CN117580870A - 表达tlr受体的经修饰的免疫细胞 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了表达TLR受体的经修饰的免疫细胞。该经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)。本申请还提供了使用这些经修饰的免疫细胞用于癌症治疗的方法和药物组合物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年8月18日提交的国际申请号PCT/CN2021/113239、2021年9月30日提交的国际申请号PCT/CN2021/122129、2021年11月25日提交的国际申请号PCT/CN2021/133061和2022年8月15日提交的国际申请号PCT/CN2022/112578的优先权，将其内容通过援引以其全文并入本文。
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技术领域
本申请涉及表达TLR受体的经修饰的免疫细胞，以及使用其用于治疗疾病或病症如癌症的方法。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)T细胞是已经被修饰以产生工程化T细胞受体从而引发免疫应答的细胞。例如，CAR-T细胞可以被设计成更有效地识别癌细胞，用于改善癌症疗法。尽管CAR-T疗法取得了成功，但这些方法通常存在较差的体内T细胞扩增和衰竭的问题，从而导致患有血液恶性肿瘤(例如，急性髓系白血病)的患者临床缓解的持久性降低。仍然需要高效的基于细胞的癌症免疫疗法。
NKG2D是一种跨膜蛋白，属于C型凝集素样受体的NKG2家族。在人类中，其由NK细胞、γδT细胞和CD8+αβT细胞表达。NKG2D配体是来自MIC和RAET1/ULBP家族的诱导自体蛋白，其在正常细胞表面上完全不存在或仅以低水平存在，但它们被经感染、转化、衰老和应激细胞过量表达(Zingoni,A等人,2018,Front Immunol.9:476)。
Toll样受体(TLR)是检测入侵病原体并激活先天和适应性免疫应答的模式识别受体。TLR作为T细胞上的有效共刺激分子，并在激活的T细胞(例如，记忆CD4+和CD8+T细胞)的细胞表面上表达。因此，T细胞上TLR的激活直接增强了T细胞受体(TCR)信号诱导的T细胞激活、功能和存活(Gelman,AE等人,2004,172(10):6065-6073)。鉴于它们在免疫系统中的关键作用，TLR激活已被用于增强免疫应答。相反，TLR激活的抑制剂可以减少自身免疫和其他不希望的免疫应答(Lu,H,2014,Front.in Immunol.5:83)。研究显示，表达CAR的工程化免疫细胞如T细胞可以用toll/白细胞介素-1(IL-1)受体(TIR)结构域装甲，以提供增强的抗肿瘤活性。参见，例如Manavalan,B等人,2011,Front.Physiol.2:41。
本文提到的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的披露内容通过援引以其全文特此并入本文。
发明内容
本申请提供了表达TLR受体的经修饰的免疫细胞，以及使用其用于治疗疾病或病症如癌症的方法。
本申请的一方面提供了经修饰的免疫细胞，其包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域；其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。
在根据经修饰的免疫细胞的一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合多聚体靶分子的亚基。在一些实施例中，多聚体靶分子的亚基相同。在一些实施例中，多聚体靶分子的亚基不同。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二结合结构域结合相同的靶分子。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二结合结构域各自结合靶分子上的相同靶位点。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域相同。
本申请的另一方面提供了根据经修饰的免疫细胞的经修饰的免疫细胞，其中第一靶结合结构域和第二结合结构域结合上述相同的靶分子，其中第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合单个靶分子上不同的非重叠靶位点。
在根据上述经修饰的免疫细胞中任一个的一些实施例中，第一TLR跨膜结构域和第一TLR信号传导结构域衍生自相同TLR分子。在一些实施例中，第二TLR跨膜结构域和第二TLR信号传导结构域衍生自相同TLR分子。在一些实施例中，第一TLR跨膜结构域和第二TLR跨膜结构域相同。在一些实施例中，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相同。在一些实施例中，第一TLR跨膜结构域和/或第一TLR信号传导结构域衍生自TLR4。在一些实施例中，第一TLR跨膜结构域和第二TLR跨膜结构域不同。在一些实施例中，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域不同。在一些实施例中，第一TLR跨膜结构域和/或第一TLR信号传导结构域衍生自TLR2。在一些实施例中，第二TLR跨膜结构域和/或第一TLR信号传导结构域衍生自TLR6。在一些实施例中，第二TLR跨膜结构域和/或第二TLR信号传导结构域衍生自TLR1。
在根据上述经修饰的免疫细胞中任一个的一些实施例中，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域是抗体部分或其抗原结合片段。在一些实施例中，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域是scFv或sdAb。在一些实施例中，scFv或sdAb特异性结合CD33、CLL1、CD123、CD19、CD20、CD22、BCMA、GPRC5D和GPC3。
在根据上述经修饰的免疫细胞中任一个的一些实施例中，靶分子是免疫检查点蛋白。在一些实施例中，靶分子选自由以下组成的组：PD-1、CD70、CD27、SIRPα和TIGIT。
在根据上述经修饰的免疫细胞中任一个的一些实施例中，靶分子是在免疫细胞上表达的天然蛋白质。在一些实施例中，靶分子是NKG2D。在一些实施例中，靶分子是突变的NKG2D。在一些实施例中，突变的NKG2D包含截短的序列和/或氨基酸取代、突变、添加和/或缺失。
在一些实施例中，靶分子是NKG2D的细胞外抗原结合结构域。在一些实施例中，靶分子是NKG2D的全长序列。
在根据上述经修饰的免疫细胞中任一个的一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是NK细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含工程化受体。在一些实施例中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，工程化受体是经修饰的T细胞受体(TCR)。在一些实施例中，工程化受体是T细胞抗原偶联物(TAC)受体。
本申请的另一方面提供了根据上述经修饰的免疫细胞中任一个的经修饰的免疫细胞，其中工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域。在一些实施例中，工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子上的非重叠靶位点的细胞外结构域。在一些实施例中，工程化受体包含特异性识别CD19、CLL1、BCMA和GPC3中任一种的细胞外结构域。
在根据上述经修饰的免疫细胞中任一个的一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含编码第一多肽的第一核酸和编码第二多肽的第二核酸。
在根据上述经修饰的免疫细胞中任一个的一些实施例中，第一多肽和第二多肽相同，并且经修饰的免疫细胞包含编码第一多肽和第二多肽的第一核酸。
在根据上述经修饰的免疫细胞中任一个的一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含编码工程化受体的第三核酸。在一些实施例中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至同一启动子。在一些实施例中，第一核酸和第二核酸可操作地连接至分开的启动子。在一些实施例中，第一核酸和第三核酸可操作地连接至同一启动子。在一些实施例中，第一核酸和第三核酸可操作地连接至分开的启动子。在一些实施例中，第一核酸、第二核酸和第三核酸可操作地连接至同一启动子。
在根据上述经修饰的免疫细胞中任一个的一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域特异性识别CD20的亚基。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域特异性识别CD33的亚基。在一些实施例中，第一靶结合结构域特异性识别CD33的V亚基，并且第二靶结合结构域特异性识别CD33的C2亚基。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域特异性识别BCMA的亚基。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域特异性识别GPRC5D的亚基。
在根据上述经修饰的免疫细胞中任一个的一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域。在一些实施例中，第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的第二细胞内结构域。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，并且第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的第二细胞内结构域。在一些实施例中，第一细胞内结构域和第二细胞内结构域相同。在一些实施例中，第一细胞内结构域和第二细胞内结构域不同。在一些实施例中，第一细胞因子受体选自由以下组成的组：GM-CSF受体、IL-18受体、IL-21受体、IL-15受体和IL-23受体。在一些实施例中，第二细胞因子受体选自由以下组成的组：GM-CSF受体、IL-18受体、IL-21受体、IL-15受体和IL-23受体。在一些实施例中，第一细胞因子受体的第一细胞内结构域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。在一些实施例中，第二细胞因子受体的第二细胞内结构域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。在一些实施例中，第一细胞因子受体的第一细胞内结构域和第二细胞因子受体的第二细胞内结构域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。在一些实施例中，第一细胞因子受体的第一细胞内结构域的C-末端与第一TLR信号传导结构域的N-末端融合。在一些实施例中，第二细胞因子受体的第二细胞内结构域的C-末端与第二TLR信号传导结构域的N-末端融合。在一些实施例中，第一细胞因子受体的第一细胞内结构域的C-末端与第一TLR信号传导结构域的N-末端融合；并且，第二细胞因子受体的第二细胞内结构域的C-末端与第二TLR信号传导结构域的N-末端融合。在一些实施例中，第一细胞因子受体的第一细胞内结构域的N-末端与TLR信号传导结构域的C-末端融合。在一些实施例中，第二细胞因子受体的第二细胞内结构域的N-末端与TLR信号传导结构域的C-末端融合。在一些实施例中，第一细胞因子受体的第一细胞内结构域的N-末端与TLR信号传导结构域的C-末端融合；并且，第二细胞因子受体的第二细胞内结构域的N-末端与TLR信号传导结构域的C-末端融合。
本申请的一方面提供了产生经修饰的免疫细胞的方法，该方法包括：将编码第一多肽的第一核酸和任选的编码第二多肽的第二核酸引入前体免疫细胞中。
在根据上述产生方法中任一个的一些实施例中，前体免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、NK细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。在一些实施例中，前体免疫细胞包含工程化受体。在一些实施例中，该产生方法进一步包括将编码工程化受体的第三核酸引入前体免疫细胞中。在一些实施例中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)、经修饰的T细胞受体(TCR)或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。
在根据上述产生方法中任一个的一些实施例中，第一核酸、第二核酸和/或第三核酸在同一载体上。在一些实施例中，载体是病毒载体。在一些实施例中，病毒载体选自由腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物组成的组。
在根据上述产生方法中任一个的一些实施例中，该方法进一步包括分离或富集包含第一核酸、第二核酸和/或第三核酸的免疫细胞。
还提供了通过根据上述产生方法中任一个的方法产生的经修饰的免疫细胞。
还提供了药物组合物，其包含根据上述经修饰的免疫细胞中任一个的经修饰的免疫细胞和药学上可接受的载剂。
本申请的另一个方面提供了治疗个体的疾病的方法，该方法包括向该个体施用有效量的根据上述药物组合物中任一个的药物组合物。在一些实施例中，该疾病是癌症。在一些实施例中，该个体是人。
还提供了包含这些经修饰的免疫细胞中的任一种的组合物、用途、套件(试剂盒)和制品。
附图说明
图1显示了包含抗CD19-CAR和抗CD20 TLR多肽(CD19-共CD20CAR；SEQ ID NO:1)的CAR融合构建体的双顺反子表达设计。从N-末端到C-末端，CAR骨架的序列符合以下模式：信号肽(SEQ ID NO:5)、抗CD19 scFv(SEQ ID NO:6)、CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:7)、CD8α跨膜(TM)结构域(SEQ ID NO:8)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域(SEQ ID NO:9)的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:10)，其与诱导型共刺激分子连接，该共刺激分子从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、抗CD20 scFv(SEQ ID NO:11)、TLR4跨膜(TM)区(SEQ ID NO:12)和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)(SEQ ID NO:13)，经由P2A切割位点(SEQ ID NO:24)。
图2显示了用TLR4装甲的CD19 BM CAR-T和CD19-共CD20 CAR-T细胞的体外细胞毒性作用。特别地，图2显示CD19 BM CAR-T和CD19-共CD20 CAR T细胞在体外以剂量依赖性方式诱导Raji靶细胞裂解。未转导的T细胞(即，“unT”)在此实验中用作对照。
图3显示了与Raji靶细胞共培养的用TLR4装甲的CD19 BM CAR-T和CD19-共CD20CAR-T细胞的体外IFNγ细胞因子切片。未转导的T细胞(即，“unT”)在此实验中用作对照。
图4显示了与Raji靶细胞共培养的用TLR4装甲的CD19 BM CAR-T和CD19-共CD20CAR-T细胞的体外TNFα细胞因子切片。未转导的T细胞(即，“unT”)在此实验中用作对照。
图5显示了在用Raji靶细胞进行的重复肿瘤刺激测定中，用TLR4装甲的CD19 BMCAR-T和CD19-共CD20 CAR-T细胞的体外杀伤功效。未转导的T细胞(即，“UNT”)在此实验中用作对照。
图6显示了与Raji靶细胞一起孵育后，用TLR4装甲的CD19 BM CAR-T和CD19-共CD20 CAR-T细胞的体外增殖(例如，扩增倍数)。
图7显示了包含抗CLL1-CAR和抗CD33 TLR多肽(CLL1-共CD33CAR；SEQ ID NO:3和CLL1-共CD33-2 CAR-T；SEQ ID NO:71)的CAR融合构建体的双顺反子表达设计。
图8显示了用TLR2和TLR1装甲的CLL1 BM CAR-T、CLL1-共CD33CAR-T细胞和用TLR4装甲的CLL1-共CD33-2 CAR-T细胞的体外细胞毒性作用。特别地，图8显示CLL1 BM CAR-T、CLL1-共CD33 CAR-T和CLL1-共CD33-2 CAR-T细胞在体外以剂量依赖性方式诱导U937靶细胞裂解。未转导的T细胞(即，“unT”)在此实验中用作对照。
图9显示了与U937靶细胞共培养的用TLR2和TLR1装甲的CLL1 BM CAR-T、CLL1-共CD33 CAR-T细胞和用TLR4装甲的CLL1-共CD33-2 CAR-T的体外IFNγ细胞因子切片。未转导的T细胞(即，“unT”)在此实验中用作对照。
图10显示了与U937靶细胞共培养的用TLR2和TLR1装甲的CLL1 BM CAR-T、CLL1-共CD33 CAR-T细胞和用TLR4装甲的CLL1-共CD33-2 CAR-T的体外TNFα细胞因子切片。未转导的T细胞(即，“unT”)在此实验中用作对照。
图11显示了在用U937靶细胞进行的重复肿瘤刺激测定中，用TLR2和TLR1装甲的CLL1 BM CAR-T、CLL1-共CD33 CAR-T细胞和用TLR4装甲的CLL1-共CD33-2 CAR-T的体外杀伤功效。未转导的T细胞(即，“UNT”)在此实验中用作对照。
图12显示了在与U937靶细胞一起孵育后，用TLR2和TLR1装甲的CLL1 BM CAR-T、CLL1-共CD33 CAR-T细胞和用TLR4装甲的CLL1-共CD33-2CAR-T的体外增殖(例如，扩增倍数)。
图13显示了在U937-Luc异种移植小鼠模型中，示例性CLL1-共CD33CARαβT和CLL1-共CD33 CARγδT治疗的体内功效研究的示意图。
图14显示了在U937-Luc异种移植小鼠模型中，CLL1-共CD33 CARαβT细胞的体内功效。
图15显示了在U937-Luc异种移植小鼠模型中，CLL1-共CD33 CARγδT细胞和CLL1-共CD33-2 CARγδT细胞的体内功效。
图16A-16B显示了用NKG2D或突变的NKG2D TLR嵌合受体装甲的CAR或TCR的示例性构建体。图16A显示了用NKG2D或突变的NKG2D TLR嵌合受体装甲的CAR的示意图。图16B显示了用NKG2D或突变的NKG2D TLR嵌合受体装甲的TCR的示意图。
图17A-17B显示了用嵌合受体装甲的CAR或TCR的示例性构建体，该嵌合受体包括靶向NKG2D配体的结合结构域、TLR跨膜结构域和细胞内效应结构域。图17A显示了用嵌合受体装甲的CAR的示意图，该嵌合受体包括靶向NKG2D配体的结合结构域、TLR跨膜结构域和细胞内效应结构域。图17B显示了用嵌合受体装甲的TCR的示意图，该嵌合受体包括靶向NKG2D配体的结合结构域、TLR跨膜结构域和细胞内效应结构域。
图18A-18B显示了用NKG2D或突变的NKG2D TLR4嵌合受体装甲的CAR或TCR的示例性构建体。图18A显示了用NKG2D或突变的NKG2D TLR4嵌合受体装甲的第二代CAR。图18B显示了用NKG2D或突变的NKG2D TLR4嵌合受体装甲的TCR。
图19显示了在用Huh7靶细胞进行的重复肿瘤刺激测定中，用NKG2D-TLR4或NKG2D-CD8-TLR4嵌合受体装甲的抗GPC3 CAR-T和抗GPC3CAR-T细胞的体外杀伤功效。未转导的T细胞(即，“UNT”)在此实验中用作对照。
图20显示了在与Huh7靶细胞一起孵育后，用NKG2D-TLR4或NKG2D-CD8-TLR4嵌合受体装甲的抗-GPC3 CAR-T和抗-GPC3 CAR-T细胞的体外增殖。
图21显示了与Huh7靶细胞共培养的用NKG2D-TLR4或NKG2D-CD8-TLR4嵌合受体装甲的抗-GPC3 CAR-T和抗-GPC3 CAR-T细胞的体外IFNγ细胞因子切片。未转导的T细胞(即，“UNT”)在此实验中用作对照。
图22显示了在用Raji靶细胞进行的重复肿瘤刺激测定中，用NKG2D-TLR4或NKG2D-CD8-TLR4嵌合受体装甲的抗CD19 CAR-T和抗CD19CAR-T细胞的体外杀伤功效。未转导的T细胞(即，“UNT”)在此实验中用作对照。
图23显示了在与Raji靶细胞一起孵育后，用NKG2D-TLR4或NKG2D-CD8-TLR4嵌合受体装甲的抗CD19 CAR-T和抗CD19 CAR-T细胞的体外增殖。
图24显示了在Huh7异种移植模型中，用NKG2D-CD8-TLR4嵌合受体装甲的抗GPC3CAR-T细胞和抗GPC3 CAR-T细胞的体内功效。
图25显示了CAR融合构建体的双顺反子表达设计，该CAR融合构建体包含串联抗BCMA-共抗BCMA CAR(SEQ ID NO:61)或单个抗BCMA-共抗BCMA CAR(SEQ ID NO:62)、单个抗BCMA-共抗BCMA-CD8 CAR(SEQ ID NO:63)、单个抗BCMA-共抗BCMA-CD28 CAR(SEQ ID NO:64)，以及串联抗BCMA-共抗GPRC5D CAR(SEQ ID NO:65)、串联抗BCMA-共抗GPRC5D-CD8 CAR(SEQ ID NO:72)、串联抗BCMA-共抗GPRC5D-CD28 CAR(SEQ ID NO:73)。
图26显示了用TLR4细胞内信号传导装甲的抗BCMA-CAR-γδT和抗BCMA-共抗BCMA-γδT细胞的体外细胞毒性作用。未转导的γδT细胞(即，“Un-γδT”)在此实验中用作对照。
图27显示了与BCMA阳性NCI-H929靶肿瘤细胞共培养的用TLR4细胞内信号传导装甲的抗BCMA-CAR-γδT和抗BCMA-共抗BCMA-γδT细胞的体外IFN-γ、TNF-α和GM-CSF细胞因子分泌。未转导的γδT细胞(即，“Un-γδT”)在此实验中用作对照。
图28显示了在用BCMA阳性NCI-H929靶肿瘤细胞进行的重复肿瘤刺激测定中，串联抗BCMA-CAR-γδT、串联抗BCMA-共抗BCMA-CARγδT、单个抗BCMA-共抗BCMA CARγδT、单个抗BCMA-共抗BCMA-CD8 CARγδT、单个抗BCMA-共抗BCMA-CD28 CARγδT、串联抗BCMA-共抗GPRC5D-CARγδT和串联抗BCMA-共抗GPRC5D-CD8 CAR-γδT细胞的体外杀伤功效和持久性。未转导的γδT细胞(即，“Un-γδT”)在此实验中用作对照。
图29显示了用TLR4细胞内信号传导装甲的串联抗BCMA-CAR-γδT和串联抗BCMA-共抗BCMA-γδT细胞在同种异体环境中的持久性，其中γδT细胞、同种异体PBMC和BCMA阳性NCI-H929靶肿瘤细胞以1:60:1的比率共孵育。
图30显示了在BCMA阳性RPMI-8226荷瘤异种移植模型中，用TLR4细胞内信号传导装甲的串联抗BCMA-CAR-γδT、串联抗BCMA-共抗BCMA-γδT细胞和串联抗BCMA-共抗GPRC5D-CD8-γδT细胞的体内杀伤功效和持久性。未转导的γδT细胞(即，“Un-γδT”)和媒介物HBSS在此实验中用作对照。
图31A-31B显示了在BCMA阳性RPMI-8226荷瘤异种移植模型中，用TLR4细胞内信号传导装甲的串联抗BCMA-CAR-γδT和串联抗BCMA-共抗BCMA-γδT细胞的体重变化以及IFN-γ、TNF-α和GM-CSF细胞因子分泌。未转导的γδT细胞(即，“Un-γδT”)和媒介物HBSS在此实验中用作对照。
具体实施方式
本申请提供了包含Toll样受体(TLR)共刺激分子(例如，TLR多肽)的经修饰的免疫细胞，以及使用其用于治疗癌症的方法。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含含有第一TLR多肽和第二TLR多肽的基于TLR的多聚体，与不表达所述多肽的经修饰的免疫细胞相比，这些经修饰的免疫细胞具有有效且持久的肿瘤溶解活性和改善的衰竭特征。在一些实施例中，第一TLR多肽包含：i)第一靶结合结构域(例如，抗体部分或其片段)，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；并且第二TLR多肽包含：i)第二靶结合结构域(例如，抗体部分或其片段)，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域。在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是T细胞。
在一些实施例中，经修饰的细胞进一步表达特异性识别感兴趣的靶抗原的嵌合抗原受体(CAR)。本文所述的TLR多肽增加CAR-T细胞增殖并增强抗肿瘤活性。
TLR多肽上的TLR信号传导的激活是靶依赖性的，并且通过二聚化或多聚化的TLR多肽以及TLR多肽与相应靶分子结合后TLR信号传导部分的形成而起始。本申请提供了用于诱导TLR信号传导部分形成的多种策略。在第一种策略中，第一多肽的第一靶结合结构域和第二多肽的第二结合结构域各自结合多聚体靶分子的亚基。在靶结合结构域与其同源靶亚基结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成TLR信号传导部分。在第二种策略中，第一多肽的第一靶结合结构域和第二多肽的第二结合结构域各自结合靶分子上不同的非重叠靶位点。在靶结合结构域与其同源靶分子结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成TLR信号传导部分。在第三种策略中，当免疫细胞包含含有细胞外结构域的工程化受体时，细胞外结构域和第一或第二靶结合结构域各自结合同一靶分子上不同的非重叠靶侧。不受理论的束缚，据信在工程化受体的细胞外结构域与靶分子结合时，在工程化受体周围形成了免疫突触。第一和第二多肽被募集至相同的免疫突触，这允许第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合，从而形成TLR信号传导部分。在另一种策略中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合相同的单体靶分子(例如，在相同的靶位点上)，并且第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与靶分子的结合允许第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合，从而形成TLR信号传导部分。
因此，本申请的一方面提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域(例如，抗体部分或其片段)，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域(例如，抗体部分或其片段)，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合多聚体靶分子的亚基，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二结合结构域结合相同的靶分子。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二结合结构域各自结合靶分子上的相同靶位点。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体、经修饰的T细胞受体或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。
本申请的另一方面提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域(例如，抗体部分或其片段)，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域(例如，抗体部分或其片段)，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中第一靶结合结构域和第二结合结构域结合相同的靶分子，并且其中第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合单个靶分子上不同的非重叠靶位点，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、经修饰的T细胞受体或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。
本申请的另一方面提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域(例如，抗体部分或其片段)，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域(例如，抗体部分或其片段)，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，和c)工程化受体(例如，CAR)，其中工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子上的非重叠靶位点的细胞外结构域。
还提供了包含这些经修饰的免疫细胞的组合物(如药物组合物)、套件和制品，以及使用本文所述的经修饰的免疫细胞治疗疾病或病症(例如，癌症)的方法。
I.定义
如本文所用，“治疗(treatment或treating)”是用于获得有益的或所希望的结果(包括临床结果)的方法。出于本披露的目的，有益的或所希望的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种：缓解由疾病引起的一种或多种症状、减弱疾病的程度、稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)、预防或延迟疾病的扩散(例如，转移)、预防或延迟疾病的复发、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态、提供疾病的缓解(部分或全部)、减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延迟疾病的进展、提高生活质量、和/或延长生存期。“治疗”还涵盖减少疾病(例如，癌症)的病理后果。本申请的方法考虑了这些治疗方面中的任一个或多个。
术语“预防(prevent)”和如“预防(prevented、preventing)”等类似词语表示用于预防、抑制或降低疾病或病症(例如，癌症)复发的可能性的方法。它还指延迟疾病或病症的复发或延迟疾病或病症的症状的复发。如本文所用，“预防(prevention)”和类似词语还包括在疾病或病症复发之前降低疾病或病症的强度、作用，减少症状和/或负担。
如本文所用，“延迟”癌症的发展是指推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定和/或延缓疾病的发展。这种延迟可以具有不同的时间长度，其取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。与不使用该方法相比，“延迟”癌症的发展的方法是在给定的时间范围内降低疾病发展的可能性和/或在给定的时间范围内降低疾病程度的方法。此类比较通常基于使用统计学上显著数量的个体进行的临床研究。可以使用标准方法来检测癌症发展，这些标准方法包括但不限于计算机化轴向断层成像(CAT扫描)、磁共振成像(MRI)、腹部超声、凝血试验、动脉造影术或活检。发展也可以指最初可能无法检测到的癌症进展，并且包括发生、复发和发作。
本文所用的术语“有效量”是指足以治疗特定障碍、病症或疾病如以改善、减轻、减少和/或延迟其一种或多种症状的药剂或药剂组合的量。关于癌症，有效量包括足以引起肿瘤缩小和/或降低肿瘤的生长速率(如抑制肿瘤生长)或者预防或延迟其他不希望的细胞增殖的量。在一些实施例中，有效量是足以延迟疾病发展的量。在一些实施例中，有效量是足以预防或延迟复发的量。有效量可以以一次或多次施用来进行施用。药物或组合物的有效量可以：(i)减少癌细胞的数量；(ii)减小肿瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、减慢、减缓并且优选地阻止癌细胞浸润到外周器官中；(iv)抑制(即，在一定程度上减慢并且优选地阻止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。
如本文所用，“个体”或“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施例中，该个体是人。
“分离的”核酸是指已经从其天然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括通常包含核酸分子的细胞中所含的该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置。
如本文所用，术语“载体”是指能够繁殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及掺入已引入载体的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够引导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将异源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用异源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代目标细胞及其子代。
将关于本文鉴定的多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列(将任何保守取代作为序列同一性的一部分)后，候选序列中与所比较多肽中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的，可以用本领域技术中的多种方式来实现比对，例如使用公众可得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)或MUSCLE软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括需要在被比较序列的全长范围实现最大比对的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序MUSCLE生成氨基酸序列同一性％值(Edgar,R.C.,NucleicAcids Research 32(5):1792-1797,2004；Edgar,R.C.,BMC Bioinformatics 5(1):113,2004)。
如本文所用，“嵌合抗原受体”或“CAR”是指将一种或多种抗原特异性移植到细胞如T细胞上的基因工程化受体。CAR也被称为“人工T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”或“嵌合免疫受体”。在一些实施例中，CAR包含对肿瘤抗原有特异性的抗体的细胞外可变结构域和T细胞或其他受体的细胞内信号传导结构域，如一个或多个共刺激结构域。“CAR-T”是指表达CAR的T细胞。如本文所用，“CLL1 CAR”是指特异性识别CLL1的CAR，“CD19 CAR”是指特异性识别CD19的CAR，“GPC3CAR”是指特异性识别GPC3的CAR，并且“BCMA CAR”是指特异性识别BCMA的CAR。
如本文所用，“T细胞受体”或“TCR”是指包含细胞外抗原结合结构域的内源或经修饰的T细胞受体，该细胞外抗原结合结构域与MHC分子中结合的特异性抗原肽结合。在一些实施例中，TCR包含TCRα多肽链和TCRβ多肽链。在一些实施例中，TCR包含TCRγ多肽链和TCRδ多肽链。在一些实施例中，TCR特异性结合肿瘤抗原。“TCR-T”是指表达重组TCR的T细胞。
如本文所用，“T细胞抗原偶联物受体”或“TAC受体”是指包含与特异性抗原结合的细胞外抗原结合结构域和T细胞受体(TCR)结合结构域、跨膜结构域及共受体分子的细胞内结构域的工程化受体。TAC受体指定表达TAC受体的T细胞的内源TCR以引发针对靶细胞的抗原特异性T细胞应答。
本文中术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖多种抗体结构，这些抗体结构包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所希望的抗原结合活性即可。术语抗体包括但不限于能够结合抗原的片段，如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab’和(Fab’)2。术语抗体包括常规的四链抗体和单域抗体，如仅有重链的抗体或其片段，例如VHH。
如本文所用的，术语“结合”、“特异性结合”或“对……有特异性”是指可测量和可再现的相互作用，如靶标与抗体之间的结合，其决定了在异质分子(包括生物分子)群体存在时靶标的存在。例如，结合或特异性结合靶标(可以是表位)的抗体是与此靶标结合的抗体，其亲和力、亲合力(avidity)、就绪性和/或持续时间优于与其他靶标的结合。在一个实施例中，抗体与不相关靶标的结合程度小于例如通过放射免疫测定法(RIA)测量的抗体与靶标的结合的约10％。在某些实施例中，特异性结合靶标的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施例中，抗体特异性结合来自不同物种的蛋白质中保守的蛋白质表位。在另一实施例中，特异性结合可以包括但不要求排他性结合。
术语“细胞”包括原代目标细胞及其子代。
应当理解，本文所述的本披露的实施例包括“由实施例组成”和/或“基本上由实施例组成”。
本文对“约”值或参数的提及包括(并描述)针对该值或参数本身的变化。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，对“不是”值或参数的提及通常意指并描述“不同于”值或参数。例如，方法不是用于治疗X型癌症，意味着该方法用于治疗不同于X型的癌症。
本文使用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。
如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“这些/该(the)”包括复数指代物，除非上下文明确地指示其他的情况。
应理解的是，为清楚起见，在单独的实施例的背景下描述的本披露的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施例的背景下描述的本披露的不同特征也可以单独地或以任何合适的子组合提供。涉及本文所述的经修饰的免疫细胞和治疗方法的实施例的所有组合均明确涵盖于本申请中，并且就如同每个组合被个别且明确地披露一样披露在本文中。此外，在描述此类变量的实施例中列出的经修饰的免疫细胞的所有子组合也均明确涵盖于本申请中，并且就如同蛋白质的每个这种子组合在本文中被个别且明确地披露一样披露在本文中。
II.经修饰的免疫细胞
本申请的一方面提供了包含第一多肽和第二多肽的经修饰的免疫细胞，其中第一多肽和第二多肽各自编码包含TLR信号传导结构域的TLR多肽(例如，TLR共刺激多肽)。在一些实施例中，在TLR多肽与其相应的靶结合时，第一和第二多肽的TLR信号传导结构域相互缔合以形成TLR信号传导部分，其中TLR信号传导部分诱导TLR信号传导，从而导致强抗肿瘤效果。第一多肽和第二多肽可以相同或不同。
在一些实施例中，与不包含所述TLR多肽的经修饰的免疫细胞相比，包含第一和第二TLR多肽的经修饰的免疫细胞具有增加的T细胞受体(TCR)信号诱导的T细胞激活、功能和/或存活。在一些实施例中，与不包含所述TLR多肽的经修饰的免疫细胞相比，TLR多肽通过经修饰的免疫细胞诱导增加的肿瘤细胞杀伤功效。在一些实施例中，与不包含所述TLR多肽的经修饰的免疫细胞相比，TLR多肽诱导增加的肿瘤细胞杀伤功效，如增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、12倍、14倍、16倍、20倍、25倍、30倍、40倍或更多中的任一个。在一些实施例中，与不包含所述TLR多肽的经修饰的免疫细胞相比，TLR多肽对经修饰的免疫细胞赋予持久功效，例如像增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更多中的任一个。在一些实施例中，与包含TLR多肽的经修饰的免疫细胞相比，当施用至个体时，经修饰的免疫细胞具有降低的体内毒性。在一些实施例中，与包含TLR多肽的经修饰的免疫细胞相比，当施用至个体时，经修饰的免疫细胞减少了体内衰竭。在一些实施例中，TLR多肽是共刺激分子。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一TLR跨膜结构域和第一TLR信号传导结构域衍生自相同TLR分子。在一些实施例中，第一TLR跨膜结构域和第一TLR信号传导结构域衍生自不同TLR分子。在一些实施例中，第二TLR跨膜结构域和第二TLR信号传导结构域衍生自相同TLR分子。在一些实施例中，第二TLR跨膜结构域和第二TLR信号传导结构域衍生自不同TLR分子。在一些实施例中，第一TLR跨膜结构域和第二TLR跨膜结构域相同。在一些实施例中，第一TLR跨膜结构域和第二TLR跨膜结构域不同。在一些实施例中，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域不同。在一些实施例中，该一个或多个TLR分子选自由以下组成的组：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9，如TLR1、TLR2、TLR4或TLR6。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分，并且其中第一TLR跨膜结构域、第一TLR信号传导结构域、第二TLR跨膜结构域和第二TLR信号传导结构域衍生自TLR4。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分；其中第一TLR跨膜结构域和第一TLR信号传导结构域衍生自TLR2，并且其中第二TLR跨膜结构域和第二TLR信号传导结构域衍生自TLR1，或者其中第一TLR跨膜结构域和第一TLR信号传导结构域衍生自TLR1，并且其中第二TLR跨膜结构域和第二TLR信号传导结构域衍生自TLR2。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分；其中第一TLR跨膜结构域和第一TLR信号传导结构域衍生自TLR6，并且其中第二TLR跨膜结构域和第二TLR信号传导结构域衍生自TLR2，或者其中第一TLR跨膜结构域和第一TLR信号传导结构域衍生自TLR2，并且其中第二TLR跨膜结构域和第二TLR信号传导结构域衍生自TLR6。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分，并且其中第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域是抗体部分或其抗原结合片段。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域是抗体部分或其抗原结合片段。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域是scFv或sdAb。在一些实施例中，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域特异性结合CD33、CLL1、CD123、CD19、CD20、CD22、BCMA、GPRC5D、NKG2D或GPC3。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域相同。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域不同。在一些实施例中，第一多肽和/或第二多肽的靶分子是免疫检查点蛋白。在一些实施例中，第一多肽和/或第二多肽的靶分子选自由以下组成的组：PD-1、CD70、CD27、SIRPα和TIGIT。在根据上述经修饰的免疫细胞中任一个的一些实施例中，靶分子是在免疫细胞上表达的天然蛋白质。在一些实施例中，靶分子是NKG2D。在一些实施例中，靶分子是突变的NKG2D。在一些实施例中，突变的NKG2D包含截短的序列和/或氨基酸取代、突变、添加和/或缺失。在一些实施例中，靶分子是NKG2D的细胞外抗原结合结构域。在一些实施例中，靶分子是NKG2D的全长序列。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分，并且其中第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合多聚体靶分子的亚基。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域是抗体部分或其抗原结合片段。在一些实施例中，多聚体靶分子的亚基不同。在一些实施例中，第一靶结合结构域特异性识别CD33的V亚基，并且第二靶结合结构域特异性识别CD33的C2亚基。在一些实施例中，多聚体靶分子的亚基相同。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域特异性识别CD20的亚基。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域特异性识别CD33的亚基。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域特异性识别BCMA的亚基。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域特异性识别NKG2D的亚基。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域特异性识别GPRC5D的亚基。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域特异性识别NKG2D的亚基。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体。在一些实施例中，工程化受体包含特异性识别CD19、CLL1、BCMA或GPC3中任一种的细胞外结构域。在一些实施例中，工程化受体是CAR，如CD19 CAR、CLL1 CAR、GPC3 CAR或BCMA CAR(例如，单个BCMA CAR或串联BCMA CAR)。在一些实施例中，工程化受体是工程化TCR。在一些实施例中，工程化受体是TAC受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分，并且其中第一靶结合结构域和第二结合结构域各自结合靶分子上的相同靶位点。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域是抗体部分或其抗原结合片段。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域特异性识别CD20的亚基。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域特异性识别CD33的亚基。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域特异性识别BCMA的亚基。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域特异性识别NKG2D的亚基。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域特异性识别GPRC5D的亚基。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域特异性识别NKG2D的亚基。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体。在一些实施例中，工程化受体包含特异性识别CD19、CLL1、GPC3和BCMA中任一种的细胞外结构域。在一些实施例中，工程化受体是CAR，如CD19 CAR、CLL1 CAR、GPC3 CAR或BCMACAR(例如，单个BCMA CAR或串联BCMA CAR)。在一些实施例中，工程化受体是工程化TCR。在一些实施例中，工程化受体是TAC受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞，其包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR4跨膜结构域，和iii)第一TLR4信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR4跨膜结构域，和iii)第二TLR4信号传导结构域；其中第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合多聚体靶分子的亚基，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR4信号传导结构域和第二TLR4信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自是NKG2D的细胞外NKG2D结合结构域。在一些实施例中，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域是抗体部分或其抗原结合片段。在一些实施例中，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域是scFv或sdAb。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽相同。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自是特异性结合CD20的scFv。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域特异性识别CD33的亚基。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自是特异性结合GPRC5D的scFv。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自是特异性结合BCMA的sdAb。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不同。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞，其包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR2跨膜结构域，和iii)第一TLR2信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR1跨膜结构域，和iii)第二TLR1信号传导结构域；其中第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合多聚体靶分子的亚基，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR2信号传导结构域和第二TLR1信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域是抗体部分或其抗原结合片段。在一些实施例中，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域是scFv或sdAb。在一些实施例中，第一靶结合结构域是抗体部分或其抗原结合片段。在一些实施例中，第一靶结合结构域特异性识别CD33的V亚基，并且第二靶结合结构域特异性识别CD33的C2亚基。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中第一多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且第二多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR4信号传导结构域和第二TLR4信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中第一多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗NKG2D细胞外结构域(ECD)、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且第二多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR4信号传导结构域和第二TLR4信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中第一多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且第二多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR4信号传导结构域和第二TLR4信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中第一多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗BCMA sdAb、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且第二多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗BCMA sdAb、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR4信号传导结构域和第二TLR4信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
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在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中第一多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD33 V结构域sdAb、TLR2跨膜结构域和TLR2信号传导结构域(例如，TLR2的胞内部分)，并且第二多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD33 C2结构域sdAb、TLR1跨膜结构域和TLR1信号传导结构域(例如，TLR1的胞内部分)，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，其中第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中第一靶结合结构域和第二结合结构域结合相同的靶分子，其中第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合单个靶分子上不同的非重叠靶位点，并且其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自是NKG2D的细胞外NKG2D结合结构域。在一些实施例中，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域是抗体部分或其抗原结合片段。在一些实施例中，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域是scFv或sdAb。在一些实施例中，多聚体靶分子的亚基相同。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域特异性识别CD20的亚基。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自是特异性结合GPRC5D的scFv。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自是特异性结合BCMA的sdAb。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自是特异性结合CD33的sdAb。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体。在一些实施例中，工程化受体包含特异性识别CD19、CLL1、GPC3和BCMA中任一种的细胞外结构域。在一些实施例中，工程化受体是CAR，如CD19 CAR、CLL1 CAR、GPC3 CAR或BCMA CAR(例如，单个BCMA CAR或串联BCMA CAR)。在一些实施例中，工程化受体是工程化TCR。在一些实施例中，工程化受体是TAC受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
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在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞，其包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR2跨膜结构域，和iii)第一TLR2信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR1跨膜结构域，和iii)第二TLR1信号传导结构域；其中第一靶结合结构域和第二结合结构域结合相同的靶分子，其中第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合单个靶分子上不同的非重叠靶位点，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR2信号传导结构域和第二TLR1信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域是抗体部分或其抗原结合片段。在一些实施例中，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域是scFv或sdAb。在一些实施例中，第一靶结合结构域是抗体部分或其抗原结合片段。在一些实施例中，第一靶结合结构域特异性识别CD33的V亚基，并且第二靶结合结构域特异性识别CD33的C2亚基。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中第一靶结合结构域和第二结合结构域结合相同的靶分子，其中第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合单个靶分子上不同的非重叠靶位点，其中第一多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且第二多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR4信号传导结构域和第二TLR4信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中第一靶结合结构域和第二结合结构域结合相同的靶分子，其中第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合单个靶分子上不同的非重叠靶位点，其中第一多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且第二多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR4信号传导结构域和第二TLR4信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中第一靶结合结构域和第二结合结构域结合相同的靶分子，其中第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合单个靶分子上不同的非重叠靶位点，其中第一多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗BCMA sdAb、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且第二多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗BCMA sdAb、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR4信号传导结构域和第二TLR4信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中第一靶结合结构域和第二结合结构域结合相同的靶分子，其中第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合单个靶分子上不同的非重叠靶位点，其中第一多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且第二多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR4信号传导结构域和第二TLR4信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中第一靶结合结构域和第二结合结构域结合相同的靶分子，其中第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合单个靶分子上不同的非重叠靶位点，其中第一多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且第二多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR4信号传导结构域和第二TLR4信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中第一靶结合结构域和第二结合结构域结合相同的靶分子，其中第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合单个靶分子上不同的非重叠靶位点，其中第一多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD33 V结构域sdAb、TLR2跨膜结构域和TLR2信号传导结构域(例如，TLR2的胞内部分)，并且第二多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD33 C2结构域sdAb、TLR1跨膜结构域和TLR1信号传导结构域(例如，TLR1的胞内部分)，并且其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域；和c)工程化受体，其中工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域，并且其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，工程化受体包含特异性识别与第一多肽和第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域。在一些实施例中，工程化受体包含特异性识别与第一多肽相同的靶分子(其不同于第二多肽的靶分子)的细胞外结构域。在一些实施例中，工程化受体包含特异性识别与第二多肽相同的靶分子(其不同于第一多肽的靶分子)的细胞外结构域。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域是抗体部分或其抗原结合片段。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合多聚体靶分子的亚基。在一些实施例中，多聚体靶分子的亚基不同。在一些实施例中，第一靶结合结构域特异性识别CD33的V亚基，并且第二靶结合结构域特异性识别CD33的C2亚基。在一些实施例中，多聚体靶分子的亚基相同。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域特异性识别CD20的亚基。在一些实施例中，工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子上的非重叠靶位点的细胞外结构域。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，工程化受体包含特异性识别CD19、CLL1、GPC3和BCMA中任一种的细胞外结构域。在一些实施例中，工程化受体是CAR，如CD19 CAR、CLL1 CAR、GPC3 CAR或BCMA CAR。在一些实施例中，工程化受体是工程化TCR。在一些实施例中，工程化受体是TAC受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR4跨膜结构域，和iii)第一TLR4信号传导结构域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR4跨膜结构域，和iii)第二TLR4信号传导结构域；和c)工程化受体，其中工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域，其中工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域，并且其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR4信号传导结构域和第二TLR4信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自是NKG2D的细胞外NKG2D结合结构域。在一些实施例中，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域是抗体部分或其抗原结合片段。在一些实施例中，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域是scFv或sdAb。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽相同。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自是特异性结合CD20的scFv。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自是特异性结合GPRC5D的scFv。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自是特异性结合BCMA的sdAb。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自是特异性结合CD33的sdAb。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不同。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR2跨膜结构域，和iii)第一TLR2信号传导结构域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR1跨膜结构域，和iii)第二TLR1信号传导结构域；和c)工程化受体，其中工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域，其中工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域，并且其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR2信号传导结构域和第二TLR1信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域是抗体部分或其抗原结合片段。在一些实施例中，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域是scFv或sdAb。在一些实施例中，第一靶结合结构域是抗体部分或其抗原结合片段。在一些实施例中，第一靶结合结构域特异性识别CD33的V亚基，并且第二靶结合结构域特异性识别CD33的C2亚基。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域；和c)工程化受体，其中工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域，其中工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域，其中第一多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且第二多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR4信号传导结构域和第二TLR4信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域；和c)工程化受体，其中工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域，其中工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域，其中第一多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且第二多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR4信号传导结构域和第二TLR4信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域；和c)工程化受体，其中工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域，其中工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域，其中第一多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且第二多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR4信号传导结构域和第二TLR4信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域；和c)工程化受体，其中工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域，其中工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域，其中第一多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗BCMA sdAb、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且第二多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗BCMA sdAb、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR4信号传导结构域和第二TLR4信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域；和c)工程化受体，其中工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域，其中工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域，其中第一多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且第二多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)，并且其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR4信号传导结构域和第二TLR4信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了经修饰的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域；和c)工程化受体，其中工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域，其中工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域，其中第一多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD33 V结构域sdAb、TLR2跨膜结构域和TLR2信号传导结构域(例如，TLR2的胞内部分)，并且第二多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD33 C2结构域sdAb、TLR1跨膜结构域和TLR1信号传导结构域(例如，TLR1的胞内部分)，并且其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了表达CAR的免疫细胞(例如，CAR-T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合多聚体靶分子的亚基。在一些实施例中，多聚体靶分子的亚基不同。在一些实施例中，多聚体靶分子的亚基相同。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二结合结构域结合相同的靶分子。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二结合结构域各自结合靶分子上的相同靶位点。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域相同。在一些实施例中，其中第一靶结合结构域和第二结合结构域结合相同的靶分子，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合单个靶分子上不同的非重叠靶位点。在一些实施例中，CAR包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域。在一些实施例中，CAR包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子上的非重叠靶位点的细胞外结构域。在一些实施例中，CAR包含特异性识别CD19、CLL1、GPC3和BCMA中任一种的细胞外结构域(例如，单个BCMA CAR或串联BCMA CAR)。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了表达TCR的免疫细胞(例如，TCR-T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合多聚体靶分子的亚基。在一些实施例中，多聚体靶分子的亚基不同。在一些实施例中，多聚体靶分子的亚基相同。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二结合结构域结合相同的靶分子。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二结合结构域各自结合靶分子上的相同靶位点。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域相同。在一些实施例中，其中第一靶结合结构域和第二结合结构域结合相同的靶分子，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合单个靶分子上不同的非重叠靶位点。在一些实施例中，TCR包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域。在一些实施例中，TCR包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子上的非重叠靶位点的细胞外结构域。在一些实施例中，TCR包含特异性识别CD19、CLL1、GPC3和BCMA中任一种的细胞外结构域(例如，单个BCMA TCR或串联BCMA TCR)。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了表达TAC的免疫细胞(例如，TAC-T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合多聚体靶分子的亚基。在一些实施例中，多聚体靶分子的亚基不同。在一些实施例中，多聚体靶分子的亚基相同。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二结合结构域结合相同的靶分子。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二结合结构域各自结合靶分子上的相同靶位点。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域相同。在一些实施例中，其中第一靶结合结构域和第二结合结构域结合相同的靶分子，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合单个靶分子上不同的非重叠靶位点。在一些实施例中，TAC包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域。在一些实施例中，TAC包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子上的非重叠靶位点的细胞外结构域。在一些实施例中，TAC包含特异性识别CD19、CLL1、GPC3和BCMA中任一种的细胞外结构域(例如，单个BCMA TAC或串联BCMA TAC)。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了表达CAR的免疫细胞(例如，CAR-T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域(例如，抗体部分或其抗原结合片段)，ii)第一TLR4跨膜结构域，和iii)第一TLR4信号传导结构域，和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域(例如，抗体部分或其抗原结合片段)，ii)第二TLR4跨膜结构域，和iii)第二TLR4信号传导结构域，其中在靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR4信号传导结构域和第二TLR4信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR4信号传导的TLR4信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽进一步包含信号肽(例如，前导序列)。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽相同。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗BCMAsdAb、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞表达抗CD19 CAR。在一些实施例中，抗CD19 CAR从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗CD19 CAR包含与SEQ ID NO:2具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CD19 CAR包含SEQ ID NO:2。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞表达抗CLL1 CAR。在一些实施例中，抗CLL1 CAR从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CLL1 sdAb、CD28α铰链结构域、CD28α跨膜(TM)结构域、CD28共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗CLL1 CAR包含与SEQ IDNO:4具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CLL1 CAR包含SEQ ID NO:4。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞表达抗BCMA CAR(例如，单个抗BCMA CAR或串联抗BCMA CAR)。在一些实施例中，抗BCMA CAR从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗BCMA CAR包含与SEQ ID NO:67具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗BCMA CAR包含SEQ ID NO:67。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自包含与SEQ ID NO:40具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自包含SEQ ID NO:40。在一些实施例中，抗BCMA CAR从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗BCMA CAR包含与SEQ ID NO:66具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗BCMA CAR包含SEQ ID NO:66。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞表达抗GPC3 CAR。在一些实施例中，抗GPC3 CAR从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPC3 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗GPC3 CAR包含与SEQ ID NO:56具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗GPC3 CAR包含SEQ ID NO:56。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自包含与SEQ ID NO:40具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自包含SEQ ID NO:40。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗CD19 CAR和抗CD20 TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:1具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:1。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗CLL1 CAR和抗CD33 TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CLL1sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:71具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:71。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗CD19 CAR和抗NKG2D TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:59具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:59。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2D ECD、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:60具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:60。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗GPC3 CAR和抗NKG2DTLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPC3scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:57具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:57。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPC3 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2D ECD、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQID NO:58具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:58。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗BCMA CAR(例如，单个抗BCMA CAR或串联抗BCMA CAR)和抗BCMA TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、单个抗BCMA sdAb、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:62具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ IDNO:62。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMAsdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:63具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:63。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD28α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:64具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:64。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、串联抗BCMA sdAb、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ IDNO:61具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:61。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗BCMA CAR(例如，单个抗BCMA CAR或串联抗BCMA CAR)和抗GPRC5D TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:65具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:65。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗GPRC5D scFv、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:72具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:72。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗GPRC5DscFv、CD28α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:73具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:73。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了表达CAR的免疫细胞(例如，CAR-T细胞)，其包含a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域(例如，抗体部分或其抗原结合片段)，ii)TLR2跨膜结构域，和iii)第一TLR2信号传导结构域，和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域(例如，抗体部分或其抗原结合片段)，ii)TLR1跨膜结构域，和iii)TLR1信号传导结构域，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，TLR1信号传导结构域和TLR2信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，第一多肽和/或第二多肽进一步包含信号肽(例如，前导序列)。在一些实施例中，第一多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD33 V结构域sdAb、TLR2跨膜结构域和TLR2信号传导结构域(例如，TLR2的胞内部分)，并且第二多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD33 C2结构域sdAb、TLR1跨膜结构域和TLR1信号传导结构域(例如，TLR1的胞内部分)。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞表达抗CLL1 CAR。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞表达抗CLL1/CD33双CAR。在一些实施例中，抗CLL1/CD33双CAR从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CLL1 sdAb、抗CD33 V结构域sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗CLL1/CD33双CAR包含与SEQ ID NO:43具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CLL1/CD33双CAR包含SEQ ID NO:43。在一些实施例中，第一多肽包含与SEQ ID NO:41具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第一多肽包含SEQ ID NO:41。在一些实施例中，第二多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第二多肽包含SEQ ID NO:42。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗CLL1 CAR和抗CD33(例如，抗CD33 V结构域和/或抗CD33 C2结构域)TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CLL1 sdAb、CD28α铰链结构域、CD28α跨膜(TM)结构域、CD28共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗CD33 V结构域sdAb、TLR2跨膜结构域、TLR2信号传导结构域(例如，TLR2的胞内部分)、P2A切割位点、信号肽、抗CD33 C2结构域sdAb、TLR1跨膜结构域和TLR1信号传导结构域(例如，TLR的胞内部分)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:3。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
免疫细胞
经修饰的免疫细胞可衍生自多种细胞类型和细胞来源。本文考虑了来自任何哺乳动物物种的细胞，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴和人。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是人细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞与接受者个体是同种异体的(即，来自相同的物种，但不同的捐赠者)。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是自体的(即，捐赠者和接受者是相同的)。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是同基因的(即，捐赠者和接受者是不同的个体，但是为同卵双胞胎)。
在一些实施例中，经修饰的免疫细胞衍生自原代细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是从个体分离的原代细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞从分离自个体的原代细胞繁殖(如增殖和/或分化)。在一些实施例中，原代细胞是造血谱系的细胞。在一些实施例中，原代细胞获自胸腺。在一些实施例中，原代细胞获自淋巴或淋巴结(如肿瘤引流淋巴结)。在一些实施例中，原代细胞获自脾。在一些实施例中，原代细胞获自骨髓。在一些实施例中，原代细胞获自血液，如外周血。在一些实施例中，原代细胞是外周血单个核细胞(PBMC)。在一些实施例中，原代细胞衍生自血浆。在一些实施例中，原代细胞衍生自肿瘤。在一些实施例中，原代细胞获自粘膜免疫系统。在一些实施例中，原代细胞获自活检样品。
在一些实施例中，经修饰的免疫细胞衍生自细胞系。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞获自商业细胞系。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是从分离自个体的原代细胞建立的细胞系。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞从细胞系繁殖(如增殖和/或分化)。在一些实施例中，细胞系是非永生(mortal)细胞系。在一些实施例中，细胞系是永生化细胞系。在一些实施例中，细胞系是肿瘤细胞系，如白血病或淋巴瘤细胞系。在一些实施例中，细胞系是衍生自PBMC的细胞系。在一些实施例中，细胞系是干细胞系。在一些实施例中，细胞系选自由HEK293-6E细胞、NK-92细胞和Jurkat细胞组成的组。
可用于本申请的示例性免疫细胞包括但不限于树突状细胞(包括未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞)、T淋巴细胞(如初始T细胞、效应T细胞、记忆T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、自然杀伤T细胞、Treg细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞)、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、及其组合。免疫细胞亚群可以通过本领域已知的一种或多种细胞表面标志物(例如，CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD11c、CD123、CD56、CD34、CD14、CD33等)的存在或不存在来定义。在药物组合物包含多个经修饰的免疫细胞的情况下，这些经修饰的免疫细胞可以是免疫细胞类型的特定亚群、免疫细胞类型的亚群的组合、或者两种或更多种免疫细胞类型的组合。在一些实施例中，免疫细胞存在于同质细胞群中。在一些实施例中，免疫细胞存在于在免疫细胞中增强的异质细胞群中。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞不是淋巴细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞适用于过继免疫疗法。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是PBMC。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是衍生自PBMC的免疫细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是T细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是CD4+T细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是CD8+T细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是B细胞。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是NK细胞。
在一些实施例中，经修饰的免疫细胞衍生自干细胞。在一些实施例中，干细胞是全能干细胞。在一些实施例中，干细胞是多能干细胞。在一些实施例中，干细胞是单能干细胞。在一些实施例中，干细胞是祖细胞。在一些实施例中，干细胞是胚胎干细胞。在一些实施例中，干细胞是造血干细胞。在一些实施例中，干细胞是间充质干细胞。在一些实施例中，干细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。
经修饰的免疫细胞可以包含任何数量(如1、2、3、4、5、10、50、100、1000或更多个中任一个)的异源核酸序列(包括第一和第二核酸序列)。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含单拷贝的第一和/或第二异源核酸序列。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含多拷贝的第一和/或第二异源核酸序列。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞还包含至少一个另外的异源核酸序列，例如，编码免疫调节剂如细胞因子、趋化因子和/或免疫检查点抑制剂的异源核酸序列。
可以将包含本文所述的一个或多个异源核酸序列的一种或多种核酸瞬时或稳定掺入经修饰的免疫细胞中。在一些实施例中，一种或多种核酸在经修饰的免疫细胞中瞬时表达。例如，一种或多种核酸可以以染色体外阵列的形式存在于经修饰的免疫细胞的细胞核中。可以使用本领域已知的任何转染或转导方法(包括病毒或非病毒方法)，将一种或多种核酸引入经修饰的免疫细胞中。示例性非病毒转染方法包括但不限于基于化学的转染，如使用磷酸钙、树状聚合物、脂质体、或阳离子聚合物(例如，DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺)；非化学方法，如电穿孔、细胞挤压、声孔效应、光学转染、刺穿染、原生质体融合、水动力递送或转座子；基于粒子的方法，如使用基因枪、磁转染或磁辅助转染、粒子轰击；和混合方法，如核转染。
在一些实施例中，一个或多个异源核酸序列存在于经修饰的免疫细胞的基因组中。例如，可以通过本领域已知的任何方法将包含一个或多个异源核酸序列的一种或多种核酸整合到经修饰的免疫细胞的基因组中，这些方法包括但不限于病毒介导的整合、随机整合、同源重组方法和定点整合方法，如使用位点特异性重组酶或整合酶、转座酶、转录激活因子样效应因子核酸酶CRISPR/Cas9和锌指核酸酶。在一些实施例中，将一个或多个异源核酸序列整合到经修饰的免疫细胞基因组的特定设计的基因座中。在一些实施例中，将一个或多个异源核酸序列整合到经修饰的免疫细胞基因组的整合热点中。在一些实施例中，将异源核酸(序列)整合到经修饰的免疫细胞基因组的随机基因座中。在单个经修饰的免疫细胞中存在多拷贝的一个或多个异源核酸序列的情况下，可以将异源核酸序列整合到经修饰的免疫细胞基因组的多个基因座中。
TLR多肽
本文所述的经修饰的免疫细胞表达toll样受体(TLR)多肽(例如，第一TLR多肽和第二TLR多肽；在本文中也分别称为第一多肽和第二多肽)。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞表达至少一种TLR多肽。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞表达两种TLR多肽。本申请还提供了TLR多肽及其组合物。在一些实施例中，本文提供的TLR多肽通过在抗原刺激后诱导TLR信号传导来提供强共刺激抗肿瘤效果。
TLR多肽衍生自TLR分子。TLR是I型跨膜糖蛋白，其特征在于存在含有富含亮氨酸重复序列(LRR)的细胞外结构域，该细胞外结构域负责介导配体识别。细胞外结构域之后是单个跨膜螺旋和细胞内Toll样/白细胞介素-1(IL-1)受体(TIR)结构域。在一些实施例中，TIR结构域负责下游信号传导(例如，诱导TLR信号传导)。TLR的结构域和功能是本领域熟知的。参见例如，Jin等人,200829(2):182-91。
在一些实施例中，这些TLR分子选自由以下组成的组：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10。在一些实施例中，TLR多肽衍生自TLR1。在一些实施例中，TLR多肽衍生自TLR2。在一些实施例中，TLR多肽衍生自TLR4。在一些实施例中，TLR多肽衍生自TLR6。
在一些实施例中，TLR多肽在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时二聚化，这导致第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，TLR多肽形成同源二聚体(例如，两个相同TLR分子的二聚化)。同源二聚体可以与衍生自TLR3、TLR4、TLR5或TLR9的TLR多肽形成。在一些实施例中，第一和第二TLR多肽各自包含TLR3跨膜结构域和TLR3信号传导结构域。在一些实施例中，第一和第二TLR多肽各自包含TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域。在一些实施例中，第一和第二TLR多肽各自包含TLR5跨膜结构域和TLR5信号传导结构域。在一些实施例中，第一和第二TLR多肽各自包含TLR9跨膜结构域和TLR9信号传导结构域。
在一些实施例中，TLR多肽形成异源二聚体(例如，两种不同TLR多肽的二聚化)。异源二聚体可以与衍生自TLR1/TLR2、TLR1/TLR4、TLR2/TLR6、TLR2/TLR10或TLR4/TLR5的TLR多肽形成。在一些实施例中，第一TLR多肽包含TLR1跨膜结构域和TLR1信号传导结构域，并且第二TLR多肽包含TLR2跨膜结构域和TLR2信号传导结构域；或者第一TLR多肽包含TLR2跨膜结构域和TLR2信号传导结构域，并且第二TLR多肽包含TLR1跨膜结构域和TLR1信号传导结构域。在一些实施例中，第一TLR多肽包含TLR1跨膜结构域和TLR1信号传导结构域，并且第二TLR多肽包含TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域；或者第一TLR多肽包含TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域，并且第二TLR多肽包含TLR1跨膜结构域和TLR1信号传导结构域。在一些实施例中，第一TLR多肽包含TLR2跨膜结构域和TLR2信号传导结构域，并且第二TLR多肽包含TLR6跨膜结构域和TLR6信号传导结构域；或者第一TLR多肽包含TLR6跨膜结构域和TLR6信号传导结构域，并且第二TLR多肽包含TLR2跨膜结构域和TLR2信号传导结构域。在一些实施例中，第一TLR多肽包含TLR2跨膜结构域和TLR2信号传导结构域，并且第二TLR多肽包含TLR10跨膜结构域和TLR10信号传导结构域；或者第一TLR多肽包含TLR10跨膜结构域和TLR10信号传导结构域，并且第二TLR多肽包含TLR2跨膜结构域和TLR2信号传导结构域。在一些实施例中，第一TLR多肽包含TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域，并且第二TLR多肽包含TLR5跨膜结构域和TLR5信号传导结构域；或者第一TLR多肽包含TLR5跨膜结构域和TLR5信号传导结构域，并且第二TLR多肽包含TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域。
示例性TLR分子列出于下表1中。
表1.示例性Toll样受体序列。
在一些实施例中，与不包含所述TLR受体结构域的经修饰的免疫细胞相比，TLR多肽通过经修饰的免疫细胞诱导针对靶细胞的细胞毒性增加，如增加至少约10％、20％、30％、40％、2倍、4倍、6倍或更多中的任一个。在一些实施例中，与不包含所述TLR受体结构域的经修饰的免疫细胞相比，TLR受体结构域通过经修饰的免疫细胞诱导针对靶细胞的细胞毒性增加，如增加不超过约6倍、4倍、2倍、40％、30％、20％、10％或更少中的任一个。在一些实施例中，通过乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性测定和/或与靶肿瘤细胞的共培养测定来测量细胞毒性。在一些实施例中，在基于细胞的测定中测量细胞毒性和肿瘤细胞杀伤能力。在一些实施例中，在体内测量细胞毒性和肿瘤细胞杀伤能力。
在一些实施例中，与不包含所述TLR受体结构域的经修饰的免疫细胞相比，TLR多肽通过经修饰的免疫细胞诱导炎性细胞因子分泌水平降低，如降低至少约10％、20％、30％、40％、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、12倍、14倍、16倍、18倍、20倍、30倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更多中的任一个。在一些实施例中，与不包含所述TLR多肽的经修饰的免疫细胞相比，TLR多肽通过经修饰的免疫细胞诱导炎性细胞因子分泌水平降低，如降低不超过约1000倍、500倍、200倍、100倍、50倍、30倍、20倍、18倍、16倍、14倍、12倍、10倍、8倍、6倍、4倍、50％、40％、30％、20％、10％或更少中的任一个。在一些实施例中，与不包含所述TLR多肽的经修饰的免疫细胞相比，TLR多肽通过经修饰的免疫细胞诱导炎性细胞因子分泌水平降低，如降低约10％-50％、2-1000倍、2-50倍、50-100倍、100-1000倍、50-500倍、10-100倍、10-50倍或50-200倍中的任一个之间。示例性炎性细胞因子包括但不限于，例如IFN-γ、TNF-α和GM-CSF。在一些实施例中，通过在血清免疫测定(如酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光免疫测定(CIA)或流式细胞术)中测量炎性细胞因子的分泌水平。在一些实施例中，在基于细胞的测定中测量炎性细胞因子分泌水平。在一些实施例中，在体内测量炎性细胞因子分泌水平。
在一些实施例中，TLR多肽是共刺激分子。在一些实施例中，TLR多肽共刺激分子是诱导型共刺激分子，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。
在一些实施例中，诱导型共刺激分子经由自切割肽(如P2A)与工程化受体(例如，本文所述的工程化受体中的任一种)连接。在一些实施例中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，TLR多肽包含跨膜结构域和信号传导结构域。在一些实施例中，TLR多肽是共刺激分子，并且包含TLR跨膜结构域和TLR信号传导结构域。在一些实施例中，信号传导结构域是细胞内结构域，如细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，TLR多肽包含：(a)靶结合结构域，(b)跨膜结构域；和(c)信号传导结构域(例如，细胞内信号传导结构域)。任选地，TLR多肽进一步包含信号传导肽。
在一些实施例中，TLR多肽包含与TLR信号传导结构域直接或间接融合的跨膜结构域。在一些实施例中，TLR多肽包含与靶结合结构域(例如，第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域)直接或间接融合的跨膜结构域。在一些实施例中，TLR多肽包含同时与靶结合结构域和TLR信号传导结构域直接或间接融合的跨膜结构域。在一些实施例中，TLR多肽包含来自TLR分子的TLR跨膜结构域。在一些实施例中，TLR分子选自由以下组成的组：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10。在一些实施例中，TLR跨膜结构域衍生自TLR1。在一些实施例中，TLR跨膜结构域衍生自TLR2。在一些实施例中，TLR跨膜结构域衍生自TLR4。在一些实施例中，TLR跨膜结构域衍生自TLR6。
在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含第一多肽和第二多肽。在一些实施例中，第一多肽包含第一靶结合结构域、第一TLR跨膜结构域和第一TLR信号传导结构域。在一些实施例中，第二多肽包含第二靶结合结构域、第二TLR跨膜结构域和第二TLR信号传导结构域。
在一些实施例中，第一TLR跨膜结构域和第一TLR信号传导结构域衍生自相同TLR分子。在一些实施例中，第一TLR跨膜结构域和/或第一TLR信号传导结构域衍生自由以下组成的组：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10。在一些实施例中，第一TLR跨膜结构域和/或第一TLR信号传导结构域衍生自由以下组成的组：TLR1、TLR2、TLR4和TLR6。在一些实施例中，第一TLR跨膜结构域和/或第一TLR信号传导结构域衍生自TLR1。在一些实施例中，第一TLR跨膜结构域和/或第一TLR信号传导结构域衍生自TLR4。
在一些实施例中，第二TLR跨膜结构域和第二TLR信号传导结构域衍生自相同TLR分子。在一些实施例中，第二TLR跨膜结构域和/或第二TLR信号传导结构域衍生自由以下组成的组：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10。在一些实施例中，第二TLR跨膜结构域和/或第二TLR信号传导结构域衍生自由以下组成的组：TLR1、TLR2、TLR4和TLR6。在一些实施例中，第二TLR跨膜结构域和/或第一TLR信号传导结构域衍生自TLR2。
在一些实施例中，第一TLR跨膜结构域和第二TLR跨膜结构域相同。在一些实施例中，第一TLR跨膜结构域衍生自TLR1，并且第二TLR跨膜结构域衍生自TLR1。在一些实施例中，第一TLR跨膜结构域衍生自TLR2，并且第二TLR跨膜结构域衍生自TLR2。在一些实施例中，第一TLR跨膜结构域衍生自TLR4，并且第二TLR跨膜结构域衍生自TLR4。在一些实施例中，第一TLR跨膜结构域衍生自TLR6，并且第二TLR跨膜结构域衍生自TLR6。
在一些实施例中，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相同。在一些实施例中，第一TLR信号传导结构域衍生自TLR1，并且第二TLR信号传导结构域衍生自TLR1。在一些实施例中，第一TLR信号传导结构域衍生自TLR2，并且第二TLR信号传导结构域衍生自TLR2。在一些实施例中，第一TLR信号传导结构域衍生自TLR4，并且第二TLR信号传导结构域衍生自TLR4。在一些实施例中，第一TLR信号传导结构域衍生自TLR6，并且第二TLR信号传导结构域衍生自TLR6。
在一些实施例中，第一TLR跨膜结构域和第二TLR跨膜结构域不同。在一些实施例中，第一TLR跨膜结构域衍生自TLR2，并且第二TLR跨膜结构域衍生自TLR1。在一些实施例中，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域不同。在一些实施例中，第一TLR信号传导结构域衍生自TLR2，并且第二TLR信号传导结构域衍生自TLR1。在一些实施例中，第一TLR跨膜结构域衍生自TLR2，第一TLR信号传导结构域衍生自TLR2，第二TLR跨膜结构域衍生自TLR1，并且第二TLR信号传导结构域衍生自TLR1。
在一些实施例中，本文所述的TLR多肽包含靶结合结构域。在一些实施例中，靶结合结构域不是衍生自受体或配体。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不是衍生自TGFβ。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不是TGFβ。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ细胞外结构域。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽不包含TGFβ的细胞外TGFβ结合结构域(例如，TGFβR1和/或TGFβR2)。在一些实施例中，靶结合结构域不包含TGFβR1的细胞外TGFβ结合结构域。在一些实施例中，靶结合结构域不包含TGFβR2的细胞外TGFβ结合结构域。在一些实施例中，靶结合结构域不是细胞外TGFβ结合结构域。在一些实施例中，靶结合结构域不是TGFβR2的细胞外TGFβ结合结构域。在一些实施例中，靶结合结构域不是TGFβRl的细胞外TGFβ结合结构域。在一些实施例中，TLR多肽(例如，第一多肽和/或第二多肽)不是WO 2018/094244 A1中描述的嵌合TGFβ受体CTBR信号变换器，该文献通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，本文提供的经修饰的免疫细胞包含第一和第二TLR多肽，其中第一TLR多肽包含第一靶结合结构域，并且第二TLR多肽包含第二靶结合结构域。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域相同。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二靶结合结构域不同。
在一些实施例中，TLR多肽的靶结合结构域是抗体或抗体片段，如scFv、Fv、Fab、(Fab’)2、单域抗体(sdAb)、或VHH结构域。在一些实施例中，该多肽是靶分子的受体的配体或细胞外部分。在一些实施例中，靶分子是肿瘤抗原。在一些实施例中，TLR多肽的靶结合结构域特异性结合单个肿瘤抗原。在一些实施例中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CLL1、CD38、CEA、EGFR(如EGFRvIII)、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1、和具有临床意义的其他肿瘤抗原、及其组合。在一些实施例中，TLR多肽特异性结合选自由以下组成的组的靶抗原：NKG2D、GPRC5D、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、AFP、CD4、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD70、CD123、CEA、EGFR(如EGFRvIII)、GD2、GPC-2、GPC3、CLDN18.2、HER2、LILRB4、IL-13Rα2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1、NKG2D、CLL1、TGFaRII、TGFbRII、CCR5、CXCR4、CCR4、HPV相关抗原和EBV相关抗原(例如，LMP1或LMP2)。在一些实施例中，靶结合结构域特异性结合CD33、CLL1、CD123、CD19、CD20、CD22、BCMA、NKG2D、GPRC5D或GPC3。
在一些实施例中，靶分子是免疫检查点蛋白。在一些实施例中，靶分子选自由以下组成的组：PD-1、CD70、CD27、SIRPα和TIGIT。
在一些实施例中，靶分子是在免疫细胞上表达的天然蛋白质。在一些实施例中，靶分子是NKG2D。在一些实施例中，靶分子是突变的NKG2D。在一些实施例中，突变的NKG2D包含截短的序列和/或氨基酸取代、突变、添加和/或缺失。在一些实施例中，靶分子是NKG2D的细胞外抗原结合结构域(本文也称为“NKG2DECD”)。在一些实施例中，靶分子是NKG2D的全长序列。在一些实施例中，NKG2D包含与SEQ ID NO:54具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第二多肽包含SEQ ID NO:54。在一些实施例中，NKG2D包含NKG2D的ECD全长序列的位置81-216处的氨基酸(SEQ ID NO:54)。在一些实施例中，NKG2D包含与SEQ ID NO:51具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第二多肽包含SEQ ID NO:51。在一些实施例中，NKG2D包含NKG2D的ECD全长序列位置89-216处的氨基酸(SEQ ID NO:54)。在一些实施例中，NKG2D包含与SEQ ID NO:52具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第二多肽包含SEQ ID NO:52。在一些实施例中，NKG2D包含NKG2D的ECD全长序列位置98-216处的氨基酸(SEQ ID NO:54)。在一些实施例中，NKG2D包含与SEQ ID NO:53具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第二多肽包含SEQ ID NO:53。
在一些实施例中，TLR多肽进一步包含信号肽，该信号肽将TLR多肽靶向细胞(例如，ER)的分泌途径，并将允许TLR多肽整合和锚定到宿主细胞的脂质双层中。适用于本文所述的TLR多肽且包含天然存在的蛋白的信号序列或合成的、非天然存在的信号序列的信号肽对于本领域技术人员将是显而易见的。在一些实施例中，信号肽来源于选自下组的分子，该组由以下组成：CD8α、GM-CSF受体α、IL-3、和IgG1重链。在一些实施例中，信号肽源自CD8α。
TLR多肽可以包含位于不同结构域之间的一个或多个肽接头。例如，靶结合结构域和TLR跨膜结构域和/或TLR跨膜结构域和TLR信号传导结构域可以经由肽键或经由肽接头彼此融合。连接不同结构域的肽接头可以相同或不同。每个肽接头可以单独优化。肽接头可以具有任何合适的长度。在一些实施例中，肽接头的长度为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50个或更多个氨基酸中的任一个。在一些实施例中，肽接头的长度为不多于约50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5个或更少个氨基酸中的任一个。在一些实施例中，肽接头的长度为以下中的任一个：约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸长、约30个氨基酸至约50个氨基酸、或约1个氨基酸至约50个氨基酸。
肽接头可具有天然存在的序列或非天然存在的序列。在一些实施例中，肽接头是柔性接头。示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n(SEQ ID NO:27)、(GSGGS)n(SEQ ID NO:28)和(GGGS)n(SEQ ID NO:29)，其中n是至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头。在一些实施例中，肽接头具有SEQ ID NO:25或26的氨基酸序列。
在一些实施例中，TLR多肽包含衍生自相同TLR分子的跨膜结构域和信号传导结构域。在一些实施例中，TLR多肽包含TLR1跨膜结构域和TLR1信号传导结构域。在一些实施例中，TLR多肽包含TLR2跨膜结构域和TLR2信号传导结构域。在一些实施例中，TLR多肽包含TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域。在一些实施例中，TLR多肽包含TLR6跨膜结构域和TLR6信号传导结构域。在一些实施例中，TLR多肽进一步包含信号肽(例如，前导序列)。在一些实施例中，TLR多肽进一步包含细胞因子受体的细胞内结构域。
在一些实施例中，包含衍生自相同TLR分子的跨膜结构域和信号传导结构域的TLR多肽进一步包含靶结合结构域。在一些实施例中，靶结合结构域是特异性结合NKG2D、CD33、CLL1、CD123、CD19、CD20、CD22、BCMA、GPRC5D或GPC3的scFv或sdAb。在一些实施例中，包含衍生自相同TLR分子的跨膜结构域和信号传导结构域的TLR多肽进一步包含特异性结合CD33的靶结合结构域。在一些实施例中，包含衍生自相同TLR分子的跨膜结构域和信号传导结构域的TLR多肽进一步包含特异性结合CD33的V结构域的靶结合结构域。在一些实施例中，TLR多肽包含TLR2跨膜结构域、衍生的TLR2信号传导结构域和特异性结合CD33的V结构域的靶结合结构域。在一些实施例中，包含衍生自相同TLR分子的跨膜结构域和信号传导结构域的TLR多肽进一步包含特异性结合CD33的C2结构域的靶结合结构域。在一些实施例中，TLR多肽包含TLR1跨膜结构域、衍生的TLR1信号传导结构域和特异性结合CD33的C2结构域的靶结合结构域。在一些实施例中，包含衍生自相同TLR分子的跨膜结构域和信号传导结构域的TLR多肽进一步包含特异性结合CD20的靶结合结构域。在一些实施例中，TLR多肽包含TLR4跨膜结构域、衍生的TLR4信号传导结构域和特异性结合CD20的靶结合结构域。在一些实施例中，包含衍生自相同TLR分子的跨膜结构域和信号传导结构域的TLR多肽进一步包含特异性结合CD33的靶结合结构域。在一些实施例中，TLR多肽包含TLR4跨膜结构域、衍生的TLR4信号传导结构域和特异性结合CD33的靶结合结构域。在一些实施例中，包含衍生自相同TLR分子的跨膜结构域和信号传导结构域的TLR多肽进一步包含特异性结合NKG2D的靶结合结构域。在一些实施例中，TLR多肽包含TLR4跨膜结构域、衍生的TLR4信号传导结构域和特异性结合NKG2D的靶结合结构域。在一些实施例中，包含衍生自相同TLR分子的跨膜结构域和信号传导结构域的TLR多肽进一步包含特异性结合BCMA的靶结合结构域。在一些实施例中，TLR多肽包含TLR4跨膜结构域、衍生的TLR4信号传导结构域和特异性结合BCMA的靶结合结构域。在一些实施例中，包含衍生自相同TLR分子的跨膜结构域和信号传导结构域的TLR多肽进一步包含特异性结合GPRC5D的靶结合结构域。在一些实施例中，TLR多肽包含TLR4跨膜结构域、衍生的TLR4信号传导结构域和特异性结合GPRC5D的靶结合结构域。在一些实施例中，TLR多肽进一步包含信号肽(例如，前导序列)。
在一些实施例中，TLR多肽进一步包含细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，TLR多肽包含一个或多个细胞因子受体的两个或更多个细胞内结构域。在一些实施例中，细胞因子受体的细胞内结构域的C-末端与TLR信号传导结构域的N-末端融合。在一些实施例中，细胞因子受体的细胞内结构域的C-末端与TLR结构域的N-末端直接融合。在一些实施例中，细胞因子受体的细胞内结构域的C-末端与TLR结构域的N-末端间接融合，如经由接头(例如，经由柔性肽接头)或经由另一个结构域。在一些实施例中，TLR多肽从N-末端到C-末端包含：i)靶结合结构域，ii)细胞因子受体的细胞内结构域，iii)TLR跨膜结构域，和iv)TLR信号传导结构域。
在一些实施例中，细胞因子受体的细胞内结构域的N-末端与TLR信号传导结构域的C-末端融合。在一些实施例中，细胞因子受体的细胞内结构域的N-末端与TLR信号传导结构域的C-末端直接融合。在一些实施例中，细胞因子受体的细胞内结构域的N-末端与TLR信号传导结构域的C-末端间接融合，如经由接头(例如，经由柔性肽接头)或经由另一个结构域。在一些实施例中，TLR多肽从N-末端到C-末端包含：i)靶结合结构域，ii)TLR跨膜结构域，iii)TLR信号传导结构域，和iv)细胞因子受体的细胞内结构域。
在一些实施例中，细胞因子受体衍生的细胞内结构域对一个或多个TLR多肽赋予改善的TLR信号传导(例如，抗肿瘤作用)。在一些实施例中，细胞因子受体衍生的细胞内结构域选自由以下组成的组：GM-CSF受体、IL-18受体、IL-21受体、IL-15受体和IL-23受体。在一些实施例中，细胞因子受体衍生的细胞内结构域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。
本文所述的经修饰的免疫细胞包含第一TLR多肽和第二TLR多肽。在一些实施例中，第一TLR多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域。在一些实施例中，第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的第二细胞内结构域。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，并且第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的第二细胞内结构域。在一些实施例中，第一细胞因子受体的第一细胞内结构域和第二细胞因子受体的第二细胞内结构域相同。在一些实施例中，第一细胞因子受体的第一细胞内结构域和第二细胞因子受体的第二细胞内结构域不同。在一些实施例中，第一细胞因子受体选自由以下组成的组：GM-CSF受体、IL-18受体、IL-21受体、IL-15受体和IL-23受体。在一些实施例中，第二细胞因子受体选自由以下组成的组：GM-CSF受体、IL-18受体、IL-21受体、IL-15受体和IL-23受体。在一些实施例中，第一细胞因子受体和第二细胞因子受体各自选自由以下组成的组：GM-CSF受体、IL-18受体、IL-21受体、IL-15受体和IL-23受体。在一些实施例中，第一细胞因子受体的第一细胞内结构域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。在一些实施例中，第二细胞因子受体的第二细胞内结构域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。在一些实施例中，第一细胞因子受体的第一细胞内结构域和第二细胞因子受体的第二细胞内结构域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。在一些实施例中，第一细胞因子受体的第一细胞内结构域的C-末端与第一TLR信号传导结构域的N-末端融合。在一些实施例中，第二细胞因子受体的第二细胞内结构域的C-末端与第二TLR信号传导结构域的N-末端融合。在一些实施例中，第一细胞因子受体的第一细胞内结构域的C-末端与第一TLR信号传导结构域的N-末端融合；并且，第二细胞因子受体的第二细胞内结构域的C-末端与第二TLR信号传导结构域的N-末端融合。在一些实施例中，第一细胞因子受体的第一细胞内结构域的N-末端与TLR信号传导结构域的C-末端融合。在一些实施例中，第二细胞因子受体的第二细胞内结构域的N-末端与TLR信号传导结构域的C-末端融合。在一些实施例中，第一细胞因子受体的第一细胞内结构域的N-末端与TLR信号传导结构域的C-末端融合；并且，第二细胞因子受体的第二细胞内结构域的N-末端与TLR信号传导结构域的C-末端融合。
在一些实施例中，本文所述的TLR多肽包含在经修饰的免疫细胞中。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗CD19 CAR分子和抗CD20 TLR多肽。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞表达抗CD19 CAR。在一些实施例中，抗CD19CAR从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗CD19 CAR包含与SEQ ID NO:2具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CD19CAR包含SEQ ID NO:2。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自包含与SEQ ID NO:40具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自包含SEQ IDNO:40。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:1具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:1。在一些实施例中，TLR多肽编码序列缺少推定的上游起始密码子中的一些或全部的序列。在一些实施例中，TLR多肽可以包含某些氨基酸突变，而不影响第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域之间形成TLR信号传导部分的缔合，从而不影响TLR信号传导的诱导。
在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗CD19 CAR分子和抗NKG2D TLR多肽。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗NKG2DECD、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞表达抗CD19 CAR。在一些实施例中，抗CD19 CAR从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗CD19 CAR包含与SEQ ID NO:2具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CD19 CAR包含SEQID NO:2。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自包含与SEQ ID NO:40具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自包含SEQ ID NO:40。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:59具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:59。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2D ECD、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:60具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:60。在一些实施例中，TLR多肽编码序列缺少推定的上游起始密码子中的一些或全部的序列。在一些实施例中，TLR多肽可以包含某些氨基酸突变，而不影响第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域之间形成TLR信号传导部分的缔合，从而不影响TLR信号传导的诱导。
在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗GPC3 CAR分子和抗NKG2D TLR多肽。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗NKG2DECD、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞表达抗GPC3 CAR。在一些实施例中，抗GPC3 CAR从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPC3 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗GPC3 CAR包含与SEQ ID NO:56具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗GPC3 CAR包含SEQID NO:56。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自包含与SEQ ID NO:40具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自包含SEQ ID NO:40。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPC3 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2DECD、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:57具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:57。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPC3 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2D ECD、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:58具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:58。在一些实施例中，TLR多肽编码序列缺少推定的上游起始密码子中的一些或全部的序列。在一些实施例中，TLR多肽可以包含某些氨基酸突变，而不影响第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域之间形成TLR信号传导部分的缔合，从而不影响TLR信号传导的诱导。
在一些实施例中，本文所述的TLR多肽包含在经修饰的免疫细胞中。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗CLL1 CAR分子和抗CD33 TLR多肽。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞表达抗CLL1 CAR。在一些实施例中，抗CLL1CAR从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CLL1 sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CLL1sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQID NO:71具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:71。在一些实施例中，TLR多肽编码序列缺少推定的上游起始密码子中的一些或全部的序列。在一些实施例中，TLR多肽可以包含某些氨基酸突变，而不影响第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域之间形成TLR信号传导部分的缔合，从而不影响TLR信号传导的诱导。
在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗BCMA CAR分子(例如，单个抗BCMA CAR或串联抗BCMA CAR)和抗BCMATLR多肽。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMA sdAb、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)。在一些实施例中，抗BCMA CAR从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗BCMA CAR包含与SEQ ID NO:67具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗BCMA CAR包含SEQID NO:67。在一些实施例中，抗BCMA CAR从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMAsdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗BCMA CAR包含与SEQ ID NO:66具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗BCMA CAR包含SEQ ID NO:66。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自包含与SEQID NO:40具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自包含SEQ ID NO:40。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、单个抗BCMA sdAb、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:62具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:62。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:63具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:63。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD28α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:64具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:64。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、串联抗BCMA sdAb、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:61具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:61。在一些实施例中，TLR多肽编码序列缺少推定的上游起始密码子中的一些或全部的序列。在一些实施例中，TLR多肽可以包含某些氨基酸突变，而不影响第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域之间形成TLR信号传导部分的缔合，从而不影响TLR信号传导的诱导。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗BCMA CAR分子(例如，单个抗BCMA CAR或串联抗BCMA CAR)和抗GPRC5D TLR多肽。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)。在一些实施例中，抗BCMA CAR从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗BCMA CAR包含与SEQ ID NO:66具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗BCMA CAR包含SEQ ID NO:66。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自包含与SEQ ID NO:40具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自包含SEQ ID NO:40。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗BCMA CAR(例如，单个抗BCMA CAR或串联抗BCMACAR)和抗GPRC5D TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗GPRC5DscFv、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:65具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:65。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗GPRC5D scFv、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:72具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:72。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗GPRC5D scFv、CD28α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:73具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:73。在一些实施例中，TLR多肽编码序列缺少推定的上游起始密码子中的一些或全部的序列。在一些实施例中，TLR多肽可以包含某些氨基酸突变，而不影响第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域之间形成TLR信号传导部分的缔合，从而不影响TLR信号传导的诱导。
在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗CLL1 CAR和抗CD33(例如，抗CD33 V结构域和/或抗CD33 C2结构域)TLR多肽。在一些实施例中，第一多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD33 V结构域sdAb、TLR2跨膜结构域和TLR2信号传导结构域(例如，TLR2的胞内部分)，并且第二多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD33 C2结构域sdAb、TLR1跨膜结构域和TLR1信号传导结构域(例如，TLR1的胞内部分)。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞表达抗CLL1 CAR。在一些实施例中，抗CLL1 CAR从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CLL1 sdAb、CD28α铰链结构域、CD28α跨膜(TM)结构域、CD28共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗CLL1 CAR包含与SEQ ID NO:4具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CLL1 CAR包含SEQ ID NO:4。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞表达抗CLL1/CD33双CAR。在一些实施例中，抗CLL1/CD33双CAR从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CLL1 sdAb、抗CD33 V结构域sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗CLL1/CD33双CAR包含与SEQ ID NO:43具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CLL1/CD33双CAR包含SEQ ID NO:43。在一些实施例中，第一多肽包含与SEQ ID NO:41具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第一多肽包含SEQ IDNO:41。在一些实施例中，第二多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第二多肽包含SEQ ID NO:42。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗CLL1 CAR和抗CD33(例如，抗CD33 V结构域和/或抗CD33 C2结构域)TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CLL1 sdAb、CD28α铰链结构域、CD28α跨膜(TM)结构域、CD28共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗CD33 V结构域sdAb、TLR2跨膜结构域、TLR2信号传导结构域(例如，TLR2的胞内部分)、P2A切割位点、信号肽、抗CD33C2结构域sdAb、TLR1跨膜结构域和TLR1信号传导结构域(例如，TLR1的胞内部分)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，TLR多肽编码序列缺少推定的上游起始密码子中的一些或全部的序列。在一些实施例中，TLR多肽可以包含某些氨基酸突变，而不影响第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域之间形成TLR信号传导部分的缔合，从而不影响TLR信号传导的诱导。
本文所述的TLR结构域(例如，TLR跨膜结构域和/或TLR信号传导结构域)中任一种的变体也在本披露的范围内，使得TLR结构域能够调节免疫细胞的免疫应答。在一些实施例中，与野生型对照物相比，共刺激信号传导结构域包含多达10个氨基酸残基变异(例如，1、2、3、4、5或8个)。包含一个或多个氨基酸变异的此类TLR结构域可以称为变体。相对于不包含突变的共刺激信号传导结构域，TLR信号传导结构域的氨基酸残基的突变可以导致信号转导的增加和增强的对免疫应答的刺激。相对于不包含突变的共刺激信号传导结构域，TLR信号传导结构域的氨基酸残基的突变可以导致信号转导的减少和降低的对免疫应答的刺激。
在一些实施例中，TLR多肽包含本文所述TLR结构域(例如，TLR跨膜结构域和/或TLR信号传导结构域)的氨基酸序列变体。在一些实施例中，TLR多肽包含本文所述TLR分子(例如，TLR分子的TLR跨膜结构域和/或TLR信号传导结构域)的氨基酸序列变体。例如，可能希望调节TLR多肽的生物学特性。可以通过向编码TLR分子的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备其TLR分子(如其TLR分子的跨膜结构域和/或信号传导结构域)的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如，TLR分子的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终的构建体，条件是最终的构建体具有所希望的特征，例如TLR结合和/或促炎活性。
在一些实施例中，与本文所述的TLR分子中任一个的序列相比，TLR分子包含一个或多个(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20个氨基酸或更多)保守取代。在一些实施例中，TLR分子与本文所述的TLR分子中任一个的序列具有至少约80％序列同一性，如至少约85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性中的任一个。如同本文所述的TLR多肽，包含修饰TLR分子的TLR多肽变体具有相似的抗肿瘤活性和低毒性。
保守取代显示于下表A中。
表A：保守取代
氨基酸可以根据共同的侧链特性分成不同的类别：
a.疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
b.中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
c.酸性：Asp、Glu；
d.碱性：His、Lys、Arg；
e.影响链取向的残基：Gly、Pro；
f.芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要将这些类别中的一个的成员交换为另一个类别。
本领域技术人员将认识到，可使用任何合适的方法在目的基因中产生突变，包括诱变、聚合酶链反应、同源重组或本领域技术人员已知的任何其他基因工程技术。突变可涉及单个核苷酸(如点突变，其涉及DNA序列内单个核苷酸碱基的去除、添加或取代)或者可涉及大量核苷酸的插入或缺失。突变可由于如DNA复制的保真度错误等事件而自发产生，或在暴露于化学或物理诱变剂后被诱导。也可以通过使用本领域技术人员熟知的特定靶向方法进行定点突变。
如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述，用于鉴定可以靶向诱变的多肽的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在此方法中，鉴定靶残基的残基或残基组(例如，带电荷的残基，如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换，以确定多肽试剂与其靶标(例如，第一TLR信号传导结构域与第二TLR信号传导结构域)的相互作用是否受到影响。可以在氨基酸位置引入另外的取代，证明对初始取代的功能敏感性。可以筛选变体以确定它们是否含有所希望的特性。
氨基酸序列插入包括氨基末端和/或羧基末端融合，长度在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的范围内，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。
在一些实施例中，可以包括肽标签(通常是能够被可获得的抗血清或化合物识别的短肽序列)用于随后TLR多肽的表达和运输。多种标签肽可用于本文所述的TLR多肽，但不限于PK标签、FLAG八肽、MYC标签、HIS标签(通常为4至10个组氨酸残基的一段)和e-标签(US6,686,152)。当使用几个标签时，一个或多个标签肽可以独立地位于蛋白质的N-末端、其C-末端、内部或这些位置中的任一处。可以使用抗标签抗体通过免疫检测测定法检测标签肽。
工程化受体
上述任何经修饰的免疫细胞可以进一步表达工程化受体。示例性工程化受体包括但不限于CAR、工程化TCR和TAC受体。在一些实施例中，工程化受体包含特异性结合抗原(例如，肿瘤抗原)的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含初级细胞内信号传导结构域和/或共刺激结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含TCR共受体的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，工程化受体由可操作地连接至启动子(如组成型启动子或诱导型启动子)的第三核酸编码。在一些实施例中，通过将蛋白质插入细胞膜中同时使细胞通过微流体系统(如CELL)，将工程化受体引入经修饰的免疫细胞中(参见例如，美国专利申请公开号20140287509)。工程化受体可以增强经修饰的免疫细胞的功能，如通过靶向经修饰的免疫细胞、通过转导信号和/或通过增强经修饰的免疫细胞的细胞毒性。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞不表达工程化受体，如CAR、TCR或TAC受体。
在一些实施例中，工程化受体包含靶向至少一种肿瘤抗原的一个或多个特异性结合结构域，和一个或多个细胞内效应结构域，如一个或多个初级细胞内信号传导结构域和/或共刺激结构域。
在一些实施例中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)。许多嵌合抗原受体是本领域已知的并且可以适用于本申请的经修饰的免疫细胞。也可以通过使用例如抗体分子的抗原结合片段或抗体可变结构域将CAR构建为对任何细胞表面标志物具有特异性。本文可以使用产生CAR的任何方法。参见例如，US6,410,319、US7,446,191、US7,514,537、US9765342B2、WO 2002/077029、WO2015/142675、US2010/065818、US2010/025177、US2007/059298、WO2017025038A1以及Berger C.等人,J.Clinical Investigation 118:1 294-308(2008)，将这些文献通过援引特此并入。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是CAR-T细胞。
本申请的CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，该细胞外结构域包含特异性结合至少一种肿瘤抗原的至少一个靶向结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域产生促进含CAR细胞(例如，CAR-T细胞)的免疫效应子功能的信号。“免疫效应子功能或免疫效应子应答”是指例如免疫效应子细胞的功能或应答，其增强或促进靶细胞的免疫攻击。例如，免疫效应子功能或应答可以指T或NK细胞促进杀死或抑制靶细胞生长或增殖的特性。免疫效应子功能的实例，例如在CAR-T细胞中，包括细胞溶解活性(如抗体依赖性细胞毒性，或ADCC)和辅助活性(如细胞因子的分泌)。在一些实施例中，CAR具有细胞内信号传导结构域，其具有减弱的免疫效应子功能。在一些实施例中，与具有全长和野生型CD3ζ以及任选的一个或多个共刺激结构域的CAR相比，该CAR具有不超过约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少中任一个的免疫效应子功能(如针对靶细胞的细胞溶解功能)的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域产生促进含CAR细胞增殖和/或存活的信号。在一些实施例中，CAR包含一个或多个选自CD28、CD137、CD3、CD27、CD40、ICOS、GITR和OX40的信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。天然存在的分子的信号传导结构域可包含分子或其片段或衍生物的整个细胞内(即胞内)部分或整个天然细胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，CAR的细胞内信号传导结构域包含初级细胞内信号传导结构域。“初级细胞内信号传导结构域”是指以刺激性方式起作用以诱导免疫效应子功能的胞内信号传导序列。在一些实施例中，初级细胞内信号传导结构域含有称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。在一些实施例中，初级细胞内信号传导结构域包含选自由CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、常见FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10和DAP 12组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，初级细胞内信号传导结构域包含选自由CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、常见FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10和DAP 12组成的组的蛋白质的非功能性或减弱的信号传导结构域。非功能性或减弱的信号传导结构域可以是具有减弱或消除一种或多种免疫效应子功能(如细胞溶解活性或辅助活性，包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC))的点突变、插入或缺失的突变信号传导结构域。在一些实施例中，CAR包含非功能性或减弱的CD3ζ(即，CD3ζ或CD3z)信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域不包含初级细胞内信号传导结构域。与具有相同构建体但具有野生型初级细胞内信号传导结构域的CAR相比，减弱的初级细胞内信号传导结构域可诱导不超过约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少中任一个的免疫效应子功能(如针对靶细胞的细胞溶解功能)。
在一些实施例中，CAR的细胞内信号传导结构域包含一个或多个(如1、2、3个或更多个中的任一个)共刺激结构域。“共刺激结构域”可以是共刺激分子的细胞内部分。术语“共刺激分子”是指免疫细胞(如T细胞)上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导免疫细胞的共刺激应答，如但不限于增殖和存活。共刺激分子是除抗原受体或其配体以外的有助于高效免疫应答的细胞表面分子。共刺激分子可表示为以下蛋白质家族：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)和激活性NK细胞受体。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体、以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。此类共刺激分子的另外的实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TGFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和特异性结合CD83的配体。
在一些实施例中，CAR包含单个共刺激结构域。在一些实施例中，CAR包含两个或更多个共刺激结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含功能性初级细胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。在一些实施例中，CAR不包含功能性初级细胞内信号传导结构域(如CD3ζ)。在一些实施例中，CAR包含由一个或多个共刺激结构域组成或基本上由一个或多个共刺激结构域组成的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，CAR包含由非功能性或减弱的初级细胞内信号传导结构域(如突变CD3ζ)和一个或多个共刺激结构域组成或基本上由非功能性或减弱的初级细胞内信号传导结构域(如突变CD3ζ)和一个或多个共刺激结构域组成的细胞内信号传导结构域。在靶向结构域与肿瘤抗原结合后，CAR的共刺激结构域可转导信号以增强具有CAR的工程化免疫细胞(如T细胞)的增殖、存活和分化，并抑制激活诱导的细胞死亡。在一些实施例中，该一个或多个共刺激信号传导结构域衍生自选自由以下组成的组的一个或多个分子：CD27、CD28、4-1BB(即CD137)、OX40、CD30、CD40、CD3、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性结合CD83的配体。
在一些实施例中，CAR的细胞内信号传导结构域包含衍生自CD28的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的胞内信号传导结构域和CD28的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，本申请的嵌合受体中的细胞内信号传导结构域包含衍生自4-1BB(即CD137)的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的胞内信号传导结构域和4-1BB的共刺激信号传导结构域。
在一些实施例中，CAR的细胞内信号传导结构域包含CD28的共刺激信号传导结构域和4-1BB的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的胞内信号传导结构域、CD28的共刺激信号传导结构域和4-1BB的共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含多肽，该多肽从N-末端至C-末端包含：CD28的共刺激信号传导结构域、4-1BB的共刺激信号传导结构域和CD3ζ的胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，CAR的靶向结构域是抗体或抗体片段，如scFv、Fv、Fab、(Fab’)2、单域抗体(sdAb)、或VHH结构域。在一些实施例中，CAR的靶向结构域是特异性结合肿瘤抗原的受体的配体或细胞外部分。在一些实施例中，CAR的一个或多个靶向结构域特异性结合单个肿瘤抗原。在一些实施例中，CAR是具有结合两种或更多种肿瘤抗原的靶向结构域的双特异性或多特异性CAR。在一些实施例中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、NKG2D、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR(如EGFRvIII)、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1、和具有临床意义的其他肿瘤抗原、及其组合。在一些实施例中，CAR特异性结合选自由以下组成的组的靶抗原：BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、AFP、CD4、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD70、CD123、CEA、EGFR(如EGFRvIII)、GD2、GPC-2、GPC3、CLDN18.2、HER2、LILRB4、IL-13Rα2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1、NKG2D、CLL1、TGFaRII、TGFbRII、CCR5、CXCR4、CCR4、HPV相关抗原和EBV相关抗原(例如，LMP1或LMP2)。
在一些实施例中，CAR是抗CD19 CAR。多种抗原结合结构域序列可用作CAR的靶向结构域。参见例如，WO 2012/079000，将该文献以其全文并入本文。在一些实施例中，抗CD19CAR从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗CD19 scFv包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CD19 CAR包含与SEQ ID NO:2具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CD19 CAR包含SEQ ID NO:2。
在一些实施例中，抗CD19 CAR是CAR系统(例如，CAR融合构建体)的一部分，其中CAR融合构建体包含抗CD19 CAR分子和抗CD20 TLR多肽。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD20scFv、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自包含与SEQ IDNO:40具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自包含SEQ ID NO:40。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:1具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ IDNO:1。
在一些实施例中，抗CD19 CAR是CAR系统(例如，CAR融合构建体)的一部分，其中CAR融合构建体包含抗CD19 CAR分子和抗NKG2D TLR多肽。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗NKG2DECD、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自包含与SEQ IDNO:40具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自包含SEQ ID NO:40。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:59具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:59。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2D ECD、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:60具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:60。
在一些实施例中，CAR是抗CLL1 CAR。多种抗原结合结构域序列可用作CAR的靶向结构域。参见例如，WO 2012/079000，将该文献以其全文并入本文。在一些实施例中，抗CLL1CAR从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CLL1 sdAb、CD28α铰链结构域、CD28α跨膜(TM)结构域、CD28共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗CLL1 sdAb包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CLL1 CAR包含与SEQ ID NO:4具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CLL1 CAR包含SEQ ID NO:4。
在一些实施例中，CAR是抗CLL1/CD33双CAR。多种抗原结合结构域序列可用作CAR的靶向结构域。参见例如，WO 2012/079000，将该文献以其全文并入本文。在一些实施例中，抗CLL1/CD33双CAR从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CLL1 sdAb、抗CD33 V结构域sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗CLL1 sdAb包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CD33 V结构域sdAb包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CLL1/CD33双CAR包含与SEQ ID NO:43具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CLL1/CD33双CAR包含SEQ ID NO:43。
在一些实施例中，抗CLL1 CAR是CAR系统(例如，CAR融合构建体)的一部分，其中CAR融合构建体包含抗CLL1 CAR和抗CD33 TLR多肽。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜结构域和TLR4信号传导结构域(例如，TLR4的胞内部分)。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自包含与SEQ ID NO:40具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第一多肽和第二多肽各自包含SEQ ID NO:40。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CLL1 sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:71具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:71。
在一些实施例中，抗CLL1 CAR是CAR系统(例如，CAR融合构建体)的一部分，其中CAR融合构建体包含抗CLL1 CAR和抗CD33(例如，抗CD33 V结构域和/或抗CD33 C2结构域)TLR多肽。在一些实施例中，第一多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD33 V结构域sdAb、TLR2跨膜结构域和TLR2信号传导结构域(例如，TLR2的胞内部分)，并且第二多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD33 C2结构域sdAb、TLR1跨膜结构域和TLR1信号传导结构域(例如，TLR1的胞内部分)。在一些实施例中，第一多肽包含与SEQ ID NO:41具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第一多肽包含SEQ ID NO:41。在一些实施例中，第二多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第二多肽包含SEQ ID NO:42。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CLL1 sdAb、CD28α铰链结构域、CD28α跨膜(TM)结构域、CD28共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗CD33 V结构域sdAb、TLR2跨膜结构域、TLR2信号传导结构域(例如，TLR2的胞内部分)、P2A切割位点、信号肽、抗CD33 C2结构域sdAb、TLR1跨膜结构域和TLR1信号传导结构域(例如，TLR1的胞内部分)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，CAR是抗GPC3 CAR。多种抗原结合结构域序列可用作CAR的靶向结构域。参见例如，WO2012/079000，将该文献以其全文并入本文。在一些实施例中，抗GPC3CAR从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPC3 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗GPC3 scFv包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在一些实施例中，抗GPC3 CAR包含与SEQ ID NO:56具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗GPC3 CAR包含SEQ ID NO:56。
在一些实施例中，抗GPC3 CAR是CAR系统(例如，CAR融合构建体)的一部分，其中CAR融合构建体包含抗GPC3 CAR和抗NKG2D TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPC3 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2DECD、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:57具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ IDNO:57。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPC3 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2D ECD、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:58具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:58。
在一些实施例中，CAR是抗BCMA CAR(例如，单个抗BCMA CAR或串联抗BCMA CAR)。在一些实施例中，抗BCMA CAR是单个抗BCMA CAR。在一些实施例中，抗BCMA CAR是串联抗BCMA CAR。多种抗原结合结构域序列可用作CAR的靶向结构域。参见例如，WO2012/079000，将该文献以其全文并入本文。在一些实施例中，单个抗BCMA CAR从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，单个抗BCMAsdAb包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列。在一些实施例中，单个抗BCMA CAR包含与SEQ IDNO:67具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，单个抗BCMA CAR包含SEQ ID NO:67。在一些实施例中，串联抗BCMA CAR从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，串联抗BCMA sdAb包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。在一些实施例中，串联抗BCMA CAR包含与SEQ ID NO:66具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，串联抗BCMA CAR包含SEQ ID NO:66。
在一些实施例中，抗BCMA CAR是CAR系统(例如，CAR融合构建体)的一部分，其中CAR融合构建体包含抗BCMA CAR(例如，单个抗BCMA CAR或串联抗BCMA CAR)和抗BCMA TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、单个抗BCMA sdAb、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:62具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:62。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:63具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:63。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD28α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:64具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:64。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、串联抗BCMA sdAb、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:61具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ IDNO:61。
在一些实施例中，抗BCMA CAR是CAR系统(例如，CAR融合构建体)的一部分，其中CAR融合构建体包含抗BCMA CAR(例如，单个抗BCMA CAR或串联抗BCMA CAR)和抗GPRC5DTLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMAsdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:65具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:65。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗GPRC5D scFv、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:72具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:72。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗GPRC5D scFv、CD28α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:73具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:73。
在一些实施例中，CAR的跨膜结构域包含选自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154，KIRDS2，OX40，CD2，CD27，LFA-1(CD11a、CD18)，ICOS(CD278)，4-1BB(CD137)，GITR，CD40，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRFl)，CD160，CD19，IL-2Rβ，IL-2Rγ，IL-7R a，ITGA1，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TGFR2，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244、2B4)，CD84，CD96(触觉)，CEACAM1，CRT AM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CDIOO(SEMA4D)，SLAMF6(NTB-A、Lyl08)，SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46，NKG2D和/或NKG2C的跨膜结构域。在一些实施例中，CAR的跨膜结构域是CD4、CD3、CD8α或CD28跨膜结构域。在一些实施例中，CAR的跨膜结构域包含CD8α的跨膜结构域。
在一些实施例中，细胞外结构域通过铰链区与跨膜结构域连接。在一个实施例中，铰链区包含CD8α的铰链区。
在一些实施例中，CAR包含信号肽，如CD8αSP。
在一些实施例中，工程化受体是经修饰的T细胞受体。在一些实施例中，工程化TCR对肿瘤抗原有特异性。在一些实施例中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、CLL1、GPC3、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR(如EGFRvIII)、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1和具有临床意义的其他肿瘤抗原。在一些实施例中，肿瘤抗原衍生自肿瘤细胞的细胞内蛋白质。已经描述了许多对肿瘤抗原(包括肿瘤相关抗原)有特异性的TCR，包括例如NY-ESO-1癌-睾丸抗原，p53肿瘤抑制抗原，针对黑素瘤(例如，MARTI、gp 100)、白血病(例如，WT1、次要组织相容性抗原)和乳腺癌(例如，HER2、NY-BR1)中肿瘤抗原的TCR。本领域已知的任何TCR可用于本申请。在一些实施例中，TCR对肿瘤抗原具有增强的亲和力。例如在US5830755和Kessels等人Immunotherapythrough TCR gene transfer.Nat.Immunol.2,957-961(2001)中描述了示例性TCR和用于将这些TCR引入免疫细胞中的方法。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞是TCR-T细胞。
TCR受体复合体是由可变TCR受体α和β链(在γδT细胞情况下为γ和δ链)与三个二聚体信号传导模块CD3δ/ε、CD3γ/ε和CD247(T细胞表面糖蛋白CD3ζ链)ζ/ζ或ζ/η形成的八聚体复合体。每个亚基的跨膜结构域中的可电离残基形成将复合体保持在一起的相互作用的极性网络。TCR复合体具有激活T细胞中信号传导级联的功能。
在一些实施例中，工程化受体是包含一种或多种T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的工程化TCR。例如在US20170166622 A1中描述了示例性TFP，该文献通过援引并入本文。在一些实施例中，TFP包含TCR亚基的细胞外结构域，该TCR亚基包含选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、其功能性片段及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些实施例中，TFP包含跨膜结构域，该跨膜结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、其功能性片段及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些实施例中，TFP包含跨膜结构域，该跨膜结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRζ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其功能性片段、及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
在一些实施例中，TFP包含TCR亚基和抗原结合结构域，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分和含有来自CD3ε的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；其中该TCR亚基与该抗原结合结构域可操作地连接，并且其中当在T细胞中表达时，将该TFP掺入TCR中。
在一些实施例中，TFP包含TCR亚基和抗原结合结构域，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分和含有来自CD3γ的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；其中该TCR亚基与该抗原结合结构域可操作地连接，并且其中当在T细胞中表达时，将该TFP掺入TCR中。
在一些实施例中，TFP包含TCR亚基和抗原结合结构域，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分和含有来自CD3δ的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；其中该TCR亚基与该抗原结合结构域可操作地连接，并且其中当在T细胞中表达时，将该TFP掺入TCR中。
在一些实施例中，TFP包含TCR亚基和抗原结合结构域，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分和含有来自TCRα的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；其中该TCR亚基与该抗原结合结构域可操作地连接，并且其中当在T细胞中表达时，将该TFP掺入TCR中。
在一些实施例中，TFP包含TCR亚基和抗原结合结构域，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分和含有来自TCRβ的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；其中该TCR亚基与该抗原结合结构域可操作地连接，并且其中当在T细胞中表达时，将该TFP掺入TCR中。
在一些实施例中，工程化受体是T细胞抗原偶联物(TAC)受体。例如在US20160368964 A1中描述了示例性TAC受体，该文献通过援引并入本文。在一些实施例中，TAC包含靶向结构域、特异性结合与TCR复合体相关的蛋白质的TCR结合结构域和T细胞受体信号传导结构域。在一些实施例中，靶向结构域是特异性结合肿瘤抗原的抗体片段，如scFv或VHH。在一些实施例中，靶向结构域是设计的锚蛋白重复序列(DARPin)多肽。在一些实施例中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：CD19、GPC3、CLL1、BCMA、NY-ESO-1、VEGFR2、MAGE-A3、VEGFR2、MAGE-A3、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR(如EGFRvIII)、GD2、HER2、IGF1R、间皮素、PSMA、ROR1、WT1和具有临床意义的其他肿瘤抗原。在一些实施例中，与TCR复合体相关的蛋白质是CD3，如CD3ε。在一些实施例中，TCR结合结构域是单链抗体，如scFv或VHH。在一些实施例中，TCR结合结构域衍生自UCHT1。在一些实施例中，TAC受体包含胞质结构域和跨膜结构域。在一些实施例中，T细胞受体信号传导结构域包含衍生自TCR共受体的胞质结构域。示例性TCR共受体包括但不限于CD4、CD8、CD28、CD45、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在一些实施例中，TAC受体包含跨膜结构域和衍生自CD4的胞质结构域。在一些实施例中，TAC受体包含跨膜结构域和衍生自CD8(如CD8α)的胞质结构域。
T细胞共受体在T细胞上表达为膜蛋白。它们可以提供TCR:肽:MHC复合物的稳定性并促进信号转导。T细胞共受体的两种亚型CD4和CD8对特定MHC类型表现出强特异性。CD4共受体仅可以稳定TCR:MHC II复合物，而CD8共受体仅可以稳定TCR:MHC I复合物。CD4和CD8在不同T细胞类型上的差异表达导致不同的T细胞功能亚群。CD8+T细胞是细胞毒性T细胞。
CD4是在免疫细胞(如辅助性T细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞)的表面上表达的糖蛋白。CD4具有暴露于细胞外细胞表面的四个免疫球蛋白结构域(D1至D4)。CD4在其短胞内/细胞内尾上含有特定的氨基酸序列，其允许CD4尾募集酪氨酸激酶Lck并与该酪氨酸激酶Lck相互作用。当TCR复合体和CD4各自结合MHC II分子的不同区域时，TCR复合体与CD4之间的紧密接近允许与CD4的胞内尾结合的Lck对CD3的胞内结构域上的免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)进行酪氨酸磷酸化，从而扩增TCR产生的信号。
CD8是由两条α链组成的同源二聚体(较不常见)或由一条α链和一条β链组成的异源二聚体(较常见)的糖蛋白，它们各自包含通过细柄(thin stalk)与膜连接的免疫球蛋白可变(IgV)样细胞外结构域和细胞内尾。CD8主要在细胞毒性T细胞的表面上表达，但也可以在自然杀伤细胞、皮质胸腺细胞和树突状细胞上发现。CD8胞内尾与Lck相互作用，一旦TCR结合其特异性抗原就会使TCR复合体的胞内CD3和ζ链磷酸化。胞内CD3和ζ链上的酪氨酸磷酸化引发磷酸化级联，最终导致基因转录。
在一些实施例中，经修饰的免疫细胞表达多于一种工程化受体，如CAR、TCR、TAC受体的任何组合。
在一些实施例中，由经修饰的免疫细胞表达的工程化受体(如CAR、TCR或TAC)靶向一种或多种肿瘤抗原。肿瘤抗原是由可引发免疫应答、特别是T细胞介导的免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质。本披露的靶向抗原的选择将取决于待治疗的癌症的特定类型。示例性肿瘤抗原包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、CLL1、BCMA、GPC3、CD19、前列腺素、PSMA、HER2/neu、存活蛋白和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2(ephrinB2)、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
在一些实施例中，肿瘤抗原包含与恶性肿瘤相关的一个或多个抗原癌症表位。恶性肿瘤表达许多可用作免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，如黑素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和gp100以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于转化相关分子组，如癌基因HER2/Neu/ErbB-2。另一组靶抗原是癌胚胎抗原，如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成个体肿瘤所特有的真正的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原。B细胞分化抗原(如CD19、CD20和CD37)是B细胞淋巴瘤中靶抗原的其他候选物。
在一些实施例中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA是肿瘤细胞所特有的，并且不存在于体内的其他细胞上。TAA相关抗原不是肿瘤细胞所特有的，相反，它也可以在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可以在使免疫系统能够对抗原作出应答的条件下发生。TAA可能是在胚胎发育期间在正常细胞上表达的抗原，此时免疫系统不成熟且不能作出应答，或者它们可能是在正常细胞上通常以极低的水平存在但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。
TSA或TAA抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原，如MART-1/MelanA(MART-I)、gp 100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原，如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5；过表达的胚胎抗原，如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因，如p53、Ras、HER2/neu；由染色体易位产生的独特肿瘤抗原，如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，如爱泼斯坦-巴尔病毒抗原EBVA及人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他基于蛋白质的大抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环素C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
核酸
本文所述的经修饰的免疫细胞包含编码本文所述的TLR多肽(例如，第一多肽和/或第二多肽)和/或工程化受体中任一种的一个或多个异源核酸序列。
在一些实施例中，提供了分离的核酸，其包含编码本文所述的多肽(例如，TLR多肽)中任一种的核酸序列。在一些实施例中，提供了分离的核酸，其包含编码本文所述的工程化受体中任一种的核酸序列。在一些实施例中，核酸是DNA。在一些实施例中，核酸是RNA。在一些实施例中，核酸是线性的。在一些实施例中，核酸是环状的。
编码第一多肽、第二多肽的核酸序列和/或编码工程化受体的核酸可以可操作地连接至一个或多个调节序列。控制编码序列的转录和/或翻译的示例性调节序列是本领域已知的，并且可以包括但不限于启动子；用于转录的适当起始、调节和/或终止(例如，聚A转录终止序列)，mRNA转运(例如，核定位信号序列)、加工(例如，剪接信号)、稳定性(例如，内含子和非编码5'和3'序列)、翻译(例如，起始Met、三联体前导序列、IRES核糖体结合位点、信号肽等)的另外的元件；以及用于将插入物引入病毒载体中的插入位点。在一些实施例中，调节序列是启动子、转录增强子和/或允许TLR多肽和/或工程化受体正确表达的序列。
术语“调节序列”或“控制序列”是指影响与其可操作地连接的编码序列的表达的DNA序列。此类调节序列的性质根据宿主生物体而不同。在原核生物中，调节序列通常包括启动子、核糖体结合位点和终止子。在真核生物中，调节序列包括启动子、终止子和在一些情况下的增强子、反式激活因子或转录因子。
术语“可操作地连接”是指其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中的并置。与编码序列“可操作地连接”的调节序列以这样的方式连接，使得编码序列的表达在与调节序列相容的条件下完成。
如本文所用，“启动子”或“启动子区”是指控制与其可操作地连接的DNA或RNA的转录的DNA或RNA区段。启动子区包括涉及RNA聚合酶识别、结合和转录起始的特定序列。此外，启动子包括调节RNA聚合酶的识别、结合和转录起始活性(即，一种或多种转录因子的结合)的序列。这些序列可以是顺式作用的，或可以对反式作用因子有应答。根据调节的性质，启动子可以是组成型启动子或调节型启动子。调节型启动子可以是诱导型或对环境有应答的(例如，对如pH、厌氧条件、渗压剂、温度、光或细胞密度等诱因有应答)。许多这样的启动子序列是本领域已知的。参见例如，美国专利号4,980,285；5,631,150；5,707,928；5,759,828；5,888,783；5,919,670和Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Press(1989)。
在一些实施例中，编码第一多肽的核酸序列可操作地连接至第一启动子。在一些实施例中，编码第二多肽的核酸序列可操作地连接至第二启动子。在一些实施例中，第一多肽与第二多肽相同，并且第一核酸同时编码第一多肽和第二多肽。在一些实施例中，编码第一多肽的核酸序列和编码第二多肽的核酸序列可操作地连接至同一启动子。在一些实施例中，编码第一多肽的核酸序列和编码第二多肽的核酸序列可操作地连接至分开的启动子。
在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含编码工程化受体的第三核酸。在一些实施例中，第一核酸和第三核酸可操作地连接至同一启动子。在一些实施例中，第一核酸和第三核酸可操作地连接至分开的启动子。在一些实施例中，第二核酸和第三核酸可操作地连接至同一启动子。在一些实施例中，第二核酸和第三核酸可操作地连接至分开的启动子。在一些实施例中，第一核酸、第二核酸和第三核酸可操作地连接至同一启动子。在一些实施例中，第一核酸、第二核酸和第三核酸可操作地连接至分开的启动子。
在一些实施例中，启动子是内源启动子。例如，可以使用本领域已知的任何方法(如CRISPR/Cas9方法)，将编码第一多肽、第二多肽和/或工程化受体的核酸敲入内源启动子下游的经修饰的免疫细胞的基因组中。在一些实施例中，内源启动子是丰度蛋白如β-肌动蛋白的启动子。在一些实施例中，内源启动子是诱导型启动子，例如，可由经修饰的免疫细胞的内源激活信号诱导。在一些实施例中，其中经修饰的免疫细胞是T细胞，启动子是T细胞激活依赖性启动子(如IL-2启动子、NFAT启动子或NFκB启动子)。在一些实施例中，启动子是异源启动子。
已经探索了各种启动子以在哺乳动物细胞中进行基因表达，并且本领域已知的任何启动子都可以用于本申请。启动子可以大致分为组成型启动子或调节型启动子，如诱导型启动子。在一些实施例中，编码第一多肽、第二多肽和/或工程化受体的异源核酸序列可操作地连接至组成型启动子。在一些实施例中，编码第一多肽、第二多肽和/或工程化受体的异源核酸序列可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施例中，第一组成型启动子可操作地连接至编码第一多肽的核酸序列，第二组成型启动子可操作地连接至编码第二多肽的核酸序列，并且诱导型启动子可操作地连接至编码工程化受体的核酸序列。在一些实施例中，第一组成型启动子可操作地连接至编码第一多肽的核酸序列，第二组成型启动子可操作地连接至编码第二多肽的核酸序列，并且第三组成型启动子可操作地连接至编码工程化受体的核酸序列。在一些实施例中，第一组成型启动子可操作地连接至编码第一多肽的核酸序列，第二组成型启动子可操作地连接至编码第二多肽的核酸序列，并且诱导型启动子可操作地连接至编码工程化受体的核酸序列。在一些实施例中，第一组成型启动子可操作地连接至编码第一多肽的核酸序列，第二组成型启动子可操作地连接至编码工程化受体的核酸序列，并且诱导型启动子可操作地连接至编码第二多肽的核酸序列。在一些实施例中，第一组成型启动子可操作地连接至编码第二多肽的核酸序列，第二组成型启动子可操作地连接至编码工程化受体的核酸序列，并且诱导型启动子可操作地连接至编码第一多肽的核酸序列。在一些实施例中，第一组成型启动子可操作地连接至编码第一多肽的核酸序列，第一诱导型启动子可操作地连接至编码工程化受体的核酸序列，并且第二诱导型启动子可操作地连接至编码第二多肽的核酸序列。在一些实施例中，第一组成型启动子可操作地连接至编码第二多肽的核酸序列，第一诱导型启动子可操作地连接至编码工程化受体的核酸序列，并且第二诱导型启动子可操作地连接至编码第一多肽的核酸序列。在一些实施例中，第一组成型启动子可操作地连接至编码工程化受体的核酸序列，第一诱导型启动子可操作地连接至编码第二多肽的核酸序列，并且第二诱导型启动子可操作地连接至编码第一多肽的核酸序列。
在一些实施例中，第一诱导型启动子可操作地连接至编码第一多肽的核酸序列，第二诱导型启动子可操作地连接至编码第二多肽的核酸序列，并且第三诱导型启动子可操作地连接至编码工程化受体的核酸序列。在一些实施例中，第一诱导型启动子可操作地连接至编码第一多肽的核酸序列，第二诱导型启动子可操作地连接至编码第二多肽的核酸序列，并且组成型启动子可操作地连接至编码工程化受体的核酸序列。在一些实施例中，第一诱导型启动子可操作地连接至编码第一多肽的核酸序列，第二诱导型启动子可操作地连接至编码工程化受体的核酸序列，并且组成型启动子可操作地连接至编码第二多肽的核酸序列。在一些实施例中，第一诱导型启动子可操作地连接至编码第二多肽的核酸序列，第二诱导型启动子可操作地连接至编码工程化受体的核酸序列，并且组成型启动子可操作地连接至编码第一多肽的核酸序列。在一些实施例中，第一诱导型启动子可操作地连接至编码第一多肽的核酸序列，第一组成型启动子可操作地连接至编码工程化受体的核酸序列，并且第二组成型启动子可操作地连接至编码第二多肽的核酸序列。在一些实施例中，第一诱导型启动子可操作地连接至编码第二多肽的核酸序列，第一组成型启动子可操作地连接至编码工程化受体的核酸序列，并且第二组成型启动子可操作地连接至编码第一多肽的核酸序列。在一些实施例中，第一诱导型启动子可操作地连接至编码工程化受体的核酸序列，第一组成型启动子可操作地连接至编码第二多肽的核酸序列，并且第二组成型启动子可操作地连接至编码第一多肽的核酸序列。
在一些实施例中，第一诱导型启动子可由第一诱导条件诱导，第二诱导型启动子可由第二诱导条件诱导，并且第三诱导型启动子可由第三诱导条件诱导。在一些实施例中，第一诱导条件与第二诱导条件相同。在一些实施例中，第一诱导条件与第三诱导条件相同。在一些实施例中，第二诱导条件与第三诱导条件相同。在一些实施例中，第一诱导条件、第二诱导条件和第三诱导条件都相同。在一些实施例中，同时诱导第一诱导型启动子和第二诱导型启动子。在一些实施例中，同时诱导第一诱导型启动子和第三诱导型启动子。在一些实施例中，同时诱导第二诱导型启动子和第三诱导型启动子。在一些实施例中，同时诱导第一诱导型启动子、第二诱导型启动子和第三诱导型启动子。在一些实施例中，顺序诱导第一诱导型启动子、第二诱导型启动子和第三诱导型启动子，例如，在第二诱导型启动子之前诱导第一诱导型启动子并且在第三诱导型启动子之前诱导第二诱导型启动子，在第二诱导型启动子之后诱导第一诱导型启动子并且在第三诱导型启动子之前诱导第二诱导型启动子，或者在第二诱导型启动子之后诱导第一诱导型启动子并且在第三诱导型启动子之后诱导第二诱导型启动子。
组成型启动子允许异源基因(也称为转基因)在宿主细胞中组成性地表达。本文考虑的示例性组成型启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、人延伸因子-1α(hEF1α)、泛素C启动子(UbiC)、磷酸甘油激酶启动子(PGK)、猿猴病毒40早期启动子(SV40)以及与CMV早期增强子偶联的鸡β-肌动蛋白启动子(CAGG)。在许多研究中，已经广泛地比较了此类组成型启动子对驱动转基因表达的效率。在一些实施例中，启动子是hEF1α启动子。
在一些实施例中，启动子是诱导型启动子。诱导型启动子属于调节型启动子的类别。诱导型启动子可以由一种或多种条件诱导，如物理条件、经修饰的免疫细胞的微环境或经修饰的免疫细胞的生理状态、诱导物(即，诱导剂)或其组合。在一些实施例中，诱导条件不诱导经修饰的免疫细胞和/或接受药物组合物的受试者中内源基因的表达。在一些实施例中，诱导条件选自由以下组成的组：诱导物、辐射(如电离辐射、光)、温度(如热)、氧化还原状态、肿瘤环境和经修饰的免疫细胞的激活状态。
在一些实施例中，启动子可由诱导物诱导。在一些实施例中，诱导物是小分子，如化学化合物。在一些实施例中，小分子选自由强力霉素、四环素、醇、金属或类固醇组成的组。化学诱导的启动子得到了最广泛的探索。这样的启动子包括其转录活性受存在或不存在小分子化学物质(如强力霉素、四环素、醇、类固醇、金属和其他化合物)调节的启动子。具有反向四环素控制的反式激活因子(rtTA)和四环素应答元件启动子(TRE)的强力霉素诱导型系统是目前最成熟的系统。WO 9429442描述了四环素应答启动子对真核细胞中基因表达的严格控制。WO 9601313披露了四环素调节的转录调节剂。另外，例如在TetSystems.com的网站上描述了Tet技术(如Tet-开系统)。任何已知的化学调节的启动子可用于驱动本申请的治疗蛋白的表达。
在一些实施例中，诱导物是多肽，如生长因子、激素或细胞表面受体的配体，例如特异性结合肿瘤抗原的多肽。在一些实施例中，该多肽由经修饰的免疫细胞表达。在一些实施例中，该多肽由异源核酸中的核酸编码。许多多肽诱导物也是本领域已知的，并且它们可以适用于本申请。例如，基于蜕皮激素受体的基因开关、基于孕酮受体的基因开关和基于雌激素受体的基因开关属于使用类固醇受体衍生的反式激活因子的基因开关(WO 9637609和WO 9738117等)。
在一些实施例中，诱导物同时包含小分子组分和一种或多种多肽。例如，依赖于多肽二聚化的诱导型启动子是本领域已知的，并且可以适用于本申请。1993年开发的第一个小分子CID系统使用FK1012(药物FK506的衍生物)诱导FKBP的同源二聚化。通过使用类似的策略，Wu等人通过使用Rapalog/FKPB-FRB*和赤霉素(Gibberelline)/GID1-GAI二聚化依赖性基因开关成功地使CAR-T细胞可通过打开开关(ON-switch)方式滴定(C.-Y.Wu等人,Science 350,aab4077(2015))。其他二聚化依赖性开关系统包括香豆霉素/GyrB-GyrB(Nature 383(6596):178-81)和HaXS/Snap-tag-HaloTag(Chemistry and Biology 20(4):549-57)。
在一些实施例中，启动子是光诱导型启动子，并且诱导条件是光。用于在哺乳动物细胞中调节基因表达的光诱导型启动子也是本领域熟知的(参见例如，Science 332,1565-1568(2011)；Nat.Methods 9,266-269(2012)；Nature 500:472-476(2013)；NatureNeuroscience 18:1202-1212(2015))。基于这样的基因调节系统对(1)DNA结合或(2)转录激活结构域募集到DNA结合蛋白的调节，这样的基因调节系统可大致分为两类。例如，在哺乳动物细胞中开发并测试了基于视黑蛋白的合成哺乳动物蓝光控制转录系统，该系统应答于蓝光(480nm)而触发细胞内钙增加，从而导致钙调磷酸酶介导的NFAT动员。最近，Motta-Mena等人描述了从天然存在的EL222转录因子开发的新的诱导型基因表达系统，该系统在人细胞系和斑马鱼胚胎中赋予对转录起始的高水平且蓝光敏感性控制(Nat.Chem.Biol.10(3):196-202(2014))。另外，利用红光诱导的拟南芥(Arabidopsis thaliana)的光感受器光敏色素B(PhyB)和光敏色素相互作用因子6(PIF6)的相互作用进行红光触发的基因表达调节。此外，还开发了紫外线B(UVB)诱导型基因表达系统并证明其在哺乳动物细胞中的靶基因转录中是有效的(Gene and Cell Therapy:Therapeutic Mechanisms andStrategies,第25章,第四版,CRC Press,2015年1月20日)。本文所述的任何光诱导型启动子可以用于驱动本申请的治疗蛋白的表达。
在一些实施例中，启动子是由光诱导型分子和光的组合诱导的光诱导型启动子。例如，化学诱导物上的可光切割的光笼化基团(photocaged group)保持诱导物无活性，除非通过辐射或其他方式去除该光笼化基团。这样的光诱导型分子包括小分子化合物、寡核苷酸和蛋白质。例如，已经开发了笼化蜕皮素、与lac操纵子一起使用的笼化IPTG、用于核酶介导的基因表达的笼化丰加霉素、与Tet-开系统一起使用的笼化强力霉素以及用于光介导的FKBP/FRB二聚化的笼化Rapalog(参见例如，Curr Opin Chem Biol.16(3-4):292-299(2012))。
在一些实施例中，启动子是辐射诱导型启动子，并且诱导条件是辐射，如电离辐射。辐射诱导型启动子也是本领域已知的，用以控制转基因表达。辐射细胞后发生基因表达的改变。例如，一组称为“立即早期基因(immediate early gene)”的基因可在电离辐射后迅速反应。示例性立即早期基因包括但不限于Erg-1、p21/WAF-1、GADD45α、t-PA、c-Fos、c-Jun、NF-κB和AP1。立即早期基因在其启动子区包含辐射应答序列。共有序列CC(A/T)6GG已在Erg-1启动子中发现，并且被称为血清应答元件或被称为CArG元件。已经深入研究了辐射诱导型启动子和转基因的组合，并证明其具有高效的治疗益处。参见例如，Cancer BiolTher.6(7):1005-12(2007)和Gene and Cell Therapy:Therapeutic Mechanisms andStrategies,第25章,第四版,CRC Press,2015年1月20日。
在一些实施例中，启动子是热诱导型启动子，并且诱导条件是热。本领域还广泛研究了驱动转基因表达的热诱导型启动子。包括Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40、Hsp10等在内的热休克或应激蛋白(HSP)在热或其他物理和化学应激下在保护细胞方面起着重要作用。已经在临床前研究中尝试了几种热诱导型启动子，包括热休克蛋白(HSP)启动子以及生长停滞和DNA损伤(GADD)153启动子。1985年首次描述的人hsp70B基因的启动子似乎是最高效的热诱导型启动子之一。Huang等人报告，在引入hsp70B-EGFP、hsp70B-TNFα和hsp70B-IL12编码序列后，肿瘤细胞在热处理后表达极高的转基因表达，而在没有热处理的情况下，未检测到转基因的表达。在IL12转基因加热处理的小鼠组中，体内肿瘤生长显著延迟(CancerRes.60:3435(2000))。另一组科学家将HSV-tk自杀基因与hsp70B启动子连接，并在携带小鼠乳腺癌的裸鼠中测试该系统。与未进行热处理的对照相比，向其肿瘤施用了hsp70B-HSVtk编码序列并进行了热处理的小鼠显示出肿瘤消退和显著的存活率(Hum.Gene Ther.[人类基因疗法]11:2453(2000))。本领域已知的另外的热诱导型启动子可以在例如Geneand Cell Therapy:Therapeutic Mechanisms and Strategies,第25章,第四版,CRCPress,2015年1月20日中找到。本文讨论的任何热诱导型启动子可以用于驱动本申请的治疗蛋白的表达。
在一些实施例中，启动子可由氧化还原状态诱导。可由氧化还原状态诱导的示例性启动子包括诱导型启动子和低氧诱导型启动子。例如，Post DE等人开发了低氧诱导型因子(HIF)应答启动子，其特异性且强烈地诱导HIF活性肿瘤细胞中的转基因表达(GeneTher.8:1801-1807(2001)；Cancer Res.67:6872-6881(2007))。
在一些实施例中，启动子可由经修饰的免疫细胞的生理状态(如内源激活信号)诱导。在一些实施例中，其中经修饰的免疫细胞是T细胞，启动子是T细胞激活依赖性启动子，其可由经修饰的T细胞的内源激活信号诱导。在一些实施例中，经修饰的T细胞被诱导物(如佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)、离子霉素或植物凝集素)激活。在一些实施例中，通过经由工程化受体(如CAR、TCR或TAC)识别肿瘤细胞上的肿瘤抗原来激活经修饰的T细胞。在一些实施例中，T细胞激活依赖性启动子是IL-2启动子。在一些实施例中，T细胞激活依赖性启动子是NFAT启动子。在一些实施例中，T细胞激活依赖性启动子是NFκB启动子。
本文所述的一个或多个异源核酸序列可存在于异源基因表达盒中，该异源基因表达盒包含一个或多个蛋白质编码序列和任选的一个或多个启动子。在一些实施例中，异源基因表达盒包含单个蛋白质编码序列。在一些实施例中，异源基因表达盒包含由单个启动子驱动的两个或更多个蛋白质编码序列(即，多顺反子)。在一些实施例中，异源基因表达盒还包含一个或多个调节序列(如5'UTR、3'UTR、增强子序列、IRES、转录终止序列)、重组位点、一个或多个选择标记(如抗生素抗性基因、报告基因等)、信号序列或其组合。
在一些实施例中，提供了包含编码本文所述的第一多肽和/或工程化受体的核酸中任一种的载体。在一些实施例中，提供了包含编码本文所述的第一多肽中任一种的第一核酸序列和编码本文所述的工程化受体中任一种的第二核酸序列的载体。在一些实施例中，编码第一多肽的第一核酸序列经由编码可自切割的接头(如P2A、T2A、E2A或F2A肽)的第三核酸序列与编码工程化受体的第二核酸序列融合。在一些实施例中，P2A序列是GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:24)。在一些实施例中，提供了包含第一载体和第二载体的组合物，该第一载体包含编码本文所述的第一多肽中任一种的第一核酸序列，该第二载体包含编码本文所述的工程化受体中任一种的第二核酸序列。在一些实施例中，提供了包含编码CAR(例如，CD19CAR或CLL1 CAR)的第一核酸序列和编码第一多肽的第二核酸序列的载体，其中该第一核酸序列经由编码可自切割的接头(如P2A)的第三核酸序列与该第二核酸序列融合。在一些实施例中，载体包含编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核酸序列。
在一些实施例中，提供了包含编码本文所述的第一多肽、第二多肽和/或工程化受体的核酸中任一种的载体。在一些实施例中，提供了包含编码本文所述的第一多肽中任一种的第一核酸序列、编码本文所述的第二多肽中任一种的第二核酸序列和编码本文所述的工程化受体中任一种的第三核酸序列的载体。在一些实施例中，编码第一多肽的第一核酸序列经由编码可自切割的接头(如P2A、T2A、E2A或F2A肽)的第四核酸序列与编码工程化受体的第二核酸序列融合。在一些实施例中，编码第一多肽的第一核酸序列经由编码可自切割的接头(如P2A、T2A、E2A或F2A肽)的第五核酸序列另外地与编码第二多肽的第三核酸序列融合。在一些实施例中，P2A序列是GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:24)。在一些实施例中，提供了包含第一载体、第二载体和第三载体的组合物，该第一载体包含编码本文所述的第一多肽中任一种的第一核酸序列，该第二载体包含编码本文所述的第二多肽中任一种的第二核酸序列，该第三载体包含编码本文所述的工程化受体中任一种的第三核酸序列。在一些实施例中，提供了载体，其包含编码CAR(例如，CD19 CAR或CLL1 CAR)的第一核酸序列、编码第一多肽的第二核酸序列和编码第二多肽的第三核酸序列，其中第一核酸序列经由编码可自切割的接头(如P2A)的第四核酸序列与第二核酸序列融合，并且其中第二核酸序列经由编码可自切割的接头(如P2A)的第五核酸序列与第三核酸序列融合。在一些实施例中，载体包含编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的核酸序列。
“载体”是一种物质组合物，其包含分离的核酸，并可以用于将分离的核酸递送至细胞内部。本领域已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一种或多种可选择的标记。术语“载体”也应被解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如像聚赖氨酸化合物、脂质体等。
在一些实施例中，载体是病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物。病毒载体技术是本领域熟知的，并且描述于例如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)以及其他病毒学和分子生物学手册中。
已经开发了用于将基因转移到哺乳动物细胞中的许多基于病毒的系统。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将异源核酸插入载体中并包装在逆转录病毒粒子中。然后可以分离重组病毒，并在体外或离体将其递送至经修饰的免疫细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施例中，使用腺病毒载体。在一些实施例中，使用慢病毒载体。在一些实施例中，使用自灭活的慢病毒载体。例如，可以用本领域已知的方案包装自灭活的慢病毒载体。可以使用本领域已知的方法，将所得的慢病毒载体用于转导哺乳动物细胞(如人T细胞)。
在一些实施例中，载体是非病毒载体(如质粒)或游离型表达载体。
在一些实施例中，载体是表达载体。“表达载体”是可用于转化所选宿主并提供编码序列在该所选宿主中表达的构建体。表达载体可以是例如克隆载体、二元载体或整合载体。表达包括优选地将核酸分子转录成可翻译的mRNA。确保在真核细胞中表达的调节元件是本领域技术人员熟知的。在真核细胞的情况下，它们通常包含确保转录起始的启动子以及任选的确保转录终止和转录物稳定的聚A信号。允许在真核宿主细胞中表达的调节元件的实例是酵母中的AOX1或GAL1启动子或者哺乳动物和其他动物细胞中的CMV-、SV40-、RSV-启动子(劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))、CMV-增强子、SV40-增强子或珠蛋白内含子。此外，根据所使用的表达系统，可以将能够将多肽引导至细胞区室或将其分泌到介质中的信号肽(例如，前导序列)添加到所述核酸序列的编码序列中，并且这些信号肽是本领域熟知的。将一个或多个信号肽在适当的阶段与翻译、起始和终止序列组装在一起，并且优选地，能够将翻译蛋白或其一部分的分泌引导到周质空间或细胞外介质中的信号肽。任选地，核酸序列可以编码融合蛋白，该融合蛋白包括赋予所希望的特性(例如，表达的重组产物的稳定化或简化纯化)的N-末端鉴定肽。合适的表达载体是本领域已知的，如Okayama-BergcDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pEF-Neo、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)、pEF-DHFR和pEF-ADA(Raum等人,Cancer Immunol Immunother(2001)50(3),141-150)或pSPORT1(GIBCO BRL)。
制备方法
本申请还提供了制备本文所述的经修饰的免疫细胞中任一种的方法。
在一些实施例中，提供了产生经修饰的免疫细胞的方法，该方法包括：将编码第一多肽的第一核酸和任选的编码第二多肽的第二核酸引入前体免疫细胞中。在一些实施例中，前体免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。在一些实施例中，前体免疫细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施例中，前体免疫细胞是γδT细胞。在一些实施例中，前体免疫细胞是肿瘤浸润性T细胞或DC激活的T细胞。在一些实施例中，前体免疫细胞包含本文所述的工程化受体中的任一种。在一些实施例中，该方法进一步包括将编码本文所述的工程化受体中任一种的第三核酸引入前体免疫细胞中。
在一些实施例中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，工程化受体是经修饰的T细胞受体(TCR)。在一些实施例中，工程化受体是T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，第一核酸序列、任选的第二核酸序列和第三核酸序列可操作地连接至同一启动子。在一些实施例中，第一核酸序列、任选的第二核酸序列和第三核酸序列可操作地连接至分开的启动子。在一些实施例中，第一核酸和任选的第二核酸和/或第三核酸序列在同一载体上。在一些实施例中，第一核酸和任选的第二核酸和/或第三核酸序列在分开的载体上。在一些实施例中，载体是病毒载体。在一些实施例中，病毒载体选自由腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物组成的组。在一些实施例中，载体是非病毒载体。在一些实施例中，载体是游离型表达载体。在一些实施例中，该方法进一步包括分离或富集包含第一核酸序列和/或第二核酸序列的免疫细胞。在一些实施例中，该方法进一步包括与至少一种药学上可接受的载剂一起配制经修饰的免疫细胞。
在一些实施例中，提供了包含本文所述的核酸或载体中任一种的分离的宿主细胞。宿主细胞可用于第一多肽、第二多肽和/或工程化受体、编码第一多肽、第二多肽和/或工程化受体的核酸或载体的表达或克隆。合适的宿主细胞可包括但不限于原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或高等真核细胞(如哺乳动物细胞)。在一些实施例中，宿主细胞包含编码第一多肽的第一载体、编码第二多肽的第二载体和编码第三多肽(例如，工程化受体)的第三载体。在一些实施例中，宿主细胞包含含有编码第一多肽、第二多肽和第三多肽的分离的核酸的单个载体。
可以使用本领域已知的多种方法制备前体免疫细胞。例如，原代免疫细胞(如T细胞)可获自多种来源，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施例中，可以使用本领域已知的多种技术(如FICOLLTM分离)从收集自个体的血液单位获得免疫细胞(如T细胞)。在一些实施例中，来自个体循环血的细胞是通过单采(apheresis)获得的。单采产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施例中，可以洗涤通过单采收集的细胞以除去血浆部分，并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在一些实施例中，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或缺乏二价阳离子(如钙和镁)的洗涤溶液洗涤。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，如根据制造商的说明通过使用半自动化“流通式(flow-through)”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics CellSaver 5)。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，例如像无Ca2+、无Mg2+的PBS，PlasmaLyte A或者含或不含缓冲液的其他盐水溶液。可替代地，可以除去单采样品的不希望组分，并将细胞直接重悬浮于培养基中。
在一些实施例中，例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析来裂解红细胞并消耗单核细胞以从外周血淋巴细胞分离原代T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA和CD45RO细胞。例如，在一个实施例中，通过与抗CD3/抗CD28(即，3×28)缀合的珠如M-450 CD3/CD28T一起孵育足以阳性选择所希望的T细胞的时间段来分离T细胞。
在一些实施例中，可以使用针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体的组合通过阴性选择进一步富集T细胞群。例如，一种方法涉及经由阴性磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该方法使用针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD1lb、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施例中，可能希望富集或阳性选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节T细胞。可替代地，在某些实施例中，通过抗C25缀合的珠或其他类似的选择方法消耗T调节细胞。
将载体或核酸引入宿主细胞(如前体免疫细胞)的方法是本领域已知的。可以通过物理、化学或生物方法将载体或核酸转移到宿主细胞中。
用于将一个或多个载体或一个或多个核酸引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生含有载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见例如，Sambrook等人(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York。在一些实施例中，通过电穿孔将载体引入细胞中。
用于将一个或多个载体或一个或多个核酸引入宿主细胞中的生物方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体已成为用于将基因插入哺乳动物例如人细胞的最广泛使用的方法。
用于将一个或多个载体或一个或多个核酸引入宿主细胞中的化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
在一些实施例中，将转导的或转染的前体免疫细胞在引入一个或多个异源核酸后离体繁殖。在一些实施例中，将转导的或转染的前体免疫细胞培养以繁殖至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中的任一个。在一些实施例中，将转导的或转染的前体免疫细胞培养不超过约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中的任一个。在一些实施例中，进一步评价或筛选转导的或转染的前体免疫细胞以选择经修饰的免疫细胞。
报告基因可用于鉴定可能转染的细胞和评估调控序列的功能。通常，报告基因是在受体生物体或组织中不存在或不表达的基因，该报告基因编码多肽，该多肽的表达通过一些易于检测的特性(例如，酶活性)来表现。报告基因的表达在DNA被引入受体细胞后的合适的时间检测。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌性碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人FEBS Letters 479:79-82(2000))。
证实前体免疫细胞中存在一个或多个异源核酸的其他方法包括例如本领域技术人员熟知的分子生物学测定，如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；生物化学测定，如通过免疫学方法(如ELISA和蛋白印迹)来检测特定肽的存在或不存在。
III.治疗方法
本申请的一方面涉及治疗个体的疾病或病症(例如，癌症)的方法，这些方法包括向该个体施用有效量的本文所述的经修饰的免疫细胞中的任一种。本申请考虑了经修饰的免疫细胞，其可以单独施用或与另一种疗法以任何组合施用，并且在至少一些方面，与药学上可接受的载剂或赋形剂一起施用。在一些实施例中，在施用之前，可以将经修饰的免疫细胞与本领域熟知的合适的药物载剂和赋形剂组合。
在一些实施例中，提供了治疗个体(例如，人)中的癌症(例如，实体癌)的方法，该方法包括向该个体施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含经修饰的免疫细胞(例如，CAR-T细胞)和药学上可接受的载剂，其中经修饰的免疫细胞包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分，并且其中第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合多聚体靶分子的亚基。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二结合结构域结合相同的靶分子。在一些实施例中，第一靶结合结构域和第二结合结构域各自结合靶分子上的相同靶位点。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含CAR和TLR多肽(例如，与CAR融合的两个或更多个TLR多肽)。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗CD19 CAR和抗CD20 TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:1具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:1。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗CD19 CAR和抗NKG2D TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:59具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:59。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2D ECD、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:60具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:60。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗GPC3 CAR和抗NKG2D TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPC3scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:57具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:57。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPC3 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2D ECD、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQID NO:58具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:58。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗BCMA CAR(例如，单个抗BCMA CAR或串联抗BCMA CAR)和抗BCMA TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体包含单个抗BCMACAR和抗BCMA TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、单个抗BCMAsdAb、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:62具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:62。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:63具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:63。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD28α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:64具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:64。在一些实施例中，CAR融合构建体包含串联抗BCMA CAR和抗BCMA TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、串联抗BCMA sdAb、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:61具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ IDNO:61。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗BCMA CAR(例如，单个抗BCMA CAR或串联抗BCMA CAR)和抗GPRC5D TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:65具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:65。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗GPRC5D scFv、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQID NO:72具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:72。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗GPRC5DscFv、CD28α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:73具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:73。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗CLL1 CAR和抗CD33(例如，抗CD33 V结构域和/或抗CD33 C2结构域)TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CLL1 sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗CD33sdAb、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:71具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:71。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CLL1 sdAb、CD28α铰链结构域、CD28α跨膜(TM)结构域、CD28共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗CD33 V结构域sdAb、TLR2跨膜结构域、TLR2信号传导结构域(例如，TLR2的胞内部分)、P2A切割位点、信号肽、抗CD33 C2结构域sdAb、TLR1跨膜结构域和TLR1信号传导结构域(例如，TLR1的胞内部分)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:3。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了治疗个体(例如，人)中的癌症(例如，实体癌)的方法，该方法包括向该个体施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含经修饰的免疫细胞(例如，CAR-T细胞)和药学上可接受的载剂，其中经修饰的免疫细胞包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域，其中第一靶结合结构域和第二结合结构域结合相同的靶分子，并且其中第一靶结合结构域和第二靶结合结构域各自结合单个靶分子上不同的非重叠靶位点，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞进一步包含工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含CAR和TLR多肽(例如，与CAR融合的两个或更多个TLR多肽)。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗CD19 CAR和抗CD20 TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:1具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:1。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗CD19 CAR和抗NKG2D TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:59具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:59。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2D ECD、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:60具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:60。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗GPC3 CAR和抗NKG2DTLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPC3scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:57具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:57。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPC3 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2D ECD、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQID NO:58具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:58。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗BCMA CAR(例如，单个抗BCMA CAR或串联抗BCMA CAR)和抗BCMA TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体包含单个抗BCMACAR和抗BCMA TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、单个抗BCMAsdAb、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:62具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:62。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:63具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:63。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD28α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:64具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:64。在一些实施例中，CAR融合构建体包含串联抗BCMA CAR和抗BCMA TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、串联抗BCMA sdAb、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:61具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ IDNO:61。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗BCMA CAR(例如，单个抗BCMA CAR或串联抗BCMA CAR)和抗GPRC5D TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗GPRC5D scFv、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:65具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:65。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗GPRC5D scFv、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQID NO:72具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:72。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗GPRC5DscFv、CD28α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:73具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:73。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗CLL1 CAR和抗CD33(例如，抗CD33 V结构域和/或抗CD33 C2结构域)TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CLL1 sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗CD33sdAb、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:71具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:71。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CLL1 sdAb、CD28α铰链结构域、CD28α跨膜(TM)结构域、CD28共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗CD33 V结构域sdAb、TLR2跨膜结构域、TLR2信号传导结构域(例如，TLR2的胞内部分)、P2A切割位点、信号肽、抗CD33 C2结构域sdAb、TLR1跨膜结构域和TLR1信号传导结构域(例如，TLR1的胞内部分)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，提供了治疗个体(例如，人)中的癌症(例如，实体癌)的方法，该方法包括向该个体施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含经修饰的免疫细胞(例如，CAR-T细胞)和药学上可接受的载剂，其中经修饰的免疫细胞包含：a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域；和c)工程化受体，其中工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域，其中在第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，第一TLR信号传导结构域和第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。在一些实施例中，工程化受体包含特异性识别与第一多肽和/或第二多肽相同的靶分子上的非重叠靶位点的细胞外结构域。在一些实施例中，工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)、工程化TCR或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含CAR和TLR多肽(例如，与CAR融合的两个或更多个TLR多肽)。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗CD19 CAR和抗CD20 TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗CD20 scFv、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:1具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:1。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗CD19 CAR和抗NKG2D TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:59具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:59。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CD19 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2DECD、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:60具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ IDNO:60。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗GPC3 CAR和抗NKG2D TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPC3 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2D ECD、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:57具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:57。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗GPC3 scFv、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗NKG2D ECD、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:58具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:58。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗BCMA CAR(例如，单个抗BCMA CAR或串联抗BCMA CAR)和抗BCMA TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体包含单个抗BCMA CAR和抗BCMA TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、单个抗BCMA sdAb、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:62具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ IDNO:62。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:63具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:63。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、单个抗BCMA sdAb、CD28α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:64具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:64。在一些实施例中，CAR融合构建体包含串联抗BCMA CAR和抗BCMA TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、串联抗BCMA sdAb、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:61具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:61。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗BCMA CAR(例如，单个抗BCMA CAR或串联抗BCMACAR)和抗GPRC5D TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗GPRC5DscFv、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:65具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:65。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗GPRC5D scFv、CD8α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:72具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:72。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、串联抗BCMA sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗GPRC5D scFv、CD28α铰链结构域、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:73具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:73。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞包含CAR系统(例如，CAR融合构建体)，其中CAR融合构建体包含抗CLL1 CAR和抗CD33(例如，抗CD33 V结构域和/或抗CD33 C2结构域)TLR多肽。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CLL1 sdAb、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗CD33 sdAb、TLR4跨膜(TM)区和TLR4的胞内部分(例如，TLR4初级细胞内信号传导结构域)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:71具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:71。在一些实施例中，CAR融合构建体从N-末端到C-末端包含：信号肽、抗CLL1sdAb、CD28α铰链结构域、CD28α跨膜(TM)结构域、CD28共刺激信号传导结构域的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域、P2A切割位点、信号肽、抗CD33 V结构域sdAb、TLR2跨膜结构域、TLR2信号传导结构域(例如，TLR2的胞内部分)、P2A切割位点、信号肽、抗CD33 C2结构域sdAb、TLR1跨膜结构域和TLR1信号传导结构域(例如，TLR1的胞内部分)。在一些实施例中，CAR融合构建体包含与SEQ ID NO:3具有至少约85％(例如，至少约86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高中的任一个)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，CAR融合构建体包含SEQ ID NO:3。在一些实施例中，第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的细胞内结构域，和/或第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的细胞内结构域。在一些实施例中，经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一些实施例中，治疗癌症的方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞；(2)抑制癌细胞的增殖；(3)诱导外周T细胞的重新分布；(4)在肿瘤中诱导免疫应答；(5)减小肿瘤尺寸；(6)缓解患有癌症的个体的一种或多种症状；(7)抑制肿瘤转移；(8)延长存活；(9)延长至癌症进展时间；(10)预防、抑制或降低癌症复发的可能性；(11)改善个体的生活质量；(12)促进肿瘤中的T细胞浸润以及(13)降低先存肿瘤转移(如转移至淋巴结)的发生率或负担。在一些实施例中，该方法实现至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高中任一个的肿瘤细胞死亡率。在一些实施例中，该方法减小至少约10％(包括例如，至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一个)的肿瘤尺寸。在一些实施例中，该方法抑制至少约10％(包括例如，至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一个)的转移。在一些实施例中，该方法将个体的存活延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24或更多个月中的任一个。在一些实施例中，该方法将至癌症进展时间延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24或更多个月中的任一个。
本文所述的方法适用于治疗多种癌症，包括实体癌和液体癌两者。这些方法可应用于所有阶段的癌症，包括早期癌症、非转移性癌症、原发性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、转移性癌症或缓解期癌症。本文所述的方法可以在辅助治疗或新辅助治疗中用作第一疗法、第二疗法、第三疗法或与本领域已知的其他类型的癌症疗法(如化学疗法、手术、激素疗法、辐射、基因疗法、免疫疗法(如T细胞疗法)、骨髓移植、干细胞移植、靶向疗法、冷冻疗法、超声疗法、光动力疗法、射频消融等)的组合疗法(即，该方法可以在基本疗法/针对性疗法之前进行)。在一些实施例中，该方法用于治疗先前已被治疗的个体。在一些实施例中，癌症对于先前疗法是难治的。在一些实施例中，该方法用于治疗先前未被治疗的个体。
在一些实施例中，该个体具有低肿瘤负荷。可以根据实体瘤(RECIST)1.1指南中的应答评价标准测量实体瘤的肿瘤负荷。参见，Eisenhauer EA等人,European Journal ofCancer 45(2009)228-247。例如，可以基于以下来评估治疗基线时可测量肿瘤的肿瘤负荷：(1)肿瘤病变(例如，通过CT扫描、通过临床检查的卡尺测量和/或胸部X射线)和(2)恶性淋巴结。例如，实体癌的肿瘤负荷可以量化为5个靶病变(每个器官最多2个)的直径之和。根据由放射科医师评估的Cheson 2007标准，可以将液体癌的肿瘤负荷测量为最多6个指数病变的产物直径之和。参见，Cheson BD等人,J.Clin.Oncol.,2007；25(5):579-586。在一些实施例中，具有低肿瘤负荷的个体的肿瘤负荷不超过约4×103、3×103、2×103、1×103、5×102、2×102、1×102或更小mm2中任一个。
在一些实施例中，该个体在接受治疗后没有经历3级或4级不良副作用。不良事件的分级根据不良事件通用术语标准v3.0(CTCAE)进行。在一些实施例中，该个体在接受治疗后没有经历细胞因子风暴。
在本文所述的方法中施用的经修饰的免疫细胞的有效量将取决于许多因素，如所治疗的癌症的特定类型和阶段、施用途径、第一多肽、第二多肽和/或工程化受体的活性等。适当的剂量方案可由医师基于临床因素确定，这些临床因素包括患者的体型、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况以及同时施用的其他药物。在一些实施例中，药物组合物的该有效量低于诱导毒理学效应(即，高于临床上可接受的毒性水平的效应)的水平，或在将药物组合物施用于个体时处于可以控制或耐受潜在副作用的水平。在一些实施例中，药物组合物的有效量包含约105至约1010个经修饰的免疫细胞。
在一些实施例中，将药物组合物施用一次(例如，推注)。在一些实施例中，施用多次(如2、3、4、5、6或更多次中的任一个)药物组合物。如果是多次施用，则它们可以通过相同或不同的途径进行，并且可以在相同部位或替代部位进行。药物组合物可以以合适的频率施用，如从每天到每年一次。通过监测患者的疾病体征并相应调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定针对特定患者的最佳剂量和治疗方案。
在一些实施例中，待治疗的个体是哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于人、猴、大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、狗、猫、兔、猪、绵羊、山羊、马、牛等。在一些实施例中，该个体是人。
药物组合物
本申请还提供了药物组合物，其包含本文所述的经修饰的免疫细胞中的任一种和任选的药学上可接受的载剂。
本申请人的药物组合物可以包含任何数量的经修饰的免疫细胞。在一些实施例中，药物组合物包含单个拷贝的经修饰的免疫细胞。在一些实施例中，药物组合物包含至少约1、10、100、1000、104、105、106、107、108或更多个拷贝中任一个的经修饰的免疫细胞。在一些实施例中，药物组合物包含单一类型的经修饰的免疫细胞。在一些实施例中，药物组合物包含至少两种类型的经修饰的免疫细胞，其中不同类型的经修饰的免疫细胞的区别在于其细胞来源、细胞类型、表达的嵌合受体和/或启动子等。
如本文所用，“载剂”包括在所采用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或个体无毒的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。生理学上可接受的载剂通常是pH缓冲水溶液。合适的药物载剂的实例是本领域熟知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。
包含这样的载剂的药物组合物可通过熟知的常规方法配制。溶剂或稀释剂优选是等渗的、低渗的或弱高渗的，并且具有相对低的离子强度。代表性实例包括无菌水，生理盐水(例如，氯化钠)，林格氏溶液，葡萄糖、海藻糖或蔗糖溶液，汉克氏溶液(Hank'ssolution)和其他生理平衡盐水溶液(参见，例如最新版的Remington:The Science andPractice of Pharmacy,A.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins)。
本文所述的药物组合物可以经由任何合适的途径施用。在一些实施例中，将药物组合物肠胃外、经皮(进入真皮)、腔内、动脉内(进入动脉)、肌内(进入肌肉)、鞘内或静脉内施用。在一些实施例中，将药物组合物皮下(在皮肤下)施用。在一些实施例中，将药物组合物静脉内施用。在一些实施例中，将药物组合物经由输注或注射向个体施用。在一些实施例中，将药物组合物直接施用至靶部位，例如通过生物射弹递送至内部或外部靶部位或者通过导管施用至动脉中的部位。在一些实施例中，将药物组合物局部(例如，瘤内)施用。施用可以使用常规的注射器和针头或本领域可获得的能够促进或改善一种或多种活性剂在受试者中的递送的任何化合物或装置。
用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。水性载剂包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏溶液或固定油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如像抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，本披露的药物组合物可以包含蛋白质载剂，像例如血清白蛋白或免疫球蛋白，优选人来源的。本领域可获得呈冷冻、液体形式或冻干形式的各种病毒配制品(例如，WO 98/02522、WO 01/66137、WO 03/053463、WO2007/056847和WO 2008/114021等)。固体(例如，干粉固体或冻干固体)组合物可通过涉及真空干燥和冷冻干燥的方法获得(参见，例如WO 2014/053571)。设想本披露的药物组合物除本文所述的经修饰的免疫细胞外还可包含其他生物活性剂，这取决于药物组合物的预期用途。
在一些实施例中，药物组合物被适当地缓冲以供人使用。合适的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液(例如，PBS)、碳酸氢盐缓冲液和/或能够维持生理或弱碱性pH(例如，约pH 7至约pH 9)的Tris缓冲液。在一些实施例中，还可以通过添加合适的张力改性剂(如甘油)使药物组合物与血液等渗。
在一些实施例中，药物组合物包含在单次使用的小瓶(如单次使用的密封小瓶)中。在一些实施例中，药物组合物包含在多次使用的小瓶中。在一些实施例中，药物组合物以散装包含在容器中。
在一些实施例中，药物组合物必须满足用于向个体施用的某些标准。例如，美国食品与药品管理局已经发布了为基于细胞的免疫治疗产品设定标准的监管指南，包括21CFR610和21CFR 610.13。本领域已知评估药物组合物的外观、特性、纯度、安全性和/或效力的方法。在一些实施例中，药物组合物基本上不含能够产生过敏作用的外来蛋白质，如细胞培养中使用的除经修饰的免疫细胞之外的动物来源的蛋白质。在一些实施例中，“基本上不含”是小于药物组合物的总体积或重量的约10％、5％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、1ppm或更少中的任一个。在一些实施例中，药物组合物在GMP级工作间(GMP-level workshop)中制备。在一些实施例中，对于肠胃外施用，药物组合物包含小于约5EU/kg体重/小时的内毒素。在一些实施例中，对于静脉内施用，药物组合物中至少约70％的经修饰的免疫细胞是活的。在一些实施例中，当使用如美国药典(USP)中所述的14天直接接种测试方法评估时，药物组合物具有“无生长”结果。在一些实施例中，在施用药物组合物之前，包括经修饰的免疫细胞和药学上可接受的赋形剂两者的样品应在最终收获前约48-72小时(或与培养物的最后再补料(re-feeding)同时)取出用于无菌测试。在一些实施例中，药物组合物不含支原体污染。在一些实施例中，药物组合物不含可检测的微生物剂。在一些实施例中，药物组合物不含传染病病原，如HIV I型、HIV II型、HBV、HCV、人嗜T淋巴细胞病毒I型；和人嗜T淋巴细胞病毒II型。
IV.套件和制品
还提供了包含本文所述的经修饰的免疫细胞中任一种或组合物(例如，药物组合物)的套件、单位剂量和制品。在一些实施例中，提供了含有本文所述的药物组合物中的任一种的套件，并且优选提供了其使用说明书。在一些实施例中，除了经修饰的免疫细胞之外，套件还包含第二癌症疗法，如化学疗法、激素疗法和/或免疫疗法。一个或多个套件可以针对个体的特定癌症进行定制，并且包含针对个体的相应的第二癌症疗法。
套件可以包含一种或多种另外的组分，如容器、试剂、培养基、诱导物、细胞因子、缓冲液、抗体等，以允许增殖或诱导经修饰的免疫细胞。套件还可以包含用于将药物组合物局部施用(如肿瘤内注射)至肿瘤部位的装置。
本申请的套件在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、软质包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。套件可以任选地提供其他组成部分，如缓冲液和解释信息。因此本申请还提供了制品，其包括小瓶(如密封的小瓶)、瓶、罐子、柔性包装等。套件的一些组分可以以水性介质或以冻干形式包装。
该制品可以包括容器和该容器上或与该容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如，瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)形成。通常，容器容纳有效治疗本文所述的疾病或病症(如癌症)的组合物，并且可具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装插页指示组合物用于治疗个体的特定病状。标签或包装插页将进一步包括用于将组合物施用于个体的说明书。标签可指示用于重构和/或使用的指导。容纳药物组合物的容器可以是多次使用的小瓶，其允许重复施用(例如，2-6次施用)重构配制品。包装插页是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，这些说明书含有关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。另外地，制品可进一步包含第二容器，该容器包含药学上可接受的缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。其可以进一步包括从商业和用户角度所希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
套件或制品可包括多个单位剂量的药物组合物和使用说明书，其包装的数量足以在药房(例如，医院药房和配药药房)中储存和使用。
实例
以下实例仅旨在作为本披露的示例，并因此不应视为以任何方式限制本披露。以下实例和详细描述是作为说明而不是作为限制而提供的。
实例1：表达外源引入的CD19和CD20 toll样受体(TLR)结构域的CAR-T细胞的制备
此实例显示了表达外源引入的toll样受体(TLR)结构域的示例性装甲的CAR-T细胞的构建。特别地，此实例显示了表达CD19和/或CD20的CAR-T细胞的构建。
1.1.嵌合抗原受体(CAR)的构建
为了构建CD19-共CD20 CAR(SEQ ID NO:1)，对编码CAR骨架多肽的CAR骨架序列进行密码子优化和化学合成，该CAR骨架多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、抗CD19 scFv(SEQ ID NO:6)、CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:7)、CD8α跨膜(TM)结构域(SEQID NO:8)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域(SEQ ID NO:9)的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:10)。还对诱导型共刺激分子的序列进行密码子优化和化学合成，该诱导型共刺激分子从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、抗CD20 scFv(SEQ ID NO:11)、TLR4跨膜(TM)区(SEQ ID NO:12)和TLR4的胞内部分(SEQ ID NO:13)，并经由P2A切割位点(SEQ ID NO:24)连接至CAR骨架序列。此构建体显示于图1中。将CAR骨架和共刺激分子克隆到慢病毒载体(例如，第二代慢病毒载体)中，下游并可操作地连接至组成型hEF1α启动子用于体外转录。参考如Blood(2006)108(12):3890-3897中所示例的，产生瞬时逆转录病毒上清液。
如上所述制备包含4-1BB作为共刺激结构域的第二CD19 CAR骨架(“CD19 BMCAR”)，其从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、抗CD19scFv(SEQ ID NO:6)、CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:7)、CD8α跨膜(TM)结构域(SEQ ID NO:8)、4-1BB共刺激信号传导结构域(SEQ ID NO:9)和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:10)，并用于比较分析。
1.2.CAR-T细胞的构建
病毒制备
包括pCMV-ΔR-8.47和pMD2.G的慢病毒包装质粒混合物购自Addgene，并且与适当的CAR编码质粒以预先优化的比率与聚乙烯亚胺混合。将HEK293细胞用慢病毒和CAR构建体的混合物转染，并且培养过夜。过夜培养后，收集上清液。将上清液离心以进一步去除细胞碎片，并通过0.45μm PES过滤器过滤。将病毒粒子沉淀，并且用预冷的DPBS冲洗。将病毒等分并立即储存在-80℃下，并且通过使用流式细胞术测定来测量supT1细胞系转导效率来确定病毒滴度。
T细胞的病毒转导
通过单采自健康供体收集白细胞。使用FICOLL-PAQUETMPLUS培养基分离外周血单个核细胞(PBMC)，并且使用Pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi)从PMBC中纯化人T细胞。随后将纯化的T细胞用人T细胞激活/扩增试剂盒(Miltenyi)预激活48小时。预激活后，以1:2的珠与细胞比率添加抗CD3/CD28 MACSiBeadTM粒子以扩增T细胞。
在8μg/mL聚凝胺存在下将预先激活的T细胞用慢病毒转导。将细胞在6孔组织培养板中以4×106个T细胞/孔培养，在37℃下持续大约48小时。将转导的细胞离心，除去上清液，并将沉淀的细胞以0.5×106个细胞/mL重悬于补充有300IU/ml IL-2的新鲜培养基中用于培养。每2至3天将细胞浓度调节至0.5×106个细胞/mL。
通过将蛋白L和兔-抗sdAb与CAR培养的细胞混合来检测T细胞上的CAR表达，以分别检测细胞表面scFv和sdAb。
实例2：CD19-共CD20 CAR-T细胞的体外细胞毒性评价
此实例显示了CD19-共CD20 CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性。
2.1乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性
为了在体外快速评价工程化T细胞(例如，CD19 BM CAR-T和CD19-共CD20 CAR-T细胞)的抗肿瘤活性，进行了细胞毒性的乳酸脱氢酶(LDH)测定。在转导后的第5天或第9天，收获CD19-共CD20 CAR转导的T细胞(SEQ ID NO:1)，并分别与靶细胞(表达CD19和CD20的BLL肿瘤Raji细胞)以1:1、1:0.3的E/T比率(效应子:CAR-T/靶比率)共孵育20小时。将CD19 BMCAR-T细胞(SEQ IDNO:2)用作阳性对照，将来自同一批次的未转导的T细胞(“UnT”)用作阴性对照。按照制造商手册(Roche)进行测定。
体外细胞毒性通过以下公式计算([LDH]E+T：从E/T共孵育释放的LDH，[LDH]E：仅从效应子释放的LDH，[LDH]max：从用Triton X-100处理的靶细胞释放的LDH，[LDH]min：从未处理的靶细胞释放的LDH)：
所有测试的CAR构建体(例如，CD19-共CD20 CAR-T、CD19 BM CAR-T和UnT细胞)都有效转导了人T细胞，CAR表达率在25％和60％之间。在同一批次的实验中，相对于未转导的T细胞，转导的细胞的细胞生长和生存力没有受到影响。如图2所示，CD19 BM CAR-T和CD19-共CD20 CAR-T细胞在体外以剂量依赖性方式诱导靶细胞裂解。此外，在低E/T比率下，CD19-共CD20 CAR-T细胞表现出比CD19 BM CAR-T更强的针对靶细胞的细胞毒性。
2.2通过均相时间分辨荧光(HTRF)的细胞因子分泌
效应T细胞激活和增殖的另一个量度是效应细胞因子如IFNγ和TNFα的产生。收集来自体外细胞毒性测定的上清液以评估CAR诱导的细胞因子释放，并且根据制造商手册进行IFN-γ的均相时间分辨荧光(HTRF)测定(Cisbio)。
将CAR-T细胞(例如，CD19 BM CAR-T、CD19-共CD20 CAR-T和未转导的“unT”CAR-T细胞)与Raji靶细胞共培养。24h后收集培养上清液以评估IFNγ和TNFα的释放，作为T细胞激活的量度。如图3和4所示，与靶细胞共培养的CD19-共CD20 CAR-T细胞分泌显著量的TNFα和IFNγ。此外，TNFα分泌水平高于阳性对照CD19 BM CAR-T细胞。
2.3长期共培养测定
为了评价CD19-共CD20 CAR-T细胞的长期杀伤功效，进行了长期共培养测定以模拟体内的动态杀伤过程。在不存在外源细胞因子(例如，IL-2)的情况下，将转导的(例如，CD19 BM CAR-T或CD19-共CD20 CAR-T)或未转导的(例如，unT)T细胞(1×105个/孔)与Raji靶细胞(4×105个/孔)以1:4的E:T比率在24孔板中共培养。共培养2或3天后，收获这些细胞中的一部分并针对CD3进行染色。通过CD3和CAR信号鉴定CAR-T细胞。对于系列共培养测定，然后以相同的E:T比率用新鲜Raji靶细胞再次攻击剩余T细胞。进行共培养，直到肿瘤细胞长得超出孔体积。每个时间点的T细胞增殖率通过将该时间点的T细胞数除以T细胞的初始数来计算。
各种CAR-T细胞在重复肿瘤刺激测定中的杀伤功效显示于图5中。CD19 BM CAR-T细胞在5轮肿瘤刺激后耗尽(例如，不能杀死另外的靶肿瘤细胞，如通过CD3％所测量)，而CD19-共CD20 CAR-T细胞持续杀死靶肿瘤细胞至7轮肿瘤刺激。此外，CD19-共CD20 CAR-T细胞在体外增殖并表现出比CD19 BM CAR-T细胞更好的长期扩增(图6)。这些结果表明，TLR4信号传导激活使CAR-T细胞抵抗衰竭，并增强其体外杀死靶肿瘤细胞的能力，由此解决了这类治疗剂进展的主要障碍。
实例3：表达外源引入的CLL1和CD33 toll样受体(TLR)结构域的CAR-T细胞的制备
此实例显示了表达外源引入的toll样受体(TLR)结构域的示例性装甲的CAR-T细胞的构建。特别地，此实例显示了表达CLL1和/或CD33的CAR-T细胞的构建。
3.1.嵌合抗原受体(CAR)的构建
此实例包含两种CAR构建体。对命名为CLL1-共CD33 CAR(SEQ ID NO:3)的第一CAR构建体进行密码子优化和化学合成，该第一CAR构建体是编码CAR骨架多肽的CAR骨架序列，该CAR骨架多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、抗CLL1 sdAb(SEQ ID NO:14)、CD28α铰链结构域(SEQ ID NO:15)、CD28跨膜(TM)结构域(SEQ ID NO:16)、CD28分子(SEQ ID NO:17)的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:10)。还对第一诱导型共刺激分子的序列进行密码子优化和化学合成，该第一诱导型共刺激分子从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、抗CD33 V结构域sdAb(SEQ ID NO:21)、TLR2跨膜(TM)区(SEQ ID NO:22)和TLR2的胞内部分(SEQ ID NO:23)，并经由P2A切割位点(SEQ IDNO:24)连接至CAR骨架序列。还对第二诱导型共刺激分子的序列进行密码子优化和化学合成，该第二诱导型共刺激分子从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、抗CD33 C2结构域sdAb(SEQ ID NO:18)、TLR1跨膜(TM)区(SEQ ID NO:19)和TLR1的胞内部分(SEQ IDNO:20)，并经由P2A切割位点(SEQ ID NO:24)连接至第一诱导型共刺激分子。此构建体显示于图7中。
对命名为CLL1-共CD33-2 CAR(SEQ ID NO:71)的第二CAR构建体进行密码子优化和化学合成，该第二CAR构建体是编码CAR骨架多肽的CAR骨架序列，该CAR骨架多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、抗CLL1sdAb(SEQ ID NO:14)、CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:7)、CD8α跨膜(TM)结构域(SEQ ID NO:8)、4-1BB(CD137)分子(SEQ ID NO:9)的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:10)。还对诱导型共刺激分子的序列进行密码子优化和化学合成，该诱导型共刺激分子从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQID NO:5)、抗CD33 sdAb(SEQ ID NO:21)、TLR4跨膜(TM)区(SEQ ID NO:12)和TLR4的胞内部分(SEQ ID NO:13)，并经由P2A切割位点(SEQ ID NO:24)连接至CAR骨架序列。此构建体显示于图7中。
将CAR骨架和共刺激分子克隆到慢病毒载体(例如，第二代慢病毒载体)中，下游并可操作地连接至组成型hEF1α启动子用于体外转录。参考如Blood(2006)108(12):3890-3897中所示例的，产生瞬时逆转录病毒上清液。
还如上所述制备了编码抗CLL1基准CAR(CLL1 BM CAR)的构建体用于比较分析(SEQ ID NO:4)。
还如上所述制备了编码抗CLL1/CD33双CAR(CLL1/CD33双CAR)的构建体用于比较分析(SEQ ID NO:43)。
3.2.T细胞的病毒制备和转导
如实例1所述制备慢病毒。根据实例1中描述的方法收集T细胞淋巴细胞并用慢病毒转导。
实例4：CLL1-共CD33 CAR-T细胞的体外细胞毒性测定
此实例显示了CLL1-共CD33 CAR-T和CLL1-共CD33-2 CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性。
4.1乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性
如实例2.1所述，在培养24h后进行LDH测定以测量细胞毒性。将表达CLL1和CD33的AML细胞系U937用作靶细胞。如图8所示，CLL1 BM CAR-T细胞、CLL1-共CD33 CAR-T和CLL1-共CD33-2 CAR-T细胞显示出针对U937靶细胞的相当的体外细胞毒性。
4.2通过均相时间分辨荧光(HTRF)的细胞因子分泌
收集来自体外细胞毒性测定的上清液以评估CAR诱导的细胞因子释放，并且根据制造商手册和实例2.2进行IFN-γ的均相时间分辨荧光(HTRF)测定(Cisbio)。
将CAR-T细胞(例如，CLL1 BM CAR-T细胞、CLL1-共CD33 CAR-T和CLL1-共CD33-2CAR-T以及未转导的“unT”CAR-T细胞)与U937靶细胞共培养。24h后收集培养上清液以评估IFNγ和TNFα的释放，作为T细胞激活的量度。如图9和10所示，与靶细胞共培养的CLL1-共CD33 CAR-T和CLL1-共CD33-2 CAR-T细胞分泌显著量的TNFα和IFNγ。此外，TNFα和IFNγ分泌水平都高于阳性对照CLL1BM CAR-T细胞。
4.3长期共培养测定
为了评价CLL1-共CD33 CAR-T细胞的长期杀伤功效，进行了长期共培养测定以模拟体内的动态杀伤过程。在不存在外源细胞因子(例如，IL-2)的情况下，将转导的(例如，CLL1 BM CAR-T、CLL1-共CD33 CAR-T或CLL1-共CD33-2 CAR-T)或未转导的(例如，unT)T细胞(1×105个/孔)与U937靶细胞(4×105个/孔)以1:4的E:T比率在24孔板中共培养。共培养2或3天后，收获这些细胞中的一部分并针对CD3进行染色。通过CD3和CAR信号鉴定CAR-T细胞。对于系列共培养测定，然后以相同的E:T比率用新鲜U937靶细胞再次攻击剩余T细胞。进行共培养，直到肿瘤细胞长得超出孔体积。每个时间点的T细胞增殖率通过将该时间点的T细胞数除以T细胞的初始数来计算。
各种CAR-T细胞在重复肿瘤刺激测定中的杀伤功效显示于图11中。CLL1 BM CAR-T细胞在再次攻击第15天后不能杀死靶肿瘤细胞，而CLL1-共CD33CAR-T和CLL1-共CD33-2CAR-T细胞持续杀死靶肿瘤细胞至肿瘤刺激的第20天。此外，CLL1-共CD33 CAR-T和CLL1-共CD33-2 CAR-T细胞在体外增殖并表现出比CLL1 BM CAR-T细胞更好的长期扩增(图12)。这些结果表明，嵌合TLR可以提供有效的共刺激信号，在CAR信号传导的背景下增强T细胞存活并增加T细胞增殖。
实例5：CLL1-共CD33 CAR-T体内小鼠模型的评价
根据图13中所示的方案，在U937-Luc异种移植小鼠模型中体内评估了装甲的TLRCAR-T细胞的抗肿瘤活性。在第0天，将2×106个具有萤火虫荧光素酶报告基因表达的U937-Luc细胞皮下植入NOD/SCID IL-2RγCnull(NSG)小鼠中。肿瘤接种后每周或每两周进行生物发光成像(BLI)，以监测模型的发展。基于BLI光子数和动物体重对动物进行随机分组。随机分组后，静脉内输注单一剂量的CAR-T细胞或UnT细胞。每周进行BLI成像以记录肿瘤生长。生物发光成像(BLI)显示，与CLL1 BM CAR T和CLL1/CD33双CAR T细胞相比，在输注了TLR装甲的CAR T细胞的小鼠中存在降低的肿瘤负荷(图14)。一致地，与CLL1 BM CAR和CLL1/CD33双CAR T细胞相比，在用TLR装甲的CAR T细胞处理的小鼠中，CAR T细胞在外周血单个核细胞(PBMC)中的百分比显著更高(图14)。因此，CLL1-共CD33 CAR-T比CLL1 BM或CLL1/CD33双CAR T细胞在体内杀伤U937-GL细胞方面更有效。
实例6：CLL1-共CD33 CAR-γδT的评价
γδT(γδT)淋巴细胞主要在胸腺中发育，并通过V(D)J重组产生其γδT细胞受体，并且为快速功能做好准备，包括对癌细胞的细胞毒性。γδT细胞的另一个潜在优势是，与αβT细胞不同，它们不局限于MHC，因此利用表达CAR转基因的工程化同种异体供体来源的γδT细胞理论上可以用作现成的通用产品，尽管这种应用将限于免疫功能非常低下的患者。因此，我们还评估了TLR装甲的CAR(例如，CLL1-共CD33和CLL1-共CD33-2)修饰的γδT的功效。
如实例5所述，在U937-Luc异种移植小鼠模型中评价CLL1-共CD33CARγδT细胞的体内功效。如图15所示，在所有小鼠中，用CLL1-共CD33 CARγδT处理的小鼠显示持续的U937肿瘤清除。然而，CLL1 BM CAR和CLL1/CD33双CARγδT组都经历肿瘤复发。一致地，与CLL1 BM CAR和CLL1/CD33双CARγδT细胞相比，在用CLL1-共CD33或CLL1-共CD33-2 CARγδT细胞处理的小鼠中，CARγδT细胞在外周血单个核细胞(PBMC)中的百分比显著更高。
实例7：表达外源引入的GPC3和NKG2D CD8 TLR4嵌合受体的CARγδT细胞的制备
此实例显示了表达外源引入的NKG2D CD8 TLR4嵌合受体的示例性装甲的CARγδT细胞的构建。特别地，此实例显示了表达GPC3的CARγδT细胞的构建。
7.1.嵌合抗原受体(CAR)的构建
为了构建抗GPC3装甲的NKG2D TLR4嵌合受体(SEQ ID NO:57)，对编码CAR骨架多肽的CAR骨架序列进行密码子优化和化学合成，该CAR骨架多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、抗GPC3 scFv(SEQ ID NO:55)、CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:7)、CD8跨膜(TM)结构域(SEQ ID NO:8)、4-1BB分子(SEQ ID NO:9)的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:10)。对NKG2D TLR4嵌合受体的序列进行密码子优化和化学合成，该NKG2D TLR4嵌合受体从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、NKG2D ECD(SEQID NO:51)、TLR4跨膜(TM)区(SEQ ID NO:12)和TLR4的胞内部分(SEQ ID NO:13)，并经由P2A切割位点(SEQ ID NO:24)连接至CAR骨架序列。
为了构建抗GPC3装甲的NKG2D CD8 TLR4嵌合受体(SEQ ID NO:58)，对编码CAR骨架多肽的CAR骨架序列进行密码子优化和化学合成，该CAR骨架多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、抗GPC3 scFv(SEQ ID NO:55)、CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:7)、CD8跨膜(TM)结构域(SEQ ID NO:8)、4-1BB分子(SEQ ID NO:9)的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:10)。还对NKG2D CD8 TLR4嵌合受体的序列进行密码子优化和化学合成，该NKG2D CD8 TLR4嵌合受体从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、NKG2D ECD(SEQ ID NO:51)、CD8α铰链(SEQ ID NO:7)、TLR4跨膜(TM)区(SEQ ID NO:12)和TLR4的胞内部分(SEQ ID NO:13)，并经由P2A切割位点(SEQ ID NO:24)连接至CAR骨架序列。此构建体显示于图16A中。
将CAR骨架和NKG2D TLR4/NKG2D CD8 TLR4嵌合受体克隆到慢病毒载体(例如，第二代慢病毒载体)中，下游并可操作地连接至组成型hEF1α启动子用于体外转录。参考如Blood(2006)108(12):3890-3897中所示例的，产生瞬时逆转录病毒上清液。
还如上所述制备了编码抗GPC3 CAR(GPC3 CAR)的构建体用于比较分析(SEQ IDNO:56)。
7.2.病毒制备
如实例1所述制备慢病毒。
7.3.γδT细胞的转导
通过向PBMC中添加5μM唑来膦酸盐和1000IU/mL IL-2来制备γδT细胞，并培养9天，定期更换补充有1000IU/mL IL-2的培养基。可替代地，从PBMC或脐带血(UCB)中分离γδT细胞，然后用抗γδTCR抗体和抗CD3(OKT3)刺激，随后以1:2的比率与基于K562的人工抗原呈递细胞(aAPC)共孵育至少10天。通过密度离心(lymphoprep)从白细胞去除术材料中分离PBMC并冷冻保存。将PBMC复苏并在补充有IL-2(1000IU/ml)和5％人AB血清的细胞培养基AIM-V中用唑来膦酸(5μΜ)激活，并且保存在加湿室(37℃，5％ CO2)中。激活后48小时，在MOI为5且存在5pg/ml聚凝胺下，用编码实例1的系统的慢病毒载体转导细胞。第二天重复这种转导程序，随后在转导后第二天补充含有IL-2(1000IU/ml)的新鲜培养基。在加湿室中在补充有IL-2(1000IU/ml)的AIM-V中培养细胞，培养基的定期更换取决于培养基的pH，以进一步扩增。转导后10天收获细胞，并确定细胞的总数、纯度和转导效率。在将来应用或冷冻保存之前，用阴性TCRγ/δ+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)进一步富集细胞。
实例8：用NKG2D CD8 TLR4嵌合受体装甲的抗GPC3 CARγδT细胞的体外细胞毒性测定
此实例显示了用NKG2D CD8 TLR4嵌合受体装甲的抗GPC3 CARγδT细胞的体外抗肿瘤活性。
8.1长期共培养测定
为了评价CARγδT细胞的长期杀伤功效，我们进行了长期共培养测定，其模拟体内的动态杀伤过程。在不存在外源细胞因子(IL-2)的情况下，将转导或未转导的T细胞(1×105个/孔)与肿瘤细胞系(Huh7细胞，1×105个/孔)以1:1的E:T比率在24孔板中共培养。2或3天的共培养后，收获这些细胞中的一部分并针对CD3进行染色。对于系列共培养测定，然后以相同的E:T比率用新鲜Huh7细胞再次攻击剩余T细胞。进行共培养，直到肿瘤细胞长得超出。每个时间点的T细胞增殖率通过将该时间点的T细胞数除以前一时间点的T细胞数来计算。
通过FACS检测的长期共培养测定的代表性结果显示于图19中。来自相同实验的经计算的T细胞增殖显示于图20中。数据表明NKG2D CD8 TLR4嵌合受体装甲的抗GPC3 CARγδT细胞比抗GPC3 CARγδT细胞具有更好的细胞毒性和体外增殖。
8.2通过HTRF检测的IFN-γ分泌
效应T细胞激活和增殖的另一个量度是效应细胞因子如IFN-γ的产生。收集来自第1轮至第3轮体外细胞毒性测定的上清液，以评估CAR诱导的细胞因子释放。根据制造商手册进行IFN-γ的HTRF测定(Cisbio，目录号62HIFNGPEH)。
相应的细胞因子释放结果显示于图21中。两种抗GPC3γδCAR T细胞都表现出针对Huh7细胞的有效杀伤活性，并应答于Huh7细胞而释放IFN-γ。用NKG2D CD8 TLR4嵌合受体装甲的CAR T细胞比裸CAR T细胞显示更高水平的IFN-γ分泌。
实例9：表达外源引入的CD19和NKG2D CD8 TLR4嵌合受体的CARαβT细胞的制备
此实例显示了表达外源引入的NKG2D CD8 TLR4嵌合受体的示例性装甲的CARαβT细胞的构建。特别地，此实例显示了表达CD19的CARαβT细胞的构建。
9.1.嵌合抗原受体(CAR)的构建
为了构建抗CD19装甲的NKG2D TLR4嵌合受体(SEQ ID NO:59)，对编码CAR骨架多肽的CAR骨架序列进行密码子优化和化学合成，该CAR骨架多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、抗CD19 scFv(SEQ ID NO:6)、CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:7)、CD8跨膜(TM)结构域(SEQ ID NO:8)、4-1BB分子(SEQ ID NO:9)的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:10)。还对NKG2D TLR4嵌合受体的序列进行密码子优化和化学合成，该NKG2DTLR4嵌合受体从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、NKG2D ECD(SEQID NO:51)、TLR4跨膜(TM)区(SEQ ID NO:12)和TLR4的胞内部分(SEQ ID NO:13)，并经由P2A切割位点(SEQ ID NO:24)连接至CAR骨架序列。
为了构建抗CD19装甲的NKG2D CD8 TLR4嵌合受体(SEQ ID NO:60)，对编码CAR骨架多肽的CAR骨架序列进行密码子优化和化学合成，该CAR骨架多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、抗CD19 scFv(SEQ ID NO:6)、CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:7)、CD8跨膜(TM)结构域(SEQ ID NO:8)、4-1BB分子(SEQ ID NO:9)的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:10)。还对NKG2D CD8 TLR4嵌合受体的序列进行密码子优化和化学合成，该NKG2D CD8 TLR4嵌合受体从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、NKG2D ECD(SEQ ID NO:51)、CD8α铰链(SEQ ID NO:7)、TLR4跨膜(TM)区(SEQ ID NO:12)和TLR4的胞内部分(SEQ ID NO:13)，并经由P2A切割位点(SEQ ID NO:24)连接至CAR骨架序列。此构建体显示于图16A中。
将CAR骨架和NKG2D TLR4/NKG2D CD8 TLR4嵌合受体克隆到慢病毒载体(例如，第二代慢病毒载体)中，下游并可操作地连接至组成型hEF1α启动子用于体外转录。参考如Blood(2006)108(12):3890-3897中所示例的，产生瞬时逆转录病毒上清液。
还如上所述制备了编码抗CD19 CAR(CD19 BM CAR)的构建体用于比较分析(SEQID NO:2)。
9.2.T细胞的病毒制备和转导
如实例1所述制备慢病毒。根据实例1中描述的方法收集T细胞淋巴细胞并用慢病毒转导。
实例10：用NKG2D CD8 TLR4嵌合受体装甲的抗CD19 CARαβT细胞的体外细胞毒性测定
此实例显示了用NKG2D CD8 TLR4嵌合受体装甲的抗CD19 CARαβT细胞的体外抗肿瘤活性。
长期共培养测定
为了评价CARαβT细胞的长期杀伤功效，我们进行了长期共培养测定。在不存在外源细胞因子(IL-2)的情况下，将转导或未转导的T细胞(1×105个/孔)与肿瘤细胞系(Raji细胞，1×105个/孔)以1:1的E:T比率在24孔板中共培养。2或3天的共培养后，收获这些细胞中的一部分并针对CD3进行染色。
对于系列共培养测定，然后以相同的E:T比率用新鲜Raji细胞再次攻击剩余T细胞。进行共培养，直到肿瘤细胞长得超出。每个时间点的T细胞增殖率通过将该时间点的T细胞数除以前一时间点的T细胞数来计算。
通过FACS检测的长期共培养测定的代表性结果显示于图22中。来自相同实验的经计算的T细胞增殖显示于图23中。数据表明NKG2D CD8 TLR4嵌合受体装甲提高了抗CD19CARαβT细胞的细胞毒性和增殖。
实例11：用NKG2D CD8 TLR4嵌合受体装甲的抗GPC3 CARγδT细胞的体内功效评价
此实例显示了用NKG2D CD8 TLR4嵌合受体装甲的抗GPC3 CARγδT细胞的体内抗肿瘤活性。
在Huh7异种移植模型中评估了示例性抗GPC3 CAR-γδT细胞的体内抗肿瘤活性。简言之，在第0天，将3百万(3×106)个Huh7细胞皮下植入NOD/SCID IL-2RγC null(NSG)小鼠中。肿瘤接种后十天，将小鼠进行如下处理：静脉内注射1×106个装甲的CAR-γδT或模拟T细胞或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。每周两次用卡尺测量肿瘤尺寸，并使用公式V＝1/2(长×宽2)计算肿瘤体积。当对照小鼠的平均肿瘤负荷达到2,000mm3时，将小鼠安乐死。
在Huh7异种移植模型中，抗GPC3 CARγδT细胞或用NKG2D CD8TLR4嵌合受体装甲的抗GPC3 CARγδT细胞的抗肿瘤效果的结果显示于图24中。未装甲的CAR-γδT细胞和NKG2D CD8 TLR4嵌合受体装甲的CAR-γδT细胞一起抑制肿瘤生长。具体地，未装甲的CAR-γδT细胞处理的小鼠达到无肿瘤，但被缓慢排斥，而NKG2D CD8 TLR4嵌合受体装甲的CAR-γδT细胞处理的小鼠达到无肿瘤并保持健康和无肿瘤，直到实验观察结束。
实例12：具有串联、单个抗BCMA sdAb或抗GPRC5D scFv的表达外源引入的toll样受体4(TLR4)细胞内结构域的CAR-T细胞的制备
此实例显示了表达外源引入的toll样受体(TLR)结构域的示例性装甲的CAR-T细胞的构建。特别地，此实例显示了具有串联、单个sdAb或抗GPRC5D scFv的抗BCMA CAR-T细胞的构建。
12.1.嵌合抗原受体(CAR)的构建
为了构建串联抗BCMA-共抗BCMA CAR(SEQ ID NO:61)，对编码CAR骨架多肽的CAR骨架序列进行密码子优化和化学合成，该CAR骨架多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQID NO:5)、串联抗BCMA sdAb(SEQ ID NO:44)、CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:7)、CD8α跨膜(TM)结构域(SEQ ID NO:8)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域(SEQ ID NO:9)的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:10)。还对诱导型共刺激分子的序列进行密码子优化和化学合成，该诱导型共刺激分子从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、串联抗BCMA sdAb(SEQ ID NO:44)、TLR4跨膜(TM)区(SEQ ID NO:12)和TLR4的胞内部分(SEQ ID NO:13)，并经由P2A切割位点(SEQ ID NO:24)连接至CAR骨架序列。
为了构建单个抗BCMA-共抗BCMA CAR(SEQ ID NO:62)，对编码CAR骨架多肽的CAR骨架序列进行密码子优化和化学合成，该CAR骨架多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQID NO:5)、抗BCMA sdAb(SEQ ID NO:68)、CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:7)、CD8α跨膜(TM)结构域(SEQ ID NO:8)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域(SEQ ID NO:9)的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:10)。还对诱导型共刺激分子的序列进行密码子优化和化学合成，该诱导型共刺激分子从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、抗BCMA sdAb(SEQ ID NO:69)、TLR4跨膜(TM)区(SEQ ID NO:12)和TLR4的胞内部分(SEQ IDNO:13)，并经由P2A切割位点(SEQ ID NO:24)连接至CAR骨架序列。
为了构建单个抗BCMA-共抗BCMA-CD8 CAR(SEQ ID NO:63)，对编码CAR骨架多肽的CAR骨架序列进行密码子优化和化学合成，该CAR骨架多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、抗BCMA sdAb(SEQ ID NO:68)、CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:7)、CD8α跨膜(TM)结构域(SEQ ID NO:8)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域(SEQ ID NO:9)的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:10)。还对诱导型共刺激分子的序列进行密码子优化和化学合成，该诱导型共刺激分子从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、抗BCMA sdAb(SEQ ID NO:69)、CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:7)、TLR4跨膜(TM)区(SEQID NO:12)和TLR4的胞内部分(SEQ ID NO:13)，并经由P2A切割位点(SEQ ID NO:24)连接至CAR骨架序列。
为了构建单个抗BCMA-共抗BCMA-CD28 CAR(SEQ ID NO:64)，对编码CAR骨架多肽的CAR骨架序列进行密码子优化和化学合成，该CAR骨架多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、抗BCMA sdAb(SEQ ID NO:68)、CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:7)、CD8α跨膜(TM)结构域(SEQ ID NO:8)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域(SEQ ID NO:9)的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:10)。还对诱导型共刺激分子的序列进行密码子优化和化学合成，该诱导型共刺激分子从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ IDNO:5)、抗BCMA sdAb(SEQ ID NO:69)、CD28铰链结构域(SEQ ID NO:15)、TLR4跨膜(TM)区(SEQ ID NO:12)和TLR4的胞内部分(SEQ ID NO:13)，并经由P2A切割位点(SEQ ID NO:24)连接至CAR骨架序列。
为了构建串联抗BCMA-共抗GPRC5D CAR(SEQ ID NO:65)，对编码CAR骨架多肽的CAR骨架序列进行密码子优化和化学合成，该CAR骨架多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、串联抗BCMA sdAb(SEQ ID NO:44)、CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:7)、CD8α跨膜(TM)结构域(SEQ ID NO:8)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域(SEQ ID NO:9)的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:10)。还对诱导型共刺激分子的序列进行密码子优化和化学合成，该诱导型共刺激分子从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ IDNO:5)、抗GPRC5D scFv(SEQ ID NO:70)、TLR4跨膜(TM)区(SEQ ID NO:12)和TLR4的胞内部分(SEQ ID NO:13)，并经由P2A切割位点(SEQ ID NO:24)连接至CAR骨架序列。
为了构建串联抗BCMA-共抗GPRC5D-CD8 CAR(SEQ ID NO:72)，对编码CAR骨架多肽的CAR骨架序列进行密码子优化和化学合成，该CAR骨架多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、串联抗BCMA sdAb(SEQ ID NO:44)、CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:7)、CD8α跨膜(TM)结构域(SEQ ID NO:8)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域(SEQ ID NO:9)的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:10)。还对诱导型共刺激分子的序列进行密码子优化和化学合成，该诱导型共刺激分子从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQID NO:5)、抗GPRC5D scFv(SEQ ID NO:70)、CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:7)、TLR4跨膜(TM)区(SEQ ID NO:12)和TLR4的胞内部分(SEQ ID NO:13)，并经由P2A切割位点(SEQ ID NO:24)连接至CAR骨架序列。
为了构建串联抗BCMA-共抗GPRC5D-CD28 CAR(SEQ ID NO:73)，对编码CAR骨架多肽的CAR骨架序列进行密码子优化和化学合成，该CAR骨架多肽从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、串联抗BCMA sdAb(SEQ ID NO:44)、CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:7)、CD8α跨膜(TM)结构域(SEQ ID NO:8)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域(SEQ ID NO:9)的胞内部分和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:10)。还对诱导型共刺激分子的序列进行密码子优化和化学合成，该诱导型共刺激分子从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、抗GPRC5D scFv(SEQ ID NO:70)、CD28铰链结构域(SEQ ID NO:15)、TLR4跨膜(TM)区(SEQ ID NO:12)和TLR4的胞内部分(SEQ ID NO:13)，并经由P2A切割位点(SEQ IDNO:24)连接至CAR骨架序列。
将CAR骨架和共刺激分子克隆到慢病毒载体(例如，第二代慢病毒载体)中，下游并可操作地连接至组成型hEF1α启动子用于体外转录。参考如Blood(2006)108(12):3890-3897中所示例的，产生瞬时逆转录病毒上清液。
分别地，构建串联抗BCMACAR(SEQ ID NO:66)和单个抗BCMA CAR(SEQ ID NO:67)，从N-末端到C-末端包含：信号肽(SEQ ID NO:5)、串联抗BCMA sdAb(SEQ ID NO:44)或第一单个抗BCMA sdAb(SEQ ID NO:68)、CD8α铰链结构域(SEQ ID NO:7)、CD8α跨膜(TM)结构域(SEQ ID NO:8)、4-1BB共刺激信号传导结构域(SEQ ID NO:9)和CD3ζ初级细胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:10)，如上所述制备并用于比较分析。
12.2.CAR-T细胞的构建
病毒制备
如实例1所述制备慢病毒。
γδT细胞的激活
通过向PBMC中添加5μM唑来膦酸盐和1000IU/mL IL-2来制备γδT细胞，并培养14天，定期更换补充有1000IU/mL IL-2的培养基。可替代地，从PBMC或脐带血(UCB)中分离γδT细胞，然后用抗γδTCR抗体和抗CD3(OKT3)刺激，随后以1:2的比率与基于K562的人工抗原呈递细胞(aAPC)共孵育至少10天。
通过密度离心(lymphoprep)从白细胞去除术材料中分离PBMC并冷冻保存。将PBMC复苏并在补充有IL-2(1000IU/ml)和5％人AB血清的细胞培养基AIM-V中用唑来膦酸(5μΜ)激活，并且保存在加湿室(37℃，5％ CO2)中。激活后48小时，在MOI为2且存在5pg/ml聚凝胺下，用编码此实例的系统的慢病毒载体转导细胞。在加湿室中在补充有IL-2(1000IU/ml)的AIM-V中培养细胞，培养基的定期更换取决于培养基的pH，以进一步扩增。转导后10天收获细胞，并确定细胞的总数、纯度和转导效率。在将来应用或冷冻保存之前，用阴性TCRγ/δ+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)进一步富集细胞。
T细胞的病毒转导
通过单采自健康供体收集白细胞。使用FICOLL-PAQUETMPLUS培养基分离外周血单个核细胞(PBMC)，并且使用Pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi)从PMBC中纯化人T细胞。随后将纯化的T细胞用人T细胞激活/扩增试剂盒(Miltenyi)预激活48小时。预激活后，以1:2的珠与细胞比率添加抗CD3/CD28 MACSiBeadTM粒子以扩增T细胞。
在8μg/mL聚凝胺存在下将预先激活的T细胞用慢病毒转导。将细胞在6孔组织培养板中以4×106个T细胞/孔培养，在37℃下持续大约48小时。将转导的细胞离心，除去上清液，并将沉淀的细胞以0.5×106个细胞/mL重悬于补充有300IU/ml IL-2的新鲜培养基中用于培养。每2至3天将细胞浓度调节至0.5×106个细胞/mL。
通过兔抗sdAb与CAR培养的细胞来检测T细胞上的CAR表达，以检测细胞表面sdAb。
实例13：体外细胞毒性
此实例显示了抗BCMA-共抗BCMA CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性。
13.1乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性
为了在体外快速评价工程化T细胞(例如，抗BCMA CAR-γδT和抗BCMA-共抗BCMACAR-γδT细胞)的抗肿瘤活性，进行了细胞毒性的乳酸脱氢酶(LDH)测定。在转导后的第7天，收获串联抗BCMA-共抗BCMA CAR(SEQ ID NO:61)和单个抗BCMA-共抗BCMA CAR(SEQ IDNO:62)转导的γδT细胞，并分别与靶细胞(表达BCMA的NCI-H929或RPMI-8226肿瘤细胞)以0.25:1、0.125:1、0.0625:1、0.03125:1和0:1的E/T比率(效应子:CAR-T/靶比率)共孵育20小时。将串联抗BCMA CAR(SEQ ID NO:66)和单个抗BCMA CAR(SEQ ID NO:67)转导的γδT细胞都用作阳性对照，来自同一批次的未转导的γδT细胞(“Un-γδT”)用作阴性对照。按照制造商手册(Roche)进行测定。
体外细胞毒性通过以下公式计算([LDH]E+T：从E/T共孵育释放的LDH，[LDH]E：仅从效应子释放的LDH，[LDH]max：从用Triton X-100处理的靶细胞释放的LDH，[LDH]min：从未处理的靶细胞释放的LDH)：
所有测试的CAR构建体都有效转导了人γδT细胞，CAR表达率在25％和80％之间。在同一批次的实验中，相对于未转导的T细胞，转导的细胞的细胞生长和生存力没有受到影响。如图26所示，对照串联或单个CAR-γδT和串联或单个抗BCMA-共抗BCMA-CAR-γδT细胞在体外以剂量依赖性方式对测试的NCI-H929和RPMI-8226肿瘤细胞都诱导靶细胞裂解。此外，对于串联和单个设计，抗BCMA-共抗BCMA-CAR-γδT细胞表现出比抗BCMA CAR-γδT更强的针对靶细胞的细胞毒性。
13.2通过均相时间分辨荧光(HTRF)的细胞因子分泌
效应γδT细胞激活的另一个量度是效应细胞因子如IFN-γ、TNF-α和GM-CSF的产生。收集来自体外细胞毒性测定的上清液以评估CAR诱导的细胞因子释放，并且根据制造商手册进行IFN-γ、TNF-α和GM-CSF的均相时间分辨荧光(HTRF)测定(Cisbio)。
将CAR-γδT细胞(例如，单个/串联抗BCMA CAR-γδT和单个/串联抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT细胞和未转导的γδT细胞)与NCI-H929或RPMI-8226靶细胞共培养。20h后收集培养上清液以评估IFN-γ、TNF-α和GM-CSF的释放，作为γδT细胞激活的量度。如图27所示，与靶肿瘤细胞共培养的单个抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT细胞和串联抗BCMA-共抗BCMACAR-γδT细胞分泌显著量的IFN-γ、TNF-α和GM-CSF，类似于单个和串联sdAb设计的抗BCMA-CAR-γδT细胞。这表明添加抗BCMA-共CAR不影响CAR介导的抗肿瘤细胞毒性。最有可能的是，TLR4信号传导有助于增强靶接合后CAR-γδT细胞的持久性。为了测试这一假设，使这些细胞经受如下所述的长期共培养测定。
13.3长期共培养测定
为了评价抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT和抗BCMA-共抗GPRC5DCAR-γδT细胞的长期杀伤功效和持久性，进行了长期共培养测定以模拟体内的动态杀伤过程。在不存在外源细胞因子(例如，IL-2)的情况下，将转导的(例如，串联抗BCMA CAR-γδT、串联抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT细胞、单个抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT细胞、单个抗BCMA-共抗BCMA-CD8CAR-γδT细胞、单个抗BCMA-共抗BCMA-CD28 CAR-γδT细胞和串联抗BCMA-共抗GPRC5DCAR-γδT细胞)或未转导的(例如，Un-γδT)T细胞(1×105个/孔)与NCI-H929靶细胞(4×105个/孔)以1:3的E:T比率在24孔板中共培养。共培养2或3天后，收获这些细胞中的一部分并针对CD3进行染色。通过CD3和CAR信号鉴定CAR-γδT细胞。对于系列共培养测定，然后以相同的E:T比率用新鲜NCI-H929靶细胞再次攻击剩余γδT细胞。进行共培养，直到肿瘤细胞长得超出孔体积。每个时间点的γδT细胞增殖率通过将该时间点的γδT细胞数除以γδT细胞的初始数来计算。
各种CAR-T细胞在重复肿瘤刺激测定中的杀伤功效显示于图28中。串联抗BCMACAR-γδT细胞在4轮肿瘤刺激后耗尽(例如，不能杀死另外的靶肿瘤细胞，如通过CD3％所测量)，而串联抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT细胞、单个抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT细胞、单个抗BCMA-共抗BCMA-CD8 CAR-γδT细胞、单个抗BCMA-共抗BCMA-CD28 CAR-γδT细胞、串联抗BCMA-共抗GPRC5DCAR-γδT细胞和串联抗BCMA-共抗GPRC5D-CD8 CAR-γδT细胞持续杀死靶肿瘤细胞至8轮肿瘤刺激。此外，我们发现串联抗BCMA-共抗GPRC5D CAR-γδT细胞在体外增殖并表现出比串联抗BCMA CAR-γδT细胞更好的长期持久性。此外，在8轮重复刺激后，串联抗BCMA-共抗GPRC5D CAR-γδT细胞、串联抗BCMA-共抗GPRC5D-CD8 CAR-γδT细胞和单个抗BCMA-共抗BCMA-CD28 CAR-γδT细胞显示出比串联抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT细胞好得多的增殖(图28)。
综上所述，这些结果表明，TLR4信号传导激活使CAR-T细胞抵抗衰竭，并增强其体外杀死靶肿瘤细胞的能力，由此解决了这类治疗剂进展的主要障碍。具体地，我们证明了由串联或单个抗BCMA sdAb触发的TLR4信号传导在增强CAR-γδT细胞的抗肿瘤细胞毒性和持久性方面同样效果良好。此外，可以用抗GPRC5D scFv或不同的铰链设计(如但不限于CD28)进一步改善细胞毒性和持久性。
实例14：同种异体环境中的体外持久性
此实例显示了串联抗BCMA-共抗BCMA CAR-T细胞在同种异体环境中的体外持久性。
14.1三向混合淋巴细胞反应(MLR)测定
为了测试串联抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT细胞作为同种异体细胞治疗的“现成”产品的潜力，我们通过在同一系统中使用CAR-γδT、HCI-H929肿瘤细胞和同种异体PBMC(使用自体PBMC作为对照)的共培养进行三向MLR测定来模拟体外同种异体环境。具体地，将这些细胞以γδT:PBMC:肿瘤＝1:60:1的比率共培养，初始γδT细胞数量为每孔4×105个细胞。共培养后3、6和9天，记录γδT细胞的数量，以确定在同种异体PBMC存在下的增殖。另一方面，在第9天，记录αβT和NK细胞数量，以确定这些具有同种异体性质的主要效应细胞是否受到γδT细胞的刺激。如图29所示，在同种异体PBMC的存在下，与串联抗BCMA CAR-γδT细胞相比，串联抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT展示出更高的增殖水平。另一方面，非常清楚的是，与对照串联抗BCMA CAR-γδT细胞相比，串联抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT细胞的同种异体αβT和NK细胞在此系统中的增殖少得多。
因此，我们证明了配备有配体诱导的TLR4信号传导的串联抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT细胞是“现成”同种异体细胞治疗剂的可行候选物，因为它甚至在同种异体细胞的存在下也展示出优异的持久性。
实例15：体内功效和安全性
此实例显示了示例性串联抗BCMA CAR-T细胞和串联抗BCMA-共抗BCMA CAR-T细胞在同种异体环境中的体内功效和安全性。
15.1RPMI-8226异种移植模型中的体内功效和安全性
在RPMI-8226异种移植模型中对示例性串联抗BCMA CAR-T的抗肿瘤活性进行了体内评估。简言之，在第0天，将一百万(1×106)个稳定表达萤火虫荧光素酶报告基因的RPMI-8226细胞皮下/静脉内植入NOD/SCID IL-2RγCnull(NSG)小鼠中。肿瘤接种后十四天，将小鼠进行如下处理：静脉内注射1×106个装甲的CAR-γδT或模拟T细胞或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。每周一次通过生物发光成像(BLI)监测肿瘤进展。此外，经由FACS分析从血液中抽取的血浆监测T细胞增殖。
对于毒性评价，每天观察临床症状，同时每周测量动物的体重和由肿瘤-Luc细胞触发的荧光强度。每周抽取血液(0.2mL)用于检测小鼠的人源化细胞因子谱(IFN-γ、TNF-α和GM-CSF)。
在低肿瘤负荷和每只小鼠1M CAR-γδT细胞剂量的第一个实验中，我们发现串联抗BCMA CAR-γδT和串联抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT细胞都可以抑制肿瘤生长。然而，很明显，串联抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT比串联抗BCMA CAR-γδT细胞展示出更好的抗肿瘤活性，因为只有用串联抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT细胞处理的小鼠保持无肿瘤，而另一个实验组在实验快结束时复发(图30)。此外，来自小鼠血液的FACS分析的药物动力学结果表明，串联抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT组的外周血中CAR-γδT细胞的扩增比串联抗BCMA CAR-γδT组高得多，进一步证实了串联抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT细胞更好的体内功效(图30)。
在另一个具有较高初始肿瘤负荷和每只小鼠0.3M CAR-γδT细胞的较低剂量的实验中，我们发现串联抗BCMA-共抗GPRC5D-CD8 CAR-γδT细胞仍然能够分化多发性骨髓瘤肿瘤细胞，由此确立了BCMA和GPRC5D双靶向的可行性和不同铰链设计(如但不限于CD8)的潜在有用性(图30)。
此外，在所有测试组之间没有发现显著的体重变化。此外，串联抗BCMA-共抗BCMACAR-γδT处理的小鼠外周血中的IFN-γ、TNF-α和GM-CSF水平与串联抗BCMA CAR-γδT处理的小鼠相似。这些发现与在体外共培养测定中得到的观察结果相当(图31A和B)。这些结果表明，串联抗BCMA-共抗BCMA CAR-γδT疗法在体内是安全的。
总之，我们在体内多发性骨髓瘤模型中确定了配备有抗BCMA触发的TLR4信号传导的抗BCMA CAR-γδT细胞是安全的，并且比单纯的第二代抗BCMA CAR-γδT更有效。
Claims (71)
1.一种经修饰的免疫细胞，其包含：
a)第一多肽，其包含：i)第一靶结合结构域，ii)第一TLR跨膜结构域，和iii)第一TLR信号传导结构域；和
b)第二多肽，其包含：i)第二靶结合结构域，ii)第二TLR跨膜结构域，和iii)第二TLR信号传导结构域；
其中在所述第一靶结合结构域和第二靶结合结构域与其相应的靶结合时，所述第一TLR信号传导结构域和所述第二TLR信号传导结构域相互缔合以形成能够诱导TLR信号传导的TLR信号传导部分。
2.如权利要求1所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域各自结合多聚体靶分子的亚基。
3.如权利要求2所述的经修饰的免疫细胞，其中所述多聚体靶分子的亚基相同。
4.如权利要求2所述的经修饰的免疫细胞，其中所述多聚体靶分子的亚基不同。
5.如权利要求1或2所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一靶结合结构域和所述第二结合结构域结合相同的靶分子。
6.如权利要求5所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一靶结合结构域和所述第二结合结构域各自结合所述靶分子上的相同靶位点。
7.如权利要求1-3和5-6中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域相同。
8.如权利要求5所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域各自结合单个靶分子上不同的非重叠靶位点。
9.如权利要求1-8中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一TLR跨膜结构域和所述第一TLR信号传导结构域衍生自相同TLR分子。
10.如权利要求1-9中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第二TLR跨膜结构域和所述第二TLR信号传导结构域衍生自相同TLR分子。
11.如权利要求1-10中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一TLR跨膜结构域和所述第二TLR跨膜结构域相同。
12.如权利要求1-11中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一TLR信号传导结构域和所述第二TLR信号传导结构域相同。
13.如权利要求11或权利要求12所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一TLR跨膜结构域和/或第一TLR信号传导结构域衍生自TLR4。
14.如权利要求1-10中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一TLR跨膜结构域和所述第二TLR跨膜结构域不同。
15.如权利要求1-11和14中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一TLR信号传导结构域和所述第二TLR信号传导结构域不同。
16.如权利要求14或权利要求15所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一TLR跨膜结构域和/或第一TLR信号传导结构域衍生自TLR2。
17.如权利要求14或权利要求15所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第二TLR跨膜结构域和/或第二TLR信号传导结构域衍生自TLR6。
18.如权利要求14-17中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第二TLR跨膜结构域和/或第二TLR信号传导结构域衍生自TLR1。
19.如权利要求1-18中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一靶结合结构域和/或所述第二靶结合结构域是抗体部分或其抗原结合片段。
20.如权利要求19所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一靶结合结构域和/或第二靶结合结构域是scFv或sdAb。
21.如权利要求20所述的经修饰的免疫细胞，其中所述scFv或sdAb特异性结合CD33、CLL1、CD123、CD19、CD20、CD22、BCMA、GPRC5D和GPC3。
22.如权利要求5-18中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述靶分子是免疫检查点蛋白。
23.如权利要求22所述的经修饰的免疫细胞，其中所述靶分子选自由以下组成的组：PD-1、CD70、CD27、SIRPα和TIGIT。
24.如权利要求5-18中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述靶分子是在免疫细胞上表达的天然蛋白质。
25.如权利要求24所述的经修饰的免疫细胞，其中所述靶分子是NKG2D。
26.如权利要求24或25所述的经修饰的免疫细胞，其中所述靶分子是NKG2D的全长序列。
27.如权利要求24或25所述的经修饰的免疫细胞，其中所述靶分子是突变的NKG2D。
28.如权利要求27所述的经修饰的免疫细胞，其中所述突变的NKG2D包含截短的序列和/或氨基酸取代、突变、添加和/或缺失。
29.如权利要求24或25所述的经修饰的免疫细胞，其中所述靶分子是NKG2D的细胞外抗原结合结构域。
30.如权利要求1-29中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
31.如权利要求30所述的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞是NK细胞。
32.如权利要求30所述的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞是细胞毒性T细胞。
33.如权利要求1-32中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞包含工程化受体。
34.如权利要求33所述的经修饰的免疫细胞，其中所述工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)。
35.如权利要求33所述的经修饰的免疫细胞，其中所述工程化受体是经修饰的T细胞受体(TCR)。
36.如权利要求33所述的经修饰的免疫细胞，其中所述工程化受体是T细胞抗原偶联物(TAC)受体。
37.如权利要求33-36中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述工程化受体包含特异性识别与所述第一多肽和/或所述第二多肽相同的靶分子的细胞外结构域。
38.如权利要求37所述的经修饰的免疫细胞，其中所述工程化受体包含特异性识别与所述第一多肽和/或所述第二多肽相同的靶分子上的非重叠靶位点的细胞外结构域。
39.如权利要求33-38中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述工程化受体包含特异性识别CD19、CLL1、BCMA和GPC3中任一种的细胞外结构域。
40.如权利要求39所述的经修饰的免疫细胞，其中所述工程化受体包含与SEQ ID NO:1、3、57-60、61-65、71-73中任一个的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:1、3、57-60、61-65、71-73中任一个的氨基酸序列。
41.如权利要求1-40中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞包含编码所述第一多肽的第一核酸和编码所述第二多肽的第二核酸。
42.如权利要求1-3、5-7、9-13和19-32中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一多肽和所述第二多肽相同，并且其中所述经修饰的免疫细胞包含编码所述第一多肽和所述第二多肽的第一核酸。
43.如权利要求33-42中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞包含编码所述工程化受体的第三核酸。
44.如权利要求41-43中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一核酸和所述第二核酸可操作地连接至同一启动子。
45.如权利要求41或43所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一核酸和所述第二核酸可操作地连接至分开的启动子。
46.如权利要求43-45中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一核酸和所述第三核酸可操作地连接至同一启动子。
47.如权利要求43-45中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一核酸和所述第三核酸可操作地连接至分开的启动子。
48.如权利要求43、44和46中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一核酸、所述第二核酸和所述第三核酸可操作地连接至同一启动子。
49.如权利要求19-21中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一靶结合结构域和所述第二靶结合结构域特异性识别CD20的亚基。
50.如权利要求8-48中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中(1)所述第一靶结合结构域特异性识别CD33的C2亚基，并且所述第二靶结合结构域特异性识别CD33的V亚基；或
(2)所述第一靶结合结构域特异性识别CD33的V亚基，并且所述第二靶结合结构域特异性识别CD33的C2亚基。
51.如权利要求1-50中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一多肽进一步包含第一细胞因子受体的第一细胞内结构域，和/或所述第二多肽进一步包含第二细胞因子受体的第二细胞内结构域。
52.如权利要求51所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一细胞内结构域和所述第二细胞内结构域相同。
53.如权利要求51所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一细胞内结构域和所述第二细胞内结构域不同。
54.如权利要求51-53中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一细胞因子受体和/或所述第二细胞因子受体选自由以下组成的组：GM-CSF受体、IL-18受体、IL-21受体、IL-15受体和IL-23受体。
55.如权利要求51-53中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一细胞因子受体的所述第一细胞内结构域和/或所述第二细胞因子受体的所述第二细胞内结构域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。
56.如权利要求51-55中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一细胞因子受体的所述第一细胞内结构域的C-末端与所述第一TLR信号传导结构域的N-末端融合；和/或所述第二细胞因子受体的所述第二细胞内结构域的C-末端与所述第二TLR信号传导结构域的N-末端融合。
57.如权利要求51-55中任一项所述的经修饰的免疫细胞，其中所述第一细胞因子受体的所述第一细胞内结构域的N-末端与所述TLR信号传导结构域的C-末端融合，和/或所述第二细胞因子受体的所述第二细胞内结构域的N-末端与所述TLR信号传导结构域的C-末端融合。
58.一种产生如权利要求1-57中任一项所述的经修饰的免疫细胞的方法，所述方法包括：将编码所述第一多肽的第一核酸和任选的编码所述第二多肽的第二核酸引入前体免疫细胞中。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述前体免疫细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、NK细胞、NK-T细胞、iNK-T细胞、NK-T样细胞、αβT细胞和γδT细胞。
60.如权利要求58或59所述的方法，其中所述前体免疫细胞包含工程化受体。
61.如权利要求58或59所述的方法，其进一步包括将编码工程化受体的第三核酸引入所述前体免疫细胞中。
62.如权利要求60或61所述的方法，其中所述工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)、经修饰的T细胞受体(TCR)或T细胞抗原偶联物(TAC)受体。
63.如权利要求58-62中任一项所述的方法，其中所述第一核酸、所述第二核酸和/或所述第三核酸在同一载体上。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述载体是病毒载体。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述病毒载体选自由腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物组成的组。
66.如权利要求58-62中任一项所述的方法，其进一步包括分离或富集包含所述第一核酸、所述第二核酸和/或所述第三核酸的免疫细胞。
67.一种通过如权利要求58-66中任一项所述的方法产生的经修饰的免疫细胞。
68.一种药物组合物，其包含如权利要求1-57和67所述的经修饰的免疫细胞、和药学上可接受的载剂。
69.一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求68所述的药物组合物。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述疾病是癌症。
71.如权利要求69或70所述的方法，其中所述个体是人。
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