且該第二靶結合結構域特異性識別CD33的C2亞基。
- 如請求項1-50中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一多肽進一步包含第一細胞介素受體的第一細胞內結構域，和/或該第二多肽進一步包含第二細胞介素受體的第二細胞內結構域。
- 如請求項51所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一細胞內結構域和該第二細胞內結構域相同。
- 如請求項51所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一細胞內結構域和該第二細胞內結構域不同。
- 如請求項51-53中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一細胞介素受體和/或該第二細胞介素受體選自由以下組成之群組：GM-CSF受體、IL-18受體、IL-21受體、IL-15受體和IL-23受體。
- 如請求項51-53中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一細胞介素受體的該第一細胞內結構域和/或該第二細胞介素受體的該第二細胞內結構域包含基於免疫受體酪胺酸的活化模體（ITAM）。
- 如請求項51-55中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一細胞介素受體的該第一細胞內結構域的C-末端與該第一TLR傳訊結構域的N-末端融合；和/或該第二細胞介素受體的該第二細胞內結構域的C-末端與該第二TLR傳訊結構域的N-末端融合。
- 如請求項51-55中任一項所述之經修飾的免疫細胞，其中該第一細胞介素受體的該第一細胞內結構域的N-末端與該TLR傳訊結構域的C-末端融合，和/或該第二細胞介素受體的該第二細胞內結構域的N-末端與該TLR傳訊結構域的C-末端融合。
- 一種產生如請求項1-57中任一項所述之經修飾的免疫細胞之方法，該方法包括：將編碼該第一多肽的第一核酸和視需要的編碼該第二多肽的第二核酸引入前驅免疫細胞中。
- 如請求項58所述之方法，其中該前驅免疫細胞選自由以下組成之群組：細胞毒性T細胞、輔助T細胞、NK細胞、NK-T細胞、iNK-T細胞、NK-T樣細胞、αβT細胞和γδT細胞。
- 如請求項58或59所述之方法，其中該前驅免疫細胞包含工程化受體。
- 如請求項58或59所述之方法，其進一步包括將編碼工程化受體的第三核酸引入該前驅免疫細胞中。
- 如請求項60或61所述之方法，其中該工程化受體係嵌合抗原受體（CAR）、經修飾的T細胞受體（TCR）或T細胞抗原偶聯物（TAC）受體。
- 如請求項58-62中任一項所述之方法，其中該第一核酸、該第二核酸和/或該第三核酸在同一載體上。
- 如請求項63所述之方法，其中該載體係病毒載體。
- 如請求項64所述之方法，其中該病毒載體選自由腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、單純皰疹病毒載體及其衍生物組成之群組。
- 如請求項58-62中任一項所述之方法，其進一步包括分離或富集包含該第一核酸、該第二核酸和/或該第三核酸的免疫細胞。
- 一種藉由如請求項58-66中任一項所述之方法產生的經修飾的免疫細胞。
- 一種藥物組成物，其包含如請求項1-57和67所述之經修飾的免疫細胞、和藥學上可接受的載劑。
- 一種治療個體的疾病之方法，該方法包括向該個體投與有效量的如請求項68所述之藥物組成物。
- 如請求項69所述之方法，其中該疾病係癌症。
- 如請求項69或70所述之方法，其中該個體係人。
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