ES2677844T3 - Péptidos para modular la actividad de linfocitos T y usos de los mismos - Google Patents

Péptidos para modular la actividad de linfocitos T y usos de los mismos Download PDF

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ES2677844T3 ES11835055.2T ES11835055T ES2677844T3 ES 2677844 T3 ES2677844 T3 ES 2677844T3 ES 11835055 T ES11835055 T ES 11835055T ES 2677844 T3 ES2677844 T3 ES 2677844T3
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Abstract

Un péptido que inhibe la unión de CD40 con CD154 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en un paciente, en donde dicho péptido tiene una longitud menor de 20 aminoácidos y comprende al menos una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8.

Description

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DESCRIPCION
Peptidos para modular la actividad de linfocitos T y usos de los mismos Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a peptidos que inhiben la interaccion de CD40 y CD154, as! como al uso de dichos compuestos para modular la actividad de linfocitos T y tratar enfermedades.
Antecedentes
La inflamacion se produce normalmente como respuesta a la infeccion de microorganismos invasores. Dicha respuesta inflamatoria es beneficiosa ya que es un elemento importante para que el sistema inmunitario localice el agente infeccioso para su eliminacion. Sin embargo, en caso de autoinmunidad no existe infeccion, a pesar del hecho de que este presente una grave inflamacion. La inflamacion en este caso, conocida como inflamacion cronica aseptica, es perjudicial dado que destruye los tejidos normales. Los resultados de dicha inflamacion aseptica alteran la vida y, en algunos casos, la ponen en peligro. Por otra parte, al igual que con la inflamacion aguda, este proceso esta mediado por celulas inmuniarias, incluyendo linfocitos T.
Una de las principales preocupaciones de la medicina moderna es como controlar la inflamacion aseptica cronica (ACI por sus siglas en ingles), como pueda ser la que tiene lugar durante las enfermedades autoinmunitarias, y como controlar la inflamacion aguda derivada de trauma. La inflamacion, tanto cronica como aguda, conlleva degeneracion tisular y perdida de la funcion de organos importantes con el tiempo. ACI no se limita a una sola enfermedad, sino que contribuye a numerosas enfermedades autoinmunitarias, entre las que se incluyen, pero sin limitarse a ellas, diabetes tipo 1, esclerosis multiple, lupus eritematoso sistemico, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, incluyendo los tipos de asma autoinmune, aterosclerosis, vasculitis, hipertension, tiroiditis incluyendo enfermedades de Hashimoto y Graves, cirrosis biliar primaria, enfermedad de Paget, enfermedad de Addison, slndrome de dificultad respiratoria aguda, lesion pulmonar aguda y ACI asociada a trasplante de organos.
Los trastornos autoinmunitarios se clasifican en dos tipos: especlficos de organo (dirigido principalmente a un organo) y no especlficos de organo (muy diseminado por todo el cuerpo). Entre los ejemplos de trastornos autoinmunitarios especlficos de organo se incluyen diabetes tipo 1 dependiente de insulina, que afecta al pancreas; tiroiditis de Hashimoto y enfermedad de Graves, que afectan a la glandula tiroides; anemia perniciosa, que afecta a la sangre; enfermedad de Addison, que afectan a las glandulas suprarrenales; hepatitis cronica activa, que afecta al hlgado; miastenia grave que afecta al musculo; y esclerosis multiple, que afecta al tejido del sistema nervioso. Un ejemplo de trastorno autoinmune no especlfico de un organo es la artritis reumatoide. Las enfermedades autoinmunitarias suelen ser cronicas, debilitantes y mortales. Los Institutos Nacionales de la Salud (NlH) estiman que hasta 23.500.000 personas en Norteamerica padecen una enfermedad autoinmunitaria con tendencia a aumentar. Se ha estimado que las enfermedades autoinmunitarias se encuentran entre las diez principales causas de mortalidad entre las mujeres de todos los grupos de edad hasta los 65 anos.
La inflamacion aguda, tal como se observa durante un traumatismo o septicemia, tambien esta mediada por celulas inmuniarias. Si bien aun no se han identificado todos los mediadores moleculares de este proceso, se ha relacionado solidamente un papel prominente de linfocitos T, macrofagos/monocitos, neutrofilos, etc. Por lo tanto, un medio para modular estos tipos de celulas controlarla necesariamente la respuesta inflamatoria.
Se ha demostrado que un subconjunto unico de linfocitos T contribuye al desarrollo de la enfermedad autoinmunitaria. Dichas celulas se caracterizan fenotlpicamente como CD41oCD40+ (Waid, D.M., G.M. Vaitaitis y J. Wagner, D.H. 2004. European Journal of Immunology 34: 1488; Vaitaitis, GM, M. Poulin, RJ Sanderson, K.J. Haskins, y D.H. Wagner Jr. 2003. Cutting Edge, J. Immunol. 170: 3455; Wagner, D.H., Jr., G. Vaitaitis, R. Sanderson, M. Poulin, C. Dobbs y K. Haskins. 2002. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 99: 3782; Wagner, D.H., Jr., E. Newell, R. Sanderson, J.H. Freed, y M.K. Newell. 1999. International Journal of Molecular Medicine 4: 231) y se conocen como linfocitos Th40. La expresion de CD40 esta asociada normalmente a celulas presentadoras de antlgeno y la mayor parte de la tecnica anterior describe que CD40 se expresa en linfocitos B, macrofagos, monocitos, etc. Sin embargo, las protelnas CD40 se expresan tambien en linfocitos T (Waid, D.M., G.M. Vaitaitis, y J. Wagner, D.H. 2004. European Journal of Immunology 34/1488; Vaitaitis, G.M., M. Poulin, RJ Sanderson, K.J. Haskins y D.H. Wagner Jr., 2003. Cutting Edge, J. Immunol. 170-3455; Wagner, D.H., Jr., G. Vaitaitis, R. Sanderson, M. Poulin, C. Dobbs y K. Haskins. 2002. Proc Natl Acad Sci EE.UU 99: 3782; Wagner, DH, Jr., E. Newell, R. Sanderson, J.H. Freed y M.K. Newell. 1999. International Journal of Molecular Medicine 4: 231; Bourgeois, C., B. Rocha y C. Tanchot. 2002. Science 297: 2060; Fanslow, WC, K.N. Clifford, M. Seaman, M.R. Alderson, M.K. Spriggs, R.J. Armitage y F. Ramsdell. 1994. Journal of Immunology 152: 4262; Ramsdell, F., M.S. Seaman, K.N. Clifford y W.C. Fanslow. 1994. Journal of Immunology 152: 2190; Grabstein, K.H., C.R. Maliszewski, K. Shanebeck, T.A. Sato, M.K. Spriggs, W.C. Fanslow y R.J. Armitage. 1993. Journal of Immunology 150: 3141; Armitage, R.J., C.R. Maliszewski, M.R. Alderson, K.H. Grabstein, M.K. Spriggs y W.C. Fanslow. 1993. Seminars in Immunology 5: 401; Cooper, C.J., G.L. Turk, M. Sun, A.G. Farr y P.J. Fink. 2004. J. Immunol 173: 6532). Mientras que los linfocitos Th40 comprenden una
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proporcion del compartimento periferico CD4+ en ratones no autoinmunes, no tratados previamente (Waid, D.M., G.M. Vaitaitis y J. Wagner, D.H. 2004. European Journal of Immunology 34: 1488; Wagner, D.H., Jr., E Newell, R. Sanderson, J.H. Freed y M.K. Newell. 1999. International Journal of Molecular Medicine 4: 231), y en seres humanos (Waid. D.M., R.J. Wagner, A. Putnam, G.M. Vaitaitis, N.D. Pennock, D.C. Calverley, P. Gottlieb, y D.H. Wagner, Jr. 2007. Clin Immunol 124: 138), dicha proporcion se expande drasticamente hasta un 50 % del compartimento CD4+ en ratones propensos a autoinmunidad (Waid, D.M., G.M. Vaitaitis y J. Wagner. 2004. European Journal of Immunology 34: 1488; Wagner, D.H., Jr., G. Vaitaitis, R. Sanderson, M. Poulin, C. Dobbs y K. Haskins, 2002. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 99: 3782; Wagner, D.H., Jr., E. Newell, R. Sanderson, J.H. Freed y M.K. Newell. 1999. International Journal of Molecular Medicine 4:231) y seres humanos (Waid. DM, R.J. Wagner, A. Putnam, G.M. Vaitaitis, ND Pennock, D.C Calverley, P. Gottlieb, y D.H. Wagner, Jr. 2007. Clin Immunol 124: 138). Estos linfocitos T no expresan marcadores de activacion temprana y se producen en el fenotipo indiferenciado de ratones no desafiados. En ratones NOD diabeticos, los linfocitos Th40 se producen en niveles exagerados en el bazo, los ganglios linfaticos y el pancreas, incluso antes del inicio de la diabetes (Waid, D.M., G.M. Vaitaitis y J. Wagner, D.H. 2004. European Journal of Immunology 34: 1488; Wagner, D.H., Jr., G. Vaitaitis, R. Sanderson, M. Poulin, C. Dobbs y K. Haskins, 2002. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 99: 3782). Se observa un numero y un porcentaje elevado de estos linfocitos T en la sangre periferica de pacientes con diabetes de tipo 1 cuando se compara con controles no autoinmunitarios y pacientes con diabetes de tipo 2 (Waid. D.M., R.J., Wagner, A. Putnam, G.M. Vaitaitis, N.D. Pennock, D.C. Calverley, P. Gottlieb y D.H. Wagner, Jr. 2007, Clin Inmmunol 12:138).
El aumento de linfocitos Th40 observado podrla significar que dichos linfocitos T son sensibles al antlgeno o que la expresion de CD40 es inducida por activacion. Asimismo, varios clones de linfocitos T diabetogenicos son CD40+ (Wagner, D.H., Jr., G. Vaitaitis, R. Sanderson, M. Poulin, C. Dobbs y K. Haskins, 2002. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 99: 3782). Los linfocitos Th40 primarios purificados de ratones NOD diabeticos y de ratones NOD pre-diabeticos (12 semanas de vida) transfieren con exito la diabetes de tipo 1 a receptores NOD.scid, lo cual demuestra directamente la patogenicidad de dicho subconjunto de linfocitos T (Waid, D.M., Vaitaitis G.M. y J. Wagner, D.H. 2004. European Journal of Immunology 34: 1488; Wagner, D.H., Jr., G. Vaitaitis, R. Sanderson, M. Poulin, C. Dobbs y K. Haskins. 2002. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 99: 3782). Se ha demostrado que los linfocitos Th40 se infiltran en las celulas beta de los islotes destruyendo la produccion de insulina, lo cual indica la especificidad del antlgeno de los islotes (Waid, D.M., G.M. Vaitaitis y J. Wagner, DH 2004. European Journal of Immunology 34: 1488; Wagner, D.H., Jr., G. Vaitaitis, R. Sanderson, M. Poulin, C. Dobbs y K. Haskins. 2002. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 99: 3782). Se ha demostrado asimismo que se requieren linfocitos Th40 para la transferencia de diabetes. Los linfocitos T perifericos (bazo y ganglio linfatico regional) con un empobrecimiento de CD40 y despues empobrecimiento de CD25, Treg, no fueron capaces de transferir diabetes a los receptores de Scid. A pesar de la eliminacion de Treg, si esta ausente el subconjunto autoagresivo linfocitos T CD40+, no tiene lugar la transferencia de la enfermedad.
Si bien los linfocitos Th40 son importantes en el desarrollo de autoinmunidad, otro factor importante es la expresion del Ligando CD40, CD154. El CD154 es inducido temporalmente en linfocitos T activados como respuesta a la estimulacion con CD3/TCR (Lederman, S., M. Yellin, A. Krichevsky, J. Belko, J. Lee y L. Chess. 1992. Journal of Experimental Medicine 175: 1091). La expresion de CD154 tambien se ha demostrado en plaquetas, monocitos, basofilos, eosinofilos, celulas dendrlticas, fibroblastos, musculo liso y celulas endoteliales (Russo, S., B. Bussolati, I. Deambrosis, F. Mariano y G. Camussi, 2003. J Immunol 171: 5489; Stumpf, C., C. Lehner, S. Eskafi, D. Raaz, A. Yilmaz, S. Ropers, A. Schmeisser, J. Ludwig, W.G. Daniel y C.D. Garlichs. 2003. Eur J Heart Fail 5: 629; Schonbeck, U., y P. Libby. 2001. Cell Mol Life Sci 58: 4). CD154 es un miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF) y se ha descrito una forma soluble de CD154 (sCD154) (Russo, S., B. Bussolati, I. Deambrosis, F. Mariano y G. Camussi 2003. J Immunol 171: 5489; Stumpf, C, C. Lehner, S. Eskafi, D. Raaz, A. Yilmaz, S. Ropers, A. Schmeisser, J. Ludwig, W.G. Daniel y C.D. Garlichs. 2003. Eur J Heart Fail 5: 629; Toubi, E. e Y. Shoenfeld. 2004 Autoimmunity 37: 457). Por lo tanto, sCD154 puede actuar como una citoquina (Stumpf, C., C. Lehner, S. Eskafi, D. Raaz, A. Yilmaz, S. Ropers, A. Schmeisser, J. Ludwig, W.G. Daniel, y C.D. Garlichs. 2003 Eur J Heart Fail 5: 629). Aunque CD154 no se ha relacionado geneticamente en estudios TID, sCD154 aparece significativamente elevado en TID y puede desempenar un papel en el proceso patologico (Varo, N., D. Vicent, P. Libby, R. Nuzzo, A.L. Calle-Pascual, M.R. Bernal, A. Fernandez-Cruz, A. Veves, P. Jarolim, J.J. Varo, A. Goldfine, E. Horton, y U. Schonbeck. 2003. Circulation 107: 2664; Cipollone, F., F. Chiarelli, G. Davi, C. Ferri, G. Desideri, M. Fazia, A. Lezzi,
F. Santilli, B. Pini, C. Cuccurullo, S. Tumini, A. Del Ponte, A. Santucci, F. Cuccurullo y A. Mezzetti. 2005. Diabetologia 48: 1216; Devaraj, S., N. Graser, S. Griffen, J. Wang- Polagruto, E. Miguelino, y I. Jialal. 2006. Diabetes 55: 774). Se ha establecido la importancia de la interaccion CD40 - CD154 en la autoinmunidad (Wagner, D.H., Jr.,
G. Vaitaitis, R. Sanderson, M. Poulin, C. Dobbs y K. Haskins. 2002. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 99: 3782; Kobata, T., M. Azuma, H. Yagita y K. Okumura. 2000. Rev. Immunogenet 2:74; Homann, D., A. Jahreis, T. Wolfe, A. Hughes, B. Coon, M.J. van Stipdonk, K.R. Prilliman, S.P. Schoenberger y M.G. von Herrath. 2002. Immunity 16: 403; Goodnow, C.C. 2001. Lancet 357: 2115; Balasa, B., T. Krahl, G. Patstone, J. Lee, R. Tisch, HO McDevitt, y N. Sarvetnick. 1997. Journal of Immunology 159: 4620). El bloqueo de la interaccion CD40-CD154 impide la artritis inducida por colageno (Durie, F.H., R.A. Fava, T.M. Foy, A. Aruffo, J.A. Ledbetter y R.J. Noelle. 1993. Science 281: 1328) encefalitis autoinmune experimental (Howard, L.M. y S.D. Miller. 2004. Autoimmunity37: 411), prostatitis (Grossman, M.E., E. Davila y E. Celis. 2001. J Immunother 24: 237) y, sobre todo, diabetes tipo 1 en el modelo de raton NOD (Balasa, B., T. Krahl, G. Patstone, J. Lee, R. Tisch, H.O. McDevitt y N. Sarvetnick, 1997. Journal of Immunology 159: 4620). En el modelo de diabetes, fue esencial administrar un anticuerpo para bloquear CD154 a ratones NOD a las 3 semanas de vida; a las 9 semanas, los anticuerpos bloqueadores no tuvieron efecto sobre la prevencion de la diabetes
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(Balasa, B., T. Krahl, G. Patstone, J. Lee, R. Tisch, H.O. McDevitt y N. Sarvetnick, 1997. Journal of Immunology 159: 4620).
El trabajo anterior ha demostrado asimismo que el subconjunto de linfocitos Th40 induce la transcripcion, traduccion y translocacion nuclear de RAG1 y RAG2, (Vaitaitis, G.M., M. Poulin, R.J. Sanderson, K.J. Haskins y D.H. Wagner Jr. 2003. Cutting Edge, J. Immunol. 170: 3455) cuando CD40 esta activado. La activacion de CD3 no induce RAG1 o RAG2 en linfocitos T (Vaitaitis, G.M., M. Poulin, R.J. Sanderson, K.J. Haskins y D.H. Wagner Jr., 2003. Cutting Edge, J. Immunol. 170:3455). Tras la induccion de RAG1/RAG2, tiene lugar una revision de TCR mediada por CD40 en los linfocitos T perifericos (Vaitaitis, G.M., M. Poulin, R.J. Sanderson, K.J. Haskin y D.H. Wagner Jr. 2003. Cutting Edge, J. Immunol. 170:3455). La induccion de CD40 de la revision del TCR depende de RAG. Los linfocitos T aislados de un raton TCR-Tg experimentan revision de TCR cuando CD40 esta activado, pero los linfocitos T del raton TCR- Tg.RAG-/- no revisan el TCR cuando CD40 esta activado (Wagner, D.H., Jr., E. Newell, R. Sanderson, J.H. Freed y M.K. Newell. 1999. International Journal of Molecular Medicine 4:231).
Se han propuesto multiples opciones de tratamiento para abordar y controlar tanto la inflamacion cronica como la aguda. Muchos enfoques emplean medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) que atacan a la produccion de leucotrienos y prostaglandinas, productos celulares que causan inflamacion localizada. Otros enfoques utilizan farmacos inmunosupresores mas potentes, como ciclofosfamida, metotrexato y azatioprina, que suprimen la respuesta inmune y detienen la progresion de la enfermedad. Otros tratamientos mas implican el uso de anticuerpos monoclonales disenados para alterar las respuestas inmunes a los propios tejidos, tal como ocurre durante las enfermedades autoinmunes. Sin embargo, todos estos tratamientos suelen tener efectos secundarios graves a largo plazo.
Por lo tanto, existe la necesidad en la tecnica de contar con metodos mas seguros y eficaces para el tratamiento y la prevencion de enfermedades autoinmunes. La presente divulgacion aborda esta necesidad mediante la description de un nuevo metodo para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.
Sumario
En un primer aspecto, la presente invention proporciona un peptido que inhibe la union de CD40 a CD154 para su uso en un metodo de tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en un paciente, teniendo dicho peptido una longitud menor de 20 aminoacidos y comprendiendo al menos una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8.
En ciertas realizaciones, la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en diabetes, esclerosis multiple, artritis reumatoide, lupus (SLE), EPOC y slndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA).
En otras realizaciones, el peptido tiene una longitud de 6 a 15 aminoacidos y comprende una secuencia nucleo que consiste en SEQ ID NO: 3. En ciertas realizaciones, el peptido tiene una longitud de 6, 13 o 15 aminoacidos.
En algunas realizaciones, el peptido es SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8.
En algunas realizaciones, el peptido se une a una protelna CD40 con una Kd mayor que 106.
En otras realizaciones, el peptido inhibe la interaction de CD40 con CD154 de tal manera que impide la expansion de linfocitos Th40.
En otras realizaciones mas, el peptido inhibe la interaccion de CD40 con CD154 de tal manera que reduce el numero de linfocitos Th40.
En otras realizaciones mas aun, el peptido inhibe la interaccion de CD40 con CD154 de tal manera que altera el perfil de expresion de citoquina de una poblacion de celulas tratadas con dicho peptido.
En un segundo aspecto, la presente invencion proporciona un metodo in vitro para inhibir la interaccion entre una protelna CD40 y una protelna CD154 que comprende poner en contacto dicha protelna CD40 con un peptido del primer aspecto que se une a dicha protelna CD40 en el sitio de union a CD154, inhibiendo de este modo la interaccion de dichas protelnas CD40 y CD154.
Asimismo, en el presente documento se describe un nuevo metodo para modular la inflamacion y, en particular, la inflamacion que se produce como resultado de una enfermedad autoinmunitaria. Dicho metodo se basa en el conocimiento de que la interaccion entre el ligando de CD40 (protelna CD154) y la protelna CD40 expresada en linfocitos T (linfocitos Th40) es importante en el desarrollo de la enfermedad autoinmunitaria, as! como en la aclaracion de los restos crlticos en CD40 y CD154 que son importantes para dicha interaccion. La presente divulgacion se refiere al bloqueo de la interaccion entre una protelna CD40 y una protelna CD154 mediante el uso de peptidos pequenos que interactuan con la protelna CD40 en un sitio en el que se unirla normalmente la protelna
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CD154. Se describe asimismo el uso de dichos peptidos para reducir el nivel de linfocitos Th40, reduciendo as! la gravedad de la enfermedad, as! como nuevos metodos para detectar linfocitos Th40.
En el presente documento se describe un peptido que interactua con una protelna CD40 de tal manera que modula la inflamacion. Los peptidos preferentes son aquellos que tienen una longitud menor de 25 aminoacidos y que se unen a una protelna CD40, inhibiendo as! su interaccion con una protelna CD154. Los peptidos preferentes son aquellos que comprenden una porcion del sitio de union a CD40 de una protelna CD154.
Asimismo, en el presente documento se describe un metodo para inhibir la interaccion entre una protelna CD40 y una protelna CD154, comprendiendo dicho metodo poner en contacto la protelna CD40 con un peptido que interactua con la protelna CD40. Los peptidos preferentes interactuan con la protelna CD40 en el sitio de union a CD154. Preferentemente, dichos peptidos tienen una longitud menor de 20 aminoacidos. Son incluso mas preferentes los peptidos que consisten en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 3-10.
Asimismo, en el presente documento se describe un metodo para modular la inflamacion en un animal o un cultivo de celulas, comprendiendo dicho metodo administrar a dicho animal, o a dichas celulas, un peptido que interactua con una protelna CD40 de tal manera que modula la inflamacion. Los peptidos preferentes son aquellos que interactuan con la protelna CD40 en el sitio de union a CD154, modulando as! la inflamacion. Los peptidos preferentes modulan la inflamacion reduciendo el nivel de linfocitos Th40 a no mas del 25 % de la poblacion total de linfocitos T. Dichos metodos pueden utilizarse para tratar enfermedades autoinmunitarias como la diabetes.
En el presente documento se describe un medio para detectar linfocitos T auto-agresivos, comprendiendo dicho metodo poner en contacto de una poblacion de linfocitos T con un peptido que se une a la protelna CD40 y la deteccion del peptido unido a CD-40.
Asimismo, en el presente documento se describe un metodo para identificar a un paciente en riesgo de desarrollar una enfermedad autoinmunitaria, comprendiendo dicho metodo la obtencion de una muestra que contiene linfocitos T de un paciente para su ensayo, la puesta en contacto de la muestra con un peptido que se une a la protelna CD40, la deteccion del peptido unido a CD-40 y la determinacion del nivel de linfocitos Th40 a partir de la cantidad de CD40 unido, en el que un nivel de linfocitos Th40 superior al 25 % de la poblacion total de linfocitos T indica que el paciente esta en riesgo de desarrollar una enfermedad autoinmunitaria.
Breve descripcion de las figuras
Fig. 1 Efecto de diversos peptidos de CD154 en el desarrollo de diabetes en ratones NOD
Fig. 2 Efecto de un peptido de 15 meros de CD154 en la relacion con CD4/CD8 en ratones NOD
Fig. 3 Reversion de la diabetes en ratones NOD utilizando un peptido de 15 meros de CD154
Fig. 4 Deteccion de linfocitos Th40 usando un peptido de 15 meros de CD154
Fig. 5 Exploracion de linfocitos B mediante el uso de un peptido de 15 meros de CD154
Fig. 6 Comparacion de los niveles de linfocitos Th40 en ratones diabeticos y no diabeticos
Fig. 7. Efecto del tratamiento con el peptido de 15 meros sobre la granulacion de insulina del pancreas
Fig. 8. Efecto de mutaciones en el peptido de 15 meros sobre la capacidad del peptido de 15 meros para inhibir
el desarrollo de diabetes en ratones NOD.
Descripcion detallada
La presente invencion se basa en el descubrimiento de que un subconjunto unico de linfocitos T, que expresan protelna CD40 y, por lo tanto, se hace referencia a ellos como linfocitos Th40, contribuye a la inflamacion autoinmune. Por otra parte, la implicacion de los linfocitos Th40 en el proceso autoinmune depende de la interaccion entre la protelna CD40 expresada en la superficie del linfocito T y la protelna CD154. La interaccion entre CD40 y CD154 tiene como resultado la entrega de senales de activacion entre las celulas y la posterior activacion del linfocito Th40. Dicha activacion tiene como resultado la propagacion del linfocito Th40 y un aumento de la inflamacion (por ejemplo, un aumento en el numero de celulas inmunitarias y moleculas inmuno-reguladoras, presentes en el sistema). En consecuencia, la inhibicion de la interaccion CD40/CD154 puede modular la actividad de los linfocitos Th40 y, en virtud de ello, afectar a la inflamacion. En el presente documento se divulgan peptidos que modifican la interaccion entre una protelna CD40 y una protelna CD154, modulando as! la inflamacion. En particular, la presente invencion se refiere a peptidos que modifican la interaccion entre la protelna CD40 expresada en la superficie de un linfocito T y una protelna CD154, modificando as! la actividad de linfocitos T y modulando la inflamacion para tratar enfermedades autoinmunes. Asimismo, en el presente documento, se divulga el uso de tales peptidos para detectar linfocitos Th40.
Antes de describir mejor la presente invencion, debe entenderse que la invencion no se limita de forma estricta a las realizaciones descritas en particular, ya que, naturalmente, pueden variar. Asimismo, ha de entenderse que la terminologla utilizada en el presente documento tiene como unico fin describir realizaciones particulares sin pretender limitarla, ya que el alcance de la presente invencion quedara limitado unicamente por las reivindicaciones.
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Debe senalarse que, tal como se utilizan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno(a)" y "el/la", incluyen las referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Debe entenderse asimismo que, tal como se utiliza en el presente documento, el termino "una" entidad se refiere a una o mas de dichas entidades. Por ejemplo, una molecula de acido nucleico se refiere a una o mas moleculas de acido nucleico. Siendo asl, los terminos y expresiones "un", "uno(a)", "uno(a) o mas" y "al menos uno(a)" pueden utilizarse indistintamente. De forma similar, las expresiones "que comprende", "que incluye" y "que tiene", pueden emplearse indistintamente.
A menos que se definan de otra forma, todos los terminos tecnicos y cientlficos empleados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden habitualmente las personas especializadas en la materia en la que se encuadra la presente invencion. Si bien, en la puesta en practica y en los ensayos de la presente invencion, es posible utilizar cualquier metodo o material similar o equivalente de los descritos en el presente documento, se describen a continuacion, los metodos y materiales preferentes. Todas las publicaciones mencionadas en el presente documento divulgan y describen los metodos y/o materiales en conexion con los cuales se citan las publicaciones. Las publicaciones tratadas en el presente documento se proporcionan unicamente por su divulgacion antes de la fecha de presentacion de la presente solicitud. En el presente documento, no debe interpretarse nada como una admision de que la presente invencion no tiene derecho a antedatar dicha publicacion en virtud de la invencion anterior. Asimismo, las fechas de publicacion proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicacion reales, lo cual es posible que tenga que ser confirmado independientemente.
Se podra apreciar que tambien se puede proporcionar ciertas caracterlsticas, que se describen dentro del contexto de realizaciones por separado, para mayor claridad, en combinacion en una unica realizacion. Por el contrario, varias caracterlsticas de la invencion descritas en el contexto de una unica realizacion, para mayor brevedad, tambien pueden proporcionarse por separado o en cualquier sub-combinacion adecuada. Todas las combinaciones de las realizaciones quedan especlficamente abarcadas en la presente divulgacion y se divulgan en el presente documento como si todas y cada una de dichas combinaciones se divulgara individual y expllcitamente en el presente documento. Asimismo, todas las sub-combinaciones quedan tambien abarcadas especlficamente y se divulgan en el presente documento como si todas y cada una de dichas sub-combinaciones se divulgaran individual y expllcitamente en el presente documento.
Asimismo, tal como se utiliza en el presente documento, el termino animal se refiere a un vertebrado, preferentemente un mamlfero, mas preferentemente un ser humano. Entre los mamlferos adecuados en los que se aplican los metodos de la presente divulgacion se incluyen, pero sin limitarse a ellos, animales de granja, animales de competicion, mascotas, primates, ratones, ratas, caballos, perros, gatos y seres humanos. Pueden utilizarse indistintamente los terminos animal, sujeto o paciente.
En el presente documento se divulga un peptido que interactua con una protelna CD40 de tal manera que modula la inflamacion. Tal como se utiliza en el presente documento, los terminos interactuar, interaccion y similares significan que dos moleculas alcanzan una proximidad flsica suficiente como para provocar una modulacion de la inflamacion. Un tipo de interaccion es una interaccion de union. En dicha interaccion, el peptido se asocia con CD40 para formar un complejo. Un ejemplo de formacion de complejo es la asociacion de un antlgeno con un anticuerpo. La union de un peptido con una protelna CD40 puede ser reversible (por ejemplo, interacciones de union no covalente) o no reversible (por ejemplo, interacciones de union covalente). Por otra parte, una interaccion reversible puede ser fuerte o debil, determinandose la fuerza de la interaccion por las fuerzas (p. ej., cargas ionicas, union de hidrogeno, interacciones de van der Walls, etc.) ejercidas por cada protelna sobre la otra protelna en el complejo. Los factores que afectan a la fuerza de una interaccion entre dos moleculas son conocidas entre las personas especializadas en la materia. Una medida util de la fuerza de union entre dos moleculas, como pueda ser un peptido y una protelna, es la constante de disociacion (Kd). Los peptidos preferentes divulgados en el presente documento son aquellos que se unen a una protelna CD40 con una Kd de no mas de aproximadamente 1 x 10-6 M, aproximadamente 1 x 10 -7 M o aproximadamente 1 x 8 M. Los peptidos particularmente preferentes son aquellos que tienen una Kd de menos de aproximadamente 1 x 10 -9 M. En una realizacion, un peptido se une a una protelna CD40 con una Kd de menos de 100 nM, de menos de 50 nM, de menos de 25 nM, de menos de 10 nM, de menos de 5 nM, de menos de 3 nM, de menos de 2 nM o de menos de 1 nM. Los metodos para medir y analizar interacciones de union entre un peptido y una protelna CD40 son conocidos entre las personas especializadas en la materia.
Tal como se utiliza en el presente documento, modular la inflamacion significa cambiar el nivel de linfocitos Th40 presente en un animal, o en un cultivo de linfocitos T. Tal como se utilizan en el presente documento, los terminos nivel, numero, recuento y concentracion pueden emplearse indistintamente. La modulacion de la inflamacion puede significar un aumento o una disminucion en el numero de linfocitos Th40 presente en el entorno inflamatorio. En consecuencia, es posible hacer referencia a la modulacion como positiva o negativa. La modulacion positiva (tambien conocida como regulacion al alza) de la inflamacion, se refiere a un aumento del numero de linfocitos Th40 en el entorno inflamatorio. La modulacion negativa (tambien conocida como regulacion a la baja) de la inflamacion se refiere a una reduccion en el numero de linfocitos Th40 presentes en el entorno inflamatorio. Un peptido preferente es aquel que regula a la baja la inflamacion, reduciendo asl el numero de linfocitos Th40 presentes en el
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entorno inflamatorio. La modulacion positiva y negativa de la inflamacion puede derivar o no en un cambio del tipo y la cantidad de moleculas inmuno-reguladoras presentes en el entorno inflamatorio.
Las personas especializadas en la materia apreciaran que tanto un sistema de cultivo de celulas como el sistema inmunitario de un animal comprenden niveles basales de celulas inmunitarias y moleculas inmuno-reguladoras. Las expresiones nivel basal y nivel normal pueden emplearse indistintamente. Con respecto al sistema inmunitario de un animal, tal como se utiliza en el presente documento, el nivel basal de un tipo de celula inmunitaria (por ejemplo, linfocito Th40) o una molecula inmuno-reguladora, se refiere al numero promedio de ese tipo de celula, o molecula inmuno-reguladora, presente en una poblacion de individuos considerados sanos (es decir, sin enfermedad metabolica, autoinmune ni infecciosa). Con respecto a un sistema de cultivo celular, tal como se utiliza en el presente documento, el nivel basal de un tipo de celula inmunitaria, o una molecula inmuno-reguladora, se refiere al nivel promedio de ese tipo de celula, o molecula inmuno-reguladora, presente en una poblacion de celulas que no esta activada. Las personas especializadas en la materia podran determinar si se activa un linfocito T o una poblacion de dichas celulas. Por ejemplo, la expresion de las protelnas CD69, CD25 y/o CD154 mediante una celula indica que la celula ha sido activada.
El nivel basal de una celula o molecula puede ser una cantidad especlfica (p. ej., una concentracion) o puede abarcar un intervalo de cantidades. Los niveles basales, o intervalos, de celulas inmuniarias y moleculas inmuno- reguladoras son conocidos entre las personas especializadas en la materia. Por ejemplo, en un individuo sano, el nivel normal de linfocitos T CD4+ presentes en la sangre humana es de 500-1500 celulas/ml. La variabilidad de esta medicion puede derivarse de las diferencias en el metodo utilizado para determinar el recuento de celulas. Asimismo, es posible registrar tambien los niveles normales de celulas como un porcentaje de una poblacion total de celulas. Por ejemplo, en un individuo sano, los linfocitos Th40 constituyen menos del 25 % de la poblacion total de linfocitos T. Por lo tanto, tal como se emplea en el presente documento, el termino inflamacion se refiere a un entorno inflamatorio en el que los linfocitos Th40 constituyen mas de aproximadamente 25 %, mas de aproximadamente 30 %, mas de aproximadamente 35 %, mas de aproximadamente 40 %, mas de
aproximadamente 45 %, mas de aproximadamente 50 %, mas de aproximadamente 55 %, mas de
aproximadamente 60 %, mas de aproximadamente 65 %, mas de aproximadamente 70 %, mas de
aproximadamente 75 % o mas de aproximadamente 80 % de la poblacion total de linfocitos T. Por otra parte, un peptido preferente es aquel que reduce el nivel de linfocitos Th40 a menos de aproximadamente 50 %, menos de aproximadamente 45 %, menos de aproximadamente 40 %, menos de aproximadamente 35 %, menos de aproximadamente 30 %, menos de aproximadamente el 27 %, o igual a aproximadamente el 25 % de la poblacion total de linfocitos T. Los metodos para medir diferentes tipos de linfocitos T en la poblacion de linfocitos T son conocidos entre las personas especializadas en la materia. Asimismo, en el presente documento se divulga un nuevo metodo para detectar linfocitos Th40 utilizando los peptidos de la presente divulgacion.
Tal como se emplea en el presente documento, la expresion entorno inflamatorio se refiere a la poblacion celulas inmuniarias global y moleculas inmuno-reguladoras relacionadas, que estan presentes en un cultivo de celulas, o en el cuerpo de un animal. Siendo asl, la expresion entorno inflamatorio abarca los tipos, y/o las cantidades relativas de celulas inmuniarias y moleculas inmuno-reguladoras (por ejemplo, citoquinas) presentes en un cultivo de celulas, o en un animal, que participan en la modificacion de una reaccion inflamatoria. Entre los ejemplos de celulas que abarca dicha expresion entorno inflamatorio se incluyen, sin limitacion, linfocitos T, neutrofilos, macrofagos, granulocitos y similares. El entorno inflamatorio se refiere a las celulas y moleculas que median la inflamacion tanto aguda como cronica. Las personas especializadas en la materia apreciaran que el entorno inflamatorio hace referencia al sistema al que se administran los peptidos de la divulgacion. En una realizacion, el sistema es un sistema de cultivo celular. En una realizacion, el sistema es un animal completo.
Un peptido preferente es aquel que interactua selectivamente con una protelna CD40 en solucion, segun se determina aplicando un ensayo, como por ejemplo un ensayo inmunoabsorbente, o sobre la superficie de un linfocito T. Tal como se emplea en el presente documento, los terminos selectivamente, selectivo, especlfico y similares indican que el peptido tiene una afinidad mayor para una protelna CD40 que para las protelnas no relacionadas con la protelna CD40. Mas especlficamente, los terminos selectivamente, selectivo, especlfico y similares indican que la afinidad del peptido por CD40 es estadlstica y significativamente mayor que su afinidad para un control negativo (por ejemplo, una protelna no relacionada como albumina) medida aplicando un ensayo convencional (p.ej., ELISA). Las tecnicas adecuadas para someter a ensayo la capacidad de un peptido de interactuar selectivamente con una protelna CD40 son conocidas entre las personas especializadas en la materia. Dichos ensayos pueden ser ensayos in vitro o in vivo. Entre los ejemplos de ensayos utiles se incluyen, pero sin limitarse a ellos, inmunoensayo ligado a enzimas, inmunoensayo ligado a enzimas competitivo, radioinmunoensayo, inmunoensayo de fluorescencia, ensayo de quimioluminiscencia, ensayo de flujo lateral, ensayo de flujo continuo, ensayo de aglutinacion, un ensayo de partlculas (p. ej., mediante el uso de partlculas como, por ejemplo, pero sin limitarse a ellas, partlculas magneticas o pollmeros plasticos, como perlas de latex o poliestireno), ensayo de inmunoprecipitacion, ensayo de inmunotransferencia (p.ej., transferencia de Western), ensayo de fosforescencia, ensayo de flujo continuo, ensayo de cromatografla, ensayo basado en electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), ensayo de resonancia de plasmon superficial, ensayo espectrofotometrico, ensayo de partlculas, ensayo sensorial electronico y ensayo de citometrla de flujo. Los metodos para realizar dicho ensayos son perfectamente conocidos entre las personas especializadas en la materia. En una realizacion, puede realizarse un ensayo usando celulas en cultivo, o puede
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realizarse en un animal completo. Los ensayos pueden disenarse para proporcionar resultados cualitativos, cuantitativos o semicuantitativos, dependiendo de como se utilicen y del tipo de resultado deseado.
En el presente documento, se divulgan peptidos que interactuan con una protefna CD40 como para modificar la interaction de la protefna CD40 con una protefna CD154, modulando asf la inflamacion. El efecto del peptido en la interaction CD40/CD154 puede ser positivo o puede ser negativo. Por ejemplo, el peptido puede interactuar con la protefna CD40 de tal manera que aumente la fuerza de la interaccion entre la protefna CD40 y una protefna CD154. Alternativamente, el peptido puede interactuar con la protefna CD40 de manera que disminuye la fuerza de la interaccion entre la protefna CD40 y una protefna CD154. Los metodos para medir la fuerza de union entre el peptido y una protefna CD40 son conocidos entre las personas especializadas en la materia. Un peptido preferente de la presente invention es aquel que reduce la fuerza de la interaccion entre una protefna CD40 y una protefna CD154. Los peptidos preferentes de la presente invencion reducen la fuerza de union entre una protefna CD40 y una protefna CD154 en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 95 %. Un peptido particularmente preferente es aquel que inhibe completamente la union de CD40 a CD154. La inhibicion completa de la union entre CD40 y CD154 significa que, cuando se aproxima un peptido de la presente invencion a una protefna CD40 y una protefna CD154 en condiciones que normalmente permitirfan la interaccion entre CD40 y CD154, no se produce dicha interaccion ni se estimulan las senales de activation en la celula que expresa CD40. En consecuencia, no tiene lugar la modulation de la inflamacion mediada por CD40/CD154. En una realization, el peptido interactua con la protefna CD40 de tal manera que reduce el nivel de inflamacion en el sistema. En una realizacion, el peptido interactua con la protefna CD40 de tal manera que inhibe el desarrollo de inflamacion en el sistema.
Si bien los peptidos de la presente invencion pueden interactuar con cualquier sitio en la protefna CD40, los peptidos preferentes de la presente invencion interactuan con la protefna CD40 en un emplazamiento que se solapa con el sitio de union a CD154. En una realizacion, un peptido de la presente invencion interactua con la protefna CD40 en el sitio de union a CD514. Un ejemplo de dicho peptido es un antagonista competitivo del ligando CD40. Tal como se emplea en el presente documento, los peptidos que interfieren con la union de una protefna CD154 a una protefna CD40, o que la inhiben, se conocen como peptidos interferentes pequenos (SIP). Tal como se emplea en el presente documento, un peptido interferente pequeno es un peptido que, a traves de propiedades fisio-qufmicas, interfiere con la interaccion entre una protefna cD40 y una protefna CD154, impidiendo asf la entrega de las senales de activacion a la celula portadora de CD40, limitando de este modo la activacion de la celula portadora de CD40 y, en consecuencia, la inflamacion. Tal como se ha demostrado en el presente documento, las consecuencias de dicha interferencia son la prevention de la activacion y propagation de linfocitos T, asf como la prevention o reduction de la inflamacion.
Un peptido util para poner en practica los metodos divulgados en el presente documento deberfa ser de un tamano suficiente para interactuar con la protefna CD40 como para modular la inflamacion. Las personas especializadas en la materia deduciran que, preferentemente, los peptidos son cortos, ya que son mas faciles y menos caros de producir. Los peptidos preferentes son aquellos que tienen una longitud menor de 20 aminoacidos. Un peptido preferente es aquel que tiene una longitud de 6, 13 o 15 aminoacidos. En una realizacion, el peptido consiste en un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. A continuation, se muestran en la Tabla 1 las secuencias de dichos peptidos.
Tabla 1
SEQ ID NO 1
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SECUENCIA________
MIETYSQPSP
FLITQMIGSV
EDFVFIKKLK
FEDLVKDITL
IAAHWSEAN
LVMLENGKQL
EPSSQRPFIV
HSSSQLCEQQ
_________TEASOVIHRV
MIETYNQTSP
FLITQMIGSA
EDFVFMKTIQ
FEGFVKDIML
QIAAHVISEA
NLVTLENGKQ
REASSQAPFI
THSSAKPCGQ
________VTDPSQVSHG
KGYY_____________
KKGYYT___________
AKKGYYTM_________
AEKGYYTM
RSVATGLPAS
LFAVYLHRRL
RCNKGEGSLS
NKEEKKENSF
SNAASVLQWA
TVKREGLYYV
GLWLKPSSGS
SVHLGGVFEL
GFSSFGLLKL
RSAATGLPIS
LFAVYLHRRL
RCNTGERSLS
NKEETKKENS
SSKTTSVLQW
LTVKRQGLYY
ASLCLKSPGR
QSIHLGGVFE
TGFTSFGLLK
MKIFMYLLTV
DKVEEEVNLH
LLNCEEMRRQ
EMQRGDEDPQ
KKGYYTMKSN
YTQVTFCSNR
ERILLKAANT
QAGASVFVNV
MKIFMYLLTV
DKIEDERNLH
LLNCEEIKSQ
FEMQKGDQNP
AEKGYYTMSN
IYAQVTFCSN
FERILLRAAN
LQPGASVFVN
L
Description______
SwissPro 27548.2 Ligando CD40 raton (Protefna CD154)
SwissPro 29965 Ligando CD40 humano (Protefna CD154)
Secuencia nucleo
6 meros__________
8 meros, raton_____
8 meros, ser humano
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VLQWAKKGYYTMKSK 15 meros, raton
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VLQWAEKGYYTMSNN 15 meros, ser humano
9
NAASVLQWAKKGYYTMKSNLVMLE 24 meros
10
ISQAVHAAHAEINEAGR 15 meros de ovoalbumina; peptido de control
11
G-L-Q-W-A-K-K-G-Y-T-M-K-S-N Gly-1
12
V-G-Q-W-A-K-K-G-Y-Y-T-M-K-S-N Gly-2
13
V-L-G-W-A-K-K-G-Y-Y-T-M-K-S-N Gly-3
14
V-L-Q-G-A-K-K-G-Y-Y-T-M-K-S-N Gly-4
15
V-L-Q-W-G-K-K-G-Y-Y-T-M-K-S-N Gly-5
16
V-L-Q-W-A-G-K-G-Y-Y-T-M-K-S-N Gly-6
17
V-L-Q-W-A-K-G-G-Y-Y-T-M-K-S-N Gly-7
18
V-L-Q-W-A-K-K-G-G-Y-T-M-K-S-N Gly-8
19
V-L-Q-W-A-K-K-G-Y-G-T-M-K-S-N Gly-9
20
V-L-Q-W-A-K-K-G-Y-Y-G-M-K-S-N Gly-10
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V-L-Q-W-A-K-K-G-Y-Y-T-G-K-S-N Gly-11
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ISQAVHAAHAEINEAGR 15 meros de ovoalbumina; peptido de control
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YVQGKANLKSKLMYT Peptido desordenado
Se ha demostrado que la interaccion de una protelna CD40 y de una protelna CD154, tiene lugar en regiones concretas dentro de cada protelna. Los autores de la invention han demostrado ahora que, sorprendentemente, un peptido que comprende unicamente una portion corta de la region CD154 que interactua con CD40, es capaz de unirse a una protelna CD40, modulando as! la inflamacion. Por lo tanto, una realization de la presente divulgation es un peptido que comprende al menos una porcion de la secuencia de aminoacidos de una protelna CD154 de manera que el peptido interactua con la protelna CD40 como para modular la inflamacion. En una realizacion, la interaccion del peptido con la protelna CD40 tiene como resultado la modulation negativa de la inflamacion. En un aspecto, el peptido comprende al menos una porcion de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En un aspecto preferente, el peptido es lo mas corto posible, pero comprende suficiente protelna CD154 para permitir la interaccion con una protelna CD40 como para modular la inflamacion. En una realizacion, un peptido de la presente divulgacion comprende 6, 13 o 15 aminoacidos contiguos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, e interactua con CD40 de tal manera que modula la inflamacion. Un peptido preferente comprende una secuencia nucleo que consiste en lisina- glicina-tirosina-tirosina (KGYY, SEQ ID NO: 3), que corresponde a los aminoacidos 142-145 de la SEQ ID NO: 1 y aminoacidos 143-146 de la SEQ ID NO: 2. Los peptidos utiles pueden comprender regiones adicionales de secuencia de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 que son adyacentes a la secuencia nucleo, siempre y cuando el peptido sea capaz de modular la inflamacion. En una realizacion de la divulgacion, un peptido comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SeQ ID NO: 8, SEQID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, siempre y cuando el peptido interactue con la protelna CD40 como para modificar la inflamacion. En una realizacion, un peptido consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.
Si bien los peptidos de la divulgacion pueden consistir completamente en secuencias que son responsables de la interaccion del peptido con una protelna CD40, pueden contener adicionalmente secuencias de aminoacidos que no interactuan con una protelna cD40, pero que tienen otras funciones utiles. A la secuencia que interactua con CD40 se la puede anadir cualquier secuencia de aminoacidos adicional util, siempre y cuando las secuencias adicionales no tengan un efecto indeseado sobre la capacidad de la secuencia que interactua con CD40 para interactuar con una protelna CD40. Por ejemplo, ademas de la secuencia de aminoacidos responsable de la interaccion con una protelna CD40, un peptido puede contener secuencias de aminoacidos que son utiles para visualizar o purificar el peptido. Dichas secuencias actuan como marcadores (p. ej., enzimas) o etiquetas (sitios de union de anticuerpos). Entre los ejemplos de dichos marcadores y etiquetas se incluyen, pero sin limitarse solo a ellos, B- galactosidasa, luciferasa, glutation-s-transferasa, tiorredoxina, etiquetas de HIS, etiquetas de biotina y etiquetas fluorescentes. Los expertos en la materia conoceran otras secuencias utiles para marcar y etiquetar protelnas.
Igualmente, los peptidos de la presente invencion pueden modificarse, siempre y cuando dicha modification no afecte significativamente a la capacidad del peptido para modular la inflamacion. Dichas modificaciones pueden realizarse, por ejemplo, para aumentar la estabilidad, la solubilidad o la capacidad de absorcion de la protelna. Entre los ejemplos de dichas modificaciones, se incluyen, pero sin limitarse a ellos, pegilacion, glicosilacion y modificacion qulmica del peptido.
Los peptidos de la presente invencion pueden obtenerse de la naturaleza (por ejemplo, obtenerse de plantas, animales o microorganismos) o pueden producirse en un laboratorio (por ejemplo, por slntesis o recombination). Los peptidos preferentes son aquellos que se sintetizan. Se incluyen asimismo peptidos que son combinaciones de moleculas naturales y sinteticas. Los expertos en la materia conocen metodos generales para producir y aislar peptidos recombinantes o sinteticos. Debe observarse que, tal como se utiliza en el presente documento, una molecula aislada o biologicamente pura es aquella que se ha extraldo de su medio natural. Siendo asl, las
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expresiones aislado, biologicamente puro, y similares, no reflejan necesariamente el grado en que la protelna ha sido purificada.
Tal como se ha descrito en el presente documento, la interaccion entre la protelna CD40 y la protelna CD154 es necesaria para la participacion de los linfocitos Th40 en la inflamacion autoinmune. En consecuencia, la inhibicion de la interaccion entre una protelna CD40 y CD154 utilizando peptidos de la presente invencion es un metodo util para modificar la inflamacion autoinmune. En el presente documento, se describe un metodo para reducir la interaccion entre una protelna CD40 y una protelna CD154 que comprende introducir en un entorno que contiene una protelna CD40 y una protelna CD154 un peptido que interactua con la protelna CD40, de tal manera que reduce la interaccion entre la protelna CD40 y la protelna CD154. En un aspecto, el peptido reduce la interaccion entre la protelna CD40 y la protelna CD154 en al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 95 %. En una realizacion, el peptido reduce la interaccion entre la protelna CD40 y la protelna CD154 en un factor de al menos 10, al menos 100, al menos 1.000, al menos 10.000. Los metodos de medicion de la fuerza de la interaccion entre la protelna CD40 y la protelna CD154 han sido descritos anteriormente y son conocidos entre las personas especializadas en la materia.
Asimismo, en el presente documento se divulga un metodo para modular la inflamacion que comprende poner en contacto una protelna CD40 con un peptido que interactua con la protelna CDE40 de tal manera que modula la inflamacion. En un aspecto, la interaccion entre el peptido y la protelna CD40 aumenta el numero de linfocitos Th40 en al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 %. En una realizacion, la interaccion entre el peptido y la protelna CD40 aumenta el numero de linfocitos Th40 en un factor de al menos 10, al menos 100, al menos 1.000, al menos 10.000. Se divulga tambien un metodo para reducir la inflamacion en un paciente, comprendiendo dicho metodo administrar al paciente un peptido de la divulgacion. En una realizacion, el peptido comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. En una realizacion, el peptido consiste en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. En una realizacion preferente, la interaccion del peptido con la protelna CD40 disminuye el numero de linfocitos Th40 en al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 95 %. En otra realizacion, la interaccion del peptido con la protelna CD40 disminuye el numero de linfocitos Th40 en un factor de al menos 10, al menos 100, al menos 1.000, al menos 10.000. En una realizacion preferente, se reduce el nivel de linfocitos Th40 de modo que los linfocitos Th40 comprenden no mas de aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 % o aproximadamente 40 % de la poblacion total de linfocitos T.
Los peptidos y metodos, tal como se divulgan en el presente documento, son adecuados para su uso en un cultivo celular, as! como para tratar a un paciente. Tal como se utiliza en el presente documento, el termino paciente se refiere a cualquier animal que necesita dicho tratamiento. El animal puede ser un ser humano o un animal no humano. Un animal preferente para su tratamiento es un mamlfero. Puede administrarse un peptido o aplicarse de por si, o como composiciones farmaceuticas. Es posible administrar un peptido de la presente invencion, o una composicion farmaceutica del mismo, a un paciente a traves de diversas rutas, entre las que se incluyen, sin limitarse a ellas, inyeccion (p.ej., intravenosa, intramuscular, subcutanea, intratecal, intraperitoneal), inhalacion, administracion oral (p.ej., en una plldora, comprimido, capsula, polvo, jarabe, solucion, suspension, pellcula fina, dispersion o emulsion), transdermica, transmucosa, pulmonar, bucal, intranasal, sublingual, intracerebral, intravaginal, rectal o topica o a traves de cualquier otro metodo adecuado conocido entre las personas especializadas en la materia.
A traves de tecnicas cllnicas convencionales conocidas en la tecnica puede determinarse la cantidad de un peptido de la presente invencion y/o una composicion farmaceutica del mismo eficaz. Dicha cantidad depende, entre otros factores, del paciente en tratamiento, incluyendo el peso, la edad y el estado del paciente, el efecto esperado del compuesto, la forma de administracion y el criterio del medico tratante.
Es posible administrar un peptido de la presente invencion, o una composicion farmaceutica del mismo, en solitario o en combination con otro u otros agentes farmaceuticos, incluyendo otros compuestos. La composicion farmaceutica concreta depende del modo de administracion deseado, como saben las personas especializadas en la materia.
Dado que los autores de la invencion han descubierto que los linfocitos Th40 estan Intimamente relacionados con el desarrollo de enfermedades autoinmunitarias, los peptidos y metodos divulgados en el presente documento pueden utilizarse para modificar la inflamacion derivada de dichas enfermedades. Por lo tanto, se divulga en el presente documento un metodo para tratar enfermedad autoinmunitaria en un paciente que necesita dicho tratamiento, comprendiendo dicho metodo administrar a un paciente un peptido que interactua con la protelna CD40, reduciendo as! la inflamacion. En una realizacion, el peptido interactua con la protelna CD40 de tal manera que afecta a la interaccion entre CD40 y CD154, reduciendo as! la inflamacion. En una realizacion preferente, la interaccion del peptido con la protelna CD40 reduce el numero de linfocitos Th40 en un paciente a un nivel igual al observado en sujetos que no tienen enfermedad autoinmunitaria. La presente invencion es adecuada para tratar a cualquier
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paciente que tenga una enfermedad autoinmunitaria cuyo desarrollo dependa de los linfocitos Th40. Mas concretamente, los peptidos de la presente invencion son adecuados para reducir el nivel de linfocitos Th40 en dichos pacientes. En una realizacion preferente, un peptido de la presente invencion reduce el nivel de linfocitos Th40 en un paciente que padece una enfermedad autoinmunitaria en aproximadamente el 25 % como maximo de la poblacion total de linfocitos T. Entre los ejemplos de dicha enfermedad incluyen, pero sin limitarse a ellas, asma, diabetes tipo 1; esclerosis multiple; lupus eritematoso sistemico; artritis reumatoide; enfermedad de Crohn; enfermedad inflamatoria intestinal; enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) incluyendo tipos de asma autoinmune; aterosclerosis; vasculitis; hipertension; tiroiditis incluyendo las enfermedades de Hashimoto y Graves; cirrosis biliar primaria; enfermedad de Paget; La enfermedad de Addison; slndrome de dificultad respiratoria aguda, lesion pulmonar aguda; ACI asociado a trasplante de organos; hipertension, etc.
Un ejemplo de una enfermedad que es particularmente susceptible de tratamiento mediante el uso de un peptido de la presente invencion es la diabetes. En la diabetes, esta alterada la produccion de insulina, o respuesta del cuerpo a ella. En consecuencia, las celulas no pueden utilizar la glucosa en la sangre y los niveles de dicho azucar se elevan. Los ratones se consideran diabeticos cuando su nivel de glucosa en sangre es superior a 250 mg/dl durante tres dlas consecutivos. En los seres humanos, un nivel de glucosa en sangre normal y promedio es de 60-110 mg/dl. Sin embargo, los diabeticos tienen niveles de glucosa en sangre de al menos 130 mg/dl, y generalmente mucho mas altos. Por tanto, en el presente documento, se divulga un metodo para prevenir la diabetes en un individuo en riesgo de desarrollar diabetes, comprendiendo dicho metodo administrar al individuo un peptido de la presente invencion. Dicho riesgo puede derivar de factores familiares (por ejemplo, herencia) o de otros factores, como el estado flsico del individuo. Los metodos de evaluation de riesgos son conocidos entre las personas especializadas en la materia. En una realizacion, se administra el peptido en el momento en que el nivel de glucosa en sangre del individuo es de aproximadamente 60 mg/dl a aproximadamente 110 mg/dl. En una realizacion, el peptido comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID nO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, siempre y cuando el peptido pueda regular negativamente la inflamacion. En una realizacion, el peptido consiste en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.
Los autores de la invencion han demostrado tambien que, sorprendentemente, el peptido de la presente invencion puede utilizarse para revertir el proceso patologico en individuos que ya presentan signos de diabetes. Por lo tanto, en el presente documento, se divulga un metodo para revertir la diabetes que comprende administrar a un paciente diagnosticado con diabetes, un peptido de la presente invencion. En una realizacion, el peptido comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, siempre y cuando el peptido puede regular negativamente la inflamacion. En una realizacion, el peptido consiste en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID nO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion “revertir la diabetes” significa reducir el nivel de glucosa en sangre de un individuo diabetico a un nivel comparable al observado en un individuo no diabetico. Como se ha senalado, el nivel de glucosa en sangre de un sujeto no diabetico es de aproximadamente 60 mg/dl a aproximadamente 110 mg/dl. Por lo tanto, en el presente documento, se divulga un metodo para reducir el nivel de glucosa en sangre en un paciente diagnosticado con diabetes a menos de 110 mg/dl, y preferentemente entre 60 mg/dl y 110 mg/dl.
Tal como se ha descrito, los peptidos de la presente invencion se unen selectivamente a una celula que expresa CD40. En consecuencia, los peptidos de la presente invencion pueden utilizarse para identificar linfocitos Th40. Por lo tanto, una realizacion de la divulgation es un metodo para detectar Th40, comprendiendo dicho metodo poner en contacto una poblacion de linfocitos T con un peptido de la presente invencion. En una realizacion preferente, se marca el peptido con un marcador detectable, como, por ejemplo, luciferasa o fosfatasa alcalina. Dicha detection se puede realizar aplicando tecnicas de ensayo conocidas entre las personas especializadas en la materia. En general, un ensayo para detectar linfocitos Th40 empleando un peptido de la presente invencion comprende (a) obtener una muestra de celulas; (b) poner en contacto un peptido de la presente invencion con dichas celulas en condiciones adecuadas para permitir la union del peptido a los linfocitos Th40, si estan presentes; (c) lavar dichas celulas empleando condiciones que interrumpen las interacciones no especlficas, y que eliminan el peptido sin unir; y (d) detectar el peptido unido a las celulas. La deteccion del peptido unido se puede lograr directa o indirectamente. Por ejemplo, puede conseguirse una deteccion directa utilizando un peptido marcado con un marcador detectable, tal como se divulga en el presente documento. Despues de la etapa de lavado indicada, se exploran las celulas simplemente en cuanto a la presencia de marcador detectable. La presencia de marcador detectable en la muestra de celulas indica la presencia de linfocitos Th40. Alternativamente, la deteccion indirecta implica el uso de una segunda molecula, como pueda ser un anticuerpo, que se une al peptido. En un ensayo de deteccion indirecta, tras la etapa de lavado indicada, se anade a la muestra de celulas una molecula de deteccion que se une al peptido. La molecula de deteccion esta marcada con un marcador detectable. Despues de lavar la molecula de deteccion no unida, se exploran las celulas en cuanto a la presencia de marcador detectable. La presencia de marcador detectable en la muestra de celulas indica la presencia de linfocitos Th40. Debe entenderse que los ensayos descritos en el presente documento sirven como ejemplos de ensayos utiles, pudiendose emplear otras tecnicas de ensayo. Las personas especializadas en la materia conoceran tecnicas de ensayo adecuadas, y tambien se describen en, por ejemplo, Cloning Molecular: A Laboratory Manual, Sambrook, J., Fritsch, EF, y Maniatis, T, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2a Edition (diciembre de 1989).
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La tecnologla de ensayo descrita tambien puede emplearse para identificar otras moleculas que modifican la interaccion entre una protelna CD40 con una protelna CD514. Entre los ejemplos de dichas moleculas se incluyen, pero sin limitarse a ellas, protelnas, peptidos y moleculas pequenas. Por ejemplo, se pueden disenar ensayos que determinen la capacidad de las moleculas para competir con un peptido de la presente invencion por la union a un linfocito Th40. Por ejemplo, se puede mezclar un peptido marcado con un marcador detectable con una molecula de ensayo y una poblacion de celulas conocida por contener linfocitos Th40, en condiciones que permitan la union del peptido con los linfocitos Th40. Tras un perlodo de incubacion apropiado, se lavan las celulas para eliminar el peptido sin unir y se exploran las celulas en cuanto a la presencia de un marcador detectable. Alternativamente, el peptido marcado podrla unirse a linfocitos Th40 primero y, despues de una etapa de lavado para eliminar el peptido sin unir, podrla anadirse la molecula de ensayo a las celulas con contenido de peptido unido. Tras un perlodo de incubacion y una etapa de lavado para eliminar la molecula sin unir, o peptido liberado, se exploran las celulas en cuanto a la presencia de un marcador detectable. En cualquier caso, la ausencia del marcador detectable en la muestra de celulas indica que la molecula de ensayo puede competir con el peptido por la union a los linfocitos Th40, mientras que la presencia del marcador detectable indicarla que la molecula de ensayo no inhibe la union del peptido a Th40 celulas. La inhibition de la union no tiene por que ser del 100%, ya que dicho ensayo tambien serla util para identificar moleculas que inhiben parcialmente la union del peptido con los linfocitos Th40. Las personas especializadas en la materia entenderan que dichos ensayos implicarlan el uso de controles positivos (p.ej., peptido sin marcar) y controles negativos (p.ej. protelna/molecula conocida por no unirse a linfocitos Th40).
Dado que los mayores niveles de linfocitos Th40 estan asociados al desarrollo de enfermedad autoinmunitaria, las directrices divulgadas en el presente documento pueden servir para identificar pacientes en riesgo de desarrollar enfermedad autoinmunitaria. Por lo tanto, en el presente documento, se divulga un metodo para identificar a un paciente en riesgo de desarrollar una enfermedad autoinmunitaria. En una realization, se identifican los pacientes en riesgo de desarrollar una enfermedad autoinmunitaria obteniendo una muestra de un paciente para su analisis, poniendo en contacto la portion de linfocitos T de dicha muestra con un peptido de la presente invencion y determinando el nivel de linfocitos Th40 presente en la muestra, en la que un nivel de linfocitos Th40 superior a aproximadamente 25 % de la poblacion total de linfocitos T indica que el paciente esta en riesgo de desarrollar una enfermedad autoinmunitaria. En una realizacion, el peptido comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ iD NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, siempre y cuando el peptido se una a la protelna CD40. En una realizacion, el peptido consiste en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ iD No: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. En una realizacion preferente, el peptido esta marcado con un marcador detectable adecuado como, por ejemplo, luciferasa o fosfatasa alcalina.
Se divulgan tambien kits utiles para poner en practica los metodos divulgados en el presente documento. Una realizacion es un kit para modular la inflamacion en un animal o en celulas en cultivo, comprendiendo dicho kit un peptido que interactua con una protelna CD40 de tal manera que modula la inflamacion. En una realizacion, el peptido comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID nO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, siempre y cuando el peptido pueda regular negativamente la inflamacion. En una realizacion, el peptido consiste en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. Otra realizacion es un kit para determinar el nivel de linfocitos Th40, comprendiendo dicho kit un peptido que interactua con una protelna CD40 y medios para detectar el peptido unido a CD40. Los kits tambien pueden contener reactivos y componentes asociados, como, por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, tampones, etiquetas, envases, inserciones, tubos, viales, jeringas y similares.
Los ejemplos que se exponen a continuation tienen un fin ilustrativo no pretendiendose limitar el alcance de la presente invencion.
Ejemplos
Ejemplo 1
En este ejemplo se demuestra el efecto de diversos fragmentos peptldicos de CD154 en las relaciones CD4/CD8 y el desarrollo de diabetes en ratones NOD.
Se disenaron los peptidos basandose en la secuencia de aminoacidos de la protelna CD154 de raton (SEQ ID NO: 1) de la base de datos SwissPro. Se realizo el pedido de los peptidos en New England Peptide. Se suspendieron los peptidos liofilizados en solution salina esteril a 1 mg/ml. A continuacion, se inyectaron 100 pg de un peptido en particular en la vena caudal de ratones NOD de 8-9 semanas de vida. Los ratones de control recibieron 100 ul de solucion salina esteril. Esto es bastante antes del inicio de la diabetes, pero despues de que haya comenzado el dano a los islotes pancreaticos. Tres dlas despues de la inyeccion inicial, se inyectaron otros 100 ug de peptido (o 100 ul de solucion salina en el caso de los ratones de control) en la vena caudal. Los ratones fueron inyectados con peptido (o solucion salina) semanalmente. A las 10 semanas de vida, se llevo un seguimiento de los ratones en cuanto a la diabetes, segun lo indico un nivel de glucosa en sangre superior a 250 mg/dl durante tres dlas consecutivos. En la Figura 1 se presentan los resultados de este estudio. Durante este tiempo, tambien se extrajo
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sangre de la vena caudal, o mediante puncion venal submandibular, y se determino el nivel de celulas CD4+ y CD8+ por citometria de flujo utilizando anticuerpos para la proteina CD4 y la proteina CD8. Los resultados de este analisis se muestran en la Figura 2.
Los resultados demuestran que el tratamiento con un peptido no relacionado con la proteina CD154 no redujo el desarrollo de diabetes en ratones NOD. En cambios, el tratamiento de ratones con un peptido de 15 meros derivado de proteina CD154 evito el inicio de la diabetes. Asimismo, tanto los peptidos de 6 meros como los de 10 meros derivados de proteina CD154, tuvieron efectos significativos sobre el desarrollo de la diabetes. Ademas, los datos demuestran que el peptido de 15 meros no comprometio el sistema inmunitario como resultado, segun lo determino la relacion cD4/Cd8.
Ejemplo 2
En este ejemplo se demuestra el efecto del peptido de 15 meros sobre la hiperglucemia en ratones NOD recien diabeticos.
Por via intravenosa se inyectaron 100 ug del peptido de 15 meros en seis ratones a los que se habia administrado el peptido de 6 meros del Ejemplo 1 y que posteriormente desarrollaron diabetes. Despues, se administro a estos ratones inyecciones semanales del peptido de 15 meros en la vena caudal y se controlo el nivel de glucosa en sangre dos veces a la semana. Se administro el peptido de 15 meros durante un total de diez semanas y una vez transcurridas, se detuvo el tratamiento. En la Figura 3, se muestran los resultados de este estudio.
En este estudio se demuestra que la inyeccion del peptido de 15 meros en ratones ya diabeticos puede revertir la hiperglucemia. Asimismo se demuestra que el cese del tratamiento tiene como resultado una hiperglucemia en curso de 7 semanas.
Ejemplo 3
En este estudio se demuestra la capacidad del peptido de 15 meros de unirse a linfocitos Th40 y linfocitos B.
Se aislo el total de linfocitos de ratones NOD de 9 semanas de vida. Los linfocitos se incubaron con anti-CD, anti- CD8 y un peptido de 15 meros marcado con FITC y despues se analizaron por citometria de flujo. Se sometieron a seleccion las celulas en cuanto a CD4 (se incluyeron las poblaciones de CD4hi y CD41o) y CD4 frente al peptido de 15 meros. Los resultados de este analisis se muestran en la Figura 4.
Se aislaron los linfocitos B de los bazos de ratones NOD. Se purificaron las celulas MHC-II+ clasificadas desde el total de linfocitos. Se tineron las celulas con el peptido de 15 meros marcado con FITC, anti-CD40, y marcadores de linfocitos B CD19 y CD21. Se sometieron a seleccion celulas MHC-II+ en cuanto a CD19+ y CD21+ y despues se midio el peptido de 15 meros frente al anticuerpo Cd40. Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 5.
En este estudio, se demuestra que una sustancial mayoria, el 90 % de los linfocitos T CD40+, tambien se unen al peptido de 15 meros, lo que demuestra que el peptido de 15 meros es muy especifico para las celulas CD40+. Se demuestra asimismo que mientras el 90 % de los linfocitos B eran CD40 positivos, solo el 8 % de los linfocitos B se unieron al peptido de 15 meros.
Ejemplo 4
En este ejemplo se demuestra el nivel de celulas CD40 positivas en la sangre de sujetos diabeticos tipo I y sujetos no diabeticos (control).
Se obtuvo 1 ml de sangre completa de cada individuo y se incubo con peptido de 15 meros conjugado con biotina. A continuacion, se expusieron las celulas a peroxidasa de rabano picante rusticano (HRP)- avidina, se lavaron y se determino la absorbancia a 405 nm con un espectrofotometro. Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 6.
En este estudio se demuestra que globulos de pacientes que tienen diabetes tipo I, presentaron una mayor actividad de union a peptidos de 15 meros que las celulas de controles no diabeticos.
Ejemplo 5
En este ejemplo se demuestra el nivel de granulacion de insulina observado en el pancreas de ratones NOD tratados con el peptido de 15 meros o un peptido de ovoalbumina.
Al inicio de la diabetes, se inyectaron a seis ratones NOD 100 pg/ml del peptido de 15 meros (SEQ ID NO: 9), lo que tuvo como resultado la reversion de la hiperglucemia en un 80 % de los receptores. Seis semanas despues de la reversion de la hiperglucemia, se sacrifico a los ratones y se les extrajo el pancreas para su analisis. Se fijo el
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pancreas, se secciono y despues se tino usando una tincion de aidehldo/fuschsina que permite la deteccion de granulos de insuiina. Se puntuo la granulacion del tejido de la siguiente manera: 4 = compietamente granuiado; 3 = 75 % de islotes granulados; 2 = 50 % de islotes granulados y peri-insulitis; 1 = 25 % de islotes granulados; 0 = no se detectaron granulos de insulina. En la Figura 7, se muestran los resultados de este analisis.
Este analisis demuestra que el peptido de 15 meros conservo granulos de insulina en la mayorla de los ratones y se mejoro significativamente en ratones diabeticos con reversion mediante el peptido en comparacion con ratones diabeticos que recibieron un peptido no pertinente.
Ejemplo 6
En este ejemplo se demuestra el efecto de las mutaciones en el peptido de 15 meros en su capacidad para prevenir el inicio de diabetes.
Se disenaron y produjeron peptidos tal como se describe en el Ejemplo 1. Se produjeron variantes de peptidos de modo que en cada variante, una glicina estaba sustituida por un aminoacido correspondiente a un aminoacido en las posiciones 1-9 de SEQ ID NO: 9, como sigue:
Gly 1 G-L-Q-W-A-K-K-G-Y-Y-T-M-K-S-N (SEQ ID NO: 11)
Gly 2 V-G-Q-W-A-K-K-G-Y-Y-T-M-K-S-N (SEQ ID NO: 12)
Gly 3 V-L-G-W-A-K-K-G-Y-Y-T-M-K-S-N (SEQ ID NO: 13)
Gly 4 V-L-Q-G-A-K-K-G-Y-Y-T-M-K-S-N (SEQ ID NO: 14)
Gly-5 V-L-Q-W-G-K-K-G-Y-Y-T-M-K-S-N (SEQ ID NO: 15)
Gly-6 V-L-Q-W-A-G-K-G-Y-Y-T-M-K-S-N (SEQ ID NO: 16)
Gly-7 V-L-Q-W-A-K-G-G-Y-Y-T-M-K-S-N (SEQ ID NO: 17)
Gly-9 V-L-Q-W-A-K-K-G-G-Y-T-M-K-S-N (SEQ ID NO: 18)
Gly-10 V-L-Q-W-A-K-K-G-Y-G-T-M-K-S-N (SEQ ID NO: 19)
Gly-11 V-L-Q-W-A-K-K-G-Y-Y-G-M-K-S-N (SEQ ID NO: 20)
Gly-12 V-L-Q-W-A-K-K-G-Y-Y-T-G-K-S-N (SEQ ID NO: 21)
Se colocaron los ratones NOD en grupos de 10 y se inyecto a los ratones de cada grupo IV, semanalmente, 50 pg de peptido de tipo silvestre (WT; leyenda) o uno de los peptido variantes (en PBD, pH 7,2) enumerados. Se llevo un seguimiento del desarrollo de la diabetes midiendo los niveles de glucosa en sangre semanalmente. Se considero que los ratones eran "diabeticos" cuando la glucosa en sangre fue de 250 mg/dl o mas en 2 lecturas consecutivas. Las inyecciones comenzaron a las 6 semanas de vida = pre-diabetes.
En este ejemplo se demuestra que la sustitucion de una glicina en cualquiera de las posiciones 1-7 o 9-12 reduce la capacidad del peptido de 15 meros de inhibir el desarrollo de diabetes. Tambien muestra que dichas mutaciones no eliminan por completo la capacidad del peptido de 15 meros mutado para inhibir el desarrollo de la diabetes.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Wagner, David
<120> PEPTIDOS PARA MODULAR LA ACTIVIDAD DE LINFOCITOS T Y USOS DE LOS MISMOS
<130> 2848-113-PCT
<140> Aun no asignado <141 >
<150> 61/394.699 <151 >
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211 > 260 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 1

Claims (10)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un peptido que inhibe la union de CD40 con CD154 para su uso en un metodo de tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en un paciente, en donde dicho peptido tiene una longitud menor de 20 aminoacidos y comprende al menos una secuencia seleccionada entre SEQ iD NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8.
  2. 2. El peptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicha enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en diabetes de tipo I, esclerosis multiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistemico, enfermedad pulmonar obstructiva cronica y slndrome de dificultad respiratoria aguda.
  3. 3. El peptido para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho peptido tiene una longitud de 6 a 15 aminoacidos y comprende una secuencia nucleo que consiste en SEQ ID NO: 3.
  4. 4. El peptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 3, que tiene una longitud de 6 a 15 aminoacidos.
  5. 5. El peptido para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho peptido es SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8.
  6. 6. El peptido para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho peptido se une a una protelna CD40 con una Kd mayor de 106.
  7. 7. El peptido para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho peptido inhibe la interaccion de CD40 con CD154 de tal manera que impide la expansion de linfocitos Th40.
  8. 8. El peptido para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho peptido inhibe la interaccion de CD40 con CD154 de tal manera que reduce el numero de linfocitos Th40.
  9. 9. El peptido para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho peptido inhibe la interaccion entre cD40 y CD154 de tal manera que altera el perfil de expresion de citoquina de una poblacion de celulas tratadas con dicho peptido.
  10. 10. Un metodo in vitro para inhibir la interaccion entre una protelna CD40 y una protelna CD154, que comprende poner en contacto dicha protelna CD40 con el peptido de la reivindicacion 1 que se une a dicha protelna CD40 en el sitio de union a CD154, inhibiendo de este modo la interaccion de dichas protelnas CD40 y CD154.
    % inhibicion de diabetes con peptido inhibidor de ligando CD40
    101H
    O
    o
    '<D
    n
    re
    b
    imagen1
    Semanas de vida
    S meros =
    K-K-G-Y-Y-T
    S meros= A-K-K-G-Y-Y-T-M
    10 meros = W-A-K-K-G-Y-Y-T-M-K
    13 meros = V-L-Q-W-A-K-K-G-Y-Y-T-M-K
    15 meros a V-L-Q-W-A-K-K-G-Y-Y-T-M-K-S-N
    24 meros= A-A-S-V-L-Q-W-A-K-K-G-Y-Y-T-M-K-S-N-L-V-V-L-E-N
    Figura 1
    hJ
    cn
    Relacion CD4/CD8 - sangre periferica
    imagen2
    1
    %
    o
    %
    'O.
    <SL
    O'
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    °s
    O'
    %■
    \
    sC>
    %
    %
    Figura 2 °
    $
    v
    %
    K)
    O)
    % Diabetico
    imagen3
    Semanas despues de la hiperglucemia
    Figura 3
    Linfocitos T
    imagen4
    O
    dIS
    Figura 4
    imagen5
    Anticuerpo-CD40
    HI
    i*r
    10
    10'
    'fu,y6
    Sf87
    *
    / ‘. ,
    1(1,36
    i«
    H’i1
    10j 10
    Figura 5
    CD
    O
    T3
    C
    £
    (0
    o
    o
    0
    Q.
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    O
    o
    _Q
    <
    0,04
    0,03 -
    0,02 -
    0,01 -
    0,00
    Medicion ELISA de CD40 en muestras de sangre
    T
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    imagen7
    _____!_____
    Datos X
    3
    Figura 6
    imagen8
    P = 0,004
    P< 0,001
    imagen9
    0 12 3 4
    SIP Reversion de la Diabetes diabetes con SIP OVA
    Figura 7
    Trayecto de Glicina a traves de peptido de 15 meros
    Gly-1
    imagen10
    Edad
    Figura 8
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