JP5090366B2 - 多価イムノグロブリン系生物活性アセンブリー - Google Patents

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関連出願
本出願は、２００６年３月２４日に提出した国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１０７６２号；２００６年３月２９日に提出した国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１２０８４号；２００６年６月２９日に提出した国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２５４９９号；２００６年３月２４日に提出した米国特許出願第１１／３８９,３５８号；２００６年３月２８日に提出した同第１１／３９１,５８４号 及び２００６年６月２９日に提出した同第１１／４７８,０２１号の一部継続出願であり、２００６年３月１４日に提出した米国特許仮出願第６０／７８２,３３２号；２００５年１０月１９日に提出した同第６０／７２８,２９２号 及び２００５年１２月１６日に提出した同第６０／７５１,１９６号に基づく優先権を主張する。本出願は、２００５年１２月１６日に提出した米国特許仮出願第６０／７５１,１９６号及び２００６年１１月６日に提出した同第６０／８６４,５３０号に基づき合衆国法典第３５巻１１９条(ｅ)に規定する利益を主張する。上記に引用する各出願の文章は、その全文が参照により本明細書に取り込まれる。
複数の機能又は結合特異性を有する抗体系薬剤の製造に関する既存の技術は、数多くの制限に悩まされている。遺伝子組換え工学によって作り出される薬剤の場合、このような制限としては、高額な製造費用、低い発現回収率、血清内での不安定性、凝集体を形成させるか又はサブユニットを解離させる結果となる溶液中での不安定性、生成物の複数の形態の存在に起因する各バッチ間での特定されない組成、副生成物の混入、立体的要因若しくは変化したコンフォメーションに起因する機能活性又は結合親和力／結合活性等を挙げることができる。化学的架橋による種々の方法により作り出される薬剤の場合、高額な製造費用と精製した製造物の不均一性が、２つの主な制限となる。
近年では、２種類以上の抗原決定基（エピトープとも呼ばれる）に結合可能な抗体又は他の結合部分に対する関心が高まっている。一般的に、天然の抗体やモノクローナル抗体は、同一のエピトープを認識する２つの抗原結合部位を有する。対照的に、二機能性又は二重特異性抗体（以下においては、本明細書を通じて二重特異性抗体の用語のみを用いる）は、２種類の異なるエピトープに結合可能な合成構造物又は遺伝子組換え構造物である。従って、２種類の異なる抗原決定基に結合する能力が、同一の分子構造物に備わることになる。
二重特異性抗体は、多くの生物医学的用途に有用である。例えば、腫瘍細胞表面の抗原又はＴ細胞表面レセプターに対する結合部位を有する二重特異性抗体は、Ｔ細胞に特定の腫瘍細胞を溶解させることができる。神経膠腫とＴ細胞上のＣＤ３エピトープを認識する二重特異性抗体を用いて、ヒトである患者の脳腫瘍を治療することに成功している（Ｎｉｔｔａ, ｅｔ ａｌ. Ｌａｎｃｅｔ. １９９０; ３５５:３６８-３７１）。また、より最近では、「二重特異性Ｔ細胞誘引体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ-ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）」（ＢｉＴＥ）と呼ばれる新たな二重特異性抗体のクラスが、生物活性のためにエフェクター細胞を用いることを要する殆どの腫瘍を標的とする二重特異性抗体の制限を克服したことが報告された（Ｋｕｆｅｒ, ｅｔ ａｌ. Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ２００４; ２２: ２３８-２４４）。ＢｉＴＥとは、標的細胞上の表面抗原とＴ細胞上のＣＤ３を標的とする２種類の異なる１本鎖Ｆｃ断片（ｓｃＦｖ）が、フレキシブルポリペプチドリンカーを介してタンデム状に結合されたものから構成される組換えによる二重特異性を示す１本鎖抗体である（Ｍａｃｋ, ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ.Ｓ.Ａ. １９９５; ９２: ７０２１-７０２５）。ＢｉＴＥは、哺乳動物細胞内で生産され、他のＣＤ３を標的とする二重特異性抗体とは対照的に、事前に又は同時にエフェクターＴ細胞を刺激することを要することなく、効果的にヒト末梢Ｔリンパ球を標的細胞に向かわせて死滅させる（Ｍａｃｋ, ｅｔ ａｌ. Ｊ Ｉｍｍｏｎｏｌ. １９９７; １５８: ３９６５-３９７０; Ｌｏｆｆｌｅｒ, ｅｔ ａｌ. Ｂｌｏｏｄ. ２０００; ９５: ２０９８-２１０３）。たったの１０-１００ ｐｇ／ｍＬ (〜０.１ — ２ ｐＭ)の濃度のＢｉＴＥでも、インビトロで標的細胞の半数最大溶解度を達成させるのに十分であることが示されており（Ｄｒｅｉｅｒ, ｅｔ ａｌ. Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ. ２００２; １００: ６９０-６９７）、マウスモデルではマイクログラム未満の量でも腫瘍増殖を防ぐことができた（Ｄｒｅｉｅｒ, ｅｔ ａｌ. Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ. ２００３; １７０: ４３９７-４４０４; Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ ｅｔ ａｌ. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ２００５; ６５: ２８８２-２８８９）
二重特異性抗体の生産については数多くの方法が知られている。例えば、２００４年２月１１日に提出された米国特許出願公報第２００５０００２９４５号には、二重特異性抗体及び多重特異性抗体の製造方法と使用が開示されており、この文献の全文は、参照により本明細書に組み込まれる。二重特異性抗体は、それぞれが異なる抗原部位を認識するモノクローナル抗体を生産する２種類の異なるハイブリドーマを融合させることを必要とするクアドローマ法によって製造できる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ, Ｎａｔｕｒｅ, １９８３; ３０５:５３７-５４０）。融合したハイブリドーマは、２種類の異なる重鎖と２種類の異なる軽鎖を合成することができ、これらの重鎖と軽鎖はランダムに結合して１０種類の異なる抗体構造からなる不均一な集団を生じさるが、これら集団のうち１種類のみ（全抗体分子の１／８に相当する）が二重特異性を持つことになるので、更に他の形態のものから精製する必要があり、製造可能であるとしてもコスト面で効率的とは言えない。更に、融合したハイブリドーマは、その親ハイブリドーマより細胞発生学的安定性に欠ける場合が多く、生産細胞のセルラインの作製がより困難になる。
別の二重特異性抗体の製造方法では、ヘテロ二重機能性架橋を用いて、２種類の異なるモノクローナル抗体を化学的に繋ぎ合せることで、得られるハイブリッド複合体は２種類の異なる標的に結合することになる（Ｓｔａｅｒｚ, ｅｔ ａｌ. Ｎａｔｕｒｅ. １９８５; ３１４:６２８-６３１ ; Ｐｅｒｅｚ, ｅｔ ａｌ. Ｎａｔｕｒｅ. １９８５; ３１６:３５４-３５６）。この方法により作られる二重特異性抗体は、本質的に、２種類のＩｇＧ分子から成るヘテロ複合体であり、ゆっくりと組織内へ拡散し、迅速に循環系から除去される。２種類の親モノクローナル抗体をそれぞれの半分の分子に還元して、次いで、混合して再度酸化することでハイブリッド構造体を得ることにより二重特異性抗体を生産することもできる（Ｓｔａｅｒｚ ａｎｄ Ｂｅｖａｎ. Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ. １９８６; ８３:１４５３-１４５７）。別の方法では、適切なリンカーを用いて２又は３種類の個別に精製したＦａｂ'断片を化学的に架橋することを伴う。例えば、欧州特許出願第０４５３０８２号には、二重又は三重特異性抗体様構造物の製造にトリマレイミド（ｔｒｉ-ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）化合物を用いることが開示されている。米国特許第６,５１１,６６３号には、連結用構造体を介して３又は４種類のＦａｂ断片を互いに共有連結させることにより、３価及び４価の単一特異性抗原結合タンパク質を調製する方法が開示されている。これら全ての化学的手法は、その高額な製造費用、労力を要する製造工程、精製工程の多さ、低い収率（＜２０％）、及び不均一な生産物等の理由により、商業的な開発に望ましい方法ではない。
他の方法としては、それぞれの親ハイブリドーマにレトロウィルス由来シャトルベクターを介して異なる選択マーカーを遺伝子導入して、次いでこれら親ハイブリドーマを融合させること（ＤｅＭｏｎｔｅ, ｅｔ ａｌ. Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ. １９９０, ８７:２９４１-２９４５）；又は、異なる抗体の重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子を含む発現プラスミドでハイブリドーマ細胞系をトランスフェクションすることによりハイブリッドハイブリドーマの作製効率を向上させることが挙げられる。これらの方法も、上述した避けられない精製の問題に直面している。
抗体の重鎖定常領域の領域内に挿入された相補的相互作用を起こすドメインにより会合される、同一又は異なる抗体由来のＦａｂ断片から成る組換え二重特異性抗体の製造方法が、米国特許第５,５８２,９９６に開示されている。相補的相互作用を起こすドメインは、相補的なロイシンジッパー、又は一方が正に帯電した一連のアミノ酸残基を含み、他方が負に帯電した一連のアミノ酸残基を含むペプチドセグメントのペアから選択される。このような方法の１つの制限として、融合した相補的相互作用ドメインを含む個々のＦａｂサブユニットが、両方のサブユニットが組み合されていない場合には、その標的抗原に対してずっと低い親和性を示すと考えられることである。
ＤＮＡ組換え技術により作製された抗体の個々のＶＨ及びＶＬドメインは、相互にペアを形成し、結合能を有する２量体（組換えＦｖ断片）を形成する（米国特許第４,６４２,３３４号）。しかしながら、このように非共有結合的に会合した分子は、生理学的条件下で実用性を有する程の安定性を示さない。適切な組成と長さ（通常１２残基を超えるアミノ酸から成る）のペプチドリンカーを用いて、同一抗体由来のＶＨドメインとＶＬドメインを連結させて、結合活性を有する１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成することもできる。ｓｃＦｖの製造方法は、米国特許第４,９４６,７７８号及び米国特許第５,１３２,４０５号に開示されている。ペプチドリンカーの長さを１２アミノ酸残基まで小さくすると、同一鎖上でのＶＨドメインとＶＬドメインのペア形成を妨げて、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを別の鎖上の相補的なドメインとペア形成させて、結果として機能的な多量体を形成させることになる。３ないし１２アミノ酸残基のリンカーで連結されたＶＨドメインとＶＬドメインのポリペプチド鎖は、その大部分が２量体（ジアボディー(ｄｉａｂｏｄｙ)と呼ばれる）を形成する。０ないし２アミノ酸残基間のリンカーを用いると、三量体（トリアボディー(ｔｒｉａｂｏｄｙ)と呼ばれる）及び４量体（テトラボディー(ｔｅｔｒａｂｏｄｙ)と呼ばれる）がより多く形成されるが、正確なオリゴマー形成パターンは、リンカーの長さに加えて、その組成並びにＶドメインの方向性（ＶＨ-リンカー-ＶＬ又はＶＬ-リンカー-ＶＨ）に依存すると考えられる。
５個以下のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを用いることで、複数の価数を有する単一特異性のジアボディー、トリアボディー及びテトラボディーが得られている。また、各ｓｃＦｖ が、１種類の抗体由来のＶＨドメインが短いペプチドリンカーによって別の抗体由来のＶＬドメインに連結されたものから成る、２種類の異なるｓｃＦｖのヘテロ２量体である二重特異性抗体が、１のシストロンにＶＨ１-リンカー-ＶＬ２を含む組換え遺伝子構築物を含み、別のシストロンにＶＨ２-リンカー-ＶＬ１を含む第２の組換え遺伝子構築物を含むジシストロニック発現ベクターを用いて作製されている（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ, ｅｔ ａｌ. Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ. １９９３; ９０: ６４４４-６４４８; Ａｔｗｅｌｌ, ｅｔ ａｌ. ＭｏＩ Ｉｍｍｕｎｏｌ. １９９６; ３３:１３０１-１３０２; Ｈｏｌｌｉｇｅｒ, ｅｔ ａｌ. Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. １９９７; １５: ６３２-６３１; Ｈｅｌｆｒｉｃｈ, ｅｔ ａｌ. Ｉｎｔ. Ｊ Ｃａｎｃｅｒ.１９９８; ７６: ２３２-２３９; Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ, ｅｔ ａｌ. Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ. １９９８; ７７: ７６３-７７２; Ｈｏｌｌｉｇｅｒ, ｅｔ ａｌ. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.１９９９; ５９: ２９０９-２９１６）。
より最近では、二重特異性を有する４価のタンデム状のジアボディー（タンダブ（ｔａｎｄａｂ）と呼ばれる）が報告されている（Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓ, ｅｔ ａｌ. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ２０００; ６０: ４３３６-４３４１）。二重特異性タンダブは、２本の同一のポリペプチドからなる二量体であり、各ポリペプチドには、２種類の抗体由来の４種類の可変ドメイン（ＶＨ １、ＶＬ１、ＶＨ２、ＶＬ２）が含まれ、これらの可変ドメインは、自己会合した際に２種類の異なる各特異性に対する２種類の潜在的な結合部位の形成を促進するような方向に連結されている。
現時点において、二重特異性又は三重特異性トリアボディーを発現するベクター構築物は実現していない。しかしながら、コレクチンのネック部分を含むポリペプチドは、三量体化することが報告されている（Ｈｏｐｐｅ, ｅｔ ａｌ. ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ. １９９４; ３４４: １９１-１９５）。コレクチンのネック領域を含む融合タンパク質からのホモ３量体又はヘテロ３量体の製造が、米国特許第６,１９０, ８８６号に開示されている。
リンカー長を変化させることにより多価で多重特異性を有するｓｃＦｖ系薬剤を製造する方法が米国特許第５,８４４,０９４号、米国特許第５,８３７,２４２号及び国際公開公報第９８／４４００１号に開示されている。一方のポリペプチド鎖が少なくとも２種類の抗体に由来するＶＨドメインから構成され、他方のポリペプチド鎖が対応するＶＬから構成される２種類のポリペプチド鎖を構築することにより、多価で多重特異性を有するｓｃＦｖ系薬剤を製造する方法が米国特許第５,９８９,８３０号及び米国特許第６,２３９,２５９号に開示されている。先行技術に係る方法による多価で多重特異性を有するｓｃＦｖ系薬剤の製造に頻繁に関連する共通の問題は、低い発現レベル、不均一な製品形態、凝集を起こさせる溶液中での不安定性、血清中での不安定性、及び親和性の損傷である。
ＣＨ１のＣ末端とＦａｂのＣＬのそれぞれが、同一の又は異なるモノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖに融合した、組換え製造された二重特異性又は三重特異性抗体が米国特許第６,８０９,１８５号に開示された。この「トリボディー（Ｔｒｉｂｏｄｙ）」技術の主要な欠点としては、付加したｓｃＦｖの結合親和性の損傷、不均一な製品形態、及び凝集を起こさせる溶液中での不安定性が挙げられる。
従って、本技術分野においては、一定の組成、均一な純度及び変化しない親和力を有し、多数の精製工程を要することなく高い収率で製造可能な、単一特異性又は複数の特異性若しくは機能のいずれかを有する多価構造体の製造方法に対する需要が未だ存在する。更にまた、このような構造は、インビボでの応用が可能な程度に十分な安定性を示すはずである。容易に構築でき、そして／又は比較的精製された形態で入手できる、単一特異性又は複数の特異性若しくは機能のいずれかを有する安定な多価構造体に対する需要が存在する。
本発明は、単一特異的及び／又は単一機能的であってもよいか、又は複数の機能若しくは結合特異性を有し、インビトロ並びにインビボでの応用に適した、安定に繋ぎ止められた構造体を作製するための足場となる技術を開示する。好ましい態様では、このように安定に繋ぎ止められた構造体は、一方が２量体化及びドッキング用ドメイン（ＤＤＤ）と呼ばれ、他方が固定用ドメイン（ＡＤ）と呼ばれる、２種類の別々のペプチド配列間での特異的相互作用を介した、ここでＡ及びＢと呼ばれる２種類の構成成分からなる複合体として生産される。より好ましい態様では、ＤＤＤ配列（図１にＤＤＤ１及びＤＤＤ２として示す）は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の調節（Ｒ）サブユニットから誘導され、ＡＤ配列（図２にＡＤ１及びＡＤ２として示す）は、ＰＫＡのＲサブユニットの会合を媒介する種々のＡキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）に見出される特定の領域から誘導される。しかしながら、当業者であれば、他の２量体化及びドッキング用ドメインと固定用ドメインも知られており、このような既知のいずれのドメインも請求項に係る主題の範囲内で用いることができることを理解するであろう。開示される方法及び組成物により、ＤＤＤ／ＡＤ結合システムを用いて、あらゆる２種類の複合体の部位特異的な共有結合性又は非共有結合性の会合が可能になる。ＤＤＤの構造上の特徴である、４本のＸ型へリックスの束の２量体化モチーフ（Ｎｅｗｌｏｎ, ｅｔ ａｌ. ＥＭＢＯ Ｊ. ２００１; ２０: １６５１-１６６２; Ｎｅｗｌｏｎ, ｅｔ ａｌ. Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ. １９９９; ３: ２２２-２２７）は、Ｓ１００ タンパク質（例えば、Ｓ１００Ｂ及びカルサイクリン）及び転写因子の肝細胞核因子（ＨＮＦ）（ＨＮＦ-１α及びＨＮＦ-１β）等の別のクラスのタンパク質にも見出される。Ｓ１００タンパク質は、腫瘍形成等の生物活性を示すことから、これらのタンパク質はこのような用途に比較的望ましくない場合がある。
シグナル伝達又は転写活性に関与する３００種類を超えるタンパク質が、ステライルαモチーフ（ｓｔｅｒｉｌｅ α ｍｏｔｉｆ）（ＳＡＭ）ドメインと呼ばれる６５-７０個のアミノ酸から成るモジュール構造を含んでおり、このモジュール構造は、その２量体化用の境界領域上に４本のＸ型へリックスの束の変異体を有する。Ｓ１００Ｂの場合、この４本のＸ型へリックスの束により、マイクロモルレベルの親和力で各２量体をＣ末端調節ドメイン（３６７-３８８番目の残基）由来のｐ５３ペプチドへ結合させることが可能になる（Ｒｕｓｔａｎｄｉ, ｅｔ ａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ. １９９８; ３７: １９５１-１９６０）。同様にＨＮＦ-１α （ＨＮＦ-ｐ１）のＮ末端にある２量体化ドメインは、ＨＮＦ-ｐ１の２量体を介してＤＣｏＨ（ＨＮＦ-１の２量体化補因子）の２量体と会合することが実証された（Ｒｏｓｅ, ｅｔ ａｌ. Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ. ２０００; ７: ７４４-７４８）。別の態様では、これらの天然の系を請求項に係る方法と組成物の範囲内で用いて、複数の機能又は結合特異性を有する安定な多量体構造体を提供することができる。例えば、クチナーゼとホスホネート（Ｈｏｄｎｅｌａｎｄ, ｅｔ ａｌ. Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ. ２００２; ９９: ５０４８-５０５２）のような酵素とその基質／阻害剤の間の結合といった、他の結合現象を用いて２種類の会合する構成成分を作り出し（「ドッキング」工程）、その後にこれらを共有結合により安定化させる（「ロック」工程）こともできる。
他の潜在的用途を有するＡＤ配列は、米国特許出願第ＵＳ２００３／０２３２４２０Ａ１号に見出すことができ、その全文が、参照により本明細書に取り込まれる。
代表的な態様では、２成分から成る複合体の１の成分Ａが、組換え工学又は化学的なスペーサーグループを介した結合により、Ａと呼ぶＡの前駆体へＤＤＤ配列を連結させることで生産され、以下においてａと呼ぶＡ／ＤＤＤの構造体を生じる。ａ中のＤＤＤ配列は２量体の自然形成を起こさせるので、従ってＡはａ２から構成される。２成分から成る複合体の他方の成分Ｂは、組換え工学又は化学的なスペーサーグループを介した結合により、Ｂと呼ぶＢの前駆体へＡＤ配列を連結させることで生産され、以下においてｂと呼ぶＢ／ＡＤの構造体を生じる。ａ２に含まれる２量体構造体が、ｂに含まれるＡＤ配列への結合用のドッキング部分を作り出すという事実は、ａ２とｂの迅速な会合を生じさせて、ａ２ｂから構成される２成分複合体を形成させる結果となる。種々の態様において、上記の結合現象は、後の、例えば、ジスルフィド架橋等（ジスルフィド架橋は、最初の結合性相互作用により反応性のチオール基が部位特異的にライゲーションすることになるので、非常に効果的に生じる）、アセンブリーの２種類の構成成分を共有結合により固定する反応によって更に安定化される。
ＤＤＤ配列とＡＤ配列の両方の戦略上有利な部位にシステイン残基を配置することにより、ａ２とｂの間の結合相互作用を、ジスルフィド架橋を介した共有結合によるものにすることができ、それによってインビボでの応用を一層実現可能にする安定係留構造体（ｓｔａｂｌｙ ｔｅｔｈｅｒｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）が形成される。安定係留構造体は、２種類の前駆体Ａ及びＢの完全な機能的特性を保持している。発明者たちは、この独自の特性の組み合わせを有する、いかなる先行技術に係る二重特異性組成物も認識しない。選択された２種類の前駆体のそれぞれは、ＤＤＤ又はＡＤのいずれかと連結され、その後組み合せることが可能であるから、上記に開示される設計は、その本質においてモジュール式のものである。２種類の前駆体は、同じ（Ａ = Ｂ）であっても異なって（Ａ ≠ Ｂ）いてもよい。Ａ = Ｂの場合、得られた複合体ａ２ｂは、以下においてａ３と呼ぶ３つのサブユニットからなる安定に繋ぎ止められたアセンブリーにより構成される。前駆体として利用可能な材料には、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、ポリヌクレオチド、ＲＮＡｉ、オリゴ糖、天然又は合成のポリマー物質、ナノ粒子、量子ドット、及び有機若しくは無機化合物が含まれる。潜在的に利用可能な前駆体の他の非限定的な例を、下記の表６-１０に列挙する。
構成サブユニットの解離防止にジスルフィド結合を使用することに加えて、安定係留構造体の全体的な安定性を向上させる別の方法を実践することもできる。例えば、このような目的のため、市販の若しくは研究用途の種々の架橋剤又は架橋方法を選択することができる。有用性が高いと考えられる薬剤は、グルタルアルデヒドであり、これは、構成サブユニットを架橋して安定な複合体を形成させることにより、非共有的に会合された多量体タンパク質から成る構造体の探索に広く用いられてきている（Ｓｉｌｖａ, ｅｔ ａｌ. Ｆｏｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ２００４; ４２:５１-５６）。他に興味深い方法は、タンパク質サブユニットの酸化的架橋形成を伴う２種類の化学的手法である。１つの方法は、近接標識技術（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）であり、ヘキサヒスチジンでタグ化されたタンパク質（Ｆａｎｃｙ, ｅｔ ａｌ. Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ. １９９６; ３:５５１-５５９）又はＮ末端側がグリシン-グリシン-ヒスチジンでタグ化されたタンパク質（Ｂｒｏｗｎ, ｅｔ ａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ. １９９８; ３７:４３９７-４４０６）が用いられる。これらのタグはＮｉ(ＩＩ)に固く結合し、過酸で酸化された場合に、タンパク質-タンパク質架橋形成を含む種々の酸化反応を媒介可能なＮｉ(ＩＩＩ)種を生成する。ＰＩＣＵＰ（非修飾タンパク質の光誘導性架橋形成（ｐｈｏｔｏ-ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ））と呼ばれる別の技術では[Ｒｕ(ＩＩ)(ｂｉｐｙ)３]２+、過硫酸アンモニウム及び可視光を用いて、タンパク質-タンパク質架橋形成が誘導される（Ｆａｎｃｙ ａｎｄ Ｋｏｄａｄｅｋ. Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ. １９９９; ９６:６０２０-６０２４）。しかしながら、下記において議論するように、当該技術分野では、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質又は他の高分子種に化学架橋形成させるための数多くの方法が知られており、このような既知の方法のいずれを用いても二成分複合体ａ２ｂを共有結合により安定化させることができる。
下記の実施例２３ないし３５により詳細に開示される好ましい態様では、単一特異性又は二重特異性のいずれかを示す６量体の複合体を形成することができる。このような複合体は、例えば、図１０、図１１及び図１３に開示するように、ＩｇＧ部分のＣ末端又はＮ末端のそれぞれにＡＤ２を付加させ、次いで、これを、６量体複合体を形成するために、ＤＤＤ２と結合したＦａｂ断片又は他のＤＤＤ２と結合した抗体若しくは抗体断片と結合させることで、形成することができる。実施例２３ないし３５で議論するように、このような単一特異性又は二重特異性の６量体複合体は、その親抗体又は断片と比べて高い結合親和力と向上した効力を示す。実施例２３ないし３５では、数多くの単一特異性又は二重特異性を示す６量体の安定係留構造体が開示されている。しかしながら、当業者であれば、これらの実施例が限定的なものではなく、表６-１０の一部で議論される、開示された６量体構造体に種々の抗原結合部分又は他の機能部分を組み込むことが可能であることを理解するであろう。
また、当業者であれば、上記議論でＩｇＧ又はＦａｂ断片について言及する場合、下記においてより詳細に議論する他の種類の抗体、抗体断片、又は非抗体タンパク質も置換できることを理解するであろう。安定係留構造体は、抗原結合成分及び／又はエフェクター成分の種々の組み合わせを含んでいてもよい。例えば、活性化された血小板及び組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）の両方と反応する二重特異性抗体は、血小板凝集を阻害して更なる血栓形成を防ぐだけでなく、内在性ｔＰＡを血小板表面に補給することにより、既存の血栓を溶解させることもできる（Ｎｅｂｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ. １９９１, ３:１２６-３１）。毒素（リボヌクレアーゼ等）と連結した抗原（ＣＤ７４等）と会合した内在化した腫瘍に対する多価抗体結合成分を含む安定係留構造体は、毒素を選択的に送達して標的腫瘍細胞を破壊するのに役立つであろう。ＩＬ-４Ｒの受容体の可溶性成分（ｓＩＬ-４Ｒ）とＩＬ-１３の受容体の可溶性成分（ｓＩＬ-１３Ｒ）を含む安定係留構造体は、喘息又はアレルギーの治療用の治療剤候補となるであろう。抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ Ｆａｂ断片から構成される、 ６量体の単一特異性を示す安定係留構造体は、その高い結合活性により、１価（ＲｅｏＰｒｏ、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）又は２価の類似体のいずれよりも効率的に血栓再形成を防ぐはずである。ＴＮＦα-Ｒの可溶性成分の複数のコピーを含む安定係留構造体は、慢性関節リウマチ及び特定の他の自己免疫疾患（ＡＩＤ）の治療において、Ｅｎｂｒｅｌ（Ａｍｇｅｎ）よりも効率的にＴＮＦを抑制させるはずである。
請求項に係る方法と組成物には、安定係留構造体と連結された１又は２種類以上のエフェクター又は担体から構成される複合体も含まれる。エフェクター又は担体は、例えば、化学架橋によるか、又は、以下で更に議論するに、二重特異性若しくは多重特異性を示す安定係留構造体に、疾患関連標的に対する第１の特異性とエフェクター及び／若しくはエフェクターに連結したハプテンに対する第２の特異性を持って結合することにより、安定係留構造体に非共有結合的又は共有結合的に連結されていてもよい。意図する用途にもよるが、エフェクターは、診断剤、治療剤、化学療法剤、放射線同位体、造影剤(ｉｍａｇｉｎｇ ａｇｅｎｔ)、血管新生阻害剤、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、薬物、プロドラッグ、酵素、結合分子、細胞表面レセプターに対するリガンド、キレート剤、免疫調節剤、オリゴヌクレオチド、ホルモン、光検出性標識、色素、ペプチド、毒素、造影剤(ｃｏｎｔｒａｓｔ ａｇｅｎｔ)、常磁性標識、超音波標識、アポトーシス促進剤、リポソーム、ナノ粒子、又はこれらの組み合わせから選択することができる。更にまた、複合体には、同一であるか異なっていてもよい２種類以上のエフェクター、又は、同一であるか異なっていてもよい２種類以上の担体が含まれていてもよい。エフェクターと担体は、同一の複合体中に存在していてもよい。エフェクターがキレート剤の場合、生じる複合体は、通常、金属と更に錯体形成するが、その金属は、放射性又は非放射性のいずれであってもよい。担体を含む複合体は、意図される用途のために、更に診断又は治療的機能を有する薬剤に組み込まれる。
特定の態様では、エフェクター又は担体は、例えば、下記で議論するプレターゲッティング法（ｐｒｅ-ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ）において、安定係留構造体の後に対象に投与することもできる。安定係留構造体を最初に対象に投与して、腫瘍等の疾患組織に局在化させることができる。次に、エフェクター又は担体を加えて、局在化した安定係留構造体に結合させることができる。エフェクター又は担体が、放射性核種等の毒素部分と結合している場合、このプレターゲッティング法により、対象の毒素に対する全身的曝露量を低下させ、毒素薬剤の標的組織への比例的に増加した送達が可能になる。又は、除去剤を投与して、ターゲッティング可能な構築物（ｔａｒｇｅｔａｂｌｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の投与前に局在化していない安定係留構造体を循環系から取り除くこともできる。これらの方法は、当該技術分野において知られており、米国特許第４,６２４,８４６号、国際公開公報第９２／１９２７３号、及びＳｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ. , Ｉｎｔ. Ｊ. Ｃａｎｃｅｒ ５１ : ２６６ (１９９２)にその詳細が記載されている。代表的なターゲッティング可能な構築物は、Ｘ-Ｐｈｅ-Ｌｙｓ(ＨＳＧ)-Ｄ-Ｔｙｒ-Ｌｙｓ(ＨＳＧ)-Ｌｙｓ(Ｙ)-ＮＨ２に示す構造を有していてもよく、ここで、この化合物には、Ｘ又はＹにおいて硬い酸の陽イオンキレート剤と、Ｘ又はＹの残りの部位に軟らかい酸の陽イオンキレート剤が含まれ；そして、この化合物には、少なくとも１種類の診断用又は治療用陽イオン、及び／又は１又は２種類以上のキレート化されたか若しくは化学的に結合した治療剤、診断剤又は酵素が更に含まれる。診断剤は、例えば、Ｇｄ(ＩＩＩ)、Ｅｕ(ＩＩＩ)、Ｄｙ(ＩＩＩ)、Ｐｒ(ＩＩＩ)、Ｐａ(ＩＶ)、Ｍｎ(ＩＩ)、Ｃｒ(ＩＩＩ)、Ｃｏ(ＩＩＩ)、Ｆｅ(ＩＩＩ)、Ｃｕ(ＩＩ)、Ｎｉ(ＩＩ)、Ｔｉ(ＩＩＩ)、Ｖ(ＩＶ)のイオン又はラジカルであってもよい。第２の代表的な構築物は、式Ｘ-Ｐｈｅ-Ｌｙｓ(ＨＳＧ)-Ｄ-Ｔｙｒ-Ｌｙｓ(ＨＳＧ)-Ｌｙｓ(Ｙ)-ＮＨ２に示す構造を有していてもよく、ここで、この化合物には、Ｘ又はＹにおいて硬い酸の陽イオンキレート剤又は軟らかい酸のキレート剤が含まれ、Ｘ又はＹの残りの部位には何も存在せず；そして、この化合物には、少なくとも１種類の診断用又は治療用陽イオン、及び／又は１又は２種類以上のキレート化されたか若しくは化学的に結合した治療剤、診断剤又は酵素が更に含まれる。このような態様では、Ａサブユニットには、例えば、腫瘍関連抗原に対する結合部位が含まれていてもよく、一方で、Ｂサブユニットには、エフェクター若しくは担体又はエフェクター若しくは担体と結合したハプテンに対する結合部位が含まれていてもよい。
本発明の安定係留構造体及びその複合体は、多種多様な治療用途及び診断用途への使用に適している。例えば、抗体の結合ドメインを基礎とする６価の構築物を、このような構築物が更なる機能的薬剤と結合していない治療に、裸の抗体を用いた治療と同様に用いることができる。これに代わり、これらの安定係留構造体を１又は２種類以上の機能性薬剤で誘導体化して、診断的応用又は治療的応用を可能にすることもできる。従来の結合の化学的手法をもちいて、更なる薬剤を安定係留構造体に共有結合させることもできる。
安定係留構造体の使用方法は、疾患又は他の医学的症状の検出、診断及び／又は治療を含んでいてもよい。このような状態には、癌、循環器疾患、アテローム性動脈硬化、脳卒中、神経委縮性疾患、アルツハイマー病、代謝病、過形成、糖尿病性網膜症、黄斑変性、炎症性大腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、喘息、浮腫、肺高血圧症、乾癬、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、オスラー・ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ-Ｗｅｂｅｒ）症候群、心筋の血管新生、新生血管形成斑（ｐｌａｑｕｅ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、再狭窄,血管外傷後の内膜新生、末梢血管拡張、血友病関節（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ ｊｏｉｎｔｓ）、血管線維腫,慢性炎症関連繊維症、肺線維症、アミロイドーシス、臓器移植拒絶、深部静脈血栓症又は傷の肉芽化が含まれてもよいが、これらに限定されるものではない。
特定の態様では、開示される方法及び組成物を用いて、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シドナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺症候群（ｐｏｌｙｇｌａｎｄｕｌａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、水疱性類天疱瘡、若年性糖尿病、ヘノッホ-シェーンライン紫斑病、後期連鎖球菌性腎炎（ｐｏｓｔ-ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、トロンボアンジチサビテランス（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓｕｂｉｔｅｒａｎｓ）、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ヴェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬又は線維化肺胞炎のような自己免疫疾患を治療することができる。
種々の態様が、炎症性及び免疫調節不全疾患、感染病、病的血管形成又は癌の治療方法と関係する可能性がある。上記の用途では、安定係留構造体は、(Ａ) 先天的免疫系の炎症誘発性エフェクター、(Ｂ) 凝固因子、(Ｃ) 補体因子及び補体調節タンパク質、並びに(Ｄ) 炎症性若しくは免疫調節不全疾患、又は病的血管形成又は癌と特異的に関連する標的であって、後者の標的は(Ａ)、(Ｂ)、又は(Ｃ)ではない標的、から成る群から選択される２種類の標的に結合する。少なくとも１の標的は(Ａ)、(Ｂ)、又は(Ｃ)である。適切な標的の組み合わせは、２００５年１２月８日に提出され、「炎症性及び免疫調節不全疾患、感染病、病的血管形成又は癌の免疫治療及び検出の方法並びに組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ- Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ, Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ, Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ）」と表題された米国特許出願第１１／２９６,４３２号に記載されているが、その記載内容は、参照により本明細書中に取り込まれている。結合分子が結合可能な先天的免疫系の炎症誘発性エフェクターは、炎症誘発性エフェクターサイトカイン、炎症誘発性エフェクターケモカイン又は炎症誘発性エフェクターレセプターであってもよい。適切な炎症誘発性エフェクターサイトカインには、ＭＩＦ、ＨＭＧＢ-１（ＨＭＧ ボックスタンパク質１）、ＴＮＦ-α、ＩＬ-１、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-８、ＩＬ- １２、ＩＬ- １５、及びＩＬ-１８が含まれる。炎症誘発性エフェクターケモカインの例には、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＩＬ-８、ＭＣＰ-１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ-１Ａ、ＭＩＰ-１Ｂ、ＥＮＡ-７８、ＭＣＰ-１、ＩＰ-１Ｏ、ＧＲＯＢ、及びエオタキシンが含まれる。炎症誘発性エフェクターレセプターには、ＩＬ-４Ｒ（インターロイキン-４レセプター）、ＩＬ-６Ｒ（インターロイキン-６レセプター）、ＩＬ-１３Ｒ（インターロイキン-１３レセプター）、ＩＬ-１５Ｒ（インターロイキン-１５レセプター）及びＩＬ-１８Ｒ（インターロイキン-１８レセプター）が含まれる。
結合分子は、少なくとも１種類の凝固因子、特に、組織因子（ＴＦ）又はトロンビンと特異的に反応してもよい。他の態様では、結合分子は、少なくとも１種類の補体因子又は補体調節タンパク質と特異的に反応する。好ましい態様では、補体因子は、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、及びＣ５ａから成る群から選択される。結合分子が補体調節タンパク質と特異的に反応する場合、補体調節タンパク質は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びｍＣＲＰから成る群から選択される。
特定の態様では、安定係留構造体は、癌の治療用処置に有用であろう。あらゆる種類の腫瘍及びあらゆる種類の腫瘍抗原をターゲッティングすることができると期待される。ターゲッティング可能な腫瘍の種類には、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、胆管癌、乳癌、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、食道、胃、頭部及び頸部の癌、ホジキンリンパ腫、肺癌、甲状腺髄様癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、腎癌、卵巣癌、膵癌、神経膠腫、黒色腫、肝癌、前立腺癌、及び膀胱癌が含まれる。
ターゲッティング可能な腫瘍関連抗原には、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、ＢｒＥ３抗原、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＨＬＡ-ＤＲ、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＨＣＧ及びそのサブユニット、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ-５）、ＣＥＡＣＡＭ-６、ＣＳＡｐ、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ-１、ＥＧＰ-２、Ｅｐ-ＣＡＭ、Ｂａ ７３３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、低酸素誘導因子(ＨＩＦ)、ＫＣ４抗原、ＫＳ-１抗原、ＫＳ１-４、Ｌｅ-Ｙ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＰＡＭ-４抗原、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＳ５、Ｓ１ＯＯ、ＴＡＧ-７２、ｐ５３、テネイシン、ＩＬ-６、ＩＬ-８、インシュリン成長因子-１（ＩＧＦ-１）、Ｔｎ抗原、トムソン-フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦ、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、１７-１Ａ抗原、血管新生マーカー（例えば、ＥＤ-Ｂフィブロネクチン）、癌遺伝子マーカー、癌遺伝子の産物、及び他の腫瘍関連抗原が含まれるが、これらに限定されるものではない。腫瘍関連抗原に関する最近の報告としては、Ｍｉｚｕｋａｍｉ ｅｔ ａｌ., (２００５, Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ. １１:９９２-９７); Ｈａｔｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ., (２００５, Ｃｕｒｒ. Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ５:２２９-４８); Ｖａｌｌｂｏｈｍｅｒ ｅｔ ａｌ. (２００５, Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｏｎｃｏｌ. ２３:３５３６-４４);及びＲｅｎ ｅｔ ａｌ. (２００５, Ａｎｎ. Ｓｕｒｇ. ２４２:５５-６３)が挙げられ、これらの各文献は参照により本明細書中に組み込まれている。特に好ましい態様は、ＣＤ２０又はＣＤ２２に対する結合部位を有する６価の単一特異性構築物に関するものであってもよい。他の好ましい態様は、ＣＤ２０とＣＤ２２の両方に対する結合部位を有する６価の二重特異性構築物に関するものであってもよい。
他の態様は、対象に１又は２回以上の安定係留構造体の投与量を投与することによる、対象のリンパ腫、白血病又は自己免疫障害の治療方法であって、ここで、第２の前駆体の結合部位が、リンパ球の抗原に結合し、そして第１の前駆体の結合部位が同一又は異なるリンパ球の抗原に結合する方法に関するものであってもよい。結合部位は、個別のエピトープ、又はＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、Ｂ７、ＭＵＣ１、Ｉａ、Ｉｉ、ＨＭ１.２４、ＨＬＡ-ＤＲ、テネイシン、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ＥＤ-Ｂフィブロネクチン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＮＣＡ ６６ａ-ｄ、壊死抗原（ｎｅｃｒｏｓｉｓ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＩＬ-２、Ｔ１Ｏ１、ＴＡＧ、ＩＬ-６、ＭＩＦ、ＴＲＡＩＬ-Ｒ１（ＤＲ４）及びＴＲＡＩＬ-Ｒ２（ＤＲ５）から成る群から選択される抗原のエピトープに結合してもよい。組成物は、例えば、１回の投与当たり２０ないし１５００ミリグラムのタンパク質、１回の投与当たり２０ないし５００ミリグラムのタンパク質、１回の投与当たり２０ないし１００ミリグラムのタンパク質、又は１回の投与当たり２０ないし１５００ミリグラムのタンパク質の投与量で非経口的に投与することができる。
別の態様では、安定係留構造体を用いて、細菌、ウィルス又は真菌等の病原性生命体による感染を治療することができる。治療可能な真菌の例には、ミクロスポラム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）、エピデルモフィトン（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）、スポロトリクシェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、クリプトコッカスネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、コシジオイデスインミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ヒストプラズマカプスラタム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ブラストミセスデルマチチディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）又はカンディダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）が含まれる。ウィルスの例には、ヒト免疫不全ウィルス (ＨＩＶ)、ヘルペスウィルス、サイトメガロウィルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト乳頭腫ウィルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウィルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオ ウィルス、ポリオウィルス、ヒト血清パルボ様ウィルス（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｐａｒｖｏ-ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓ）、シミアンウイルス４０、呼吸器合胞体ウィルス、マウス乳腺腫瘍ウィルス、水痘-帯状疱疹ウイルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒト Ｔ 細胞白血病ウイルス、エプスタイン-バーウイルス、マウス白血病ウィルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス又はブルータングウィルスが含まれる。代表的な細菌には、バシラスアントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ストレプトコッカスアガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、レジオネラニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、エシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ネイセリアゴノロエアエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ネイセリアメニンギチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ニューモコッカス（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、ヘモフィリスインフルエンザエＢ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ）、トレポネマパリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ライム病スピロヘータ（Ｌｙｍｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ）、シュードモナスアエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、マイコバクテリウムラプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、ブルセラアボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、マイコバクテリウムチュペルキュロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）又はマイコプラズマが含まれる。
以下に限定される訳ではないが、安定係留構造体に組み込まれる前駆体には、細菌毒素、植物毒素、リシン、アブリン,リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ Ｉ、ブドウ球菌エンテトロキシンＡ、ポークウィード抗ウィルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、シュードモナス内毒素、ランピルナーゼ（Ｒａｐ）、Ｒａｐ（Ｎ６９Ｑ）、ＰＥ３８、ｄｇＡ、ＤＴ３９０、ＰＬＣ、ｔＰＡ、サイトカイン、成長因子、可溶性レセプター成分、サーファクタントタンパク質Ｄ、ＩＬ-４、ｓＩＬ-４Ｒ、ｓＩＬ-１３Ｒ、ＶＥＧＦ１２１、 ＴＰＯ、ＥＰＯ（エリトロポイエチン）、血栓溶解剤、酵素、蛍光タンパク質、ｓＴＮＦα-Ｒ、アヴィマー（ａｖｉｍｅｒ）、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ又はナノボディー等の１又は２種類以上のタンパク質が含まれていてもよい。
別の態様では、血管新生阻害剤は、前駆体の一部若しくは全部を形成してもよく、又は安定係留構造体に結合していてもよい。代表的な有用な血管新生阻害剤には、アンジオスタチン、バキュロスタチン、カンスタチン（ｃａｎｓｔａｔｉｎ）、マスピン、抗ＶＥＧＦ 抗体若しくはペプチド、抗胎盤成長因子 抗体又はペプチド、抗Ｆｌｋ-１ 抗体、抗Ｆｉｔ- １ 抗体若しくはペプチド、ラミニン ペプチド、フィブロネクチン ペプチド、プラスミノゲンアクチベーター阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、ＩＰ-１０、Ｇｒｏ-β、トロンボスポンジン、２-メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭ１Ｏ１、マリマスタット、ペントサンポリサルフェート（ｐｅｎｔｏｓａｎ ｐｏｌｙｓｕｌｐｈａｔｅ）、アンジオポエチン２ 、インターフェロンα、ハービマイシンＡ（ｈｅｒｂｉｍｙｃｉｎ Ａ）、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋ プロラクチン断片、リノマイド（Ｌｉｎｏｍｉｄｅ）、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲ二ステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、ＴＮＰ-４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキューチン（ａｃｃｕｔｉｎ）、アンジオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ-１４７０、血小板因子 ４又はミノサイクリンが含まれる。
更なる別の態様では、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン-１、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトテシン、１０-ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン、イリノテカン（ＣＰＴ-１１）、ＳＮ-３８、カルボプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノマイシン グルクロニド、ダウノルビシン、デキサメタゾン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、２-ピロリノドクソルビシン（２Ｐ-ＤＯＸ）、シアノ-モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エチニルエストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エトポシド グルクロニド、エトポシドホスフェート、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３',５'-Ｏ-ジオレオイル-ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ-ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、ゲムシタビン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、Ｌ- アスパラギナーゼ、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、酢酸メドロプロゲステロン（ｍｅｄｒｏｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ）、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、６-メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトタン、酪酸フェニル、プレドニゾン、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ-３４１、セムスチン ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキサン、タキソール、プロピオン酸テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、べルケード（ｖｅｌｃａｄｅ）、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンクリスチン、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、オンコナーゼ（ｏｎｃｏｎａｓｅ）、ｒａｐＬＲ１、ＤＮａｓｅ Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、ポークウィード抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、シュードモナス内毒素、アンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉 ＲＮＡ、又はこれらの組み合わせといった、１又は２種類以上の治療剤を、安定係留構造体と結合させるか又は安定係留構造体内に組み込ませてもよい。
種々の態様は、安定係留構造体、及び疾患細胞のアポトーシス誘導に有用なその使用方法に関するものであってもよい。更なる詳細は、米国特許公開公報第２００５００７９１８４号に見出すことができ、この全文は、参照により本明細書中に組み込まれている。このような構造体は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１Ｏ、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ １３８、ＣＤ １４７、ＨＬＡ-ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＳＡｐ、ＣＡ-１２５、ＴＡＧ-７２、ＥＦＧＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＧＦ-ＩＲ、ｃ-Ｍｅｔ、ＰＤＧＦＲ、ＭＵＣｌ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＴＮＦＲｌ、ＴＮＦＲ２、ＮＧＦＲ、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ６、ＶＥＧＦ、ＰＩＧＦ、ＥＤ-Ｂ フィブロネクチン、テネイシン、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、及びＩＬ-６から成る群から選択される抗原に対する結合親和力を有する前駆体を含んでいてもよい。より特別な態様では、アポトーシスの誘導に有用な安定係留構造体には、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、若しくはヒト抗体、又はこれらの断片が含まれていてもよい。好ましい態様では、安定係留構造体には、抗ＣＤ７４ 対 抗ＣＤ２０、抗ＣＤ７４ 対 抗ＣＤ２２、抗ＣＤ２２ 対 抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２０ 対 抗ＨＬＡ-ＤＲ、抗ＣＤ １９ 対 抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２０ 対 抗ＣＤ８０、抗ＣＤ２ 対 抗ＣＤ２５、抗ＣＤ８ 対 抗ＣＤ２５、抗ＣＤ２ 対 抗ＣＤ１４７、抗ＣＥＡＣＡＭ５ 対 抗ＣＤ３、抗ＣＥＡＣＡＭ６ 対 抗ＣＤ３、抗ＥＧＦＲ 対 抗ＣＤ３、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ 対 抗ＣＤ３、抗 ＣＤ２０ 対 抗ＣＤ３、抗ＣＤ７４ 対 抗ＣＤ３ 及び抗ＣＣＤ２２ 対 抗ＣＤ３の組み合わせが含まれる。他の好ましい態様では、安定して繋ぎとめられた構造体は、単一特異性または多重特異性の抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＨＬＡ-ＤＲ及び／若しくは抗ＣＤ７４であってもよい。当業者であれば、多価の安定係留構造体は、例えば、ＣＤ２０若しくはＣＤ２２抗原の異なるエピトープに結合する複数の抗原結合部分を含んでいてもよく、又はこれに代わり、全て同一のエピトープに結合する単一の抗原結合部分を複数コピー含んでいてもよいことを理解するであろう。より好ましい態様では、キメラ抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体又は抗体断片は、ＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ＬＬ１（抗ＣＤ７４）、Ｌ２４３（抗ＨＬＡ-ＤＲ）及びＡ２０（抗ＣＤ２０）の可変ドメインから誘導することができる。
例示的態様の説明
特許、特許出願、論文、書籍及び論説を含むが、これらに限定されない、本出願に引用される全ての文献、又は文献の一部は、参照により、その全文が明示的に本明細書に組み込まれる。
特定の態様では、ａ２ｂの型にある新規な安定係留構造体、及びこれらの複合体の製造方法が提供される。一般的に、二成分複合体は、Ａ又はａ２と呼ばれるホモ２量体構造体であって、これに部位特異的に会合するＢ又はｂと呼ばれる第２の構造体を含む、非共有的に連結したホモ２量体から構成される。生じるａ２ｂ構造体は、非共有結合により安定化されてもよく、好ましくは、ＡとＢの間の共有結合的相互作用（例えば、ジスルフィド結合）により安定化されてもよい。Ａは２つの同一のサブユニットで形成され、各サブユニットは、２量体化及びドッキング用ドメイン（ＤＤＤ）と呼ばれるペプチド配列に結合した前駆体から構成されており、ＤＤＤは、好ましい態様では、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）から誘導される。サブユニットに含まれるＤＤＤドメインは、自然に会合して安定なホモ２量体を形成し、この会合により、次いで、固定用ドメイン（ＡＤ）と呼ばれるペプチド配列に対する高い親和性を有する結合部位が作り出されることになり、ＡＤは、例えば、種々のＡキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）内に見出され、そしてＢに含まれる。従って、Ｂは、ＡＤに結合した前駆体から構成される。
二成分複合体の会合は、ＡＤペプチドと（ＤＤＤ)２結合部位との相互作用を介して迅速に起こる。ＤＤＤペプチドは、その誘導体化がそのペプチドの２量体化する能力並びにＡＤペプチドの結合する能力に干渉しない場合には、実質的に、あらゆるポリペプチド配列内に挿入するか、又はあらゆる前駆体に繋ぎ止めることができる。同様にして、ＡＤペプチドは、その誘導体化が、ＡＤのＤＤＤホモ２量体への結合に干渉しない場合には、実質的に、あらゆるポリペプチド配列内に挿入するか、又はあらゆる前駆体に繋ぎ止めることができる。このモジュール方式（ｍｏｄｕｌａｒ ａｐｐｒｏａｃｈ）は、非常に用途が広く、この方法を用いることで、あらゆるＡをあらゆるＢと組み合わせて、Ａの前駆体から得られる２つのサブユニット（ａ２）とＢの前駆体から得られる１つのサブユニット（ｂ）を含む二成分アセンブリーを形成することが可能である。ＡとＢの両方の前駆体に、第２の抗体ドメインと会合して抗原結合部位（例えば、Ｆａｂ又はｓｃＦｖ）を作り出せる抗体ドメインが含まれる場合、生じるａ２ｂ複合体は、二重特異性を示し且つ３価体である。ある態様では、二成分複合体は、例えば化学的結合によって、リガンド若しくは薬物などのエフェクターに、デキストラン若しくはナノ粒子等の担体に、又はエフェクター及び単体の両方に連結されて、このような修飾によって果たされる更なる用途が可能となる。好ましい態様では、上記主題に沿った変更を施して、ホモ６量体又はヘテロ６量体のいずれかの６量体を調製することができる。
二成分複合体の安定性は、Ａに含まれるＤＤＤによるＢに含まれるＡＤに対する結合親和力に主として依存しており、平衡サイズ排除ＨＰＬＣ分析によると、Ｃ末端に融合したＡＤ１構築物（ｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１、実施例３に記載）とＣ末端又はＮ末端に融合したＤＤＤ１構築物（Ｃ-ＤＤＤ１- Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４又はＮ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ- １４、両方とも実施例４に記載）の間に形成される２種類のプロトタイプのａ２ｂ構造体（実施例５に記載）では８ ｎＭ以下であると評価されたことから、ａ２ｂ複合体に含まれる共有結合したＡ及びＢは、個々のサブユニットの不所望な解離を防ぎ、それによってインビボでの応用を容易なものにする。二成分複合体を安定化させるため、システイン残基をＤＤＤ配列とＡＤ配列の両方の戦略上有利な位置に導入してＤＤＤとＡＤの間にジスルフィド結合を形成可能にすることができる。他の方法又はストラテジーを適用して、ａ２とｂの架橋形成を介して安定な複合体を形成させることもできる。例えば、構成サブユニットは、グルタルアルデヒド又はＰＩＣＵＰ法を用いて、比較的低い効率で、比較的低い特異性をもって相互に共有結合させることができる。共有結合による架橋形成の他の既知の方法も用いることができる。
定義
本明細書で用いる「１つ（ａ）」又は「１つ（ａｎ）」は、１又は２個以上の事項を意味する。
本明細書で用いる「及び（ａｎｄ）」並びに「又は（ｏｒ）」は、接続的又は離接的ないずれかを意味するものとして用いてもよい。即ち、これら両方の用語は、他に記載のない限り、「及び／又は」と同等であると理解されなければならない。
「２量体化及びドッキング用ドメイン（ＤＤＤ）」は、ＤＤＤを含む２つのホモ単量体を自然に２量体化させるペプチド配列を指す。生じるホモ２量体は、ＤＤＤ配列内に、アンカードメインに対するドッキング部位を含む。代表的なＤＤＤ配列は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼから得ることができるが、他の既知のＤＤＤ配列を用いてもよい。
「アンカードメイン（ＡＤ）」は、２量体化したＤＤＤ配列に対する結合親和力を有するペプチド配列である。代表的なＡＤ配列は、Ａキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）のいずれからも得ることができるが、他の既知のＡＤ配列を用いてもよい。
「前駆体」は、より安定で、決定的又は最終的な産物がそれから形成される物質の平易かつ通常の意味に従って用いられる。
本明細書で用いる「結合分子」、「結合部分」又は「ターゲッティング分子」は、標的の分子、細胞、複合体及び／又は組織に特異的に結合可能なあらゆる分子である。結合分子には、抗体又はその断片、類似体若しくは模倣体、アビマー、アプタマー又はターゲッティングペプチドが含まれるが、これらに限定される訳ではない。
本明細書で用いる「抗体」は、完全長（即ち、天然の、又は正常なイムノグロブリン遺伝子断片を用いた組換えプロセスにより形成された）のイムノグロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、又は、抗体断片の様な、イムノグロブリン分子の免疫活性（即ち、特異的結合性）を示す部分若しくは類似体を指す。
「抗体断片」とは、Ｆ(ａｂ)２、Ｆ(ａｂ')２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ等のような抗体の一部分である。構造の如何に関わらず、抗体断片は、その完全な抗体が認識する抗原と同一の抗原に結合する。また、「抗体断片」という用語には、特異的な抗原と結合して複合体を形成することで抗体のように作用するあらゆる合成タンパク質又は遺伝子組換えタンパク質も含まれる。例えば、抗体断片には、重鎖と軽鎖の可変領域から成る「Ｆｖ」断片のような可変領域、軽鎖と重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって連結された組換え１本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）、並びに超可変領域を模倣するアミノ酸残基から成る最小認識ユニット（ＣＤＲ）からなる単離された断片が含まれる。
「エフェクター」とは、選択した結果をもたらす原子、分子又は化合物である。エフェクターには、治療剤及び／又は診断剤を含めてもよい。
「治療剤」は、疾患の治療に有用な原子、分子又は化合物である。治療剤の例には、抗体、抗体断片、薬物、毒素、酵素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、キレート剤、ホウ素化合物、光活性薬剤、色素及び放射性同位体が含まれる。他の有用な治療剤と方法の例は、米国出願公開公報第２００５０００２９４５号、同第２００４００１８５５７号、同第２００３０１４８４０９号及び同第２００５００１４２０７号に開示されており、これら各文献は参照により本明細書に組み込まれる。
「診断剤」は、疾患の診断に有用な、原子、分子又は化合物である。有用な診断剤には、放射性同位体、色素（ビオチン-ストレプタビジン複合体等）、造影剤、蛍光化合物又は蛍光分子、及び磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）のための促進剤（例えば、常磁性イオン等）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
「免疫複合体」は、原子、分子又はより高次の構造体（例えば、担体、治療剤、又は診断剤）と結合する分子（例えば、抗体成分）の複合体である。
「裸の抗体（ｎａｋｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、他のいずれの薬剤とも結合していない抗体である。
「担体」とは、治療剤又は診断剤と会合して、これらの薬剤の標的細胞への送達を促進可能な原子、分子又はより高次の構造体である。担体としては、脂質（例えば、より高次の構造体を形成可能な両親媒性脂質等）、多糖（デキストラン等）、又は、ミセル、リポソーム、又はナノ粒子等の他のより高次の構造体を挙げることができる。
本明細書で用いる「抗体融合タンパク質」とは、同一又は異なる特異性を有する同一又は異なるｓｃＦｖ若しくは抗体断片の２又は３つ以上が連結した、組換え技術により作製された抗原結合分子である。融合タンパク質の価数は、その融合タンパク質が、単一の抗原又はエピトープに対して幾つの結合アーム又は結合部位を持つかを示す；即ち、１価、２価、３価又は多価等。多価の抗体融合タンパク質とは、１の抗原に対する結合において複数の相互作用を生じさせ、従って、その抗原に対する結合活性を増大できることを意味する。特異性は、１の抗体融合タンパク質が何種類の抗原又はエピトープと結合可能であるかを示す；即ち、単一特異性、二重特異性、三重特異性、多重特異性等。これらの定義によれば、例えばＩｇＧ等の天然抗体は、２本の結合アームを持つので２価であるが、１種類のエピトープにしか結合しないので単一特異性となる。例えば、同一の抗体と反応性を示す２つの結合部位を有するジアボディー等、単一特異性の多価融合タンパク質は、１のエピトープに対して２個以上の結合部位を有するが、この１種類のエピトープにしか結合しない。融合タンパク質は、単一の抗体成分、異なる抗体成分の多価若しくは多重特異性を示す組合せ、又は複数コピーの同一の抗体成分を含んでいてもよい。融合タンパク質は、更に、抗体又は抗体断片と治療剤とを含んでていもよい。このような融合タンパク質に適した治療剤の例としては、免疫調節剤（「抗体-免疫調節剤融合タンパク質」）及び毒素（「抗体-毒素融合タンパク質」）が挙げられる。１の好ましい毒素は、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、好ましくは組換えＲＮａｓｅを含む。
本明細書に記載する抗体又は免疫複合体の製剤若しくは組成物は、投与量が生理学的に有意なものである場合には、「治療上有効量」で投与されると言われる。薬剤は、その存在によりレシピエントの哺乳動物に検出可能な生理学的変化が生じた場合に生理学的に有意なものとなる。特定の態様では、抗体製剤は、その存在により、抗腫瘍反応が引き起こされるか、又は自己免疫疾患状態の兆候及び症状が軽減された場合に、生理学的に有意なものとなる。生理学的に有意な作用とは、レシピエント哺乳動物内での、標的細胞の増殖阻害又は死滅に至る、体液性及び／又は細胞性免疫反応の誘起であってもよい。「治療上有効量」とは、対象内で最も好ましい作用を起こす薬剤量に限定されるものではなく、対象、細胞、組織又は器官に対してその薬剤のあらゆる可能な既知の作用を生じさせる量を指す場合もある。
モジュール式サブユニットから成る安定係留アセンブリーの作製方法
開示される方法及び組成物により、モジュール式サブユニットから成る安定係留アセンブリーを作成するための足場となる技術が提供される。１の態様は、好ましくは個別に作製される２種類の特定の成分ＡとＢから形成される安定係留二成分複合体に関する。しかしながら、別の態様では、例えば、ＡとＢの両方をコードするベクター又はＡとＢを別々にコードする２種類の異なるベクターで単一のセルラインをトランスフェクトする等により、ＡとＢを両方一緒に作製してもよい。ＡとＢが両方ともＦａｂ断片である場合には、ＡとＢを同時作製した場合には、軽鎖の混ざり合いにより不均一な産物が生じることになるので、個別に作製することが好ましい。
ある態様では、２つの同一のサブユニット（ａ２）から成るＡは、１つのサブユニット（ｂ）から成るＢと組み合され、ａ２ｂの構成にあるアセンブリーが形成される。ＡとＢの会合は、それぞれＡとＢに組み込まれたＤＤＤ配列とＡＤ配列間の強力な結合相互作用により、部位特異的で自発的なものとなる。ＡとＢは両方ともいかなる物質であってもよく、ＤＤＤが連結するＡの前駆体は、ＡＤが連結するＢの前駆体と異なっていてもよく、又は同一であってもよい。後者の場合、生じるａ２ｂ複合体は、ａ３と呼ばれることになり、同一ではあるが、ＤＤＤとＡＤの両方に連結した前駆体をそれぞれ含む３個のサブユニットから構成される。
請求項に係る方法と組成物のモジュール式の特性により、あらゆるＡとあらゆるＢの組み合わせが可能になる。ＡとＢに付加されるか又は組み込まれる前駆体の種類については、これらの前駆体が、ＤＤＤの２量体化又はＤＤＤのＡＤへの結合に干渉しない限り、実質的に何らの制限を受けることもない。組換え技術によって作製する場合、ＡとＢは、独立して、異なる宿主細胞内で作り出され、精製され、そして保存されることも可能である（又は、これに代わり、上記で議論したように同一の宿主細胞内で作り出される）。しかしながら、会合させる前のＡとＢの精製の必要性については、絶対的に要求されるわけではない。ＡとＢを含む細胞抽出物又は培養培地を、適切な条件下で直接混合して二成分複合体を形成させてもよく、次いで、この二成分複合体を酸化してジスルフィド結合により安定化させ、その後に精製してもよい。特定の用途においては、Ｂを、精製した後でＡと組み合わせる前に、エフェクター又は担体と結合させることが望ましい。また、これに代わり、Ａを、精製した後でＢと組み合わせる前に、エフェクター又は担体と結合させることが望ましい。また、ＡとＢの両方を、組み合せる前に、エフェクター又は担体を用いて修飾することが望ましい。更に、特定の用途においては、ａ２ｂ複合体をエフェクター又は担体と結合させることが望ましい場合もある。ＡとＢが同一の宿主細胞内で作り出される場合、これらは自然にａ２ｂ複合体へと組み合さるであろう。
好ましい態様では、自然界で生じるｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の調節サブユニットとＡキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）のアンカードメインとの間の特異的なタンパク質／タンパク質相互作用を利用する。ＰＫＡについては、１９６８年に最初の報告がなされた（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ, Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２４３:３７６３-６５ (１９６８)参照）。調節（Ｒ）サブユニットの２量体により不活性型に保たれる２つの触媒サブユニットから成るホロ酵素構造が、１９７０年代半ばに解明された（Ｃｏｒｂｉｎ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２４８:１８１３- ２１ (１９７３)参照）。２種類のＲサブユニット（ＲＩ及びＲＩＩ）が見つかり、そのそれぞれがα型とβ型のアイソフォームを有する。Ｒサブユニットは、安定な２量体としてのみ単離されており、２量体化ドメインは、アミノ末端側の最初の４４残基から成ることが証明されている（Ｈａｕｓｋｅｎ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２７１:２９０１６-２２ (１９９６)参照）。広範囲なセリン／スレオニンキナーゼであるＰＫＡのシグナル伝達特異性は、Ａキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）と呼ばれる結合タンパク質を介したホロ酵素の区画化を通して達成される（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２６５:２１５６１-６６ (１９９０)）。
最初のＡＫＡＰである、微小管関連タンパク質-２は、１９８４年にキャラクタリゼーションが行われた（Ｌｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ, Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ ＵＳＡ. ８１:６７２３-２７ (１９８４)）。現時点では、酵母からヒトまでの種の範囲内で、５０種類を超える、構造上の多様性を示すＡＫＡＰが同定されている（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔ Ｒｅｖ ＭｏＩ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ. １２:９５９-７０ (２００４)参照）。ＡＫＡＰのＰＫＡアンカードメインは、１４-１８残基の両親媒性へリックスである（Ｃａｒｒ ｅｔ ａｌ. Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２６６:１４１８８-９２ (１９９１)参照）。ＰＫＡアンカードメインのアミノ酸配列は、ＡＫＡＰの間でも非常に多様性に富み、ＲＩＩ２量体への結合親和力は２ - ９０ ｎＭの範囲で変化し、一方でＲＩ２量体への結合親和力は約１００倍弱い（Ａｌｔｏ ｅｔ ａｌ. Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ ＵＳＡ. １００:４４４５-５０ (２００３)参照）。アンカードメインは、ＲＩＩのアミノ末端側の最初の２３残基によって形成されるＲＩＩの２量体の疎水性面に結合する（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ., Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ.. ６:２１６-２１ (１９９９)）。従って、ＲＩＩの２量体化ドメインとＡＫＡＰ結合ドメインは、両方とも同じ４４個のアミノ酸から成る配列内に位置している。更に、ＡＫＡＰは、ＲＩＩの２量体にのみ結合し、単量体に結合することはない。この相互作用の構造モデルを図７に示す。
ＤＤＤ配列とＡＤ配列の相互作用により形成される非共有結合による複合体は、共有結合により安定化させることで、インビボでの用途に使用できる。これは、ＤＤＤ配列とＡＤ配列の両方の戦略的に有利な位置にシステイン残基を導入することにより（ＤＤＤ２とＡＤ２について示されるように）、ジスルフィド結合の形成を促進することができる。これに代わり、別の既知の共有結合的架橋の種類を用いることもできる。
二成分複合体の２つの成分（ＡとＢ）は、組換え技術で作製する場合、同一の宿主細胞内で合成してもよいが、より好ましくは、２つの別々の宿主細胞セルラインにて作製される。Ａを合成させる発現ベクターには、ＤＤＤ１又はＤＤＤ２といった、ＰＫＡのＲサブユニットのＤＤＤをコードする配列と融合した対象ポリペプチド（Ａ）のＤＮＡ配列が含まれるが、このＤＤＤは、ＲＩα、ＲＩβ、ＲＩＩα、ＲＩＩβ、又は他のあらゆる天然若しくは合成の機能的類似体の最初の３０個を超えるアミノ酸から成るものであってもよい。ＤＤＤは、Ａのアミノ末端又はカルボキシル末端に、直接的に結合されてもよいが、好ましくは、適切な長さと組成のアミノ酸残基を含むスペーサーと共に結合させることができる。これに代わり、ＤＤＤの結合活性とポリペプチド融合パートナーの所望の活性が弱められない限り、ＤＤＤは、融合タンパク質内部に配置することができる。合成の際、Ａ／ＤＤＤ融合タンパク質は、ＤＤＤ１と排他的に安定なホモ２量体を形成するか、大部分においてＤＤＤ２と安定なホモ４量体を形成する。安定なホモ６量体又はヘテロ６量体の形成方法については、下記の実施例にて議論する。
Ｂを合成させる第２の発現カセットは、Ａを合成させるベクターと同一のベクター内に存在してもよいが、好ましくは別個のベクター内に存在して、ＡＤ１又はＡＤ２等のアンカードメイン（ＡＤ）をコードする配列と融合した対象ポリペプチド（Ｂ）のＤＮＡ配列を含み、アンカードメインは、あらゆるＡＫＡＰタンパク質、又は天然若しくは米国出願公開公報第２００３／０２３２４２０Ａ１号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示される合成類似体から得ることが可能である。ＡＤは、Ｂのアミノ末端又はカルボキシル末端に、直接的に結合されてもよいが、好ましくは、適切な長さと組成のアミノ酸残基を含むスペーサーと共に結合させることができる。ジスルフィド還元剤の存在下でＢ／ＡＤ２融合タンパク質(ｂ)とＡ／ＤＤＤ２融合タンパク質（主にａ４）を混合することにより、ａ２ｂから成る二成分複合体が生じ、この複合体は、次いで、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の適切な酸化剤の添加により促進されるジスルフィド結合の形成によって安定化される。
サブユニットのモジュール式の特性により、あらゆるＤＤＤ２ポリペプチド２量体とあらゆるＡＤ２ポリペプチドの組み合わせが可能になる。種々のモジュール式のサブユニットのストックは、精製された産物として、又は、非精製細胞培養上清として個別に保存して、その後、所望の時点で組み合わせて種々のａ２ｂ構造体を得ることができる。
更なる態様では、適切な結合化学物質を用いて、薬物若しくはキレート剤のようなエフェクター又はデキストラン若しくはナノ粒子のような担体を、Ａ又はＢのいずれかに、その精製後に結合させてもよい。これに代わり、このような修飾を、構造体の形成と精製後にその構造体に施すか、又はＡとＢの両方に混合前に施すこともできる。
組換え抗体結合ドメインから得られるモジュール式サブユニットの安定係留アセンブリー 開示される方法及び組成物は、単一特異性又は二重特異性であってよい組換え抗体を基礎とする多価結合構造体を提供するために有用である。例えば、ＤＤＤ２配列を単鎖Ｆｖと融合させて単一特異性結合構造体を得ることができる。より一般的には、ＤＤＤ配列は、抗体の可変ドメインと融合することができ、それは相補的抗体の可変ドメインと会合して、抗原結合部位を形成することができる。例えば、ＤＤＤ１又はＤＤＤ２配列を、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインを含む抗体配列（Ｆｄ／ＤＤＤ）、又は、これに代わりＶＬドメインとＣＬドメイン（Ｌ／ＤＤＤ）に融合させることができる。次いで、Ｆｄ／ＤＤＤ又はＬ／ＤＤＤを、それぞれ相補的なＬ又はＦｄと会合させて、Ｆａｂ／ＤＤＤを形成させ、更には、Ｆａｂ／ＤＤＤ１の２量体又はＦａｂ／ＤＤＤ２の４量体／２量体を形成させることができる。
同様に、ＡＤ２等のＡＤ配列を、１本鎖Ｆｖ融合させることもできるが、又は、より一般的に、ＶＨドメインとＣＨ１を含む抗体配列（Ｆｄ／ＡＤ２）と融合させることも可能であり、この抗体配列は、同一抗体由来のＬ鎖とペア形成した場合にＦａｂ／ＡＤ２を形成する。これに代わり、ＡＤ２等のＡＤ配列を、ＶＬドメインとＣＬドメインを含む抗体配列と融合させることも可能であり、この抗体配列は、同一抗体由来のＦｄ鎖とペア形成した場合にＦａｂ／ＡＤ２を形成する。Ｆａｂ／ＤＤＤ２の４量体／２量体をＦａｂ／ＡＤ２と混合して、その後この混合物を還元して酸化すると、単一特異性又は二重特異性であってもよい、３価の結合構造体から成る安定係留アセンブリーが生じる。
結合構造体のＶＨ領域とＶＬ領域は、「ヒト化」モノクローナル抗体又はヒト抗体から得ることができる。これに代わり、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域は、イムノグロブリンのコンビナトリアルライブラリーから単離したヒト抗体断片から得た配列を含んでいてもよい。例として、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ., ＭＥＴＨＯＤＳ: Ａ ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２: １１９ (１９９１)、及び Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ., Ａｎｎ. Ｒｅｖ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １２: ４３３ (１９９４)を参照。ヒトイムノグロブリンのファージライブラリーの作製に有用なクローニングベクターと発現ベクターは、例えば、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ラホーヤ、カリフォルニア州）から得ることができる。
ヒト抗体のＶＨ配列又はＶＬ配列は、マウス内で作製したヒトモノクローナル抗体から得てもよい。このような抗体は、抗原投与に応じて特定のヒト抗体を作り出すよう「操作された」トランスジェニックマウスから得られる。この技術では、内在性の重鎖と軽鎖の遺伝子座がターゲッティングにより破壊された胚性幹細胞から発生したマウス種内にヒト重鎖と軽鎖の遺伝子座の成分が導入される。そのトランスジェニックマウスは、ヒト由来抗原に特異的なヒト抗体を合成可能であり、このマウスを用いてヒト抗体を分泌するハイブリドーマを作製することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ. ７: １３ (１９９４), Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ ３６８: ８５６ (１９９４)及び Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ., Ｉｎｔ. Ｉｍｍｕｎ. ６: ５７９ (１９９４)に記載されている。
抗体断片を含む組換え融合タンパク質の一般的な製造方法
特定のエピトープを認識する抗体断片をコードする核酸配列は、当該技術分野でよく知られる技法によって得ることができる。例えば、所望の特異性を有する抗体を分泌するハイブリドーマを用いて、例えば、ＰＣＲ又は従来のｃＤＮＡクローニング技術等の既知の技法を用いて調製可能な抗体をコードするＤＮＡを得ることができる。これに代わり、Ｆａｂ'発現ライブラリー又は抗体ファージディスプレーライブラリーを構築して、所望の特異性を有する抗体断片をスクリーニングすることもできる。
抗体断片をコードする核酸は、次いで、ＤＤＤ又はＡＤのいずれかをコードする核酸へ、直接又はペプチドスペーサーをコードする配列を介してライゲーションすることができる。これらの種類の融合タンパク質をコードする核酸配列の製造方法は、当該技術分野でよく知られており、実施例において更に提示される。
別の態様では、更なるアミノ酸残基を、Ａ／ＤＤＤ又はＢ／ＡＤから構成されるモジュール式サブユニットのＮ末端又はＣ末端のいずれかに添加してもよく、この場合、正確な融合部位は、ＤＤＤ又はＡＤがＮ末端又はＣ末端（又は内部の位置）のいずれに結合しているかに依存するであろう。更なるアミノ酸残基には、ペプチドタグ、シグナルペプチド、サイトカイン、酵素（例えば、プロドラッグ活性化酵素等）、ホルモン、毒素、ペプチド薬物、膜相互作用性ペプチド、又は他の機能性タンパク質が含まれていてもよい。
所望の宿主細胞内での組換えタンパク質の製造方法は、当該技術分野でよく知られている。精製を容易化するため、安定係留構造体に、ＦＬＡＧ配列又はポリＨＩＳ配列等の適切なペプチドタグを含ませて、適切なアフィニティーカラムを用いてその精製を促進してもよい。
安定係留構造体の構成サブユニットの発現に適した代表的な発現系は、ｐｄＨＬ２ベクターであり、このベクターは、メトトレキサート処理によりセレクションと増幅を可能にする増幅可能なマウスｄｈｆｒ遺伝子を有する。Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５:１９１ (１９８９)を参照。ｐｄＨＬ２ベクターにより、２つのメタロチオネインプロモーターとＩｇＨエンハンサーによって別々に制御される２つの遺伝子の独立した発現が可能となる。
安定係留構造体の構成サブユニットの発現に適した宿主細胞又はセルラインは、当業者に知られている。ヒト宿主細胞を用いると、発現されるあらゆる分子にヒトのグリコシル化パターンの修飾を施すことができる。しかしながら、開示される方法に関して、ヒト宿主細胞が必須であるか又は好ましいとされるとは示されていない。
例として、安定係留構造体の構成サブユニットをコードする、直鎖状にされたｐｄＨＬ２ベクターを、エレクトロポレーションによりＳｐ２／０等のマウス骨髄腫セルラインにトランスフェクトすることができる。セレクションは、０.０５-０.１ μＭのメトトレキサートを含有する培地中で細胞をインキュベートすることにより、トランスフェクションの４８時間後から開始することができる。次いで、メトトレキサート濃度を段階的に５ μＭまで増加させて、選択したクローンを増幅させることができる。
安定係留構造体の複合体
上述の安定係留構造体にさらなる部分を複合体形成させることができる。例えば、薬物、トキシン、放射性化合物、酵素、ホルモン、細胞毒性タンパク質、キレート、サイトカイン、及びその他の機能剤を、安定係留構造体の１又は２個以上のサブユニットに複合体形成させることができる。複合体形成は、例えば、側鎖にアミノ基、カルボキシル基、チオール基、又はヒドロキシル基を有するアミノ酸残基への共有結合により可能である。例えば、ジイソシアネート、ジイソチオシアネート、ビス（ヒドロキシスクシンイミド）エステル、カルボジイミド、マレイミド‐ヒドロキシスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒドなど、種々の従来のリンカーをこの目的のために使用することができる。安定係留構造体への剤の複合体形成は、未修飾構造に含まれる各サブユニットの活性に著しい影響を与えないことが好ましい。モジュールのサブユニットに対して別々に複合体形成を行って、その後にサブユニットを集合させて安定係留構築物を構築することができ、又は、別の選択肢として、完成した安定係留構築物若しくは安定係留構築物を形成する中間体を用いて複合体形成を行うこともできる。さらに、細胞毒性剤又はその他の剤をまずポリマー担体へ結合させ、続いてそれを安定係留構造体へ複合体形成させることもできる。この方法については、本明細書に参照することで組み入れられる、Ｒｙｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ, ７５：３８６７‐３８７０，１９７８；米国特許第４,６９９,７８４号、及び米国特許第４,０４６,７２２号を参照のこと。
本明細書で述べる複合体は、本技術分野で公知の種々の方法で作製することができる。例えば、安定係留構造体を１３１Ｉで放射標識し、そして脂質と複合体形成することにより、得られた複合体はリポソームを形成することができる。リポソームは、１若しくは２種類以上の治療薬（例えば、ＦＵｄＲ‐ｄＯなどの薬物）又は診断薬を取り込むことができる。又は、別の選択肢として、安定係留構造体は、担体に加えて１３１Ｉ（例えば、チロシン残基に）及び薬物（例えば、リシン残基のイプシロンアミノ基に）と複合体形成することができ、担体がさらなる治療薬又は診断薬を取り込むことができる。治療薬及び診断薬は、安定係留構造体の１又は２個以上のサブユニットと共有結合することができる。
リポソーム及びミセルの形成は本技術分野において公知である。例えば、Ｗｒｏｂｅｌ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（１９９５），１２３５：２９６‐３０４；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９９），５１：１０９９‐１１０５；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（２０００），２０５：１０１‐１０８；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９９４），８３：７２‐７５；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．（２００２），１：３３７‐３４６；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００３），１００：６０３９‐６０４４；米国特許第５,５６５,２１５号；米国特許第６,３７９,６９８号;及び米国特許出願第２００３／００８２１５４号を参照のこと。
ポリマー、シリカ、若しくは金属から形成され、薬物送達若しくは画像法に有用であるナノ粒子又はナノカプセルに関しても報告がある。例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０００），１１：２１５‐２１７；米国特許第５，６２０，７０８号；米国特許第５，７０２，７２７号；及び米国特許第６，５３０，９４４号を参照のこと。抗体又は結合分子とリポソームとの複合体形成による治療薬又は診断薬のための標的化担体の形成に関して報告がなされている。例えば、Ｂｅｎｄａｓ，Ｂｉｏｄｒｕｇｓ（２００１），１５：２１５‐２２４；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，ＭｏＩ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ（２００２），１：３３７‐３４６；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ（２００３），１００：６０３９‐６０４４；Ｂａｌｌｙ， ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．（１９９８），８：２９９‐３３５；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９９４）， １０９：７３‐８１；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９７），４９：１６‐２１；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ａｎｔｉ‐ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ（１９９８），１３：４５３‐４６１を参照のこと。また、米国特許第６,３０６,３９３号；米国特許出願第１０／３５０,０９６号；米国特許出願第０９／５９０,２８４号、及び、１９９９年６月９日出願の米国特許出願第６０／１３８,２８４号も参照のこと。これらの文献はすべて参照することで本明細書に組み入れられる。
広範囲に及ぶ種々の治療薬及び診断薬は、これらを有利に用いて安定係留構造体の複合体を形成することができ、又は、安定係留構造体の認識部位と結合するハプテンと結合することができる。診断薬としては、放射性同位元素、ＭＲＩ用の増感剤又は超音波イメージング用の造影剤、及び蛍光物質を挙げることができる。多くの適切なイメージング剤が本技術分野で公知であり、それらをタンパク質又はペプチドへ結合させる方法も公知である（例えば、共に本明細書に参照することで組み入れられる米国特許第５,０２１，２３６号及び第４,４７２,５０９号を参照のこと）。特定の結合方法では、例えばタンパク質又はペプチドへ結合するＤＴＰＡなどの有機キレート化剤を用いた金属キレート錯体の使用が含まれる（米国特許第４,４７２，５０９号）。
安定係留構造体に放射性金属又は常磁性イオンを組み込むためには、まず、放射性金属又は常磁性イオンと結合する同一のキレート形成基が複数付加された担体と安定係留構造体とを反応させる必要のある場合がある。そのような担体としては、ポリリジン、多糖類、又は、例えば本目的に有用であることが公知であるエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビスチオセミカルバゾン、ポリオキシムなどのキレート形成基が結合することができる側基を有する誘導体化された若しくは誘導体化可能なポリマー体が挙げられる。キレートを含有する担体は、凝集及び免疫活性の失活を最小限に抑えるような方法で、通常の化学反応によって安定係留構造体と結合することができる。
このような複合体を作製するために適用されるその他の、より特殊な方法及び試薬は、その全文が参照することで本明細書に組み入れられる、米国特許第４，８２４，６５９号に開示されている。特に有用な金属‐キレートの組み合わせには、２‐ベンジル‐ＤＴＰＡ並びにそのモノメチル及びシクロへキシル類似体を含み、診断用の同位体と共に一般的なエネルギー範囲である６０乃至４０００ｋｅＶで使用される。有用な診断用核種の例としては、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、又は１１１Ｉｎが挙げられる。同じキレートでマンガン、鉄、及びガドリニウムなどの非放射性金属と錯体化したものは、本明細書で述べる安定係留構造体及び担体と共に用いられ、ＭＲＩに有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、及びＴＥＴＡなどの大環状キレートは、種々の金属及び放射性金属、最も詳細には、それぞれが、放射性核種であるガリウム、イットリウム、及び銅と共に使用される。このような金属‐キレート錯体は、環サイズを対象金属に合わせることによって非常に安定化することができる。２２３Ｒａと錯体形成する大環状ポリエーテルなど、他の環タイプのキレートを使用することもできる。
治療薬としては、例えば、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィロトキシン、タキサン、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗生物質、Ｃｏｘ‐２阻害剤、有糸分裂阻害剤、抗血管新生剤、及びアポトーシス促進剤、特にはドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、ＣＰＴ‐１１、カンプトテシン、並びにこれらの種類の及び他の種類の抗癌剤、などの化学療法薬が挙げられる。その他の癌に対する化学療法薬としては、ナイトロジェンマスタード、アルキルスルホン酸、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、プラチナ配位錯体、ホルモン、などが挙げられる。適切な化学療法薬は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１９ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．１９９５）、及びＧＯＯＤＭＡＮ ＡＮＤ ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ，７ｔｈ Ｅｄ．（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．１９８５）、並びにこれらの刊行物の改訂版に記載されている。試験薬などのその他の適切な化学療法薬は、当業者に公知であり、本技術分野で公知の方法を用いて本明細書で述べる安定係留構造体と複合体形成することができる。
別の治療薬の種類は、α‐粒子（２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃなど）、β‐粒子（３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６６Ｄｙ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅなど）、又はオージェ電子（１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、６７Ｇａ、１９１Ｏｓ、１９３ｍＰｔ、１９５ｍＰｔ、１９５ｍＨｇなど）を放出する放射性核種から成る。安定係留構造体は、上記の１又は２種類以上の放射性核種により、診断薬に関して述べた方法を用いて標識することができる。
検出可能な標識（例：蛍光分子）又は細胞毒性剤（例：放射性ヨウ素）を含有する適切なペプチドを、安定係留構造体と共有結合、非共有結合、又はその他の形で結合させることができる。例えば、治療に有用な複合体は、光活性剤又は色素を安定係留構造体に取り込むことによって得ることができる。蛍光色素などの蛍光組成物、及び可視光応答性のポルフィリンなどのその他の色素原又は色素を用い、病変部へ適切な光を当てることによって病変部を検知し、治療することが行われている。治療上これは、光放射、光線療法、又は光力学治療と呼ばれる。Ｊｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ＰＨＯＴＯＤＹＮＡＭＩＣ ＴＨＥＲＡＰＹ ＯＦ ＴＵＭＯＲＳ ＡＮＤ ＯＴＨＥＲ ＤＩＳＥＡＳＥＳ（Ｌｉｂｒｅｒｉａ Ｐｒｏｇｅｔｔｏ １９８５）；ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇｈ，Ｃｈｅｍ．Ｂｒｉｔａｉｎ（１９８６），２２：４３０、を参照のこと。さらに、光線療法のためにモノクローナル抗体を光活性化色素と結合させることも行われている。Ｍｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８３），１３０：１４７３；同著者，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９８５），４５：４３８０；Ｏｓｅｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６），８３：８７４４；同著者，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．（１９８７），４６：８３； Ｈａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．（１９８９），２８８：４７１；Ｔａｔｓｕｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｓｅｒｓ Ｓｕｒｇ． Ｍｅｄ．（１９８９），９：４２２；Ｐｅｌｅｇｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ（１９９１）， ６７：２５２９、を参照のこと。内視鏡、又は腹腔鏡への応用も意図している。内視鏡を用いた検出及び治療の方法は、参照することで本明細書にその全文が組み入れられる米国特許第４,９３２,４１２号; 米国特許第５,５２５,３３８号; 米国特許第５,７１６,５９５号; 米国特許第５,７３６,１１９号; 米国特許第５，９２２,３０２号; 米国特許第６,０９６,２８９号;及び米国特許第６,３８７,３５０号に記載されている。
特定の態様では、本明細書で述べる新規な構築物及び方法は、介入治療のためのＲＮＡｉの標的化送達に有用である。送達運搬体は、その前駆体としてヒトプロタミン（約５０個のアミノ酸残基のペプチド）と融合した内在性の抗体結合ドメインを有する安定係留構造体を用いることができる。有用なａ２構築物の例としては、ＶＨ‐ＣＨ１‐ｈＰ１‐ＤＤＤ１／／ＶＬ‐ＣＬ又はＶＨ‐ＣＨ１‐ｈＰ２‐ＤＤＤ１／／ＶＬ‐ＣＬであり、ここでｈＰ１及びｈＰ２はそれぞれヒトプロタミン１及びヒトプロタミン２であり、どちらもインビボで使用した場合に安定なＤＮＡ複合体を形成することができる（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：７０９‐７１７，２００５； Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１３：１９４‐１９５，２００６）。有用なａ４構築物の例としては、ＶＨ‐ＣＨ１‐ｈＰ１‐ＤＤＤ２／／ＶＬ‐ＣＬ又はＶＨ‐ＣＨ１‐ｈＰ２‐ＤＤＤ２／／ＶＬ‐ＣＬであり、これらは４種類の活性なＦａｂフラグメントを提供し、その各々がＲＮＡｉに結合するヒトプロタミンを有する。多価複合体により、標的細胞への結合及び受容体の媒介による標的細胞への内部移行が促進されることになり、その細胞内において、非共有結合しているＲＮＡｉがエンドソーム内で解離し、細胞質中へ放出される。酸化還元反応が関与していないため、ｈＰ１又はｈＰ２内にある３個の分子内ジスルフィド結合が問題となることはない。ＲＮＡｉの送達に加えて、これらの構築物を治療用遺伝子又はＤＮＡワクチンの標的化送達に使用することもできる。別の有用な分野として、その機能の面からタンパク質のＲＮＡｉ類似体である細胞内抗体の産生にこの技術が適用される。
治療薬
医薬組成物
ある態様では、安定係留構造体及び／又は１若しくは２種類以上のその他の治療薬を、癌を有する対象などの対象へ投与することができる。そのような薬剤は、医薬組成物の形で投与することができる。一般に、これには、ヒト又は動物に有害となり得る不純物を実質的に含有しない組成物の調製が必要となる。当業者であれば、例えば経口投与、又は静脈内投与などの非経口投与を含む様々な経路で医薬組成物を対象に投与することができることが分かるであろう。
特定の態様では、効果量の治療薬を対象に投与しなければならない。「効果量」とは、その薬剤が所望の効果を発揮する量のことである。効果量は、例えば薬剤の効力、及び意図する効果などによって異なる。例えば、黄斑変性症、又は子宮内膜症などの過形成の状態の治療には、固形腫瘍の減少若しくは除去、又はその転移の予防若しくは減少を目的とした癌治療に必要な量に比べて、より少ない量の抗血管新生剤が必要である場合がある。特定の目的のための特定の薬剤の効果量は、本技術分野で公知の方法を用いて決定することができる。
化学療法薬
特定の態様では、化学療法薬を投与することができる。抗癌用に使用できる化学療法薬としては、５‐フルオロウラシル、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シクロホスファミド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エストロゲン受容体結合剤（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、エトポシド（ＶＰ１６）、ファルネシル‐タンパク質転移酵素阻害剤、ゲムシタビン、イホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、メトトレキサート、マイトマイシン、ナベルビン、ニトロソ尿素、プリカマイシン、プロカルバジン、ラロキシフェン、タモキシフェン、タキソール、テモゾロミド（ＤＴＩＣの水性溶液）、トランス白金化合物、ビンブラスチン及びメトトレキサート、ビンクリスチン、又は上記の類似体若しくは誘導体化された変形体などが挙げられるが、これらに限定されない。感染性の生物に対して使用できる化学療法薬としては、アシクロビル、アルベンダゾール、アマンタジン、アミカシン、アモキシシリン、アンホテリシンＢ、アンピシリン、アズトレオナム、アジスロマイシン、バシトラシン、バクトリム、バトラフェン（登録商標）、ビホナゾール、カルベニシリン、カスポファンギン、セファクロル、セファゾリン、セファロスポリン、セフェピム、セフトリアキソン、セファトキシム、クロラムフェニコール、シドホビル、シプロ（登録商標）、クラリスロマイシン、クラブラン酸、クロトリマゾール、クロキサシリン、ドキシサイクリン、エコナゾール、エリスロサイクリン、エリスロマイシン、フラジール、フルコナゾール、フルシトシン、ホスカルネット、フラゾリドン、ガンシクロビル、ゲンタマイシン、イミペネム、イソニアジド、イトラコナゾール、カナマイシン、ケトコナゾール、リンコマイシン、リネゾリド、メロペネム、ミコナゾール、ミノサイクリン、ナフチフィン、ナリジクス酸、ネオマイシン、ネチルマイシン、ニトロフラントイン、ニスタチン、オセルタミビル、オキサシリン、パロモマイシン、ペニシリン、ペンタミジン、ピペラシリン‐タゾバクタム、リファブチン、リファンピン、リマンタジン、ストレプトマイシン、スルファメトキサゾール、スルファサラジン、テトラサイクリン、チオコナゾール、トブラマイシン、トルシクラート、トルナフタート、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、バラシクロビル、バンコマイシン、ザナミビル、及びジスロマイシン、が挙げられるが、これらに限定されない。
化学療法薬、及び投与方法、投与量、などは、当業者に公知である（例えば、該当する箇所が参照することで本明細書に組み入れられる、”Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”，Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ”Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”、及び”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”、を参照）。治療を受ける対象の状態に応じて、投与量の若干の変更が必要となる。投与の責任者は、いかなる場合でも、個々の対象に応じた適切な投与量を決定する。
ホルモン
副腎皮質ステロイドホルモンは、他の化学療法薬の効果を高めることができ、従って、組み合わせて治療に使用されることが多い。副腎皮質ステロイドホルモンの例としては、プレドニゾン及びデキサメタゾンが挙げられる。カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、及び酢酸メゲストロールなどのプロゲスチンは、子宮内膜の癌や乳癌に用いられる。ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオールなどのエストロゲンは、前立腺癌などの癌に用いられる。タモキシフェンなどの抗エストロゲン剤は、乳癌などの癌に用いられる。プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロンなどのアンドロゲンも、乳癌の治療に用いられる。
抗血管新生剤
特定の態様では、アンジオスタチン、バクロスタチン（ｂａｃｕｌｏｓｔａｔｉｎ）、カンスタチン（ｃａｎｓｔａｔｉｎ）、マスピン、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＰＩＧＦペプチド及び抗体、抗血管増殖因子抗体、抗Ｆｌｋ‐１抗体、抗Ｆｌｔ‐１抗体及びペプチド、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性因子阻害剤、組織メタロプロテアーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、ＩＰ‐１０、Ｇｒｏ‐β、トロンボスポンジン、２‐メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット、ペントサンポリサルフェート、アンジオポエチン‐２、インターフェロン‐α、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノマイド（Ｌｉｎｏｍｉｄｅ)、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ‐４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アクチン、アンジオスタチン、シドホビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ‐１４７０、血小板第４因子、又はミノサイクリンなどの抗血管新生剤を用いることができる。
免疫調節剤
本明細書で用いる、「免疫調節剤」という用語には、インターロイキン、コロニー刺激因子、インターフェロン（例：インターフェロン‐α、‐β、及び‐γ）、及び「Ｓ１因子」と称する幹細胞増殖因子などの、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、及び、造血因子が含まれる。適切な免疫調節剤部分の例としては、ＩＬ‐２、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐２１、インターフェロン‐ガンマ、ＴＮＦ‐αなどが挙げられる。
「サイトカイン」という用語は、別の細胞に対して細胞間のメディエーターとして働く一つの細胞集団によって放出されるタンパク質又はペプチドに対する一般名称である。本明細書で広く用いるように、サイトカインの例としては、リンホカイン、モノカイン、増殖因子、及び従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるものとしては、ヒト成長ホルモン、Ｎ‐メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝細胞増殖因子；プロスタグランジン；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子‐α及び‐β；ミュラー管抑制因子；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ‐βなどの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ‐α及びＴＧＦ‐βなどのトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子‐Ｉ及び‐ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン‐α、‐β、及び‐γなどのインターフェロン；マクロファージ‐ＣＳＦ（Ｍ‐ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージ‐ＣＳＦ（ＧＭ‐ＣＳＦ）；及び顆粒球‐ＣＳＦ（Ｇ‐ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ‐１、ＩＬ‐１α、ＩＬ‐２、ＩＬ‐３、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐８、ＩＬ‐９、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐１１、ＩＬ‐１２；ＩＬ‐１３、ＩＬ‐１４、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１６、ＩＬ‐１７、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐２１などのインターロイキン（ＩＬ）、ＬＩＦ、Ｇ‐ＣＳＦ、ＧＭ‐ＣＳＦ、Ｍ‐ＣＳＦ、ＥＰＯ、キットリガンド（ｋｉｔ−ｌｉｇａｎｄ）若しくはＦＬＴ‐３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子、及びＬＴが挙げられる。本明細書で用いるサイトカインという用語は、天然源由来又は組換え細胞培養物由来のタンパク質、及び生物活性である天然配列サイトカインの同等物を含む。
ケモカインは、一般に、免疫エフェクター細胞をケモカインの発現部位へ取り込む化学誘因物質として作用する。ケモカインには、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１‐α、ＭＩＰ１‐β、及びＩＰ‐１０が含まれるがこれらに限定されない。当業者であれば、特定のサイトカインも化学誘因効果を有することが知られており、これもケモカインという用語に分類され得るということを認識するであろう。同様に、免疫調節剤及びサイトカインという用語は、各々に分類される物質が重複している。
放射性同位元素治療及び放射免疫療法
ある態様では、ペプチド及び／又はタンパク質を放射性核種治療法又は放射免疫療法に使用することができる（例えば、各々が参照することで本明細書に組み入れられる、Ｇｏｖｉｎｄａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，４：３７５‐９１；Ｓｈａｒｋｅｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，２００５，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４６：１１５Ｓ‐１２７Ｓ；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． ( Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００６；２４：８２３‐８３４），”Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｅ‐ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ”、を参照)。特別の態様では、有用な放射性同位元素で安定係留構造体を直接標識し、対象へ投与することができる。別の選択肢としての態様では、疾患組織内の発現が増加した部位に局在化する二重特異性の安定係留構造体を投与した後に、放射標識したハプテンペプチド又はリガンドを注入するという、上述のプレ標的法（ｐｒｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）によって放射性同位元素を投与することができる。
疾患組織の治療に有用な放射性同位元素としては、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ， ２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、及び２１１Ｐｂが挙げられるが、これらに限定されない。治療用の放射性核種は、崩壊エネルギーが２０乃至６０００ｋｅＶの範囲であることが好ましく、オージェ電子放射体の場合は６０乃至２００ｋｅＶ、β放射体の場合は１００乃至２５００ｋｅＶ、そしてα放射体の場合は４０００乃至６０００ｋｅＶが好ましい。β粒子を放出する有用な核種の最大崩壊エネルギーは、２０乃至５０００ｋｅＶが好ましく、１００乃至４０００ｋｅＶがより好ましく、５００乃至２５００ｋｅＶが最も好ましい。オージェ電子を放出する粒子によって実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。例えば、Ｃｏ‐５８、Ｇａ‐６７、Ｂｒ‐８０ｍ、Ｔｃ‐９９ｍ、Ｒｈ‐１０３ｍ、Ｐｔ‐ １０９、Ｉｎ‐１１１、Ｓｂ‐１１９、Ｉ‐１２５、Ｈｏ‐１６１、Ｏｓ‐１８９ｍ、及びＩｒ‐１９２である。β粒子を放出する有用な核種の崩壊エネルギーは、＜１０００ｋｅＶが好ましく、＜１００ｋｅＶがより好ましく、＜７０ｋｅＶが最も好ましい。α粒子の発生によって実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。そのような放射性核種としては、Ｄｙ‐１５２、Ａｔ‐２１１、Ｂｉ‐２１２、Ｒａ‐２２３、Ｒｎ‐２１９、Ｐｏ‐２１５、Ｂｉ‐２１１、Ａｃ‐２２５、Ｆｒ‐２２１、Ａｔ‐２１７、Ｂｉ‐２１３、及びＦｍ‐２５５が挙げられるが、これらに限定されない。α粒子を放出する有用な放射性核種の崩壊エネルギーは、２０００乃至１００００ｋｅＶが好ましく、３０００乃至８０００ｋｅＶがより好ましく、４０００乃至７０００ｋｅＶが最も好ましい。
例えば、６７Ｃｕは、その６１．５時間という半減期、及びβ粒子とガンマ線を豊富に供給することから、放射免疫療法にとってより有望な放射性同位元素の一つとされており、これを、キレート化剤であるｐ‐ブロモアセトアミド‐ベンジル‐テトラエチルアミン四酢酸（ＴＥＴＡ）を用いてタンパク質又はペプチドと複合体形成することができる。別の選択肢として、高エネルギーのβ粒子を放出する９０Ｙを、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を用いて、ペプチド、抗体、融合タンパク質、又はそれらの断片と結合させることができる。
さらなる可能性のある放射性同位元素としては、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、１６９Ｙｂ、などが挙げられる。
別の態様では、放射線増感剤を用いることができる。放射線増感剤を添加することにより、効力を高めることができる。放射線増感剤については、Ｄ．Ｍ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ（ｅｄ．），ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ ＷＩＴＨ ＲＡＤＩＯＬＡＢＥＬＥＤ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）、に記載されており、この文献のすべては参照することで本明細書に組み入れられる。
ボロン付加体（ｂｏｒｏｎ ａｄｄｅｎｄ）を添加した熱中性子放射化治療（ｔｈｅｒｍａｌ ｎｅｕｔｒｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）用の担体を有する安定係留構造体は、通常、ある程度の効果を見せる。しかしながら、標的化されていない免疫複合体が除去されるのを待ってから中性子の照射を行うことは有利であろう。リガンドと結合する抗体を使うことで、除去を促進することができる。この一般原理の説明に関しては、米国特許第４，６２４，８４６号を参照のこと。例えば、カルボランなどのボロン付加体が抗体と結合することができる。本技術分野で公知のように、側鎖にカルボキシル官能基を有するカルボランを作製することができる。アミノデキストランなどの担体とカルボランとの結合は、カルボランのカルボキシル基を活性化し、担体上のアミノ基と縮合させることによって達成することができる。そして、中間体の複合体を抗体と複合体形成させる。複合体の投与後、ボロン付加体は熱中性子の照射によって活性化され、α線の放出によって崩壊する放射性原子に変換され、毒性の高い狭い範囲での効果を示す。
キット
種々の態様が、患者の疾患組織の治療又は診断に適した構成物を含むキットに関するであろう。典型的なキットには、少なくとも１種類の安定係留構造体を含むことができる。投与成分を含む組成物が、経口送達などの消化管を通じての送達用に製剤されていない場合は、キットの構成物をその他の何らかの経路を通じて送達することが可能な装置を含めることができる。非経口送達などの用途のための装置の一つの種類としては、組成物を対象の体内へ注入するのに使用するシリンジがある。吸入装置を使用することもできる。
キットの構成物はまとめて一つに梱包してもよく、又は２若しくは３個以上の別々の容器に梱包してもよい。ある態様では、容器は、組成物の再組成に適した無菌の凍結乾燥した製剤を収容するバイアルとすることができる。キットは、さらに、再組成に適した、及び／又は他の試薬の希釈に適した１若しくは２種類以上のバッファーを含むことができる。使用することができるその他の容器としては、小袋、トレイ、箱、チューブ、などが挙げられるが、これらに限定されない。キットの構成物は、容器内に無菌状態で梱包され、容器内でその状態を維持することができる。含めることができる別の構成物としては、キットをその用途に使用する人向けの説明書である。
製剤及び投与
その複合体を含む安定係留構造体は、さらに製剤され、１若しくは２種類以上の薬理学的に許容される賦形剤、１若しくは２種類以上の追加成分、又はこれらのある組み合わせを含む組成物を得ることができる。これらは、薬理学的に有用な製剤を作製する公知の方法で達成することができ、それにより、活性成分（すなわち、安定係留構造体又は複合体）が１若しくは２種類以上の薬理学的に許容される賦形剤と混ぜ合わされ、混合物となる。薬理学的に許容される賦形剤の一つの例は、無菌リン酸緩衝食塩水である。その他の適切な賦形剤は当業者に公知である。例えば、Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０）、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）、及びその改訂版を参照のこと。
本明細書で述べる組成物の好ましい投与経路は、非経口注入である。非経口投与では、薬理学的に許容される賦形剤と共に、組成物を、溶液、懸濁液、又はエマルジョンなどの注入可能な単位剤形に製剤する。そのような賦形剤は、元来毒性も治療効果もない。そのような賦形剤の例としては、食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液、及びハンクス液である。固定油及びオレイン酸エチルなどの非水性賦形剤を使用することもできる。好ましい賦形剤は、食塩水中５％のブドウ糖溶液である。賦形剤は、バッファー及び保存剤を含む、等張力及び化学安定性を高める物質などの添加剤を少量含んでいても良い。経口投与を含む他の投与法も意図している。
安定係留構造体を含む製剤された組成物は、例えばボーラス注入又は連続注入などによる静脈内投与に使用することができる。注入用の組成物は、添加保存剤と共に、例えばアンプル又は多重投与用容器（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｓｅ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）内の単位剤形として提供することができる。組成物は、油性若しくは水性媒体中の懸濁液、溶液、又はエマルジョンとしての形を取ることもでき、懸濁剤、安定剤、及び／又は分散剤などの製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）を含むことができる。又は、別の選択肢として、組成物は、使用する前に例えば無菌のパイロジェンを含有しない水などの適切な媒体中で組成化する、粉体状とすることもできる。
組成物は溶液の形で投与することもできる。溶液のｐＨはｐＨ５乃至９の範囲とするべきであり、好ましくはｐＨ６．５乃至７．５である。その製剤は、リン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン‐ＨＣｌ、又はクエン酸などの適切な薬理学的に許容されるバッファーを含む溶液とするべきである。バッファーの濃度は１乃至１００ｍＭの範囲とするべきである。製剤された溶液は、さらに塩化ナトリウム又は塩化カリウムなどの塩を、５０乃至１５０ｍＭの濃度で含むこともできる。グリセロール、アルブミン、グロブリン、界面活性剤、ゼラチン、プロタミン、又はプロタミンの塩などの安定剤を効果量含むこともできる。製剤された組成物の全身投与は、安定係留構造体のテンプレートとしてヒト化抗体を用いた場合、通常、２乃至３日ごとに、又は週１回行われる。又は、別の選択肢として、毎日の投与も有用である。通常、投与は筋肉内注射又は血管内注入のいずれかによって行われる。
組成物は、皮下又はその他の非経口経路から哺乳類へ投与することができる。さらに、連続注入、又は一回若しくは複数回のボーラスによって投与することができる。抗体又は免疫複合体に有用な方法を、本明細書で述べる組成物に適用することができる。一般に、投与される免疫複合体、融合タンパク質、又は抗体単体（ｎａｋｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）のヒトに対する投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的健康状態、及び過去の病歴などの要素によって異なる。通常、一回の静脈内注入で約１ｍｇ／ｋｇ乃至２０ｍｇ／ｋｇの範囲の活性成分の投与量をレシピエントに提供することが好ましいが、状況に応じてこれよりも少ない又は多い量を投与することもできる。この投与量は、例えば４乃至１０週間にわたって１週間に一回、好ましくは８週間にわたって１週間に一回、そしてより好ましくは４週間にわたって１週間に一回、など、必要に応じて繰り返すことができる。数ヶ月にわたって隔週に行うなど、より頻度を下げて投与することもできる。投与は、投与量と投与スケジュールを適切に調整し、種々の非経口経路から行うことができる。種々の典型的態様では、投与量は、１００乃至５００ｍｇ、２００乃至１０００ｍｇ、５００乃至２０００ｍｇ、１００乃至２５０ｍｇ、２５０乃至５００ｍｇ、５００乃至１０００ｍｇ、又は抗体、抗体断片、若しくは融合タンパク質の投与において公知のその他の範囲とすることができる。
免疫複合体又は抗体の作用の持続時間を制御するために用いる薬理学的な方法を、本明細書で述べる製剤された組成物に適用することができる。例えば、エチレン‐酢酸ビニル共重合ポリマーのマトリックス並びにステアリン酸ダイマー及びセバシン酸の酸無水物共重合ポリマーのマトリックスなどの、免疫複合体若しくは抗体単体を複合体化又は吸着する生体適合性ポリマーを用いることによって、制御放出する製剤を得ることができる。Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２），１０：１４４６、を参照のこと。そのようなマトリックスからの免疫複合体又は抗体の放出速度は、免疫複合体又は抗体の分子量、免疫複合体や抗体のマトリックス中の量、及び分散粒子のサイズによって異なる。Ｓａｌｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．（１９８９），５５：１６３；Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，上述、を参照のこと。その他の固体剤形は、Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０）、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）、及びこれらの改訂版に記載されている。
治療の目的のために、治療効果量の組成物を哺乳類へ投与する。本明細書で開示する治療法及び診断法に適した対象は、通常はヒトであるが、哺乳類、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、ヤギ、ウシ、アルパカ、ラマ、又はヒツジなどのヒト以外の動物も対象として意図している。
本明細書で開示する安定係留構造体は、”Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｂ‐ＣｅＩＩｓ”という発明の名称で２０００年６月９日に出願され、全文が参照することで本明細書に組み入れられる現在出願中の米国特許出願第０９／５９０，２８４号に開示されている、自己免疫障害を治療する方法に特に有用である。そのような結合構造を含む組成物は、２０乃至５０００ｍｇの投与量で静脈内又は筋肉内に投与されることが好ましい。鼻腔内又はその他の非注射経路（ｎｏｎｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｒｏｕｔｅ）による投与も可能である。血液を含む特定の組織に配置したマイクロスフェア、リポソーム、又はその他の微粒子送達システムを通して組成物を投与することもできる。
組成物をエアロゾルとして投与し、肺へ局在的に送達させることもできる。水性エアロゾル又は非水性（例：フルオロカーボン噴霧剤）懸濁液のいずれかを使用可能である。エアロゾルを調製するには、超音波噴霧器を用いて、組成物中の安定係留構造体が、分解や失活を引き起こし得るせん断力へ曝露することを最小限に抑えることが好ましい。
一般に、投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的健康状態、及び過去の病歴などの要素によって異なる。好ましくは、飽和量の安定係留構造体を患者へ投与する。
通常、約５０乃至５００ミリグラムの範囲の投与量の安定係留構造体をレシピエントに提供することが好ましいが、状況に応じてこれよりも少ない又は多い量を投与することもできる。投与量の例としては、一回の投与量あたり２０乃至１５００ミリグラムのタンパク質、一回の投与量あたり２０乃至５００ミリグラムのタンパク質、一回の投与量あたり２０乃至１００ミリグラムのタンパク質、一回の投与量あたり２０乃至１０００ミリグラムのタンパク質、一回の投与量あたり１００乃至１５００ミリグラムのタンパク質などが挙げられる。組成物が放射性核種を含む態様では、投与量はミリキューリーで測定することができる。９０Ｙの場合、投与量は１５乃至４０ｍＣｉ、１０乃至３０ｍＣｉ、２０乃至３０ｍＣｉ、又は１０乃至２０ｍＣｉの間とすることができる。
放射性核種と連結した安定係留構造体は、細菌治療に特に効果的である。安定係留構造体が対象中の１又は２個以上の感染部位に局在化されたことを確認後、一般的には、各々患者の体重７０ｋｇに対して、１３１Ｉの場合一回の投与量あたり２０ｍＣｉ乃至１５０ｍＣｉ、９０Ｙの場合一回の投与量あたり５ｍＣｉ乃至３０ｍＣｉ、又は１８６Ｒｅの場合一回の投与量あたり５ｍＣｉ乃至２０ｍＣｉなど、より高い投与量の標識組成物を注入する。注入は、静脈内、動脈内、リンパ内、くも膜下腔内、又は腔内（すなわち非経口）で行うことができ、繰り返し注入することができる。治療法によっては複数回に分けて投与することが有利である場合があり、これによって、通常は正常組織への照射量を比例して高めることなく、細菌毒性を高めた投与が提供される。
安定係留構造体を化学的に結合しない化学療法薬、抗菌剤、サイトカイン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、などは、組成物の投与の前、最中、又は後に投与することができる。又は、別の選択肢として、そのような薬剤を安定係留構造体に結合させることもできる。
ａ２ｂ型の安定係留構造体は、特にプレ標的剤（ｐｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）として適している。典型的な構造は、標的組織又は細胞と二価で結合する２個のｓｃＦｖ又はＦａｂサブユニットであるａ２と、ハプテンと結合する１個のｓｃＦｖ又はＦａｂサブユニットであるｂと、から成る。そのような二重特異性三価構造体を、まず対象へ投与し、続いて任意に除去剤（ｃｌｅａｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を投与した後、次にハプテンが検出可能な診断用の標識剤などの機能剤、又は治療方法のための治療薬と結合している薬剤を投与する。当業者であれば、二重特異性抗体を用いる他の公知の方法も、安定係留構造体を用いて実施することができることに気づくであろう。これらの診断及び治療法は、抗体を主体とした薬剤が診断又は治療に用いられる実質的にいかなる状況にも応用することができる。以下で述べるように、二重特異性六価安定係留構造体も、二重特異性三価構造体と同様の目的のために用いることができる。
治療及び診断への使用：プレ標的を用いない用途
その複合体を含む安定係留構造体は、抗体又は免疫複合体を用い、プレ標的を必要としない、広範囲にわたる種々の治療及び診断用途への使用に適している。例えば、三価の構造体は、「単体の（ｎａｋｅｄ）」構築物として、すなわち、そのような構造体が追加的な機能剤と複合体形成をしない態様において、抗体単体を用いる治療と同じ方法によって、治療に用いることができる。又は、別の選択肢として、安定係留構造体を１若しくは２種類以上の機能剤で誘導体化することにより、診断又は治療への応用を可能とすることができる。追加する剤は、上述のように、安定係留構造体と共有結合することができる。
安定係留構造体と結合する放射性及び非放射性診断薬の使用も意図している。適切な非放射性診断薬は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、又は超音波法に使用する診断薬である。ＭＲＩ用の薬剤としては、例えばマンガン、鉄、ガドリニウムなどの非放射性金属が挙げられ、これらは２‐ベンジル‐ＤＴＰＡ並びにそのモノメチル及びシクロヘキシル類似体などの適切なキレートと錯体形成する。全文が参照することで本明細書に組み入れられる、２００１年１０月１０日に出願された米国特許出願第０９／９２１，２９０号を参照のこと。
安定係留構造体は、画像診断法に有用な放射性同位元素で標識することができる。適切な放射性同位元素としてはエネルギー範囲が６０乃至４０００ＫｅＶのものを挙げることができ、又はより具体的には、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、４５Ｔｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４‐１５８Ｇｄ、１７７Ｌｕ、３２Ｐ、１８８Ｒｅ、など、又はこれらの組み合わせを挙げることができる。例えば、全文が参照することで本明細書に組み入れられる、発明者Ｇ．Ｌ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ａｎｄ Ｗ．Ｊ．ＭｃＢｒｉｄｅ、発明の名称”Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｇａｌｌｉｕｉｍ−６８”である米国特許出願、並びに、画像法を目的として１８Ｆ、６８Ｇａ、９４ｍＴｃ、などのポジトロン放射体を開示している米国特許仮出願第６０／３４２，１０４号、を参照のこと。検出は、例えば単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）又はポジトロン放射型断層撮影法（ＰＥＴ）によって行うことができる。潜在性腫瘍を識別するための手術中の診断にも応用することができる。
別の態様では、安定係留構造体は、β‐放射体（３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６６Ｄｙ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、など）、オージェ電子放射体（１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、６７Ｇａ、１９１Ｏｓ、１９３ｍＰｔ、１９５ｍＰｔ、１９５ｍＨｇ、など）、α‐放射体（２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、など）、又はこれらの組み合わせを含む、新生物性細胞又はその他の急速に分裂する細胞を死滅させるのに有用な１若しくは２種類以上の放射性同位元素で標識することができる。
安定係留構造体は、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、及びエルビウム（ＩＩＩ）から成る群より選択される金属の複合体を含むことができる１又は２種類以上の画像増感剤（ｉｍａｇｅ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）と結合させることで、ＭＲＩに使用することができる。同様に、安定係留構造体は、１又は２種類以上の現在市販されている画像増感剤と結合させることで、超音波画像法に使用することができる。米国特許第６，３３１，１７５号には、ＭＲＩ技術及びＭＲＩ画像増感剤と複合体形成した抗体の調製に関して記載されており、その全文は参照することで本明細書に組み入れられる。
トキシンなどの機能タンパク質は、いくつかの方法で安定係留構造体の中に存在することができる。例えば、機能タンパク質は、ＤＤＤ２又はＡＤ２のいずれかに融合することによって二成分複合体のいずれかの成分の前駆体となることができ、続いて、例えばＦａｂ／ＡＤ２又はＦａｂ／ＤＤＤ２から成る標的化物と結合する。又は、別の選択肢として、機能タンパク質は、標的化構造体と融合してＡの前駆体となることができ、得られたＡは選択的に適切なＢと対を形成する。この点で使用することができるトキシンとしては、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン‐Ａ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ジフテリントキシン（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉｎ ｔｏｘｉｎ）、シュードモナスエキソトキシン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｏｔｏｘｉｎ）、及びシュードモナスエンドトキシン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）が挙げられる（例えば、Ｐａｓｔａｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８６）， ４７：６４１、及びＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ‐Ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（１９９４），４４：４３、を参照のこと）。ここで使用するのに適したさらなるトキシンは当業者に公知であり、参照することで本明細書に組み入れられる、米国特許第６，０７７，４９９号に開示されている。他の対象となる機能タンパク質としては、種々のサイトカイン、血餅溶解剤（ｃｌｏｔ‐ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、酵素、及び蛍光タンパク質が挙げられる。
上述の「単体の」安定係留結合構造体を対象に投与することにより、対象の新生物疾患を治療する方法も提供され、ここで、少なくとも１個の抗原結合部位が、炭酸脱水酵素ＩＸ、αフェトプロテイン、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、Ｂａ７３３、ＢｒＥ３‐抗原、ＣＡ１２５、癌胎児抗原（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ１３８、大腸特異的抗原‐ｐ（ｃｏｌｏｎ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ‐ｐ）（ＣＳＡｐ）、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ‐１、ＥＧＰ‐２、Ｆｌｔ‐１、Ｆｌｔ‐３、葉酸受容体、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ‐ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、Ｉａ、ＩＬ‐２、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、インスリン様増殖因子、ＫＣ４‐抗原、ＫＳ‐１、ＫＳ１‐４、Ｌｅ（ｙ）、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、壊死抗原、ｐ５３が結合した抗原、ＰＡＭ‐４抗体、胎盤成長因子、前立腺性酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＳ５、Ｓ１００、Ｔ１０１、ＴＡＣ、ＴＡＧ‐７２、Ｔｎ抗原、トムソン‐フリーデンライヒ抗原（Ｔｈｏｍｓｏｎ‐Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ ａｎｔｉｇｅｎ）、腫瘍壊死抗原、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン、ＶＥＧＦ、１７‐１Ａ‐抗原、血管新生マーカー、癌遺伝子マーカー、又は癌遺伝子産物、から成る群より選択される抗原と結合する。ＴＲＡＩＬ‐Ｒ１及びＴＲＡＩＬ‐Ｒ２などのＴＲＡＩＬ受容体に対する抗体は、本技術分野で公知である（例えば、Ｇｅｏｒｇａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００５，１３０：５０１‐５１０；Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００５，５７９：５３７９‐８４、を参照）。そのような抗体若しくは断片は、単独で、又は抗ＴＡＡ抗体と組み合わせて、癌の治療に使用することができる。
新生物疾患は、癌腫、肉腫、神経膠腫、リンパ腫、白血病、及び黒色腫から成る群より選択することができる。標的とすることができる典型的な腫瘍の種類としては、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、胆道癌、乳癌、子宮頚癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、直腸結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頚部癌、ホジキンリンパ腫、肺癌、甲状腺髄様癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵癌、神経膠腫、黒色腫、肝癌、前立腺癌、及び膀胱癌が挙げられる。
上述の安定係留結合構造体及び薬理学的に許容される担体を含有する治療組成物を、１又は２回以上対象に投与することによって、対象のＢ細胞悪性腫瘍、又はＢ細胞免疫若しくは自己免疫障害を治療する方法も提供され、ここで、各抗原結合部位は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、又はＩＬ‐１７の別々のエピトープと結合する。治療組成物は、一回あたり２０乃至１５００ミリグラムのタンパク質、又は一回あたり２０乃至５００ミリグラムのタンパク質、又は一回あたり２０乃至１００ミリグラムのタンパク質を含む投与量を非経口的に投与することができる。対象は、一回あたり２０乃至１００ミリグラムのタンパク質の非経口投与を繰り返し受けることができ、又は一回あたり２０乃至１５００ミリグラムのタンパク質の非経口投与を繰り返し受けることができる。これらの方法では、この結合構造体の細画分を、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａ、及び２２５Ａｃ、又はこれらの組み合わせなどの放射性同位元素で標識することができる。
各抗原結合部位が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、又はＩＬ‐１７の別々のエピトープと結合する安定係留結合構造体、薬理学的に許容される担体、並びに１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４‐１５８Ｇｄ、１７７Ｌｕ、３２Ｐ、４５Ｔｉ、及び１８８Ｒｅから成る群より選択される放射性核種、又はこれらの組み合わせを含有する診断用組成物を対象に投与することによって、対象のＢ細胞悪性腫瘍、又はＢ細胞免疫若しくは自己免疫障害を検出又は診断する方法も提供される。検出は、上述のように、ＳＰＥＣＴ又はＰＥＴによって行うことができる。潜在性腫瘍を識別するための手術中の診断にも応用することができる。
各抗原結合部位が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、又はＩＬ‐１７の別々のエピトープと結合する安定係留結合構造体、薬理学的に許容される担体、並びに、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に用いられる１若しくは２種類以上の画像増感剤を含有する診断用組成物を対象に投与することによって、対象のＢ細胞悪性腫瘍、又はＢ細胞免疫若しくは自己免疫障害を検出又は診断する方法も提供される。画像増感剤は、上述のものから選択することができる。
非新生物疾患若しくは障害を診断及び／又は治療する方法であって、検出可能な標識又は治療薬が結合され、１個以上の抗原結合部位がこの疾患若しくは障害のマーカー物質に特異的である安定係留構造体を、この疾患若しくは障害を持つ対象に投与することによる方法も提供される。このような疾患又は障害は、ミクロスポルム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）、エピデルモフィトン（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）、スポルトリクスシェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、クリプトコッカスネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、コクシジオイデスイミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ヒストプラズマカプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ブラストミセスデルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、及びカンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）などの真菌類、又はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒトパピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｐａｒｖｏ‐ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓ）、サルウイルス４０、呼吸器合胞体ウイルス、マウス乳癌ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン‐バーウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、及びブルータングウイルスなどのウイルスによって引き起こされるものであってよい。
このような疾患又は障害は、アンスラックスバシラス（Ａｎｔｈｒａｘ ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカスアガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、レジオネラニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、大腸菌、ナイセリアゴノレー（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリアメニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ニューモコクス（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、ヘモフィルスインフルエンザエＢ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ）、トレポネーマパリドゥム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ライム病スピロヘータ、シュードモナスエルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、マイコバクテリウムレプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、ブルセラアボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、及びマイコバクテリウムツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）などのバクテリア、又はマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）によって引き起こされるものであってよい。このような疾患又は障害は、マラリアなどの寄生虫によって引き起こされるものであってよい。
このような疾患又は障害は、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ‐シェンライン紫斑病、レンサ球菌感染後腎炎（ｐｏｓｔ‐ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性血管炎（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓｕｂｉｔｅｒａｎｓ）、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本病、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、及び線維化肺胞炎、などの自己免疫疾患であってよい。
このような疾患又は障害は、心筋梗塞、虚血性心疾患、若しくは動脈硬化プラーク、又は移植片拒絶、又はアルツハイマー病、又はアトピー性組織によって引き起こされるものであってよい。このような疾患又は障害は、感染病原体によって炎症が引き起こされ、その炎症部位における活性化された顆粒球、単球、リンパ球系細胞、又はマクロファージの癒着によって引き起こされる炎症であってもよい。
さらに、構造体と受容体を持つ細胞との結合を導く受容体に対するリガンドをＡ成分又はＢ成分のいずれかが有する安定係留構造体を用いて、特定の受容体を発現する細胞、又は受容体を過剰発現する細胞を標的とすることもできる。治療薬又は診断薬は、１若しくは２種類以上の構造体のサブユニットと融合又は複合体形成し、診断及び治療の方法を可能とすることができる。
治療及び診断への使用：プレ標的を用いた用途
プレ標的とは、もともとは、特に骨髄などの正常組織への望ましくない毒性をもたらす、直接標的化した抗体の遅い血中クリアランスを解決するために開発された多段階プロセスである。プレ標的により、放射性核種又はその他の治療薬が、血中から数分以内に除去される低分子化合物に結合される。標的抗原に加えて放射標識した低分子化合物を認識することができるプレ標的剤をまず投与し、その後、プレ標的剤が十分に血中から除去されてから、放射標識した化合物を投与する。
プレ標的法は、検出薬若しくは治療薬の標的：バックグラウンド比を増加させるために開発された。プレ標的及びビオチン／アビジンを用いた方法の例としては、例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８６３，７１３号; Ｇｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：２２６，１９８８； Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：１２９４，１９８７； Ｏｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：７２８，１９８８； Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：１９５１，１９８８； Ｓｉｎｉｔｓｙｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３０：６６，１９８９；Ｋａｌｏｆｏｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３１ ：１７９１，１９９０；Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４８：１６７，１９９１；Ｐａｇａｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：５９６０，１９９１；Ｐａｇａｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２：２１１，１９９１；米国特許第５,２５６,３９５号; Ｓｔｉｃｋｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：６６５０，１９９１； Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：３１１９，１９９１；米国特許第６,０７７，４９９号; 米国特許出願第０９／５９７,５８０号；米国特許出願第１０／３６１,０２６号；米国特許出願第０９／３３７,７５６号; 米国特許出願第０９／８２３,７４６号；米国特許出願第１０／１１６,１１６号; 米国特許出願第０９／３８２,１８６号; 米国特許出願第１０／１５０,６５４号; 米国特許第６,０９０,３８１号; 米国特許第６,４７２,５１１号; 米国特許出願第１０／１１４,３１５号; 米国特許仮出願第６０／３８６,４１１号; 米国特許仮出願第６０／３４５,６４１号; 米国特許仮出願第６０／３３２８,８３５号；米国特許仮出願第６０／４２６,３７９号；米国特許出願第０９／８２３,７４６号; 米国特許出願第０９／３３７,７５６号；米国特許仮出願第６０／３４２,１０３号;及び米国特許第６,９６２,７０２号、に記載されており、これらはすべて参照することで本明細書に組み入れられる。
具体的な、限定されない例において、安定係留構造体を主体とするプレ標的剤は、ＣＥＡに特異的な２個の同じ腫瘍抗原結合部位、及びハプテン、ヒスタミン‐サクシニル‐グリシン（ＨＳＧ）、に特異的な第三の結合部位を有する。別の選択肢の態様では、同じ又は異なるハプテンにより、異なる腫瘍関連抗原を標的とすることができる。
プレ標的用途において、標的化可能な剤は、リポソームの脂質膜の外側表面に共有結合している二価のＨＳＧ‐ペプチドを持つリポソームとすることができる。リポソームは対比のために気体を充填してもよく、又は、治療薬若しくは診断薬を充填してもよい。
対象の疾患若しくは障害を治療又は診断するプレ標的法は、（１）上述の、二重特異性の三価又は六価の結合構造体の対象への投与であって、この場合、第一の抗原結合部位がマーカー物質又は障害に特定のマーカー物質に向けられ、第二の抗原結合部位が二価のハプテンを有する標的化可能な構築物に向けられる、投与と、（２）選択的に、除去組成物（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）の対象への投与、及びその組成物による循環からの結合構造体の除去と、（３）二価のハプテンを有する標的化可能な構築物の対象への投与であって、この場合、標的化可能な構築物が１種類以上のキレート化された若しくは化学的に結合された治療薬又は診断薬をさらに含む、投与と、によって提供される。疾患若しくは障害は上述のものであってよい。
さらに、（１）新生物障害を持つ患者への上述の結合構造体の投与であって、この場合構造体がプロドラッグを活性化することのできる共有結合した酵素を有する、投与と、（２）選択的に、除去組成物の対象への投与、及びその組成物による循環からの結合構造体の除去と、（３）プロドラッグの患者への投与と、による、抗体依存性酵素プロドラッグ治療（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｒｕｇ ｔｈｅｒａｐｙ）(ＡＤＥＰＴ)の方法も提供される。
追加的用途
一般的に、安定係留構造体は、癌、又は癌以外の疾患の治療に効力を示す抗体主体の薬剤の代わりとすることができる。放射性同位元素、薬物、及びトキシンが、癌細胞によって産生された若しくは癌細胞と関連するマーカーと特異的に結合する抗体、又は抗体断片と複合体形成することができることは公知であり、また、そのような抗体の複合体を用いて、放射性同位元素、薬物、又はトキシンを腫瘍部位に対して標的化してその治療効力を高め、副作用を最小限に抑えることができることも公知である。このような薬剤及び方法の例は、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅ （Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ．Ｍ．Ｆｒａｎｋｓ ａｎｄ Ｎ．Ｍ．Ｔｅｉｃｈ，ｅｄｓ， Ｃｈａｐｔｅｒ １８，ｐｐ．３７８‐４１０，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８６）、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ Ｒａｄｉｏｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ （Ｃ．Ｗ．Ｖｏｇｅｌ，ｅｄ．， ３‐３００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８７)， 及びＤｉｌｌｍａｎ，Ｒ．Ｏ．（ＣＲＣ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ １ ：３５７，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８４)、にレビューされている。Ｐａｓｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ (１９８６)，４７：６４１；Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ (１９８７)，２３８：１０９８‐１１０４；及びＢｒａｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．(１９８７)，１３：１５３５‐１５４４、も参照のこと。
特定の態様では、多価の安定係留構造体は、例えば、各々が参照することで本明細書に組み入れられる、米国特許第６,１２６,９１６号；第６,０７７,４９９号；第６,０１０,６８０号；第５,７７６,０９５号；第５,７７６,０９４号；第５,７７６,０９３号；第５,７７２,９８１号；第５,７５３,２０６号；第５,７４６,９９６号；第５,６９７,９０２号；第５,３２８,６７９号；第５,１２８,１１９号；第５,１０１,８２７号;及び第４,７３５,２１０号に記載の方法を用いて、正常な又は疾患状態の組織及び器官の治療及び／又はイメージングに利用することができる。さらなる方法は、１９９９年６月２２日出願の、米国特許出願第０９／３３７,７５６号、及び２００１年４月３日出願の米国特許出願第０９／８２３,７４６号に記載されている。このようなイメージングは、安定係留構造体の直接標識、又は、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，”Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ，” (ｉｎ ｐｒｅｓｓ， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．)、 に記載のプレ標的画像法（ｐｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｍａｇｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）によって行うことができる。各々が参照することで本明細書に組み入れられる、米国特許公開公報第２００５０００２９４５号、第２００４００１８５５７号、第２００３０１４８４０９号、及び第２００５００１４２０７号も参照のこと。
癌及び他の形の治療における免疫複合体の使用の他の例は、とりわけ、以下の米国特許に開示されている：米国特許第４,３３１,６４７号、第４,３４８,３７６号、第４,３６１,５４４号、第４,４６８,４５７号、第４,４４４,７４４号、第４,４６０,４５９号、第４,４６０,５６１、ＵＳ４,６２４,８４６号、第４,８１８,７０９号、第４,０４６,７２２、ＵＳ４,６７１,９５８号、第４,０４６,７８４号、第５,３３２,５６７、ＵＳ５,４４３,９５３号、第５,５４１,２９７号、第５,６０１,８２５、ＵＳ５,６３５,６０３号、第５,６３７,２８８号、第５,６７７,４２７、ＵＳ５,６８６,５７８号、第５,６９８,１７８号、第５,７８９,５５４、ＵＳ５,９２２,３０２号、第６,１８７,２８７号、及び第６,３１９,５００号。これらの方法は、設計した抗体及び従来の方法の抗体を本発明の安定係留構造体に置き換えることにより、本明細書で開示する方法へ適用することもできる。
ある態様では、ここで開示され請求された安定係留構造体は、放射性核種治療法又は放射免疫療法に使用することができる（例えば、各々が参照することで本明細書に組み入れられる、Ｇｏｖｉｎｄａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，４：３７５‐９１；Ｓｈａｒｋｅｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，２００５，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４６：１１５Ｓ‐１２７Ｓ；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． (ｉｎ ｐｒｅｓｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．），”Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｅ‐ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ”を参照)。
別の態様では、単体の又は複合体形成した安定係留構造体、抗体又は抗体断片と組み合わせて、放射線増感剤を使用することができる。例えば、放射線増感剤は、放射標識した安定係留構造体と組み合わせて使用することができる。放射線増感剤を添加することで、放射標識した安定係留構造体単独による治療に比べて、効力を高めることができる。放射線増感剤は、Ｄ．Ｍ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ（ｅｄ．），ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ ＷＩＴＨ ＲＡＤＩＯＬＡＢＥＬＥＤ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）、に記載されており、この全文が参照することで本明細書に組み入れられる。
請求項に記載のいずれの方法に使用する安定係留構造体も、抗菌剤と結合させるか、又は一緒に投与することができる。
請求項に記載のいずれの方法に使用する安定係留構造体も、サイトカイン及び免疫修飾剤と結合させるか、又は一緒に投与することができる。このようなサイトカイン及び免疫修飾剤には、少なくとも、インターフェロンα、β、及びγ、並びにコロニー刺激因子が含まれる。
開示された方法は、安定係留構造体を用いた患者の免疫応答の刺激に使用することもできる。一つの態様では、安定係留構造体は、抗イディオタイプ抗体の抗原結合部位（ＡＢＳ）を含むことができる。このような安定係留構造体は、腫瘍関連抗原のエピトープの擬態となり、身体の免疫応答を高めることができる。
安定係留構造体は、現在抗体を利用している免疫学的手順の多くに使用することができる。このような手順には、抗イディオタイプ抗体及びエピトープと複合体形成した抗体の使用による免疫システムの増強が含まれる。米国特許第５,７９８,１００号；第６,０９０,３８１号；及び第６,１３２,７１８号を参照のこと。抗イディオタイプ抗体は、癌及び感染性疾患に対するワクチンとしても利用される。米国特許第６,４４０,４１６号及び第６,４７２,５１１号を参照のこと。さらに、多特異性の、三量体又は六量体結合構造体は、多剤トランスポータータンパク質と結合して、細胞及び病原体内の多剤耐性表現型を克服する。このような方法における抗体は、本明細書で開示する安定係留構造体に置き換えることができる。
種々の態様が、自己免疫性疾患の症状を治療する方法に関連する。この方法では、投与前に薬理学的に許容される担体と混合されていてもよい安定係留構造体を、自己免疫性疾患の患者に投与する。本方法の安定係留構造体は、Ｂ細胞又はＴ細胞の抗原エピトープと特異的に結合するＡＢＳを少なくとも一つ含むべきである。Ｂ細胞の抗原はＣＤ２２であってよく、エピトープはＣＤ２２のエピトープＡ、エピトープＢ、エピトープＣ、エピトープＤ、及びエピトープＥ、並びにその他であってよい。Ｂ細胞関連抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＬＡ‐ＤＲ、及びＣＤ７４などの別の細胞の抗原であってもよい。Ｔ細胞抗原にはＣＤ２５を含んでもよい。特定の態様では、自己免疫性疾患の治療に用いる安定係留構造体を選択して、ＩＬ‐１７と結合させることができる。
ＡＢＳは、類人霊長類動物、マウスのモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト由来の配列を含むことができる。例えば、ＡＢＳは、ヒト化ＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ヒト化ＬＬ１（抗ＣＤ７４）、又はヒト化Ａ２０（抗ＣＤ２０）モノクローナル抗体由来のものであってよい。
投与は、一回の投与あたり２０乃至２０００ｍｇの投与量を、非経口的に行うことができる。投与は、症状がある程度軽減されるまで繰り返し行うことができる。
請求項に記載の方法で治療することができる患者としては、ヒトを含むいずれの動物も含まれる。動物は、ヒト、霊長類、ウマ類、イヌ類、及びネコ類などの哺乳類が好ましい。
安定係留構造体は、全身化学療法に対して耐性又は抵抗性を有する疾患の治療に使用することができる。これには、種々のウイルス、真菌、バクテリア、及び原虫による感染症、並びに特定の寄生虫感染症が含まれる。ウイルスによる感染症としては、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン‐バーウイルス及びサイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス（ラブドウイルス）、パピローマウイルス、並びにパポーバウイルスによって引き起こされるものが挙げられ、これらはすべて全身性抗菌剤／細胞毒性剤による治療が困難である。多価結合構造体の使用により、標的ウイルスに対する結合活性を高めることができ、その結果著しく高い治療係数が得られる。放射性同位元素（熱中性子によって活性化可能なボロン付加体を含む）によって標識された安定係留構造体の複合体を用いた標的化した放射免疫療法により、抗ウイルス療法に新しいアプローチがもたらされる。
本発明で述べる方法によって治療することができる原虫としては、例えば、プラスモディア（Ｐｌａｓｍｏｄｉａ）（特に、プラスモディアファルシパルム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、マラリア寄生虫）、トキソプラズマゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）（トキソプラズマ症の感染病原体）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｅ）（リーシュマニア症の感染病原体）、及びエンシェリキアヒストリティカ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）が挙げられる。安定係留構造体を使用することにより、様々な段階のマラリアの検出及び治療を飛躍的に向上させることができる。スポロゾイト抗原と結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は公知である。しかし、スポロゾイト抗原が、血液ステージ（ｂｌｏｏｄ ｓｔａｇｅ）の寄生虫に共有されないことから、そのようなスポロゾイト抗原を標的とするｍＡｂｓの使用は、注入直後でホストの肝幹細胞内で繁殖する前という、スポロゾイトが循環内に遊離している比較的短い時間に限定される。従って、原虫（プラスモディアファルシパルムなど）の１種類を超える寄生ステージを標的とすることができるｍＡｂｓの混合物を使用することが好ましく、これは複数の特異性を有する１又は２種類以上の安定係留構造体によって達成することができる。画像法には例えば９９ｍＴｃを、又は、治療には例えば２１１Ａｔ若しくは、例えばピリメタミンなどの抗マラリア薬を用いた複合体を使用することにより、さらに利点を得ることができる。
トキソプラズマ症も全身化学療法に対して耐性を有する。トキソプラズマゴンディ（Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ）、又はホストの自然抗体と特異的に結合するｍＡｂｓがトキソプラズマ症に対する免疫応答において役割を果たすことができるかどうかは明らかではないが、マラリア寄生虫の場合のように、適切に標的化された安定係留構造体は、治療薬を送達する効果的な運搬体となることができる。
広く流行している蠕虫感染症である住血吸虫症は、ある種の淡水巻貝が保有する、自由に遊泳するセルカリアによって引き起こされる。マラリアの場合のように、感染プロセスに関与するセルカリアには異なるステージがある。セルカリアの複数のステージに結合し、選択的に１又は２種類以上のステージの複数のエピトープに結合してもよく、多特異性複合体の形であることが好ましい安定係留構造体は、イメージング剤又は治療薬と複合体形成して、効果的に標的化され、治療効力を高めることができる。
シャーガス病の原因病原体であるトリパノソーマ‐クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）の１又は２種類以上の形と結合する安定係留構造体を作製し、この微生物感染症の検出及び治療に使用することができる。安定係留構造体は、分化ステージにあるトリパノソーマの細胞表面糖タンパク質又はその他の表面抗原と反応するため、イメージング剤及び治療薬を体内の寄生虫が浸潤した部位へ向けるのに適している。
入手可能な薬物で治療することが非常に困難である別の感染性生物は、らい菌（マイコバクテリウムレプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ））である。マイコバクテリウムレプレ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）の表面上の複数のエピトープに特異的に結合する安定係留構造体を作製し、単独若しくは組み合わせて使用して、イメージング剤及び／又は抗菌剤／細胞毒性剤をらい菌に対して標的化することができる。
旋毛虫症、糞線虫症など、蠕虫による寄生虫感染症は、化学療法薬に対して比較的抵抗性があり、安定係留構造体の標的として適している。その診断及び治療は、寄生虫の１種類若しくは、好ましくは複数種類のエピトープと特異的に結合する適切な安定係留構造体又はその複合体によって行うことができる。
ヒトの大部分の感染症の原因となっているほとんどの微生物及び寄生虫に特異的に結合する抗体は入手可能であり、又は容易に産生させることができる。その多くは過去にインビトロでの診断目的に使用されており、診断薬及び治療薬を感染部位に対して標的化する抗体複合体の成分として安定係留構造体中へ取り込ませることができる。ヒト及び哺乳類の病原性微生物及び無脊椎動物の寄生虫は、その様々なステージで発現された多様な抗原を有する複雑な生活環を持った生命体である。従って、標的化による治療は、異なった形態における抗原決定基を認識する安定係留構造体を作製し、混合物又は多特異性複合体のいずれかの形で組み合わせ、適切な治療様式と結びつけた形で使用することで、最大限の効果を引き出すことができる。例えば放射性核種及び／又はＭＲＩ増感剤などのイメージング剤の結合によって感染部位を検出する安定係留構造体を含む試薬の使用にも、同じ原理が適用される。
他の態様は、効果量の安定係留構造体及び標的化可能な構築物を投与することによる手術中に疾患組織を識別する方法に関連し、ここで、安定係留構造体は、標的組織と特異的に結合する少なくとも１個の抗原結合部位、及び標的化可能な構築物と特異的に結合する少なくとも１個のその他の抗原結合部位を含み、この場合、前記の少なくとも１個の抗原結合部位は、標的細胞、組織、若しくは病原体上、又はそれらに産生された若しくはそれらに関連する分子上の相補的な結合部分と結合することができる。
さらに他の態様は、効果量の安定係留構造体及び標的可能な構築物を投与することによる、内視鏡を用いて対象内の疾患組織を識別する方法に関連する。安定係留構造体は、標的組織と特異的に結合する少なくとも１個の抗原結合部位、及び標的化可能な構築物と特異的に結合する少なくとも１個の抗原結合部位を含み、この場合、前記の少なくとも１個の抗原結合部位は、標的細胞、組織、若しくは病原体上、又はそれらに産生された若しくはそれらに関連する分子上の相補的な結合部分との特異的な結合を示す。
有用な検出方法の別の選択肢としては、例えばＧｉｖｅｎ Ｉｍａｇｉｎｇ社（ジョージア州、ノークロス）などより市販されている種類の経口摂取用カプセルカメラ／検出器を用いる、ワイヤレスカプセル内視鏡検査がある。特定の態様は、効果量の安定係留構造体及び標的可能な構築物を投与することによる、内視鏡を用いて対象内の疾患組織を識別する方法に関連する。この態様では、安定係留構造体は、標的組織と特異的に結合する少なくとも１個の抗原結合部位、及び標的化可能な構築物と特異的に結合する少なくとも１個の抗原結合部位を含み、この場合、前記の少なくとも１個の抗原結合部位は、標的細胞、組織、若しくは病原体上、又はそれらに産生された若しくはそれらに関連する分子上の相補的な結合部分との特異的な結合を示す。
別の選択肢としての態様は、効果量の安定係留構造体及び標的化可能な構築物を投与することによる、対象の血管内の疾患組織を識別する方法に関連する。安定係留構造体は、標的細胞、組織、若しくは病原体上、又は細胞、組織、若しくは病原体に産生された若しくは関連する分子上の相補的な結合部分と特異的に結合する少なくとも１個の抗原結合部位（ＡＢＳ）、及び標的化可能な構築物と特異的に結合する少なくとも１個のＡＢＳを含む。標的組織は、甲状腺、肝臓、心臓、卵巣、胸腺、副甲状腺、子宮内膜、骨髄、リンパ節、又は脾臓などの正常組織であってよい。
ある態様は、請求項に記載の方法を実施するためのキットに関連する。キットは標的化可能な構築物を含むことができる。標的化可能な構築物は、上述の標的化可能な構築物に適するいずれの剤によっても標識することができる。さらに、標的化可能な構築物は非標識だが、キットは標的化可能な構築物を標識する標識試薬を含む、ということも可能である。含める場合の標識試薬は、標識剤及び架橋剤を含むことができる。キットはさらに、標的化可能な構築物に特異的な少なくとも１個のＡＢＳ及び標的化可能な組織に特異的な少なくとも１個のＡＢＳを有する安定係留構造体を含むことができる。キットは、選択的に、安定係留構造体を循環から除去するための除去組成物を含むことができる。
安定係留構造体の標的
安定係留構造体の標的に関するさらなる開示としては、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．による２００４年１２月９日出願の、米国特許仮出願第６０／６３４,０７６号、”Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ‐ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ"、に開示されており、この全文は参照することで本明細書に組み入れられる。
ある態様では、ここで請求項に記載の安定係留構造体は、２種類の異なる標的と特異的に反応する。異なる標的としては、これらに限定されないが、先天性の免疫システムの炎症誘発性エフェクター（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）、凝固因子、補体因子及び補体制御タンパク質、炎症性若しくは免疫失調性の障害、感染性病原体、又は病的血管新生若しくは癌と特異的に関連する標的が挙げられ、ここで、この後者の標的の種類は免疫システムの炎症誘発性エフェクタでも凝固因子でもない。従って、特定の態様では、安定係留構造体は、疾患細胞、病的血管新生若しくは癌、又は感染性疾患と関連する少なくとも一つの結合特異性と、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好中球、単球、及びマクロファージの受容体若しくは抗原、及び樹状細胞などの免疫システムの成分、又はトロンビン若しくは組織因子などの凝固の修飾因子、又はＩＬ‐１、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１０、ＨＭＧＢ‐１、及びＭＩＦなどの炎症誘発性サイトカインに対する少なくとも一つの特異性とを有する。
安定係留構造体は、単体の状態であってもよいが、画像診断剤（例：同位元素、放射線造影剤）、又は放射性核種、ボロン化合物、免疫調節剤、ペプチド、ホルモン、ホルモン拮抗薬、酵素、オリゴヌクレオチド、酵素阻害剤、光活性治療薬（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）、細胞毒性剤、抗血管新生剤、及びこれらの組み合わせを含む治療薬と複合体形成してもよい。安定係留構造体と標的との結合により、免疫細胞の機能を下方制御又はこれに影響を与えることができるが、安定係留構造体はさらに、免疫細胞の機能に直接影響を与えないその他の標的とも結合することができる。例えば、ＣＤ６６又はＣＥＡＣＡＭ６（例：ＮＣＡ９０若しくはＮＣＡ９５）などに対する抗顆粒球抗体を用いることにより、感染組織中の顆粒球を標的とすることができ、また、ＣＥＡＣＡＭ６を発現する癌を標的とすることもできる。
一つの態様では、治療薬はオリゴヌクレオチドである。例えば、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖のオリゴヌクレオチドであってよく、二本鎖干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子であってもよい。オリゴヌクレオチドは、ｂｃｌ‐２又はｐ５３のような癌遺伝子に対抗するものであってよい。ｂｃｌ‐２の発現を抑制するアンチセンス鎖分子は、米国特許第５，７３４，０３３号に記載されている。オリゴヌクレオチドは、安定係留構造体と複合体形成してもよく、安定係留構造体の治療薬部分を形成してもよい。別の選択肢として、オリゴヌクレオチドは、安定係留構造体と同時に又は順に投与してもよい。
別の態様では、治療薬はボロン付加体であり、治療は、治療薬の局在化の後の熱中性子又は熱外中性子の照射を伴う。治療薬は、特に色素原又は色素である光活性治療薬であってもよい。
好ましい態様では、治療薬は、薬物又はトキシンなどの細胞毒性剤である。さらに好ましくは、薬物が、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホン酸、ニトロソ尿素、ゲムシタビン、トリアゼン、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ‐２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗生物質、酵素、酵素阻害剤、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制薬、ホルモン拮抗薬、エンドスタチン、タキソール、ＳＮ３８、カンプトテシン、ドキソルビシン及びその類似体、代謝拮抗薬、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、メトトレキサート、ＣＰＴ‐１１、及びこれらの組み合わせ、から成る群より選択される。
別の好ましい態様では、治療薬は、動物源、植物源、及び微生物源を含む群より選択されるもの由来のトキシンである。好ましいトキシンとしては、リシン、アブリン、αトキシン、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン‐Ａ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ジフテリントキシン（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉｎ ｔｏｘｉｎ）、シュードモナスエキソトキシン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｏｔｏｘｉｎ）、及びシュードモナスエンドトキシン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）が挙げられる。
治療薬は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、幹細胞増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、及びこれらの組み合わせなどの免疫調節剤であってよく、前記のリンホトキシンは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）である。造血因子はインターロイキン（ＩＬ）であってよく、コロニー刺激因子は顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）若しくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）であってよく、インターフェロンはインターフェロンα、β、若しくはγであってよく、幹細胞増殖因子はＳ１因子であってよい。別の選択肢として、免疫調節剤は、ＩＬ‐１、ＩＬ‐２、ＩＬ‐３、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１７、ＩＬ‐１８、ＩＬ‐２１、インターフェロン‐γ、ＴＮＦ‐α、又はこれらの組み合わせを含んでもよい。
好ましい治療用放射性核種には、ｋｅＶの範囲が８０乃至５００ｋｅＶであるβ、α、及びオージェ電子放射体が含まれる。典型的な治療用放射性核種としては、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、８６Ｙ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１１１Ｉｎ、１１１Ａｇ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１９８Ａｕ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、及び２２５Ａｃ、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。典型的な光活性治療薬は、色素原及び色素を含む群より選択される。
さらに好ましくは、治療薬は、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ‐Ｖ‐ステロイド異性化酵素、酵母アルコール脱水素酵素、α‐グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸異性化酵素、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース酸化酵素、β‐ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-６-リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼ、を含む群より選択される酵素である。
治療薬ペプチドの種々の例は本技術分野で公知であり、そのようないずれの公知の治療薬も使用することができる。典型的な治療薬ペプチドとしては、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、結合ペプチド、ブロッキングペプチド、トキシン、血管新生因子、抗血管新生因子、抗生物質、抗癌性ペプチド、抗ウイルス性ペプチド、医薬用ペプチド、酵素、刺激薬、拮抗薬、エリスロポエチンなどの造血剤、及びその他の多くの臨床的に有用な化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
安定係留構造体は、少なくとも一つの炎症誘発性エフェクターサイトカイン、炎症誘発性エフェクターケモカイン、又は炎症誘発性エフェクター受容体と特異的に結合することができる。安定係留構造体が結合することができる炎症誘発性エフェクターサイトカインとしては、ＭＩＦ、ＨＭＧＢ‐１、ＴＮＦ‐α（腫瘍壊死因子α）、ＩＬ‐１、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１７、及びＩＬ‐１８が挙げられるが、これらに限定されない。炎症誘発性エフェクターケモカインとしては、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＩＬ‐８、ＭＣＰ‐１（単球走化性タンパク質１）、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ‐１Ａ（マクロファージ炎症性タンパク質１Ａ）、ＭＩＰ‐１Ｂ（マクロファージ炎症性タンパク質１Ｂ）、ＥＮＡ‐７８（上皮好中球活性化ペプチド７８（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ７８））、ＩＰ‐１０、ＧＲＯＢ（ＧＲＯβ）、及びエオタキシンが挙げられるが、これらに限定されない。炎症誘発性エフェクター受容体としては、ＩＬ‐４Ｒ、ＩＬ‐６Ｒ、ＩＬ‐１３Ｒ、ＩＬ‐１５Ｒ、ＩＬ‐１７Ｒ、及びＩＬ‐１８Ｒが挙げられるが、これらに限定されない。安定係留構造体は、組織因子又はトロンビンなどの少なくとも一つの凝固因子とも特異的に反応することができる。リンホカイン／サイトカインは、免疫細胞上のこれらの受容体と反応して活性化を引き起こし、抗体は、リンホカイン／サイトカインを中和することによって活性化を阻害する。別の選択肢として、抗体は、リンホカイン／サイトカインの受容体と反応して活性化を阻害することができる。
安定係留構造体が特異的に結合する異なる標的は、同じ種類又は異なる種類のエフェクター及び凝固因子由来のものであってよい。例えば、安定係留構造体が特異的に結合する２若しくは３種類以上の異なる標的は、２若しくは３種類以上の炎症誘発性エフェクターサイトカイン、２若しくは３種類以上の炎症誘発性エフェクターケモカイン、２若しくは３種類以上の炎症誘発性エフェクター受容体、又は２若しくは３種類以上の凝固因子など、同じ種類のエフェクター又は凝固因子から選択されてもよい。別の選択肢として、２若しくは３種類以上の異なる標的は、異なる種類のエフェクター又は凝固因子から選択されてもよい。例えば、一つの標的は、先天性免疫システムの炎症誘発性エフェクターであり、一つの標的は凝固因子であってよい。又は、安定係留構造体は、少なくとも一つの炎症誘発性エフェクターサイトカイン及び少なくとも一つの炎症誘発性エフェクターケモカイン、少なくとも一つの炎症誘発性エフェクターサイトカイン及び少なくとも一つの炎症誘発性エフェクター受容体、又は少なくとも一つの炎症誘発性エフェクターケモカイン及び少なくとも一つの炎症誘発性エフェクター受容体など、２つの異なる種類の炎症誘発性エフェクターと特異的に反応してもよい。安定係留構造体が特異的に反応する二つの異なる標的が、先天性免疫システムの同じ炎症誘発性エフェクターの一つを超えるエピトープ、又は同じ凝固因子の一つを超えるエピトープである場合もある。
従って、「二つの異なる標的」とは、二つの異なる抗原、又は同じ抗原の二つの異なるエピトープを意味する場合がある。複数の抗体を同一の抗原に用いて結合価を上げることができる。例えば、特に敗血症、ある種の癌、及び動脈硬化プラークの治療を目的としてＭＩＦ又はＨＭＧＢ‐１を標的とする場合、標的の二つの同一のエピトープに結合する二つの抗体を、ＣＤ７４などのＨＬＡクラスＩＩインバリアント鎖抗原などの異なる抗原に対する１若しくは２個以上の結合アームを有する別の抗体と共に、安定係留構造体に取り込むことができる。抗体は、例えば、ＭＩＦ及びＣＤ７４に対する抗体；ＨＭＧＢ‐１及びＣＤ７４に対する抗体、などのように二つの異なる抗原に結合するものを選択することができる。
炎症誘発性エフェクター受容体を標的とする場合、好ましい態様では、実際の標的は炎症誘発性エフェクター受容体の細胞外ドメインであってよい。別の選択肢としての態様では、安定係留構造体は、炎症誘発性エフェクター受容体に対する反応性を有する少なくとも一つの分子を含んでもよい。この分子は、受容体と特異的に相互作用を生ずる、前記の炎症誘発性エフェクター受容体に対する天然の拮抗物質、又はこの拮抗物質の断片若しくは変異体であってよい。好ましい態様では、天然の拮抗物質は、天然のＩＬ‐１受容体拮抗物質、又はこの拮抗物質の断片若しくは変異体である。
一つの態様では、標的は、適応性免疫システムの抗原又は受容体であってよい。他の態様では、安定係留構造体の標的は、顆粒球、単球、マクロファージ、樹状細胞、及びＮＫ‐細胞などの先天性免疫システムの細胞上に発生するものであってよい。その他の標的には、血小板及び内皮細胞が含まれる。さらに別の標的の群は、Ｃ５ａ、ＬＰＳ、ＩＦＮγ、及びＢ７から成る群である。適切な標的のさらなる群には、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ＣＤ８３、ＣＤ１４７、及びＣＤ１５４が含まれる。ＣＤは免疫細胞上の標的であり、これらを阻害して免疫細胞の応答を阻止することができる。ＣＤ８３は活性化樹状細胞のマーカーとして特に有用である（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，Ａｕｇ．２３，２００４(Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ)；Ｚｉｎｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００(３)：３４５‐５１(２００４)）。
ＭＩＦ、ＨＭＧＢ‐１、ＴＮＦ‐α、補体因子及び補体制御タンパク質、並びに凝固因子などの特定の標的が特に重要である。ＭＩＦは、先天性免疫システムの中枢的なサイトカインであり、炎症反応の制御において重要な役割を担っている。元々はマクロファージのランダムな遊走を阻害する、Ｔリンパ球由来の因子として説明されていた、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）として知られるタンパク質は、ほぼ３０年の間謎のサイトカインであった。近年、ＭＩＦが脳下垂体前葉の産物であることの発見、並びに生理活性な組換えＭＩＦタンパク質のクローニング及び発現により、そのインビボでの重要な役割が明らかとなった。ＭＩＦは、グルココルチコイドによって刺激されたマクロファージ及びＴリンパ球から放出されるという独特の性質を有する。放出されると、ＭＩＦは、インビトロで、ＬＰＳ刺激された単球によるＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β、 ＩＬ‐６、及びＩＬ‐８の産生に対するグルココルチコイドの阻害作用を克服し、インビボで、致死の内毒血症に対するステロイドの保護作用を抑制する。ＭＩＦはさらに、ＩＬ‐２及びＩＦＮ‐γの産生を回復させることにより、インビトロでグルココルチコイドによるＴ細胞増殖の阻害を拮抗する。ＭＩＦは、グルココルチコイドの阻害作用を対抗制御することができると認識された最初のメディエーターであり、従って、ホストの炎症及び免疫を制御する重要な役割を果たしている。ＭＩＦは、癌、病的血管新生、及び敗血症又は敗血症性ショックに特に有用である。
ＤＮＡ結合性の核及び細胞質タンパク質であるＨＭＧＢ‐１は、ＩＬ‐１β、ＴＮＦ、又はＬＰＳによって活性化された単球及びマクロファージから放出される炎症誘発性サイトカインである。これは、そのＢボックスドメインを介して、ＤＣの表現型の成熟を誘起する。さらに、炎症誘発性サイトカインであるＩＬ‐１α、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１２、ＴＮＦ‐α、及びＲＡＮＴＥＳの分泌の増加も引き起こす。壊死細胞から放出されたＨＭＧＢ‐１は、組織障害又は細胞障害のシグナルである場合があり、これらはＤＣによって検知されると、免疫応答を誘起し、及び／又は増大させる。Ｐａｌｕｍｂｏ ｅｔ ａｌ．の報告によれば、ＨＭＢＧ１は、中胚葉性血管芽細胞の遊走と増殖を誘起する（Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１６４：４４１‐４４９ (２００４)）。
ＨＭＧＢ‐１は、ＴＮＦ及びＩＬ‐１βに関連する著しく遅れた動態を示すエンドトキシンによる致死性の後期メディエーターである。ＴＮＦ及びＩＬ‐βなどの特定の早期の炎症メディエーターを標的とする試験薬単独では有効であることが診療所において示されなかったが、安定係留構造体は、早期及び後期の両方の炎症メディエーターを標的とすることにより、応答を改善することができる。
ＨＭＢＧ‐１を標的とする安定係留構造体は、関節炎、特にコラーゲン関節炎の治療に有用である。ＨＭＢＧ‐１を含む安定係留構造体も、敗血症及び／又は敗血症性ショックの治療に有用である。Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０１：２９６‐３０１ (２００４)；Ｋｏｋｋｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，４８：２０５２‐８(２００３)；Ｃｚｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，１８７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ３９１‐６ (２００３)；Ｔｒｅｕｔｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ，２５４：３７５‐８５(２００３)。
ＴＮＦ‐αは、全身炎症及び急性期応答に関わる重要なサイトカインである。ＴＮＦ‐αは、刺激を受けた単球、線維芽細胞、及び内皮細胞から放出される。マクロファージ、Ｔ細胞及びＢリンパ球、顆粒球、平滑筋細胞、好酸球、軟骨細胞、骨芽細胞、マスト細胞、グリア細胞、並びにケラチノサイトも、刺激後、ＴＮＦ‐αを産生する。その放出は、例えば感染などの障害の過程の中で、インターロイキン１及び菌体エンドトキシンなどの他のいくつかのメディエーターによって促進される。一般的にはインターロイキン‐１及び‐６と共に、種々の器官系上で数多くの作用を起こす。ＴＮＦ‐αの作用の一つとして食欲抑制があり；従って、悪液質の治療のための安定係留構造体は、ＴＮＦ‐αを標的とすることが好ましい。さらに、肝臓の急性期応答も促進し、これによってＣ反応性タンパク質及び数多くのその他のメディエーターの増大が引き起こされる。敗血症又は敗血症性ショックの治療時にも有用な標的となる。
補体系は、細胞受容体によって活性化されることの多い血清の糖タンパク質の切断が関与する、複雑なカスケードである。「補体カスケード」は、恒常的であり、非特異的であるが、機能するためには活性化されなければならない。補体活性化により、酵素的、及び生化学的反応が一方向に連続的に発生する。このカスケードでは、特定の補体タンパク質、Ｃ５が、２種類の高活性な炎症性副生物、Ｃ５ａ及びＣ５ｂを形成し、これらは一緒になって白血球細胞を活性する。次に、これが、有害サイトカイン、炎症性酵素、及び細胞接着分子を含む数多くのその他の炎症性副生物を誘起する。これらの副生物は一緒になって、多くの炎症性疾患に見られる組織の破壊を引き起こすことができる。このカスケードは、最終的には炎症反応、貪食細胞の走化性、オプソニン化、及び細胞溶解を誘起する結果となる。
補体系は、古典経路及び代替経路という、二つの異なる経路を介して活性化することができる。ほとんどの補体成分は番号が付されているが（例：Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、など）、「因子」と呼ばれるものもある。成分の中にはその機能を活性化するために酵素による切断が必要なものもあり；単に組み合わさることで活性な複合体を形成するものもある。古典経路における活性成分には、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ２ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ４ａ、及びＣ４ｂが含まれる。代替経路の活性成分には、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、因子Ｂ、因子Ｂａ、因子Ｂｂ、因子Ｄ、及びプロパージンが含まれる。各経路の最後のステージは同じであり、成分の集合による膜侵襲複合体の形成が関与する。膜侵襲複合体の活性成分には、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、及びＣ９ｎが含まれる。
補体系のこれらの成分はいずれも安定係留構造体の標的とすることができるが、特定の補体成分が好ましい。Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、及びＣ５ａは、マスト細胞からヒスタミン及びセロトニンなどの走化性因子を放出させ、これらは貪食細胞、抗体、及び補体などを誘因する。これらは好ましい標的の一つの群を形成する。好ましい標的の別の群は、Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ、及びＣ５ｂを含み、これらは外来細胞の食作用を促進する。標的の別の好ましい群は、これら二つの群の前駆成分、すなわちＣ３、Ｃ４、及びＣ５である。Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、及びＣ９は、外来細胞（膜侵襲複合体）の溶解を誘起し、さらに標的の別の好ましい群を形成する。
補体Ｃ５ａは、Ｃ３ａと同様に、アナフィラトキシンである。これは炎症を媒介し、好中球からの抗菌性であるプロテアーゼ及び活性酸素の放出を誘起する走化性誘引物質である。従って、Ｃ５ａ及びその前駆体Ｃ５は、特に好ましい標的である。Ｃ５を標的とすることにより、Ｃ５ａに影響を与えるだけでなく、膜侵襲複合体の構築を開始するＣ５ｂにも影響を与える。従って、Ｃ５は別の好ましい標的である。Ｃ３ｂ、及びその前駆体Ｃ３は、古典補体経路及び代替補体経路の両方がＣ３ｂに依存しているため、これらも好ましい標的である。この因子のレベルに影響を及ぼすのは、Ｃ１インヒビター、タンパク質Ｈ、及び第Ｉ因子の三つのタンパク質であり、これらも本発明にかかる好ましい標的である。ＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９などの補体制御タンパク質を、安定係留構造体が結合する標的としてもよい。
凝固因子、特に組織因子（ＴＦ）及びトロンビンも好ましい標的である。ＴＦは、組織トロンボプラスチン、ＣＤ１４２、凝固第ＩＩＩ因子、又は第ＩＩＩ因子としても知られる。ＴＦは膜内在性受容体糖タンパク質であり、サイトカイン受容体スーパーファミリーに分類される。リガンドが結合するＴＦの細胞外ドメインは、ＴＦが２型サイトカイン受容体の一つに分類されることと一致した特徴を有する二つの構造モジュールから成る。ＴＦは、血液凝固プロテアーゼのカスケードに関与しており、ＴＦの細胞外ドメインと、循環血液凝固因子であるセリンプロテアーゼ第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩａ因子との間で高親和性複合体を形成することにより、外因性及び内因性の両方の血液凝固カスケードを開始する。このような酵素活性複合体は、続いて第ＩＸ因子及び第Ｘ因子を活性化し、トロンビンの発生及び血餅の形成を引き起こす。
ＴＦは、単球、マクロファージ、及び血管内皮細胞を含む様々な種類の細胞によって発現され、ＩＬ‐１、ＴＮＦ‐α、又は細菌性リポ多糖によって誘起される。プロテインキナーゼＣは、内皮細胞のＴＦ発現のサイトカインによる活性化に関与している。エンドトキシン及びサイトカインによるＴＦの誘起は、グラム陰性敗血症の患者に見られる播種性血管内凝固の開始の重要なメカニズムである。ＴＦは、炎症、癌、脳機能、免疫応答、及び腫瘍関連の血管新生を含む、止血以外の種々の機能にも関与していると思われる。従って、本発明によると、ＴＦを標的とする安定係留構造体は、凝固障害の治療だけでなく、敗血症、癌、病的血管新生、及びその他の免疫及び炎症性失調症の治療にも有用である。いくつかのサイトカインが種々の細胞内でのＴＦの発現に影響を及ぼす能力、及び受容体に結合するリガンドの効果により、凝固経路とサイトカインネットワークとの間の複雑な相互作用が示唆されている。リガンドの結合（第ＶＩＩａ因子）が細胞内カルシウムシグナルを発することが報告されており、このことはＴＦが真の受容体であることが示している。
トロンビンは、凝固因子ＩＩ（プロトロンビン）の活性化された形であり；フィブリノーゲンをフィブリンへ変換する。トロンビンはマクロファージに対する強力なケモタキシン（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｎ）であり、そのサイトカイン及びアラキドン酸代謝物の産生を変化させることができる。敗血症と併発する凝固障害において特に重要である。敗血症患者又はＬＰＳ投与を施した動物モデルにおける凝固システムの活性化について、数多くの研究が発表されている。３０年を超す研究にも関わらず、ＬＰＳで誘起される肝毒性のメカニズムに関してはよく分かっていない。現在のところ明らかなのは、これには、細胞性と液性のメディエーター間の複雑で連続的な一連の相互作用が関与しているということである。これと同時期に、グラム陰性の全身敗血症及びその予後（ｓｅｑｕａｌｌａｅ）が大きな健康上の問題となったが、ＬＰＳ又は種々の炎症メディエーターに対するモノクローナル抗体を用いた治療の試みは失敗に終わった。トロンビンと少なくとも一つのその他の標的を標的とする安定係留構造体は、敗血症治療の臨床定な失敗に対応するものである。
他の態様では、安定係留構造体は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、又はＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０、又はＣＤ８６などのアクセサリー分子と結合する。安定係留構造体は、Ｔ細胞活性化サイトカイン、又はＮＦ‐κＢなどのサイトカインメディエーターとも結合することができる。
特定の態様では、二つの異なる標的のうちの一つが癌細胞受容体、又は癌関連抗原、特には、Ｂ細胞系抗原（ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３など）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、テネイシン、ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ、ＥＧＰ‐１、ＥＧＰ‐２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１３８、ＮＣＡ６６、ＣＥＡＣＡＭ６（癌胎児抗原関連細胞接着分子６）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１６、ＩＬ‐６、α‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａ３、ＣＡ１２５、結腸特異性抗原ｐ（ＣＳＡｐ）、葉酸受容体、ＨＬＡ‐ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、Ｉａ、ＥＬ‐２、インスリン様増殖因子（ＩＬＧＦ）及びＩＬＧＦ受容体、ＫＳ‐１、Ｌｅ（ｙ）、ＭＡＧＥ、壊死抗原、ＰＡＭ‐４、前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、Ｐｒ１、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺膜特異抗原（ＰＳＭＡ）、Ｓ１００、Ｔ１０１、ＴＡＣ、ＴＡＧ７２、ＴＲＡＩＬ受容体、並びに炭酸脱水酵素ＩＸ、から成る群より選択されるものである。
敗血症、並びに免疫失調症及びその他の免疫性障害と関連する標的としては、ＭＩＦ、ＩＬ‐１、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、ＣＤ７４、ＣＤ８３、及びＣ５ａＲが挙げられる。Ｃ５ａＲに対する抗体及び阻害剤は、敗血症のげっ歯類 (Ｈｕｂｅｒ‐Ｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ ２００２；１６：１５６７‐１５７４；Ｒｉｅｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００２；１１０：１０１‐１０８)、並びに敗血症性ショック及び成人呼吸促迫症候群のサル（Ｈａｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ １９８９；４６：１９５‐１９９；Ｓｔｅｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９８６；７７：１８１２‐１８１６)の生存率を向上させることが明らかにされた。従って、敗血症に対しては、二つの異なる標的のうちの一つは、ＬＰＳ／Ｃ５ａなどの感染症に関連する標的が好ましい。その他の好ましい標的としては、ＨＭＧＢ‐１、ＴＦ、ＣＤ１４、ＶＥＧＦ、及びＩＬ‐６が挙げられ、これは各々敗血症又は敗血症性ショックと関連している。好ましい安定係留構造体は、ＭＩＦ／ＴＦ及びＨＭＧＢ‐１／ＴＦなど、ＨＭＧＢ‐１、ＴＦ、及びＭＩＦから選択される２若しくは３種類以上の標的を標的とするものである。
さらに他の態様では、二つの異なる標的のうちの一つは、ＭＩＦ（Ｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，３０(６)：３７５‐８０ (２００２)）などの移植片対宿主病又は移植拒絶反応に関連する標的であってよい。二つの異なる標的のうちの一つは、ＩＬ‐８などの急性呼吸促迫症候群に関連するもの（Ｂｏｕｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＭＣ Ｐｕｌｍ Ｍｅｄ， ４(１)：６(２００４)）、ＭＩＦなどの粥状動脈硬化若しくは再狭窄に関連するもの（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，２４(４)：７０９‐１４（２００４)）、ＩＬ‐１８などの喘息に関連するもの（Ｈａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｏｃｔ．１１，２００４ Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ）、ＴＮＦ‐αなどの肉芽腫症に関連するもの（Ｕｌｂｒｉｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，５０(８)：２７１７‐８ (２００４))、カルバミル化ＥＰＯ（エリスロポエチン）などの神経障害に関連するもの（Ｌｅｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５(５６８１)：１６４‐５(２００４)）、又はＩＬ‐６及びＴＮＦ‐αなどの悪液質に関連するもの、であってもよい。
他の標的としては、Ｃ５ａ、ＬＰＳ、ＩＦＮ‐γ、Ｂ７；ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２７、ＣＤ２９、ＣＤ３８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ＣＤ８３、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４が挙げられる。ＬＰＳを含む特定の微生物抗原による単球細胞の活性化は、ある程度ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ、又はＣＤ１１ｃに対する抗体によって阻害することができ、従ってβ２インテグリンの関与を示している（Ｃｕｚｚｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１６４：５８７１‐５８７６；Ｍｅｄｖｅｄｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８；１６０：４５３５‐４５４２）。ＣＤ８３は、巨細胞性動脈炎（ＧＣＡ）に関与していることが明らかにされ、この疾患は中程度から大きなサイズの動脈、主には大動脈弓及び大動脈そのものの頭蓋外枝に影響を及ぼす全身性血管炎であり、血管狭窄とこれに続く組織虚血、並びに失明、脳卒中、及び大動脈弓症候群の重度の合併症を引き起こす（Ｗｅｙａｎｄ ａｎｄ Ｇｏｒｏｎｚｙ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００３；３４９：１６０‐１６９；Ｈｕｎｄｅｒ ａｎｄ Ｖａｌｅｎｔｅ，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｖｅｓｓｅｌｓ．Ｇ．Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎ ａｎｄ Ｃ．Ｍ．Ｗｅｙａｎｄ，ｅｄｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００２； ２５５‐２６５）。ＣＤ８３に対する抗体は、ヒトＧＣＡのモデルであるＳＣＩＤマウスの血管炎を抑制することが明らかにされ（Ｍａ‐Ｋｒｕｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２００４；１９９：１７３‐１８３）、この研究者らによれば、このことは、活性化されることによってＣＤ８３を発現する樹状細胞が、ＧＣＡにおいて重要な抗原プロセシング細胞であることを示唆している。これらの研究においては、マウスの抗ＣＤ８３Ｍａｂ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ＩｇＧ１クローンＨＢ１５ｅ）が用いられた。ＴＮＦファミリーに分類されるＣＤ１５４は、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球の表面上で発現され、ＣＤ１５４に対するヒト化モノクローナル抗体が、活動性全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者に対して著しい臨床的効果をもたらしたことが報告された（Ｇｒａｍｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００３；１１２：１５０６‐１５２０）。この抗体がその他の自己免疫疾患に有用である可能性があることも示唆されている（Ｋｅｌｓｏｅ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００３；１１２：１４８０‐１４８２）。確かに、この抗体が難治性免疫性血小板減少性紫斑病の患者に効果的であったとする報告もなされた（Ｋｕｗａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００４；１０３：１２２９‐１２３６）。
関節リウマチにおいて、組み換えインターロイキン１受容体拮抗薬であるＩＬ‐１Ｒａ又はアンキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標））が活性を示した（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ２００４；６３：１０６２‐８；Ｃｏｈｅｎ， Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ２００４；３０：３６５‐８０）。今まではメトトレキサートを併用した治療が必要であったこのような患者の治療が、アナキンラを１又は２種類以上の抗炎症誘発性エフェクターサイトカイン又は抗炎症誘発性エフェクターケモカイン（上述）と組み合わせることによって向上する。確かに、関節リウマチの抗体治療のレビューにおいて、Ｔａｙｌｏｒ（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２００３；３：３２３‐３２８）は、ＴＮＦに加えて、ＩＬ‐Ｉ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐１７、及びＩＬ‐１８などのサイトカインに対するその他の抗体が有用であることを示唆している。
より好ましい標的の組み合わせのいくつかを以下に示す。これは好ましい組み合わせの例のリストであり、網羅的であることを意図したものではない。
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安定係留構造体は、少なくとも二つの別々の抗体及び／若しくは受容体、又は異なる標的に結合するこれらのリガンドを含む混合物であってよい。一つの好ましい態様では、標的は、先天性免疫システムの炎症誘発性エフェクター、凝固因子、補体因子及び補体制御タンパク質、並びに炎症性若しくは免疫失調性の障害、病的血管新生若しくは癌、又は感染性症と特異的に関連する標的から成る群より選択される。
安定係留構造体は、ＬＰＳ、ＩＬ‐Ｉ、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐６、ＭＩＦ、ＨＭＧＢ１、ＴＮＦ、ＩＦＮ、組織因子、トロンビン、ＣＤ１４、ＣＤ２７、及びＣＤ １３４などに対する受容体又は標的分子と結合することができる。これらの多くは受容体及び可溶型の両方として血中に存在する。安定係留構造体と結合することにより、速やかに血中から除去され、続いて、安定係留構造体の第二の成分によって、マクロファージなどの別の細胞を標的とし、その細胞、特にリソソームによって輸送、分解される。これは、第二の標的成分がマクロファージ及び樹状細胞によって発現されたＣＤ７４などの内在性抗原を標的とする場合に特に効果的である。これは、Ｈａｎｓｅｎによる米国特許第６，４５８，９３３号の開示と一致するが、炎症性サイトカイン及びその他の免疫失調症の免疫調節分子及び受容体、並びに癌の免疫療法のための癌抗原に焦点を当てている。
癌の治療のための好ましい安定係留構造体は、ＣＤ５５及び上述のいずれかの癌抗原に対する抗体、ＣＤ４６及び上述のいずれかの癌抗原に対する抗体、ＣＤ５９及び上述のいずれかの癌抗原に対する抗体、ＭＩＦ及び上述のいずれかの癌抗原に対する抗体、ＮＦ‐κＢ及び上述のいずれかの癌抗原に対する抗体、並びにＩＬ‐６及び上述のＩＬ‐６以外のいずれかの癌抗原に対する抗体を含む。
安定係留構造体は、１又は２種類以上の第二の治療薬と組み合わせて用いることができる。この第二の治療薬は、先天性免疫システムの成分に影響を与えるものであってもよい。又は、別の選択肢として、適応性免疫システムの成分に影響を与えてもよい。第二の治療薬は、細胞障害性薬物などの、凝固、癌、又は自己免疫疾患に影響を与える成分であってもよい。
診断薬又は治療薬を含む安定係留構造体は、薬理学的に許容される注入媒体、好ましくはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中、生理学的ｐＨ及び濃度で、ヒト又は哺乳類の治療及び診断に用いるキットとして提供することができる。製剤は、特にヒトに用いることを意図する場合は、無菌であることが好ましい。そのようなキットの任意の構成物としては、安定剤、バッファー、標識試薬、放射性同位元素、常磁性化合物、クリアランス促進のための第二抗体、及び従来のシリンジ、カラム、バイアルなどが挙げられる。
ファージディスプレイ
別の選択肢としてのある態様では、ＤＤＤ及び／又はＡＤドメインを構築する結合ペプチドは、本技術分野で公知のファージディスプレイ法によって同定することができる。例えば、ＤＤＤドメインに結合し、従って天然のＡＤ配列に置き換わることができるペプチドは、ＤＤＤ二量体に対するファージディスプレイパニングを行い、高い結合親和性を有するファージを選別することにより、識別することができる。特定の標的分子に選択的又は特異的な他の種類の結合ペプチドは、選択された標的に対してファージディスプレイパニングを行うことによって検出することができる。
多様なペプチドの集団を作製するための種々のファージディスプレイの方法及び技術は本技術分野で公知である。例えば、各々が参照することで本明細書に組み入れられる、米国特許第５，２２３，４０９号、第５，６２２，６９９号、及び６，０６８，８２９号は、ファージライブラリーを作製する方法を開示している。ファージディスプレイ技術は、バクテリオファージを遺伝学的に操作してその表面に低分子ペプチドが発現できるようにすることを含む（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５‐１３１７；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１：２２８‐２５７）。
過去十年の間に、ファージディスプレイによるペプチドライブラリーの構築、及びそのライブラリーを用いてペプチドリガンドを単離するスクリーニング法の開発において、著しい進展が見られた。例えば、ペプチドライブラリーを使用することにより、炎症反応に関与する抗体又は細胞接着を媒介するインテグリンなどの多くのタンパク質内の相互作用部位及び受容体‐リガンド結合モチーフを特徴付けることが可能となった。この方法は、ペプチド模倣薬又はイメージング剤の開発を可能とすることができる新規のペプチドリガンドの識別にも用いられている（Ａｒａｐ ｅｔ ａｌ．，１９９８ａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：３７７‐３８０）。ペプチドに加えて、単鎖抗体などのより大きなタンパク質ドメインも、ファージ粒子の表面上にディスプレイすることができる（Ａｒａｐ ｅｔ ａｌ．，１９９８ａ）。
ある標的分子に対して選択的な標的化アミノ酸配列は、パニングによって単離することができる（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ ａｎｄ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８０：３６４‐３６６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，１９９９，Ｔｈｅ Ｑｕａｒｔ． Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４３：１５９‐１６２）。簡潔に述べると、推定された標的化ペプチドを含むファージのライブラリーを標的分子へ投与し、ファージが結合したサンプルを回収する。標的分子は、例えば、９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェルの底に付着させてもよい。標的と結合したファージは溶出し、ホストバクテリア内で増殖させ、増幅することができる。
特定の態様では、パニングのラウンド間に、ファージをホストバクテリア内で増幅することができる。ファージによって溶解されるのではなく、バクテリアは、特定のインサートをディスプレイするファージの複製物を複数分泌することができる。所望する場合は、増幅されたファージを再度標的分子に曝露し、回収してさらなるパニングのラウンドを行うことができる。選択的な又は特異的なバインダーの集団が得られるまで、複数ラウンドのパニングを行うことができる。ペプチドのアミノ酸配列は、ファージゲノム内の標的化ペプチドインサートに対応するＤＮＡを配列決定することによって同定することができる。そして、識別された標的化ペプチドは、標準的なタンパク質化学技術による合成ペプチドとして作製することができる（Ａｒａｐ ｅｔ ａｌ．，１９９８ａ，Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。
アプタマー
特定の態様では、構築物形成の前駆体は、アプタマーを含むことができる。構築方法、及びアプタマーの結合特性の測定方法は、本技術分野で公知である。例えば、そのような技術は米国特許第５，５８２，９８１号、第５，５９５，８７７号、及び第５，６３７，４５９号に記載されており、これらは各々参照することで本明細書に組み入れられる。
アプタマーは、合成、遺伝子組換え、及び精製を含む公知のいかなる方法で作製してもよく、単独でも、又は同一の標的に特異的なその他のリガンドと組み合わせて使ってもよい。一般に、特異的な結合を行うには、最小で約３個、好ましくは少なくとも５個のヌクレオチドが必要である。１０、２０、３０、又は４０ヌクレオチドのアプタマーが好ましいであろうが、１０塩基よりも短い配列のアプタマーも使用可能である。
アプタマーは結合特異性を付与する配列を含む必要があるが、隣接領域で延長することもでき、又は誘導体化することもできる。好ましい態様では、アプタマーの結合配列にプライマー結合配列を隣接させることができ、これによってＰＣＲ又はその他の増幅技術によるアプタマーの増幅が促進される。さらなる態様では、隣接配列は、基質へのアプタマーの固定化を促進する部分を優先的に認識又はこれに結合する特定の配列を含むことができる。
アプタマーは、従来のＤＮＡ又はＲＮＡ分子のように、単離、配列決定、及び／若しくは増幅、又は合成することができる。別の選択肢として、対象であるアプタマーは修飾されたオリゴマーを含むことができる。アプタマーに通常存在するいずれのヒドロキシ基もホスホン酸基やリン酸基で置換したり、標準的な保護基で保護したり、活性化して他のヌクレオチドとのさらなる結合を形成したりすることができ、又は、固体支持体と複合体形成することができる。Ｐ（Ｏ）ＯをＰ（Ｏ）Ｓ、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、又はＣＮＲ２で置換するなど、１又は２個以上のリン酸ジエステル結合を別の連結基で置換することができ、この場合ＲはＨ又はアルキル（１乃至２０の炭素数）であり、Ｒ’はアルキル（１乃至２０の炭素数）であり；さらに、この基はＯ又はＳを介して隣接するヌクレオチドと結合していてもよい。オリゴマー中のすべての結合が同一である必要はない。
特定の対象標的を結合するアプタマーを調製し、スクリーニングする方法は、例えば、各々が参照することで本明細書に組み入れられる、米国特許第５，４７５，０９６号及び米国特許第５，２７０，１６３号によって公知である。この技術は一般に、候補アプタマーの混合物からの選別と段階的な結合の反復、非結合アプタマーからの結合アプタマーの分離、及び増幅を含む。最も高い親和性を有するアプタマーに対応する配列は混合物中にわずかな数しか存在しないため（恐らく、わずかにアプタマー１分子）、分離を行う間、相当量のアプタマー（約５乃至５０％）が混合物中に残るように分配基準を設定することが一般的に好ましい。サイクルごとに、標的への高い親和性を有するアプタマーが濃縮される。選別と増幅のサイクルを３乃至６回繰り返すことによって、高い親和性と特異性をもって標的と結合するアプタマーを作製することができる。
アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）
特定の態様では、本明細書で述べる前駆体、成分、及び／又は複合体は、１若しくは２個以上のアビマー配列を含むことができる。アビマーは、種々の標的分子に対する親和性及び特異性という点である程度抗体に類似している結合タンパク質の一種である。これは、ヒトの細胞外ドメインからインビトロでのエクソンシャッフリング及びファージディスプレイによって開発された（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３：１４９３‐９４；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２４：２２０）。得られたマルチドメインタンパク質は、複数の独立した結合ドメインを有することができ、それによって、エピトープが一つである結合タンパク質と比べて、向上した親和性（場合によってはサブナノモル）及び特異性を示すことができる（上記と同じ文献）。種々の態様において、アビマーは、請求された方法及び組成物に使用するために、例えばＡＤ及び／又はＤＤＤ配列と結合することができる。アビマーの構築及方法及び使用方法に関するさらなる詳細は、例えば、米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号、第２００５００４８５１２号、第２００５００５３９７３号、第２００５００８９９３２号、及び第２００５０２２１３８４号に開示されており、これらの文献の各々の実施例のセクションは、参照することで本明細書に組み入れられる。
タンパク質及びペプチド
請求された方法及び組成物の範囲内において、種々のポリペプチド又はタンパク質を使用することができる。特定の態様では、タンパク質は、抗体又は抗原結合性部位を有する抗体断片を含むことができる。他の態様では、タンパク質又はペプチドは、酵素、ホルモン、サイトカイン、結合性タンパク質、又はトキシンなどのエフェクターモジュールでもよい。
本明細書で用いるタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドは、一般に、約２００個を超えるアミノ酸から、遺伝子から翻訳された完全長の配列までのタンパク質；約１００個を超えるアミノ酸のポリペプチド；及び／又は約３個乃至約１００個のアミノ酸のペプチドを意味するが、これらに限定されない。便宜上、「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、本明細書では区別なく使用する。従って、「タンパク質又はペプチド」という用語は、天然のタンパク質に存在する２０種類の一般的なアミノ酸の少なくとも一つ、又は少なくとも一つの修飾されたアミノ酸若しくは特殊なアミノ酸を含むアミノ酸配列を包含する。
本明細書で用いる「アミノ酸残基」は、天然アミノ酸、本技術分野で公知のアミノ酸誘導体又は擬態アミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｉｍｉｃ）を意味する。特定の態様では、タンパク質又はペプチドの残基は連続しており、アミノ酸残基の配列を中断する非アミノ酸を含まない。他の態様では、配列は１又は２個以上の非アミノ酸を含むことができる。特別な態様では、タンパク質又はペプチドの残基の配列は、１又は２個以上の非アミノ酸部分によって中断されていてもよい。
従って、「タンパク質又はペプチド」という用語は、天然のタンパク質に存在する２０種類の一般的なアミノ酸の少なくとも一つ、又は少なくとも一つの修飾されたアミノ酸若しくは特殊なアミノ酸を含むアミノ酸配列を包含し、２‐アミノアジピン酸、３‐アミノアジピン酸、β‐アラニン、β‐アミノ‐プロピオン酸、２‐アミノ酪酸、４‐アミノ酪酸、ピペリジン酸、６‐アミノカプロン酸、２‐アミノヘプタン酸、２‐アミノイソ酪酸、３‐アミノイソ酪酸、２‐アミノピメリン酸、２，４‐ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２’‐ジアミノピメリン酸、２，３‐ジアミノプロピオン酸、Ｎ‐エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロヒドロキシリシン、３‐ヒドロキシプロリン、４‐ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ‐メチルグリシン、サルコシン、Ｎ‐メチルイソロイシン、６‐Ｎ‐メチルリシン、Ｎ‐メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、及びオルニチンを含むがこれらに限定されない。別の選択肢として、タンパク質又はペプチドは、天然のＬ‐アミノ酸に加えて、又はその代わりに、１若しくは２種類以上のＤ‐アミノ酸を含むことができる。Ｄ‐アミノ酸を組み込んだペプチドを作製する方法は、例えば、２００４年６月１４日出願、ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．、米国特許出願公開第２００５００２５７０９号に開示されている。
タンパク質又はペプチドは、標準的な分子生物学的技術によるタンパク質、ポリペプチド、若しくはペプチドの発現、タンパク質若しくはペプチドの自然源からの単離、又はタンパク質若しくはペプチドの化学合成を含む、当業者に公知のいかなる技術を用いて作製してもよい。種々の遺伝子に対応するヌクレオチド配列、並びにタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドの配列は、過去に開示されており、当業者に公知のコンピュータデータベースから探し出すことができる。そのようなデータベースの一つは、米国生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎｂａｎｋ及びＧｅｎＰｅｐｔである。公知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示された技術、若しくは当業者に公知であろう技術を用いて、増幅及び／又は発現することができる。別の選択肢として、種々の市販されているタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドの製剤が当業者に公知である。
ペプチドミメティック
ポリペプチドの作製に関する別の態様は、ペプチドミメティックの使用である。ミメティックは、タンパク質の二次構造の要素を擬態するペプチド含有分子である。例えば、参照することで本明細書に組み入れられる、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｕｒｎ Ｍｉｍｅｔｉｃｓ”ｉｎ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＹ，Ｐｅｚｚｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ(１９９３)、を参照のこと。ペプチドミメティック用いることの裏づけとなる論理的根拠は、タンパク質のペプチドバックボーンが、抗体と抗原などの分子間の相互作用を促進するようにアミノ酸側鎖を配向するために主に存在するということである。ペプチドミメティックは天然分子に類似の分子相互作用を行うことができると考えられる。これらの原理を用いて、本明細書で開示する結合ペプチドの自然の性質の多くを有するが、胃や腸での吸収率の向上、及び／又はインビボでの安定性若しくは活性の改善など、特性が変化又は改善された第二世代の分子を設計することができる。
融合タンパク質
種々の態様は、融合タンパク質に関連するであろう。このような分子は、一般に、ペプチドの全部分又は大部分を有し、Ｎ末端若しくはＣ末端において、第二のポリペプチド若しくはタンパク質の全部分又は一部分と結合している。例えば、融合は、他の種のリーダー配列を利用することができ、異種ホスト内でのタンパク質の組換え発現を可能とする。別の有用な融合としては、抗体エピトープなどの免疫活性ドメインの付加がある。さらに別の有用な融合の形としては、ＦＬＡＧエピトープなど、精製に用いる部分の結合を挙げることができる（Ｐｒｉｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：５８０‐５８９；Ｃａｓｔｒｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６６：４６４７‐４６５３）。融合タンパク質の別の使用は、例えば、第一のモノマーに結合したＤＤＤ配列及び第二のモノマーに結合したＡＤ配列を提供するなど、本発明で請求される係留複合体の成分の構築に関連するであろう。
融合タンパク質の作製方法は、当業者に公知である。このようなタンパク質は、例えば、二官能の架橋剤を用いた化学結合、完成した融合タンパク質の新規合成、又は第一のタンパク質若しくはペプチドをコードするＤＮＡ配列を第二のペプチド若しくはタンパク質をコードするＤＮＡ配列に結合させ、続いて以下の実施例で例示するように、インタクトな融合タンパク質を発現させる。
合成ペプチド
タンパク質又はペプチドは、その全体又は一部を、従来の技術に従って溶液中又は固体支持体上で合成することができる。種々の自動合成機が市販されており、公知のプロトコルに従って使用することができる。例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， (１９８４，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ． ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．)；Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，(１９８３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０５：６４４２)；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，(１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２：３４１‐３４７)；及びＢａｒａｎｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ (１９７９，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１‐２８４)、を参照のこと。普通は約６から約３５乃至５０アミノ酸までである短いペプチド配列を、このような方法で容易に合成することができる。別の選択肢として、組換えＤＮＡ技術を用いることができ、この場合、対象のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターへ挿入し、適切なホスト細胞中へトランスフォーム又はトランスフェクトし、発現に適した条件下で培養する。
ペプチドの投与
請求された方法及び／又は組成物の種々の態様は、対象へ投与される１又は２種類以上のペプチドを主体とする安定係留構造体に関連するであろう。投与は、経口、経鼻、頬側、吸入、直腸内、腟内、局所、同所、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、くも膜下腔内、又は静脈内注射を含むがこれらに限定されない、本技術分野で公知のいかなる経路によっても行うことができる。
対象へ経口投与された未修飾ペプチドは、消化管で分解される場合があり、配列と構造によっては、腸の内壁を通しての吸収が低い場合がある。しかし、ペプチドを化学修飾して内在性プロテアーゼによる分解に対する感受性を抑えたり、又は消化管を通しての吸収性を高めたりする方法はよく知られている（例えば、Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６９：６０４‐１１；Ｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｃｒｏｏｋｅ，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：３５１‐６９；Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｒｏ，１９９５，ＢＵＲＧＥＲ’Ｓ ＭＥＤＩＣＩＮＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ，ＶＯＬ．Ｉ，ｅｄ．Ｗｏｌｌｆ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｏ，１９９６，Ｐｕｒｅ ＆ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６８：１３０３‐０８、を参照）。Ｄ‐アミノ酸を含むペプチド；ペプチドの構造を擬態する有機分子から成るペプチドミメティック；又は、ビニル性（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ペプトイドなどのペプトイド、などのペプチド類似体のライブラリーを作製する方法も報告されており、対象への経口投与に適したペプチドを主体とした安定係留構造体の構築に用いることができきる。
特定の態様では、通常のペプチド結合を、ＣＨ２‐ＮＨ、ＣＨ２‐Ｓ、ＣＨ２‐ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、ＣＯ‐ＣＨ２、ＣＨＯＨ‐ＣＨ２、などの１又は２個以上の別の連結基に置換することができる。ペプチドミメティックを作製する方法はよく知られている（例えば、各々が参照することで本明細書に組み入れられる、Ｈｒｕｂｙ，１９８２，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３１：１８９‐９９；Ｈｏｌｌａｄａｙ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２４：４４０１‐０４；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ‐Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２３：２５３３；Ａｌｍｑｕｉｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ２３：１３９２‐９８；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ． １４：１７７‐１８５；Ｓｐａｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３８：１２４３‐４９；米国特許第５，１６９，８６２号;第５，５３９，０８５号;第５，５７６，４２３号、第５，０５１，４４８号、第５，５５９，１０３号、を参照）。ペプチドミメティックは、そのペプチド類似体に比べて高いインビボでの安定性及び／又は吸収性を示すことができる。
別の選択肢として、Ｎ末端及び／又はＣ末端をキャップすることでエキソペプチダーゼ活性を阻害したペプチドを経口送達によって投与することができる。例えば、Ｃ末端はアミドペプチドを用いてキャップすることができ、Ｎ末端はペプチドのアセチル化でキャップすることができる。ペプチドは、環化し、例えば環状のアミド、ジスルフィド、エーテル、スルフィド、などを形成することでエキソペプチダーゼを阻止することもできる。
ペプチドは、特にエキソペプチダーゼが活性を示すことが知られている部位の天然のＬ‐アミノ酸をＤ‐アミノ酸で置換することによっても安定化することができる。エキソペプチダーゼの結合配列及び切断配列は本技術分野で公知であり、Ｄ‐アミノ酸を組み込んだペプチドを作製し使用する方法は報告されている（例えば、参照することで本明細書に組み入れられる、２００４年６月１４日出願、ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．、米国特許出願公開第２００５００２５７０９号）。特定の態様では、ペプチド及び／又はタンパク質を、プロテイナーゼ阻害剤及び／又はペプチターゼ阻害剤と共に製剤することにより、経口投与することができる。
治療用ペプチドの経口送達のその他の方法は、Ｍｅｈｔａ（”Ｏｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｈｏｒｍｏｎｅｓ，” Ｊｕｎｅ ２００４，ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）によって開示されている。ペプチドは、腸のタンパク質分解活性を調節し、腸壁を通してのペプチドの輸送を促進する賦形剤を含む腸溶コーティングされた固体剤形として投与される。インタクトなペプチドのこの技術を用いた相対生体利用率は、投与量の１％乃至１０％の範囲であった。コール酸ナトリウム及びプロテアーゼ阻害剤を含む、腸溶コーティングされたマイクロカプセルを用いることにより、インスリンのイヌへの投与が成功した（Ｚｉｖ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ． １８ (Ｓｕｐｐｌ．２)：７９２‐９４）。ペプチドの経口投与が、浸透促進剤及び腸溶コーティングとしてアシルカルニチンを用いて行われた（Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ３０Ｄ‐５５、Ｒｏｈｍ Ｐｈａｒｍａ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社、Ｍｅｈｔａ，２００４を参照）。経口投与されるペプチドに用いられる賦形剤としては、一般に、界面活性剤又はペプチドの溶解性若しくは吸収性を高めるためのその他の剤と共に、１若しくは２種類以上の腸のプロテアーゼ／ペプチダーゼの阻害剤を挙げることができ、これらは腸溶コーティングされたカプセル又は錠剤内にまとめて含めておくことができる（Ｍｅｈｔａ、２００４）。カプセル内に有機酸を含めることにより、腸内でカプセルが溶解した時に腸を酸性にし、腸のプロテアーゼの活性を阻害することができる（Ｍｅｈｔａ、２００４）。ペプチドの経口送達の別の選択肢としては、吸収と酵素分解に対する耐性を高める、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を主体とする両親媒性オリゴマーとの複合体形成が挙げられるであろう（Ｓｏｌｔｅｒｏ ａｎｄ Ｅｋｗｕｒｉｂｅ，２００１，Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．６：１１０）。
さらに他の態様では、ペプチドは、経口又は吸入投与のために、ＩｇＧ１のＦｃ領域などの特定のタンパク質との複合体形成によって修飾することができる（実施例３乃至７参照）。ペプチド‐Ｆｃ複合体の作製及び使用の方法は、例えば、Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（２００５，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．２０：１８０５‐１３）及びＤｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．(２００５，Ｊ．Ａｅｒｏｓｏｌ．Ｍｅｄ．１８：２９４‐３０３)に開示されており、これらは各々参照することで本明細書に組み入れられる。Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．(２００５)は、ＣＨＯ細胞中の組換え発現を用いることによる、ＦＳＨのα及びβサブユニットと、単鎖若しくはヘテロ二量体の形のＩｇＧ１のＦｃ領域との複合体形成について開示している。Ｆｃと複合体形成したペプチドは、新生児Ｆｃ受容体（ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）が媒介する輸送システムにより肺又は腸の上皮細胞を通して吸収された。Ｆｃと複合体形成したペプチドは、天然のペプチドと比べて、インビボでの高い安定性と吸収性を示した。ヘテロ二量体複合体の方が、単鎖型のものよりも活性であることも観察された。
架橋剤
ある態様では、タンパク質、ペプチド、又はその他の高分子は、ホモ二官能性架橋剤、ヘテロ二官能性架橋剤、及び／又は光活性化が可能な架橋剤などの本技術分野で公知の種々の架橋剤を用いて、共有結合によって架橋することができる。そのような架橋剤の限定されない例としては、１，５‐ジフルオロ‐２，４‐（ジニトロベンゼン）；Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドのスベリン酸エステル；酒石酸ジスクシンイミジル、ジメチル‐３，３’‐ジチオビスプロピオンイミデート；Ｎ‐スクシンイミジル‐３‐（２‐ピリジルチオ）プロピオネート；４‐（ブロモアミノエチル）‐２‐ニトロフェニルアジド；及び４‐アジドグリオキサールが挙げられる。典型的な態様では、ＤＣＣＤ又はＥＤＣなどのカルボジイミド架橋剤を用いて酸性残基をアミノ基又はその他の基と架橋させることができる。そのような架橋剤は修飾して、蛍光標識剤などの種々の標識剤と結合させることができる。
二官能性架橋剤は、様々な目的に広く用いられている。二つの同じ官能基を有するホモ二官能性架橋剤は、同一の及び異なる高分子の間、又は高分子サブユニットの間の架橋、並びにポリペプチドのリガンドとその特異的な結合部位との連結を、高い効率で誘起することが示された。ヘテロ二官能架橋剤は、二つの異なる官能基を有する。この二つの異なる官能基の反応性の違いを利用して、架橋の選択性と順序の両方を制御することができる。二官能性架橋剤は、例えばアミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、カルボキシに特異的な基など、その官能基の特異性に応じて分類することができる。当然、遊離アミノ基に対する架橋剤は、その市場での手に入りやすさ、合成の容易さ、及び適用される反応条件の温和さのため、特によく用いられている。ヘテロ二官能架橋剤の大部分は、一級アミノ基と反応する基及びチオール基と反応する基を含む。
別の例として、ヘテロ二官能架橋剤及びこの架橋剤の使用方法が報告されている（米国特許第５，８８９，１５５号）。この架橋剤は、求核性のヒドラジド残基と求電子性のマレイミド残基を連結させ、一つの例では、アルデヒドと遊離のチオールとを結合させる。架橋剤は修飾して、種々の官能基を架橋させることができる。
抗体
種々の態様は、標的に対する抗体に関連するであろう。本明細書で用いる「抗体」という用語は、抗原結合領域を有するいかなる抗体様分子も意味し、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、などの抗体断片が含まれる。種々の抗体を主体とする構築物及び断片を調製し、使用する技術は、本技術分野で公知である。抗体の調製及びキャラクタリゼーションの方法も本技術分野で公知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗｅ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、を参照）。有用な抗体は、広範囲にわたる公知の様々な供給者から購入することもできる。例えば、ハイブリドーマ細胞系を分泌する種々の抗体が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ (ＡＴＣＣ、バージニア州、マナサス)より入手可能である。
抗体断片の作製
請求項に記載した方法及び／又は組成物のある態様は、抗体断片に関連するであろう。そのような抗体断片は、従来の方法により、全抗体のペプシン又はパパインによる分解によって得ることができる。例えば、抗体断片は、ペプチンによる抗体の酵素切断によって作製することができ、Ｆ（ａｂ’）２断片が得られる。この断片はチオール還元剤を用いてさらに切断し、続いて任意に、ジスルフィド結合の開裂によって生成したスルフヒドリル基のブロックを行い、一価のＦａｂ’断片を作製することができる。別の選択肢として、パパインを用いた酵素切断により、一価のＦａｂ断片が２個とＦｃ断片が１個作製される。抗体断片を作製する典型的な方法は、米国特許第４，０３６，９４５号；米国特許第４，３３１，６４７号；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９６０，Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８９：２３０；Ｐｏｒｔｅｒ，１９５９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７３：１１９；Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６７，ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ｐａｇｅ ４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ)、及びＣｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．(ｅｄｓ．)，１９９１，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，(Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ)、に開示されている。
重鎖の分離による一価の軽鎖‐重鎖断片の形成、さらなる断片の切断、又はその他の酵素的、化学的、若しくは遺伝子的技術などの、抗体を切断するその他の方法を、インタクトな抗体によって認識される抗原にその断片が結合する限りにおいて、用いることができる。例えば、Ｆｖ断片は対合するＶＨ鎖とＶＬ鎖を含む。この対合は、Ｉｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，１９７２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２６５９、に記載のように、非共有結合であり得る。別の選択肢として、種々の鎖を、分子間ジスルフィド結合によって結合したり、又はグルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋させたりすることができる。Ｓａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７、を参照のこと。
Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーによって連結されたＶＨ鎖とＶＬ鎖を含むことが好ましい。このような単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドリンカー配列によって連結された、ＶＨドメインとＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって作製される。この構造遺伝子は、発現ベクターに挿入され、続いて大腸菌などのホスト細胞中へ導入される。この組換えホスト細胞は、二つのＶドメインがペプチドリンカーで架橋された単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを作製する方法は本技術分野で公知である。Ｗｈｉｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：９７；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３；米国特許第４,９４６,７７８号;Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１２７１、及びＳａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７を参照のこと。
抗体断片の別の形は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小の認識ユニット」）は、対象の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することで得ることができる。そのような遺伝子は、例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体産生細胞のＲＮＡから種々の領域を合成することなどによって得られる。Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６；Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．(ｅｄｓ．)，１９９５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，ｐａｇｅｓ １６６‐１７９(Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ)；Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，(ｅｄｓ．)，１９９５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ｐａｇｅｓ １３７‐１８５(Ｗｉｌｅｙ‐Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．)、を参照のこと。
キメラ及びヒト化抗体
キメラ抗体は、ヒト抗体の種々の領域が、例えば、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むマウス抗体の種々の領域などに置換された、組換えタンパク質である。対象に投与されると、キメラ抗体は、低下した免疫原性と向上した安定性を示す。キメラ抗体を構築する方法は、本技術分野で公知である（例：Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １３：４６９）。
キメラモノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンのＨ鎖及びＬ鎖の可変領域からヒト抗体の対応するドメインへマウスＣＤＲを転移することによってヒト化することができる。キメラモノクローナル抗体内のマウスフレームワーク領域（ＦＲ）も、ヒトＦＲ配列で置換される。ヒト化モノクローナル抗体の安定性と抗原特異性を保持するため、１又は２個のヒトＦＲ残基をマウスの対応する残基で置換することができる。ヒト化モノクローナル抗体は、対象の治療的処置に用いることができる。ヒト化抗体の標的に対する親和性を、ＣＤＲ配列の選択的な修飾によって高めることもできる（国際公開公報ＷＯ００２９５８４Ａ１）。ヒト化モノクローナル抗体を作製する技術は本技術分野で公知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２：３２３；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９２，１２：４３７；Ｔｅｍｐｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６；Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９３，１５０：２８４４、を参照）。
他の態様は、非ヒト霊長類の抗体に関連するであろう。ヒヒの内部で治療に有用な抗体を産生させる一般的な技術は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，国際公開公報ＷＯ９１／１１４６５ (１９９１)、及びＬｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：３１０(１９９０)、に見ることができる。
ヒト抗体
コンビナトリアル法、又はヒト免疫グロブリンの遺伝子座でトランスフォームされたトランスジェニック動物を用いて完全ヒト抗体を作製する方法は、本技術分野で公知である（例えば、Ｍａｎｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：３１５‐２８；Ｃｏｎｒａｄ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，２００５，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ．８：１１７‐２６；Ｂｒｅｋｋｅ ａｎｄ Ｌｏｓｅｔ，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．３：５４４‐５０；これらの文献の各々は参照することで本明細書に組み入れられる）。このような完全ヒト抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体よりもさらに副作用が少ないこと、及びインビボで実質的に内在性ヒト抗体として機能することが期待される。特定の態様では、請求された方法及び手順は、このような技術で作製したヒト抗体を利用することができる。
一つの別の選択肢として、ファージディスプレイ技術を用いてヒト抗体を作製することができる（例えば、参照することで本明細書に組み入れられる、Ｄａｎｔａｓ‐Ｂａｒｂｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．４：１２６‐４０）。ヒト抗体は正常なヒトから作製することもでき、癌などの特定の疾患状態を示すヒトから作製することもできる（Ｄａｎｔａｓ‐Ｂａｒｂｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。疾患状態の個人からヒト抗体を構築する利点は、循環する抗体レパートリーが疾患関連抗原に対する抗体に偏っている場合があることである。
この方法の限定されない一つの例として、Ｄａｎｔａｓ‐Ｂａｒｂｏｓａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）は、骨肉腫患者からヒトＦａｂ抗体断片のファージディスプレイライブラリーを構築した。全ＲＮＡは一般的に循環する血中リンパ球から得られた（上記と同じ文献）。組換えＦａｂは、μ鎖、γ鎖、及びκ鎖抗体レパートリーからクローン化され、ファージディスプレイライブラリーに挿入された（上記と同じ文献）。ＲＮＡはｃＤＮＡに変換され、それを用いて、免疫グロブリンのＨ鎖及びＬ鎖の配列に対するプライマーにより、Ｆａｂ ｃＤＮＡライブラリーが作製された（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１‐９７、本文献は参照することで本明細書に組み入れられる）。ライブラリーの構築は、Ａｎｄｒｉｓ‐Ｗｉｄｈｏｐｆ ｅｔ ａｌ．（２０００，Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．(ｅｄｓ)，１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ ｐｐ．９．１ ｔｏ ９．２２、本文献は参照することで本明細書に組み入れられる。）に従って行われた。最終的に得られたＦａｂ断片は制限酵素によって分解され、バクテリオファージゲノム内に挿入されてファージディスプレイライブラリーが作製された。このようなライブラリーは、本技術分野で公知のように、標準的なファージディスプレイ法でスクリーニングすることができる。当業者であれば、この技術は単なる典型例であって、ヒト抗体又は抗体断片をファージディスプレイで作製し、スクリーニングするいかなる公知の方法も利用できることは認識されるであろう。
もう一つの別の選択肢としては、ヒト抗体を産生するよう遺伝子改変されたトランスジェニック動物を使用して、標準的な免疫化プロトコルにより、実質的にいかなる免疫原性標的に対する抗体も作製することができる。そのようなシステムの限定されない例としては、Ａｂｇｅｎｉｘ社（カリフォルニア州、フリーモント）のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）がある（例：Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１‐２３、本文献は参照することで本明細書に組み入れられる）。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）及び類似の動物では、マウス抗体遺伝子が不活性化されて機能性のヒト抗体遺伝子に置換されており、マウスの免疫システムのそれ以外の部分はインタクトな状態のままである。
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、アクセサリー遺伝子及び制御配列と共に、可変領域配列の大部分を含むヒトＩｇＨ及びＩｇカッパ遺伝子座の一部を有する、生殖細胞系で形成されたＹＡＣ（酵母人工染色体）でトランスフォームされた。ヒト可変領域のレパートリーを用いて、抗体産生Ｂ細胞を作製することができ、これは公知の技術によってハイブリドーマへプロセッシングすることができる。標的抗原で免疫されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、通常の免疫応答によってヒト抗体を産生し、これを上述の標準的な技術によって回収し、及び／又は産生させる。種々の系統のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）が入手可能であり、各々が異なる種類の抗体を産生することができる。このようなヒト抗体は、化学架橋反応又はその他の公知の方法によって、他の分子と結合させることができる。遺伝子導入によって産生されたヒト抗体は、通常のヒト抗体の薬物動態学的性質は維持しながら、治療薬としての可能性を有することが示された（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。当業者であれば、請求された組成物及び方法がＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）システムの使用に限定されず、ヒト抗体を産生するよう遺伝子改変されたいかなるトランスジェニック動物も利用できることが認識されるであろう。
疾患組織の検出、診断、及びイメージングの方法
タンパク質に基づいたインビトロ診断
本発明は、安定係留構造体を用いて、インビトロ及び／又はインビボで疾患関連抗原の存在に関する生物サンプルのスクリーニングを行うことを意図している。典型的な免疫測定法では、以下で述べるように、抗体、融合タンパク質、又はこれらの断片を含む安定係留構造体を、液相で又は固相担体に結合させて用いることができる。好ましい態様、特にインビボでの投与を含む態様では、抗体又はその断片はヒト化される。抗体又はその断片が完全ヒト型であることも好ましい。さらに好ましくは、融合タンパク質はヒト化抗体又は完全ヒト抗体を含む。当業者であれば、特定の遺伝子の発現レベルを同定する広範囲にわたる種々の技術が知られており、免疫測定法、ＲＴ‐ＰＣＲ法、ｍＲＮＡ精製及び／又はｃＤＮＡ調製に続いて行う遺伝子発現アッセイ用のチップへのハイブリダイゼーションなど、このようないずれの公知の方法を用いても、個々の対象及び／又は組織内での発現レベルを同定できることを認識するであろう。有用な典型的インビトロアッセイとしては、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、スロットブロット、ドットブロット、などが挙げられる。このような技術はインタクトな抗体を用いて開発されたものではあるが、抗体、抗体断片、又はその他の結合部分が取り込まれた安定係留構造体を使用することができる。
抗体、融合タンパク質、抗体断片、及び／又はその他の結合部分が取り込まれた安定係留構造体を用いて、組織検体から調製された組織切片中の標的抗原の存在を検出することもできる。そのようなｉｎ ｓｉｔｕ検出法を用いて、抗原の存在及び検査組織中の抗原の分布を特定することができる。ｉｎ ｓｉｔｕ検出は、検出可能に標識された構造体を、凍結された又はパラフィンに埋め込まれた組織切片へ適用することによって実施することができる。ｉｎ ｓｉｔｕ検出の一般的な技術は当業者に公知である。例えば、Ｐｏｎｄｅｒ，”Ｃｅｌｌ Ｍａｒｋｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”ｉｎ ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ １１３‐３８ Ｍｏｎｋ(ｅｄ．)(ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８７)、及び、ページ５．８．１‐５．８．８のＣｏｌｉｇａｎ、を参照のこと。
安定係留構造体は、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光標識剤、色素、色素原、化学発光標識剤、生物発光標識剤、又は常磁性標識剤などの適切なマーカー部分によって検出可能に標識することができる。
マーカー部分は、γカウンター若しくはβシンチレーションカウンターの使用、又はオートラジオグラフィーなどの方法によって検出される放射性同位元素であってよい。好ましい態様では、診断用複合体は、γ‐、β、又はポジトロン放射性同位元素である。マーカー部分とは、所定の条件下でシグナルを発生する分子のことである。マーカー部分の例としては、放射性同位元素、酵素、蛍光標識剤、化学発光標識剤、生物発光標識剤、及び常磁性標識剤が挙げられる。マーカー部分の安定係留構造体への結合は、本技術分野で公知の標準的な技術を用いて行うことができる。これに関する典型的な方法は、Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７０：１(１９７６)、Ｓｃｈｕｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８１：１(１９７７)、Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：１１０１(１９９０)、に記載されている。
核酸に基づいたインビトロ診断
安定係留構造体は、ある態様において、核酸部分を取り込むことができる。特別な態様では、特に核酸増幅法を用いて核酸を分析することにより、結合のレベルを同定することができる。種々の増幅の形式が本技術分野で公知であり、そのような公知のいかなる方法も使用することができる。一般に、増幅は、増幅されるべき標的核酸配列に選択的に又は特異的にハイブリダイズする１又は２種類以上のプライマーの使用を含む。
本明細書で定義するプライマーという用語は、鋳型依存性プロセスにおける新生核酸の合成を開始することができるいかなる核酸も包含することを意図している。増幅用プライマーの選別及び設計を行うためのコンピュータープログラムが、当業者に公知の市販業者及び／又は公的機関から入手可能である。与えられたサンプル中に存在するマーカー配列を増幅するために使用できる鋳型依存性プロセスは数多く存在する。最もよく知られている増幅法の一つは、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法と呼ばれる）であり、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、及び第４，８００，１５９号に詳細が記載されている。しかし、その他の増幅法も知られており、使用することができる。
インビボ診断
標識化ペプチド又はＭＡｂを用いた画像診断の方法はよく知られている。例えば、免疫シンチグラフィの技術では、リガンド又は抗体がγ線を放出する放射性同位元素で標識化され、患者へ導入される。γカメラを用いて、γ線を放出する放射性同位元素の位置と分布を検出する。例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ（ｅｄ．），ＲＡＤＩＯＬＡＢＥＬＥＤ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＦＯＲ ＩＭＡＧＩＮＧ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＹ（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９８８）、Ｃｈａｓｅ，”Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅｓ，”ｉｎ ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ． ６２４‐６５２（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９９０）、及びＢｒｏｗｎ，”Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＹ ２２７‐４９，Ｐｅｚｚｕｔｏ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ １９９３）、を参照のこと。１８Ｆ、６８Ｇａ、６４Ｃｕ、及び１２４Ｉなどのエネルギーが５１１ｋｅＶであるものなど、ポジトロンを放出する放射性核種（ＰＥＴ同位元素）を使用することも好ましい。そのようなイメージングは、安定係留構造体の直接の標識化、又は、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，”Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｅ‐ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ,”（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００６；２４：８２３‐８３４）に記載のプレ標的画像法によって行うことができる。米国特許公開公報第２００５０００２９４５号、第２００４００１８５５７号、第２００３０１４８４０９号、及び第２００５００１４２０７号も参照のこと。これらの各文献は参照することで本明細書に組み入れられている。
患者に施される放射線量は、検出と正確な測定が可能である最小の半減期、最小の体内残留率、及び最小の同位元素量の組み合わせが最適である同位元素を選択することによって、できる限り低いレベルに維持される。画像診断法に適した放射性同位元素の例としては、９９ｍＴｃ及び１１１Ｉｎが挙げられる。
安定係留構造体、又はこれに結合するハプテン若しくは担体も、インビボ診断の目的のための常磁性イオン及び放射線医学に用いる種々の造影剤で標識することができる。磁気共鳴画像法に特に有用な造影剤は、ガドリニウム、マンガン、ジスプロシウム、ランタン、又は鉄のイオンを含む。追加的な剤としては、クロム、銅、コバルト、ニッケル、レニウム、ユーロピウム、テルビウム、ホルミウム、又はネオジムが挙げられる。リガンド、抗体、及びその断片は、超音波造影剤／増感剤と複合体形成することもできる。例えば、超音波造影剤の一つは、ヒト化ＩｇＧ又はその断片を含むリポソームである。気体を充填したリポソームも好ましい超音波造影剤である。
イメージング剤と放射性同位元素
多くの適切なイメージング剤が本技術分野で知られており、それらをタンパク質又はペプチドへ結合する方法も同様である（例えば、共に参照することで本明細書に組み入れられる、米国特許第５，０２１，２３６号及び第４，４７２，５０９号を参照）。特定の結合方法は、例えばＤＴＰＡなどの有機キレート化剤を用いてタンパク質又はペプチドに結合した金属キレート錯体の使用を含む（米国特許第４，４７２，５０９号）。タンパク質又はペプチドは、グルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸などのカップリング剤の存在下で酵素と反応することもできる。蛍光マーカーとの複合体は、これらのカップリング剤の存在下で、又はイソチオシアネートとの反応によって調製される。
イメージング剤として使用できる可能性のある常磁性イオンの限定されない例としては、クロム(ＩＩＩ)、マンガン(ＩＩ) 、 鉄(ＩＩＩ) 、鉄(ＩＩ) 、コバルト(ＩＩ) 、ニッケル(ＩＩ) 、銅(ＩＩ) 、ネオジム(ＩＩＩ) 、サマリウム(ＩＩＩ) 、イッテルビウム(ＩＩＩ) 、ガドリニウム(ＩＩＩ) 、バナジウム(ＩＩ) 、テルビウム(ＩＩＩ) 、ジスプロシウム(ＩＩＩ) 、ホルミウム(ＩＩＩ) 、及びエルビウム(ＩＩＩ)が挙げられ、特にガドリニウムが好ましい。Ｘ線画像法などのその他の状況において有用なイオンとしては、ランタン(ＩＩＩ)、金(ＩＩＩ)、鉛(ＩＩ)、及び、特に、ビスマス(ＩＩＩ)が挙げられるが、これらに限定されない。
イメージグ剤又は治療薬として使用できる可能性のある放射性同位元素としては、アスタチン２１１、炭素１４、クロム５１、塩素３６、コバルト５７、コバルト５８、銅６２、銅６４、銅６７、Ｅｕ１５２、フッ素１８、ガリウム６７、ガリウム６８、水素３、ヨウ素１２３、ヨウ素１２４、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、鉄５２、鉄５９、ルテチウム１７７、リン３２、リン３３、レニウム１８６、レニウム１８８、Ｓｃ４７、セレン７５、銀１１１、イオウ３５、テクネチウム９４ｍ、テクネチウム９９ｍ、イットリウム８６及びイットリウム９０、並びにジルコニウム８９、が挙げられる。特定の態様ではＩ１２５の使用が好ましい場合が多く、テクネチウム９９ｍ、及びインジウム１１１も、エネルギーが低いことと検出限界距離が長いことから好ましい場合が多い。
放射標識したタンパク質又はペプチドは、本技術分野で公知の方法に従って作製することができる。例えば、ヨウ化ナトリウム若しくはヨウ化カリウム、及び次亜塩素酸ナトリウムなどの化学酸化剤、若しくはラクトペルオキシダーゼなどの酵素酸化剤と接触させてヨウ素化することができる。タンパク質又はペプチドは、例えば過テクネチウム酸を第一スズ溶液で還元し、還元されたテクネチウムをセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）カラム上にキレート化し、このカラムへペプチドを加えるというようなリガンド交換プロセス、又は、例えば過テクネチウム酸、ＳｎＣｌ２などの還元剤、フタル酸ナトリウム‐カリウム溶液などのバッファー溶液、及びペプチドをインキュベートするというような直接標識技術により、テクネチウム９９ｍで標識することができる。金属イオンとして存在する放射性同位元素をペプチドと結合させるのによく用いられる中間官能基（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）として、ジエチレントリアミン四酢酸（ＤＴＰＡ）、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ポルフィリンキレート剤、及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。さらに、ローダミン、フルオレセインイソチオシアネート、及びレノグラフィン（ｒｅｎｏｇｒａｐｈｉｎ）を含む蛍光標識剤も使用することを意図している。
特定の態様では、タンパク質又はペプチドは、発色基質との接触によって着色産物を生成する第二の結合リガンド又は酵素（酵素標識）と結合させることができる。適切な酵素の例としては、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（西洋ワサビ）ペルオキシダーゼ、及びグルコースオキシダーゼが挙げられる。好ましい第二の結合リガンドとしては、ビオチン、及びアビジン、又はストレプトアビジン化合物である。このような標識剤は当業者に公知であり、例えば、各々が参照することで本明細書に組み入れられる、米国特許第３,８１７,８３７号、第３,８５０,７５２号、第３,９３９,３５０号、第３,９９６,３４５号、第４,２７７,４３７号、第４,２７５,１４９号、及び第４,３６６,２４１号に記載されている。これらの蛍光標識剤はインビトロでの使用が好ましいが、特に内視鏡用途や血管内検出の方法など、インビボでの用途にも使用することができる。
別の選択肢としての態様では、リガンド、抗体、又はその他のタンパク質若しくはペプチドを、蛍光マーカーで標識することができる。光検出可能な標識剤の限定されない例としては、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４３０、ＡＭＣＡ、アミノアクリジン、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ‐ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ‐Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ‐ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ‐ＴＲＸ、５‐カルボキシ‐４’，５’‐ジクロロ‐２’，７’‐ジメトキシフルオレセイン、５‐カルボキシ‐２’，４’，５’，７’‐テトラクロロフルオレセイン、５‐カルボキシフルオレセイン、５‐カルボキシローダミン、６‐カルボキシローダミン、６‐カルボキシテトラメチルアミン、カスケードブルー、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、６‐ＦＡＭ、塩化ダンシル、フルオレセイン、ＨＥＸ、６‐ＪＯＥ、ＮＢＤ（７-ニトロベンズ‐２−オキサ１，３‐ジアゾール）、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルバイオレット、クレシルブルーバイオレット（ｃｒｅｓｙｌ ｂｌｕｅ ｖｉｏｌｅｔ）、ブリリアントクレシルブルー、パラアミノ安息香酸、エリスロシン、フタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、希土類クリプテート、ユーロピウムトリスビピリジンジアミン、ユーロピウムクリプテート又はキレート、ジアミン、ジシアニン、ラホーラブルー色素（Ｌａ Ｊｏｌｌａ ｂｌｕｅ ｄｙｅ）、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、アロコシアニンＢ（ａｌｌｏｃｏｃｙａｎｉｎ Ｂ）、フィコシアニンＣ、フィコシアニンＲ、チアミン、フィコエリスロシアニン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｏｃｙａｎｉｎ）、フィコエリトリンＲ、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンイソシアネート、ローダミンレッド、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、テトラメチルローダミン、Ｅｄａｎｓ、及びテキサスレッドが挙げられる。これらの及びその他の発光標識剤は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社（オレゴン州、ユージーン）、及びＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（カリフォルニア州、サンディエゴ）などの市販業者から入手することができる。
有用な化学発光標識化合物としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、又はルシフェルリン、ルシフェラーゼ、及びエクオリンなどの生物発光化合物を挙げることができる。診断用複合体は、例えば手術中の、内視鏡による、若しくは血管内の、腫瘍又は疾患の診断に用いることができる。
種々の態様において、有用な標識剤は金属ナノ粒子を含むことができる。ナノ粒子の調製方法は公知である（例えば、米国特許第６,０５４,４９５号；第６,１２７,１２０号； 第６,１４９,８６８号；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｍｅｉｓｅｌ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ． ８６：３３９１‐３３９５，１９８２、を参照）。ナノ粒子は市販業者から入手することもできる（例えば、Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．社、ニューヨーク州、Ｙａｐｈａｎｋ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．社、ペンシルバニア州、ウォリントン）。Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．社（ニューヨーク州、Ｙａｐｈａｎｋ）のＮａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）ナノ粒子などの修飾されたナノ粒子が市販されている。タンパク質又はペプチドとの複合体形成に有用な機能化ナノ粒子を購入することができる。
以下の実施例は、例示を提供するものであり、請求項に係る発明を限定するものではない。
３つのＦａｂサブユニットから構成される非共有結合的ａ２ｂ複合体の作製方法
実施例１．モジュール式Ｆａｂサブユニットの一般的な製造ストラテジー
ＤＤＤ配列又はＡＤ配列のいずれかを含む融合タンパク質としてＦａｂモジュールを製造してもよい。各Ｆａｂ融合タンパク質について、独立したトランスジェニックセルラインを開発した。モジュールは、製造されたならば、所望の場合には精製するか又は細胞培養上清液中のまま保存できる。製造の後、あらゆる(Ｆａｂ-ＤＤＤ)２モジュールをあらゆるＦａｂ-ＡＤモジュールと組み合わせて、二重特異性を示す３価のＦａｂ（ｂｓＴＦ）を作り出すことができる。
プラスミドベクターｐｄＨＬ２を用いて数多くの抗体と抗体を基礎とする構築物が製造されている。Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ (１９８９), １２５:１９１-２０２; Ｌｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ., Ｃａｎｃｅｒ (Ｐｈｉｌａ) (１９９７), ８０:２６６０-６、を参照。ジシストロン性の哺乳動物発現ベクターにより、ＩｇＧの重鎖と軽鎖が合成されることになる。多くの異なるＩｇＧ-ｐｄＨＬ２構築物について、ベクターの配列は殆ど同じであるが、その可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）配列において唯一差異が存在する。当業者に公知の分子生物学的ツールを用いることで、これらのＩｇＧ発現ベクターを、Ｆａｂ-ＤＤＤ又はＦａｂ-ＡＤの発現ベクターに変換することができる。Ｆａｂ-ＤＤＤ発現ベクターを作製するため、重鎖のヒンジ部、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインのコーディング配列を、ヒンジ部の最初の４残基、１４残基のＧｌｙ-Ｓｅｒリンカー及びＲＩＩａの最初の４４残基（ＤＤＤ１と呼ぶ、図１参照）をコードする配列で置き換える。Ｆａｂ-ＡＤ発現ベクターを作製するため、ＩｇＧのヒンジ部、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインのコーディング配列を、ヒンジ部の最初の４残基、１５残基のＧｌｙ-Ｓｅｒリンカー及びＡＫＡＰ-／５と呼ばれる１７残基の合成ＡＤ（ＡＤ１と呼ぶ、図２参照）をコードする配列で置き換える。このＡＫＡＰ-／５と呼ばれる１７残基の合成ＡＤは、バイオインフォマティクスとペプチドアレイ技術によって作り出され、非常に強い親和力（０.４ ｎＭ）でＲＩＩａの２量体に結合することが示されている。Ａｌｔｏ, ｅｔ ａｌ. Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ., Ｕ.Ｓ.Ａ (２００３), １００:４４４５- ５０を参照。
以下に記載するように、２種類のシャトルベクターを設計して、ＩｇＧ-ｐｄＨＬ２ベクターからＦａｂ-ＤＤＤ１又はＦａｂ-ＡＤ１の発現ベクターへの変換を容易化した。
ＣＨ１の調製
ｐｄＨＬ２プラスミドベクターを鋳型として用いたＰＣＲによりＣＨ１ドメインを増幅させた。左側のＰＣＲプライマーは、ＣＨ１ドメインの上流部分（５'）とＳａｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位から成り、ＣＨ１コーディング配列の５'末端になる。右側のプライマーは、ヒンジ部(ＰＫＳＣ)の最初の４残基をコードする配列と、これに続くＧＧＧＧＳ（最後の２つのコドン（ＧＳ）にはＢａｍ ＨＩ制限酵素部位が含まれる）から成る。
５'側のＣＨ１左側プライマー
５'ＧＡＡＣＣＴＣＧＣＧＧＡＣＡＧＴＴＡＡＧ-３' （配列番号５）
ＣＨ１+Ｇ４Ｓ-Ｂａｍ 右側
５'ＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＣＴＣＴＴＡＧＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＣＴＧＧ-３' （配列番号６）
４１０ ｂｐのＰＣＲアンプライマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）をｐＧｅｍＴ ＰＣＲクローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）内にクローニングして、Ｔ７（５'）の方向にあるインサートについてクローンのスクリーニングを行った。
(Ｇ４Ｓ)２ＤＤＤ１の構築
リンカーペプチドの１１残基（最初の２つのコドンにはＢａｍＨＩ制限酵素部位が含まれる）の下流にＤＤＤ１のアミノ酸配列をコードする(Ｇ４Ｓ)２ＤＤＤ１と定義する２重鎖ヌクレオチドの合成をＳｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ社（ヘイバーヒル、英国）に依頼した。３'末端に終止コドンとＥａｇＩ制限酵素部位が付加されている。コードしたポリペプチド配列を以下に示す。
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ （配列番号７）
ＲＩＩＡ１-４４トップ及びＲＩＩＡ１-４４ボトムと定めた、その３'末端において３０塩基対が重複する２種類のオリゴヌクレオチドを合成し（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ）、１７４ ｂｐのＤＤＤ１配列の中央の１５４塩基対を含むように組み合わせた。オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、Ｔａｑポリメラーゼを用いたプライマー伸長反応に付した。
ＲＩＩＡ１-４４トップ
５'ＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＡＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＣＧＡＣＡＧ-３' （配列番号８）
ＲＩＩＡ１-４４ボトム
５'ＧＣＧＣＧＡＧＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＧＣＧＧＧＴＧＡＡＧＴＡＣＴＣＣＡＣＴＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＣＡＧＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＴＣＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＴＡＧＣＣＣＴＧ-３' （配列番号９）
プライマー伸長の後、以下のプライマーを用いたＰＣＲにより２重鎖を増幅させた：
Ｇ４Ｓ Ｂａｍ-左側
５'-ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴ-３' （配列番号１０）
１-４４ 終止Ｅａｇ右側
５'-ＣＧＧＣＣＧＴＣＡＡＧＣＧＣＧＡＧＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＧＣＧ-３' （配列番号１１）
上記のアンプライマーをｐＧｅｍＴベクター内にクローニングし、Ｔ７（５’）の方向にあるインサートについてスクリーニングを行った。
(Ｇ４Ｓ)２-ＡＤ１の構築
リンカーペプチドの１１残基（最初の２つのコドンにはＢａｍＨＩ制限酵素部位が含まれる）の下流にＡＤ１のアミノ酸配列をコードする(Ｇ４Ｓ)２-ＡＤ１と定義する２重鎖ヌクレオチドを合成した（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ）。３'末端に終止コドンとＥａｇＩ制限酵素部位が付加されている。コードされるポリペプチド配列を以下に示す。
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ （配列番号１２）
ＡＫＡＰ-ＩＳトップ及びＡＫＡＰ-ＩＳボトムと定義する２種類の重複する相補的なオリゴヌクレオチドを合成した。
ＡＫＡＰ-ＩＳトップ
５'ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＴＣＧＡＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＧＧＣＣＧ-３' （配列番号１３）
ＡＫＡＰ-ＩＳボトム
５'ＣＧＧＣＣＧＴＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＴＧＴＣＣＡＣＧＡＴＣＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＴＣＧＡＴＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣ-３' （配列番号１４）
以下のプライマーを用いたＰＣＲにより、２重鎖を増幅させた：
Ｇ４Ｓ Ｂａｍ-左側
５'-ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴ-３' （配列番号１５）
ＡＫＡＰ-ＩＳ終止Ｅａｇ右側
５'-ＣＧＧＣＣＧＴＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧ-３' （配列番号１６）
上記のアンプライマーをｐＧｅｍＴベクター内にクローニングし、Ｔ７（５’）の方向にあるインサートについてスクリーニングを行った。
ＤＤＤ１のＣＨ１へのライゲーション
制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩを用いてＤＤＤ１配列をコードする１９０ｂｐの断片をｐＧｅｍＴから切り出し、次いで、ＣＨ１-ｐＧｅｍＴ内の同じ部位にライゲーションしてシャトルベクターＣＨ１-ＤＤＤ１-ｐＧｅｍＴを作り出した。
ＡＤ１のＣＨ１へのライゲーション
制限酵素 ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩを用いてＡＤ１配列を含む１１０ｂｐの断片をｐＧｅｍＴから切り出し、次いで、ＣＨ１-ｐＧｅｍＴ内の同じ部位にライゲーションしてシャトルベクターＣＨ１-ＡＤ１-ｐＧｅｍＴを作り出した。
ｐｄＨＬ２を基礎とするベクター内へのＣＨ１-ＤＤＤ１又はＣＨ１-ＡＤ１のクローニング
上記のモジュール式設計を用いることで、ＣＨ１-ＤＤＤ１又はＣＨ１-ＡＤ１は、ｐｄＨＬ２ベクター内にあるあらゆるＩｇＧ構築物中に組み込むことができる。ｐｄＨＬ２からＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ制限酵素断片（ＣＨ１-ＣＨ３）を取り除き、これを、各ｐＧｅｍＴシャトルベクターから切り出したＣＨ１-ＤＤＤ１又はＣＨ１-ＡＤ１のＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ断片と置き換えることにより、重鎖の定常ドメイン全体が上記構築物の１つと置き換えられる。
Ｎ末端ＤＤＤドメイン
ＤＤＤ又はＡＤの位置は、ＣＨ１のカルボキシル末端に限定されない。ＤＤＤ１配列がＶＨドメインのアミノ末端に付加された構築物を組換え技術により作製した。
実施例２：発現ベクター
ｈ６７９-Ｆｄ-ＡＤ１-ｐｄＨＬ２の構築
ｈ６７９-Ｆｄ-ＡＤ１-ｐｄＨＬ２は、１４アミノ酸残基から構成されるフレキシブルなＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドスペーサーを介してＦｄのＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に結合したＡＤ１を有するｈ６７９ Ｆａｂの製造に用いる発現ベクターである。ＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ断片を、ＣＨ１-ＡＤ１-ＳＶ３シャトルベクターからＳａｃＩＩとＥａｇＩで切り出したＣＨ１-ＡＤ１断片と置き換えることにより、ｈ６７９の可変ドメインを含むｐｄＨＬ２系ベクターをｈ６７９-Ｆｄ-ＡＤ１-ｐｄＨＬ２へと変換した。
Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２の構築
Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２は、ＤＤＤ１が、フレキシブルなペプチドスペーサーを介して、ＣＨ１のカルボキシル末端でｈＭＮ-１４ Ｆａｂに結合した融合タンパク質Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４を２コピー含む安定な２量体の製造に用いる発現ベクターである。ＳａｃＩＩとＥａｇＩの制限エンドヌクレアーゼを用いた制限酵素処理によりＣＨ１-ＣＨ３ドメインを取り除いて、ＣＨ１-ＤＤＤ１-ＳＶ３シャトルベクターからＳａｃＩＩとＥａｇＩで切り出したＣＨ１-ＤＤＤ１断片を挿入することにより、ｈＭＮ-１４ ＩｇＧの製造に用いたプラスミドベクターｈＭＮ１４(Ｉ)-ｐｄＨＬ２をＣ-ＤＤＤ１-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２へと変換した。
Ｎ-ＤＤＤ１-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２の構築
Ｎ-ＤＤＤ１-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２は、ＤＤＤ１が、フレキシブルなペプチドスペーサーを介して、ＶＨのアミノ末端でｈＭＮ-１４ Ｆａｂに結合した融合タンパク質Ｎ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４を２コピー含む安定な２量体の製造に用いる発現ベクターである。
発現ベクターは、以下のように組換え技術で作製した。ＤＤＤ１ドメインは、以下に示す２種類のプライマーを用いたＰＣＲによって増幅させた。
ＤＤＤ１ Ｎｃｏ左側
５' ＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＧＣＣ-３' （配列番号１７）
ＤＤＤ１-Ｇ４Ｓ Ｂａｍ右側
５'ＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＡＴＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＧＡＧＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＧＣＧＧＧＴＧ-３' （配列番号１８）
ＰＣＲの結果、ＮｃｏＩ制限酵素部位とＢａｍＨＩ制限酵素部位を含むリンカー（Ｇ４Ｓ）部分のコーディング配列とが、それぞれ５'末端と３'末端に付加された。１７０ｂｐのＰＣＲアンプライマーをｐＧｅｍＴベクター内にクローニングし、Ｔ７（５’）の方向にあるインサートについてスクリーニングを行った。ＮｃｏＩとＳａｌＩ制限酵素を用いて１９４ｂｐのインサートをｐＧｅｍＴベクターから切り出し、これと同じ酵素で処理して調節したＳＶ３シャトルベクター内にこのインサートをクローニングすることで、中間ベクターＤＤＤ１-ＳＶ３を作製した。
ｈＭＮ-１４ Ｆｄ配列は、以下に示すオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって増幅させた。
ｈＭＮ-１４ＶＨ左側 Ｇ４Ｓ Ｂａｍ
５'-ＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧ-３' （配列番号１９）
ＣＨ１-Ｃ終止 Ｅａｇ
５'-ＣＧＧＣＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣＴＣＴＴＡＧＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣ-３' （配列番号２０）
ＰＣＲの結果、ＢａｍＨＩ制限酵素部位とリンカー（Ｇ４Ｓ）部分のコーディング配列が、アンプライマーの５'末端に付加された。終止コドンとＥａｇＩ制限酵素部位が３'末端に付加された。１０４３ｂｐのＰＣＲアンプライマーをｐＧｅｍＴ内にクローニングした。制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥａｇＩを用いてｈＭＮ-１４-ＦｄのインサートをｐＧｅｍＴベクターから切り出し、次いで、これと同じ酵素で処理して調節したＤＤＤ１-ＳＶ３ベクターにライゲーションすることで、構築物Ｎ-ＤＤＤ１-ｈＭＮ-１４Ｆｄ-ＳＶ３を作製した。
制限酵素ＸｈｏＩ及びＥａｇＩを用いてＮ-ＤＤＤ１-ｈＭＮ-１４Ｆｄ配列を切り出し、１.２８ ｋｂのインサート断片を、同じ酵素を用いてＣ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２を処理して調節したベクターにライゲーションした。最終的な発現ベクターは、Ｎ-ＤＤＤ１-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐＤＨＬ２である。
実施例３．ｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１の作製と精製
ＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼを用いた制限酵素処理によりｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１ベクターを直鎖状にして、エレクトロポレーションによりＳｐ／ＥＥＥ骨髄腫細胞にトランスフェクトした。このジシストロニック発現ベクターにより、ｈ６７９κ軽鎖とｈ６７９ Ｆｄ-ＡＤ１の両方の合成と分泌が行われ、ｈ６７９ Ｆａｂ- ＡＤ１が形成される。エレクトロポレーション後に細胞を９６ウェル組織培養プレート内に播種し、０.０５ μＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）を用いてトランスフェクトされたクローンのセレクションを行った。ＢＳＡ-ＩＭＰ-２６０（ＨＳＧ）複合体でコーティングしたマイクロタイタープレートを用いたＥＬＩＳＡと、ＨＲＰ結合ヤギ由来抗ヒトＦａｂを用いた検出により、クローンのタンパク質発現についてスクリーニングを行った。ＨＳＧ（ＩＭＰ-２３９）センサーチップを使用したＢＩＡｃｏｒｅ分析により、培地の希釈サンプルの注入から得られる初期勾配を測定することで生産能を決定した。最も生産能の高いクローンは、約３０ ｍｇ／Ｌの初期生産能を示した。シングルステップＩＭＰ-２９１アフィニティークロマトグラフィーにより４.５リットルのローラーボトル培養から２３０ ｍｇのｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１が精製された。培養培地は、ＩＭＰ-２９１アフィゲルカラムにローディングする前に、限外濾過により約１０倍に濃縮した。ＰＢＳでカラムをベースラインまで洗浄し、１ Ｍのイミダゾール、１ ｍＭのＥＤＴＡ、０.１ ＭのＮａＡｃ（ｐＨ ４.５）でｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１を溶離した。溶離液のＳＥ-ＨＰＬＣ分析により、５０ ｋＤａのタンパク質と一致する保持時間（９.６３分間）で単一のシャープなピークが示された（データは非表示）。還元的ＳＤＳ-ＰＡＧＥ解析では、ｈ６７９-ＡＤ１のポリペプチド成分を表す２本のバンドだけが明確に確認された（データは非表示）。
実施例４．Ｎ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４とＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の作製と精製
Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２ベクターとＮ-ＤＤＤ１-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２ベクターをエレクトロポレーションによりＳｐ２／０由来骨髄腫細胞にトランスフェクトした。Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２ベクターは、ジシストロニック発現ベクターであり、このベクターによってｈＭＮ-１４κ軽鎖とｈＭＮ-１４ Ｆｄ-ＤＤＤ１の両方の合成と分泌が行われ、そして、ｈＭＮ-１４κ軽鎖とｈＭＮ-１４ Ｆｄ-ＤＤＤ１が組み合わさることでＣ-ＤＤＤ１-ｈＭＮ-１４ Ｆａｂが形成される。Ｎ-ＤＤＤ１-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２ベクターは、ジシストロニック発現ベクターであり、このベクターによってｈＭＮ-１４κ軽鎖とＮ-ＤＤＤ１-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４の両方の合成と分泌が行われ、そして、ｈＭＮ-１４κ軽鎖とＮ-ＤＤＤ１-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４が組み合わさることでＮ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４が形成される。各融合タンパク質は、そのＤＤＤ１ドメインの相互作用を介して安定なホモ２量体を形成する。
エレクトロポレーション後に細胞を９６ウェル組織培養プレート内に播種し、０.０５ μＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）を用いてトランスフェクトされたクローンのセレクションを行った。ＷＩ２（ｈＭＮ-１４に対するラット由来抗ｉｄモノクローナル抗体）でコーティングしたマイクロタイタープレートを用いたＥＬＩＳＡとＨＲＰ結合ヤギ由来抗ヒトＦａｂを用いた検出により、クローンのタンパク質発現についてスクリーニングを行った。最も生産能の高いＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ１４ ＦａｂクローンとＮ-ＤＤＤ１- Ｆａｂ-ｈＭＮ１４ Ｆａｂクローンの初期生産能は、それぞれ６０ ｍｇ／Ｌ及び６ ｍｇ／Ｌであった。
ＡＤ１-アフィゲルを用いたＮ-ＤＤＤ１-ｈＭＮ-１４とＣ-ＤＤＤ１-ｈＭＮ-１４のアフィニティー精製
ＤＤＤ／ＡＤ相互作用を利用して、ＤＤＤ１含有構築物のアフィニティー精製を行った。合成により作製されたＡＤ１-Ｃは、ＡＤ１配列とカルボキシル末端のシステイン残基から成るペプチドであり（実施例６参照）、このシステイン残基を用いて当該ペプチドをスルフヒドリル基と無水クロロ酢酸の反応後にアフィゲルに結合する。ＤＤＤ含有ａ２構造体は、中性のｐＨでＡＤ１-Ｃ-アフィゲル樹脂に特異的に結合し、低ｐＨ（例えば、ｐＨ ２.５）で溶離可能である。
シングルステップＡＤ１-Ｃアフィニティークロマトグラフィーにより１.２リットルのローラーボトル培養から総量として８１ ｍｇのＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４を精製した。培養培地は、ＡＤ１-Ｃ-アフィゲルカラムにローディングする前に、限外濾過により約１０倍に濃縮した。ＰＢＳでカラムをベースラインまで洗浄し、０.１ Ｍのグリシン（ｐＨ ２.５）でＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４を溶離した。溶離液のＳＥ-ＨＰＬＣ分析により、１０７ ｋＤａのタンパク質と一致する保持時間（８.７分間）で単一のシャープなピークが示された（データは非表示）。還元的ＳＤＳ-ＰＡＧＥによっても純度を確認したところ、Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の２種類のポリペプチド成分について予測される分子量にある２本のバンドのみが示された（データは非表示）。
上記のシングルステップＡＤ１-Ｃアフィニティークロマトグラフィーにより１.２リットルのローラーボトル培養から総量として１０ ｍｇのＮ-ＤＤＤ１ -ｈＭＮ-１４が精製された。溶離液のＳＥ-ＨＰＬＣ分析により、１０７ ｋＤａのタンパク質と一致する保持時間（８.７７分間）で単一のシャープなピークが示された（データは非表示）。還元的ＳＤＳ-ＰＡＧＥでは、Ｎ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４のポリペプチド成分と考えられる２本のバンドのみが示された（データは非表示）。
被検物質が異なる量のＷＩ２と混合されたサンプルのＳＥ-ＨＰＬＣにより、Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の結合活性を測定した。ＷＩ２ ＦａｂとＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４を０.７５:１のモル比で混合することで調製したサンプルでは、３本のピークが示され、これらのピークは、結合していないＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ １４（８.７１分間）、１つのＷＩ２ Ｆａｂと結合したＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４（７.９５分間）、及び２つのＷＩ２ Ｆａｂと結合したＣ- ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ １４（７.３７分間）によるものと考えられた（データは非表示）。モル比４でＷＩ２ ＦａｂとＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４を含むサンプルを分析した際には、７.３６分に単一のピークのみが観察されただけであった（データは非表示）。上記の結果により、ｈＭＮ１４-Ｆａｂ-ＤＤＤ１が２量体であり、２つの活性な結合部位を有することが示される。Ｎ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４に対して上記の実験を繰り返した場合にも、非常に近似した結果が得られた。
競合的ＥＬＩＳＡでは、Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４とＮ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の両方が、ｈＭＮ-１４ ＩｇＧと同程度の活性であるが、１価のｈＭＮ-１４ Ｆａｂよりは有意に強力にＣＥＡに結合することが示された（データは非表示）。ＥＬＩＳＡプレートは、ｈＭＮ-１４が特異性を示すＣＥＡのエピトープ（Ａ３Ｂ３）を含む融合タンパク質でコーティングされていた。
実施例５．ａ２ｂ複合体の形成
ａ２ｂ複合体の形成の証拠は、最初にＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４（ａ２として）及びｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１（ｂとして）を等モル量で含む混合物のＳＥ-ＨＰＬＣ分析により提示された。上記のサンプルを分析した際に、ｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１（９.５５分間）又はＣ-ＤＤＤ１ -Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４（８.７３分間）のいずれか一方よりも大きい新たなタンパク質の形成に一致する、８.４０分間の保持時間を有する単一のピークが観察された（データは非表示）。ｈＭＮ-１４ Ｆ(ａｂ')２をｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１と混合した場合、又はＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４ を６７９-Ｆａｂ-ＮＥＭを混合した場合には、高磁場へのシフトは観察されなかったことから、相互作用がＤＤＤ１ドメインとＡＤ１ドメインにより特異的に媒介されることが示された。ｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１とＮ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４を用いた場合にも、非常に近似した結果が得られた（データは非表示）。
ＢＩＡｃｏｒｅを用いて、ＤＤ１とＡＤ１の融合タンパク質間の特異的相互作用を更に実証して特徴付けた。最初にｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１又は６７９-Ｆａｂ-ＮＥＭのいずれかを、高密度ＨＳＧ結合（ＩＭＰ２３９）センサーチップの表面に結合させ、その後、Ｃ- ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４又はｈＭＮ-１４ Ｆ(ａｂ')２を注入することにより実験を行った。予期した通り、ｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１とＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の組み合わせのみが、後者を注入した際に、応答単位を更に増加させた（データは非表示）。Ｎ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４とｈ６７９- Ｆａｂ-ＡＤ１を用いた場合にも近似した結果が得られた（データは非表示）。
平衡化ＳＥ-ＨＰＬＣ（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ＳＥ-ＨＰＬＣ）実験を行って、各融合タンパク質中に存在するＡＤ１とＤＤＤ１の間の特異的相互作用の結合親和力を測定した。ｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１のＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４、Ｎ-ＤＤＤ１-ｈＭＮ-１４及び組換えヒトＲＩＩαの市販のサンプルとの結合の解離定数（Ｋｄ）は、それぞれ１５ ｎＭ、８ ｎＭ及び３０ ｎＭであることが判明した。
その他の関連方法
実施例６．Ｄｉ-ＡＤ１の作製
本実施例では、以下に示すアミノ酸配列を有する低分子ポリペプチド（ＡＤ１-Ｃ）を合成した。
ＮＨ２-ＫＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＫＧＣ-ＣＯＯＨ （配列番号３７）
ＡＤ１-Ｃでは、ＡＤ１のアミノ酸配列（下線部）のＮ末端にリジン残基が、カルボキシル末端にはＫＧＣトリペプチドが配置されている。溶解度を増大させるため２つのリジン（Ｋ）残基を導入し、柔軟性を加えるためにＣ末端のシステインの手前にグリシン（Ｇ）残基を挿入した。ＤＭＳＯ処理によって、ＡＤ１-Ｃを酸化してＤｉ-ＡＤ１と定める２量体にし、これをＲＰ-ＨＰＬＣによって精製した。Ｄｉ-ＡＤ１の構造の模式図を以下に示す（=はジスルフィド架橋を示す）
ＮＨ２-ＫＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＫＧＣ=ＣＧＫＡＱＱＩＡＮＤＶＩＱＫＡＬＹＥＩＱＫ-ＮＨ２ （配列番号２１）
更なる修飾に利用可能な数多くの官能基がＤｉ-ＡＤ１又はＡＤ１-Ｃ中に存在する。例えば、Ｄｉ-ＡＤ１とＡＤ１-Ｃに含まれるそれぞれ８個と４個の第１級アミノ基を用いて、薬物、毒素、タンパク質、又はその他のエフェクターを結合させることができる。更に、Ｄｉ-ＡＤ１とＡＤ１-Ｃは、それぞれ２個と１個のチロシン残基を有しており、これらのチロシン残基は、放射性ヨウ素化に用いることができる。最後に、ＡＤ１-Ｃは、遊離のシステイン残基を含んでおり、このシステイン残基を用いて、エフェクターを結合させるか又はエフェクターを含むＤｉ-ＡＤ１類似体を形成することもできる。
実施例７．新規なプレターゲッティング方法
本発明の方法により、新規なプレターゲッティング方法が提供される。以下において、ハプテン結合性抗体を必要せず、親和性促進系（Ｌｅ Ｄｏｕｓｓａｌ ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ (１９８９), ３０:１３５８-６６）を用いたプレターゲッティング系の例を提供する。実施例４で記載するように作製したＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４又はＮ-Ｆａｂ-ＤＤＤ２-ｈＭＮ-１４の２量体は、腫瘍のプレターゲッティングに用いることができる。最初に１０７ ｋＤａのタンパク質を患者に静脈内投与し、そして、腫瘍上のＣＥＡに結合させるが、一方で、血液と正常な組織からは排出されることになる。後の時点において、治療用放射性同位体（例えば、９０Ｙ）又は診断用放射性同位体（例えば１１１Ｉｎ）を担持するＤｉ-ＡＤ１のＤＯＴＡ複合体等の２価ペプチドを静脈内投与する。低分子ペプチド（〜５０００ Ｄａ）は、血液と正常な組織からは迅速に排出されつつも、既に腫瘍に保持されているＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４と特異的に相互作用することが予測される２つのＡＤ配列を含んでいるため、この低分子ペプチドは、腫瘍に局在化することになる。
ＳＥ-ＨＰＬＣにより、インビトロでのＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４のＤｉ-ＡＤ１との架橋形成を証明した。Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４をＤｉ-ＡＤ１と混合した際に、架橋構造の形成をしめす８.６７分から７.９５分へのタンパク質ピークのシフトが起こった（データは非表示）。ｈＭＮ-１４ Ｆ(ａｂ')２をＤｉ-ＡＤ１と混合した場合には、このようなシフトは観察されず、架橋形成がＤＤＤ１とＡＤ１の間の相互作用によって媒介されることが示された。ピークのシフトが実際にＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の特異的な架橋形成に起因していたことを確認するため、複合体をＤＴＴで還元してＤｉ-ＡＤ１のジスルフィド結合を切断したところ、８.６７分にピークが戻るシフトが生じた（データは非表示）。
実施例８．ＤＤＤ融合タンパク質又はＡＤ融合タンパク質のアフィニティー精製
より低い親和力でのドッキングを示すＤＤＤタンパク質又はＡＤタンパク質を作製することで、万能のアフィニティー精製システムを開発できる。ＲＩαの２量体により形成されるＤＤＤは、ＲＩＩαの場合と比べて５００倍弱い親和力（２２５ ｎＭ）でＡＫＡＰ-ＩＳ (ＡＤ１)に結合する。従って、最初の４４アミノ酸残基から形成されるＲＩαの２量体を作製して樹脂に結合させることで、あらゆるＡＤ１含有融合タンパク質を精製するための誘引性のアフィニティーマトリックスを作り出すことができる。
自然界には数多くの低い親和性を示す（０.１ μＭ）ＡＫＡＰアンカードメインが存在する。必要であれば、高度に予測可能なアミノ酸置換を導入して更に結合親和力を弱めさせることも可能である。合成的に又は生物学的に低親和性のＡＤを作製して、あらゆるＤＤＤ１融合タンパク質のアフィニティー精製に使用するための樹脂に結合させることが可能である。
安定係留構造体の作製に関する方法
実施例９．３つのＦａｂ断片から構成されるジスルフィド結合により安定化された構造体を作製するためのベクター
Ｎ-ＤＤＤ２-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２
Ｎ-ＤＤＤ２-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２は、Ｆｄのアミノ末端に付加したＤＤＤ２の２量体化及びドッキング用ドメインの配列を有するＮ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の作製用の発現ベクターである（図４）。ＤＤＤ２は、１５アミノ酸残基のＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介してＶＨドメインに結合している。ＤＤＤ２は、２量体化及びドッキング用ドメイン（ＤＤＤ１と同じ２量体化及びドッキング用ドメイン）の上流にシステイン残基を有する。分泌された融合タンパク質は、ＤＤＤ２ドメインの非共有結合的相互作用によって互いに保持された２個の同一のｈＭＮ-１４ Ｆａｂのコピーから構成される（図３Ｂ）。
発現ベクターについては、以下のように組換え操作した。ＤＤＤ２の１-１３番目の残基を含み、互いに重複する２種類の相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＤＤ２トップ及びＤＤＤ２ボトム）を合成した。これらのオリコヌクレオチドをアニールさせて、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）でリン酸化すると、ＮｃｏＩとＰｓｔＩの制限エンドヌクレアーゼで制限酵素処理したＤＮＡへのライゲーションに適したオーバーハングが、５'末端と３'末端にそれぞれ生じた。
ＤＤＤ２トップ
５'ＣＡＴＧＴＧＣＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡ-３' （配列番号２２）
ＤＤＤ２ ボトム
５'ＧＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＧＧＧＡＴＣＴＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＧＣＡ-３' （配列番号２３）
ＮｃｏＩとＰｓｔＩの制限酵素処理により調製したＤＤＤ１-ｈＭＮ１４ Ｆｄ-ＳＶ３のベクター断片に２重鎖ＤＮＡをライゲーションして、中間構築物ＤＤＤ２-ｈＭＮ１４ Ｆｄ-ＳＶ３を作製した。ＸｈｏｌとＥａｇＩの制限エンドヌクレアーゼを用いて、この中間構築物から、ＤＤＤ２-ｈＭＮ１４ Ｆｄのコーディング配列を含む１.２８ ｋｂのインサート断片を切り出し、同じ酵素で制限酵素処理して調製したｈＭＮ１４-ｐｄＨＬ２ベクターＤＮＡにライゲーションした。最終発現ベクターは、Ｎ-ＤＤＤ２-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２である（図４）。
Ｃ-ＤＤＤ２-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２
Ｃ-ＤＤＤ２-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２は、Ｆｄのカルボキシル末端に１４アミノ酸残基のＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介して付加したＤＤＤ２の２量体化及びドッキング用ドメインの配列を有するＣ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の作製用の発現ベクターである（図５Ａ）。分泌される融合タンパク質は、ＤＤＤ２ドメインの非共有結合的相互作用によって互いに保持された２個の同一のｈＭＮ-１４ Ｆａｂのコピーから構成される（図５Ｂ）。
発現ベクターについては、以下のように組換え操作した。リンカーペプチドの一部（ＧＧＧＧＳＧＧＧＣＧ、配列番号３８）のコーディング配列とＤＤＤ２の１-１３番目の残基を含み、互いに重複する２種類の相補的なオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリコヌクレオチドをアニールさせて、Ｔ４ ＰＮＫでリン酸化すると、ＢａｍＨＩとＰｓｔＩの制限エンドヌクレアーゼで制限酵素処理したＤＮＡへのライゲーションに適したオーバーハングが、５'末端と３'末端にそれぞれ生じた。
Ｇ４Ｓ-ＤＤＤ２トップ
５'ＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＧＣＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡ-３' （配列番号２４）
Ｇ４Ｓ-ＤＤＤ２ボトム
５'ＧＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＧＧＧＡＴＣＴＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＧＣＡＡＣＣＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧ-３' （配列番号２５）
ＢａｍＨＩとＰｓｔＩの制限酵素処理により調製したシャトルベクターＣＨ１-ＤＤＤ１-ｐＧｅｍＴに２重鎖ＤＮＡをライゲーションして、シャトルベクターＣＨ１-ＤＤＤ２- ｐＧｅｍＴを作製した。ＳａｃＩＩとＥａｇＩを用いて、ＣＨ１-ＤＤＤ２-ｐＧｅｍＴから、５０７ ｂｐの断片を切り出し、ＳａｃＩＩとＥａｇＩで制限酵素処理して調製したＩｇＧ発現ベクターｈＭＮ１４(Ｉ)-ｐｄＨＬ２にライゲーションした。最終発現構築物は、Ｃ-ＤＤＤ２-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２である（図６）。
ｈ６７９-Ｆｄ-ＡＤ２-ｐｄＨＬ２
Ｎ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４又はＣ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４にＢとしてペア形成するようにｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２を設計した。ｈ６７９-Ｆｄ-ＡＤ２-ｐｄＨＬ２は、ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に１４アミノ酸残基のＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介して付加したＡＤ２のアンカードメインの配列を有するｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２の作製用の発現ベクターである。ＡＤ２は、ＡＤ１のアンカードメイン配列の上流側に１つと下流側にも１つのシステイン残基を有する。
発現ベクターについては、以下のように組換え操作した。ＡＤ２のコーディング配列とリンカー配列の一部を含み、互いに重複する２種類の相補的なオリゴヌクレオチド（ＡＤ２トップ及びＡＤ２ボトム）を合成した。これらのオリコヌクレオチドをアニールさせて、Ｔ４ ＰＮＫでリン酸化すると、ＢａｍＨＩとＳｐｅＩの制限エンドヌクレアーゼで制限酵素処理したＤＮＡへのライゲーションに適したオーバーハングが、５'末端と３'末端にそれぞれ生じた。
ＡＤ２トップ
５'ＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＡＧＡＴＣＧＡＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡ-３' （配列番号２６）
ＡＤ２ボトム
５'ＴＴＣＡＧＣＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＴＧＴＣＣＡＣＧＡＴＣＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＴＣＧＡＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧ-３' （配列番号２７）
ＢａｍＨＩとＳｐｅＩの制限酵素処理により調製したシャトルベクターＣＨ１-ＡＤ１-ｐＧｅｍＴに２重鎖ＤＮＡをライゲーションして、シャトルベクターＣＨ１-ＡＤ２-ｐＧｅｍＴを作製した。ＳａｃＩＩとＥａｇＩの制限酵素を用いて、このシャトルベクターから、ＣＨ１とＡＤ２のコーディング配列を含む４２９塩基対の断片を切り出し、同じ酵素で制限酵素処理して調製したｈ６７９-ｐｄＨＬ２ベクターにライゲーションした。最終発現ベクターは、ｈ６７９-Ｆｄ-ＡＤ２-ｐｄＨＬ２である。
実施例１０．ｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２の作製
ｈ６７９-Ｆｄ-ＡＤ２-ｐｄＨＬ２ベクターを、エレクトロポレーションによりＳｐ／ＥＥＥ骨髄腫細胞にトランスフェクトした。このジシストロニック発現ベクターにより、ｈ６７９κ軽鎖とｈ６７９ Ｆｄ-ＡＤ２の両方の合成と分泌が行われ、これによってｈ６７９ Ｆａｂ-ＡＤ２が形成される。ＡＤのいずれかの末端に存在するシステイン残基により２つの潜在的に反応性のあるスルフヒドリル基が提供される。エレクトロポレーション後に細胞を９６ウェル組織培養プレート内に播種し、０.０５ μＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）を用いてトランスフェクトされたクローンのセレクションを行った。ＢＳＡ-ＩＭＰ-２６０（ＨＳＧ）複合体でコーティングしたマイクロタイタープレートを用いたＥＬＩＳＡとヤギ由来抗ヒトＦａｂ-ＨＲＰ抗体を用いた検出により、クローンのタンパク質発現についてスクリーニングを行った。ＨＳＧ（ＩＭＰ-２３９）センサーチップを使用したＢＩＡｃｏｒｅ分析により、培地の希釈サンプルの注入から得られる初期勾配を測定することで生産能を決定した。最も生産能の高いクローンは、約５０ ｍｇ／Ｌの初期生産能を示した。シングルステップＩＭＰ-２９１アフィニティークロマトグラフィーにより２.９リットルのローラーボトル培養から総量で１６０ ｍｇのｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２が精製された。培養培地は、ＩＭＰ-２９１アフィゲルカラムにローディングする前に、限外濾過により約１０倍に濃縮した。ＰＢＳでカラムをベースラインまで洗浄し、１ Ｍのイミダゾール、１ ｍＭのＥＤＴＡ、０.１ ＭのＮａＡｃ（ｐＨ ４.５）でｈ６７９- ＡＤ２を溶離した。溶離液のＳＥ-ＨＰＬＣ分析により、５０ ｋＤａのタンパク質と一致する保持時間（〜１０分間）で単一のシャープなピークが示された（データは非表示）。この物質をｈＭＮ１４-Ｆａｂ-ＤＤＤ１と混合した際には、二成分複合体のものと考えられる新たなピークのＳＥ-ＨＰＬＣトレースの観察により証拠付けられるように、１／３だけが反応性を示した(データは非表示)。しかしながら、ＴＣＥＰを用いたｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２の還元により、１００％の活性が生じた(データは非表示)。このことにより、（１）分子内ジスルフィド結合がＡＤ２の２つのシステイン残基間に形成されることでＤＤＤとの会合が妨げられるが、他の物質との反応からスルフヒドリル基を保護できること；及び（２）分子内ジスルフィド架橋は還元により切断可能であり、これによって２つの遊離スルフヒドリル基を有するＤＤＤ反応性アンカードメインが生じること、が示唆される。
実施例１１．ａ２構造体としてのＮ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の作製
Ｎ-ＤＤＤ２-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２ベクターを、エレクトロポレーションによりＳｐ／ＥＥＥ骨髄腫細胞にトランスフェクトした。このジシストロニック発現ベクターにより、ｈＭＮ-１４κ軽鎖とＮ-ＤＤＤ２-ｈＭＮ-１４ Ｆｄの両方の合成と分泌が行われ、これによってＮ-ＤＤＤ２-ｈＭＮ１４ Ｆａｂが形成される。Ａ２構造体は、ＤＤＤ２を介した２量体化により形成され、これによって各ＤＤＤ２のシステイン残基から２つの潜在的に反応性のあるスルフヒドリル基が提供されると予想される。エレクトロポレーション後に細胞を９６ウェル組織培養プレート内に播種し、０.０５ μＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）を用いてトランスフェクトされたクローンのセレクションを行った。
ＷＩ２（ｈＭＮ-１４-抗Ｉｄ）でコーティングしたマイクロタイタープレートを用いたＥＬＩＳＡとヤギ由来抗ヒトＦａｂ-ＨＲＰを用いた検出により、クローンのタンパク質発現についてスクリーニングを行った。最も生産能の高いクローンは、約１０ ｍｇ／Ｌの初期生産能を示した。プロテインＬアフィニティークロマトグラフィーにより１.８リットルのローラーボトル培養から総量として１６ ｍｇのＮ-ＤＤＤ２-ｈＭＮ-１４が精製された。培養培地は、プロテインＬアフィニティークロマトグラフィーカラムにローディングする前に、限外濾過により約１０倍に濃縮した。ＰＢＳでカラムをベースラインまで洗浄し、１ ｍＭのＥＤＴＡ、０.１ ＭのＮａＡｃ（ｐＨ ２.５）でＮ-ＤＤＤ２-ｈＭＮ １４を溶離し、直ちにＴｒｉｓ-ＨＣｌで中和した。ＳＥ-ＨＰＬＣ分析では４本のタンパク質のピークが示され（データは非表示）、これらのうち２本は後にＮ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４のａ４型（７.９分間）及びａ２型（８.８分間）と同定され、残りの２本については、κ鎖の２量体と単量体であった。この混合物は、ＴＣＥＰ等のチオール還元剤を添加して大多数のａ４型をａ２型に変換しない限り、殆どｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１との結合活性を示さなかった（データは非表示）。これらのデータにより、（１）分子内ジスルフィド結合がＤＤＤ２に存在する２つのシステイン残基を通じた２つのａ２構造体の連結によりａ４が形成され、それによってＡＤとの会合が妨げられるが、他の物質との反応からスルフヒドリル基を保護できること；及び（２）分子内ジスルフィド架橋は還元により切断可能であり、これによって２つの遊離スルフヒドリル基を含むＡＤ反応性のＤＤＤ２量体を有するａ２構造体が生じること、が示唆される。この副生成物（ａ４）が、４つの活性なＦａｂサブユニットから構成されることは特筆すべきことである。高濃度のＴＥＣＰと長い反応時間の場合であっても、全Ｎ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の約１５％が還元後もＡ４型として残る（データは非表示）。これにより、ジスルフィド架橋に加えて、ドメインスワッピング等の他の機構も ａ４型の形成に寄与する可能性があることが示唆される。
実施例１２．Ｃ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の作製
Ｃ-ＤＤＤ２-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２ベクターを、エレクトロポレーションによりＳｐ／ＥＥＥ骨髄腫細胞にトランスフェクトした。このジシストロニック発現ベクターにより、ｈＭＮ-１４κ軽鎖とＣ-ＤＤＤ２-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４の両方の合成と分泌が行われ、ｈＭＮ-１４κ軽鎖とＣ-ＤＤＤ２-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４が組み合わさることでＣ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ１４が形成される。Ｎ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の場合と同様に、ａ２構造体は、ＤＤＤ２を介した２量体化により形成され、これによって各ＤＤＤ２のシステイン残基から２つの潜在的に反応性のあるスルフヒドリル基が提供されると予想される。エレクトロポレーション後に細胞を９６ウェル組織培養プレート内に播種し、０.０５ μＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）を用いてトランスフェクトされたクローンのセレクションを行った。
ＷＩ２（ｈＭＮ-１４-抗Ｉｄ）でコーティングしたマイクロタイタープレートを用いたＥＬＩＳＡとヤギ由来抗ヒトＦａｂ-ＨＲＰを用いた検出により、クローンのタンパク質発現についてスクリーニングを行った。最も生産能の高いクローンは、約１００ ｍｇ／Ｌの初期生産能を示し、これはＮ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の初期生産能を１０倍上回るものであった。プロテインＬアフィニティークロマトグラフィーにより、実施例３に記載されるように、１.８リットルのローラーボトル培養から総量として２００ ｍｇのＣ-ＤＤＤ２-ｈＭＮ-１４が精製された。プロテインＬで精製したＣ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ- ｈＭＮ-１４のＳＥ-ＨＰＬＣプロファイル（データは非表示）は、Ｎ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４のものと近似していた。４本のタンパク質ピークのうち、２本はＣ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４のａ４型（８.４０分間）及びａ２型（９.２６分間）と同定されたが、残りの２本は、κ鎖の２量体と単量体を表している。この混合物は、ＴＣＥＰ等のチオール還元剤を添加して大多数のａ４型を高い結合活性でｈ６７９-ＡＤ１に結合するａ２型に変換しない限り、殆どｈ６７９-ＡＤ１との結合活性を示さなかった。これらのデータによりＣ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４がＮ-ＤＤＤ２-ｈＭＮ-１４の機能的同等物であることが示される。
実施例１３．ＴＦ１の作製
ｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２は、Ｂ成分としてＮ-ＤＤＤ２-ｈＭＮ-Ｆａｂ-１４又はＣ-ＤＤＤ２-ｈＭＮ-１４等の ａ２成分とペアを形成するよう設計した。これらは、組み合せた場合に直ちに会合して ａ２ｂ構造体（図７Ａ）を形成するが、ａ２ｂ構造体は、更にジスルフィド結合を介して共有結合するように誘導される場合がある（図７Ｂ）。Ｎ-ＤＤＤ２構築物とＡＤ２構築物のキャラクタリゼーションで、完全なＤＤＤ／ＡＤ交互作用を達成するためには、これら各構築物の還元が必要なことが示されたことから、本製造方法にも還元工程を含めた。最初に還元剤として固相化したＴＣＥＰを用いることで、還元剤の除去に要する時間を節約した。室温で１時間還元した後、遠心によりＴＣＥＰ-アガロースを取り除き、ＤＭＳＯを終濃度１０％で反応溶液に添加した。これよりＴＦ１と呼ぶ共有結合したａ２ｂ複合体の存在の第１の証拠は、ＢＩＡｃｏｒｅ分析により示された。
固相化したＴＣＥＰを用いた小規模な反応で実現性を確認した後、以下のように大規模なＴＦ１の作製を行った。最初に、Ｎ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４（プロテインＬ精製した）及びｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２（ＩＭＰ-２９１精製した）を、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ＰＢＳ（ｐＨ ７.４）中でおおよそ化学量論的濃度で混合した。ＴＣＥＰの添加前では、ＳＥ-ＨＰＬＣは何らａ２ｂ形成の証拠を示さなかった（データは非表示）。その代り、ａ４を表すピーク（７.９７分; ２００ ｋＤａ）、ａ２を表すピーク（８.９１分; １００ ｋＤａ）及びＢを表すピーク（１０.０１分; ５０ ｋＤａ）が存在した。５ ｍＭのＴＣＥＰの添加により迅速にａ２ｂ複合体が形成され、１５０ ｋＤａのタンパク質と一致する８.４３分に新たなピークとして示された（データは非表示）。ｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２と考えられるピーク（９.７２分）が依然として明確に確認される一方で、ａ２又はａ４のいずれに対応する明確なピークも観察されなかったことから（データは非表示）、本実験では、過剰量のＢが存在していたことが明らかである。１時間還元した後、複数回のＰＢＳ交換を伴う一晩の透析によりＴＣＥＰを取り除いた。得られた溶液を１０％ＤＭＳＯと混合し、室温で一晩保管した。
ＳＥ-ＨＰＬＣで分析した際に、ａ２ｂを表すピークは、保持時間が８.３１分に対し、僅かに０.１分減少し、よりシャープになったように見えたが（データは非表示）、これは、我々の先の発見によれば、結合親和力の増大を示している。ＩＭＰ-２９１アフィニティークロマトグラフィーによって更に複合体を精製して、κ鎖の混入物を取り除いた。予期した通り、過剰量のｈ６７９-ＡＤ２も同時に精製されてきたので、後で調製ＳＥ-ＨＰＬＣによって取り除いた（データは非表示）。
ＴＦ１は非常に安定な複合体である。ＨＳＧ（ＩＭＰ-２３９）センサーチップへの結合についてＴＦ１を試験した際には、サンプル注入の終了時にも反応の明確な低下が観察されなかった。対照的に、ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４とｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１の両方の等モル混合物を含む溶液を同様の条件下で試験した際には、サンプル注入の間及び直後に応答単位の増加が観察されると同時に急な下降が検出され、初期に形成されたａ２ｂ構造体が不安定であったことが示された。更にまた、その後のＷＩ２の注入によりＴＦ１の応答単位が相当に増加したが、Ｃ-ＤＤＤ１／ＡＤ１混合物の場合には明確な増大が認められなかった。
センサーチップ上に固定化されたＴＦ１へのＷＩ２の結合により生じる応答単位の更なる増加は、２つの完全に機能的な結合部位に対応しており、これらの結合部位のそれぞれには、Ｎ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の１つのサブユニットが寄与している。このことは、ＷＩ２の２つのＦａｂ断片へ結合するＴＦ１の能力によっても確認された（データは非表示）。事前にＴＦ１のように正確に還元して酸化したｈ６７９-ＡＤ２とＮ-ＤＤＤ１-ｈＭＮ １４を含む混合物をＢＩＡｃｏｒｅで分析した際には、ＷＩ２の更なる結合は殆ど存在しておらず（データは非表示）、ＴＦ１のようなジスルフィド結合で安定化されたａ２ｂ複合体は、ＤＤＤ２とＡＤ２の相互作用を通じてのみ形成可能であることが示された。
本製造方法に２点の改善を施して、工程の時間を短縮し効率性を高めた。第１の点では、遊離ｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２とｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２に繋がれていないａ４／ａ２構造体、並びに軽鎖がＩＭＰ-２９１アフィニティークロマトグラフィーによって除去されないように、ａ４／ａ２構造体の混合物として存在する僅かに過剰モル量のＮ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４を用いて、ｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２と反応させた。第２の点では、還元後にＴＣＥＰを除去する手段として透析又はダイアフィルトレーションに代えて疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いることで、製造時間を短縮するだけでなく、潜在的なウィルスを除去する工程が加えられることになる。Ｎ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４と６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２を混合して、５ ｍＭのＴＣＥＰを用いて室温で１時間還元した。溶液を０.７５ Ｍの硫酸アンモニウムと混合し、次いでブチルＦＦ ＨＩＣカラムにローディングした。カラムを、０.７５ Ｍの硫酸アンモニウム、５ ｍＭのＥＤＴＡ、ＰＢＳで洗浄してＴＣＥＰを取り除いた。還元したタンパク質をＰＢＳでＨＩＣカラムから溶離し、１０％ＤＭＳＯと混合した。室温で一晩インキュベーションした後に、ＩＭＰ-２９１アフィニティークロマトグラフィーにより純度の高いＴＦ１を単離した（データは非表示）。ゲルろ過等の更なる精製工程は必要とされなかった。
実施例１４．ＴＦ２の作製
ＴＦ１を守備良く作製し、次いでＣ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４をｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２と反応させることで、ＴＦ２と定める類似体（図８）も得られた。ＴＦ２は、ＴＦ１に対して２点の潜在的な利点を有する。第１に、Ｃ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４は、Ｎ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４より１０倍高いレベルで作り出される。第２に、Ｃ末端にＤＤＤドメインを有する融合タンパク質は、Ｎ末端にＤＤＤドメインを有する融合タンパク質と比べて、顕著に強いＣＥＡ結合活性を示す。上記については、ドメインの配置に起因するものと考えられ、Ｎ-ＤＤＤの変異体の場合には、結合が立体障害により弱められる可能性がある。
以下のようにして、ＴＦ２の試験的なバッチを、＞９０％の収率で作り出した。プロテインＬで精製したＣ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４（２００ ｍｇ）をｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２（６０ ｍｇ）と１.４:１のモル比で混合した。総タンパク質濃度は、１ ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で１.５ ｍｇ／ｍｌであった。これに続くＴＣＥＰによる還元、ＨＩＣクロマトグラフィー、ＤＭＳＯによる酸化及びＩＭＰ-２９１アフィニティークロマトグラフィーを含む工程は、ＴＦ１について記載したのと同様であった。ＴＣＥＰの添加前には、ＳＥ-ＨＰＬＣではａ２ｂ形成の何らの証拠も示されなかった（データは非表示）。その代り、ａ４を表すピーク（８.４０分; ２１５ ｋＤａ）、ａ２を表すピーク（９.３２分; １０７ ｋＤａ）及びｂを表すピーク（１０.３３分; ５０ ｋＤａ）が存在した。５ ｍＭのＴＣＥＰの添加により迅速にａ２ｂ複合体が形成され、二成分構造体のものと予測される１５７ ｋＤａのタンパク質と一致する８.７７分に新たなピークとして示された（データは非表示）。ＩＭＰ-２９１アフィニティークロマトグラフィーによりＴＦ２を殆ど均一になるまで精製した（データは非表示）。ＩＭＰ-２９１に結合しなかった分画のＳＥ-ＨＰＬＣ分析により、産物からのａ４、ａ２及び遊離κ鎖が取り除かれたことが示された（データは非表示）。
非還元的なＳＤＳ-ＰＡＧＥ解析により、ＴＦ２の大部分は、ＩｇＧに近い相対移動度を示す大きな共有結合による構造体として存在することが示された（データは非表示）。付加的なバンドは、本実験の条件下ではジスルフィド結合の形成が不十分であることを示す。還元的ＳＤＳ-ＰＡＧＥでは、ＴＦ２の構成ポリペプチドを表すバンドのみが明確であることから、非還元性ゲル中のいずれの付加的なバンドも、産物に関するものであることが示される（データは非表示）。しかしながら、４種類の各ポリペプチドの相対移動度は、非常に近似しており分解不可能である。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析（データは非表示）では、１５６,４３４ Ｄａの単一ピークが示されたが、これはＴＦ２の計算上の質量（１５７,３１９ Ｄａ）の９９.５％の範囲内にある。
ＴＦ２の機能性を、ＴＦ１について記載したのと同様に、ＢＩＡｃｏｒｅにより測定した。ＴＦ２、Ｃ-ＤＤＤ１-ｈＭＮ-１４ + ｈ６７９-ＡＤ１（非共有結合によるａ２ｂ複合体のコントロールサンプルとして使用）、又はＣ-ＤＤＤ２-ｈＭＮ-１４ + ｈ６７９-ＡＤ２（還元されていないａ２成分とｂ成分のコントロールサンプルとして使用）を１ μｇ／ｍｌ（総タンパク質）にまで希釈して、ＨＳＧが固相化されたセンサーチップ上を通過させた。ＴＦ２の反応性は、２種類のコントロールサンプルの約２倍であったことから、コントロールサンプル中のｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ成分だけがセンサーチップに結合したまま残るであろうことが示された。次に、ＷＩ２ ＩｇＧの注入では、更なるシグナル応答性によって示されるように、ＴＦ２だけが、ｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤと強く会合したＤＤＤ-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４成分を有していたことが実証された。センサーチップ上に固定化されたＴＦ２へのＷＩ２の結合により生じる応答単位の更なる増加は、２つの完全に機能的な結合部位に対応しており、これらの結合部位のそれぞれには、Ｃ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の１つのサブユニットが寄与している。このことは、ＷＩ２の２つのＦａｂ断片へ結合するＴＦ２の能力によっても確認された（データは非表示）。
競合的ＥＬＩＳＡによりＴＦ２の相対ＣＥＡ結合活性を測定した。プレートは、ｈＭＮ-１４により認識されるＣＥＡのＡ３Ｂ３ドメインを含む融合タンパク質でコーティングした（０.５ μｇ／ウェル）。ＴＦ１、ＴＦ２及びｈＭＮ-１４ ＩｇＧの段階希釈を４つの重複する系に作製し、ＨＲＰが結合したｈＭＮ-１４ ＩｇＧ（１ ｎＭ）を含むウェル内でインキュベートした。データは、ＴＦ２が、少なくともＩｇＧと同程度で、ＴＦ１より２倍強い結合活性でＣＥＡに結合することを示す（データは非表示）。先の同様のアッセイにおいて、Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４が、ｈＭＮ-１４ ＩｇＧよりも強いＣＥＡ結合活性を示すことが判明しており、これは、つまり、Ｎ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４よりも強い結合活性で結合していることになる。Ｃ-ＤＤＤ-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の親ＩｇＧと比べた明らかな結合活性の向上についての可能な説明としては、前者のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーにより、ＩｇＧよりも柔軟性に優れた分子が提供されるということが挙げられる。Ｎ-ＤＤＤ変異体もフレキシブルなペプチドリンカーを有するが、ＣＥＡ結合部位が互いの近くで、かつＤＤＤ２量体の近隣に位置しているので、結果として結合活性が低下する。
実施例１５．ＴＦ１とＴＦ２の血清安定性
ＴＦ１及びＴＦ２は、血液と組織内において幾多もの希釈を受ける、インビボでの使用が可能な安定係留構造体となるように設計されている。ＢＩＡＣＯＲＥを用いてヒト血清内でのＴＦ２の安定性を評価した。ＴＦ２を、４名のドナーからプールした新鮮なヒト血清で０.１ ｍｇ／ｍｌに希釈し、５％ ＣＯ２の下で３７℃にて７日間インキュベートした。毎日採取したサンプルを１：２５に希釈し、次いで、ＩＭＰ-２３９ ＨＳＧ センサーチップを用いたＢＩＡＣＯＲＥによって分析した。ＷＩ２ ＩｇＧを注入することで、無傷で完全な活性を示すＴＦ２の量を定量した。血清サンプルを、ストックから直接希釈したコントロールサンプルと比較した。ＴＦ２は、血清中で非常に安定しており、７日後において、その二重特異的結合活性の９８％を保持していた（データは非表示）。同様の結果が、ヒト血清中又はマウス血清中のいずれのＴＦ１について得られた（データは非表示）。
実施例１６．腫瘍保持マウス内でのＴＦ２の生体内分布
皮下にヒトの大腸腺癌の異種移植片（ＬＳ １７４Ｔ）を保持するメスの胸腺欠損ヌードマウス内での生体内分布試験を行った。細胞は、マウス１匹当たり１ｘ１Ｏ７個の細胞を５０匹のマウスに皮下注射するのに十分な程度になるまで組織培養で増殖させた。１週間後に腫瘍を測定し、マウスを各時点に５匹のマウスから成るグループに振り分けた。試験開始時の平均の腫瘍サイズは０.１４１ ± ０.０４４ ｃｍ３であった。全てのマウスに、４０ μｇの１２５Ｉ-ＴＦ２（２５０ ｐｍｏｌｅｓ、２ μＣｉ）を注射した。次いで、注射後０.５、２、４、１６、２４、４８及び７２時間でマウスを屠殺して検死した。本試験では全部で３５匹のマウスを用いた。腫瘍並びに種々の組織を取り出し、γカウンター内に静置して、各時点での組織１グラム当たりの注射された用量のパーセント（ＩＤ／ｇ％）を測定した。
１２５Ｉ-ＴＦ２の放射性ヨウ素化では、１.４８ ｍＣｉ／ｍｇの特異的活性を有する２.７％の非結合放射性同位体が生じた。標識サンプルを次いで、単独で、及び２０倍の過剰モル量のＣＥＡと混合した後にＳＥ-ＨＰＬＣに付した。約８３％のＴＦ２が、１０.１分間の保持時間で溶離した。標識したＴＦ２には、９％の凝集物質（保持時間=９.０３分間）と８％の低分子量物質（保持時間=１４.３７分間）が存在していた。ＣＥＡと混合した際には、９５％の標識ＴＦ２が高分子量種（保持時間=７.２５分間）へとシフトした。これらの結果から、標識した製剤が、腫瘍保持マウスへの投与に許容可能であったことが示された。
表１には、腫瘍及び種々の組織内でのＩＤ／ｇ％の計算値が示されている。腫瘍の取込みピークは、注射の４時間後に生じた（１０.３ ± ２.１ ＩＤ／ｇ％）。注射後１６時間から２４時間の間では、腫瘍内のＴＦ２量に有意な差はなく（５.３ ± １.１ ＩＤ／ｇ％と５.３７ ± ０.７ ＩＤ／ｇ％）、血液値にもよるが、これら２つの時点の間であれば、腫瘍ターゲッティングに強い影響を与えることなく、いつでもペプチドを投与できることが示された。正常組織でのＴＦ２の取り込みとクリアランスは、先にＴＦ１について観察された場合と非常に近似していた。ＴＦ１及びＴＦ２は、両方ともＲＥＳ系（脾臓及び肝臓）を通じたクリアランスを示す傾向にあると考えられた。
腫瘍保持マウスでのＴＦ２の血液ＰＫについても評価を行ったところ、２相性のクリアランスを示した。これらのデータは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ（バージョン４.１）に提供される２コンパートメント解析によって解析した。表２に測定したパラメーターを示す。
実施例１７．腫瘍保持マウス内でのＴＦ２プレターゲッティング
皮下にヒトの大腸腺癌の異種移植片（ＬＳ １７４Ｔ）を保持するメスの胸腺欠損ヌードマウス内でＴＦ２を用いたプレターゲッティング試験を行った。細胞は、マウス１匹当たり１ｘ１Ｏ７個の細胞を５５匹のマウスに皮下注射するのに十分な程度になるまで組織培養で増殖させた。１週間後に腫瘍を測定し、マウスを各時点に５匹のマウスから成るグループに振り分けた。試験開始時の平均の腫瘍サイズは０.１０５ ± ０.０６８ ｃｍ３であった。２０匹のマウスに、８０ μｇの１２５Ｉ-ＴＦ２（５００ ｐｍｏｌｅｓ、２ μＣｉ）を注射し、１６時間後に９９ｍＴｃ-ＩＭＰ-２４５（４０ μＣｉ、９２ ｎｇ、５０ ｐｍｏｌｅｓ）を投与した。注射後０.５、１、４及び２４時間でマウスを屠殺して検死した。更に、２４時間時点グループの３匹のマウスについては、注射後１、４及び２４時間の時点においてγカメラで撮影した。コントロールとして更に３匹のマウスに９９ｍＴｃ-ＩＭＰ-２４５（プレターゲッティング無し）を投与し、２４時間での撮影後に検死する前にも、注射後１、４及び２４時間の時点に撮影を行った。腫瘍並びに種々の組織を取り出し、γカウンター内に静置して、各時点での組織１グラム当たりの注射された用量のパーセント（ＩＤ／ｇ％）を測定した。
１２５Ｉ-ＴＦ２及び１２５Ｉ-ＴＦ２でプレターゲッティングした９９ｍＴｃ-ＩＭＰ-２４５について測定したＩＤ／ｇ％値を、それぞれ表３と表４に示す。ＴＦ２レベルは、ペプチド注射後の最初の４時間（又はＴＦ２投与後の２０時間）に亘って、相対的に変化がなく、注射後０.５時間（ＴＦ２投与後の１６.５時間）での６.７ ± １.６ ＩＤ／ｇ％から４時間の時点（ＴＦ２投与後の２０時間）での６.５ ± １.５ ＩＤ／ｇ％の範囲にあった。ＴＦ２でプレターゲッティングしたＩＭＰ-２４５の腫瘍の取込み値（ＩＤ／ｇ％）は、注射後０.５、１、４及び２４時間で２２ ± ３％、３０ ± １４％、２５ ± ４％及び１６ ± ３％であった。
正常組織に関しては、現在までに開発された他のプレターゲッティング薬剤について得られた結果（Ｒｏｓｓｉ, ｅｔ ａｌ. Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ２００５; １１(１９ Ｓｕｐｐｌ): ７１２２ｓ-７１２９ｓ）との比較において、ＴＦ２でプレターゲッティングしたマウスで試験した場合では、各時点での肝臓、肺及び血液内には有意に少ないペプチドが存在していた。これらのデータから、ＴＦ２が、後に投与されるペプチドと結合する可能性のある残余断片を後に残すことなく、正常な臓器を通じて効率的に除去されることが示される。
腫瘍での高い取込み率、並びに正常組織内での低いレベルにより、良好な腫瘍：非腫瘍（Ｔ／ＮＴ）比が得られ（表５）、これによって、ＴＦ２が、ＣＥＡ産生腫瘍へのジ-ＨＳＧ系エフェクターの局在化に適したプレターゲッティング薬剤であることが確認された。
実施例１８．グルタチオンレドックスシステムを用いたＴＦ２の作製
上記の実施例１３及び１４に開示する方法に代わる態様として、安定係留構造体を一体として連結させる特異的なジスルフィド結合を形成するグルタチオンレドックスシステムを用いて、ＴＦ１又はＴＦ２等の安定係留構造体を作製することもできる。
簡易化された効果的なＴＦ２の製造方法は、以下のように達成された。全ての工程は、室温で実施した。最初に、Ｃ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４（プロテインＬ精製した）及びｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２（ＩＭＰ-２９１精製した）を、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ＰＢＳ（ｐＨ ７.４）中でおおよそ化学量論的濃度で混合した。還元したグルタチオンを１ ｍＭの終濃度で添加した。その３０分後に、酸化したグルタチオンを２ ｍＭの終濃度で添加した。ＢＩＡＣＯＲＥ分析によればＴＦ２形成は、酸化グルタチオンの添加の２分後では５０％完了しており、４時間以内に１００％完了した。ＴＦ２は、上記の実施例１４に記載するように、ほぼ均一になるまでＩＭＰ-２９１アフィニティークロマトグラフィーで精製した。
実施例１９．顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）の部位特異的ＰＥＧ化
組換えヒトＧＭ-ＣＳＦ（１４ ｋＤａ）は、種々の血液疾患の治療に臨床で用いられている。現在のＧＭ-ＣＳＦ製品の制限としては、循環系での半減期が短いことが挙げられ、従って、最適な効果を得るためには、患者に毎日注射してＧＭ-ＣＳＦを投与しなければならない。タンパク質治療薬の循環系での半減期を伸ばすために既に採用された１つの方法として、そのタンパク質をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾してその有効サイズを増大させることが挙げられる。しかしながら、タンパク質にＰＥＧを結合させる（ＰＥＧ化）ための現時点での全ての既知の方法は、最適なものではなく、通常、目的タンパク質の修飾には部位特異的結合を達成させる必要がある（Ｄｏｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ. ２００５, １６: １２９１-１２９８）。このような修飾を用いた場合でも、複合体の収率は一定ではなく、得られる産物が均質なものになるとは限らない。
収率を定量できるＧＭ-ＣＳＦの部位特異的なペグ化は、本発明（以下において、ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）法又は技術と呼ぶ）を用いることで達成可能であり、その概要を以下に示す。ＤＤＤ２配列を、スペーサーを介してＧＭ-ＣＳＦのＣ末端に融合させることでＧＭ-ＣＳＦの２量体を作製してＡＤ２に対するドッキング部位を作り出し、ＡＤ２をＰＥＧと結合させることでＰＥＧ-ＡＤ２が得られる。ＴＦ２について記載したのと同様の条件下でＧＭ-ＣＳＦ-ＤＤＤ２とＰＥＧ-ＡＤ２を組み合わせることで、ＰＥＧ化ＧＭ-ＣＳＦが形成される。循環系での半減期が伸びることに加え、ペグ化産物中のＧＭ-ＣＳＦの２量体構造は、現在のＧＭ-ＣＳＦの単体型よりも高い性能を示すはずである。この方法は、治療効果を向上させるためには循環系での半減期の延長を必要とする他のサイトカイン（組換えヒトＩＬ-２等）、酵素（組換えヒトアルギナーゼ等）又は生物活性ペプチド（トロンボポエチンレセプターのペプチドアゴニスト等；Ｃｗｉｒｔａ ｅｔ ａｌ., Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７, ２７６: １６９６-１６９９を参照）若しくはペプチド模倣体にも応用できる。
実施例２０．ＤＮＬ技術により得られた新規な免疫薬物
目的の細胞毒性薬物を結合可能なＢ成分としての融合タンパク質を作製し、これを用いてＡ成分として作製したターゲッティングタンパク質と結合させて、新規な種類の免疫薬物を得ることが可能であり、その概要を以下に示す。第１に、高レベルで発現されるヒトイムノグロブリンの軽鎖をスキャフォールド又は担体となるタンパク質として選択し、これをＡＤ２配列にそのＣ末端側で融合させる。軽鎖の２量体の形成を防ぐため、末端部のシステイン（これは、Ｆｄ鎖とジスルフィド結合を形成する）をセリンで置換する。更に、この軽鎖に少なくとも１つのＮ-グリコシル化部位（トリペプチド配列Ｎ-Ｘ-Ｔ）を組換え技術によって導入することで、オリゴ糖の付加が可能になり、これらは、組換え技術によって高収量で作製して、均一に精製可能であり、そして適切な化学的手法、例えば、Ｓｈｉｈらがアミノデキストランへのアントラサイクリンの結合について記載したような（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. １９９１; ５１ : ４１９２-４１９８）、を介して薬物結合用の基質としても使用できる。このような薬物含有Ｂ成分は、ターゲッティング機能と内部移行機能を有する結合構造体と連結されたＤＤＤ２を含む種々のＡ成分と組み合わせることができる。これに代わる方法では、ＡＤ２で誘導体化した薬物含有アミノデキストランが適切なＡ成分と組み合されて特定の薬物治療のターゲッティングが可能となる。その他の高レベルで発現される組換え分子を薬物結合用のスキャフォールド又は担体となるタンパク質として選択することも可能である。
実施例２１．好中球を死滅させるための病原体のターゲッティング
インフルエンザＡウィルス、カンディダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、及びＥ. ｃｏｌｉを含む種々の病原体により引き起こされる疾患の治療に潜在的に有用な広範囲の感染症治療薬にとして、最近、組換えヒトサーファクタントタンパク質断片Ｄ（ｒｆｈＳＰ-Ｄ）と抗ＣＤ８９抗体のＦａｂを含む化学複合体が報告されている（Ｔａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. ２００４, １７２: ４９３４-４９４０）。以下のように、好中球に病原体をターゲッティングしてこれを死滅させる安定係留複合体を作製するためにＤＮＬ技術を用いることも可能である。αへリックスコイルドコイルネックドメインとＣ末端糖認識ドメイン（ＣＲＤ）を含む切断型のｈＳＰ-Ｄ断片を、Ｎ末端でＤＤＤ２と融合させ、ＣＤＲを介して病原体と多価的に結合するＡ構造体を作り出す。好中球上のＦｃＲへのターゲッティングを可能とするためには、Ａ構造体を、抗ＣＤ８９のＦａｂとＡＤ２の融合タンパク質から構成されるＢ成分に連結して、ｈＳＰ-Ｄの２つのＣＲＤと抗ＣＤ８９の１つのＦａｂから構成される安定な複合体を得る。ヒトサーファクタントタンパク質Ａ（ｈＳＰ-Ａ）をｈＳＰ-Ｄと他の抗体（ＣＤ３及びＣＤ６４に対する抗体等）で置換することにより、同様の感染症治療薬を調製することができる。
実施例２２．ＰＫＡとＡＫＡＰに由来しないタンパク質-タンパク質相互作用ドメインを用いて作製した多価多重特異性構造体
２種類の基本となる方法が想定される。最初の方法は、ＤＤＤとＡＤの役割の入れ替えに適しているであろう別の天然のタンパク質-タンパク質相互作用ドメインの探索と評価に依存する。例えば、ＨＮＦ-１αのＮ末端の２量体化ドメインでＤＤＤを置換し、ＨＦＮ-１（ＤｃｏＨ）の２量体化補助因子でＡＤを置換してもよい。第２の方法の概要を以下に示す。
ヒトｐ５３は、分離した機能ドメインから成るモジュール型のタンパク質である。４量体化ドメイン（ｐ５３ｔｅｔ）と呼ばれるヒトｐ５３のＣ末端側残基３２５-３５５（スキームＩ）は、溶液中で自然に４量体を形成させるが、実際にはこの４量体は、２個の２量体が弱い親和力（Ｋｄ〜２ ｕＭ）で結合した２量体の２量体である。しかしながら、各２量体内の単量体は強力に会合しており、そのＫｄは、１０-１５ Ｍ未満であると報告されている（Ｂｒｏｋｘ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２００３; ２７８: ２３２７-２３３２）。従って、ｐ５３ｔｅｔを含む融合タンパク質は、ＰＫＡのヒトＲＩＩαのＤＤＤ配列を含む融合タンパク質と同様に、非常に強固に結合した２量体を形成することが予測される。Ｐ５３ｔｅｔの２量体に第２の構造体を結合させるため、イーストツーハイブリッドシステム又は適切なファージディスプレーライブラリーを用いて、１ ｕＭ以下のＫｄを有して、１５ないし５０残基を含むｐ５３ｔｅｔに対する結合ペプチドを選択する。最も高い親和力（即ち、最も低いＫｄ値）を示すペプチドは、必要な場合にはシステインで誘導体化し、そして目的のタンパク質に融合して、これをｐ５３ｔｅｔの２量体に安定につなぎ止めることができる。
スキームＩ
ＧＥＹＦＴＬＱＩＲＧＲＥＲＦＥＭＦＲＥＬＮＥＡＬＥＬＫＤＡＱＡ （配列番号２８）
ＩｇＧを基礎とする６価のＤＮＬ構造体（ＨＩＤＳ）の作製と使用
実施例２３．６量体構築物
ａ２ｂ複合体形成のための上記のＤＮＬ技術を応用して、ＩｇＧを基礎とする６価のＤＮＬ構造体（ＨＩＤＳ）を作製した。組換え複合タンパク質として作製した２種類のモジュールを組み合わせて種々のＨＩＤＳを作製した。Ｆａｂ-ＤＤＤ２モジュールは、Ｔｒｉ-Ｆａｂ構造体の作製へ用いるものについて記載する通りであった（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ. Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ.２００６; １０３(１８): ６８４１-６、上記実施例参照）。Ｆａｂ-ＤＤＤ２モジュールは、ＡＤ２含有モジュールに結合する安定なホモ２量体を形成する。ＨＩＤＳを作製するため、２種類のＩｇＧ-ＡＤ２モジュールを作り出して、Ｆａｂ-ＤＤＤ２モジュールとペア形成させた：Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ＩｇＧ及びＮ-Ｌ-ＡＤ２-ＩｇＧ。
Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ＩｇＧモジュールは、９個のアミノ酸残基から成るペプチドリンカーを介してＩｇＧの重鎖（Ｈ）のカルボキシル末端（Ｃ）に融合したＡＤ２ペプチドを有する（図９Ａ）。リンカーペプチド（ＧＳＧＧＧＧＳＧＧ、配列番号２９）とこれに続くＡＤ２ペプチド（ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ、配列番号４）のコーディングＤＮＡ配列を、標準的なＤＮＡ組換え手法によりＣＨ３（重鎖定常ドメイン３）のコーディング配列の３'末端に結合させて、隣接したオープンリーディングフレームを得る。重鎖-ＡＤ２ポリペプチドを軽鎖ポリペプチドと共発現させた場合、２つのＡＤ２ペプチドを有するＩｇＧ分子が形成されるので（図 ９Ｂ）、従って、これによって、２つのＦａｂ-ＤＤＤ２の２量体を結合させることができる。Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ＩｇＧモジュールは、いずれのＦａｂ-ＤＤＤ２モジュールとも組み合わせることができ、これによって１本のＦｃ断片と６本のＦａｂ断片から構成される多種多様な６価の構造体が作り出すことが可能になる。Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ＩｇＧモジュールとＦａｂ-ＤＤＤ２モジュールが、同一の親モノクローナル抗体（ＭＡｂ）に由来する場合、得られるＨＩＤＳは、同一の抗原に対する６本の結合アームを有する単一特異性構造物となる（図１０）。モジュールが、代わりに、２つの異なるＭＡｂに由来する場合、得られるＨＩＤＳは、Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ＩｇＧモジュールに対して特異的な２本の結合アームとＦａｂ-ＤＤＤ２モジュールに対して特異的な４本の結合アームを有する二重特異性構造物となる（図１１）。
Ｎ-Ｌ-ＡＤ２-ＩｇＧは、別の種類のＩｇＧ-ＡＤ２モジュールであり、ＡＤ２ペプチドが、１３個のアミノ酸残基から成るペプチドリンカーを介してＩｇＧの軽鎖（Ｌ）のアミノ末端（Ｎ）に融合している（図１２Ａ）。Ｌ鎖は、κ又はλのいずれであってもよく、文及び図において、同じ意味を有するＫとしても表わされる。ＡＤ２ペプチド（ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ、配列番号４）とこれに続くリンカーペプチド（ＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ、配列番号３０）のコーディングＤＮＡ配列を、Ｌ鎖の可変ドメイン（ＶＬ）のコーディング配列の５'末端に結合させて、隣接したオープンリーディングフレームを得る。ＡＤ２-κ鎖ポリペプチドを重鎖ポリペプチドと共発現させた場合、２つのＡＤ２ペプチドを有するＩｇＧ分子が形成されるので（図１２Ｂ）、従って、これによって、２つのＦａｂ-ＤＤＤ２の２量体を結合させることができる。Ｎ-Ｌ-ＡＤ２-ＩｇＧモジュールは、いずれのＦａｂ-ＤＤＤ２モジュールとも組み合わせることができ、これによって図１３に示す、１本のＦｃ断片と６本のＦａｂ断片から構成される多種多様な６価の構造体を作り出すことが可能になる。
実施例２４．Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ＩｇＧ-ｐｄＨＬ２発現ベクターの作製
ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターは、多くの種類の組換えＩｇＧの発現の媒介に用いられてきた。あらゆるＩｇＧ-ｐｄＨＬ２ベクターのＣ-Ｈ-ＡＤ２-ＩｇＧ-ｐｄＨＬ２ベクターへの変換を容易化するために、プラスミドシャトルベクターを作製した。ｐｄＨＬ２ ベクターを鋳型として、オリゴヌクレオチドＦｃ ＢｇＩＩＩ左側とＦｃ Ｂａｍ-ＥｃｏＲＩ右側をプライマーとして用いて、Ｆｃ（ＣＨ２とＣＨ３ドメイン）の遺伝子を増幅させた。
Ｆｃ ＢｇＩＩＩ左側
５'-ＡＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧ-３' （配列番号３１）
Ｆｃ Ｂａｍ-ＥｃｏＲＩ右側
５'-ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ-３' （配列番号３２）
アンプライマーをｐＧｅｍＴ ＰＣＲクローニングベクター内にクローニングした。制限酵素ＸｂａＩとＢａｍＨＩを用いてｐＧｅｍＴからＦｃインサート断片を切り出し、ＸｂａＩとＢａｍＨＩを用いたｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２-ｐｄＨＬ２の制限酵素処理により調節したＡＤ２-ｐｄＨＬ２ベクターにライゲーションして、シャトルベクターＦｃ-ＡＤ２-ｐｄＨＬ２を作製した（図１４Ａ）。
あらゆるＩｇＧ-ｐｄＨＬ２発現ベクター（図１４Ｂ）をＣ-Ｈ-ＡＤ２-ＩｇＧ- ｐｄＨＬ２発現ベクター（図１４Ｃ）へ変換するために、前者から８６１ ｂｐのＢｓｒＧＩ／ＮｄｅＩ制限処理断片を切り出し、Ｆｃ-ＡＤ２-ｐｄＨＬ２ベクターから切り出した９５２ ｂｐのＢｓｒＧＩ／ＮｄｅＩ制限処理断片で置き換えた。ＢｓｒＧＩは、ＣＨ３ドメインを切断し、ＮｄｅＩは発現カセットの下流（３'）を切断する。
実施例２５．Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＬＬ２ ＩｇＧの作製
エプラツズマブ又はｈＬＬ２ ＩｇＧは、ヒト化抗ヒトＣＤ２２ＭＡｂである。実施例２４の記載と同様にｈＬＬ２ ＩｇＧ-ｐｄＨＬ２からＣ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＬＬ２ ＩｇＧの発現ベクターを作製し、これを用いてエレクトロポレーションによりＳｐ２／０骨髄腫細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後に細胞を９６ウェルプレート内に播種し、メトトレキサートを含む培地中でトランスジェニッククローンのセレクションを行った。ｈＬＬ２特異的な抗イディオタイプＭＡｂでコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレートを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡとペロキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧを用いた検出により、クローンのＣ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＬＬ２ ＩｇＧ生産能についてスクリーニングを行った。タンパク質を生産させるため、ローラーボトル内でクローンを増殖させて、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによりシングルステップで増殖に使用済みの培養培地からＣ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＬＬ２ ＩｇＧを精製した。ＳＥ-ＨＰＬＣ分析により、２本のタンパク質ピークが解明された（図１５）。より遅く溶離したピークの保持時間（８.６３分間）は、ｈＬＬ２ ＩｇＧと近似している。より速く溶離したピークの保持時間（７.７５分間）は、３００ ｋＤａのタンパク質と一致する。後になって、このピークがジスルフィド結合したＣ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＬＬ２-ＩｇＧの２量体を表すと判断された。この２量体は、ＤＮＬ反応中に単量体型へと還元される。ＳＤＳ-ＰＡＧＥ解析により、精製されたＣ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＬＬ２-ＩｇＧが、モジュールの単量体型とジスルフィド結合した２量体型の両方で構成されていることが示された（図１６）。非還元的条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥでは、これら２つの形態を表すタンパク質バンドが明確に認められるが、還元的条件下では、全ての形態が、構成ポリペプチド（重鎖-ＡＤ２とκ鎖）を表す２本のバンドに減少した。他のバンドの混入は検出されなかった。
実施例２６．Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＡ２０ ＩｇＧの作製
ｈＡ２０ ＩｇＧは、ヒト化抗ヒトＣＤ２０ＭＡｂである。実施例２４の記載と同様にｈＡ２０ ＩｇＧ-ｐＤＨＬ２からＣ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＡ２０ ＩｇＧの発現ベクターを作製し、これを用いてエレクトロポレーションによりＳｐ２／０骨髄腫細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後に細胞を９６ウェルプレート内に播種し、メトトレキサートを含む培地中でトランスジェニッククローンのセレクションを行った。ｈＡ２０特異的な抗イディオタイプＭＡｂでコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレートを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡとペロキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧを用いた検出により、クローンのＣ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＡ２０ ＩｇＧ生産能についてスクリーニングを行った。タンパク質を生産させるため、ローラーボトル内でクローンを増殖させて、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによりシングルステップで増殖に使用済みの培養培地からＣ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＡ２０ ＩｇＧを精製した。ＳＥ-ＨＰＬＣ分析とＳＤＳ-ＰＡＧＥ解析により、実施例２５のＣ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＬＬ２ ＩｇＧで得られた結果と非常に近似する結果が得られた。
実施例２７．Ｎ-Ｌ-ＡＤ２-ｈＡ２０ ＩｇＧの作製
軽鎖リーダーペプチド、ＡＤ２、１３残基のペプチドリンカー及びｈＡ２０ Ｖｋの最初の４残基（全てコドンフレームが整合されている）のコーディング配列を含む１９７ ｂｐのＤＮＡ２重鎖を以下のように作製した。Ｔａｑポリメラーゼを用いたプライマー伸長により、３５塩基配列分重複する２種類の１００-ｍｅｒ合成オリゴヌクレオチドから完全な２重鎖を作製した。
ＬＰ-ＡＤ２-Ｌ１３トップ
ＣＡＴＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＡＧＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＧＴＧＧＣＣＡＧＡＴＣＧＡＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣ （配列番号３３）
ＬＰ-ＡＤ２-Ｌ１３ボトム
ＣＣＧＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＧＡＣＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＴＧＴＣＣＡＣＧＡＴＣＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＴＣＧＡＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣ （配列番号３４)
配列は、ＰＣＲによって増幅させ、これによって、５'末端と３'末端に、ＸｂａＩとＰｖｕＩＩの制限部位がそれぞれ付加した。アンプライマーをｐＧｅｍＴにクローニングした。
ＬＰ-左側ＸｂａＩ
ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＴＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡ （配列番号３５）
Ｌ１３-ＶＫ右側ＰｖｕＩＩ
ＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＴＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣ （配列番号３６）
ｐＧｅｍＴから１９７ ｂｐのＸｂａＩ／ＰｖｕＩＩ断片を切り出し、ＸｂａＩとＰｖｕＩＩを用いた制限酵素処理により調製した ｈＡ２０ ＶＫシャトルベクターｈ２Ｂ８-Ｖｋ-ｐＢＲ２にライゲーションした。新たなシャトルベクターは、ＡＤ２-Ｋ-ｈＡ２０-ｐＢＲ２となる。ＡＤ２-Ｋ-ｈＡ２０-ｐＢＲ２から５３６ ｂｐのＸｂａＩ／Ｂａｍ ＨＩ制限処理断片を切り出して、ＸｂａＩとＢａｍ ＨＩを用いた制限酵素処理により調製した ｈＡ２０-ＩｇＧ-ｐＤＨＬ２ベクターにライゲーションすることで、発現ベクターＮ-Ｌ-ＡＤ２-ｈＡ２０-ＩｇＧ-ｐｄＨＬ２を作製した。
Ｎ-Ｌ-ＡＤ２-ｈＡ２０-ＩｇＧ-ｐｄＨＬ２を用いてエレクトロポレーションによりＳｐ２／０骨髄腫細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後に細胞を９６ウェルプレート内に播種し、メトトレキサートを含む培地中でトランスジェニッククローンのセレクションを行った。ｈＡ２０特異的な抗イディオタイプＭＡｂでコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレートを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡとペロキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧを用いた検出により、クローンのＮ-Ｌ-ＡＤ２-ｈＡ２０ ＩｇＧ生産能についてスクリーニングを行った。タンパク質を生産させるため、ローラーボトル内でクローンを増殖させて、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによりシングルステップで増殖に使用済みの培養培地からＮ-Ｌ-ＡＤ２-ｈＡ２０ ＩｇＧを精製した。
サイズ排除ＨＰＬＣにより、試料中のＮ-Ｌ-ＡＤ２-ｈＡ２０ ＩｇＧの大部分が、ＩｇＧと近似する保持時間を有する単量体型であることが示された。更なる２本のピークは、恐らくジスルフィド結合した２量体型と３量体型を表しており、各ピークは、全タンパク質の約１５％を占めることも観察された（図１７Ａ）。試料の穏やかな還元（ＤＮＬ反応でも用いられるように）により、２量体型と３量体型が単量体型へと変換される（図１７Ｂ）。これら３つの型の推定上の構造の模式図を図１８に示す。
実施例２８．Ｈｅｘ-ｈＡ２０の作製
ＤＮＬ法を用いて、Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＡ２０ ＩｇＧ（実施例２６参照）をｈＡ２０-Ｆａｂ-ＤＤＤ２と組み合わせることにより、単一特異性を示す抗ＣＤ２０のＨＩＤＳであるＨｅｘ-ｈＡ２０を作製した。Ｈｅｘ-ｈＡ２０構造体は、６本の抗ＣＤ２０抗体のＦａｂ断片と１本のＦｃ断片を含む（図１０）。
Ｈｅｘ-ｈＡ２０は４ステップで作製した。
工程１、組み合せ：２１０％モル当量の(ｈＡ２０-Ｆａｂ-ＤＤＤ２)２をＣ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＡ２０ ＩｇＧと混合した。２つのＦａｂ-ＤＤＤ２の２量体が各Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＡ２０ ＩｇＧ分子に結合しており、更なる１０％過剰量の前者により、この結合反応が確実に完了することから、上記のモル比を用いた。Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＡ２０ ＩｇＧと(ｈＡ２０-Ｆａｂ-ＤＤＤ２)２の分子量は、それぞれ１６８ ｋＤａと１０７ ｋＤａである。例として、１３４ ｍｇのｈＡ２０-Ｆａｂ-ＤＤＤ２を１００ ｍｇのＣ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＡ２０ ＩｇＧと混合することで、前者の２１０％モル当量が達成される。混合物は、典型的には１ ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ ７.４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で作製される。
工程２、穏やかな還元：還元型のグルタチオン（ＧＳＨ）を１ ｍＭの終濃度で添加し、この溶液を、室温（１６ – ２５℃）で１-２４時間保持した。
工程３、穏やかな酸化：還元の後、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＨ）を２ ｍＭの終濃度で反応混合物に直接加え、この溶液を室温で１-２４時間保持した。
工程４、ＤＮＬ産物の単離：酸化の後、反応混合物を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム上に直接ローディングした。カラムをＰＢＳで洗浄し、Ｈｅｘ-ｈＡ２０を０.１ Ｍのグリシン（ｐＨ ２.５）で溶離した。過剰量のｈＡ２０-Ｆａｂ-ＤＤＤ２を反応で用いたことから、非結合性のＣ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＡ２０ ＩｇＧ又は(ｈＡ２０-Ｆａｂ-ＤＤＤ２)２部分を１つだけ含んだ不完全なＤＮＬ構造体は存在していなかった。非結合性の過剰なｈＡ２０-Ｆａｂ-ＤＤＤ２は、アフィニティー樹脂に結合しない；従って、プロテインＡで精製した物質には、所望の生成物のみが含まれる。
構成ポリペプチドの推定アミノ酸配列から計算した分子量は、３８６ ｋＤａである。サイズ排除ＨＰＬＣ分析により、３７５ — ４００ ｋＤａのタンパク質構造と一致する保持時間を有する単一のタンパク質ピークが示された（図１９）。非還元的条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、高分子量のバンドの集まりが示され、大きな共有結合した構造体の存在が示唆される（図２０Ａ、レーン３）。還元的条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥ（図２０Ｂ、レーン３）により、３種類の予測されたポリペプチド鎖のみの存在が示される：ＡＤ２-融合重鎖（ＨＣ-ＡＤ２）、ＤＤＤ２-融合Ｆｄ鎖（Ｆｄ-ＤＤＤ２）、及びκ鎖。
実施例２９．Ｈｅｘ-ｈＬＬ２の作製
ＤＮＬ法を用いて、Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＬＬ２ ＩｇＧ（実施例２５参照）をｈＬＬ２-Ｆａｂ-ＤＤＤ２と組み合わせることにより、単一特異性を示す抗ＣＤ２２のＨＩＤＳ（Ｈｅｘ-ｈＬＬ２）を作製した。ＤＮＬ反応は、実施例２８でＨｅｘ-ｈＡ２０について記載する通りに行った。
構成ポリペプチドの推定アミノ酸配列から計算した分子量は、３８６ ｋＤａである。サイズ排除ＨＰＬＣ分析により、３７５ — ４００ ｋＤａのタンパク質構造と一致する保持時間を有する単一のタンパク質ピークが示された（図２１）。非還元的条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、高分子量のバンドの集まりが示され、大きな共有結合した構造体の存在が示唆される（図２０Ａ、レーン４）。還元的条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥ（図２０Ｂ、レーン４）により、３種類の予測されたポリペプチド鎖のみの存在が示される：ＨＣ-ＡＤ２、Ｆｄ-ＤＤＤ２、及びκ鎖。
実施例３０．ＤＮＬ１とＤＮＬ１Ｃの作製
ＤＮＬ法を用いて、Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＬＬ２ ＩｇＧ（実施例２５参照）をｈＡ２０-Ｆａｂ-ＤＤＤ２と組み合わせて二重特異性のＨＩＤＳを作製することで、ＤＮＬ１を得るか、又はｈＭＮ-１４-ＤＤＤ２と組み合わせて二重特異性のＨＩＤＳを作製することで、ＤＮＬ１Ｃを得た。ＤＮＬ１は、ＣＤ２０に対する４本の結合アームとＣＤ２２に対する２本の結合アームを有する。ｈＭＮ-１４は、癌胎児抗原（ＣＥＡ）に対するヒト化ＭＡｂであるから、ＤＮＬ１Ｃは、ＣＥＡに対する４本の結合アームとＣＤ２２に対する２本の結合アームを有する。 ＤＮＬ反応は、実施例２８でＨｅｘ-ｈＡ２０について記載する通りに行った。
ＤＮＬ１とＤＮＬ１Ｃの両方について、構成ポリペプチドの推定アミノ酸配列から計算した分子量は、〜３８６ ｋＤａである。サイズ排除ＨＰＬＣ分析により、各構造体について、３７５ — ４００ ｋＤａのタンパク質構造と一致する保持時間を有する単一のタンパク質ピークが示された（ＤＮＬ１は図２２Ａ、そしてＤＮＬ１Ｃは図２２Ｂ）。非還元的条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、高分子量のバンドの集まりが示され、大きな共有結合した構造体の存在が示唆される（図２０Ａ、レーン１及び５）。還元的条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥ（図２０Ｂ、レーン１及び５）により、この大きな共有結合した構造体が、３種類の予測されたポリペプチドのみで構成されていることが示される：ＨＣ-ＡＤ２、Ｆｄ-ＤＤＤ２、及びκ鎖。
実施例３１．ＤＮＬ２とＤＮＬ２Ｃの作製
ＤＮＬ法を用いて、Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＡ２０ ＩｇＧ（実施例２６参照）をｈＬＬ２-Ｆａｂ-ＤＤＤ２と組み合わせて二重特異性のＨＩＤＳを作製することで、ＤＮＬ２を得るか、又はｈＭＮ-１４-ＤＤＤ２と組み合わせて二重特異性のＨＩＤＳを作製することで、ＤＮＬ２Ｃを得た。ＤＮＬ２は、ＣＤ２２に対する４本の結合アームとＣＤ２０に対する２本の結合アームを有する。ＤＮＬ２Ｃは、ＣＥＡに対する４本の結合アームとＣＤ２０に対する２本の結合アームを有する。 ＤＮＬ反応は、実施例２８でＨｅｘ-ｈＡ２０について記載する通りに行った。
ＤＮＬ２とＤＮＬ２Ｃの両方について、構成ポリペプチドの推定アミノ酸配列から計算した分子量は、〜３８６ ｋＤａである。サイズ排除ＨＰＬＣ分析により、各構造体について、３７５ — ４００ ｋＤａのタンパク質構造と一致する保持時間を有する単一のタンパク質ピークが示された（図２３）。非還元的条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、高分子量のバンドの集まりが示され、大きな共有結合した構造体の存在が示唆される（図２０Ａ、レーン２及び６）。還元的条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥ（図２０Ｂ、レーン２及び６）により、この大きな共有結合した構造体が、３種類の予測されたポリペプチドのみで構成されていることが示される：ＨＣ-ＡＤ２、Ｆｄ-ＤＤＤ２、及びκ鎖。
実施例３２．Ｋ-Ｈｅｘ-ｈＡ２０の作製
ＤＮＬ法を用いて、Ｎ-Ｌ-ＡＤ２-ｈＡ２０ ＩｇＧ（実施例２７参照）をｈＡ２０-Ｆａｂ-ＤＤＤ２と組み合わせて単一特異性の抗ＣＤ２０ ＨＩＤＳ（Ｋ-Ｈｅｘ- ｈＡ２０）を作製した。ＤＮＬ反応は、実施例２８でＨｅｘ-ｈＡ２０について記載する通りに行った。
構成ポリペプチドの推定アミノ酸配列から計算した分子量は、３８６ ｋＤａである。非還元的条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、高分子量のバンドの集まりが示され、大きな共有結合した構造体の存在が示唆される（図２４、レーン２ 及び３）。還元的条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥ（図 ２４、レーン２Ｒ 及び３Ｒ）により、この大きな共有結合した構造体が、４種類の予測されたポリペプチドのみで構成されていることが示される：Ｆｄ-ＤＤＤ２、Ｈ鎖、κ鎖、及びＡＤ２-κ。
実施例３３．ＤＮＬ３の作製
Ｎ-Ｌ-ＡＤ２-ｈＡ２０ ＩｇＧ（実施例２７参照）をｈＬＬ２-Ｆａｂ-ＤＤＤ２と組み合わせて二重特異性のＨＩＤＳを作製した。ＤＮＬ反応は、実施例２８でＨｅｘ-ｈＡ２０について記載する通りに行った。
構成ポリペプチドの推定アミノ酸配列から計算した分子量は、３８６ ｋＤａである。サイズ排除ＨＰＬＣ分析により、３７５ — ４００ ｋＤａのタンパク質構造と一致する保持時間を有する単一のタンパク質ピークが示された（図２５）。非還元的条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、高分子量のバンドの集まりが示され、大きな共有結合した構造体の存在が示唆される（図２４、レーン１）。還元的条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥ（図２４、レーン１）により、この大きな共有結合した構造体が、４種類の予測されたポリペプチドのみで構成されていることが示される：Ｆｄ-ＤＤＤ２、Ｈ鎖、κ鎖、及びＡＤ２-κ
実施例３４．ＨＩＤＳのインビトロでのキャラクタリゼーション
図２６と図２７に示すように、実施例２８-３３に記載するように作製したＨＩＤＳは、その親Ｆａｂ／ＩｇＧの結合特性を保持している。競合的ＥＬＩＳＡを用いることで、種々のＨＩＤＳの結合活性を調べる際には、ｈＡ２０（ＷＲ２）と結合したラット由来抗イディオタイプＭＡｂを用いてｈＡ２０成分の結合活性を評価するか、又はｈＬＬ２（ＷＮ）と結合したラット由来抗イディオタイプＭＡｂを用いてｈＬＬ２成分の結合活性を評価した。ｈＡ２０の結合性を評価するため、ＥＬＩＳＡプレートをｈＡ２０ ＩｇＧでコーティングして、ＷＲ２の結合において、ＨＩＤＳを固相化されたＩｇＧと競合させた。ｈＬＬ２の結合性を評価するため、ＥＬＩＳＡプレートをｈＬＬ２ ＩｇＧでコーティングして、ＷＮの結合において、ＨＩＤＳを固相化されたＩｇＧと競合させた。ペロキシダーゼ結合抗ラットＩｇＧを用いて、固相化したＩｇＧに結合している抗Ｉｄの相対量を検出した。
ＣＤ２０への相対結合活性を図２６Ａに示す。２つのＣＤ２０結合基を有するＤＮＬ２は、やはり２本のＣＤ２０結合アームを有するｈＡ２０ ＩｇＧと同程度の結合活性を示した。４つのＣＤ２０結合基を有するＤＮＬ１は、ＤＮＬ２又はｈＡ２０ ＩｇＧよりも強力な（〜４倍）相対結合活性を示した。６つのＣＤ２０結合基を有するＨｅｘ-ｈＡ２０は、ｈＡ２０ ＩｇＧと比べて更に強力な（〜１０倍）相対結合活性を示した。
ＣＤ２２への結合についての同様の発見を図２６Ｂに示す。２つのＣＤ２０結合基を有するＤＮＬ１は、やはり２本のＣＤ２２結合アームを有するｈＬＬ２ ＩｇＧと同程度の結合活性を示した。４つのＣＤ２２結合基を有するＤＮＬ２は、ＤＮＬ１又はｈＬＬ２ ＩｇＧよりも強力な（＞５倍）相対結合活性を示した。６つのＣＤ２２結合基を有するＨｅｘ-ｈＬＬ２は、ｈＬＬ２ ＩｇＧと比べて更に強力な（＞１０倍）相対結合活性を示した。
ＤＮＬ２とＤＮＬ３は、両方とも２つの ｈＡ２０ Ｆａｂと４つのｈＬＬ２ Ｆａｂを含むことから、これらは同一の抗ｉｄ抗体への結合において同程度の強度を示す（図２７）。
ＨＩＤＳのいくつかは、リンパ腫セルラインに対して強力な抗増殖作用を示すことが実証された。ＤＮＬ１、ＤＮＬ２及びＨｅｘ-ｈＡ２０は、インビトロでＤａｕｄｉ Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞の細胞増殖を阻害した（図２８）。１０ ｎＭの濃度で細胞を処理した場合には、ＨＩＤＳはリツキシマブよりも相当に高い効果を示した（図２８Ａ）。細胞カウントアッセイにでは、ＤＮＬ１とＤＮＬ２の効力は、リツキシマブの１００倍を超える程強いと評価され、Ｈｅｘ-ｈＡ２０は、更に一層強力であることが示された（図２８Ｂ）。このことは、種々の濃度のＨＩＤＳで処理したＤａｕｄｉ細胞について用量-反応曲線を作製して、ＭＴＳ増殖アッセイにより確認した（図２９）。リツキシマブと比較した場合、二重特異性ＨＩＤＳ（ＤＮＬ１及びＤＮＬ２）及びＨｅｘ-ｈＡ２０は、それぞれ、＞１００倍及び＞１００００倍強力であった。
実施例３５．ＨＩＤＳのインビボでの抗腫瘍活性
マウスのヒトＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫モデルにより、ＨＩＤＳが、インビボで治療効能を有することが示された（図３０）。低投与量（１２ μｇ）のＤＮＬ２及びＨｅｘ-ｈＡ２０により、腫瘍保持マウスの生存時間が２倍超まで延ばされた。より多くの投与量（６０ μｇ）を用いた処置により、長期生存者が現れた。
実施例３６．ＨＩＤＳと親ＩｇＧのリンパ腫セルラインに対する相対的効果
ＭＴＳ増殖アッセイにより、３種類の異なるリンパ腫セルラインに対する ＨＩＤＳ（ＤＮＬ１、ＤＮＬ２、Ｈｅｘ-ｈＡ２０）対親ＩｇＧ（ｈＡ２０ ＩｇＧ）の用量反応曲線の比較を行った（図３１）。Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞（図３１、上段のパネル）では、二重特異性構造体のＤＮＬ１（データは非表示）とＤＮＬ２が、親ｈＡ２０ ＩｇＧと比べて、＞１００倍高い抗増殖活性を示し、Ｈｅｘ-ｈＡ２０が＞１０,ＯＯＯ倍高い活性を示した。本アッセイでは、Ｈｅｘ-ｈＬＬ２とコントロール構造体（ＤＮＬ１-Ｃ及びＤＮＬ２-Ｃ）は、殆ど抗増殖活性を示さなかった（データは非表示）。
Ｒａｊｉリンパ腫細胞（図３１、中段のパネル）では、Ｈｅｘ-ｈＡ２０は、強力な抗増殖活性を示したが、ＤＮＬ２はｈＡ２０ ＩｇＧと比べても極弱い活性を示したにすぎなかった。Ｒａｍｏｓリンパ腫細胞（図３１、下段のパネル）では、ＤＮＬ２とＨｅｘ-ｈＡ２０は、両方ともｈＡ２０ ＩｇＧと比べて強力な抗増殖活性を示した。これらのデータは、親ＩｇＧに対するＨＩＤＳの増強された効能が、特定のセルラインに限定されるものではなく、むしろ、適切な標的を表示する細胞について普遍的な現象であることを示している。
実施例３７．ＨＩＤＳと親ＩｇＧの効力に対する架橋形成による影響
抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の架橋形成は、そのインビトロでの効力を促進することが示されている。図３２には、ＭＴＳアッセイによって評価した、親ＩｇＧに対するＨＩＤＳの相対効力に対する架橋形成による影響が示されている。図３２に示すように、上記効果は、ヤギ由来抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的架橋と架橋形成したｈＡ２０ ＩｇＧで処理したＤａｕｄｉリンパ腫細胞で、架橋形成されていないｈＡ２０ ＩｇＧとの比較において、再現性を以て示された。しかしながら、架橋が存在している場合であってもＤＮＬ２又はＨｅｘ-ｈＡ２０では抗増殖活性の促進は観察されなかった。以下でも議論するように、更に４つのＦａｂ基がＨＩＤＳのカルボキシル末端に繋ぎ止められた場合には、ＨＩＤＳのＦｃ部分への接近が不可能になることが考えられる。
実施例３８．血清中での安定性
図３３には、二重特異性ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した、ヒト血清中でのＤＮＬ１とＤＮＬ２の安定性が示されている。新鮮なプールされたヒト血清中で１０ μｇ／ｍｌのタンパク質構造体を、５％のＣＯ２下で３７℃にて５日間インキュベートした。０日目のサンプルでは、アリコートを血清で希釈した直後に液体窒素で凍結させた。ＥＬＩＳＡプレートは、ｈＡ２０ ＩｇＧに対する抗Ｉｄでコーティングし、ｈＬＬ２ ＩｇＧに対する抗Ｉｄを用いて二重特異性結合を検出した。ＤＮＬ１とＤＮＬ２の両方とも血清内で非常に安定しており、完全な二重特異性結合活性を保持していた。
実施例３９．ＣＤＣ及びＡＤＣＣ活性
リツキシマブやｈＡ２０等の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体は、インビボで腫瘍細胞を死滅させるための補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）及びシグナル伝達誘導性の増殖阻害／アポトーシスを利用することができる。Ｄａｕｄｉ細胞を用いたインビトロでのアッセイで、６価のＤＮＬ構造体（ＤＮＬ１、ＤＮＬ２、Ｈｅｘ-ｈＡ２０）のＣＤＣ活性について試験を行った。驚くべきことに、ＣＤ２０に結合するいずれの６価構造体もＣＤＣ活性を示さなかった（図３４）。親ｈＡ２０ ＩｇＧは、強力なＣＤＣ活性を示したが（図３４）、ＣＤ２２に対するｈＬＬ２抗体は、期待されたように何ら活性を示さなかった。ＤＮＬ２とＨｅｘ-ｈＡ２０には、ｈＡ２０ ＩｇＧと同程度のＣＤＣ活性を示したｈＡ２０-ＩｇＧ-Ａｄ２（図３４）が含まれていることから、ＤＮＬ２とＨｅｘ-ｈＡ２０が作用を示さないことは、興味深いものであった。
新たに単離した末梢血液単核球を用いてＤＮＬ１のＡＤＣＣ活性についてアッセイを行った（図３５）。リツキシマブとｈＡ２０ ＩｇＧは、両方ともＤａｕｄｉ細胞に対して強い活性を示したが（図３５）、ＤＮＬ１は検出可能なレベルのＡＤＣＣ活性を示さなかった。
これらのデータは、更に４個のＦａｂ基がＦｃ領域のカルボキシル末端に繋ぎ止められた場合には、エフェクター機能（ＣＤＣ及びＡＤＣＣ）のためのＦｃ領域への接近が不可能になる場合があることを示している。従って、６価のＤＮＬ構造体は、インビボでの抗腫瘍活性に関して、シグナル伝達誘導性の増殖阻害／アポトーシスのみに依存していると考えられる。
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図１には、代表的なＤＤＤ配列が示されている。ＤＤＤ１（配列番号１）の下線を引いた配列は、ヒトＰＫＡのＲＩＩαに見出される最初の４４個のアミノ末端残基に対応する。ＤＤＤ２（配列番号２）は、Ｎ末端の２つのアミノ酸残基においてＤＤＤ１と異なっている。 図２には、代表的なＡＤ配列が示されている。ＡＤ１（配列番号３）の下線を引いた配列は、ＡＫＡＰ-ｉｓに対応しており、これは０.４ ｎＭ のＫｄを有すると報告された、最適化されているＲＩＩ選択ペプチドである。ＡＤ２（配列番号４）も示されている。 図３は、Ｎ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４（Ａ）とＤＤＤ２に媒介される２量体化により形成された推定上のａ２構造体（Ｂ）の模式図を示す。 図４は、Ｎ-ＤＤＤ２-ＶＨ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２プラスミド発現ベクターの設計を示す。 図５は、Ｃ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４（Ａ）とＤＤＤ２に媒介される２量体化により形成された推定上のａ２構造体（Ｂ）の模式図を示す。 図６は、Ｃ-ＤＤＤ２-ＶＨ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２プラスミド発現ベクターの設計を示す。 図７は、（Ａ）還元的条件下でＮ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４とｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２を混合することにより形成される非共有結合的ａ２ｂ複合体と、（Ｂ）ジスルフィド架橋により形成される共有結合を有するＴＦ１構造体の図式的表示である。 図７は、ＴＦ２の模式図を示す。 図９は、Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ＩｇＧの略図である。（Ａ）重鎖-ＡＤ２及び軽鎖のｃＤＮＡ／ポリペプチド配列を並べたもの。（Ｂ）Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ＩｇＧの図式的表示。 図１０は、Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ＩｇＧモジュールとＦａｂ-ＤＤＤ２モジュールの組み合わせにより生じた単一特異性ＨＩＤＳ（６価のＩｇＧを基礎とするＤＮＬ構造）の図示的表示である。 図１１は、Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ＩｇＧモジュールとＦａｂ-ＤＤＤ２モジュールの組み合わせにより生じた二重特異性ＨＩＤＳの図示的表示である。 図１２は、Ｎ-Ｋ-ＡＤ２-ＩｇＧの略図である。（Ａ）重鎖及びＡＤ２-軽鎖のｃＤＮＡ／ポリペプチド配列を並べたもの。（Ｂ）Ｎ-Ｋ-ＡＤ２-ＩｇＧの図式的表示。 図１３は、Ｎ-Ｋ-ＡＤ２-ＩｇＧモジュールとＦａｂ-ＤＤＤ２モジュールの組み合わせにより生じた二重特異性ＨＩＤＳの図示的表示である。 図１４は、（Ａ）Ｆｃ-ＡＤ２-ｐｄＨＬ２シャトルベクター、（Ｂ）ＩｇＧ-ｐｄＨＬ２哺乳動物用発現ベクター及び（Ｃ）Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ＩｇＧ-ｐｄＨＬ２哺乳動物用発現ベクターの略図である。 図１５は、プロテインＡ-精製Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＬＬ２-ＩｇＧのＳＥ-ＨＰＬＣ分析を示す。単量体及び二量体の形態を表すピークが示されている。 図１６は、還元的条件及び非還元的条件下でのプロテインＡ-精製Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＬＬ２-ＩｇＧのＳＤＳ-ＰＡＧＥ解析を示す。還元的レーンにおいて、重鎖-ＡＤ２、重鎖及びκ軽鎖を表すバンドが示されている。Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＬＬ２-ＩｇＧと共有結合的２量体を表すバンドは、非還元的レーンに示されている。分子量マーカーの位置も示されている。 図１７は、プロテインＡ-精製Ｎ-Ｋ-ＡＤ２-ｈＬＬ２-ＩｇＧのＳＥ-ＨＰＬＣ分析を示す。（Ａ）単量体、２量体及び３量体の形態を表すピークが矢印と共に示されている。（Ｂ）２量体及び３量体の形態が、単量体の形態に変換されたことを示すグルタチオンを用いた還元後の分析。 図１８は、Ｎ-Ｋ-ＡＤ２-ｈＬＬ２-ＩｇＧの（Ａ）２量体の形態及び（Ｂ）３量体の形態の推定上の構造の略図であり、これらは、穏やかな還元によって（Ｃ）単量体の形態に変換される。 図１９は、プロテインＡ-精製Ｈｅｘ-ｈＡ２０のＳＥ-ＨＰＬＣ分析を示す。 図２０は、６種類のＣ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＬＬ２-ＩｇＧを基礎とするＨＩＤＳのＳＤＳ-ＰＡＧＥ解析を示す。（Ａ）非還元的条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥ。（Ｂ）還元的条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥ。重鎖-ＡＤ２、Ｆｄ-ＤＤＤ２及びκ軽鎖を表すバンドが、矢印と共に示されている。分子量マーカーの位置も示されている。 図２１は、プロテインＡ-精製Ｈｅｘ-ｈＬＬ２のＳＥ-ＨＰＬＣ分析を示す。 図２２は、(Ａ) ＤＮＬ１と(Ｂ) ＤＮＬ１ＣのＳＥ-ＨＰＬＣ分析を示す。 図２３は、ＤＮＬ２のＳＥ-ＨＰＬＣ分析を示す。 図２４は、還元的条件及び非還元的条件下でのＤＮＬ３とＫ-Ｈｅｘ-ｈＡ２０のＳＤＳ-ＰＡＧＥ解析を示す。還元的レーンにおいて、重鎖、ＡＤ２-κ鎖、Ｆｄ-ＤＤＤ２及びκ軽鎖を表すバンドが示されている。ＤＮＬ３とＫ-Ｈｅｘ-ｈＡ２０を表すバンドは、非還元的レーンに示されている。分子量マーカーの位置も示されている。 図２５は、ＤＮＬ３のＳＥ-ＨＰＬＣ分析を示す。 図２６は、親ＩｇＧとＤＮＬ１、ＤＮＬ２ Ｈｅｘ-ｈＡ２０及びＨｅｘ-ｈＬＬ２のｈＡ２０／ｈＬＬ２への相対的な結合活性を比較した２種類の競合的ＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。マイクロタイタープレートは、５μｇ／ｍｌのｈＡ２０又はｈＬＬ２ ＩｇＧでコーティングした。ＨＩＤＳの段階希釈物をｈＡ２０又はｈＬＬ２ ＩｇＧに特異的な抗Ｉｄと混合し、これを一定の濃度に維持した（２ ｎＭ）。コーティングしたウェルへの抗Ｉｄの結合レベルは、ペロキシダーゼ結合ヤギ抗ラットＩｇＧとＯＰＤ基質溶液を用いて検出した。結果は、ＨＩＤＳ濃度に対する（コーティングしたウェルへの抗Ｉｄの結合の）阻害％としてプロットしている。ＥＣ５０（５０％の阻害を起こす有効濃度）の値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて計算した。（Ａ）ｈＡ２０コーティングしたウェル内のＷＩ２（ｈＡ２０ラット抗Ｉｄ）又は（Ｂ）ｈＬＬ２コーティングしたウェル内のＷＮ（ｈＬＬ２ラット抗Ｉｄ）への結合には、ＨＩＤＳを用いて競合させた。 図２７は、ＤＮＬ２及びＤＮＬ３のｈＡ２０／ｈＬＬ２への相対的な結合活性を比較した２種類の競合的ＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。実験は、図２６に記載した通りに行った。（Ａ）ｈＡ２０コーティングしたウェル内のＷＩ２（ｈＡ２０ラット抗Ｉｄ）又は（Ｂ）ｈＬＬ２コーティングしたウェル内のＷＮ（ｈＬＬ２ラット抗Ｉｄ）への結合には、ＤＮＬ２、ＤＮＬ３及び親ＩｇＧを用いて競合させた。 図２８は、Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞をＤＮＬ１、ＤＮＬ２、Ｈｅｘ-ｈＡ２０又はリツキシマブで処理した後の細胞カウントアッセイの結果を示す。異なる濃度のＨＩＤＳ又はリツキシマブのいずれか１つを補充したＲＰＭＩ １６４０培地１ｍｌ当たりに１ ｘ １０５個のＤａｕｄｉ細胞を組織培養フラスコに播種した。Ｇｕａｖａ ＰＣＡを用いて目視可能な細胞を毎日カウントした。（Ａ）１０ ｎＭの濃度での処理後の比較増殖曲線。（Ｂ）選択した濃度での比較増殖曲線。 図２９は、Ｄａｕｄｉ細胞の種々のＨＩＤＳによる処理に対する用量反応実験の結果を示す。細胞は、ＲＰＭＩ １６４０培地中で、９６ウェルプレート内に、５０００細胞／ウェルで播種した。最も低い濃度で２ ｘ １０-８から６.４ ｘ １０-１２ Ｍの濃度で ５倍の段階希釈を、３つの系に重複して行った。プレートは４日間インキュベートし、その後、ＭＴＳ試薬を添加して、４９０ ｎｍでプレートを測定するまで更に４時間インキュベートを続けた。結果は、ＨＩＤＳモル濃度の対数に対する未処理ウェルのＯＤ４９０のパーセントとして示されている。各用量反応曲線について、ＥＣ４０（４０％の増殖阻害を生じる有効濃度）の値を測定した。 図３０は、ヒトバーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ）を埋め込まれたマウスをＤＮＬ２又はＨｅｘ-ｈＡ２０で処置したインビボでの治療実験の結果を示す。マウス（１グループ当たり４匹）には、静脈内（ｉ.ｖ.）注射により１.５ ｘ １０７個のＤａｕｄｉ細胞を接種した（０日目）。１日目、４日目及び７日目に４ μｇ又は２０ μｇのＤＮＬ２又はＨｅｘ-ｈＡ２０のいずれかをマウスに腹腔内（ｉ.ｐ.）投与した。マウスは、後肢麻痺を発症するか又は＞２０％の体重減少を生じた場合に、屠殺した。結果は時間（日数）に対する生存率％としてプロットした。生存率の中間値と長期生存者が示されている。 図３１は、二重特異性ＨＩＤ(ＤＮＬ２ - ｆｏｕｒ ｈＬＬ２ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｔｅｔｈｅｒｅｄ ｔｏ ａｎ ｈＡ２０ ＩｇＧ)及び単一特異性ＨＩＤ（Ｈｅｘ- ｈＡ２０）で処理したＤａｕｄｉ細胞、Ｒａｊｉ細胞及びＲａｍｏｓ細胞に対するＭＴＳ増殖アッセイにより作成した、ｈＡ２０ ＩｇＧコントロールとの比較における、相対的用量反応曲線を示す。Ｄａｕｄｉ細胞（上段のパネル）では、ｈＡ２０ ＩｇＧ と比べて、ＤＮＬ２は１００倍を超え、Ｈｅｘ-ｈＡ２０は１００００倍を超える程強力な抗増殖活性を示した。Ｒａｊｉ細胞（中段のパネル）では、ｈＡ２０ ＩｇＧ と比べて、Ｈｅｘ-ｈＡ２０は強力な抗増殖活性を示したが、ＤＮＬ２は、最小レベルの活性を示しただけであった。Ｒａｍｏｓ細胞（下段のパネル）では、ＤＮＬとＨｅｘ-ｈＡ２０の両方とも、ｈＡ２０ ＩｇＧと比較して強力な抗増殖活性を示した。 図３２は、ｈＡ２０ ＩｇＧ、ＤＮＬ２及びＨｅｘ-ｈＡ２０の抗増殖活性に対する架橋形成の効果を示す。図に示すように、架橋形成は、ｈＡ２０ ＩｇＧの抗増殖活性を強めたが、ＤＮＬ２又はＨｅｘ-ｈＡ２０の活性を向上させることはなかった。 図３３は、二重特異性ＥＬＩＳＡアッセイにより測定した、ヒト血清中でのＤＮＬ１とＤＮＬ２の安定性を示す。タンパク質構造体は、１０ μｇ／ｍｌで、新鮮なヒト血清プール中にて３７℃、５％ ＣＯ２で５日間インキュベートした。０日目のサンプルでは、アリコートを血清で希釈した直後に液体窒素で凍結させた。ＥＬＩＳＡプレートは、ｈＡ２０ ＩｇＧに対する抗Ｉｄでコーティングし、ｈＬＬ２ ＩｇＧに対する抗Ｉｄを用いて二重特異性結合を検出した。ＤＮＬ１とＤＮＬ２の両方とも血清内で非常に安定しており、完全な二重特異性結合活性を保持していた。 図３４は、ＤＮＬ１、ＤＮＬ２、Ｈｅｘ-ｈＡ２０、ｈＬＬ２、ｈＡ２０-ＩｇＧ及びｈＡ２０-ＩｇＧ-ＡＤ２による補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）又はその欠如を示す。ｈＡ２０ ＩｇＧ とｈＡ２０-ＩｇＧ-ＡＤ２は、インビトロでのアッセイにおいてＤａｕｄｉ細胞に対する強力なＣＤＣ活性を示したが、驚くべきことに、本アッセイにおいては、６価のＤＮＬ構造体のいずれも、ＣＤＣ活性を示さなかった。ＤＮＬ２とＨｅｘ-ｈａ２０の両方ともｈＡ２０-ＩｇＧ-ＡＤ２を含んでおり、ｈＡ２０ ＩｇＧと同程度のＣＤＣ活性を示した。 図３５は、新しく単離した末梢血液単核球を用いてアッセイした、ｈＡ２０ ＩｇＧ、リツキシマブ及びｈＬＬ２ ＩｇＧとの比較における、ＤＮＬ１の抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を示す。リツキシマブとｈＡ２０ ＩｇＧの両方とも強力なＡＤＣＣ活性を示したが、ＤＮＬ１は、何ら検出可能なレベルのＡＤＣＣを示さなかった。

Claims (29)

  1. ２個のＡＤ２（配列番号４）部分に結合したＩｇＧ抗体と、各断片がＤＤＤ２（配列番号２）部分に結合した同一の又は異なるＩｇＧの４本のＦａｂ断片とを含み、前記ＡＤ２部分が前記ＤＤＤ２部分に結合している、６量体の安定係留構造体。
  2. 前記ＡＤ２部分が、前記ＤＤＤ２部分にジスルフィド結合により共有結合している、請求項１に記載の構造体。
  3. 前記構造体が、６本のＦａｂ断片と１本のＦｃ断片を含む、請求項１に記載の構造体。
  4. 前記Ｆａｂ断片のそれぞれが、同一の抗原エピトープに結合する、請求項１に記載の構造体。
  5. 前記Ｆａｂ断片のうち２本の断片が第１の抗原エピトープに結合し、そして前記Ｆａｂ断片のうち４本の断片が第２の抗原エピトープに結合する、請求項１に記載の構造体。
  6. 前記抗体又はＦａｂ断片が、ヒト抗体、ヒト化抗体若しくはキメラ抗体、又はこれらのＦａｂ断片である、請求項１に記載の構造体。
  7. 前記ＩｇＧ抗体及び／又はＦａｂ断片が、炭酸脱水酵素ＩＸ、α-フェトプロテイン、Ａ３、Ａ３３抗体の特異的抗原、Ｂａ ７３３、ＢｒＥ３抗原、ＣＡ１２５、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ１３８、大腸特異的抗原-ｐ（ｃｏｌｏｎ-ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ-ｐ）（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＳＡｐ、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ-１、ＥＧＰ-２、Ｅｐ-ＣＡＭ、Ｆｌｔ-１、Ｆｌｔ-３、葉酸レセプター、ＨＬＡ-ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）及びそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、低酸素誘導因子（ＨＩＦ-１)、Ｉａ、ＩＬ-２、ＩＬ-６、ＩＬ-８、インシュリン成長因子-１（ＩＧＦ-１）、ＫＣ４抗原、ＫＳ-１抗原、ＫＳ１-４、Ｌｅ-Ｙ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＡＭ-４抗体の特異的抗原、胎盤成長因子、ｐ５３、前立腺酸性フォスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＳ５、Ｓ１ＯＯ、ＴＡＣ、ＴＡＧ-７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬレセプター、Ｔｎ抗原、トムソン-フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦ、ＥＤ-Ｂフィブロネクチン、１７-１Ａ抗原、脈管形成マーカー、癌遺伝子マーカー又は癌遺伝子産物から成る群から選択される抗原に結合する、請求項１に記載の構造体。
  8. 前記構造体に、共有結合若しくは非共有結合により結合した１又は２個以上のエフェクター又は担体を更に含む、請求項１に記載の構造体。
  9. 前記エフェクターが、診断剤、治療剤、化学療法剤、放射線同位体、造影剤(ｉｍａｇｉｎｇ ａｇｅｎｔ)、抗血管新生剤、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、薬物、プロドラッグ、酵素、結合分子、細胞表面レセプターに対するリガンド、キレート剤、免疫調節剤、オリゴヌクレオチド、ホルモン、光検出性標識、色素、ペプチド、毒素、造影剤(ｃｏｎｔｒａｓｔ ａｇｅｎｔ)、常磁性標識、超音波標識、アポトーシス促進剤、リポソーム、ナノ粒子又はこれらの組み合わせである、請求項８に記載の構造体。
  10. 前記ＩｇＧ抗体及び前記Ｆａｂ断片が、標的の分子、複合体、凝集体、細胞、抗原又は組織に対する結合親和力を有する、請求項１に記載の構造体。
  11. 前記ＩｇＧ抗体が、標的の分子、複合体、凝集体、細胞、抗原又は組織に対する結合親和力を有し、そして少なくとも１つのＦａｂ断片が、ハプテンに対する結合部位を有する、請求項１に記載の構造体。
  12. 前記ＩｇＧ抗体が、細胞表面レセプター、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュロキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ｔｐＡ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、ウロキナーゼ、ＣＡ１９-９、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＥＤ-Ｂフィブロネクチン、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、Ｇ２５０抗原、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｈＴＲ、ＨＬＡクラスＩＩ、ＨＭＷ／ＭＡＡ、ＨＮ／ＮＤＶ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ-２Ｒ／Ｔａｃ、ＩＬ-１７、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、Ｍ１３コートタンパク質、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＣＤ７４、ＥＧＰ-１、ＣＤ２５／Ｔａｃ、ＬｅＹ、メソセリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、Ｅｒｂ-Ｂ２、Ｅｒｂ-Ｂ３、ＥｐＣＡＭ、ＧＰ２４０、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ｐ９７、ＣＤ３、ＩＬ-４Ｒ、ＩＬ-４、ＩＬ-１３、ＶＥＧＦＲ-２、ＣＤ１４、ＣＤ１１１／ネクチン-１、葉酸レセプターα、ｇｐ１２０、ＩＬ-６、ＩＬ-５、ＩＬ-８、ＣＤ１５４、ＩｇＥ、ＬＦＡ-１、β-トリプターゼ、ＣＤ１０５／エンドグリン（ｅｎｄｏｇｌｉｎ）、ＴＮＦα、ＲＳＶ Ｆタンパク質、ＣＥＡのＡ１Ｂ１、ＣＥＡのＮドメイン、ＰｆＭＳＰ-１、ＴＡＧ-７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＶＥＦＧＲ１／Ｆｌｔ-１、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ又はＶＥＧＲＦ３／Ｆｌｔ-４、に対する結合親和力を有する、請求項１１に記載の構造体。
  13. 少なくとも１つのＦａｂ断片が、ＩＬ-１７、ヒスタミンスクシニルグリシン（ＨＳＧ）、インジウム-ＤＴＰＡ、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＶＥＦＧＲ１／Ｆｌｔ-１、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ、ＶＥＧＲＦ３／Ｆｌｔ-４、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ８９、ＣＤ２、アデノウィルスファイバーノブ、Ｍ１３コートタンパク質、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペロキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ｔｐＡ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン又はウロキナーゼ、に対する結合親和力を有する、請求項１２に記載の構造体。
  14. 前記ＩｇＧ抗体が、ＣＥＡ、ＥＤ-Ｂフィブロネクチン、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＶＥＦＧＲ１／Ｆｌｔ-１、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ、ＶＥＧＲＦ３／Ｆｌｔ-４、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＰｆＭＳＰ-１、ＨＮ／ＮＤＶ、ＥｐＣＡＭ／１７-１Ａ、ｈＴＲ、ＩＬ-２Ｒ／Ｔａｃ、ＣＡ１９-９、ＭＵＣ１、ＨＬＡクラスＩＩ、ＧＤ２、Ｇ２５０、ＴＡＧ-７２、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＭＷＭＡＡ、ＣＤ４０、Ｍ１３コートタンパク質及びＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａから成る群から選択される細胞表面抗原に対する結合親和力を有し、そして少なくとも１つのＦａｂ断片が、ヒスタミンスクシニルグリシン（ＨＳＧ）及びインジウム-ＤＴＰＡから成る群から選択されるハプテン、又はＣＤ２２、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＶＥＦＧＲ１ ／Ｆｌｔ-１、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ、ＶＥＧＲＦ３／Ｆｌｔ-４、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ８９、ＣＤ２及びアデノウィルスファイバーノブから成る群から選択される細胞表面抗原のいずれかに対する結合親和力を有する、請求項１１に記載の構造体。
  15. 前記ＩｇＧ抗体が、Ｍ１３コートタンパク質及びＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａから成る群から選択される細胞表面抗原、又はアルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペロキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ｔｐＡ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン及びウロキナーゼから成る群から選択される生体分子のいずれかに対する結合親和力を有し、そして少なくとも１つのＦａｂ断片が、Ｍ１３コートタンパク質及びＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａから成る群から選択される細胞表面抗原、又はアルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペロキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ｔｐＡ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン及びウロキナーゼから成る群から選択される生体分子のいずれかに対する結合親和力を有する、請求項１に記載の構造体。
  16. 前記ＩｇＧ抗体及び前記Ｆａｂ断片が、同一の抗原に結合し、前記抗原が、ＣＤ１４、ＣＤ１１１／ネクチン-１、葉酸レセプターα、ｇｐ１２０、ＩＬ-６、ＩＬ-５、ＩＬ-８、ＣＤ１５４、ＩｇＥ、ＬＦＡ-１、β-トリプターゼ、ＣＤ１０５／エンドグリン（ｅｎｄｏｇｌｉｎ）、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＴＮＦα、ＲＳＶ Ｆ-タンパク質、ＣＥＡのＡ１Ｂ１及びＣＥＡのＮドメインから成る群から選択される、請求項１に記載の構造体。
  17. 前記ＩｇＧ抗体及び前記Ｆａｂ断片が、ＣＤ２０／ＣＤ２２; ＣＤ２０／ＣＤ７４; ＣＤ２０／ＨＬＡ-ＤＲ; ＣＤ２２／ＣＤ７４; ＣＤ２２／ＨＬＡ-ＤＲ; ＣＤ７４／ＨＬＡ-ＤＲ; ＣＤ７４／ＣＥＡ又はＨＬＡ-ＤＲ／ＣＥＡの抗原の組合せに結合する、請求項４に記載の構造体。
  18. 疾病を伴う又は病的状態にある対象を治療する製剤の製造における請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の６量体の安定係留構造体の使用において、前記構造体が前記疾病又は病的状態に治療的効果を有する、使用。
  19. 前記疾病又は病的状態が癌または自己免疫疾患である、請求項１８に記載の使用。
  20. 前記疾病又は病的状態が癌であり、前記ＩｇＧ抗体及び／又はＦａｂ断片が、炭酸脱水酵素ＩＸ、α-フェトプロテイン、Ａ３、Ａ３３抗体の特異的抗原、Ｂａ ７３３、ＢｒＥ３抗原、ＣＡ１２５、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ１３８、大腸特異的抗原-ｐ（ｃｏｌｏｎ-ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ-ｐ）（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ-１、ＥＧＰ-２、Ｅｐ-ＣＡＭ、Ｆｌｔ-１、Ｆｌｔ-３、葉酸レセプター、Ｇ２５０抗原、ＨＬＡ-ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）及びそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、低酸素誘導因子（ＨＩＦ-１）、Ｉａ、ＩＬ-２、ＩＬ-６、ＩＬ-８、インシュリン成長因子-１（ＩＧＦ-１）、ＫＣ４抗原、ＫＳ-１抗原、ＫＳ１-４、Ｌｅ-Ｙ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＡＭ-４抗体の特異的抗原、胎盤成長因子、ｐ５３、前立腺酸性フォスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＳ５、Ｓ１ＯＯ、ＴＡＣ、ＴＡＧ-７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬレセプター、Ｔｎ抗原、トムソン-フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦ、ＥＤ-Ｂフィブロネクチン、１７-１Ａ抗原、脈管形成マーカー、癌遺伝子マーカー又は癌遺伝子産物から成る群から選択される腫瘍関連抗原に対する結合親和力を有する、請求項１９に記載の使用。
  21. 化学療法剤、サイトカイン、又は抗血管新生剤と組合わせた請求項２０に記載の使用。
  22. 前記Ｆａｂ断片の少なくとも１つが、ハプテンに対する結合親和力を有する、請求項２０に記載の使用。
  23. 前記対象へ投与するための前記ハプテンの使用を更に含む、請求項２２に記載の使用。
  24. 前記ハプテンが、抗血管新生剤、化学療法剤、サイトカイン、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、オリゴヌクレオチド、放射線同位体、免疫刺激剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、ホルモン、結合分子、脂質、ポリマ、ミセル、リポソーム、ナノ粒子、またはこれらの組み合わせからなる群から選択された薬剤に結合する、請求項２３に記載の使用。
  25. 前記疾病又は病的状態が、真菌、ウイルス、バクテリア、又はパラサイトによって生じる、請求項１８に記載の使用。
  26. 前記疾病又は病的状態が、自己免疫疾患である、請求項１８に記載の使用。
  27. 前記構造体が、ＩｇＧ抗体と、抗ＣＤ７４抗体×抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ７４抗体×抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２２抗体×抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２０抗体×抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＣＤ１９抗体×抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２０抗体×抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ２抗体×抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ８抗体×抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ２抗体×抗ＣＤ１４７抗体、抗ＣＥＡＣＡＭ５４抗体×抗ＣＤ３抗体、抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体×抗ＣＤ３抗体、抗ＥＧＦＲ抗体×抗ＣＤ３抗体、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体×抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体×抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ７４抗体×抗ＣＤ３抗体、及び抗ＣＤ２２抗体×抗ＣＤ３抗体からなる群から選択されたＦａｂ断片の組み合わせを含む、請求項１８に記載の使用。
  28. 前記疾病又は病的状態が、神経変性症、アルツハイマー病、代謝疾患、心疾患、アテローム性動脈硬化、又は、臓器移植拒否反応である、請求項１８に記載の使用。
  29. 前記癌が、上皮癌、間葉性癌、血液癌、神経癌、上皮性悪性腫瘍、黒色腫、非上皮性悪性腫瘍、神経芽細胞腫、白血病、リンパ腫、神経膠腫及び骨髄腫からなる群から選択される、請求項２０に記載の使用。
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