ES2638439T3 - Ligandos peptídicos avß6 y sus usos - Google Patents

Abstract

Un péptido, cuya secuencia de aminoácidos consiste en una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: GFTTGRRGDLATIHGMNRPF; YTASARGDLAHLTTTHARHL; y NAVPNLRGDLQVLAQKVART.

Description

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Resonancia Magnética (IRM), Espectroscopia de Resonancia Magnética (ERM), Tomografía Computarizada por Emisión de Fotones Individuales (TCEFI) y Tomografía de Emisión de Positrones (TEP) y captura de imágenes óptica. Preferentemente, los restos de captura de imágenes son entidades no tóxicas, estables, que conservan sus propiedades en condiciones in vitro e in vivo. Los ejemplos de dichos restos incluyen pero sin limitación restos

5 radiactivos, por ejemplo isótopos radiactivos. Los átomos radiactivos adecuados incluyen tecnecio-99m o yodo-123 para estudios escintigráficos. Otros restos fácilmente detectables incluyen, por ejemplo, marcadores de espín para IRM tales como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, fluor-18, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro y restos ópticos que incluyen Cy5.5 y puntos cuánticos.

En una realización adicional de la presente invención un polipéptido se liga a un resto terapéuticamente activo, preferentemente el resto es citotóxico.

La expresión “resto terapéuticamente activo” abarca un resto que tiene propiedades beneficiosas, profilácticas y/o terapéuticas.

15 En una realización el resto terapéuticamente activo es un agente quimioterapéutico citotóxico. Se conocen bien en la técnica agentes quimioterapéuticos citotóxicos e incluyen agentes antineoplásicos tales como:

Agentes alquilantes incluyendo mostazas de nitrógeno tales como mecloretamina (HN2), ciclofosfamida, ifosfamida, melfalán (L-sarcolisina) y clorambucilo, 10 etileniminas y metilmelaminas tales como hexametilmelamina, tiotepa; alquil sulfonatos tales como busulfán; nitrosoureas tales como carmustina (BCNU), lomustina (CCNLJ), semustina (metil-CCN-U) y estreptozocina (estreptozotocina); y triacenos tales como decarbacina (DTIC; dimetiltriacenoimidazolcarboxamida); antimetabolitos incluyendo análogos de ácido fólico tales como metotrexato (ametopterina); análogos de pirimidina tales como fluorouracilo (5-fluorouracilo; 5-FU), 25 floxuridina (fluorodesoxiuridina; FUdR) y citarabina (arabinósido de citosina); y análogos de purina e inhibidores relacionados tales como mercaptopurina (6-mercaptopurina; 6-MP), tioguanina (6-tioguanina; TG) y pentostatina (2’-desoxicofonicina). Productos naturales incluyendo alcaloides de la vinca tales como vinblastina (VLB) y vincristina; epipodofilotoxinas tales como etopósido y tenipósido; antibióticos tales como dactinomicina (actinomicina D), daunorabicina (daunomicina; rubidomicina), doxorubicina, bleomicina, plicamicina (mitramicina) y mitomicina (mitomicina Q; enzimas tales como L-asparaginasa; y modificadores de la respuesta biológica tales como interferón alfenomas. Agentes misceláneos incluyendo complejos de coordinación de platino tales como cisplatino (cis-DDP) y carboplatino; antracenodiona tal como mitoxantrona y antraciclina; urea sustituida tal como hidroxiurea; derivado de metil hidracina tal como procarbacina (N-metilhidracina, MIH); y supresor adrenocortical tal como mitotano (o, p’-DDD) y aminoglutetimida; taxol y análogos/derivados; y agonistas/antagonistas de

35 hormonas tales como flutamida y tamoxifeno.

Se conocen bien en la técnica métodos para conjugar polipéptidos con agentes terapéuticos.

En una realización adicional de la presente invención un polipéptido se une a una partícula que contiene el agente terapéutico. Las partículas en este caso incluyen nanopartículas y vesículas basadas en lípidos tales como liposomas u otras estructuras similares compuestas de lípidos. En consecuencia, la presente invención proporciona los péptidos como se definen en el presente documento y un vehículo de liposoma y nanopartículas que comprenden los péptidos como se definen en el presente documento.

45 Los liposomas son vesículas esféricas que comprenden una bicapa fosfolipídica que puede usarse como agentes para suministrar materiales tales como fármacos o material genético. Los liposomas pueden estar compuestos de fosfolípidos derivados de forma natural con cadenas lipídicas mixtas (fosfatidiletanolamina de huevo) o de componentes puros como DOPE (dioleolilfosfatidiletanolamina). La síntesis y el uso de liposomas están ahora bien establecidos en la técnica. Los liposomas se crean en general por aplicación de ultrasonidos de fosfolípidos en un medio adecuado tal como agua. Las bajas tasas de cizallamiento crean liposomas multilamelares que tienen estructuras multicapa. Ultrasonidos de alto cizallamiento continuados tienden a formar liposomas unilamelares más pequeñas. La investigación también ha podido posibilitar liposomas para evitar la detección por el sistema inmunitario, por ejemplo por revestimiento de los liposomas con polietilenglicol (PEG). También es posible incorporar especies en liposomas, tales como los péptidos de la invención para ayudar a dirigirlos a un sitio de suministro, por

55 ejemplo en células o in vivo.

El uso de nanopartículas como agentes de suministro para materiales asociados o unidos a las nanopartículas se conoce en la técnica. Algunos tipos de nanopartículas comprenden un núcleo, con frecuencia de átomos metálicos y/o semiconductores, al que pueden ligarse ligandos de uno o más tipos de diferentes, incluyendo, por ejemplo, uno

o más de los péptidos de la presente invención, véase por ejemplo documentos WO02/32404, WO2005/10816 y WO2005/116226. Pueden formarse otros tipos de nanopartícula a partir de materiales tales como liposomas. En algunos casos, las nanopartículas pueden derivatizarse o conjugarse con otros ligandos que pueden estar presentes para proporcionar las nanopartículas con diferentes propiedades o funciones. En algunas realizaciones, las nanopartículas pueden ser puntos cuánticos, es decir, nanocristales de materiales semiconductores que tienen las

65 propiedades químicas y físicas sorprendentes que difieren notablemente de las del sólido a granel (véase Gleiter, Adv. Mater. 1992, 4, 474-481). Ahora que se entienden sus efectos de tamaño cuántico, se ha hecho cada vez más

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Ensayos de adhesión celular

Se ha descrito previamente adhesión de células marcadas con [51Cr] a placas flexibles de 96 pocillos recubiertas con ligandos de ECM (Thomas et al, 2001). Brevemente, las placas se recubrieron con LAP (0,25 µg/ml para NIH 3T3B6.19, 0,5 µg/ml para VB6) o vitronectina (10 µg/ml; BD Biosciences, Oxford, Reino Unido). Se permitió que las células se adhirieran durante 40 minutos (VB6, NIH 3T3 β6.19) o 60 minutos (V+B2) antes de lavarse la placa dos veces con PBS complementado con cationes (Mg2+ 0,5 mM, Ca2+ 1 mM). Las placas se cortaron con tijeras y la radiactividad de cada pocillo se cuantificó en Contador Gamma Automático Wizard 1470 (Perkin-Elmer, Boston, MA, Estados Unidos). Se calculó el porcentaje de adhesión comparando la radiactividad residual asociada con cada pocillo con la radiactividad del aporte inicial de la siguiente manera:

Radiactividad residual (cpm ) de pocillo

Adhesión (%) = x100

Radiactividad (cpm ) de aporte

Todas las muestras se ensayaron en pocillos por cuadruplicado en al menos tres ensayos separados.

ELISA de tipo sándwich competitivo

Se recubrieron placas de 96 pocillos (Immulon IB, Thermo LifeSciences) con P2W7 10 µg/ml en PBS a 4 ºC durante una noche, después se bloqueó por incubación con caseína 2 % (p/v) en PBS antes de lavar con PBS. Todos los lavados posteriores usaron Tampón de Lavado (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, MnCl2 1 mM), y todas las incubaciones posteriores tuvieron lugar en Tampón Conjugado (Caseína 1 %, Tris 20 mM, NaCl 150 mM, MnCl2 1 mM). Los pocillos se incubaron con rsαvβ6 durante una hora, se lavaron y se expusieron a una solución premezclada de péptido y fibronectina biotinilada 2 µg/ml. La fibronectina biotinilada unida se detectó con ExtrAvidina HRP (SIGMA) a una dilución de 1:1000, y se desarrolló usando el sistema TMB+ (DAKO). Los ensayos se cuantificaron por lectura de la absorbancia a A450 nm en un lector de placas Tecan GENios. Todos los datos se obtuvieron en el intervalo lineal, confirmado por una curva patrón de fibronectina biotinilada en cada placa.

Citometría de flujo

Se evaluó la expresión de integrinas por líneas celulares por citometría de flujo como se ha descrito previamente (Marshall et al, 1995). Brevemente, se incubaron suspensiones celulares con anticuerpos anti-integrina a 10 µg/ml o péptidos biotinilados a diversas concentraciones. Después de 45 min a 4 ºC, las células se lavaron y se detectó el péptido/anticuerpo unido por incubación de 30 min a anti-biotina de ratón (1:100, Stratech, Reino Unido) seguido de una incubación adicional durante 30 minutos con Alexafluor 488 conjugado con anti-IgG de ratón (dilución final 1:500; Molecular Probes) o estreptavidina-FITC (concentración final de 1:200) respectivamente. Las células se analizaron en un FACScan (Becton-Dickinson) equipado con software CellQuest que capturaba 10.000 acontecimientos por muestra.

Síntesis peptídica

Los péptidos fueron sintetizados usando síntesis peptídica en fase sólida convencional por el laboratorio de Síntesis de Péptidos del Reino Unido de Investigación de Cáncer. Brevemente, se obtuvieron aminoácidos protegidos y resinas Wang precargadas de Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, Reino Unido). Se obtuvieron disolventes y HBTU [2-hexafluorofosfato de (1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio] de Applied Biosystems (Warrington, Reino Unido). Los péptidos se sintetizaron en un Modelo 431A actualizado y Sintetizador de Fase Sólido de Applied Biosystems 433A en resina Wang precargada usando ciclos de supervisión de retroalimentación básicos y HBTU como un reactivo de acoplamiento. Se usó 9-fluorenilmetiloxicarbonilo para protección de grupos α-amino temporales y se retiró usando piperidina. Fueron grupos protectores de cadena lateral terc-butiloxicarbonilo para Lys; tritilo para His, Asn y Gln; 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo para Arg; terc-butiléster para Glu y Asp y tercbutiléter para Thr, Ser y Tyr.

Se consiguió escisión de la resina y desprotección de los péptidos mediante el tratamiento de la resina de peptidilo con 10 ml de una mezcla que contenía 9,25 ml de ácido trifluoroacético, 0,25 ml de etanoditiol, 0,25 ml de triisopropilsilano y 0,25 ml de agua a 20 ºC (temperatura ambiente) durante 4 horas. El péptido se precipitó usando dietiléter helado y el después se filtró en un embudo de filtro de vidrio sinterizado fino con vacío ligero. El precipitado de péptido se disolvió en solución de agua/ácido acético 10 % y se liofilizó.

Los péptidos en bruto se purificaron por HPLC de fase inversa en una columna Aquapore ODS de 20 micrómetros de 250 x 10 mm y se confirmó después la autenticidad del péptido purificado por espectroscopia de masas MALDI-TOF (ionización y desorción por láser asistida por matriz tiempo de vuelo) en un espectrómetro de masas de trampa iónica MAT LCQ Finningan. Algunos péptidos se biotinilaron in situ en soporte de resina usando procedimientos convencionales.

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Tabla 3. Estadística estructural para 35 grupos estructurales de péptidos A20FMDV-1, A20FMDV-2 y A20LAP.

A20FMDV-1 A20FMDV-2 A20LAP

Desviación de m.c. de cadena principal a través del grupo 0,65 0,59 0,63 sobre seis restos que incluye: DLXX(L/I)XX (Å) Contribuciones de energía (kcal mol -1) a a a 0,18 ± 0,05 0,25 ± 0,06 0,20 ± 0,04 ENOE 0,45 ± 0,06 0,91 ± 0,02 0,33 ± 0,04

Edihédrico

Tabla 4: Secuencia de aminoácidos de péptidos. Los D-aminoácidos se muestran en minúscula y se destacan en negrita. Todos los péptidos DBD1, DBD2 y Ran contienen un enlace disulfuro entre las dos cisteínas.

Serie

Nombre Secuencia Número de restos

7-12 unidades iniciales

DD1 RRGDLATIH 9

DD2

FTTGRRGDLATI 12

DD3

TGRRGDLATI 10

DD4

GRRGDLA 7

DD5

FTTGRRGDL 9

DD6

LRRGDRPSLRY 11

DD7

LRRGDRPSL 9

DD8

LRRGDRP 7

DD9

GGLRRGDRPSL 11

DD10

GGLRRGDRP 9

DD11

GLRRGDRPSL 10

DD12

RGDRPSL 7

DD13

GGFRRGDRPSL 11

DD14

GSIYDGYYVFPY 12

DD15

NAGRRGDLGSL 11

DD16

GRRGDLGSL 9

DD17

NAGRRGDLGS 10

DD18

NAGRRGDL 8

DD19

VPNLRGDLQVLA 12

Serie A20

A20FMDV1 YTASARGDLAHLTTTHARHL 20

A20LAP

GFTTGRRGDLATIHGMNRPF 20

A20FMDV2

NAVPNLRGDLQVLAQKVART 20

Serie p18-INK

P_FMDV2 VPNLRGDLQVLAQKVARTLP 20

P_18INK

SAAARGDLEQLTSLLQNNVN 20

P_FMDV2-INK

VPNLRGDLQVLTSLLQNNVN 20

P_INK-FMDV2

SAAARGDLEQLAQKVARTLP 20

P_INK-FMDV2-X

SAAARGDLEQLRQKVARTLP 20

P_INK-FMDV2-XX

SAAARGDLETLRQKVARTLP 20

Péptidos D-valina

A20DV12 NAVPNLRGDLQvLAQKVART 20

A20DV17

NAVPNLRGDLQVLAQKvART 20

A20DV1217

NAVPNLRGDLQvLAQKvART 20

Péptidos biotinilados

B-A20FMDV1 Biotina-εAhx-YTASARGDLAHLTTTHARHL 20

B-A20FMDV1-Ran

Biotina-εAhx-ARHALTYRTGATHLAHTDSL 20

B-A20LAP

Biotina-εAhx-GFTTGRRGDLATIHGMNRPF 20

B-A20LAP-Ran

Biotina-εAhx-PGRTFHRFGMGAITRTGNDL 20

B-A20FMDV2

Biotina-εAhx-NAVPNLRGDLQVLAQKVART 20

B-A20FMDV2-Ran

Biotina-εAhx-RQLNVDALNVAGVRALKPTQ 20

Cíclicos de 1ª generación

DBD1 eykCPNLRGDLQVLAQKVCRTK 22

B-DBD1

Biotin-εAhxeykCPNLRGDLQVLAQKVCRTK 22

B-Ran

Biotina-εAhxeykCKLVGALQPDNVLQRCRTK 22

Cíclicos de 2ª generación

DBD2 CYVPNLRGDLQVLAQKVAKC 20

B-DBD2

Biotina-εAhx-CYVPNLRGDLQVLAQKVAKC 20

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Claims (1)

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