JP4455322B2 - 二重特異性抗体ならびにキャリアペプチドと活性薬剤を含むハプテン構築物を用いる薬物プレターゲッティング - Google Patents

二重特異性抗体ならびにキャリアペプチドと活性薬剤を含むハプテン構築物を用いる薬物プレターゲッティング Download PDF

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Description

発明の背景
本願は１９９９年８月２３日出願の米国出願番号０９／３８２，１８６の一部継続出願、および２００１年４月３日出願の米国出願番号０９／８２３，７４６の一部継続出願であり、これは双方とも、１９９９年６月２２日出願の一部継続出願であり、これらの内容は引用することにより本明細書の一部とする。
発明の分野
本発明は、例えば放射免疫療法（ＲＡＩＴ）などの治療用と、および例えば放射免疫診断（ＲＡＩＤ）および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）などの診断用途のための免疫学的試薬に関する。詳しくは本発明は、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）および二重特異性抗体フラグメント（ｂｓＦａｂ）に関する。さらに本発明は、特定の免疫原に対して惹起されたモノクローナル抗体、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有するヒト化およびキメラモノクローナル二重特異性抗体および抗体フラグメント、このような抗体および抗体フラグメントをコードするＤＮＡ、ならびにこれらのＤＮＡを発現するベクターに関する。もっと初期の米国特許仮出願番号６０／０９０，１４２号および同６０／１０４，１５６号には、現在本発明に含まれているものの一部が開示されており、それらの内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
関連技術
癌の治療および診断のアプローチには、抗体または抗体フラグメントを罹患組織に向けることが含まれ、この抗体または抗体フラグメントは罹患部位に診断剤または治療剤をターゲッティングすることができる。検討されてきたこの方法の１つのアプローチとして、標的罹患組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、標的低分子量ハプテンに特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有するｂｓＡｂの使用が含まれる。この方法では、ｂｓＡｂを投与して標的に局在化させ、正常な組織からクリアリングする。しばらくしてから、ｂｓＡｂの第二の特異性によって認識され、元の標的にも局在する、放射性標識された低分子量のハプテンが得られる。
ｂｓＡｂと組み合わせて使用した低分子量ハプテンは、多数の特定の画像化および治療用途があるにもかかわらず、可能な各適用のための各ｂｓＡｂの調製は実用的ではない。さらに、このｂｓＡｂ／低分子量ハプテンの系を適用するには、他のいくつかの問題を克服しなければならない。第一に、低分子量のハプテンに結合するｂｓＡｂのアームは、ｂｓＡｂと結合した場合、低分子量のハプテンが生体系から迅速にクリアリングされるように設計されているので、高い親和性で結合されなければならない。第二に、非ｂｓＡｂ結合低分子ハプテンは、非標的組織の取り込みおよび保持を回避するために、生体系を実際にクリアリングする必要がある。第三に、検出剤および／または治療剤は、使用されたｂｓＡｂプロトコール内でのその使用にわたり低分子ハプテンと会合したままでなければならない。
このアプローチで目的とされるのは、適切な二重特異性のＡｂを用いてキレート剤および金属−キレート複合体を癌へ向けるｂｓＡｂである。用いるキレート剤および金属−キレート複合体は多くの場合放射性であり、放射免疫映像法にはコバルト−５７(Goodwin et al.,米国特許第号４，８６３，７１３号)、インジウム−１１１(Barbet et al.,米国特許第５，２５６，３９５号および米国特許第５，２７４，０７６号， Goodwin et al, J. Nucl. Med., 33:1366-1372 (1992)、およびKranenborg et al., Cancer Res (suppl.), 55:5864s-5867s (1995)およびCancer (suppl. ) 80:2390-2397 (1997))およびガリウム−６８(Boden et al., Bioconjugate Chem., 6:373-379, (1995)およびSchuhmacher et al., Cancer Res., 55:115-123 (1995))が用いられる。このＡｂはキレート剤および金属−キレート複合体に対して惹起されたものなので、それらが本来惹起された複合体に顕著に特異性を有する。実際、Boden et al.のｂｓＡｂは、キレート剤および金属−キレート複合体の鏡像異性体混合物のうちの１つの鏡像異性体に特異性を有する。この顕著な特異性は、放射免疫療法（ＲＡＩＴ）に有用なイットリウム−９０およびビスマス−２１３ならびにＭＲＩに有用なガドリニウムなどの他の核種が別の用途で利用可能な試薬と容易に交換できないという１つの点で不利であることが分かっている。結果として非金属であるヨウ素−１３１が、第二のターゲッティング工程でＩ−１３１標識インジウム−金属−キレート複合体の使用によるＲＡＩＴ用に採用されている。この方法のもう１つの不利な点として、診断または治療用に設計される薬剤ごとに抗体を惹起する必要があることである。
プレターゲッティング法は癌のイメージングおよび治療に関してかなりの注目を浴びてきた。エフェクター分子（例えば、小キャリアに結合された放射性核種または薬物）が直接ターゲティング剤に結合される直接ターゲッティング系とは違い、プレターゲッティング系では、エフェクター分子はターゲッティング剤の後しばらくしてから与えられる。これにより、ターゲッティング剤を腫瘍病巣に局在させ、より重要なことには身体からクリアリングする時間ができる。ほとんどのターゲッティング剤は抗体タンパク質であったことから、それらは小さなエフェクター分子（通常、分の単位）よりもはるかにゆっくり身体からクリアリングされる傾向がある（通常、日の単位）。治療用放射性核種を含む直接ターゲッティング系では、ターゲッティング剤が腫瘍においてそのピークレベルにゆっくり達し、身体からクリアリングされる間中、身体および特に極めて傷つきやすい赤色骨髄が放射線に曝される。プレターゲッティング系では、放射性核種は常に、身体から極めて迅速にクリアリングされるキレートまたはペプチドなどの小「エフェクター」分子に結合されているので、正常な組織の暴露は最小となる。小分子は腫瘍の脈管構造を効率的に横断して一次ターゲッティング剤に結合するので、放射性核種の最大腫瘍取り込みもまた極めて迅速である。その大きさが小さいこともまた、腫瘍中でのより均一な分布を促す。
プレターゲッティングではいくつかの異なる戦略が用いられてきたが、アビジン／ストレプトアビジン−ビオチン認識系または腫瘍抗原とエフェクター分子を同時に認識する二重特異性抗体を伴う場合が最も多い。アビジン／ストレプトアビジン−ビオチン系は極めて用途が広く、いくつかの構成で用いられている。抗体をストレプトアビジンまたはビオチンに結合させ、これを一次ターゲッティング剤として用いる。その後にそれぞれビオチンまたはアビジン／ストレプトアビジンと結合させたエフェクター分子がくることもある。別の構成では、まず、ビオチン結合抗体を、その後、ストレプトアビジン／アビジンとの架橋をターゲッティング、次に、ビオチン結合エフェクターを与える三工程のアプローチに頼るものである。これらの系は、エフェクターおよびターゲッティング剤が用いる構成に応じてビオチンまたはストレプトアビジン／アビジンと結合可能である限り、種々のエフェクター物質とともに用いるために容易に変換することができる。多くのターゲッティング状況で用いるためのその用途の広さとアビジン／ストレプトアビジンとビオチンの間の高い結合親和性により、この種のプレターゲッティングは提案されている他の系に優る著しい利点を持つ。しかし、アビジンおよびストレプトアビジンは外来タンパク質であり、従って、免疫原性があり、臨床適用において投与できる回数は制限される。この点で、ｂｓＡｂには比較的免疫原性のないヒト化タンパク質として操作することができるという利点がある。ｂｓＡｂの結合親和性（典型的には １０−９〜１０−１０Ｍ）はストレプトアビジン／アビジン−ビオチンの極めて高い親和性（〜１０−１５Ｍ）とは比べものにならず、両プレターゲッティング系とも一次ターゲッティング剤の結合親和性に依存し、従って、ストレプトアビジン／アビジン−ビオチン系のより高い親和性はｂｓＡｂプレターゲッティング系に優る実質的な利点を提供し得ない。しかし、ほとんどのｂｓＡｂは一次標的と結合するために利用できるアームを１つしか持っておらず、一方、ストレプトアビジン／アビジン−ビオチンプレターゲッティング系は典型的には標的と結合するためのアームを二つ持つ全ＩｇＧを用いており、これが標的結合を強化する。二価ペプチドを用いることにより、親和性の増強がなされ、これにより、一価のペプチドに比べて標的部位に対するペプチドの結合が著しく向上する。このように、両系とも、妥当な保持力を持つ優れたターゲッティング比をもたらす可能性がある。
ｂｓＡｂを用いたプレターゲッティングはまた、エフェクター分子を認識する抗体の１つのアームを必要とする。これまでに報告されているほとんどの放射性核種ターゲッティング系は、インジウム付加ＤＴＰＡに対する抗体または他のキレートに対する抗体などのキレート−金属複合体に対する抗体に頼ってきた。この抗体は一般にこの特定のキレート−金属複合体に対して高い選択性があることから、特定のエフェクター分子を用いて新たなｂｓＡｂを構築する必要がある。もし抗体がエフェクターに特異的でなく、その代わりに別の物質と反応性があったとすればこの必要はなくなる可能性がある。このような場合には、それらがまた抗体認識物質を含んでいる限り、種々のエフェクターが作製される得る。本発明者らは、種々のエフェクター物質が調製できる認識系としてヒスタミン誘導体であるヒスタミン−スクシニル−グリシル（ＨＳＧ）に対する抗体を用いたJanevik-Ivanovska et al.が最初に記載しているプレターゲッティング系の開発を続けてきた。放射性ヨウ素化し、かつレニウムを付加した二価のＨＳＧ含有ペプチドを用いて優れたプレターゲッティング結果が報告されている。この研究では、発明者らは、この系を、放射性標識９０Ｙ、１１１Ｉｎ、および１７７Ｌｕに好適なペプチド、ならびに別の９９ｍＴｃ結合ペプチドを含むように拡張した。
このように、罹患組織に向けることができ、かつ、次に投与されるターゲッティング可能な診断または治療コンジュゲートに特異的に結合し得る免疫剤、および二重特異性または多重特異性抗体の変更なく種々の診断剤および治療剤に適合する柔軟な系の必要が依然としてある。
発明の概要
本発明の１つの目的は、多様な診断および治療用途に用いるために改良し得る、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する多重特異性抗体および抗体フラグメントを提供することである。
本発明の他の目的は、多重特異性抗体とターゲッティング可能な構築物の組み合わせを用いた診断および治療のプレターゲッティング法、多重特異性を作出する方法、およびこのような方法において用いるためのキットを提供することである。
上記の目的を達成する上で、本発明者らは１を超える診断剤または治療剤を有し得るターゲッティング可能な構築物に対して多重特異性Ａｂを惹起することが有利であることを見出した。この技術を用いることにより、キレート剤、金属キレート複合体、治療剤または診断剤の特徴を、新規な用途ごとに新たな多重特異性Ａｂを惹起することなく種々の用途に適合するよう変えることができる。さらに、このアプローチを用いることにより、二以上の異なるキレート剤、金属キレート複合体、診断剤または治療剤を本発明による多重特異性Ａｂとともに用いることができる。
本発明は、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する多重特異性もしくは二重特異性抗体または抗体フラグメントに関する。
式：Ｘ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｙ）−ＮＨ２（配列番号１）の化合物（この化合物はＸまたはＹに位置した硬酸陽イオンキレート剤と、残りのＸまたはＹに位置した軟酸陽イオンキレート剤を含む）が提供される。硬酸陽イオンキレート剤はカルボン酸基またはアミン基を含んでもよく、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡおよびＴＥＴＡのようなキレート剤を含み得る。軟酸陽イオンキレート剤はチオール基を含んでもよく、Ｔｓｃｇ−ＣｙｓおよびＴｓｃａ−Ｃｙｓのようなキレート剤も含み得る。この化合物の好ましい実施態様は、ＩＭＰ ２４５としても知られるＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２（配列番号１）である。他の実施態様は、（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−ＮＨ２（配列番号１）で示されるように、切り替え位置に硬酸陽イオンキレート剤と軟酸陽イオンキレート剤を有し得る。
この化合物はまた、異なるキレート部分に結合された陽イオンを含み得る。例えば、硬酸陽イオンキレート剤は第IIa族および第IIIa族金属陽イオンを含んでもよく、これらは硬酸キレート剤に結合していることが多い。軟酸キレート剤に結合させ得る軟酸陽イオンは遷移金属、ランタニド類、アクチニド類および／またはＢｉを含む得る。このような軟酸陽イオンの限定されない例としては、Ｔｃ、Ｒｅ、およびＢｉが挙げられる。
また、Ｘ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｙ）−ＮＨ−Ｒ（配列番号１）を含むターゲッティング可能な構築物も提供される。ここでも、硬酸陽イオンキレート剤はＸまたはＹのいずれかに位置し、軟酸陽イオンキレート剤は残りのＸまたはＹに位置する。このターゲッティング可能な構築物はまた、化合物を治療もしくは診断剤または酵素「Ｒ」に化合物を結合させるためのリンカーも含む。このリンカーはＲ基を化合物に結合させるための少なくとも１つのアミノ酸を有することができる。治療剤の例としては、薬物、プロドラッグ（例えば、エピルビシングルクロニド、ＣＰＴ−１１、エトポシドグルクロニド、ダウノマイシングルクロニドおよびドキソルビシングルクロニド）または毒素（例えば、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素）が挙げられる。
他の治療剤の例としては、ドキソルビシン、ＳＮ−３８、エトポシド、メトトレキサート、６−メルカプトプリンおよび／またはリン酸エトポシドが挙げられる。診断剤としては、核種、力学的療法のための１以上の薬剤（例えば、ベンゾポルフィリン一酸環Ａ（ＢＰＤ−ＭＡ）、錫エチオプルプリン（ＳｎＥＴ２）、スルホン化アルミニウムフタロシアニド（ＡＩＳＰｃ）およびルテチウムテキサフィリン（Ｌｕｔｅｘ）などの光増感剤）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）およびコンピューター断層撮影法（ＣＴ）用の造影剤および画像増強剤が挙げられる。酵素は、標的部位においてプロドラッグを薬物に変換し得るか、または解毒型の薬物中間体を有毒型に再変換し、標的部位において該薬物の毒性を高め得るＲ基として提供してもよい。
本発明の一つの実施態様によれば、患者において罹患組織を治療、診断および／または同定する方法が提供され、この方法は、
（Ａ）該患者に、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体または抗体フラグメントを投与すること；
（Ｂ）所望により、該患者にクリアリング組成物を投与し、該組成物により、局在していない抗体または抗体フラグメントを循環からクリアリングすること；
（Ｃ）該患者に、二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも１つの他のアームによって認識可能な少なくとも１つのエピトープを含むか、これを担持するキャリア部分と、１以上の結合した治療剤もしくは診断剤または酵素とを含んでなる第一のターゲッティング可能な構築物を投与すること；および
（Ｄ）ターゲッティング可能な構築物が酵素を含んでなる場合において、
１）該酵素が標的部位においてプロドラッグを薬物に変換することができる場合には、プロドラッグ；
２）該酵素が解毒型中間体を有毒型に再変換し、その結果、標的部位において該薬物の毒性を高め得る場合には、該患者中で解毒されて毒性の低い中間体を形成することができる薬物、
３）該酵素が解毒型中間体を有毒型に再変換し、その結果、標的部位において該薬物の毒性を高め得る場合には、天然の過程によって該患者中で活性化され、毒性の低い中間体に変換されることによって解毒を受けるプロドラッグ、あるいは、
４）該酵素が標的部位において該プロドラッグを薬物に変換することができる場合には、該二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも１つの他のアームによって認識され得る少なくとも１つのエピトープを含むか、またはこれを担持するキャリア部分と、プロドラッグとを含む、第二のターゲッティング可能な構築物
を該患者にさらに投与することを含んでなる。
本発明の他の実施態様によれば、患者において罹患組織を処置または同定するのに有用なキットが提供され、そのキットは、
（Ａ）標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体または抗体フラグメント；
（Ｂ）二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも１つの他のアームによって認識され得る少なくとも１つのエピトープを含むか、またはこれを担持するキャリア部分と、１以上の結合した治療剤もしくは診断剤または酵素とを含んでなる第一のターゲッティング可能な構築物；
（Ｃ）所望により、局在していない抗体および抗体フラグメントのクリアリングに有用なクリアリング組成物；および
（Ｄ）所望により、第一のターゲッティング可能な構築物が酵素を含む場合において、
１）該酵素が標的部位においてプロドラッグを薬物に変換することができる場合には、プロドラッグ；
２）該酵素が解毒型中間体を有毒型に再変換し、その結果、標的部位において該薬物の毒性を高め得る場合には、該患者中で解毒されて毒性の低い中間体を形成することができる薬物、
３）該酵素が解毒型中間体を有毒型に再変換し、その結果、標的部位において該薬物の毒性を高め得る場合には、天然の過程によって該患者中で活性化され、毒性の低い中間体に変換されることによって解毒を受けるプロドラッグ、あるいは、
４）該酵素が標的部位において該プロドラッグを薬物に変換することができる場合には、該二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも１つの他のアームによって認識され得る少なくとも１つのエピトープを含むか、またはこれを担持するキャリア部分と、プロドラッグとを含む、第二のターゲッティング可能な構築物
を含んでなる。
本発明の他の実施態様によれば、このような抗体または抗体フラグメントをコードするＤＮＡ構築物が提供される。特に、ターゲッティング可能な構築物に対する反応性および罹患組織に対する反応性の有利な性質を提供する可変領域を産生するＤＮＡ構築物を提供する。本発明のこの態様によれば、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体または抗体フラグメントを宿主中で産生し得る発現カセットを含んでなる組換えＤＮＡ構築物が提供され、この構築物は、５’から３’の転写方向で、宿主細胞中で機能的な転写開始調節領域、宿主細胞中で機能的な翻訳開始調節領域、二重特異性抗体または抗体フラグメントをコードするＤＮＡ配列、ならびに宿主細胞中で機能的な転写および翻訳終結調節領域を含んでなり、二重特異性抗体または抗体フラグメントは調節領域の調節下にある。
本発明の他の実施態様によれば、組換え技術による抗体または抗体フラグメントの調製法が提供される。本発明のこの態様によれば、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体または抗体フラグメントの調製方法が提供され、その方法は、
（Ａ）宿主細胞に上記の組換えＤＮＡ構築物を導入する工程；ならびに
（Ｂ）細胞を増殖させ、抗体または抗体フラグメントを単離する工程
を含んでなる。
本発明の別の実施態様によれば、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性融合タンパク質の調製方法が提供され、その方法は、
（１）（Ａ）二重特異性融合タンパク質のフラグメントを宿主中で産生し得る発現カセットを含んでなる組換えＤＮＡ構築物であって、５’から３’の転写方向で、宿主細胞中で機能的な転写開始調節領域、宿主細胞中で機能的な翻訳開始調節領域、軽鎖抗体フラグメントに連結したｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列、ならびに宿主細胞中で機能的な転写および翻訳終結調節領域を含み、二重特異性融合タンパク質のフラグメントが調節領域の調節下にある組換えＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入すること；
（Ｂ）（Ａ）における軽鎖抗体フラグメントに相補的で、軽鎖抗体フラグメントに会合する場合、結合部位が標的組織に特異的なＦａｂフラグメントを形成するＦｄフラグメントを宿主細胞中で産生し得る発現カセットを含んでなる組換えＤＮＡ構築物であって、５’から３’の転写方向で、宿主細胞中で機能的な転写開始調節領域、宿主細胞中で機能的な翻訳開始調節領域、ＦｄフラグメントをコードするＤＮＡ配列、ならびに宿主細胞中で機能的な転写および翻訳終結調節領域を含んでなり、Ｆｄフラグメントが調節領域の調節下にある組換えＤＮＡ構築物を宿主細胞に同時導入すること；
（Ｃ）細胞を増殖させ、二重特異性融合タンパク質を単離すること；あるいは
（２）（Ａ）二重特異性融合タンパク質のフラグメントを第一の宿主中で産生し得る発現カセットを含んでなる組換えＤＮＡ構築物であって、５’から３’の転写方向で、第一の宿主細胞中で機能的な転写開始調節領域、第一の宿主細胞中で機能的な翻訳開始調節領域、軽鎖抗体フラグメントに連結したｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列、ならびに第一の宿主細胞中で機能的な転写および翻訳終結調節領域を含んでなり、二重特異性融合タンパク質のフラグメントが調節領域の調節下にある組換えＤＮＡ構築物を第一の宿主細胞に導入すること；
（Ｂ）（２）（Ａ）における軽鎖抗体フラグメントに相補的で、軽鎖抗体フラグメントに会合する場合、結合部位が標的組織に特異的なＦａｂフラグメントを形成するＦｄフラグメントを第二の宿主細胞中に産生し得る発現カセットを含んでなる組換えＤＮＡ構築物であって、５’から３’の転写方向で、第二の宿主細胞中で機能的な転写開始調節領域、第二の宿主細胞中で機能的な翻訳開始調節領域、ＦｄフラグメントをコードするＤＮＡ配列、ならびに第二の宿主細胞中で機能的な転写および翻訳終結調節領域を含んでなり、Ｆｄフラグメントが調節領域の調節下にある組換えＤＮＡ構築物を第二の宿主細胞に導入すること；
（Ｃ）第一の宿主細胞および第二の宿主細胞を増殖させること；
（Ｄ）所望により、二重特異性融合タンパク質フラグメントおよびＦｄフラグメントを単離すること；
（Ｅ）それらのフラグメントを組み合わせて二重特異性融合タンパク質を産生し、その二重特異性融合タンパク質を単離すること
を含んでなる。
種々の宿主細胞を使用して二重特異性抗体または抗体フラグメントを調製することができ、宿主細胞には、限定されるものではないが、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、および細菌細胞が含まれる。一つの実施態様では、本方法において、哺乳類の接合体を利用し、組換えＤＮＡ構築物の導入により、二重特異性抗体または抗体フラグメントを産生し得るトランスジェニック動物を産生する。
本発明によれば、とりわけ、多様な診断および治療用途に用いるために改良し得る、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体および抗体フラグメントが提供される。
本発明のさらなる実施態様は、光線力学的治療における本発明による抗体または抗体フラグメントの使用に関する。
本発明のさらなる実施態様は、ポジトロン放射断層撮影(positron-emission tomography; ＰＥＴ）用の放射免疫イメージングにおける本発明による抗体または抗体フラグメントの使用に関する。
本発明のさらなる実施態様は、単一光子放出用の放射免疫イメージングにおける本発明による抗体または抗体フラグメントの使用に関する。
本発明のさらなる実施態様は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）における本発明による抗体または抗体フラグメントの使用に関する。
本発明のさらなる実施態様は、Ｘ線、コンピューター断層撮影(conputed tomography; ＣＴ）または超音波イメージングにおける本発明による抗体または抗体フラグメントの使用に関する。
本発明のさらなる実施態様は、手術中、内視鏡的または静脈内における診断および／または療法のための本発明による抗体または抗体フラグメントの使用に関する。
本発明のさらなる実施態様は、ホウ素中性子捕獲療法（boron neutron capture therapy; ＢＮＣＴ）における本発明による抗体または抗体フラグメントの使用に関する。
本発明のさらなる実施態様は、罹患組織（例えば、癌、感染症、炎症、血餅、アテローム性動脈硬化症、梗塞）、正常組織（例えば、脾臓、副甲状腺、胸腺、骨髄）、異所組織（例えば、子宮内膜症）、および病原体の診断または処置のための本発明による抗体または抗体フラグメントの使用に関する。
さらに、本発明によれば、二重特異性抗体と以下のターゲッティング可能な構築物：
Figure 0004455322
 の組み合わせを用いた診断および治療のプレターゲッティング法、ならびに二重特異性抗体の作出方法、ならびにこのような方法で用いるためのキットが提供される。
本発明者らは、１を超える診断剤または治療剤を有し得るターゲッティング可能な構築物に対してｂｓＡｂを惹起することが有利であることを見出した。この技術を用いることにより、キレート剤、金属キレート複合体、治療剤または診断剤の特徴を、新規な用途ごとに新たなｂｓＡｂを惹起することなく、種々の用途に適合するように変えることができる。さらに、このアプローチを用いることにより、二以上の異なるキレート剤、金属キレート複合体または治療剤を本発明によるｂｓＡｂとともに用いることができる。
本発明は、被験体において罹患組織を処置または同定する方法に関し、この方法は、
（Ａ）該被験体に、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、少なくとも二種のＨＳＧハプテンを含むターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体または抗体フラグメントを投与すること；
（Ｂ）所望により、該被験体にクリアリング組成物を投与し、該組成物により、局在していない抗体または抗体フラグメントを循環からクリアリングすること；
（Ｃ）該被験体に、少なくとも二種のＨＳＧハプテンと少なくとも１つのキレート剤とを含んでなるキャリア部分を含んでなり、また、少なくとも１種の診断用および／または治療用陽イオン、および／または１以上のキレート化された、または化学的に結合された治療剤もしくは診断剤または酵素を含んでもよいターゲッティング可能な構築物を投与すること；および
（Ｄ）ターゲッティング可能な構築物が酵素を含んでなる場合において、
１）該酵素が標的部位においてプロドラッグを薬物に変換することができる場合には、プロドラッグ；
２）該酵素が解毒型中間体を有毒型に再変換し、その結果、標的部位において該薬物の毒性を高め得る場合には、該被験体中で解毒されて毒性の低い中間体を形成することができる薬物；あるいは、
３）該酵素が解毒型中間体を有毒型に再変換し、その結果、標的部位において該薬物の毒性を高め得る場合には、天然の過程によって該被験体中で活性化され、毒性の低い中間体に変換されることによって解毒を受けるプロドラッグ
を該被験体にさらに投与することを含んでなる。
本発明はさらに、哺乳類において標的細胞、組織または病原体を検出または処置する方法に関し、その方法は、
標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを含んでなる二重特異性抗体または抗体フラグメントの有効量を投与すること（該少なくとも１つのアームは標的細胞、組織または病原体上、あるいはそれにらにより産生されるか、またはそれらと関連する分子上の相補的結合部分に結合することができる）；ならびに、
Figure 0004455322
 からなる群から選択されるターゲッティング可能な構築物を投与すること
を含んでなる。
本発明はさらに、被験体において罹患組織を処置または同定する方法に関し、この方法は、
該被験体に、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体または抗体フラグメントを投与すること；
所望により、該被験体にクリアリング組成物を投与し、該組成物により、局在していない抗体または抗体フラグメントを循環からクリアリングすること；ならびに、
該被験体に、
Figure 0004455322
Figure 0004455322
からなる群から選択されるターゲッティング可能な構築物を投与すること
を含んでなる。
本発明はさらに、被験体において罹患組織を処置または同定するのに有用なキットに関し、そのキットは、
（Ａ）標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体または抗体フラグメント（前記構築物は、
Figure 0004455322
 からなる群から選択される）；
（Ｂ）二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも１つの他のアームによって認識され得る少なくとも１つのエピトープを含むか、またはこれを担持するキャリア部分と、１以上の結合した治療剤もしくは診断剤または酵素を含んでなるターゲッティング可能な構築物；
（Ｃ）所望により、局在していない抗体および抗体フラグメントのクリアリングに有用なクリアリング組成物；ならびに
（Ｄ）所望により、該第一のターゲッティング可能な構築物が酵素を含む場合において、
１）該酵素が標的部位においてプロドラッグを薬物に変換することができる場合には、プロドラッグ；
２）該酵素が解毒型中間体を有毒型に再変換し、その結果、標的部位において該薬物の毒性を高め得る場合には、該被験体中で解毒されて毒性の低い中間体を形成することができる薬物、あるいは、
３）該酵素が解毒型中間体を有毒型に再変換し、その結果、標的部位において該薬物の毒性を高め得る場合には、天然の過程によって該被験体中で活性化され、毒性の低い中間体に変換されることによって解毒を受けるプロドラッグ
を含んでなる。
本発明はさらに、
Figure 0004455322
 からなる群から選択されるターゲッティング可能な構築物に関する。
本発明はさらに、ターゲッティング可能な構築物をスクリーニングする方法に関し、その方法は、
該ターゲッティング可能な構築物を、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体または抗体フラグメントと接触させて混合物を得ること（該少なくとも１つのアームは、標的細胞、組織もしくは病原体上、またはそれらによって産生される、もしくはそれらに関連する分子上の相補的結合部分に結合し得る）；ならびに
所望により、該混合物をインキュベートすること；ならびに
該混合物を分析すること
を含んでなる。
本発明はさらに、哺乳類において正常な組織をイメージングする方法に関し、その方法は、
標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体または抗体フラグメントの有効量を投与すること（該少なくとも１つのアームは、標的細胞、組織上、またはそれらによって産生される、もしくはそれらに関連する分子上の相補的結合部分に結合し得る）；ならびに
Figure 0004455322
 からなる群から選択されるターゲッティング可能な構築物を投与すること
を含んでなる。
本発明はさらに、被験体において罹患組織を手術中に同定または処置する方法に関し、その方法は、
標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体または抗体フラグメントの有効量を投与すること（該少なくとも１つのアームは、標的細胞、組織もしくは病原体上、またはそれらによって産生される、もしくはそれらに関連する分子上の相補的結合部分に結合し得る）；ならびに
Figure 0004455322
 からなる群から選択されるターゲッティング可能な構築物を投与すること
を含んでなる。
本発明はさらに、被験体において罹患組織を内視鏡により同定または処置する方法に関し、その方法は、
標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体または抗体フラグメントの有効量を投与すること（該少なくとも１つのアームは標的細胞、組織もしくは病原体上、またはそれらによって産生される、もしくはそれらに関連する分子上の相補的結合部分に結合し得る）；ならびに
Figure 0004455322
 からなる群から選択されるターゲッティング可能な構築物を投与すること
を含んでなる。
本発明はさらに、被験体における罹患組織を静脈内において同定または処置する方法に関し、その方法は、
標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体または抗体フラグメントの有効量を投与すること（該少なくとも１つのアームは標的細胞、組織もしくは病原体上、またはそれらによって産生される、もしくはそれらに関連する分子上の相補的結合部分に結合し得る）；ならびに
Figure 0004455322
 からなる群から選択されるターゲッティング可能な構築物を投与すること
を含んでなる。
本発明のさらなる態様、特徴、および利点を以下に記載し、その一部が本明細書から自明であるか、本発明の実施によって確認されるであろう。本発明の実施態様および利点は、付属の特許請求の範囲に特に示される手段および組み合わせによって実施および獲得することができる。
好ましい実施態様の詳細な説明
特に断りのない限り、可算名詞("a"または"an")は１つ以上のものを意味する。
Ｉ．概説
本発明は、標的組織に対して反応性のある少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な複合体に対して反応性のある少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）または抗体フラグメント（ｂｓＦａｂ）を提供する。望ましくは、ターゲッティング可能な複合体は、少なくとも２単位の認識可能なハプテンを有するペプチドを含む。認識可能なハプテンの例としては、限定されるものではないが、ヒスタミンスクシニルグリシン（ＨＳＧ）およびフルオレセインイソチオシアネートが挙げられる。ターゲッティング可能な構築物は罹患組織の処置または同定に有用な種々の薬剤と結合させることができる。結合される薬剤の例としては、限定されるものではないが、キレート剤、金属キレート複合体、薬物、毒素（例えば、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、シュードモナス内毒素）およびその他のエフェクター分子が挙げられる。さらに、プロドラッグの活性化または薬物の標的特異的毒性の増強に有用な酵素を、ターゲッティング可能な構築物に結合させることができる。従って、ターゲッティング可能な構築物に対して反応性のあるｂｓＡｂの使用により、適用ごとに新しいｂｓＡｂを惹起することなく種々の治療および診断適用を行うことができる。二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）プレターゲッティングは診断および治療適用の潜在的に免疫原性のない、選択性の高い代替法である。本明細書に記載のｂｓＡｂプレターゲッティング系は、種々の異なるイメージングまたは治療剤とともに用いるために開発できる可能性があるという点で、他のプレターゲッティング系に優る、さらなる著しい利点がある。この系の柔軟性は、ヒスタミン−スクシニル−グリシン（ＨＳＧ）に対する抗体の使用とＨＳＧ残基を含むペプチドの開発に基づくものである。ＨＳＧ含有ペプチドは１１１Ｉｎ、９０Ｙ、または１７７Ｌｕのキレート化のためのＤＯＴＡ、あるいはテクネチウム／レニウムキレートを用いて合成したものである。プレターゲッティングでは、これらの抗原を発現する腫瘍に腫瘍ターゲッティング能を与えるために、これらのペプチドは、抗癌胎児抗原（ＣＥＡ）または抗結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）抗体のいずれかのＦａｂ’で化学的に安定化させた抗ＨＳＧ Ｆａｂ’を用い、二重特異性抗体との組み合わせにおいて使用された。しかしながら、他の抗原標的としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ｌａ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＰＡＭ−４、ＢｒＥ３、ＴＡＧ−７２（Ｂ７２．３，ＣＣ４９）、ＥＧＰ−１（例えばＲＳ７）、ＥＧＰ−２（例えば１７−１Ａおよびその他のＥｐ−ＣＡＭ標的）、Ｌｅ（ｙ）（例えばＢ３）、Ａ３、ＫＳ−１、Ｓ１００、ＩＬ−２、Ｔ１０１、壊死抗原、葉酸受容体、脈管形成因子（例えばＶＥＧＦ）、テネイシン、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、腫瘍関連サイトカイン、ＭＡＧＥ、および／またはそのフラグメントなどに対する当技術分野で公知の多様な腫瘍関連抗原が挙げられる。組織特異的抗体（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ７４などのような骨髄細胞に対するもの、パラチドグロブリン抗体など）、ならびに血餅のフィブリン、アテローム性動脈硬化症プラークのマクロファージ抗原（例えばＣＤ７４抗体）などの非悪性罹患組織に対する抗体、また、特定の病原体の抗体（例えば、細菌、ウイルスおよび寄生虫に対するもの）が当技術分野で周知である。
これらのペプチドは、精製を必要としない容易な方法により、高い特異的活性を持つように放射性標識することができる。腫瘍担持ヌードマウスにおけるin vivo研究では、腫瘍または正常組織において保持が最小で、身体から迅速にクリアリングされる放射性標識ペプチドが示されている。１〜２日後にプレターゲッティング量のｂｓＡｂを投与した場合、腫瘍の放射性標識ペプチドの取り込みは２８から１７５倍に高まり、腫瘍／非腫瘍比は、ペプチド注射のちょうど３時間で２：１から８：１に高まったが、このことはこの同じ時間で９９ｍＴｃ抗ＣＥＡ Ｆａｂ’で見られるものよりも著しい向上を示した。抗ＣＳＡｐｘ抗ＨＳＧ Ｆ（ａｂ’）２ ｂｓＡｂは腫瘍において最高かつ最長の保持を示し。１１１Ｉｎ標識ペプチドと組み合わせて用いた場合、９０Ｙおよび１７７Ｌｕなどの治療用放射性核種に関する線量評価値は、腫瘍にちょうど１２，０００ｃＧｙが送達でき、腎臓は１５００ｃＧｙを受け取り、他の総ての組織は５００ｃＧｙを受け取ったことが示唆された。このように、このプレターゲッティング系は柔軟性が高く、診断イメージングおよび治療上着目される幅広い化合物アレイを用いることができ、また、優れた腫瘍の取り込み比およびターゲッティング比を達成することでこれらの適用に極めて有望となる。
さらに、哺乳類において標的細胞、組織または病原体を検出および／または処置する方法が含まれ、その方法は標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体または抗体フラグメントの有効量を投与することを含んでなる。本明細書において「病原体」とは、限定されるものではないが、真菌（例えば、小胞子菌(Microsporum)、白癬菌(Trichophyton)、表皮菌(Epidermophyton)、スポロトリクス・シェンキー(Sporothrix schenckii)、シルプトコッカス・ネオフォルマンス(Cyrptococcus neoformans)、コクシジオイデス・イミチス(Coccisioides immitis)、ヒストプラズム・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、ブラストミセス・デルマティティディス(Blastomyces dermatitidis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)）、ウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、シミアンウイルス４０、呼吸器多核体（ＲＳ）ウイルス、マウス乳癌ウイルス、水疱−帯状疱疹ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、マウス白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣贅ウイルスおよびブルータングウイルス）、寄生虫、細菌（例えば、炭疽菌(Anthrax bacillus)、ストレプトコッカス・アガラクチエ(Streptococcus agalactiae)、レジュネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophilia)、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、大腸菌(Escherichia coli)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningiti
dis)、肺炎双球菌(Pneumococcus)、Ｂ型インフルエンザ菌(Hemophilis influenzae B）、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、ライム病スピロヘータ、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、らい菌(Mycobacterium leprae)、ウシ流産菌(Brucella abortus)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)および破傷風毒素）、マイコプラズマ（例えば、マイコプラズマ・アルスリティディス(Mycoplasma arthritidis)、Ｍ．ヒオリニス(M. hyorhinis)、Ｍ．オーラル(M. orale)、Ｍ．アルギニニ(M. arginini)、アコレプラスマ・ライドラウィー(Acholeplasma laidlawii)、Ｍ．サリバルム(M. salivarum)、および肺炎マイコプラズマ(M. pneumoniae)、ならびに原生動物（例えば、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、トキソプラズマ(Toxoplasma gondii)、ランゲリ・トリパノソーマ(Trypanosoma rangeli)、クルーズ・トリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)、ローデシア・トリパノソーマ(Trypanosoma rhodesiensei)、ブルセイ・トリパノソーマ(Trypanosoma brucei)、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)、日本住血吸虫(Schistosoma japanicum）、ウシバベシア(Babesia bovis)、エルメリア・テネラ(Elmeria tenella)、回旋糸状虫(Onchocerca volvulus)、熱帯リーシュマニア(Leishmania tropica)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、回旋糸状虫(Onchocerca volvulus)、タイレリア・パルバ(Theileria parva)、胞状条虫(Taenia hydatigena)、テニア・オビス(Taenia ovis)、カギナシサナダ(Taenia saginata)、単胞条虫(Echinococcus granulosus)およびメソセストイデス・コルチ(Mesocestoides corti)が挙げられる。米国特許第５，３３２，５６７号明細書を参照されたい。
また、本明細書では、抗体および抗体フラグメントも提供される。抗体フラグメントは、抗体の抗原結合部分であり、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどである。抗体フラグメントは、無傷の抗体によって認識される抗原と同一の抗原と結合する。例えば、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体フラグメントは、ＣＤ２２のエピトープと結合する。
「抗体フラグメント」には、特定の抗原との結合によって複合体を形成する抗体のように作用する任意の合成または遺伝子操作されたタンパク質も含まれる。例えば、抗体フラグメントには、重鎖および軽鎖の可変領域からなる単離フラグメントの「Ｆｖ」フラグメント、軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカー（「ｓＦｖタンパク質」）によって連結されている組換え一本鎖ポリペプチド分子、および「超可変領域」を模倣するアミノ酸残基からなる最小の認識単位が含まれる。これらのいわゆる「超可変」領域または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のうち３つが軽鎖または重鎖の各可変領域に見られる。各ＣＤＲは比較的保存されているフレームワーク領域（ＦＲ）によってフランキングされている。ＦＲは可変領域の構造的完全性を維持しているものと思われる。軽鎖のＣＤＲおよび対応する重鎖のＣＤＲが抗原結語部位を形成する。ＣＤＲの「超可変性」により、抗体の特異性の多様性が説明される。
本明細書において「被験体」とは、動物（すわなち、脊椎動物および無脊椎動物）をいい、限定されるものではないが、ヒトおよびその他の霊長類、齧歯類（例えば、マウス、ラットおよびモルモット）、ウサギ類（例えば、ウサギ）、ウシ類（例えば、蓄牛）、ヒツジ類（例えば、ヒツジ）、ヤギ類（例えば、ヤギ）、ブタ類（例えば、ブタ）、ウマ類（例えば、ウマ）、イヌ類（例えば、イヌ）、ネコ類（例えば、ネコ）、家禽類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、その他のキジ類など）、ならびに限定されるものではないが、有蹄類（例えば、シカ）、クマ、魚類、ウサギ類、齧歯類、鳥類などの動物をはじめとする野生化した、または野生の動物が挙げられる。この用語は特定の齢または性に限定されるものではない。よって、雄であれ雌であれ、成体および新生被験体、ならびに胎児もこの用語に包含される。
II．抗体に対してターゲッティング可能な構築物
ターゲッティング可能な構築物は多様な構造であり得るが、免疫応答の惹起をなくすためだけでなく、ｂｓＡｂターゲッティング方法の範囲内で使用する場合はin vivoで迅速にクリアリングされるように選択される。強い免疫応答の惹起には疎水性の薬剤が最良であるのに対し、迅速なin vivoクリアリングのためには親水性の薬剤が好ましく、従って、疎水性と親水性の間のバランスを確立する必要がある。これは、多くの有機部分の固有の疎水性を相殺する親水性キレート剤の使用に一部依存することにより達成される。また、溶液の反対の性質を有するターゲッティング可能な構築物のサブユニット（例えば、ペプチド）を選択することができ、あるものは疎水性であり、またあるものは親水性であるアミノ酸を含む。ペプチド以外に、炭水化物を使用することができる。
ターゲッティング可能な構築物は２つといったわずかなアミノ酸残基（好ましくはアミノ酸残基２〜１０個）を有するペプチドバックボーンを含むことができ、キレート剤などの他の部分と結合させることができる。ターゲッティング可能な構築物は、好ましくはキレート剤に結合されていてもよい任意の金属イオンを含めて５０，０００ダルトン未満、有利には約２０，０００ダルトン未満、１０，０００ダルトン、または５，０００ダルトンの分子量を有する低分子量の構築物であるべきである。例えば、公知のペプチドＤＴＰＡ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＯＨ（ここで、ＤＴＰＡはジエチレントリアミン五酢酸である）を使用して分子のインジウム−ＤＴＰＡ部分に対する抗体を作製している。しかし、非インジウム含有分子の使用および適切なスクリーニング工程により、チロシル−リジンジペプチドに対する新規のＡｂを作製することができる。より通常には、ターゲッティング可能な構築物の抗原ペプチドは、４以上の残基（ペプチドＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（配列番号２）など）を有する（ここで、ＤＯＴＡは１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン四酢酸であり、ＨＳＧは式：
Figure 0004455322
 のヒスタミンスクシニルグリシル基である）。非金属含有ペプチドを免疫原として使用し、得られたＡｂをＰｈｅ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（配列番号２）バックボーンに対する反応性についてスクリーニングしてもよい。
ターゲッティング可能な構築物のハプテンも、例えば化学ハプテンなど、免疫認識部分を提供する。化学ハプテン、好ましくはＨＳＧハプテンを用いると、抗体に対する構築物の高い特異性が示される。これは、ＨＳＧハプテンに対して惹起された抗体は公知であり、適当なｂｓＡｂに容易に組み込むことができることから生じる。このペプチドバックボーンに対するハプテンの結合はｂｓＡｂまたはｂｓＦａｂに対して特異的なターゲッティング可能な構築物が生じる。
本発明はまた、最終のｂｓＡｂ／構築物系とともに用いた場合に、ターゲッティング可能な構築物を認識するｂｓＡｂのアームが完全に特異的であることを保証するために、ペプチドバックボーンへ非天然アミノ酸、例えばＤ−アミノ酸を組み込むことも意図する。本発明はさらに、非天然アミノ酸およびペプトイドから構築されたものなどの他のバックボーン構造も意図する。
免疫原として使用されるペプチドは、固相支持体および標準的な連続的脱保護およびカップリング技術を用いた自動ペプチド合成装置によって便宜に合成される。ペプチド中の遊離のアミノ基（これは、後にキレート複合体として使用される）を、アセチル基などの標準的な保護基でブロックするのが有利である。このような保護基は当業者に公知である。Greene and Wuts Protective Groups in Organic Synthesis, 1999 (John Wiley and Sons, N. Y.)参照。ペプチドをその後ｂｓＡｂ系で用いるために調製する場合、in vivoにおけるカルボキシペプチダーゼ活性を阻害するために樹脂から切断して対応するＣ末端アミドを作出するのが有利である。
III．キレート部分
ターゲッティング可能な構築物における親水性のキレート部分の存在は、迅速なin vivoクリアランスを保証する助けとなる。キレート剤は親水性の他、それらの金属結合特性に関して選択され、少なくとも、そのｂｓＡｂエピトープがペプチドの一部であるか、または非キレート化学ハプテンであるターゲッティング可能な構築物に関しては金属−キレート複合体の認識がもはや問題ではないので、所望に応じて変更してもよい。
特に有用な金属−キレートの組み合わせとしては、放射イメージングおよびＲＡＩＴ用の４７Ｓｃ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、１６１Ｔｂ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、および２２５Ａｃとともに用いる２−ベンジル−ＤＴＰＡ、ならびにそのものメチルおよびシクロヘキシル類似体が挙げられる。本発明のｂｓＡｂで単独で用いる場合、同じキレート剤をＭＲＩで用いるＭｎ、ＦｅおよびＧｄなどの非放射活性金属と複合体を形成させる。ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸）、ＤＯＴＡ、およびＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセタミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）などの大環キレート剤は種々の金属および放射性金属とともに、より詳しくはそれぞれＧａ、ＹおよびＣｕの放射性核種とともに用いられる。
ＤＴＰＡおよびＤＯＴＡ型のキレート剤は、リガンドがカルボン酸基またはアミン基などの硬塩基キレート官能基を含む場合、硬酸陽イオン、特にIIa族およびIIIa族金属陽イオンをキレート化するのに最も有効である。このような金属−キレート複合体は対象とする金属に環のサイズを適合させることで極めて安定にすることができる。ＲＡＩＴのための２２３Ｒａなど、安定に結合する核種としては大環ポリエーテルなどの他の環状キレート剤が対象となる。ポルフィリンキレート剤は多くの放射性金属とともに用いることができ、ｂｓＡｂに向けられた免疫光療法のための特定の非放射性金属複合体としても有用である。また、１を超える種類のキレート剤をターゲッティング可能な構築物に結合させて複数の金属イオン、例えば非放射性イオン、診断用放射性核種および／または治療用放射性核種と結合させてもよい。
ターゲッティング可能な構築物のキレート剤と結合させることができる特に有用な診断用放射性核種としては、限定されるものではないが、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、またはその他のγ、βまたはポジトロン放出剤が挙げられる。好ましくは、診断用放射性核種としては、２５〜１０，０００ｋｅＶの範囲、より好ましくは２５〜４，０００ｋｅＶの範囲、いっそうより好ましくは２０〜１，０００ｋｅＶの範囲、なおいっそうより好ましくは７０〜７００ｋｅＶの範囲の減衰エネルギーを含む。有用なポジトロン放出放射性核種の減衰エネルギーは好ましくは＜２，０００ｋｅＶ、より好ましくは１，０００ｋｅＶ未満であり、最も好ましくは＜７００ｋｅＶである。γ線検出を利用する診断剤として有用な放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｃｒ−５１、Ｃｏ−５７、Ｃｏ−５８、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｓｅ−７５、Ｒｕ−９７、ｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｉｎ−１１４ｍ、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｙｂ−１６９、Ｈｇ−１９７およびＴＩ−２０１が挙げられる。有用なγ線放出放射性核種の減衰エネルギーは好ましくは２０〜２０００ｋｅＶ、より好ましくは６０〜６００ｋｅＶ、および最も好ましくは１００〜３００ｋｅＶである。
好ましくは、ターゲッティング可能な構築物のキレート剤に結合させることができる有用な治療用放射性核種としては、限定されるものではないが、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕおよび２１１Ｐｂが挙げられる。治療用放射性核種は好ましくは２５〜１０，０００ｋｅＶの範囲の減衰エネルギーを有する。有用なβ粒子放出核種の減衰エネルギーは好ましくは２５〜５，０００ｋｅＶ、より好ましくは１００〜４，０００ｋｅＶ、最も好ましくは５００〜２，５００ｋｅＶである。また、オージェ放出粒子により実質的に減衰する放射性核種も好ましい。例えば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、Ｉ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍおよびＩｒ−１９２がある。有用なβ粒子放出核種の減衰エネルギーは好ましくは＜１，０００ｋｅＶ、より好ましくは＜１００ｋｅＶ、最も好ましくは＜７０ｋｅＶである。また、α粒子の生成によって実質的に減衰する放射性核種も好ましい。このような放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３およびＦｍ−２５５が挙げられる。有用なα粒子放出放射性核種の減衰エネルギーは好ましくは２，０００〜９，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００〜８，０００ｋｅＶ、最も好ましくは４，０００〜７，０００ｋｅＶである。
米国特許第５，７５３，２０６号明細書に開示のキレート剤（特に、チオセミカルバゾニルグリオキシルシステイン（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）およびチオセミカルバジニルアセチルシステイン（Ｔｓｃａ−Ｃｙｓ）キレート剤）を有利に使用して、Ｔｃ、Ｒｅ、Ｂｉ、ならびに軟塩基リガンド（特に、硫黄またはリン含有リガンド）に強く結合する他の遷移金属、ランタニドおよびアクチニドの軟酸陽イオンを結合させる。これは、ペプチドへの１種より多い型のキレート剤、例えば、Ｉｎ（ＩＩＩ）陽イオンにはＤＴＰＡなどの硬酸キレート剤、およびＴｃ陽イオンには軟酸キレート剤（例えば、Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓなどのチオール含有キレート剤）の結合に有用であり得る。ジＤＴＰＡハプテンに対する抗体が公知（Barbet‘395, 前掲）であり、標的抗体と容易に結合してｂｓＡｂを形成するので、プレターゲッティングプロトコールにおける放射性同位元素標的用の、非放射性ジＤＴＰＡキレート剤および放射性同位元素結合用の他のキレート剤を有するペプチドハプテンを使用することができる。このようなペプチドの一例は、Ａｃ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２（配列番号７）である。このペプチドに予めＩｎ（ＩＩＩ）を付加した後、９９−ｍ−Ｔｃ陽イオンで標識することができ、Ｉｎ（ＩＩＩ）イオンはＤＴＰＡによって優先的にキレート化され、Ｔｃ陽イオンはチオール含有Ｔｓｃｇ−ＣｙｓＣに優先的に結合する。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡなどの他の硬酸キレート剤を、ＤＴＰＡ基と置換することができ、それらに特異的なＭａｂを、類似の技術を用いて産生することができ、これを使用して抗ジＤＴＰＡ Ｍａｂを作製することができる。
２つの異なる硬酸または軟酸キレート剤を、異なるサイズの陽イオン、キレート環の幾何学、および陽イオンの好ましい複合体イオン構造によって、２つの異なる硬酸または軟酸陽イオンに優先的に結合するように、リンカーに（例えば、異なるキレート環のサイズで）組込むことができると考えられる。これにより、２つの異なる金属（その１つまたは両方が放射性であるか、ＭＲＩ増強に有用であるものでよい）を、プレターゲッティングされたｂｓＡｂによる最終的な捕捉のためのリンカーに組み込ませる。
好ましいキレート剤としては、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡおよびＴｓｃｇ、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。これらのキレート剤は以下の構築物：
Figure 0004455322
 に例示されるように、キレート剤−ペプチド複合体に組み込まれている。
上記のキレート剤−ペプチド複合体（ｆ）および（ｇ）は６８Ｇａと結合することが示されており、従って、ポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）適用に有用である。
キレート剤は標準的な化学を用いてターゲッティング可能な構築物のペプチドに結合されるが、そのいくつかが以下の実施例で詳しく開示される。要するに、ペプチドＡｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２（配列番号４）の合成は、まず、ペプチド合成装置でリンクアミド樹脂にＡｌｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを結合させることにより達成される。本明細書で用いるこれらの保護基の略号「Ａｌｏｃ」および「Ｆｍｏｃ」は、アリロキシカルボニルおよびフルオレニルメチルオキシカルボニル基をさす。次に、標準的なＦｍｏｃ自動合成プロトコールを用いてリジンの側鎖にＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨおよびＴｓｃＧを付加して以下のペプチド：Ａｌｏｃ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ））−リンク樹脂を生成した。次に、このＡｌｏｃ基を除去した。その後、このペプチド合成を合成装置上で続け、以下のペプチド：Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ））−リンク樹脂（配列番号４）を作製した。Ｎ末端アシル化の後、側鎖のＡｌｏｃ保護基を除去する。得られたペプチドを次に、Kaiser試験を用い、樹脂のアミンに関して陰性の判定が得られるまで活性化Ｎ−トリチル−ＨＳＧ−ＯＨで処理した。Karacay et al Bioconjugate Chem. 11:842-854 (2000)を参照されたい。Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２（配列番号４）の合成、ならびにＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（配列番号３）、ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（配列番号２）、ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｅｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２（配列番号１）の合成は以下に詳しく記載されている。
IV．金属キレート調製の一般法
キレート剤−ペプチド複合体は、固体として長期保存することができる。これらを、金属結合反応のための単位用量に定量し、固体、液体、または半液体溶液、凍結溶液または凍結乾燥調製物のいずれかとして単位用量で保存できる。これらは周知の手順によって標識することができる。
典型的には、硬酸陽イオンを、便宜な塩の溶液として導入し、硬酸キレート剤または可能ならば軟酸キレート剤によって取り上げる。しかし、その後の軟酸陽イオンの添加によって、軟酸キレート剤によるその結合が誘導されて、キレート化することができる任意の硬酸陽イオンが置き換わる。例えば、過剰な非放射性１１１ＩｎＣｌ３の存在下でさえ、in situで塩化スズおよびＮａ９９ｍ−ＴｃＯ４を用いて作製された９９ｍ−Ｔｃ（Ｖ）グルコヘプトネートまたはＴｃ陽イオンでの標識は、軟酸キレート剤に対して定量的に促進する。
他の軟酸陽イオン（１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１３Ｂｉなど）およびＭｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｐｂ、Ｃｕ、Ｃｄ、Ａｕ、Ｆｅ、Ａｇ（一価）、Ｚｎ、およびＨｇの二価または三価の陽イオン（特に、６４Ｃｕおよび６７Ｃｕ）（これらのいくつかは放射免疫診断または放射免疫治療に有用である）を、類似の方法によってリンカーペプチドに付加することができる。Ｒｅ陽イオンを、過レニウム酸塩およびスズイオンからin situで作製するか、予め還元したグルコヘプトン酸レニウムまたは他のトランスキレート剤を使用することができる。過レニウム酸塩の還元にはＴｃの還元に必要なものよりも多量のスズイオン（典型的には、２００μｇ／ｍＬを超える最終濃度）を必要とするので、高レベルのスズイオンがジスルフィド環化ペプチドに存在するもののような感受性ジスルフィド結合を還元させないように、十分注意が必要である。レニウムで放射性標識する際にもＴｃ−９９ｍで用いたものと同様の手順が用いられる。Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ−リガンドのＲｅＯ金属複合体の調製のための１つの方法は、ペプチドのＲｅＯＣｌ３（Ｐ（Ｐｈ３）２との反応であるが、ＲｅＯ（エチレンジアミン）２などの他の還元種の使用も可能である。
Ｖ．投与法
以下に示される考察の多くは罹患組織を処置する場合の本発明の二重特異性抗およびターゲッティング可能な構築物の使用に関して着目するものであることに注意すべきである。しかしがら、、本発明は、米国特許第６，１２６，９１６号明細書、同第６，０７７，４９９号明細書、同第６，０１０，６８０号明細書、同第５，７７６，０９５号明細書、同第５，７７６，０９４号明細書、同第５，７７６，０９３号明細書、同第５，７７２，９８１号明細書、同第５，７５３，２０６号明細書、同第５，７４６，９９６号明細書、同第５，６９７，９０２号明細書、同第５，３２８，６７９号明細書、同第５，１２８，１１９号明細書、同第５，１０１，８２７号明細書、および同第４，７３５，２１０号明細書（これらは引用することにより本明細書の一部とされる）に記載の方法を用いて、正常な組織および臓器の処置および／またはイメージングに本発明の二重特異性抗体およびターゲッティング可能な構築物を用いることも意図する。本明細書において「組織」とは、限定されるものではないが、卵巣、胸腺、副甲状腺、骨髄または脾臓由来の組織をはじめとする組織をさす。正常組織をターゲッティングする場合に重要な使用としては、子宮内膜症など、異所性である（すなわち、正規の位置からはずれている）組織を同定および処置することである。
上記で論じたｂｓＡＢおよびターゲッティング可能な構築物の投与は、リンカー部分と結合した治療剤の投与前のいずれかの時間にｂｓＡｂを投与することにより行えばよい。試薬の用量およびタイミングは、当業者ならば容易に判断することができ、これは、使用する試薬の特定の性質によって異なる。ｂｓＡｂ−Ｆ（ａｂ’）２誘導体を最初に投与する場合、ターゲッティング可能な構築物の投与前に１〜６日間待機するのが適切である。ＩｇＧ−Ｆａｂ’ｂｓＡｂ複合体が一次標的ベクターである場合、このリンカー部分の投与前の待機時間はより長く、３〜１５日間の範囲で指示すればよい。あるいは、ｂｓＡｂおよびターゲッティング可能な構築物はカクテル型または一方の後に他方を投与することのいずれかで実質的に同時に投与することもできる。
多様な診断剤および治療剤が本ターゲッティング可能な構築物に有利に結合させることができる、一般に、診断剤および治療剤としては、同位元素、薬物、毒素、サイトカイン、サイトカイン複合体、ホルモン、増殖因子、複合体、放射性核種、造影剤、金属、細胞傷害剤および免疫調節剤が挙げられる。例えば、ガドリニウム金属は磁気共鳴イメージングに用いられ、フルオロクロムは光線力学的療法と組み合わせることができる。さらに、造影剤はＭＲＩ造影剤（ガドリニウムイオン、ランタンイオン、マグネシウムイオン、鉄、クロム、銅、コバルト、ニッケル、ジスプロシウム、レニウム、ユーロピウム、テルビウム、ホルミウム、ネオジウム、またはその他の匹敵する標識など）、ＣＴ造影剤、および超音波造影剤であり得る。さらなる診断剤としては、蛍光標識化合物（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリセリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレサミンなど）、化学発光化合物（ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルなど）、および生物発光化合物（ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンなど）が挙げられる。また、放射性核種も診断および／または治療剤として使用することができ、例えば、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、および２１１Ａｔが挙げられる。
治療剤としてはまた、例えば、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィロトキシン、タキサン、代謝拮抗物質、アルキル化剤、抗体、Ｃｏｘ−２阻害剤、有糸分裂阻害剤、抗血管形成剤、およびアポトーシス剤、特にドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、ＣＰＴ−１１、カンプトテカンなどの化学療法薬、ならびにこれらおよび他種の抗癌剤に由来するもの含まれる。免疫複合体および抗体融合タンパク質の調製に有用な他の治療剤としては、無いとロゲンマスタード、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位複合体、ホルモンなどが挙げられる。好適な治療剤は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995)、およびGOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985)、ならびにこれらの刊行物の改訂版に記載されている。試験中の薬物など、その他の好適な治療剤は当業者に公知である。治療剤はまた、限定されるものではないが、他の薬物、プロドラッグおよび／または毒素も含み得る。「薬物」、「プロドラッグ」および「毒素」の用語は本明細書を通じて定義される。「診断剤」または「診断」とは、限定されるものではないが、検出剤、検出、または局在化を含む。
ターゲッティング可能な構築物が診断剤を含む場合、ｂｓＡｂは好ましくは、診断剤とともにターゲッティング可能な構築物を投与する前に投与する。このｂｓＡｂが罹患組織をターゲッティングするのに十分な時間が経った後、診断剤を、ターゲッティング可能な構築物の手段により、イメージング（画像化）が達成できるように投与する。光を放射して回収した種々の構造を直接的または間接的に見ることによって体腔中の腫瘍を検出することができる。非電離放射線を放射してこれらの構造から捕獲する事ができる限り、任意の身体部位での病変を視覚化することができる。例えば、高分解能で非侵襲性の画像化技術であるポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）を、ヒト疾患の視覚化用の本発明の抗体と使用することができる。ＰＥＴでは、陽電子消滅崩壊の検出の間に５１１ｋｅＶのγ光子を産生した。Ｘ線、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、ＭＲＩおよびγイメージング（例えば、Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT))もまた、これらの理学療法とともに機能する診断剤の使用を通じて用いることができる。
最初に考察したように、ターゲッティング可能な構築物は２５〜１０，０００ｋｅＶのγ、β、αおよびオージェ粒子および／またはポジトロンを放出する放射性診断剤を含み得る。このような薬剤の例としては、限定されるものではないが、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄおよび１７５Ｌｕが挙げられる。
本ｂｓＡｂまたはｂｓＦａｂは、米国特許第６，０９６，２８９号明細書、同第４，３３１，６４７号明細書、同第４，８１８，７０９号明細書、同第４，３４８，３７６号明細書、同第４，３６１，５４４号明細書、同第４，４４４，７４４号明細書、同第５，８５１，５２７号明細書に記載のように、光線力学的療法（ＰＤＴ）の方法において使用することができる。ＰＤＴでは、光増感剤（photosensitizer）、例えばジヘマトポルフィリンエーテルなどのヘマトポルフィリン誘導体、を被験体に投与する。例えば６３０ｎｍの光を用いて抗腫瘍活性を誘導する。皮膚が太陽光線による光増感未満である場合、別の光増感剤（より長い波長で有用な物質を含む）を使用することができる。このような光増感剤の例としては、限定されるものではないが、ベンゾポルフィリン一酸環Ａ（ＢＰＤ−ＭＡ）、スズエチオプルプリン（ＳｎＥＴ２）、スルホン化アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳＰｃ）、およびルテチウムテキサフィリン（Ｌｕｔｅｘ）が挙げられる。
さらに、ＰＤＴでは、診断薬を、例えば全身注射し、レーザー誘起蛍光法を使用して光活性剤が結合した癌部位を内視鏡（ワイヤレスのカプセルサイズの内視鏡またはカメラを含む）によって検出することができる。例えば、これは初期肺腫瘍の蛍光気管支鏡検査に適用されている（Doiron et al, Chest 76:32(1979)。別の例では、これらの抗体および抗体フラグメントを、単光子放出に使用することができる。例えば、本発明の抗体または抗体フラグメントの被験体への投与後に、Ｔｃ−９９ｍ標識診断薬を投与することができる。次いで、被験体をγ線カメラでスキャンして単光子放出コンピュータ断層撮影画像を得て病変または腫瘍部位を決定する。
治療上有用な免疫複合体は光活性剤または色素を抗体コンポジットに結合させることにより得られる。蛍光およびその他の色素源または色素（可視光に感受性のあるポルフィリンなど）は、病変部に適当な光を照射することにより病変部を検出および処置するのに使用されてきた。療法では、これは光照射、光療法または光線力学的療法と呼ばれている(Jori et al (eds.), Photodynamic Therapy of Tumors and Other Diseases (Libreria Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain 22:430(1986))。さらに、光療法を達成するため、モノクローナル抗体が光活性化色素に結合されてきた。Mew et al., J. Immunol. 130:1473 (1983);同上, Cancer Res. 45:4380 (1985); Oseroff et al., Proc.. Natl. Acad, Sci. USA 83:8744 (1986); 同上, Photoehem. Photobiol. 46:83 (1987); Hasan et al., Prog. Clin. Biol. Res. 283:471(1989); Tatsuta et al, Lasers Surg. Med. 9:422 (1989); Pelegrin et al., Cancer 67:2529 (1991)。しかしながら、これらの初期の研究では内視鏡による治療適用（特に、抗体フラグメントまたはサブフラグメントを併用する）の使用は含まれていなかった。従って、本発明は、光活性剤または色素を含んでなる免疫複合体の治療的使用を意図する。
Ｘ線およびコンピューター断層撮影を増強するためには放射線不透性材料および造影材料が用いられるが、これらにはヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、タリウム化合物などが含まれる。特定の化合物としては、バリウム、ジアトリゾエート、エチオド化オイル、クエン酸ガリウム、イオカルム酸、イオセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパン酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメ酸、イオタスル、イオテトル酸、イオサラム酸、イオトロキシ酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポデート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリオドン、および塩化タリウム（thallous chloride）が含まれる。また、デキストランおよびリポソーム、特にガス充填リポソームをはじめとする超音波造影材料も使用できる。一実施態様では、サイトカインなどの免疫調節剤を、リンカー、または当業者に公知の他の方法によってターゲッティング可能な構築物に結合させてもよい。本明細書において「免疫調節剤」とは、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン（腫瘍壊死（ＴＮＦ）など）、および造血因子（インターロイキン（例えば、インターロイキン（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８）など）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ）、「Ｓ１因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子、エリスロポエチン、およびトロンボポエチンが挙げられる。好適な免疫調節剤部分の例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−αなどが挙げられる。
ターゲッティング可能な構築物はまた、標的部位で薬物／プロドラッグを活性化することができるか、身体の解毒経路の調節によって通常の治療効果を改良することができる酵素に結合させることもできる。ｂｓＡｂの投与後、低分子量ハプテンを有するターゲッティング可能な構築物に結合させた酵素を投与する。酵素を、ｂｓＡｂ；ターゲッティング可能な構築物の結合によって標的部位にプレターゲッティングした後、標的部位で作用することが知られている細胞傷害性薬を注射する。この薬物は哺乳類の通常の解毒処理によって解毒されて毒性の低い中間体を形成するものであってもよい。例えば、薬物は、肝臓において潜在的に毒性の低いグルクロニドへと変換するものであってもよい。解毒中間体は次に、標的部位でプレターゲッティング酵素によってより有毒な形態に再変換することができ、これにより標的部位での毒性が増強する。
あるいは、投与したプロドラッグはプレターゲッティング酵素によって有効薬へと変換させることもできる。プレターゲッティング酵素は、解毒薬物の再循環によって処理の効率を改良する。このアプローチを、任意の酵素−薬物対での使用に適用することができる。あるいは、ターゲッティング可能な構築物を酵素とともに、患者に投与する前にターゲッティングｂｓＡｂと混合することもできる。ｂｓＡｂ：ターゲッティング可能な構築物の複合体が標的部位に局在し、結合していないターゲッティング可能な構築物が循環からクリアリングされるのに十分な時間が経過した後、プロドラッグを投与する。上述のように、次にプロドラッグをプレターゲッティング酵素によりin situで薬物に変換させる。
抗癌治療に有用な特定の細胞傷害性薬物は血清に比較的不溶である。非結合形態では非常に毒性があるものもあり、その毒性はプロドラッグへの変換によってかなり減少する。難溶性薬物のより溶解性の高い複合体（例えば、グルクロニド、親水性の酸のエステルまたは親水性アミンのアミド）への変換により、血清の水相でのその溶解性および静脈、動脈、または毛細血管の細胞壁を通り抜け、腫瘍を浸漬する間質液への到達能力が向上する。標的部位にてプロドラッグが切断され、溶解性の低い薬物が蓄積する。このようなプロドラッグから薬物への変換についての多くの例が、Hansenの米国特許第５，８５１，５２７号明細書に開示されている。
芳香族または脂環式アルコール、チオール、フェノールおよびアミンなどの特定の毒性物質の肝臓内でのグルクロニドへの変換は、毒性物質を無毒化し、容易に尿中に排泄させる身体の方法である。このような物質に変換することができる抗腫瘍薬の１つの種類が、アントラサイクリングリコシドであり、ヒトβ−Ｄ−グルクロニダーゼの基質であることが認められている、エピルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）の４−エピマーである。例えば、Arcamone Cancer Res. 45: 5995 (1985)を参照。極性基の少ない他の類似体は、より親油性が高く、このようなアプローチにより有望であると考えられる。芳香族または脂環式アルコール、チオールまたはアミン基を有する他の薬物または毒素は、このような複合体形成の候補である。これらの薬物またはその他のプロドラッグ形態は、本発明の部位特異的増強法の好適な候補である。
プロドラッグＣＰＴ−１１（イリノテカン）は、in vivoにてカルボキシルエストラーゼによって活性な代謝産物ＳＮ−３８に変換される。従って、本発明の１つの適用では、腫瘍およびハプテン（例えば、ジ−ＤＴＰＡ）を標的化するｂｓＡｂを用い、続いて、ジ−ＤＴＰＡ−カルボキシルエステラーゼ複合体の注入を行う。一度、適切な腫瘍対バックグラウンド局在化比が達成すると、ＣＰＴ−１１を施与し、腫瘍に局在しているカルボキシルエステラーゼは、腫瘍にてＣＰＴ−１１をＳＮ−３８へと変換する役目を果たす。活性なＳＮ−３８は難溶性であるために腫瘍周辺に残存し、結果的に標的化されている抗原にネガティブな隣接腫瘍細胞に対して効果を発揮する。このことが本方法のさらなる利点である。改変型カルボキシルエステラーゼについては記載されており、本発明の範囲内である。例えば、Potter et al., Cancer Res. 58 : 2646-2651 (1998)およびPotter et al., Cancer Res. 58: 3627-3632 (1998)を参照されたい。
エトポシドは、そのグルクロニド形成によって大幅に無毒化する、広く使用されている制癌剤であり、これは本発明の範囲内である。例えば、Hande et al. Cancer Res. 48: 1829-1834 (1988)を参照されたい。グルクロニド複合体を細胞傷害性薬物から調製し得、ｍＡｂ−グルクロニダーゼ複合体でプレターゲッティングした腫瘍の治療薬として注入することができる。例えば、Wang et al. Cancer Res. 52: 4484-4491 (1992)を参照されたい。従って、このような複合体を本明細書に記載のプレターゲッティングアプローチで使用することもできる。同様に、ダウノマイシンおよびドキソルビシンの誘導体に基づいて設計されたプロドラッグについては、カルボキシルエステラーゼおよびグルクロニダーゼとの使用について記載されている。例えば、Bakina et al. J. Med Chem. 40: 4013-4018 (1997)を参照されたい。本発明の範囲内で使用することができるプロドラッグ／酵素対の他の例としては、限定されるものではないが、フェノールマスタードのヒドロキシ誘導体のグルクロニドプロドラッグおよびβ−グルクロニダーゼ；フェノールマスタードまたはＣＰＴ−１１およびカルボキシペプチダーゼ；メトトレキサート置換α−アミノ酸およびカルボキシペプチダーゼＡ；薬物（６−メルカプトプリンおよびドキソルビシン）のペニシリンまたはセファロスポリン複合体とβ−ラクタマーゼ；およびエトポシドホスフェートおよびアルカリ性ホスファターゼが挙げられる。
あるいは、標的部位にてプロドラッグを活性化することができるか、または身体の無毒化経路を制御することによって通常の治療薬の効果を向上させることができる酵素をハプテンと結合してもよい。酵素−ハプテン複合体を、プレターゲッティングｂｓＡｂの投与後に被験体に投与し、標的部位に向けさせる。酵素を標的部位に局在させた後、標的部位にて作用することが知られている細胞傷害性薬物またはプレターゲッティング酵素によってin situにて薬物に変換されるそのプロドラッグ形態を注入する。上記のように、薬物は、哺乳動物の通常の無毒化プロセスによって無毒化されて毒性の低い中間体、最も一般的にはグルクロニドを形成するものでである。無毒化された中間体、例えば、グルクロニドはプレターゲッティング酵素によってそのより毒性のある形態に再変換されることにより、標的部位での細胞傷害性が増大する。これにより薬物が再循環する。同様に、投与されたプロドラッグは通常の生物学的プロセスによって活性な薬物に変換され得る。プレターゲッティング酵素は、無毒化された薬物の再循環によって治療効果を向上させる。このアプローチを任意の酵素−薬物対との使用に採用してもよい。
別の実施態様では、酵素−ハプテン複合体を患者への投与前に標的ｂｓＡｂと混合することができる。酵素−ハプテン−ｂｓＡｂ複合体が標的部位に局在化し、結合していない複合体を循環からクリアリングされるのに十分な時間が経過した後にプロドラッグを投与する。次いで、上記のように、プロドラッグはプレターゲッティング酵素によってin situにて薬物に変換される。
本発明はさらに、本発明のｂｓＡｂおよび診断薬のホウ素中性子捕獲療法（Boron Neutron Capture Therapy（ＢＮＣＴ）プロトコールにおける使用を意図する。ＢＮＣＴは、腫瘍に局在している１０Ｂ原子の中性子照射によって腫瘍細胞に電離放射線を送達させるように設計された二成分系である。ＢＮＣＴは、安定な同位元素（同位元素が富化された１０Ｂ（１９．８％の天然存在度で存在））を熱中性子照射してα粒子および７Ｌｉ原子核を生成する場合に生じる核反応に基づく。これらの粒子は、約１細胞の直径の路程を有し、それにより高い線エネルギー付与が得られる。この核反応で生成したごく少数の短距離の１．７ＭｅＶのα粒子で、細胞核を標的化し、それを破壊するのに十分である。癌でＢＮＣＴを成功させるには、腫瘍部位で高濃度の１０Ｂを局所化させる一方で、非標的器官を本質的にホウ素の無い状態にしておく必要がある。ＢＮＣＴに向けたプレターゲッティングｂｓＡｂを用いて被験体の腫瘍を治療する組成物および方法については、米国特許第６，２２８，３６２号明細書に記載されており、これは本発明の目的に向けて容易に改変することができる。
本発明の別の実施態様では、ターゲッティング可能な構築物のペプチド主鎖をプロドラッグと結合させる。プレターゲッティングｂｓＡｂを患者に投与し、標的に局在させ、循環を実質的にクリアリングする。適当な時間後、プロドラッグを含むターゲッティング可能な構築物（例えば、ポリグルタミン酸（ＳＮ−３８−エステル）１０）を施与し、それによって薬物を腫瘍標的にて特異的に局在させる。腫瘍は、腫瘍内および腫瘍周囲の細胞の高速溶解によって、細胞内供給源から放出される酵素の量を増加させることが分かっている。実施者は、これらの酵素によって活性化することができるプロドラッグを適切に選択することによってこの事実を十分に利用することができる。例えば、カルボキシルエステラーゼは、ポリグルタミン酸（ＳＮ−３８−エステル）１０のエステル結合を切断することによってプロドラッグポリグルタミン酸（ＳＮ−３８−エステル）１０を活性化し、腫瘍で遊離したＳＮ−３８の濃縮物を大量に放出する。あるいは、好適な酵素を腫瘍部位に標的化することもできる。
ターゲッティング可能な構築物からの切断後、薬物は腫瘍細胞による内在化を受ける。あるいは、標的での架橋によって無傷の複合体の一部として薬物を内在化することができる。ターゲッティング可能な構築物は、腫瘍結合ｂｓＡｂの内在化を誘導し、それによって内在化されるべき薬物のレベルが高まることで治療効果を向上させることができる。
種々のペプチド担体がプロドラッグとの結合に十分に適しており、その担体としては、ポリアミノ酸（例えば、ポリリジン、ポリグルタミン酸（Ｅ）およびアスパラギン酸（Ｄ）（そのＤ−アミノ酸類似体を含む））、コポリマー（例えば、ポリ（Ｌｙｓ−Ｇｌｕ）｛ポリ［ＫＥ］｝）が挙げられ、その比は１：１０〜１０：１が有利である。アミノ酸混合物に基づくコポリマー（例えば、ポリ（Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）（配列番号８）（ＫＡＥＹ；５：６：２：１））も使用することができる。規定の分子量のより小さな高分子担体は固相ペプチド合成技術によって作製することができ、２〜５０残基鎖長のポリペプチドが容易に作製することができる。この種の試薬の第２の利点は、正確な構造定義のほか、鎖内の一定のポイントに１つまたは所望の数の化学結合手を置く能力である。これは後に、各部分の選択されたレベルでの認識および治療ハプテンの結合に使用することができる。
ポリ（エチレン）グリコール［ＰＥＧ］は、二重特異性抗体プロドラッグアプローチに望ましいin vivoでの性質を有する。ＳＮ−３８のヒドロキシル基と標準的なジヒドロキシルＰＥＧの両端とのエステル結合を、ＳＮ−３８とＰＥＧのヒドロキシル基との間への二価酸（例えば、コハク酸）の挿入によって導入してＳＮ−３８−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）２ＣＯ−Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ−ＯＳＮ−３８などの種を合成する。合成されたジ−ＳＮ−３８−ＰＥＧはＳＮ−３８−ポリマープロドラッグのクラスの最も短いメンバーと考えることができる。ＰＥＧ誘導体の所望のin vivoでの性質およびその二量体の機能性による限られた負荷能力により、Poiani et al.により記載されものような、より大量のハプテンを保有する能力を有するＰＥＧコポリマーが作製される。例えば、Poiani et al. Bioconjugate Chem., 5: 621-630, 1994を参照されたい。ＰＥＧ誘導体を、そのビス（スクシンイミジル）カーボネート誘導体として両端で活性化させ、リジンなどの多官能ジアミンと共重合させる。リシルカルボキシル基が重合プロセスに関与しない（−Ｌｙｓ（ＣＯＯＨ）−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＣＯＯＨ）−ＰＥＧ−）ｎ反復単位を含むこのような共重合産物をＳＮ−３８残基の結合に使用することができる。ＳＮ−３８残基を遊離カルボキシル基と反応させ、（−Ｌｙｓ−（ＣＯＯＨ）−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＣＯＯＨ）−ＰＥＧ−）ｎ鎖のＳＮ−３８エステルを生成させる。
認識ハプテンおよびプロドラッグの保有に使用することができる他の合成ポリマーとしては、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＭＰＡ）コポリマー、ポリ（スチレン−コ−マレイン酸／無水物）（ＳＭＡ）、ポリ（ジビニルエーテルマレイン酸無水物）（ＤＩＶＥＭＡ）、ポリエチレンイミン、エトシキ化ポリエチレン−イミン、スターバーストデンドリマーおよびポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）が挙げられる。例として、複数の無水物単位からなるＤＩＶＥＭＡポリマーを限定量のＳＮ−３８と反応させ、ポリマー主鎖に所望の置換率の薬物を生成させる。残存した無水物基を水性条件下で切断して遊離カルボン酸基を生成させる。限定数の遊離カルボン酸基を標準的な水溶性ペプチドカップリング剤（例えば、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を用いて活性化し、遊離アミノ基を有する認識部分とカップリングさせる。後者の例はヒスタミンであり、これに対する抗体は過去に抗体を惹起している。
種々のプロドラッグをターゲッティング可能な構築物と結合させることができる。ポリマー用途の上記の例は、プロドラッグＣＰＴ−１１（イリノテカン）の活性代謝物ＳＮ−３８と関係する。ＳＮ−３８は、エステラーゼ型酵素に感受性を有するアリールエステルを作製する以上での記述で使用された芳香族ヒドロキシル基を有する。同様に、化学療法で広く使用されるカンプトセシン類似体のトポテカンは、ＳＮ−３８に関して記載されるものと類似の様式で使用してエステラーゼ感受性ポリマー−プロドラッグを生成し得る利用可能な芳香族ヒドロキシル残基を有している。
ドキソルビシンはまた、カンプトセシンファミリーに関して記載されるものと類似の酸触媒反応を用いてカルボン酸含有高分子担体とカップリングすることができる芳香族ヒドロキシル基を含む。同様に、ダウノマイシン、エピルビシンおよびイダルビシンのようなドキソルビシン類似体を、同じ様式でカップリングすることができる。高分子担体との化学的カップリングに十分に活性なアミノ「化学結合手」を有するドキソルビシンおよび他の薬物を、多数の方法においてこれらの遊離アミノ基を介して担体分子と効率的にカップリングすることができる。遊離カルボン酸基を有するポリマーをin situにて活性化し（ＥＤＣ）、活性化したポリマーをドキソルビシンと混合して、薬物をアミド結合を介してポリマーの側鎖と直接結合することができる。ビス（スクシンイミジル）エステル基との反応後に２つのアミドとして２つのアミンを架橋するために、アミノ含有薬物を、市販の切断可能な架橋剤（例えば、エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）(EGS, Pierce Chemical Co,, Rockford, IL)またはビス−［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン(BSOCOES, Molecular Biosciences, Huntsville, AL)）を混合することによってアミノペンダントポリマーとカップリングすることもできる。これはこれらの基が依然として酵素による切断に感受性を有しているために有利である。例えば、（ドキソルビシン−ＥＧＳ）ｎ−ポリリジンは、依然として、エステラーゼなどの酵素によるＥＧＳ結合鎖内のジエステル基の酵素切断に感受性を有している。ドキソルビシンはまた、確立された手順（ＨｙＢｎ＝ｐ−Ｈ２ＮＮＨＣ６Ｈ４ＣＯ２Ｈ）を用いて種々のペプチド（例えば、ＨｙＢｎＫ（ＤＴＰＡ）ＹＫ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ２）と結合することができる。Kaneko et al., J Biocoyugate Chem., 2: 133-141,1991を参照されたい。
一つの好ましい実施態様では、治療複合体はアミン残基を含む担体およびキレート剤（例えば、ＤＴＰＡ）とカップリングしたドキソルビシンを含有してＤＴＰＡ−ペプチド−ドキソルビシン複合体（ここで、ＤＴＰＡがプレターゲッティングｂｓＡｂの認識部分をなす）を形成する。好ましくは、担体はチロシル−リジン ジペプチド、例えば、Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ２を含み、さらにより好ましくは、Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ２を含む。治療においては、ビス−ＤＰＴＡ含有ペプチドとのドキソルビシンフェニルヒドラゾン複合体が特に望ましい。
メトトレキセートはまた、ドキソルビシンに関して記載されるものと類似の様式で活性化カルボン酸含有ポリマーとカップリングするのに利用可能なアミノ基を有する。これはアミノ基含有ポリマーとカップリングするために活性化され得る２つのグルタミルカルボキシル基（αおよびγ）も有する。メトトレキセートの遊離カルボン酸基をin situにて活性化し（ＥＤＣ）、活性化した薬物をアミノ含有ポリマーと混合して、薬物をアミド結合を介してポリマーの側鎖と直接結合することができる。過剰な未反応または交差反応薬物はサイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーを用いてポリマー−薬物複合体から容易に分離される。
メイタンシノイドおよびカリケアミシン（例えば、エスペラマイシン）は、切断されて化学操作に有用な単一のチオールを有する種を生成することができる混合ジおよびトリスルフィド結合を含む。チオメイタンシノイドまたはチオエスペラマイシンをまず、ペプチダーゼによる切断に感受性を有するマレイミド−ペプチドなどの架橋剤と反応させる。次いで、ペプチドのＣ末端を活性化し、ポリリジンなどのアミノ含有ポリマーとカップリングする。
さらに別の実施態様では、in vivoでの標的への治療薬またはプロドラッグポリマーの二重特異性抗体指向性送達を放射性核種の二重特異性抗体送達と組み合わせて、化学療法と放射免疫治療を組み合わせることができる。各治療薬をターゲッティング可能な構築物と結合し、同時投与してもよいし、または核種を第１のターゲッティング可能な構築物の一部として施与し、薬物を第２のターゲッティング可能な構築物の一部として後の工程で施与してもよい。１つの簡単な実施態様では、単一のプロドラッグと単一の核種を含むペプチドを構築する。例えば、トリペプチドＡｃ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ２はターゲッティング可能な構築物の担体部分として使用し得、それにより、ＳＮ−３８をアリールエステルとしてγグルタミルカルボキシル基と結合させる一方で、キレートＤＯＴＡをアミドとしてε−アミノ基と結合させて、複合体Ａｃ−Ｇｌｕ（ＳＮ−３８）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−ＮＨ２を生成することができる。次いで、ＤＯＴＡキレートを画像化および治療目的で種々の金属（Ｉｎ−１１１、Ｙ−９０、Ｓｍ−１５３、Ｌｕ−１７７およびＺｒ−８９を含む）により放射性標識することができる。金属−ＤＯＴＡ複合体はターゲッティング可能な構築物で認識可能なハプテンを提示し得るため、ＤＯＴＡ複合体の一部として使用する金属の唯一の要件は、そのうえ使用する第２の認識抗体が十分に高い親和性で特定の金属−ＤＯＴＡ複合体を認識することである。一般に、この親和性（ｌｏｇＫａ）は６〜１１である。ポリ［Ｇｌｕ（ＳＮ−３８）１０−Ｌｙｓ（Ｙ−９０−ＤＯＴＡ）２］などの高分子ペプチドは、より化学的に定義された上記の低ＭＷ試薬と同じくらい容易に施与することができ、それらがまさに好ましい。また、認識薬剤が放射免疫治療薬と無関係であるように三置換されたポリマー（例えば、ポリ［Ｇｌｕ（Ｓｎ−３８）１０−Ｌｙｓ（Ｙ−９０−ＤＯＴＡ）ｎ（ヒスタミン−スクシネート）ｍ］（ここで、ｎおよびｍは整数である））を使用することができる。プロドラッグは、腫瘍部位に存在するカルボキシエステラーゼまたは第２のターゲッティング可能な構築物を使用してその部位を標的化したカルボキシルエステラーゼにより活性化される。
あるいは、別々の工程で化学療法薬および放射免疫治療薬を投与することによって併用療法を行うことができる。例えば、ＣＥＡ−腫瘍を発現している患者にまず、ＣＥＡと特異的に結合する少なくとも１つのアームとハプテンがイットリウム−ＤＯＴＡの複合体であるターゲッティング可能な構築物と特異的に結合する少なくとも１つの別のアームを有するｂｓＡｂを投与する。その後、患者にイットリウム−ＤＯＴＡ−β−グルクロニダーゼの複合体を含むターゲッティング可能な構築物を用いて治療する。ｂｓＡｂおよび酵素の局在化およびクリアリングに十分な時間の経過後、Ａｃ−Ｇｌｕ（ＳＮ−３８）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｙ−９０−ＤＯＴＡ）−ＮＨ２を含む第２のターゲッティング可能な構築物を施与する。第２のターゲッティング可能な構築物は、第１のターゲッティング可能な構築物とまだ結合していない、腫瘍のｂｓＡｂによって、腫瘍に局在化する。標的部位に局在化した第１のターゲッティング可能な構築物は、Ａｃ−Ｇｌｕ（ＳＮ−３８）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｙ−９０−ＤＯＴＡ）−ＮＨ２にて作用して自由なＳＮ−３８薬物を遊離する。プロドラッグとそれに対する各酵素の標的部位での局在化は、酵素を確実に限定されない基質とすることによって、活性薬物の生成を促す。本実施態様は、当技術分野で現在実施されている現行のプロドラッグ方法論を顕著に改良している。
核種を先に施与するターゲッティング可能な構築物の一部として送達させた後、後の工程でプロドラッグ−ポリマーを投与する別の利点は、照射と薬物治療との相乗効果を操作し、それゆえ、その効果を最大にすることができることである。ＰＡＩＴ後の照射損傷により腫瘍がより「漏出性」になると推定される。こうして、ポリマー−プロドラッグを腫瘍により完全でかつ深く侵入させることができる。これにより化学治療が向上する。
あるいは、ＲＡＩＴ治療薬を、ターゲッティング可能な構築物ではなく、ｂｓＡｂと結合させてもよい。例えば、Ｙ−９０−ＤＯＴＡと結合した抗ＣＥＡ×抗ＤＴＰＡをまず、ＣＥＡ発現腫瘍患者に投与する。この例では、抗インジウム−ＤＴＰＡ抗体がイットリウム−ＤＯＴＡキレートと結合しないということから得られる、特定の抗キレートｍａｂの選択性を利用する。Ｙ−９０−ＤＯＴＡ−抗ＣＥＡ×抗インジウム−ＤＴＰＡを腫瘍にて最大にし、非標的組織を実質的にクリアリングした後に、インジウム−ＤＴＰＡ−グルクロニダーゼの複合体を注入してＣＥＡ腫瘍部位に特異的に局在させる。次いで、患者にポリ（Ｇｌｕ）（ＳＮ−３８）１０などのポリマー−プロドラッグを注入する。腫瘍にて後者を活性な単量体ＳＮ−３８へと選択的に切断し、化学治療薬を先に投与したＲＡＩＴと首尾よく組み合わせる。
標的部位の抗原に特異的な少なくとも１つの結合部位と抗体−酵素複合体の酵素成分に特異的な少なくとも１つの別の結合部位を有する二重特異性抗体または抗体フラグメントを本方法で使用することができることもまた特記すべきである。このような抗体は、注入前に酵素と結合することにより、酵素と抗体とが共有結合する必要性を未然に回避することができるし、または、それを注入し、標的部位に局在させることができ、非標的抗体が哺乳類の循環系から実質的にクリアリングされた後に、酵素を、十分な量の酵素が局在する抗体または抗体フラグメントに到達し、それと結合して、in situにて抗体−酵素複合体を形成することができる量および経路で注入することができる。
本発明はまた、特許出願番号第６０／２２０，７８２号明細書に記載されるような、少なくとも３つの異なる標的結合部位を有する多価標的結合タンパク質の使用も意図することもまた特記すべきである。多価標的結合タンパク質は、いくつかのＦａｂ様フラグメントを化学的リンカーを介して架橋することによって作製されている。米国特許第５，２６２，５２４号明細書；第５，０９１，５４２号明細書およびLandsdorp et al., Euro. J. Immunol. 16: 679-83 (1986)を参照されたい。また、多価標的結合タンパク質は、いくつかの単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）を共有結合して単一ポリペプチドを形成することによっても作製されている。米国特許第５，８９２，０２０号明細書を参照されたい。基本的にはｓｃＦｖ分子の会合体である多価標的結合タンパク質については、米国特許第６，０２５，１６５号明細書および第５，８３７，２４２号明細書に開示されている。３つのｓｃＦｖ分子を含む３価の標的結合タンパク質については、Krott et al., Proten Engineering 10 (4): 423-433 (1997)に記載されている。
ｂｓＡｂの投与とターゲッティング可能な構築物の投与との間に施与されるクリアリング剤を使用することができる。本発明者らは、新規の力学的作用を有するクリアリング剤（すなわち、ｂｓＡｂの疾病標的アームに対して向けられるグリコシル化抗イディオタイプＦａｂ’フラグメント）を本発明で使用することができることを発見した。抗ＣＥＡ（ＭＮ−１４Ａｂ）×抗ペプチドｂｓＡｂを施与し、疾病標的中で最大限の範囲まで付着させることができる。残るｂｓＡｂをクリアリングするために、ＷＩ２と呼ばれるＭＮ−１４に対する抗イディオタイプＡｂを、好ましくは、グリコシル化Ｆａｂ’フラグメントとして施与する。クリアリング剤が一価でｂｓＡｂと結合する一方で、その付加グリコシル残基が全ての複合体を肝臓に指向させ、そこで迅速な代謝が行われる。次いで、ターゲッティング可能な構築物と結合した治療薬または診断薬を被験体に施与する。ｂｓＡｂのＭＮ−１４アームに対するＷＩ２ Ａｂは、ＷＩ２−Ｆａｂ’が一価部分であることから、架橋に関与しないために、高い親和性を有し、クリアリング機構は他の開示された機構（Goodwin et al., 前記を参照）とは異なっている。
本発明のさらに別の態様によれば、患者の罹患組織の治療または同定に好適なキットであって、標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアームとターゲッティング可能な構築物と特異的に結合する少なくとも１つの別のアームを有する二重特異性抗体または抗体フラグメント、二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも１つの別のアームによって認識可能な少なくとも１つのエピトープを含むか有する担体部分を含む第一のターゲッティング可能な構築物、１以上の複合化した治療剤もしくは診断剤、または酵素、ならびに、所望により、非局在化抗体および抗体フラグメントをクリアリングするのに有用なクリアリング組成物を含むキットが提供される。第一のターゲッティング可能な構築物が、標的部位にてプロドラッグを薬物へと変換することができる酵素、薬物の無毒化された中間体を毒性のある形態に再変換し、その結果、標的部位にて薬物の毒性を増強し得る酵素、または自然プロセスを通じて患者中で活性化され、毒性の低い中間体への変換による無毒化を受けるプロドラッグを、無毒化された中間体から毒性ある形態へと再変換し、その結果、標的部位にて薬物の毒性を増強し得る酵素を含む場合、キットは、所望により、プロドラッグを含んでいてもよい。また、二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも１つの別のアームによって認識可能な少なくとも１つのエピトープを含むか有する担体部分、酵素が標的部位にてプロドラッグを薬物へと変換することができる場合には、プロドラッグを含む第２のターゲッティング可能な構築物も使用し得る。罹患組織の同定または治療を容易にする手段もキットに含めることができる。例として、限定されるものではないが、シリンジなどの適用装置が挙げられる。罹患組織の同定または治療用に開示された本発明の利用に必要な溶液もキットに含めることができる。
ターゲッティング可能な構築物は、静脈内、動脈内、術中、内視鏡的、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内投与、局所カテーテルによる潅流、または直接病変内局注により施与し得、持続注入または単一もしくは複数のボーラスにより、あるいは罹患組織の診断（検出）および治療に向けた当業者には公知のその他の方法によっても可能である。さらに、ターゲッティング可能な構築物は、罹患組織の検出および治療のための他の方法に向けた薬剤を含んでもよい（限定されるものではないが、これまでに記述されたような、超音波検査で使用するデキストランまたはリポソーム製剤のターゲッティング可能な構築物との複合体、またはＸ線、ＣＴ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴおよび超音波検査などの他の画像診断技術で使用する他の造影剤など）。
VI．抗体産生方法
ペプチド主鎖および／またはハプテンに対するＡｂをＡｂ産生に関する周知の方法によって作製する。例えば、正常な免疫能を有する動物に完全フロイントアジュバント中の免疫原、例えば、（ペプチド）ｎ−ＫＬＨ（ここで、ＫＬＨはキーホールリンペットヘモシアニンであり、かつｎ＝１〜３０）を注入し、続いて、不完全フロイントアジュバント中に懸濁した同じ免疫原を２回注入し、抗原のｉ．ｖ．追加免疫の３日後に脾臓細胞を回収した。次いで、回収した脾臓細胞を、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と融合し、得られたクローンの培養物上清を、直接結合ＥＬＩＳＡにより抗ペプチド反応性について解析する。産生したＡｂの詳細な特異性は、最初の免疫原のペプチド断片を用いて解析することができる。これらの断片は、自動ペプチド合成装置によって容易に作製することができる。Ａｂ産生では、酵素欠損ハイブリドーマを単離して融合細胞株を選択することができる。この技術を使用してリンカー（例えば、Ｉｎ（III）−ＤＴＰＡキレート）を含む１以上のキレートに対する抗体を惹起することもできる。Ｉｎ（III）−ジ−ＤＴＰＡに対するマウスモノクローナル抗体が公知である（Barbet'395、前記）。
本発明において使用する抗体は、マーカー物質として種々の細胞表面または細胞内腫瘍関連抗原に特異的である。これらのマーカーは、腫瘍によって生じる物質であるかもしれないし、腫瘍部位に、腫瘍細胞表面上に、または腫瘍細胞（細胞質、核または種々の細胞小器官もしくは細胞以下の構造を問わない）内に蓄積する物質であるかもしれない。このような腫瘍関連マーカーのうち、Herberman, "Immunodiagnosis of Cancer", in Fleisher ed., "The Clinical Biochemistry of Cancer", page 347(American Association of Clinical Chemists, 1979)により、ならびに米国特許第４，１５０，１４９号明細書；第４，３６１，５４４号明細書；および第４，４４４，７４４号明細書に開示されるものである。Thorpe et al.の米国特許第５，９６５，１３２号明細書、Thorpe et al.の米国特許第６，００４，５５４号明細書、Epstein et al.の米国特許第６，０７１，４９１号明細書、Epstein et al.の米国特許第６，０１７，５１４号明細書、Epstein et al.の米国特許第５，８８２，６２６号明細書、Epstein et al.の米国特許第５，０１９，３６８号明細書、および Thorpe et al.の米国特許第６，３４２，２２１号明細書（これらの全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる）も参照されたい。
腫瘍関連マーカーは、Herberman, 前記によって、腫瘍胎児抗原、胎盤抗原、発癌または腫瘍ウイルス関連抗原、組織関連抗原、器官関連抗原、異所性ホルモンおよび正常抗原もしくはその変異体をはじめとする数多くのカテゴリーに分類されている。腫瘍関連マーカーのサブユニットを使用して腫瘍特異性（例えば、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）のβ−サブユニットまたは癌胎児性抗原（ＣＥＡの）γ領域）の高い抗体を惹起することが時に有利であり、米国特許第４，３６１，６４４号明細書および第４，４４４，７４４号明細書で開示されるように、非腫瘍物質との交差反応性が極めて低い抗体の産生が刺激される。また、腫瘍血管構造（例えば、ＶＥＧＦ）マーカー、腫瘍壊死（エプステインの特許）マーカー、膜受容体（例えば、葉酸受容体、ＥＧＦＲ）マーカー、トランスメンブレン抗原（例えば、ＰＳＭＡ）マーカー、および癌遺伝子産物マーカーは、抗体または抗体フラグメントの好適な腫瘍関連標的としての役割も果たし得る。腫瘍細胞で豊富に発現されるＢ細胞複合抗原などの正常細胞構成要素のマーカー（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、およびＢ細胞悪性腫瘍のＨＬＡ−ＤＲ）、ならびに特定の腫瘍細胞で発現されるサイトカイン（例えば、Ｔ細胞悪性腫瘍のＩＬ−２受容体）もまた、本発明の抗体および抗体フラグメントの好適な標的である。本発明の抗体および抗体フラグメントによって標的化することができる他の周知の腫瘍関連抗原としては、限定されるものではないが、ＣＥＡ、ＣＳＡｐ、ＴＡＧ−７２、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＢｒＥ３、ＰＡＭ−４、ＫＣ−４、Ａ３、ＫＳ−１、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、テネイシン、Ｔ１０１、Ｓ１００、ＭＡＧＥ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、およびＣＤ７４が挙げられる。
目的の別のマーカーはトランスメンブレンアクチベーターおよびＣＡＭＬ−インタラクター（ＴＡＣＩ）である。Yu et al. Nat Immunol. 1: 252-256 (2000)を参照されたい。簡潔には、ＴＡＣＩはＢ細胞悪性腫瘍（例えば、リンパ腫）のマーカーである。さらに、ＴＡＣＩおよびＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）が腫瘍壊死因子相同体、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）と結合することは公知である。ＡＰＲＩＬは、一次ＢおよびＴ細胞のin vitro増殖を刺激し、in vivoでのＢ細胞の蓄積により脾臓重量が増加する。また、ＡＰＲＩＬは受容体結合に関してＴＡＬＬ−１（ＢＬｙＳまたはＢＡＦＦとも呼ばれる）と競合する。可溶性ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩはＡＰＲＩＬの結合を特異的に妨げ、ＡＰＲＩＬにより刺激される一次Ｂ細胞の増殖をブロックする。ＢＣＭＡ−Ｆｃは、マウスにおいてキーホールリンペットヘモシアニンおよびニューモバックスに対する抗体の産生も阻害し、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを介するＡＰＲＩＬおよび／またはＴＡＬＬ−１シグナル伝達が体液性免疫の発生に必要であることがわかる。このように、ＡＰＲＩＬ−ＴＡＬＬ−１およびＢＣＭＡ−ＴＡＣＩがＢおよびＴ細胞機能の刺激に関係する２リガンド−２受容体経路を構成している。
免疫原に対する抗体の最初の惹起後、抗体を配列決定し、その後、組換え技術によって調製することができる。ネズミ抗体および抗体フラグメントのヒト化およびキメラ化は当業者に周知である。例えば、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域由来のマウス相補性決定領域をヒト可変ドメインに導入し、次いで、ネズミ対応物のフレームワーク領域内でヒト残基と置換することによって作製される。ヒト化モノクローナル抗体由来の抗体成分を使用することで、ネズミ定常部の免疫原性に関する潜在的な問題が排除される。ネズミ免疫グロブリン可変ドメインをクローニングする一般的方法は、例えば、全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされるOrlandi et al.の刊行物、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 3833 (1989)に記載されている。ヒト化Ｍａｂの作製技術は、例えば、Jones et al., Nature 321: 522 (1986), Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988), Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988), Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437 (1992)、およびSinger et al., J. Immun. 150: 2844 (1993)に記載されており、その各々が引用することにより本明細書の一部とされる。
あるいは、完全なヒトの抗体を、トランスジェニック非ヒト動物から得ることができる。例えば、Mendez et al., Nature Genetics, 15: 146-156 (1997)；米国特許第５，６３３，４２５号明細書を参照されたい。例えば、ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックマウスから回収することができる。マウス体液性免疫系を、内在性免疫グロブリン遺伝子を不活化し、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによってヒト化する。ヒト免疫グロブリン遺伝子座は、非常に複雑で、ヒトゲノムのほぼ０．２％を占める多数の不連続なセグメントを含む。トランスジェニックマウスにより確実に抗体の十分なレパートリーを作製し得るように、ヒト重鎖および軽鎖の遺伝子座の大部分をマウスゲノムに導入しなければならない。これは段階的プロセスによって達成され、生殖細胞系列配置中にヒト重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座のいずれかを含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）の形成によって開始される。各挿入断片の大きさが約１Ｍｂであるため、ＹＡＣ構築には免疫グロブリン遺伝子座の重複断片の相同組換えが必要である。２つのＹＡＣ（一方は重鎖遺伝子座を含み、他方は軽鎖遺伝子座を含む）を、ＹＡＣ含有酵母スフェロブラストとマウス胚幹細胞との融合を介してマウスに個別に導入する。次いで、胚幹細胞クローンをマウス胚盤胞に微量注入する。得られた雄キメラを、その生殖細胞系列によってＹＡＣを伝達する能力についてスクリーニングし、ネズミ抗体産生不全マウスと交配させる。２つのトランスジェニック系統（一方はヒト重鎖遺伝子座を含み、他方はヒト軽鎖遺伝子座を含む）の交配により、免疫化に応答するヒト抗体を産生する子孫を作製する。
非再配列ヒト免疫グロブリン遺伝子を、微小細胞媒介性染色体導入（ＭＭＣＴ）を介してマウス胚幹細胞に導入することもできる。例えば、Tomizuka et al., Nature Genetics, 16: 133 (1997)を参照されたい。この方法では、ヒト染色体を含む微小細胞をマウス胚幹細胞と融合する。導入された染色体は安定に維持され、成体キメラは好適な組織特異性発現を示す。
あるいは、本発明の抗体または抗体フラグメントを、コンビナトリアル免疫グロブリンライブリーから単離されたヒト抗体フラグメントから誘導してもよい。例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Barbas et al., METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2: 119 (1991)、およびWinter et al., Ann. Rev. Immunol. 12: 433 (1994)を参照されたい。Ｂ細胞不死化によるモノクローナル抗体の作製に関連する多くの問題は、ファージディスプレーを用いて大腸菌(E.coli)中の抗体フラグメントを操作し、発現させることによって克服することができる。高親和性モノクローナル抗体を確実に回収するために、コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーは幅広いレパートリーサイズであるべきである。典型的な戦略は、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成するために免疫化マウスのリンパ球または脾臓細胞から得たｍＲＮＡを利用する。重鎖および軽鎖遺伝子をＰＣＲで個別に増幅し、ファージクローニングベクターに連結する。２つの異なるライブラリー（一方は重鎖遺伝子を含み、他方は軽鎖遺伝子を含む）を作製する。ファージＤＮＡを各ライブラリーから単離し、重鎖および軽鎖配列をともに連結し、パッケージングしてコンビナトリアルライブラリーを作製する。各ファージは重鎖ｃＤＮＡと軽鎖ｃＤＮＡとの無作為な対を含み、大腸菌の感染の際に感染細胞での抗体鎖の発現を指向する。目的の抗原を認識する抗体を同定するために、ファージライブラリーをプレーティングし、プラーク中に存在する抗体分子をフィルターへ移す。フィルターを放射性標識抗原とともにインキュベートした後、洗浄して過剰の結合していないリガンドを除去する。オートラジオグラムによる放射性スポットにより、抗原と結合している抗体を含むプラークを同定する。ヒト免疫グロブリンファージライブラリーの作製に有用なクローニングベクターおよび発現ベクターを、例えば、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥクローニングシステム(La Jolla, CA)から得ることができる。
類似の戦略を用いて高親和性のｓｃＦｖを得ることができる。例えば、Vaughn et al., Nat. Biotechnol., 14: 309-314 (1996)を参照されたい。幅広いレパートリーを有するｓｃＦｖライブラリーを、全ての公知のＶＨ、ＶκおよびＶλ遺伝子ファミリーに相当するＰＣＲプライマーを用いて非免疫化ヒト供与体由来のＶ遺伝子を単離することによって構築することができる。増幅後、ＶκおよびＶλプールを合わせて１つのプールとする。これらのフラグメントをファージミドベクターに連結する。次いで、ｓｃＦｖリンカー（Ｇｌｙ４、Ｓｅｒ）３をＶＬフラグメントの上流のファージミドに連結する。ＶＨおよびリンカー−ＶＬフラグメントを増幅し、ＪＨ領域で構成する。得られたＶＨ−リンカー−ＶＬフラグメントをファージミドベクターに連結する。ファージミドライブラリーを上記のようにフィルターを用いるか、免疫チューブ(Nunc; Maxisorp)を用いてパニングする。免疫化ウサギのリンパ球または脾臓細胞由来のコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーを構築することによって、また、P.pastorisでｓｃＦｖ構築物を発現させることによって類似の結果を達成することができる。例えば、Ridder et al., Biotechnology, 13: 255-260 (1995)を参照されたい。さらに、好適なｓｃＦｖの単離後、結合親和性が高く、解離速度が遅い抗体フラグメントをＣＤＲ３突然変異誘発および鎖のシャッフリングなどの親和性成熟プロセスによって得ることができる。例えば、Jackson et al., Br. J. Cancer, 78: 181-188 (1998); Osbourn et al., Immunotechnolog, 2: 181-196 (1996)を参照されたい。
抗体フラグメントの別の形態が単一のＣＤＲをコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ鎖反応を用いて抗体産生細胞のＲＮＡ由来の可変領域を合成することによって作製される。例えば、Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106 (1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies, "in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), pages 166-179 (Cambridge University Press 1995);およびWard et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies, "in MONOCLONAL ANTIBODIES; PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al., (eds.), pages 137-185 (Wiley-Liss, Inc. 1995)を参照されたい。
ｂｓＡｂを当技術分野で公知の技術によって調製することができる。例えば、抗ＣＥＡ腫瘍Ａｂおよび抗ペプチドＡｂを個別にペプシンで消化してそれぞれＦ（ａｂ’）２を得る。抗ＣＥＡ−Ａｂ−Ｆ（ａｂ’）２をシステインで還元してＦａｂ’単量体単位を作製し、これを架橋剤ビス（マレイミド）ヘキサンとさらに反応させてＦａｂ’−マレイミド部分を作製する。抗ペプチドＡｂ−Ｆ（ａｂ’）２をシステインで還元し、精製し、回収した抗ペプチドＦａｂ’−ＳＨを抗ＣＥＡ−Ｆａｂ’−マレイミドと反応させてＦａｂ’×Ｆａｂ’二重特異性Ａｂを作製する。あるいは、抗ペプチドＦａｂ’−ＳＨフラグメントを抗ＣＥＡ Ｆ（ａｂ’）２とカップリングしてＦ（ａｂ’）２×Ｆａｂ’構築物を作製するか、抗ＣＥＡ ＩｇＧとカップリングしてＩｇＧ×Ｆａｂ’二重特異性構築物を作製する。１つの実施態様では、ＩｇＧ×Ｆａｂ’構築物を、過ヨウ素酸塩で酸化し、続いて、市販のヒドラジン−マレイミド架橋剤との反応によって活性化した抗ＣＥＡ ＩｇＧ重鎖炭水化物への抗ペプチドＦａｂ’チオール基の付着により部位特異的に調製することができる。使用した成分Ａｂを公知の技術によってキメラ化またはヒト化することができる。キメラ抗体は齧歯動物由来の可変ドメインおよび相補性決定領域領域を含む組換えタンパク質であり、抗体分子の残りの部分はヒト抗体由来である。ヒト化抗体はモノクローナル抗体のネズミ相補性決定領域がネズミ免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域からヒト可変ドメインに導入された組換えタンパク質である。
種々の組換え法を使用して二重特異性抗体および抗体フラグメントを作製することができる。例えば、二重特異性抗体および抗体フラグメントをトランスジェニック家畜の乳汁中で作製することができる。例えば、Colman, A., Biochem. Soc. Symp., 63: 141-147, 1998; 米国特許第５，８２７，６９０号明細書を参照されたい。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖対をコードするＤＮＡセグメントをそれぞれ含む２つのＤＮＡ構築物を調製する。フラグメントを、哺乳類上皮細胞において優先的に発現するプロモーター配列を含む発現ベクターにクローニングする。例としては、限定されるものではないが、ウサギ、ウシおよびヒツジカゼイン遺伝子、ウシα−ラクトグロブリン遺伝子、ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子、ならびにマウスホエイ酸タンパク質遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。好ましくは、挿入したフラグメントは、哺乳類特異的遺伝子由来の同起源のゲノム配列のその３’側にフランキングしている。これにより、ポリアデニル化部位および転写安定配列が提供される。発現カセットを受精した哺乳類の卵子の前核に同時注入し、これを、その後、受容体である雌の子宮に移植し、懐胎させる。出産後、その子孫をサザン解析により両トランスジーンの存在についてスクリーニングする。抗体が存在するためには、重鎖および軽鎖遺伝子いずれもが同一細胞で同時に発現されなければならない。当技術分野では公知の標準的な免疫学的方法を使用し、トランスジェニック雌由来の乳汁を抗体または抗体フラグメントの存在および機能性について解析する。抗体は当技術分野で公知の標準的な方法により乳汁から精製することができる。
キメラＡｂを、マウス軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードするｃＤＮＡ断片のヒト抗体由来のＣドメインをコードする断片への連結によって構築する。Ｃドメインは抗原結合に寄与しないため、キメラ抗体は起源のマウスＡｂと同一の抗原特異性を維持するが、配列はヒト抗体により近い。キメラＡｂは、いくつかのマウス配列を依然含んでいるが、なお免疫原性である。ヒト化Ａｂは、抗原を認識するのに必要なマウスアミノ酸のみを含む。この産物は、ヒト抗体フレームワークにマウス相補性決定領域由来のアミノ酸を確立することによって構築する。
最近の他のｂｓＡｂ作製方法としては、より一般的な免疫グロブリンイソタイプよりも強く架橋するように、さらなるシステイン残基を有する人工組換えＡｂが挙げられる。例えば、FitzGerald et al., Protein Eng. 10 (10): 1221-1225, 1997を参照されたい。別のアプローチは、必要な二重特異性を有する２以上の異なる単鎖抗体または抗体フラグメントと連結した組換え融合タンパク質を操作することである。例えば、Coloma et al., Nature Biotech. 15: 159-163, 1997を参照されたい。分子操作を用いて種々の二重特異性融合タンパク質を作製することができる。一形態では、二重特異性融合タンパク質は一価であり、例えば、１つの抗原に対して１つの結合部位を有するｓｃＦｖと第２の抗原に対して１つの結合部位を有するＦａｂフラグメントからなる。別の形態では、二重特異性融合タンパク質は二価であり、例えば、１つの抗原に対して２つの結合部位を有するＩｇＧと第２の抗原に対して２つの結合部位を有するｓｃＦｖからなる。
ダイアボディーとも呼ばれる機能的二重特異性単鎖抗体（ｂｓｃＡｂ）を、組換え法を用いて哺乳類細胞で作製することができる。例えば、Mack et al., Proc. Natl, Acad. Sci., 92: 7021-7025, 1995を参照されたい。例えば、組換え法を用いたグリシン−セリンリンカーを介する２つの単鎖Ｆｖフラグメントの連結によってｂｓｃＡｂを作製する。目的の２つの抗体のＶ軽鎖（ＶＬ）およびＶ重鎖（ＶＨ）ドメインを標準的なＰＣＲ法を用いて単離する。次いで、各ハイブリドーマから得たＶＬおよびＶＨｃＤＮＡを連結して２工程融合ＰＣＲにて単鎖フラグメントを形成する。第１のＰＣＲ工程により、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ１）３リンカーを導入し、第２の工程により、ＶＬおよびＶＨアンプリコンを連結する。次いで、各単鎖分子を細菌発現ベクターにクローニングする。増幅後、単鎖分子の１つを切り出し、目的の第２の単鎖分子を含む他のベクターにサブクローニングする。得られたｂｓｃＡｂフラグメントを真核生物発現ベクターにサブクローニングする。機能タンパク質発現は、ベクターをチャイニーズハムスター卵巣細胞にトランスフェクトすることにより得ることができる。二重特異性融合タンパク質は同様に調製される。二重特異性単鎖抗体および二重特異性融合タンパク質は本発明の範囲内に含まれる。
２以上の異なる単鎖抗体または抗体フラグメントを結合した二重特異性融合タンパク質は同様に作製される。
組換え法を用いて種々の融合タンパク質を作製することができる。例えば、ヒト化モノクローナル抗ＣＥＡ抗体由来のＦａｂフラグメントとネズミ抗ジＤＴＰＡ由来のｓｃＦｖを含む融合タンパク質を作製することができる。フレキシブルリンカー（例えば、ＧＧＧＳ（配列番号１０））によりｓｃＦｖを抗ＣＥＡ抗体の重鎖の定常部に連結する。あるいは、ｓｃＦｖをｈＭＮ−１４の軽鎖の定常部に連結することができる。ｓｃＦｖへの重鎖Ｆｄのインフレームでの連結に必要な好適なリンカー配列をＰＣＲ反応を通じてＶＬおよびＶＫドメインに導入する。次いで、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ断片を、ＣＨ１ドメインをコードするＤＮＡ配列を含むステージングベクターに連結する。得られたｓｃＦｖ−ＣＨ１構築物を切り出し、抗ＣＥＡ抗体のＶＨ領域をコードするＤＮＡ配列を含むベクターに連結する。得られたベクターを使用して二重特異性タンパク質発現用の哺乳類細胞にトランスフェクトすることができる。
大腸菌発現系を用いて大量のｂｓｃＡｂおよび融合タンパク質を作製することができる。例えば、Zhenping et al., Biotechnology, 14 :192-196, 1996を参照されたい。機能的なｂｓｃＡｂを、２つのフラグメントのＶＬおよびＶＨドメインが異なるポリペプチド鎖に存在する２つの「交差」ｓｃＦｖフラグメントの大腸菌における同時発現によって作製することができる。目的の２つの抗体のＶ軽鎖（ＶＬ）およびＶ重鎖（ＶＨ）ドメインを標準的なＰＣＲ法を用いて単離する。次いで、ｃＤＮＡを、目的の第１の抗体のＶＬドメインのＣ末端をリンカーを介して第２の抗体のＶＨドメインのＮ末端に連結するように細菌発現ベクターに連結する。同様に、目的の第２の抗体のＶＬドメインのＣ末端をリンカーを介して第１の抗体のＶＨドメインのＮ末端に連結する。得られたジシストロニックなオペロンを、強力なプロモーター（例えば、リン酸塩欠乏によって誘導される大腸菌アルカリ性ホスファターゼプロモーター）の転写制御下に置く。あるいは、単鎖融合構築物を、ｌａｃプロモーターおよび２％グリシンおよび１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００からなる培地を用いて大腸菌で首尾よく発現させた。例えば、Yang et al.,Appl. Environ. Microbiol., 64: 2869-2874, 1998を参照されたい。大腸菌の熱安定性エンテロトキシンIIシグナル配列を使用してペプチドをペリプラズム空間に指向させる。分泌後、２つのペプチド鎖は会合して両方の抗原結合特異性を有する非共有結合ヘテロダイマーを形成する。ｂｓｃＡｂは当技術分野で公知の標準的手順（例えば、ブドウ球菌プロテインＡクロマトグラフィー）を用いて精製する。
機能的ｂｓｃＡｂおよび融合タンパク質をトランスジェニック家畜の乳汁中で作製することもできる。例えば、Colman, A., Biochem. Soc. Symp., 63: 141-147, 1998; 米国特許第５，８２７，６９０号明細書を参照されたい。上記のように得たｂｓｃＡｂフラグメントを、哺乳類上皮細胞において優先的に発現するプロモーター配列を含む発現ベクターにクローニングする。例として、限定されるものではないが、ウサギ、ウシおよびヒツジカゼイン遺伝子、ウシα−ラクトグロブリン遺伝子、ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子、ならびにマウスホエイ酸タンパク質遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。好ましくは、挿入したｂｓｃＡｂは、哺乳類特異的遺伝子由来の同起源のゲノム配列のその３’側にフランキングしている。これにより、ポリアデニル化部位および転写安定配列が提供される。次いで、発現カセットを受精した哺乳類の卵子の前核に注入し、これを、その後、受容体である雌の子宮に移植し、懐胎させる。出産後、その子孫をサザン解析により導入したＤＮＡの存在についてスクリーニングする。当技術分野では公知の標準的な免疫学的方法を使用し、トランスジェニック雌由来の乳汁をｂｓｃＡｂの存在および機能性について解析する。ｂｓｃＡｂは当技術分野では公知の標準的な方法により乳汁から精製することができる。乳汁中でｂｓｃＡｂのトランスジェニック産生により、大量のｂｓｃＡｂの効率的な獲得法が提供される。
機能的ｂｓｃＡｂおよび融合タンパク質をトランスジェニック植物で作製することもできる。例えば、Fiedler et al., Biotech., 13: 1090-1093, 1995; Fiedler et al., Immunotechnology, 3: 205-216, 1997を参照されたい。このように作製することにより、いくつかの利点（低価格、大量生産および安定した長期保存など）が付与される。タンパク質を小胞体に指向させるために、上記のように得たｂｓｃＡｂフラグメントを、プロモーター配列を含み、シグナルペプチド配列をコードする発現ベクターにクローニングする。種々のプロモーターを利用して、発現産物を植物内の特定の位置に指向させることができる。例えば、タバコ植物における遍在的な発現は、強力なカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを用いて達成することができ、器官特異的発現は種子特異的レグミンＢ４プロモーターを介して達成される。発現カセットを当技術分野で公知の標準的な方法によって形質転換する。形質転換をサザン解析によって評価する。当技術分野で公知の標準的な免疫学的方法を使用し、トランスジェニック植物をｂｓｃＡｂの存在および機能性について解析する。ｂｓｃＡｂは当技術分野で公知の標準的な方法を用いて植物組織から精製することができる。
さらに、トランスジェニック植物は、ｂｓｃＡｂおよび融合タンパク質の長期保存を容易にする。機能的に活性なｓｃＦｖタンパク質を、室温で１週間保存後にタバコの葉から抽出した。同様に、室温で１年間保存したトランスジェニックタバコ種子には、ｓｃＦｖタンパク質またはその抗原結合活性の喪失は認められない。
機能的ｂｓｃＡｂおよび融合タンパク質を昆虫細胞で作製することもできる。例えば、Mahiouz et al., J. Immunol. Methods, 212: 149-160 (1998)を参照されたい。昆虫ベースの発現系により、大量の均質で適切に折りたたまれたｂｓｃＡｂの作製産生手段が提供される。バキュロウイルスは広く使用されている昆虫細胞の発現ベクターであり、組換え抗体分子に首尾よく適用されてきた。例えば、Miller, L. K., Ann. Rev. Microbiol., 42: 177 (1988) ;Bei et al., J. Immunol. Methods, 186: 245 (1995)を参照されたい。あるいは、誘導プロモーターの転写制御下でのｂｓｃＡｂ構築物を含む安定な昆虫細胞株を作製することにより誘導発現系を利用することができる。例えば、Mahiouz et al., J. Immunol. Methods, 212: 149-160 (1998)を参照されたい。上記のように得たｂｓｃＡｂフラグメントをキイロショウジョウバエ(Drosophila)メタトチオネインプロモーターおよびヒトＨＬＡ−Ａ２リーダー配列を含む発現ベクターにクローニングする。次いで、構築物をキイロショウジョウバエ(D. melanogaster) ＳＣ−２細胞にトランスフェクトする。細胞を多量の銅、亜鉛、またはカドミウムに暴露することによって発現を誘導する。当技術分野で公知の標準的な免疫学的方法を使用して、ｂｓｃＡｂの存在および機能性を判定する。精製ｂｓｃＡｂは当技術分野で公知の標準的な方法を用いて得られる。
本発明の好ましい二重特異性抗体は、ＭＡｂ Ｍｕ−９のＦｖとＭＡｂ ６７９のＦｖまたはＭＡｂ ＭＮ−１４のＦｖとＭＡｂ ６７９のＦｖ、ならびにそれらのヒトキメラ化またはヒト化対応物を組み込んだものである。ＭＮ−１４、ならびにそのキメラ化およびヒト化対応物については、米国特許第５，８７４，５４０号明細書に開示されている。また、Ｍｕ−９または６７９の１以上のＣＤＲを組み込んだ二重特異性抗体も好ましい。また、抗体は融合タンパク質であり得るし、またはクラス−III 抗ＣＥＡ抗体および６７９のＦｖを組み込んだ二重特異性抗体であり得る。クラス−III 抗ＣＥＡをはじめとするクラス−III 抗体については、米国特許第４，８１８，７０９号明細書において詳細に記述されている。
VII．他の応用
本発明は、米国特許第６，０９６，２８９号明細書に記載されているような、上記のターゲッティング可能な構築物と結合するｂｓＡｂおよび治療薬または診断薬の術中、血管内、内視鏡的腫瘍および病巣検出、生検ならびに治療における使用を包含する。
本発明の抗体および抗体フラグメントは、治療および画像化目的だけでなく、in vitro研究の実施における補助手段として使用することができる。例えば、本発明のｂｓＡｂをin vitroにて使用して、ターゲッティング可能な構築物が１以上のｂｓＡｂと安定した複合体を形成することができるかどうかを確かめることができる。このようなアッセイは、ｂｓＡｂと安定した複合体を形成するターゲッティング可能な構築物の同定において当業者の手助けとなる。これにより、当業者は治療薬および／または造影剤として優れていると考えられるターゲッティング可能な構築物の同定が可能になる。
アッセイは問題のターゲッティング可能な構築物を少なくとも２モル等量のｂｓＡｂと合わせることによって実施することが有利である。インキュベーション後、混合物をサイズ排除ＨＰＬＣにより分析して構築物がｂｓＡｂと結合しているかどうかを判定する。あるいは、アッセイを標準的なコンビナトリアル法を使用して実施する（ここで、 種々のｂｓＡｂ溶液を標準９６ウェルプレートに入れる）。各ウェルに、ターゲッティング可能な構築物の溶液を添加する。インキュベートし、分析した後、構築物がどのｂｓＡｂと最良の結合をするかが容易に判定できる。
当然のことではあるが、ｂｓＡｂのターゲッティング可能な構築物への添加順序は重要でない。すなわち、ｂｓＡｂを構築物に添加してもよいし、逆の場合も同じである。また、ｂｓＡｂも構築物も溶解状態である必要はない。すなわち、それらは、溶解状態またはストレートのいずれか都合のよい方法で添加してよい。最後に、結合が確立されさえすれば、結合についての解析方法は重要でない。よって、限定されるものではないが、サイズ排除ＨＰＬＣと合わせた、もしくはその代わりの、ＦＡＢＭＳ、高電界型ＮＭＲ、または他の好適な方法をはじめとする標準的な解析方法を使用して結合について解析し得る。
以下、本発明を実施例により説明するが、これらは何ら限定されるものではない。
実施例１）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ−）−ＮＨ ２ （ＩＭＰ ２４３）の合成
Ｌ−チロシンの代わりにＤ−チロシンを使用し、ＤＴＰＡの代わりにＮ−トリチル−ＨＳＧ−ＯＨを使用することを除き、Karacay et. al. Bioconjugate Chem. 11: 842-854 (2000)により記載されているようにペプチドを合成した。Ｎ−トリチル−ＨＳＧ−ＯＨの最終カップリングは、樹脂上のペプチドに対して１０倍過剰のＮ−トリチル−ＨＳＧ−ＯＨを使用して行った。Ｎ−トリチル−ＨＳＧ−ＯＨ（ＮＭＰ中０．２８Ｍ）を、１当量（ＨＳＧに対して）のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、１当量のベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェ−ト（ＢＯＰ）および２当量のジイソプロピルエチルアミンを使用して活性化した。活性化した基質を樹脂と室温にて１５時間混合した。
実施例２）ＩＭＰ ２４３を含むＴｃ−９９ｍキットの調合
窒素パージを行った脱気水１７０ｍＬに溶かした２２．０９３ｇヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、０．４５ｇ２，４−ジヒドロキシ安息香酸、０．２５７ｇ酢酸ナトリウム塩、および１０．８８９ｇ α−Ｄ−グルコヘプタン酸ナトリウム塩を含有する調合緩衝液を調製した。数滴の1 Ｍ ＮａＯＨを添加してこの溶液をｐＨ ５．３に調整した後、全量２２０ｍＬにさらに希釈した。スズ緩衝溶液は、０．２ｍＬのＳｎＣｌ２（２００ｍｇ／ｍＬ）を３．８ｍＬの調合緩衝液で希釈することにより調製した。ペプチド Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２（配列番号４）（０．００２６ｇ）を７８ｍＬの緩衝溶液に溶かし、０．５２ｍＬのスズ緩衝液と混合した。次いで、このペプチド溶液を０．２２μｍ Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ フィルターで濾過し、１．５ｍＬアリコートを３ｍＬ凍結乾燥バイアルに入れた。充填したバイアルはすぐに冷凍し、凍結乾燥させ、真空下にてクリンプシールを装着した。
生理食塩水１．５ｍＬ中、過テクネチウム酸塩溶液（２７ｍＣｉ）をキットに添加した。キットを室温にて１０分間インキュベートし、沸騰水浴中で２５分間加熱した。キットは室温まで冷却した後に使用した。
実施例３）二重特異性抗体腫瘍プレターゲッティングによって治療用／画像診断用放射性同位元素を腫瘍へと運ぶペプチド
ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（配列番号２）（ＩＭＰ ２３７）を合成し、二重特異性抗体腫瘍プレターゲッティングによって９０Ｙまたは１７７Ｌｕなどの治療用放射性同位元素を腫瘍へと送達させた。二重特異性抗体は、腫瘍の抗原と結合する１つの部分とＨＳＧペプチドと結合するもう１つの部分からなる。ＨＳＧペプチドと結合する抗体は６７９である。この系はまた、１１１Ｉｎ−１１１などの画像診断用同位元素を送達させるにも利用し得る。
ＩＭＰ ２３７の合成：
標準Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成を用い、Sieberアミド樹脂(Nova-Biochem)でＩＭＰ ２３７を合成し、次の保護したアミノ酸：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、（Advanced Chemtechの試薬）トリ−ｔ−ブチルＤＯＴＡ(Macrocyclics)を順に添加してペプチド主鎖を構築した。次いで、サイドのリジン側鎖をDangles et. al. J. Org. Chem. 52: 4984-4993 (1987)の方法によりＰｄ［Ｐ（Ｐｈ）３］４で脱保護した。その後、アミノ酸の連結に利用するＢＯＰ／ＨＢＴＵ二重カップリング手順を用い、ＨＳＧリガンドをトリチルＨＳＧとして添加した（以下で記述する合成）。ペプチドを樹脂から切断し、ＴＦＡ処理により保護基を除去した。ＨＰＬＣによりペプチドを精製し、１．８２３ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＮＨ−Sieberアミド樹脂から０．６０７９ｇのペプチドを得た。
Ｎ−トリチル−ＨＳＧ−ＯＨの合成：
グリシンｔ−ブチルエステル塩酸塩（１５．２６３ｇ，９．１×１０−２ｍｏｌ）と１９．７６０ｇ Ｎａ２ＣＯ３とを混合した後、５０ｍＬのＨ２Ｏに懸濁し、氷浴で冷却した。次いで、無水コハク酸（９．１４２ｇ，９．１４×１０−２ｍｏｌ）を、室温までゆっくりと温めた反応溶液に添加し、この溶液を１８時間攪拌した。クエン酸（３９．９１１ｇ）を５０ｍＬのＨ２Ｏ に溶かし、ゆっくりと反応溶液に添加し、その後、２×１５０ｍＬ ＥｔＯＡｃで抽出した。この有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮し、２５．７０９ｇの白色の固体を得た。
粗生成物（２５．７０９ｇ）を１２５ｍＬジオキサンに溶かし、室温の水浴中で冷却し、１１．２４４ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドと混合した。ジイソプロピルカルボジイミド１５．０ｍＬを反応溶液に添加し、この溶液を１時間攪拌した。次いで、ヒスタミン二塩酸塩（１８．４０２ｇ，１．００×１０−１ｍｏｌ）を１００ｍＬのＤＭＦおよび３５ｍＬジイソプロピルエチルアミンに溶かした。ヒスタミン混合物を反応溶液に添加し、この溶液を室温にて２１時間攪拌した。この反応物を１００ｍＬ水でクエンチし、濾過し、沈殿物を取り出した。溶媒をロータリーエバポレーターにより高真空下にて除去した。粗生成物を３００ｍＬジクロロメタンに溶かし、１００ｍＬ飽和ＮａＨＣＯ３で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、黄色のオイルとして３４．１９ｇの粗生成物を得た。
粗生成物（３４．１９ｇ）を５０ｍＬクロロホルムに溶かし、３１ｍＬジイソプロピルエチルアミンと混合した。塩化トリフェニルメチル（２５．４１５ｇ）を５０ｍｌクロロホルムに溶かし、攪拌した反応溶液に滴下し、この溶液を氷浴で冷却した。この反応物を４５分間攪拌した後、１００ｍＬのＨ２Ｏでクエンチした。層を分離させ、有機溶液をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、緑色のガムを得た。このガムを１００ｍＬのＥｔ２Ｏでトリチュレートし、黄色の沈殿物を得た。これを３×Ｅｔ２Ｏ各５０ｍＬで洗浄した。固体を真空乾燥させ、３０．６４１ｇ（５９．５％ 全収率）のＮ−トリチル−ＨＳＧ−ｔ−ブチルエステルを得た。
Ｎ−トリチル−ＨＳＧ−ｔ−ブチルエステル（２０．６２０ｇ，３．６４×１０−２ｍｏｌ）を３０ｍＬクロロホルムおよび３５ｍＬ氷酢酸の溶液に溶かした。この反応物を氷浴で冷却し、１５ｍＬのＢＦ３−Ｅｔ２Ｏを反応溶液にゆっくりと添加した。反応物を室温までゆっくりと温め、５時間混合した。反応物を、２００ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨに注ぎ込むことによりクエンチし、生成物を２００ｍＬクロロホルムで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、未精製のガムを得た。これを１００ｍＬのＥｔ２Ｏでトリチュレートし、沈殿物を得た。未精製の沈殿物を４００ｍＬの０．５Ｍ ｐＨ ７．５ リン酸緩衝液に注ぎ込み、２×２００ｍＬ ＥｔＯＡｃで抽出した。水層を１Ｍ ＨＣｌでｐＨ３．５まで酸性化し、２×２００ｍＬクロロホルムで抽出した。沈殿物を得、それを濾過により回収した（８．５８ｇ）。これまでのサンプルとのＨＰＬＣ比較によりこの沈殿物は所望の生成物であった（ＥＳＭＳ ＭＨ＋ ５１１）。
放射性標識：
９０ Ｙキットの調製
ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（配列番号２）を０．２５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ／１０％ＨＰＣＤ緩衝液に９、１８、３５、７０および１４０μｇ／ｍＬの濃度にて溶かした。この溶液を０．２２μｍ Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ フィルターで滅菌濾過し、１ｍＬアリコートを酸洗浄済の凍結乾燥バイアルに入れた。充填したバイアルは充填したらすぐに冷凍し、凍結乾燥させた。凍結乾燥サイクルが完了したら、凍結乾燥装置から取り出したらすぐにバイアルを真空密閉し、クリンプシールを装着した。
９０Ｙ（〜４００μＣｉ／キット）を脱イオン水中１ｍＬに希釈し、凍結乾燥キットに添加した。このキットを沸騰水浴中で１５分間加熱し、バイアルを室温まで冷却し、標識されたペプチドを逆相ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ条件：Ｗａｔｅｒｓ Ｎｏｖａ−Ｐａｋ Ｃ−１８、８×１００ｍｍ ＲＣＭカラム、３ｍＬ／分にて、１００％（Ｈ２Ｏ中０．１％ＴＦＡ）〜１００％（９０％ＣＨ３ＣＮ，０．１％ＴＦＡ，１０％Ｈ２Ｏ）の直線勾配を用いて溶出）により評価した。ＨＰＬＣ分析により、この処方での完全標識に必要なペプチドの最小濃度が３５μｇ／ｍＬであることが分かった。逆相ＨＰＬＣトレースにより、９０Ｙ標識ペプチドのシャープなピークが示された。サイズ排除ＨＰＬＣによれば、標識ペプチドは、過剰な６７９ ＩｇＧと混合すると完全に結合した。
１１１ Ｉｎによる標識
１１１Ｉｎ（〜３００μＣｉ／キット）を脱イオン水中０．５ｍＬに希釈し、凍結乾燥キットに添加した。このキットを沸騰水浴中で１５分間加熱し、バイアルを冷却し、０．５Ｍ酢酸緩衝液中２．５６×１０−５Ｍ Ｉｎ ０．５ｍＬを添加し、このキットを再び沸騰水浴中で１５分間加熱した。標識ペプチドのバイアルを室温まで冷却し、逆相ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ条件：Ｗａｔｅｒｓ Ｎｏｖａ−Ｐａｋ Ｃ−１８、８×１００ｍｍ ＲＣＭカラム、３ｍＬ／分にて、１００％（Ｈ２Ｏ中０．１％ＴＦＡ）〜１００％（９０％ＣＨ３ＣＮ，０．１％ＴＦＡ，１０％Ｈ２Ｏ）の直線勾配を用いて溶出）により評価した。ＨＰＬＣ分析により、この処方での標識（４．７％遊離した１１１Ｉｎ）に必要なペプチドの最小濃度が３５μｇ／ｍＬであることが分かった。逆相ＨＰＬＣトレースにより、１１１Ｉｎ標識ペプチドのシャープなピークが示された。サイズ排除ＨＰＬＣによれば、標識ペプチドは、過剰な６７９ ＩｇＧと混合すると完全に結合した。
in-vivo試験：
ＧＷ−３９ヒト結腸腫瘍異種移植片(colonic xenograft tumor)（１００〜５００ｍｇ）を有するヌードマウスに二重特異性抗体ｈＭＮ−１４×ｍ６７９（１．５×１０−１０ｍｏｌ）を注入した。１１１Ｉｎ標識ペプチド（８．８μＣｉ，１．５×１０−１１ｍｏｌ）を注入する前に、２４時間にわたって抗体を除去した。注入後３、２４、４８時間の時点で動物を犠牲にした。
ｈＭＮ−１４×ｍ６７９でプレターゲッティングしたマウスにおけるペプチドの生体分布試験の結果を表１にて示す。プレターゲッティング試験におけるペプチドの腫瘍と非腫瘍との比率を表２にて示す。
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ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（配列番号２）（ＩＭＰ ２３７）およびＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（配列番号３）（ＩＭＰ ２４１）の血清安定性：
ペプチドの標識およびＨＰＬＣ分析
ペプチド、ＩＭＰ ２３７およびＩＭＰ ２４１を、Karacay et. al. Bioconjugate Chem. 11: 842-854 (2000)により記載されている手順にしたがって標識した。ペプチド、ＩＭＰ ２４１（０．００１９ｇ）を０．５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ（ｐＨ５．５，５８７μｌ）に溶かした。１．７μＬアリコートのペプチド溶液を０．５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ（ｐＨ５．５，１６５μｌ）で希釈した。１０μＬの１１１Ｉｎ（１．８ｍＣｉ）をペプチド溶液に添加し、混合物を沸騰水浴中で３０分間加熱した。
標識ペプチドを、Ｗａｔｅｒｓ ８×１００ｍｍ ｒａｄｉａｌ−ｐａｋ、ｎｏｖａ−ｐａｋ Ｃ−１８ ＲＣＭカートリッジカラムを用いてＨＰＬＣにより分析した。カラムを３ｍＬ／分にて、１００％（水中０．１％ＴＦＡ）から開始され、１００％（９０％アセトニトリルおよび１０％水中０．１％ＴＦＡ）までの直線勾配を用いて１０分かけて溶出した。この標識において約６％の遊離１１１Ｉｎがカラムの空隙容量に溶出した（１．６分）。また、５分および６．６〜８分にも１１１Ｉｎ標識されたピークが得られた。１１１Ｉｎ標識ペプチドは８．８分に単一のピークとして溶出した。１１１Ｉｎ ＩＭＰ ２３７のＨＰＬＣプロフィールは１１１Ｉｎ ＩＭＰ ２４１とほとんど同じであった。
血清安定性
アリコート（３０μＬ）の１１１Ｉｎ ＩＭＰ ２４１を３００μＬの新鮮なマウス血清に入れ、３７℃のインキュベーター内に置いた。ペプチドはＨＰＬＣにより上記のようにモニタリングした。
アリコート（２４μＬ）の１１１Ｉｎ ＩＭＰ ２３７を２３０μＬの新鮮なマウス血清に入れ、３７℃のインキュベーター内に置いた。ペプチドはＨＰＬＣにより上記のようにモニタリングした。
この分析では、マウス血清中、３７℃にて２２時間加熱した後に、１１１Ｉｎ ＩＭＰ ２４１がわずかに分解を受けた（〜５％）可能性が示された。１１１Ｉｎ ＩＭＰ ２３７は３７℃にて２２時間インキュベートした後、保持時間の短いピークに約７０％変化した。
結論：
ＩＭＰ ２４１ペプチド中のＤ−チロシンは、ＩＭＰ ２３７と比べてマウス血清中でのペプチドの分解が遅い。
ＩＭＰ ２３７とＩＭＰ ２４１とのin vivo安定性の比較
１１１Ｉｎ ＩＭＰ ２３７と１１１Ｉｎ ＩＭＰ ２４１とのin vivo安定性を、３０分および６０分の時点でマウス由来の尿サンプルを（ＨＰＬＣにより）試験して比較した。ペプチド、ＩＭＰ ２４１およびＩＭＰ ２３７を上記のように１１１Ｉｎ−１１１標識した。
標識ペプチドをＢａｌｂ／ｃマウスに注入し、これらのマウスを各時点に１マウスを使用して、ペプチドの注入後３０分および６０分の時点で犠牲にした。それに伴うＨＰＬＣトレースでは、１１１Ｉｎ ＩＭＰ ２４１は無傷で排出されたが、１１１Ｉｎ ＩＭＰ ２３７は１１１Ｉｎ標識された新たなペプチドにほぼ完全に代謝されたことを示している。
結論
ペプチド主鎖でのＴｙｒのＤ−Ｔｙｒとの置換によりin-vivoにおけるペプチドの代謝を最小化した。
他のin vivo試験
ＧＷ−３９ヒト結腸腫瘍異種移植片（１００〜５００ｍｇ）を有するヌードマウスに二重特異性抗体ｍＭｕ−９×ｍ６７９（１．５×１０−１０ｍｏｌ）を注入した。１１１Ｉｎ標識ペプチド（８．８μＣｉ，１．５×１０−１１ｍｏｌ）を注入する前に４８時間、抗体を除去してもかまわない。注入後３、２４、４８時間の時点で動物を犠牲にした。
ｍＭＵ−９×ｍ６７９でプレターゲッティングしたマウスにおけるペプチドの生体分布試験の結果を表３にて示す。プレターゲッティング試験におけるペプチドの腫瘍と非腫瘍との比率を表４にて示す。表５のデータは、二重特異性抗体で前処理していないマウスにおけるペプチドの生体分布を示している。
Figure 0004455322
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実施例４）ペプチド抗原の合成
ペプチド、Ａｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−ＯＨ（配列番号２）を、固相合成用樹脂を使用し、最初の残基（リジン）を、示差的に保護した誘導体、α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨとして樹脂に付着させて構築する。α−Ｆｍｏｃ保護基を選択的に除去し、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＢｕｔ）、α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨを、カップリングとα−アミノ基脱保護の交互サイクルで添加する。次いで、Ａｌｏｃ−およびＯＢｕｔ−側鎖保護基を、ＴＦＡと反応させて除去し、遊離α−およびε−アミノ基を無水酢酸との反応によりキャップし、Ａｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−ＯＨ（配列番号２）を得る。
実施例５）Ａｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−ＯＨ（配列番号２）のＫＬＨへのカップリング
水に溶かし、１Ｎ ＨＣｌで４．０にｐＨを調整した、ペプチド、Ａｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−ＯＨ（配列番号２）を、１モル等量の１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドで処理し、４℃にて１時間反応させる。ｐＨ ８．５にて緩衝化したキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を１００倍モル過剰の活性化ペプチドで処理し、共役反応を４℃にて１時間進行させる。ペプチド−ＫＬＨ複合体をサイズ排除クロマトグラフィーにより未反応のペプチドから精製し、抗体産生に使用する。
実施例６）抗ペプチドＡｂの作製
正常な免疫能を有するマウスに、完全フロイントアジュバント中のペプチド抗原混合物を注入する。不完全フロイントアジュバントと混合したペプチドの２回の追加抗原注射を、次の数週間の間に投与する。脾臓細胞を動物から採取し、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と融合させる。得られたクローンの培養上清を、ＥＬＩＳＡにより、元来のペプチド免疫原でコーティングしたプレートを使用して、抗ペプチド反応性について分析する。融合細胞系を選択できるよう酵素欠損ハイブリドーマを単離し、選択したクローンを培養培地で増殖させ、抗ペプチドＡｂを産生させる。
実施例７）抗ペプチドＡｂの精製
抗ペプチドＡｂは、ＩｇＧ画分を単離するためにプロテインＡカラムを、次いで、所望の生成物を清浄するためにイオン交換カラムを使用して、クロマトグラフィーにより精製される。目的のＡｂは、目的のペプチドを活性化ビーズまたは樹脂に化学的にカップリングさせることにより調製した、固相支持体に結合した該ペプチドからなるアフィニティーカラムの使用により最終的に精製される。
実施例８）抗ペプチドＡｂのＦ（ａｂ’） ２ への消化
抗ペプチドＡｂを、２００μｇ／μＬのペプシンとともにｐＨ ４にて１時間インキュベートし、未消化のＩｇＧを除去するためにプロテインＡのタンデムカラムを、次いで、低分子量混入物質を除去するためにＧ−５０−Ｓｅｐｈａｄｅｘにより精製する。
実施例９）抗ペプチド−ＡｂのＦａｂ’−ＳＨへの還元
抗ペプチド−Ｆ（ａｂ’）２を、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する新しく調製した０．１Ｍ ＰＢＳ中システイン溶液との反応によりＦａｂ’フラグメントに還元する。反応の進行は、ＨＰＬＣにより追跡し、約１時間で完了すると、Ｆａｂ’−ＳＨをスピンカラムクロマトグラフィーにより精製し、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有するｐＨ＜５の脱酸素緩衝液に入れて貯蔵する。
実施例１０）抗ＣＥＡ−ＩｇＧのマレイミド部分への酸化的カップリング
抗ＣＥＡ Ａｂ ＩｇＧを、暗所において、１０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムとの４℃にて９０分間の反応により酸化する。酸化Ａｂをスピンカラムクロマトグラフィーにより精製し、過剰の架橋剤４−（４−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）と混合する。反応を２時間進行させ、ＩｇＧ−ヒドラゾン−マレイミドをスピンカラムクロマトグラフィーにより精製する。ヒドラゾン結合を、１０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムとの反応により還元し、再精製する。
実施例１１）抗ＣＥＡ−ＩｇＧ×抗ペプチド−Ｆａｂ’二重特異性Ａｂの調製
実施例１０）のＩｇＧ−ヒドラジド−マレイミドを、実施例６で調製した等モル量の抗ペプチドＦａｂ’−ＳＨにより、ｐＨ ６．０、室温にて３０分間で処理する。残りの遊離チオール基はヨードアセトアミドとの３０分間の反応によりブロックする。二重特異性Ａｂ抗ＣＥＡ−ＩｇＧ×抗ペプチド−Ｆａｂ’を、未反応のＦａｂ’を除去するためにサイズ排除クロマトグラフィーにより、次いで、ＩｇＧ×Ｆａｂ’を未反応のＩｇＧから分離するために固相に結合したペプチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。
実施例１２）Ａｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−ＮＨ ２ （配列番号２）の合成
ペプチド、Ａｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−ＮＨ２（配列番号２）を、固相合成用樹脂を使用し、最初の残基（リジン）を、示差的に保護した誘導体、α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨとして該樹脂に付着させて構築する。α−Ｆｍｏｃ保護基を選択的に除去し、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＢｕｔ）、α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨを、カップリングとα−アミノ基脱保護の交互サイクルで添加する。Ａｌｏｃ側鎖をパラジウム（０）触媒との反応により除去する。別法として、ＴＦＡとの反応により除去され得るＢｏｃ保護基を使用してもよく、遊離アミノ基を過剰のＩＴＣ−Ｂｚ−ＤＴＰＡと反応させる。過剰のＢｚ−ＤＴＰＡを除去した後、α−アミノ基を無水酢酸との反応によりキャップし、ＴＦＡを用いて樹脂から全ペプチドを取り外し（チロシル残基の脱保護を伴う）、Ａｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−ＮＨ２を得る。
実施例１３）Ｙ−９０によるＡｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−ＮＨ ２ （配列番号２）の放射性標識
１００倍モル過剰の標題のペプチドを、ｐＨ ５．５の酢酸緩衝液中のイットリウム−９０放射性核種と混合する。放射性標識は３０分後に完了し、定量的である。
実施例１４）カルボキシルエステラーゼのジ−ＤＴＰＡ−ペプチドへの結合
ｐＨ ８．０の０．２Ｍリン酸緩衝液中カルボキシルエステラーゼ（５ｍｇ）を、５倍モル過剰の架橋剤スルホ−スクシンイミジル−［４−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）で処理する。２時間室温にて撹拌した後、Ｇ−２５ Ｓｅｐｈａｄｅｘのスピンカラムを使用して活性化酵素を低分子量混入物質から分離し、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有するｐＨ７の０．１Ｍリン酸緩衝液中で平衡化させる。テトラペプチド、Ｎ−アセチル−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ２（配列番号１１）（１０倍モル過剰）を活性化酵素に添加し、スピンカラムに使用したのと同じ緩衝液に溶かす。室温にて１時間撹拌した後、Ｃｙｓ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ２（配列番号１１）ペプチドカルボキシルエステラーゼ複合体を、ｐＨ ６．０の０．２５Ｍ酢酸緩衝液によるＧ−２５ Ｓｅｐｈａｄｅｘでのスピンカラムクロマトグラフィーにより未反応のペプチドから精製する。結合の成功は複合体のアリコートのインジウム−１１１での標識およびサイズ排除ＨＰＬＣによる分析により立証される。
実施例１５）ＲＡＩＴに向けた抗ＣＥＡ−ＩｇＧ×抗ペプチド−Ｆａｂ’二重特異性Ａｂの使用
ＣＥＡを発現している腫瘍を有する患者に、抗ＣＥＡ−ＩｇＧ×抗ペプチド−Ｆａｂ’二重特異性Ａｂを施与する。７日後、患者に（実施例１３の）Ｙ−９０−ジ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ−ペプチドを施与する。Ｙ−９０標識ペプチドは、非標的組織から迅速にクリアリングされるが、抗ＣＥＡ−ＩｇＧ×抗ペプチド−Ｆａｂ’二重特異性Ａｂでプレターゲッティングした部位に集中して局在し、腫瘍を破壊する。
実施例１６）ガラクトース−ＷＩ２−Ｆａｂ’クリアリング剤の調製
ＷＩ２と称される、ＭＮ−１４に対する抗イディオタイプＡｂを、実施例８で概略を示したように、ペプシンを使用してＦ（ａｂ’）２フラグメントに消化する。Ｆ（ａｂ’）２を、実施例９で概略を示したように、低分子量チオールを使用してＦａｂ’フラグメントに還元する。還元終了時に、Ｆａｂ’−ＳＨをスピンカラムクロマトグラフィーにより精製し、過剰のヨードアセトアミドと反応させ、ヒンジ領域のチオール基をブロックし、再結合を防止する。過剰のヨードアセトアミドからの再精製後、Ｆａｂ’を４００倍モル過剰のガラクトシル化剤、シアノメチル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドのチオ−イミデート（Karacay et al.を参照）と反応させる。ガラクトシル化タンパク質を２つのスピンカラムにより精製し、ガラクトース：Ｆａｂ’比をＭＡＬＤＩ−ＭＳにより決定する。
実施例１７）ｂｓＡｂクリアリング工程での、ＲＡＩＴに向けた抗ＣＥＡ−ＩｇＧ×抗ペプチドＦａｂ’二重特異性Ａｂの使用
ＣＥＡを発現している腫瘍を有する患者に、抗ＣＥＡ−ＩｇＧ（ＭＮ−１４）×抗ペプチド−Ｆａｂ’二重特異性Ａｂを施与する。３日後、患者にクリアリング用量のガラクトース−ＷＩ２−Ｆａｂ’を施与する。クリアリング用量のガラクトース−ＷＩ２−Ｆａｂ’施与から２４時間後、患者にＹ−９０−ジ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ−ペプチドを施与する。Ｙ−９０標識ペプチドは、非標的組織から迅速にクリアリングされるが、抗ＣＥＡ−ＩｇＧ×抗ペプチド−Ｆａｂ’二重特異性Ａｂでプレターゲッティングした部位に集中して局在し、腫瘍を破壊する。
実施例１８）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ ２ （配列番号７）（ＩＭＰ １９２）の合成
最初のアミノ酸、Ａｌｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを、ペプチド合成装置の０．２１ｍｍｏｌのリンクアミド樹脂に付着させ、次いで、標準Ｆｍｏｃ自動合成プロトコールを使用してリジンの側鎖にＴｃ−９９ｍリガンド結合残基、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨおよびＴｓｃＧの付加を行い、次のペプチド、Ａｌｏｃ−Ｌｙｓ（ＴｓｃＧ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−リンク樹脂を形成した。次いで、Ａｌｏｃ基を、１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２、０．７５ｍＬの氷酢酸および２．５ｍｌのジイソプロピルエチルアミンに溶かした、１００ｍｇのＰｄ［Ｐ（Ｐｈ）３］４を含有する溶液８ｍＬで樹脂を処理することにより除去した。次いで、樹脂混合物を０．８ｍｌの水素化トリブチルスズで処置し、６０分間ボルテックス混合した。次いで、ペプチド合成を合成装置で続け、次のペプチド、Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ−）−リンク樹脂（配列番号７）を作製した。１０ｍＬのＤＭＦ、３ｍＬの無水酢酸および６ｍＬのジイソプロピルエチルアミンを含有する溶液８ｍＬを添加して樹脂を６０分間ボルテックス混合することによりＮ末端をアセチル化した。次いで、側鎖Ａｌｏｃ保護基を上記のように除去し、標準Ｆｍｏｃ脱保護プロトコールを使用して樹脂をピペリジンで処理し、樹脂に残った全ての酢酸を除去した。
活性化ＤＴＰＡおよびＤＴＰＡ付加：
ＤＴＰＡ５ｇを、メタノール中１．０Ｍ水酸化テトラブチルアンモニウム４０ｍＬに溶かした。メタノールを高真空下で除去し、粘性のオイルを得た。オイルを５０ｍＬ ＤＭＦに溶かし、揮発性溶媒をロータリーエバポレーターにより高真空下にて除去した。ＤＭＦ処理をあと２回繰返した。次いで、粘性あるオイルを５０ｍｌ ＤＭＦに溶かし、５ｇ ＨＢＴＵと混合した。次いで、８ｍｌアリコートの活性化ＤＴＰＡ溶液を樹脂に加え、これを１４時間ボルテックス混合した。ＤＴＰＡ処理は、樹脂が、カイザー試験によってアミンについて試験陰性と判定されるまで繰返した。別法として、ＤＴＰＡ テトラ−ｔ−ブチルエステルをＤＩＣおよびＨＢＴＵなどの通常のカップリング剤とともに使用してもよい(Arano Y, Uezono T, Akizawa H, Ono M, Wakisaka K, Nakayama M, Sakahara H, Konishi J, Yokoyama A., "Reassessment of diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) as a chelating agent for indium-111 labeling of polypeptides using a newly synthesized monoreactive DTPA derivative," J Med Chem. 1996 Aug 30; 39 (18): 3451-60を参照)。
切断および精製：
次いで、ペプチドを、３０ｍｌ ＴＦＡ、１ｍｌトリイソプロピルシラン、および１ｍｌエタンジチオールから作製した溶液８ｍｌでの６０分間の処理により樹脂から切断した。未精製の切断ペプチドを３０ｍｌのエーテルに注ぐことにより沈殿させ、遠心分離により回収した。次いで、４×３０ｃｍ Ｗａｔｅｒｓ 分取Ｃ−１８ Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋカラム（１５μｍ、１００Å）を使用する逆相ＨＰＬＣによりペプチドを精製した。ＨＰＬＣ画分を回収し、凍結乾燥させ、ＥＳＭＳにより所望の生成物を含む画分（ＭＨ±１５９０）を得た。
キットの調製：
ペプチドを、７８μｇのペプチド、０．９２ｍｇの非放射性ＩｎＣｌ３、１００μｇの塩化第一スズ、３ｍｇのゲンチジン酸、およびＨＰＣＤ（再構成時に１０％）を含む凍結乾燥キットに配合した。
実施例１９）Ｔｃ−９９ｍでの標識および安定性
ＩＭＰ １９２キットは、２５ｍＣｉ Ｎａ９９ｍＴｃＯ４を含有する１．５ｍＬ生理食塩水でバイアルの内容物を再構成することにより標識した。キットを室温にて１０分間インキュベートした後、沸騰水浴中で１５分間加熱した。次いで、標識ペプチドの溶液を室温まで冷却した。アリコートを安定性試験用に取り出した。アリコートを生理食塩水、ｐＨ ７．５の０．０５Ｍリン酸塩中１ｍＭシステイン、および新鮮なヒト血清で１：１０希釈した。最初のキット溶液、生理食塩水希釈物およびシステイン攻撃液は室温でインキュベートし、一方、血清サンプルは３７℃でインキュベートした。サンプルはＨＰＬＣおよびＩＴＬＣによりモニタリングした。標識ペプチドはin vitroでの試験で安定していた。血清中の標識ペプチドの保持時間は６．３分から７．３分に変化した。この変化はいくつかの血清成分のペプチドとのイオン対形成に起因し得る。
Figure 0004455322
実施例２０）ｈＭＮ−１４×７３４（Ｆａｂ×Ｆａｂ）の調製
このｂｓＡｂは、実施例８と同様に、ｈＭＮ−１４Ｆａｂ’ＳＨ（ヒト化モノクローナル抗ＣＥＡ抗体）および７３４Ｆａｂ’ｍａｌ（ネズミ抗ジＤＴＰＡ）フラグメントを架橋することにより調製した。ｈＭＮ−１４および７３４のＦａｂ’ＳＨフラグメントは、１０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下、１０ｍＭ ２−メルカプトエチルアミンを用いて、ｐＨ ７．３、３７℃にて６０分間、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを還元することにより調製した。スピンカラム（Ｐｅｎｅｆｓｋｙ）精製（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０−８０、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ５．３）後にＦａｂ’ＳＨを回収した。４ｍＭ Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドを使用して、室温にて６０分間、７３４Ｆａｂ’ＳＨフラグメントにマレイミド基（群）を導入した。スピンカラム精製を使用して、Ｆａｂ’ｍａｌを単離した。７３４Ｆａｂ’ｍａｌおよびｈＭＮ−１４Ｆａｂ’ＳＨの架橋を、１：１のモル比において、４℃にて１６時間進行させた。この間に形成され得るジスルフィド結合を破壊するために、反応混合物を１０ｍＭ ２−メルカプトエチルアミンでｐＨ ５．３、２３℃にて１時間処理した。ＳＨ基をｐＨ ６．４にてＮ−エチルマレイミドを用いてブロックした。反応混合物をスピンカラムに通し、過剰の小分子量化合物を除去した。次いで、サイズ排除ＨＰＬＣ分析用カラム、Ｂｉｏ−Ｓｉｌ ＳＥＣ−２５０で精製した後にｂｓＡｂを単離した。精製したｂｓＡｂのＨＰＬＣ保持時間は１０．２３分であった。
実施例２１）ＨＰＬＣ結合試験
ｂｓＡｂをクロラミンＴを使用して放射性ヨウ化物にした(Greenwood and Hunter)。放射性ヨウ化ｂｓＡｂの、ＣＥＡ、ＷＩ２（ラット抗ＭＮ−１４イディオタイプ抗体）および放射性標識ペプチジルＤＴＰＡキレートとの結合を、サイズ排除ＨＰＬＣ分析により調べた。１０〜２０倍モル過剰のＣＥＡで処理した場合、約９０％の放射性ヨウ化ｂｓＡｂがＣＥＡと結合した。ｂｓＡｂは放射性標識インジウム−ＤＴＰＡキレートと複合体を形成した（ＩＭＰ−１５６またはＩＭＰ−１９２）：
ＩＭＰ １５６：Ａｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ２（配列番号２）。
実施例２２）血清安定性
放射性ヨウ化ｂｓＡｂを、加湿５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃にて、新鮮なヒト血清中での安定性について試験した。アリコートをＳＥ−ＨＰＬＣにより調べた。血清タンパク質と結合した放射性ヨウ素を検出するために、アリコートをＷＩ２と混合し、ｂｓＡｂピークをより早期の保持時間に変化させた。ｂｓＡｂは、血清中で４８時間インキュベートした後に、ＷＩ２に対する結合能の３〜５％の減少を示した。ｂｓＡｂを血清中で７２時間インキュベートした場合には、わずかな凝集物の形成（４〜７％）が観察された。
実施例２３）９９ｍ−Ｔｃ−ＩＭＰ−１９２
このペプチジルキレートのＴｃ−９９ｍ複合体のin vitroにおける安定性は、生理食塩水、新鮮なヒト血清および１０ｍＭシステイン中での最大２０時間のインキュベーションにより確立した。in vivoにおける安定性は、プレターゲッティング試験において９９ｍ−Ｔｃ−ＩＭＰ−１９２を注入したマウスから採取した尿を分析して調べた。尿中に排出された活性は、ＳＥ−ＨＰＬＣにより示されるように活性が依然として抗体と結合するから、無傷ペプチドであるのように思われる。正常なＢＡＬＢ／ｃマウスでの９９ｍ−Ｔｃ−ＩＭＰ−１９２の生体分布試験では、迅速な血液クリアランスが示された、表７。in vitroおよびin vivoでの試験により、９９ｍ−Ｔｃ−ＩＭＰ−１９２の安定性が明示される。
Figure 0004455322
実施例２４）ｈＭＮ１４Ｆａｂ−７３４ｓｃＦｖの構築および発現
組換え法を使用して、ヒト化モノクローナル抗ＣＥＡ抗体由来のＦａｂフラグメントおよびネズミ抗ジＤＴＰＡ由来のｓｃＦｖを含む一価の二重特異性融合タンパク質を作製した。図３参照。単鎖７３４（７３４ｓｃＦｖ）の構造はＧＧＧＳ（配列番号１０）−ＶＬ−（ＧＧＧＧＳ） ３ （配列番号９）−ＶＨとして設計され、近位のＧＧＧＳ（配列番号１０）は、ｓｃＦｖがｈＭＮ−１４の重鎖の定常領域に連結するためのフレキシブル結合を提供する（図１）。また、ｓｃＦｖはｈＭＮ−１４の軽鎖の定常領域に連結することができる。ｈＭＮ−１４重鎖Ｆｄの７３４ｓｃＦｖへのインフレーム連結に必要である好適なリンカー配列を、特異的プライマーセットを使用するＰＣＲ反応により７３４のＶＬおよびＶＫドメインに導入した。
７３４ＶＬのＰＣＲ増幅を、プライマーセット、７３４ＶＬｓｃＦｖ５’（Ｃｙｓ）および７３４ＶＬｓｃＦｖ３’（このようなプライマーについてのポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列は、その全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる１９９９年６月２２日出願の米国特許出願番号第０９／３３７，７５６号で示され、記述されている）を使用して実施した。プライマー７３４ＶＬｓｃＦｖ５’（Ｃｙｓ）は、短いフレキシブルリンカー、ＧＧＧＳ（配列番号１０）を介して７３４ＶＬの最初の６残基（ＱＬＶＶＴＱ）（配列番号１３）にインフレーム連結した、ヒトＩｇＧ１ヒンジの最初の４残基（ＰＫＳＣ）（配列番号１２）をコードしているセンス鎖配列を示す。ｈＭＮ−１４重鎖Ｆｄ−７３４ｓｃＦｖ融合物とｈＭＮ−１４軽鎖との鎖間ジスルフィド結合に必要であることから、ヒトヒンジの１つのシステインが含められた。ＣＨ１ドメインとヒンジを連結しているイントロン配列での連結を容易にするためにＰｓｔＩ部位を組み込んだ。プライマー７３４ＶＬｓｃＦｖ３’は、７３４ＶＬドメインの最後の６残基（ＴＫＬＫＩＬ）（配列番号１４）およびＶＬドメインの下流にインフレーム融合されたフレキシブルリンカー配列の一部（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧ）（配列番号１５）をコードしているアンチセンス配列を示す。
ＰＣＲ増幅後、増幅産物（〜４００ｂｐ）を最初にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理してＰＣＲ増幅中に末端に付加した余分な「Ａ」残基を除去し、続いてＰｓｔＩで消化した。得られた産物はＰｓｔＩオーバーハングおよび平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡ断片であった。７３４ＶＨのＰＣＲ増幅は、プライマーセット、７３４ＶＨｓｃＦｖ５’および７３４ＶＨｓｃＦｖ３’（Ｓａｃ１）を使用して実施した。プライマー、７３４ＶＨｓｃＦｖ５’（特許番号第０９／３３７，７５６号明細書を参照）は、ＶＬおよびＶＨ配列を連結しているフレキシブルリンカー配列（ＳＧＧＧＧＳ）（配列番号１６）の残りの部分および７３４ＶＨドメインの最初の６残基（ＥＶＫＬＱＥ）（配列番号１７）をコードしているセンス鎖配列を示す。プライマー、７３４ＶＨｓｃＦｖ３’（Ｓａｃ１）（特許番号第０９／３３７，７５６号明細書を参照）は、７３４ＶＨの最後の６残基（ＴＶＴＶＳＳ）（配列番号１８）をコードしているアンチセンス配列を示す。また、翻訳終止コドンも含まれる。サブクローニングを容易にするために終止コドンの下流に制限部位Ｅａｇ１およびＳａｃ１を組み込んだ。同様に、〜４００ｂｐのＰＣＲ増幅ＶＨ産物を最初にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理してＰＣＲ産物の末端にある余分な「Ａ」残基を除去し、次いで、Ｓａｃ１で消化し、平滑末端−付着末端立体配置を有するＶＨ ＤＮＡ断片を得る。
ヒトＩｇＧ１ゲノム配列のＳａｃＩＩ断片を含むｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ(Stratagene, La Jolla)ベースのステージングベクター（ＨＣ１ｋｂｐＳＫ）を構築した。ゲノムＳａｃＩＩ断片は、部分的５’イントロン、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン、ＣＨ１をヒンジに連結しているイントロン配列、ヒンジ配列、ヒンジをＣＨ２ドメインに連結しているイントロン配列、およびＣＨ２ドメインの一部を含む。ＨＣ１ｋｂｐＳＫ内のヒンジおよびＣＨ２ドメインの一部を含むセグメントをＰｓｔＩ／Ｓａｃ１消化により取り出し、作成したクローニング部位を使用して、以上で調製したＶＬ（ＰｓｔＩ／平滑）およびＶＨ（平滑／Ｓａｃ１）ＰＣＲ産物を同時に連結した。
得られた構築物（ＣＨ１−７３４ｐＳＫ）のＣＨ１ドメインをイントロンを介して７３４ｓｃＦｖ遺伝子配列に連結する（図４）。ＩｇＧ１のゲノムＳａｃＩＩ断片は、ＣＨ１ドメインにフランキングする５’イントロン配列の一部しか含んでいないため、残りのイントロン配列をＢａｍＨ１／ＳａｃＩＩセグメントとしてＣＨ１−７３４ｐＳＫの対応する部位に挿入して、全イントロン配列を再構築した。次いで、全５’イントロン、ＣＨ１ドメイン、連結イントロン、５ヒンジ残基、短いＧＧＧＳリンカー（配列番号１０）、および７３４ｓｃＦｖ配列を含むＢａｍＨ１／Ｅａｇ１断片を単離し、それを使用して、ｈＭＮ−１４ｐｄＨＬ２ベクターのヒトゲノムＩｇＧ１定常配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ／Ｅａｇ１セグメントと置換した。一方の末端にＢａｍＨ１オーバーハング、もう一方の末端にＨｉｎｄＩＩＩオーバーハングを有するＨＮＢリンカー（特許番号第０９／３３７，７５６号を参照）を使用し、ｈＭＮ−１４ｐｄＨＬ２ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥａｇＩ部位へのＢａｍＨ１／Ｅａｇ１断片の連結を容易にした。得られたベクターはｈＭＮ−１４−７３４ｐｄＨＬ２と称され、二重特異性タンパク質発現に向けて哺乳類細胞をトランスフェクトするのに使用できる。
ｈＭＮ−１４ｐｄＨＬ２ベクターは、これまでに記載されているベクター、ｐｄＨＬ２から誘導した。Losman et al., Cancer Supplement, 80: 2660, 1997を参照。ｈＭＮ−１４ｐｄＨＬ２の構築は、標準的な分子生物学技術を使用し、ｈＬＬ２ｐｄＨＬ２のＶＨおよびＶＫドメインをｈＭＮ−１４のものと置換することにより実施した（図５）。ｈＭＮ−１４−７３４ｐｄＨＬ２ベクターをエレクトロポレーションによりＳＰ２／０細胞にトランスフェクトし、ｂｓＡｂを分泌している細胞クローンを同定した。プロテインＬカラム(Pierce, Rockford, IL)により細胞培養物上清（クローン３４１．１Ｇ６）から精製したｂｓＡｂは、７５ｋＤタンパク質（アミノ酸配列計算に基づく）であり、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥではおそらく二次構造から６６ｋＤマーカーと同時に移動したのであろう（図２、レーン２）。還元条件下では、重鎖（５０ｋＤ）および軽鎖（２５ｋＤ）に対応するバンドが観察された（図２、レーン４）。プロテインＬがヒト、マウスおよびラットのκ軽鎖と結合するため、トランスフェクトーマにより分泌されたκ鎖モノマー（２５ｋＤ）およびダイマー（５０ｋＤ）も同時精製された（図２、レーン２）。κモノマーおよびダイマーからのｂｓＡｂのさらなる分離はイオン交換クロマトグラフィーにより達成される。精製ｈＭＮ−１４Ｆａｂ−７３４ｓｃＦｖは、ＣＥＡおよびＩｎ−ＤＴＰＡ−ＢＳＡの両方との用量依存的な特異的結合を示す。
実施例２５）乳汁でのｂｓｃＡｂのトランスジェニックによる産生
ｂｓｃＡｂフラグメントを、挿入部位にフランキングする５’カゼインプロモーター配列および３’非翻訳ゲノム配列を有する発現ベクターにクローニングする。次いで、当技術分野では標準的な手順を使用して、発現カセットを受精したマウス卵子の前核に注入する。次いで、卵子を受容体である雌の子宮に移植し、懐胎させる。出産後、その子孫をサザン解析により導入したＤＮＡの存在についてスクリーニングする。当技術分野では公知の標準的な免疫学的方法を使用し、トランスジェニック雌由来の乳汁をｂｓｃＡｂの存在および機能性について解析する。ｂｓｃＡｂは固定化抗原との相補的結合、カラムクロマトグラフィーまたは当技術分野では公知の他の方法により乳汁から精製することができる。
実施例２６）植物でのｂｓｃＡｂのトランスジェニックによる産生
ｂｓｃＡｂフラグメントを、ソラマメ(Vicia faba)由来の短縮レグミンＢ４プロモーターと５４塩基対のＬｅＢ４非翻訳ＲＮＡリーダーを有し、ＬｅＢ４シグナルペプチドをコードしている発現ベクターにクローニングし、タンパク質を小胞体に指向させる。Zambryski et al.により記載された方法に従い、アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介性遺伝子導入を使用して、発現カセットをタバコリーフディスクに形質転換する。形質転換はサザン解析により確認する。当技術分野では公知の標準的な免疫学的方法を使用し、トランスジェニック植物をｂｓｃＡｂの存在および機能性について解析する。ｂｓｃＡｂは当技術分野では公知の標準方法を使用して植物組織から精製することができる。
実施例２７）プレターゲッティング試験
ＧＷ３９腫瘍異種移植片を有する雌ヌードマウス（Taconic NCRNU、３〜４週齢）をプレターゲッティング試験に使用した。腫瘍は０．３〜０．８ｇであった。
Figure 0004455322
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９９ｍ−Ｔｃ−ＩＭＰ−１９２を注入した腫瘍結合ｂｓＡｂの有効なＤＴＰＡ結合部位の比率を、１つのペプチドが１つのｂｓＡｂ分子と結合すると仮定して上記のデータから算出した。しかし、１つのペプチド分子が２つのｂｓＡｂ分子と架橋することも可能である。
Figure 0004455322
上記の試験データより、ヒト化×ネズミｂｓＡｂがＣＥＡおよびインジウム−ＤＴＰＡとの結合能を保持すること、ｈＭＮ−１４×７３４（Ｆａｂ×Ｆａｂ）が腫瘍を効率的に標的化すること、二機能性ペプチジルＴｃ−９９ｍキレート剤が安定であること、９９ｍ−Ｔｃ−ＩＭＰ−１９２が腫瘍局在性のｈＭＮ−１４×７３４と複合体を形成し、少なくとも２４時間保持されること、および９９ｍ−Ｔｃ−ＩＭＰ−１９２注入後早い時点（１〜３時間）で腫瘍のイメージングが可能であることが示される。
実施例２８） ｂｓＡｂクリアリング工程での、ＲＡＩＴに向けた抗ＣＥＡ Ｆａｂ×抗ペプチドｓｃＦｖ融合タンパク質の使用
結腸癌を有する６９歳の男性が治癒を目的とする切除を受け、１年後にＣＥＡの血清レベルが５０ｎｇ／ｍＬであることが分かっている。その患者はＣＴスキャンを受け、１ｃｍ〜３ｃｍまでの５つの腫瘍病変が肝臓の左葉に存在している。その患者に１００ｍｇのｈＭＮ１４−Ｆａｂ／７３４−ｓｃＦｖ融合タンパク質を施与する。３日後、患者にクリアリング用量のガラクトース−ＷＩ２−Ｆａｂ’を施与する。クリアリング用量のガラクトース−ＷＩ２−Ｆａｂ’の２４時間後、血中の融合タンパク質はクリアリング剤の注入直前のタンパク質の濃度の２０倍減少する。次いで、患者に５０ｍＣｉのＹ−９０を含有するＩＭＰ ２４５ Ｙ−９０−ジ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ−ペプチドを注入する。３ヵ月後のＣＴスキャンの実施にて、３つの病変が消失し、残る２つのものは大きくなっていないことがはっきりと示されている。このときのＣＥＡの血清レベルは１０ｎｇ／ｍＬに減少している。その後の６ヶ月間、ＣＥＡの血清レベルの増加は見られず、ＣＴスキャンにて２つの腫瘍病変が成長していないことが明示されている。ＣＥＡの増加が観察される場合には１回目の治療の１年後にその治療を繰り返し行い、２回目の治療の３ヵ月および６ヵ月後に２つの腫瘍病変の大きさの縮小が認められている。６ヵ月後の血清ＣＥＡレベルは５ｎｇ／ｍＬ未満である。
実施例２９）カルボキシルエステラーゼ−ＤＴＰＡ複合体の調製
ウサギ肝臓カルボキシルエステラーゼ（SIGMA；タンパク質含量−１７ｍｇ）２バイアルを、２．２ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ７．７で再構成し、２５倍モル過剰のＣＡ−ＤＴＰＡと、新しく調製した、ＤＭＳＯ中の後者の原液（−２５ｍｇ／ｍｌ）を使用して混合する。複合体混合物中のＤＭＳＯの最終濃度は３％（ｖ／ｖ）である。１時間インキュベートした後、混合物を２つの５ｍＬスピンカラム（０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ ７．３中Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０／８０）で予備精製し、過剰の試薬およびＤＭＳＯを除去する。溶出液を０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ ６．８を使用し、４ｍｌ／分にてＴＳＫ ３０００Ｇ Ｓｕｐｅｌｃｏカラムで精製する。複合体を含む画分をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（商標）濃縮器で濃縮し、緩衝液を０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．５と交換する。回収：０．９ｍｌ、４．１１ｍｇ／ｍｌ（３．７ｍｇ）。標準条件を使用した分析用ＨＰＬＣによる分析およびインラインでのＵＶ検出の結果、保持時間９．３分の大きなピークと１０．８分の小さなピークが９５対５の比にて判明した。酵素解析では非修飾のカルボキシルエステラーゼに匹敵する１１５酵素単位／タンパク質ｍｇが示された。非修飾のＣＥおよびＤＴＰＡ修飾したＣＥ両方の質量分析（ＭＡＬＤＩモード）では１．５に近い平均ＤＴＰＡ置換比が示される。放射性インジウムでスパイクした既知の過剰のインジウムを使用した金属結合アッセイにより、二重試験にて、ＤＴＰＡ：酵素の比率が１．２４および１．４１であることが確認された。カルボキシルエステラーゼ−ＤＴＰＡを酢酸Ｉｎ−１１１で、１２．０ｍＣｉ／ｍｇの比活性にて標識した後、過剰の非放射性酢酸インジウムで処理し、最後に、１０ｍＭ ＥＤＴＡで処理し、過剰の非放射性インジウムを除去する。ＨＰＬＣおよびＩＴＬＣ分析による取込みは９７．７％である。ＨＰＬＣサンプルは２０倍モル過剰の二重特異性抗体ｈＭＮ−１４Ｆａｂ’×７３４Ｆａｂ’と完全に複合体を形成し、得られた生成物はさらに二重特異性抗体に対して８０倍モル過剰のＷＩ２（ｈＭＮ−１４に対する抗ＩＤ）と複合体を形成する。
実施例３０）ＩＭＰ ２２４の合成
０．０５９６ｇの量のフェニルヒドラジン含有ペプチド、ＩＭＰ ２２１（Ｈ２Ｎ−ＮＨ−Ｃ６Ｈ４−ＣＯ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ２ ＭＨ＋ １３２２、Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳにより作製）を３ｍＬのＤＭＦ中０．０２４５ｇの塩酸ドキソルビシンと混合した。この反応溶液を暗所において室温にて反応させた。４時間後、さらに０．０２６３ｇのＩＭＰ ２２１を添加し、反応を一晩続けた。次いで、全ての反応混合物を、Ｗａｔｅｒｓ Ｎｏｖａ−Ｐａｋ（３−４０×１００ｍｍセグメント、６μｍ、６０Å）プレップカラムで、８０：２０〜６０：４０ 緩衝液Ａ：Ｂ（緩衝液Ａ＝０．３％ＮＨ４ＯＡｃ、緩衝液Ｂ＝９０％ＣＨ３ＣＮ中０．３％ＮＨ４ＯＡｃ）の勾配を用いて４０分かけて溶出するＨＰＬＣにより精製した。生成物を含む画分を合わせ、凍結乾燥させ、０．０４５３ｇの所望の生成物を得た。これはＥＳＭＳによりＭＨ＋ １８４７と確認された。
実施例３１）ＩＭＰ ２２４キットの調製
実施例３１のペプチドをＩｎ−１１１標識用のキットに調合した。５．０１４ｇ ２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよび０．５９８ｇクエン酸を含有する８５ｍＬの溶液を調製した。1 Ｍ ＮａＯＨを添加してこの溶液をｐＨ ４．２０に調整し、水で１００ｍＬに希釈した。０．００１０ｇ量のペプチド、ＩＭＰ ２２４を１００ｍＬの緩衝液に溶かし、１ｍＬアリコートを０．２２μｍ Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ フィルターで滅菌濾過し、２ｍＬ凍結乾燥バイアルに入れた。これらはすぐに冷凍し、凍結乾燥させた。
実施例３２）ＩＭＰ ２２４キットのＩｎ−１１１での標識
Ｉｎ−１１１を０．５ｍＬの水に溶かし、凍結乾燥キットに注入した。キット溶液を室温にて１０分間インキュベートした後、０．５Ｍ ＮａＯＡｃおよび２．５６×１０−５Ｍ冷インジウムを含有するｐＨ７．２の緩衝液０．５ｍＬを添加した。
実施例３３）ＩＭＰ ２２４キットのin-Vitro安定性
ＩＭＰ ２２４キットを、記載されているように２．５２ｍＣｉのＩｎ−１１１で標識した。アリコート（０．１５ｍＬ、３７０μＣｉ）を回収し、０．９ｍＬ ０．５Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ４．０、０．９ｍＬ ０．５Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ ５．０、および０．９ｍＬ ０．５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ ７．５と混合した。標識ペプチドの安定性は、逆相ＨＰＬＣにより追跡した。ＨＰＬＣ条件：Ｗａｔｅｒｓ Ｒａｄｉａｌ−Ｐａｋ Ｃ−１８ Ｎｏｖａ−Ｐａｋ ８×１００ｍｍ、流速３ｍＬ／分、勾配：１０分かけて１００％Ａ＝０．３％ＮＨ４ＯＡｃ〜１００％Ｂ＝９０％ＣＨ３ＣＮ、０．３％ＮＨ４ＯＡｃ。
Figure 0004455322
実施例３４）ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＩＭＰ ２２１のin-vivo生体分布
キットを０．５ｍＬ水中４００μＣｉ Ｉｎ−１１１で再構成した。Ｉｎ−１１１キット溶液を室温にて１０分間インキュベートした後、冷インジウムを含有するｐＨ ７．２の０．５Ｍ酢酸緩衝液１．５ｍＬで希釈した。標識ペプチドを、飽和ＮａＣｌ中、ＩＴＬＣにより分析した。遊離したＩｎ−１１１はＩＴＬＣストリップの上部２０％の位置に存在した。
各マウスに１００μＬ（２０μＣｉ）のＩｎ−１１１標識ペプチドを注入した。１時間点当たり３匹の動物を使用し、３０分、１時間、２時間、４時間、および２４時間の時点で動物に麻酔をかけ、犠牲にした。血液、筋肉、肝臓、肺、腎臓、脾臓、大腸、小腸、胃、尿および尾部を集め、計数した。生体分布試験の結果を次の表にて示す。
Figure 0004455322
実施例３５）ＩＭＰ ２２４のin-vivo安定性およびクリアランス
キットを０．５ｍＬ水中４ｍＣｉ Ｉｎ−１１１で再構成した。Ｉｎ−１１１キットを室温にて１０分間インキュベートした後、冷インジウムを含有するｐＨ ７．２の０．５Ｍ酢酸緩衝液０．５ｍＬで希釈した。標識ペプチドを、飽和ＮａＣｌ中、ＩＴＬＣにより分析した。遊離したＩｎ−１１１はＩＴＬＣストリップの上部２０％の位置に存在した。
各マウスに１００μＬ（４００μＣｉ）のＩｎ−１１１標識ペプチドを注入した。１時間点当たり２匹の動物を使用し、３０分および１時間の時点で動物に麻酔をかけ、犠牲にした。ＨＰＬＣ分析に向け、血清および尿サンプルを集め、冷凍保存し、可能な限り早く冷凍して送った。尿サンプルのＨＰＬＣ（サイズ排除クロマトグラフィーによる）では、Ｉｎ−１１１標識ペプチドが依然として抗体と結合し得ることがわかった。逆相ＨＰＬＣ分析では、放射性標識ペプチドが尿中に無傷で排出されることがわかった。血清中に残っている活性の量はわずかであり、検出器の感度が低いために逆相ＨＰＬＣにより分析できなかった。ドキソルビシンは〜９５％肝胆汁性クリアランスである。よって、加水分解可能な様式でビスＤＴＰＡペプチドを付けることにより、薬剤の生体分布が〜１００％腎排泄が生じるように変更される。これにより、非標的化薬剤の全てが迅速に無傷なまま排出されるため薬剤の毒性がはるかに低いものとなる。
Figure 0004455322
実施例３６）ＩＭＰ ２２４およびＩＭＰ ２２５によるプレターゲッティング試験
１０μｇのペプチドを含有するＩＭＰ ２２４の凍結乾燥キットを使用した。キットを２ｍＬバイアルに入れて凍結乾燥させ、１ｍＬ滅菌水で再構成した。０．５ｍＬアリコートを取り出し、１．０ｍＣｉ Ｉｎ−１１１と混合した。Ｉｎ−１１１キット溶液を室温にて１０分間インキュベートした後、０．１ｍＬを取り出し、滅菌バイアルにて冷インジウムを含有する酢酸緩衝液ＢＭ８−１２、１．９ｍＬで希釈した。標識ペプチドを、飽和ＮａＣｌ中、ＩＴＬＣにより分析した。遊離したＩｎ−１１１はＩＴＬＣストリップの上部２０％の位置に存在した。
ＧＷ３９腫瘍異種移植片を有する雌ヌードマウス（Taconic NCRNU、３〜４週齢）をプレターゲッティング試験に使用した。腫瘍は０．３〜０．８ｇであった。各動物に１００μＬ（５μＣｉ、１５μｇ、１．５×１０−１０ｍｏｌ）のＩ−１２５標識抗体、Ｆ６×７３４−Ｆ（ａｂ’）２を注入した。
７２時間後、各マウスに１００μＬ（１０μＣｉ）のＩｎ−１１１標識ペプチドを注入した。１時間点当たり５匹の動物を使用し、１時間、４時間、および２４時間の時点で動物に麻酔をかけ、犠牲にした。腫瘍、血液、筋肉、肝臓、肺、腎臓、脾臓、大腸、小腸、胃、尿および尾部を集め、計数した。
１１μｇのペプチドを含有するＩＭＰ ２２５、Ａｃ−Ｃｙｓ（Ｄｏｘ−ＣＯＣＨ２）−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ２（配列番号１１）、ＭＮａ＋ １９３８）の凍結乾燥キットに関して、この試験を繰り返した。
Figure 0004455322
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本発明にて記載の二重特異性構築物または類似の特異性を有する他のものの組合せはプレターゲッティングするＲＡＩＴ（ここで、ＩＭＰ−１９２ペプチドおよびその類似体を１８８−Ｒｅ、２１３−Ｂｉ、６７−Ｃｕなどの治療用放射性同位元素で標識する）に好適である。治療用キレート剤は、以上で記述したように、ｂｓＡｂにより認識されるキレートエピトープ以外のものを有するペプチドと結合できることが確認される。
当然のことながら、同様に、検出可能な放射性標識は、種々のリンカーと組み合わせ、本発明のプレターゲッティング法を使用して、切除すべき、あるいは術中、内視鏡、血管内または他の類似の手順で検出および／または処置すべき目的の部位、例えば、腫瘍に向けることができる。プレターゲッティングは非放射性ｂｓＡｂを用いて行われ、最終的な低分子量放射性標識リンカーの投与および局在化ならびに結合していないリンカーのクリアランスはともに比較的迅速であり、不必要な遅れを避けるべき外科手術に適合し、半減期の短い放射性同位元素を使用できる。さらに、開示された治療法を手術後の放射免疫治療プロトコールに使用して残存する腫瘍細胞の根絶を確実に行うことができる。
実施例３７）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ ２ （配列番号１）（ＩＭＰ２４５）の合成
ＩＭＰ１９２の合成で記述したように、通常の二重カップリング手順によりペプチドを合成した。５当量の保護したＤＯＴＡを使用する１６時間のベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェ−ト（ＢＯＰ）のシングルカップリングにより、トリ−ｔ−ブチルＤＯＴＡをペプチドのＣ末端に付加した。次いで、無水酢酸を使用して樹脂をキャップした。パラジウム触媒を使用して側鎖にあるＡｌｏｃ基を除去し、ＩＭＰ ２４３の合成で記述したように、Ｎ−トリチル−ＨＳＧ基を付加した。生成物を樹脂から切断し、ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥後に４つの画分から０．２３８５ｇの生成物を得た。ＥＳＭＳ ＭＨ＋ １８３２。
実施例３８）Ｔｃ−９９ｍキットの調製
窒素パージを行った脱気水１７０ｍＬに溶かした２２．０９３ｇヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、０．４５ｇ ２，４−ジヒドロキシ安息香酸、０．２５７ｇ酢酸ナトリウム塩、および１０．８８９ｇ α−Ｄ−グルコヘプタン酸ナトリウム塩を含有する調合緩衝液を調製した。数滴の1 Ｍ ＮａＯＨを添加してこの溶液をｐＨ ５．３に調整した後、全量２２０ｍＬにさらに希釈した。スズ緩衝溶液は、０．２ｍＬのＳｎＣｌ２（２００ｍｇ／ｍＬ）を３．８ｍＬの調合緩衝液で希釈することにより調製した。ペプチド、ＩＭＰ ２４５（０．００２９ｇ）を０．１Ｍ ＨＣｌ中１．６×１０−３Ｍ ＩｎＣｌ３ １ｍＬに溶かした。ペプチド溶液を０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ２ｍＬと混合し、室温にて１５分間インキュベートさせた。次いで、調合緩衝液７５ｍＬおよびスズ緩衝液０．５２ｍＬをペプチド溶液に添加した。次いで、このペプチド溶液を０．２２μｍ Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ フィルターで濾過し、１．５ｍＬアリコートを３ｍＬ凍結乾燥バイアルに入れた。充填したバイアルはすぐに冷凍し、凍結乾燥させ、真空下にてクリンプシールを装着した。
実施例３９）ＩＭＰ２４５のＴｃ−９９ｍでの標識
高温（沸騰水浴）：
生理食塩水１．５ｍＬ中、過テクネチウム酸塩溶液（２９ｍＣｉ）をキットに添加した。キットを室温にて１０分間インキュベートし、沸騰水浴中で１５分間加熱した。キットは室温まで冷却した後に使用した。
低温（３７℃）：
生理食塩水１．５ｍＬ中、過テクネチウム酸塩溶液（２５ｍＣｉ）をキットに添加した。キットを室温にて１４分間インキュベートし、３７℃の水浴中で１８分間加熱した。キットは室温まで冷却した後に使用した。この標識でのＨＰＬＣ保持時間は別のインジェクターを使用したためにわずかに異なる。
実施例４０）ＩＭＰ２４５のペプチド分析（ＨＰＬＣ）
ペプチドを逆相ＨＰＬＣおよびサイズ排除ＨＰＬＣにより分析した（以下に示す）。サイズ排除ＨＰＬＣトレースにより、ペプチドが２つのｍＭｕ−９×ｍ６７９および２つのｈＭＮ−１４×ｍ６７９二重特異性抗体と結合することが示された（全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる"A Universal Pre-Targeting System for Cancer Detection and Therapy Using Bi-specific Antibodies," Sharkey, R. M., McBride, W. J., Karacay, H., Chang, K., Griffiths, G. L., Hansen, H. J., and Goldenberg, D. M.を参照）。逆相ＨＰＬＣ分析では、大きなピークの前にいくつかの小さなピークが示され、加熱による小さなピークと大きなピークとの比率の大きな変化はないように思われた。
ＳＥＣからの回収：
Ｔｃ−９９ｍ ＩＭＰ ２４５単独 ５４％、
Ｔｃ−９９ｍ ＩＭＰ ２４５＋ｈＭＮ−１４×ｍ６７９ ６６％、
Ｔｃ−９９ｍ ＩＭＰ ２４５＋ｍＭｕ−９×ｍ６７９ ６６％。
実施例４１）ＩＭＰ２４５の血清安定性
アリコートのＴｃ−９９ｍ ＩＭＰ ２４５、５０μＬを４７０μＬの新鮮なマウス血清で希釈し、３７℃にてインキュベートした。２．５時間および１９時間の時点でアリコートを取り出し、逆相ＨＰＬＣにより分析した。ペプチドは比較的安定しているように思われた。
実施例４２）ＩＭＰ ２４５の冷レニウムオキソ錯体の合成
レニウムオキソ錯体を、０．０５０４ｇのＩＭＰ ２４５を０．００４５ｇのＲｅＯＢｒ４Ｎ（ｂｕ）４（Cotton et. al.の方法により合成)および１ｍＬ ＤＭＦ中５０μＬ ＤＩＥＡと室温にて５日間混合することにより作製した。全ての反応混合物をＨＰＬＣにより精製し、０．０１１８ｇの所望の生成物を得た。
ＥＳＭＳ ＭＨ＋ ２０３１。
実施例４３）Ｔｃ−９９ｍキットの調製（ゲンチジン酸型）
ペプチド、ＩＭＰ ２４５（０．００２９ｇ、１．５８×１０−６ｍｏｌ）を０．００２０ｇのＩｎＣｌ３を含有するｐＨ ５．５の０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ緩衝液２．０ｍＬに溶かした。ペプチド溶液を５０℃にて１７分間加熱した。調合緩衝液を２２．０９３ｇヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＣＤ）、０．４５０ｇ ２，４−ジヒドロキシ安息香酸（ゲンチシン酸）、０．２５７ｇ酢酸ナトリウム塩、１０．８８９ｇ α−Ｄ−グルコヘプタン酸から調製し、窒素パージを行ったＤＩ水１７０ｍＬに溶かした。数滴の1 Ｍ ＮａＯＨを添加してこの溶液をｐＨ ５．３０に調整し、ＤＩ水で最終量２２０ｍＬに希釈した。その後、調合緩衝液を０．２２μｍフィルターで滅菌濾過した。スズ緩衝液は、アルゴンパージを行った滅菌バイアルで、０．２ｍＬ（６Ｍ ＨＣｌ中２００ｍｇ／ｍＬ ＳｎＣｌ２）を３．８ｍＬの調合緩衝液で希釈することにより調製した。次いで、ペプチド溶液を７６ｍＬの調合緩衝液および０．５６ｍＬのスズ緩衝液と混合した。次いで、この溶液の１．５ｍＬアリコートをＭｉｌｌｅｘ ＧＶ ０．２２ｍｍフィルターに通し、３ｍＬ凍結乾燥バイアルに入れた。充填したバイアルはすぐにドライアイスで冷凍し、凍結乾燥させた。凍結乾燥サイクルが完了したらキットを真空密閉した。各キットは５５μｇのペプチドを含み、１．５ｍＬ量の生理食塩水中９９ｍＴｃＯ４ −での再構成に向けて調合した。
実施例４４）Ｔｃ−９９ｍキットの調製（アスコルビン酸型）
アスコルビン酸を配合するＴｃ−９９ｍ キットを、ゲンチシン酸の代わりに０．２２２ｇのＬ−アスコルビン酸を使用することを除き、ゲンチシン酸キットと同様に調製した。
実施例４５）Ｔｃ−９９ｍキットの標識
キットを生理食塩水中９９ｍＴｃＯ４ １．５ｍＬ（０．５〜７０ｍＣｉ）で再構成し、室温にて１０分間インキュベートした。次いで、キットを沸騰水浴中で１５分間加熱し、室温まで冷却した後に使用した。
実施例４６）Ｔｃ−９９ｍ／Ｉｎ ＩＭＰ ２４５の標識と安定性
初期標識計画では、ＤＯＴＡに冷インジウムを注入し、キットから高収量のＴｃ−９９ｍ／Ｉｎ ＩＭＰ ２４５を得ることが好ましいことが明示されている。１．５ｍＬ中３０ｍＣｉ Ｔｃ−９９ｍにて標識する場合、ゲンチシン酸処方では、ペプチドのよりクリーンな最初の標識が生ずるが、アスコルビン酸処方では、ペプチドを室温にて一晩保存した場合にはるかに高い安定性を有するキットを提供した。新鮮なマウス血清中、３７℃にての初期安定性試験の結果、Ｔｃ−９９ｍ標識ペプチドがキット中と同じくらい血清中でも安定していることが示された。範囲を拡大した勾配でのＨＰＬＣ分析によって、標識ペプチドが２つのピークを有することが分かった。これらの２つのピークは、ｓｙｎおよびａｎｔｉ型Ｔｃオキソ種の形成によるものと考えられる。ピークの比率はペプチド配列、処方および標識条件に応じて変化し得る。
実施例４７）ＩＭＰ ２４５のＹ−９０およびＩｎ−１１１での標識
ペプチドを０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ３．０８に、２．２×１０−３Ｍ（ペプチド）にて溶かした。次いで、アリコート、３．５μＬのペプチド溶液を１６５μＬの０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ３．９３および６μＬのＹ−９０溶液と混合した。その後、この混合物を８５〜９５℃にて２０分間加熱した。逆相ＨＰＬＣにより、ペプチドが十分に標識されていることがわかった。
類似の標識方法を、Ｉｎ−１１１を使用し、数多くの条件下で試したが、その方法ではクリーンな、標識された生成物が得られなかった。その後の、冷ペプチドのＨＰＬＣ分析では、いくつかの新たなピークの形成が示された。ペプチドは保存時にジスルフィドを形成していると考えられた。次いで、Ｔｃ／Ｒｅリガンドに冷レニウムを予備注入し、Ｙ−９０、Ｌｕ−１７７、およびＩｎ−１１１での標識に向けてペプチドを安定化させた。
実施例４８）ＲｅＯ ＩＭＰ ２４５のＩｎ−１１１での標識
ペプチド、０．００２５ｇ ＲｅＯ ＩＭＰ ２４５（ＭＨ＋ ２０３１）を０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ ３．９８緩衝液５６０μＬ（２．２×１０−３Ｍペプチド）に溶かした。アリコート、２．７μＬのＲｅＯ ＩＭＰ ２４５を２μＬのＩｎ−１１１（５７３μＣｉ）および１５０μＬの０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ ３．９８緩衝液と混合した。その後、この溶液を沸騰水浴中で２０分間加熱した。ＨＰＬＣ分析により、Ｔｃ−９９ｍ／Ｉｎ ＩＭＰ ２４５と同程度の保持時間でのクリーンな、標識されたピークが示された。
実施例４９） ９０ Ｙ、 １１１ Ｉｎ、および １７７ Ｌｕによる放射性標識に好適なペプチドの作製
ｂｓＭＡｂｓの調製：
ヒト化ＭＮ−１４抗ＣＥＡまたはネズミＭｕ−９抗ＣＳＡｐおよびネズミ６７９のＦａｂ’フラグメントからなる二重特異性Ｆ（ａｂ’）２抗体を、架橋剤としてＰＤＭを使用して調製した。各親抗体のＦ（ａｂ’）２をまず調製した。ｈＭＮ−１４またはＭｕ−９では、Ｆ（ａｂ’）２を１ｍＭ ＤＴＴを用いてＦａｂ’−ＳＨに還元し、これを０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（酢酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液）を含有するｐＨ ５．３の酢酸緩衝液でダイアフィルトレーションを行ってＤＴＴを除去し、５〜１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、必要になるまで２〜８℃にて保存した。６７９では、Ｆ（ａｂ’）２を１ｍＭ ＤＴＴを用いてＦａｂ’−ＳＨに還元し、次いで、これを５容量の酢酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液で希釈し、続いて、２０ｍＭ ＰＤＭ（９０％ＤＭＦ中調製物）を最終濃度４ｍＭまで迅速に添加した。室温にて３０分間攪拌した後、得られた溶液（６７９ Ｆａｂ’−ＰＤＭを含有）を遊離ＰＤＭが最小となるまで酢酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液でダイアフィルトレーションを行い、５〜１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。次いで、ｈＭＮ−１４ Ｆａｂ’−ＳＨまたはＭｕ−９ Ｆａｂ’−ＳＨの溶液を６７９ Ｆａｂ'−ＰＤＭの溶液と、Ｆａｂ’量に基づき１：１比にて混合した。システインを最終濃度２ｍＭまで添加し、共役反応物をクエンチし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００充填カラム(Amersham, Pharmacie Bio, Piscataway, NJ)での精製後に所望の二重特異性複合体（〜１００ｋＤａ）を得た。これらの二重特異性複合体をＳＥ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＩＥＦにより解析した。ｈＭＮ−１４×ｍ６７９ Ｆ（ａｂ’）２については、二重特異性がＢＩＡｃｏｒｅならびにＳＥ−ＨＰＬＣによって立証された。さらに、ＨＳＧに対するｈＭＮ−１４×６７９の親和性は、製造業者推奨の方法により１つのＨＳＧ置換基とチオールを含有するペプチドを添加して誘導したＣＭ−５チップを使用したＢＩＡｃｏｒｅ解析により決定した(Biacore, Inc., Piscataway, NJ 08854)。
生体分布試験では、ｈＭＮ−１４×ｍ６７９ Ｆ（ａｂ’）２をクロラミン−Ｔ法（２０）により１２５ＩＮａ(Perkin Elmer Life Science, Inc. Boston, MA)を使用して放射性ヨウ化物にし、遠心分離用サイズ排除カラムを使用して精製した。品質保証試験では、ＩＴＬＣにより結合していない放射性ヨウ素が＜５％であること、ＳＥ−ＨＰＬＣにより生成物の＞９０％が単一のピークとして移動すること(Bio-Sil SE 250, Bio Rad, Hercules, CA)、および過剰のＣＥＡの添加により放射性標識された生成物の＞９０％がより大きな分子量へとシフトすること(Scripps Laboratories, San Diego, CA)が判明した。１２５Ｉ−ｍＭｕ−９×ｍ６７９ ｂｓＭＡｂを同様に、ＣＳＡｐ供給源としてＧＷ−３９ヒト結腸異種移植片由来の部分精製した抽出物を使用して試験した。この結果、ｍＭｕ−９−×６７９ｂｓＭＡｂの溶出プロフィールがＳＥ−ＨＰＬＣカラムの空隙画分へとシフトした。
ヒト化ＭＮ−１４（ｈＭＮ−１４）Ｆａｂ’−ＳＨを上記と同様に調製した。９９ｍＴｃ−過テクネチウム酸塩（３０ｍＣｉ）を凍結乾燥させたｈＭＮ−１４−Ｆａｂ’−ＳＨ（１．０ｍｇ）に直接添加し、３０分以内に動物に注入した。この生成物は、ＩＴＬＣにより３．０％の結合していない９９ｍＴｃおよび９２％の免疫反応性部分を有していた。
ペプチドの放射性標識：
９０Ｙ−、ｌ７７Ｌｕ−および１１１Ｉｎ−放射性標識に使用する二価ＨＳＧ−ペプチド、ＩＭＰ ２４１は、これらの放射性金属の結合を容易にするＤＯＴＡリガンドを含む。ＩＭＰ ２４１を０．５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ ４．０）に、２．２×１０−３Ｍの濃度まで溶かした。９０ＹＣｌ３ をPerkin Elmer Life Sciences, Inc.(Boston, MA)より、１１１ＩｎＣｌ３をIsoTex Diagnostics(Friendswood, TX)より、および１７７ＬｕをResearch Reactor Facility, University of Missouri-Columbia,(Columbia, MO)より入手した。
１１１Ｉｎ−ＩＭＰ ２４１を、３ｍＣｉの１１１ＩｎＣｌ３をプラスチック製円錐形バイアルで０．５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ ４．０（３×１１１ＩｎＣｌ３量）および２．３μＬのＩＭＰ ２４１（０．５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ ４． ０中２．２×１０−３Ｍ)と混合することにより調製した。遠心分離後、混合物を沸騰水浴中で３０分間加熱し、冷却した。この混合物を遠心分離し、ＤＴＰＡを最終濃度３ｍＭまで添加した。室温にて１５分後、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．５により最終量を１．０ｍＬとした。結合していない同位元素の量を逆相ＨＰＬＣおよびＩＴＬＣ（塩化ナトリウム飽和溶液中での展開）により決定した。逆相ＨＰＬＣ分析は、Ｃ−１８ Ｎｏｖａ−Ｐａｋ ４μｍ 固定相を充填したＷａｔｅｒｓ ８×１００ｍｍ ｒａｄｉａｌ Ｐａｋカートリッジで実施した。カラムを１．５ｍＬ／分にて、１００％Ａ（水中０．０７５％ＴＦＡ）〜５５％Ａおよび４５％Ｂ（ここで、Ｂは７５％アセトニトリルおよび２５％水中０．０７５％のＴＦＡである）までの直線勾配を用いて１５分かけて溶出した。１５分の時点で、溶媒を１００％Ｂに変更し、初期条件で再平衡化するまで５分間そこで維持した。逆相ＨＰＬＣ分析では、１１．８分にて単一のピークが示された。過剰のｍ６７９ ＩｇＧと混合した１１１Ｉｎ−ＩＭＰ ２４１のＢｉｏ−Ｓｉｌ ＳＥ ２５０ ＨＰＬＣゲル濾過カラムでの分析では、抗体との結合を示す抗体の保持時間にて１つのピークが示された。
ＩＭＰ−２４１を、１５ｍＣｉの９０ＹＣｌ３、０．５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ ４．０の３倍量、および８３．２μＬのＩＭＰ ２４１（０．５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ ４．０中１．１×１０−４Ｍ）、およびアスコルビン酸、最終濃度６．７５ｍｇ／ｍＬ、に添加することにより、９０Ｙで放射性標識した。混合物を沸騰水浴中で３０分間加熱し、室温まで冷却した後、ＤＴＰＡを最終濃度５ｍＭまで添加した。１５分後、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．５により最終量を１．０ｍＬとした。塩化ナトリウム飽和溶液中で展開させたＩＴＬＣストリップから、結合していない同位元素が＜０．２％であることがわかった。過剰のｍ６７９ ＩｇＧと混合した９０Ｙ−ＩＭＰ ２４１のＳＥ−ＨＰＬＣによる分析では、抗体との結合を示す抗体の保持時間にて１つのピークが示された。
放射性標識ペプチドのマウス血清中における安定性を、各放射性標識ペプチドをマウス血清で１０倍希釈し、その溶液を３７℃にてインキュベートすることにより試験した。サンプルを１、３、および２４時間の時点で採取し、逆相ＨＰＬＣにより分析した。
in vivoプレターゲッティング試験：
ＧＷ−３９、ＣＥＡ産生ヒト結腸癌細胞系（Goldenberg, D. M. and Hansen, H. J, Carcinoembryonic antigen present in human colonic neoplasms serially propagated in hamsters, Science, 175: 1117-18 (1972)を参照）をヌードマウスにおいて、１〜２ｇの腫瘍を滅菌生理食塩水ですりつぶし、すりつぶした混合物を５０メッシュワイヤースクリーンに通し、生理食塩水量を腫瘍１ｇ当たり１０ｍｌ生理食塩水の最終割当量に調整することにより、連続増殖させた。およそ６週齢の雌ＮＣｒヌードマウス(Charles River Laboratories, Inc., Fredrick MDまたはTaconic, Germantown, NY)にこの懸濁液０．２ｍＬを皮下移植した。腫瘍移植の２〜３週後、動物に放射性標識ペプチドを単独で注入するか、あるいは、プレターゲッティングするためにｂｓＭＡｂを、続いて、１〜２日後に放射性標識ペプチドを注入した。プレターゲッティングするために、１．５×１０−１０モル（ｌ５μｇ；６μＣｉ１２５Ｉ）のｂｓＭＡｂを静脈注射し（０．１〜０．２ｍＬ）、続いて、１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２４１（１．５×１０−１１モル、８〜１０μＣｉ）、１７７Ｌｕ−ＩＭＰ−２４１（１．５×１０−１１モル、５μＣｉ）、または９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４３（１．５×１０−１１、２５〜３０μＣｉ）の静脈注射（０．１〜０．２ ｍＬ）を行った。ペプチド注入後の指定された時点で、動物に麻酔をかけ、心臓穿刺により採血し、その後、剖検に先だって安楽死させた。組織を取り出し、重量を計り、注入される物質から調製した標準とともに、各放射性核種に好適なウインドウを使用するγ線シンチレーションにより計数した。二重同位元素計測を使用する場合には、適切な後方散乱補正を作成した。消化組織（胃、小腸および大腸）の重量を計り、それらの内容物を計数した。データは、組織１ｇ当たりの注射投与量の割合（％ＩＤ／ｇ）および腫瘍の正常組織に対するパーセンテージ比（Ｔ／ＮＴ）として表している。表および図で示す全ての値は、そこに示される各試験に使用した動物数で計算した値の平均と標準偏差である。
結果：
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ペプチドの放射性標識およびｂｓＭＡｂについての試験
ＩＭＰ−２４１のＤＯＴＡキレート基は、１１１Ｉｎ、９０Ｙおよび１７７Ｌｕなどの他の放射性金属とともに使用することができる。ペプチドを、各々約６００、１６５０、および３００Ｃｉ／ｍｍｏｌの比放射能を有するこれらの放射性核種で放射性標識した。１７７Ｌｕの比放射能の低さは、生成物を使用する時点でのその経過時間と１７７Ｌｕの比放射能を最適化するように実施されていない同位元素の製造工程の両方に起因した。９９ｍＴｃ−ペプチドの比放射能は１５００〜１６００Ｃｉ／ｍｍｏｌであった。どの場合にも、放射性標識条件は、精製が不要となるようペプチドでの放射活性の取り込みが確実に＞９８％であるように開発された。逆相ＨＰＬＣでは、３７℃にて新鮮なマウス血清と混合した場合に、全てのペプチドが２４時間にわたり安定しており、それらの調製後にも最初の溶出プロフィールを保持していることがわかった。ＩＭＰ−２４３および２４５の、範囲を拡大した勾配でのＨＰＬＣ分析によって、標識ペプチドがｓｙｎおよびａｎｔｉ型テクネチウムオキソ種の形成によるものと考えられる２つのピークを有することが分かった。
図６はＳＥ−ＨＰＬＣによりｈＭＮ−１４×ｍ６７９ ｂｓＭＡｂの１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２４１との結合を示している。本質的に全ての放射性標識ペプチドはｂｓＭＡｂ溶出時間へとシフトするが、ＣＥＡをまずｂｓＭＡｂに添加し、続いて、放射性標識ペプチドの添加を行う場合には、放射活性の全量が空隙画分へとシフトする。同様の結果が、ＣＳＡｐ調製物を使用した場合のｍＭｕ−９×ｍ６７９ ｂｓＭＡｂでも判明した（示されていない）。ｈＭＮ−１４×ｍ６７９ Ｆ（ａｂ’）２ ｂｓＭＡｂのチップ上のモノＨＳＧペプチドとの結合動態をＢＩＡｃｏｒｅにより評価し、ＫＤ＝１．５×１０−９Ｍであることが判明した。
ペプチドの生体分布
生体分布を目的として、組織でのペプチドの検出を容易にするためにＩＭＰ−２４１をγ線を放射する放射性核種、１１１Ｉｎまたは１７７Ｌｕで放射性標識し、一方、ＩＭＰ−２４３およびＩＭＰ−２４５は９９ｍＴｃで放射性標識した。腫瘍を有するヌードマウスにおいて、１７７Ｌｕ−および１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２４１は類似の分布およびクリアランス特性を示した（表２０および２１）。いずれの場合も、ペプチドは血液から迅速にクリアリングされるため、その注入後３時間以内に血液中には正確に定量するのに十分な放射活性が存在しなかったが、主要な器官では定量を可能とするのに十分な放射活性が存在した。放射活性は腎排泄によって体外に排出されるが、注入した活性のわずかなものがモニタリング期間にわたり腎臓内に残存していた。注入の０．５〜１．０時間後では、平均腎臓重量０．１５ｇにて、注入した全活性の約０．６％が腎臓に存在するだけであった。１７７Ｌｕ−ＩＭＰ−２４１を施与したさらなる動物群で４８時間の時点にて剖検を行なったが、腎臓には正確に記録するだけの放射活性しかなかったため、そのデータは表には示していない。しかしながら、腎臓での１７７Ｌｕ−ＩＭＰ−２４１は０．９４±０．２％ＩＤ／ｇのレベルまで低下し、これは２４時間の時点で見られるレベルと比べて約４５％の低下であった。放射活性の大部分は尿中に排出されるが、消化管を通じてクリアリングされるごくわずかな放射活性もある。あらゆる消化組織（すなわち、胃、小腸および大腸）では、１．０〜３．０時間まで、注入した全活性の約０．６〜０．７％の割合を占め得る。２４時間までには、あらゆる消化組織では、放射活性の０．０７％の割合を占めるにすぎなかった。
９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４３の組織分布はＩＭＰ−２４１とはかなり違っていた（表２２）。血液からのクリアランスは遅く、肝臓での取込みは多く、消化管ではかなりの割合で存在した。例えば、注入の１時間後、小腸には２４．３±４．７５％ＩＤ／ｇの９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４３が含まれており、３時間までに活性は大腸にシフトした。２４時間までに、活性は体内から完全にクリアリングされた。このように、小腸および大腸を通る放射活性の進行で見られるように、放射活性は消化組織自体とは関係がないが、胃腸内容物中に存在した。別のペプチド、ＩＭＰ−２４５は、消化組織において放射活性がはるかに小さかった。肝臓および腎臓での保持についても９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４３で見られるものよりかなり少なかった。
プレターゲッティング試験
ｈＭＮ−１４×ｍ６７９ Ｆ（ａｂ’）２ ｂｓＭＡｂを使用して９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４３および９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５のプレターゲッティング能力を試験した。ｂｓＭＡｂを、９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４３またはＩＭＰ−２４５のいずれかによりその分布が同時に表示され得るように、１２５Ｉで放射性標識した。ｂｓＭＡｂをi. v.にて動物に施与し、２４時間後、放射性標識ペプチドを施与し、３および２４時間後に動物の剖検を行なった。プレターゲッティング設定では、９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４３の腫瘍での取込みは、その注入の３および２４時間後にペプチド単独で見られるものよりもほぼ２８倍および７０倍多かった（表２３）。腫瘍での取込みは３時間の時点で１２．２５±３．３２％ＩＤ／ｇであり、２４時間までに７．３６±３．１９まで低下した。この時点を過ぎての腫瘍での９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４３の減少は、この同時点を過ぎて４．７８±１．１１％ＩＤ／ｇ〜２．２４±０．５３％ＩＤ／ｇまで下がった腫瘍でのｂｓＭＡｂの減少ほど大きくはなかった。９９ｍＴｃ− ＩＭＰ−２４３の腫瘍／非腫瘍比率は、ペプチドがまだクリアリングされず、これが２４時間までにほぼ２０倍高まった大腸の場合を除いて、３時間以内では全てが２．０：１より大きかった。腫瘍／血液の比率はペプチド注入の３時間後に２．４±０．６であった。９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５の腫瘍での取込みは９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４３で見られるものと類似していた（表６）が、主として、ｂｓＭＡｂがこれらの動物において、９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４３を施与した動物においてよりも低いレベルまでクリアリングされるため、腫瘍／非腫瘍比率では９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５が有利であった。しかしながら、９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５プレターゲッティングでは１時間の時点でさえも胃腸での取り込みが低かったため、このペプチドは９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４３とは異なる利点を有していた。９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５の腫瘍／腎臓比率は９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４３で得られるものよりも高かった。これらの生体分布データからは、９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５によるプレターゲッティングにより直接放射性標識したＦａｂ’フラグメントで見られるものよりも早い時点で優れた画像コントラストが提供されるはずであることが示唆される。また、９９ｍＴｃ標識ペプチドを使用した場合の腫瘍／腎臓比率が、その注入の３時間後に９９ｍＴｃ−ｈＭＮ−１４ Ｆａｂ’で直接放射性標識した抗体フラグメントよりも実質的に高いことも強調すべきであろう（表２５）。
２つの異なるターゲッティング系をＩＭＰ−２４１ペプチドのプレターゲッティング評価に使用し、一方の系ではヒト化抗ＣＥＡ抗体(ｈＭＮ−１４)を使用し、もう一方ではネズミのＣＳＡｐに対する抗体（ｍＭｕ−９）を使用した。各ｂｓＭＡｂを、そのＦａｂ’をネズミ６７９ ＭＡｂのＦａｂ’と化学的にカップリングすることにより調製した。生体分布試験では、各ｂｓＭＡｂを、その分布を１１１Ｉｎで放射性標識したＩＭＰ−２４１と一緒に評価し得るように、１２５Ｉで放射性標識した。各プレターゲッティング系では、腫瘍を有するヌードマウスに注入するｂｓＭＡｂおよびペプチドの量を同じにしたが、Ｍｕ−９ ｂｓＭＡｂはｈＭＮ−１４ ｂｓＭＡｂよりも血液からのクリアリングに時間が長くかかるため、ｈＭＮ−１４ ｂｓＭＡｂの２４時間後に対し、Ｍｕ−９ ｂｓＭＡｂの４８時間後に放射性標識ペプチドを施与した。ｈＭＮ−１４×ｍ６７９構築物では２４時間遅らせ、ｍＭｕ−９×ｍ６７９構築物では４８時間遅らせて使用することにより、各ｂｓＭＡｂの血液レベルは同等の、各々０．７９±０．２４％ＩＤ／ｇおよび０．５５±０．１０％ＩＤ／ｇとなった。腫瘍でのＭｕ−９ ｂｓＭＡｂ（１３．１±４．３６％ＩＤ／ｇ）の量がＭＮ−１４ ｂｓＭＡｂ（２．９２±０．４１）よりも高いことの発見は、Ｍｕ−９と抗ＣＥＡ抗体のターゲッティングを比較したこれまでの研究からＭｕ−９は抗ＣＥＡ抗体の場合よりもＧＷ−３９異種移植片モデルにおいて取り込みが多く、長く保持されることが判明していることから予期していないことではなかった。腫瘍でのＭｕ−９ ｂｓＭＡｂの量が多いほど高い濃度のペプチドが達成され、ｈＭＮ−１４ ｂｓＭＡｂでプレターゲッティングした動物におけるペプチド、１１．３±２．２％ＩＤ／ｇと比べて、ペプチド注入後わずか３時間で１７．８±１．４％ＩＤ／ｇのレベルに達した。興味深いことに、腫瘍でのｂｓＭＡｂに対するペプチドの％ＩＤ／ｇの比率はｈＭＮ−１４ ｂｓＭＡｂでは３時間の時点で３．９であったのに対し、Ｍｕ−９ ｂｓＭＡｂではこの同時点で１．４であったことから、ｈＭＮ−１４ ｂｓＭＡｂはペプチドとの結合率がより高かった。しかしながら、Ｍｕ−９プレターゲッティング系では１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２４１が腫瘍で長時間保持され、この時間はｂｓＭＡｂが腫瘍と結合している時間の長さに相当した。各系では、３時間の時点で観察されるペプチド：ｂｓＭＡｂ比率が４８時間の観察期間にわたり維持され、ペプチドが、具体的に言えば、ｂｓＭＡｂによって拘束されていることが示唆された。プレターゲッティングにより、１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２４１の腫瘍付加がペプチド単独に対してほぼ１００倍増大した（表２０参照）。また、腫瘍／非腫瘍比率は、プレターゲッティングによって、どのｂｓＭＡｂプレターゲッティング系を使用するかには関係なく、１１１Ｉｎ−２４１ペプチド単独の場合と比べて有意に改善された。概して、Ｉｎ−ＩＭＰ−２４１の腫瘍／非腫瘍比率はＭｕ−９ ｂｓＭＡｂ系で、特に、長期間有意に高かった。
ＩＭＰ−２４１を１７７Ｌｕまたは１１１Ｉｎで放射性標識したかどうかには関係なく、プレターゲッティング結果は同じであった。表２７で示すように、ｈＭＮ−１４ ｂｓＭＡｂプレターゲッティング系を使用した場合、１７７Ｌｕ−ＩＭＰ−２４１の％ＩＤ／ｇは１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２４１の場合と同じであった。１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２４１の分布が１７７Ｌｕ−ＩＭＰ−２４１とよく似ていること、および１１１Ｉｎは９０Ｙ−分布の予測の代わりとしても使用されることから、長期生体分布試験は１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２４１およびｍＭｕ−９×ｍ６７９ Ｆ（ａｂ’）２ ｂｓＭＡｂを使用して実施した。図７にて示されるように、腫瘍でのＭｕ−９抗体の長期保持の結果として、腫瘍で放射性標識ペプチドの優れた保持がなされた。これらのデータを使用して、放射線量推定値を９０Ｙおよび１７７Ｌｕについてモデル化した。９０Ｙはその高いβ線放射エネルギー（２．２７ＭｅＶｍａｘ）から、１７７Ｌｕ（４９５ｋｅＶｍａｘ）より高い放射線量を１ｍＣｉ当たりベースで腫瘍に送達させる。しかしながら、よりよく比較するため、線量制限のある器官に同じ放射エネルギーをもたらすように放射線量をノーマライズした。この場合において、許容に値する線量として腎臓に対し１５００ｃＧｙを選択したが、類似の毒性が生じた。組織への吸収線量をノーマライズすると、データから、１７７Ｌｕ−ＩＭＰ−２４１により９０Ｙ−ＩＭＰ−２４１と同じ線量を腫瘍に送達させ得ることが示される。腎臓が１５００ｃＧｙに耐え得るならば、腫瘍はほぼ１２，０００ｃＧｙ、大部分の固形腫瘍が致死的となるであろう放射線量を受けるであろう。
当業者ならば、本発明の組成物および方法に対して種々の修飾および変形をなし得ることは明らかであろう。よって、このような修飾および変形が添付の請求項およびそれらの等価物の範囲にあるならば、本発明がそれらを包含することは意図されている。
以上で引用した全ての刊行物の開示は、各々を個々に引用することにより本明細書の一部とされるのと同様に、明示的に全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる。
関連するさらなる参照文献としては下記のものがある。
Figure 0004455322
Figure 0004455322
総ての参照文献の全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
種々のＡｂおよびｂｓＡｂを図示したものである。 精製ｈＭＮ−１４Ｆａｂ−７３４ｓｃＦｖのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。非還元（レーン１および２）および還元（レーン３および４）条件下で４〜２０％ポリアクリルアミドゲルの各レーンに３μｇのｈＭＮ−１４ ＩｇＧ（レーン１および３）を適用した。 二つの二重特異性融合タンパク質を図示したものである。 ｈＭＮ−１４Ｆａｂ−７３４ｓｃＦｖ二重特異性融合タンパク質を産生するのに有用なＤＮＡ構築物の産生を示す。 ｈＭＮ−１４Ｆａｂ−７３４ｓｃＦｖ二重特異性融合タンパク質を産生するのに有用なＤＮＡ構築物の産生を示す。 ｈＭＮ−１４ｘｍ６７９ ｂｓＭＡｂと１１１Ｉｎ付加ＩＭＰ−２４１二価ＨＳＧ−ＤＯＴＡペプチドとの結合特性を示す。パネルＡ：ＳＥ−ＨＰＬＣにおける１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２４１単独；パネルＢ：ｈＭＮ−１４ｘ６７９ ｂｓＭＡｂと混合した１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２４１；パネルＣ：過剰量のＣＥＡとともにｈＭＮ−１４ｘｍ６７９ ｂｓＭＡｂを含有する混合物に加えた１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２４１。クロマトグラムは１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２４１とｂｓＭＡｂ（Ｂ）およびｂｓＭＡｂ／ＣＥＡ複合体（Ｃ）との会合を示す。 ＧＷ−３９腫瘍担持ヌードマウスにおける１２５Ｉ−ｍＭｕ−９ｘｍ６７９Ｆ（ａｂ’）２ｂｓＭＡｂおよび１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２４１のクリアランスを示す。マウスに放射性標識ｂｓＭＡｂを腹腔内注射し、４８時間後、放射性標識ペプチドを腹腔内投与した。数値はグラム当たりの注射量％の平均および標準偏差を示す（各時間間隔につきｎ＝５）。

Claims (81)

  1. 下記式の化合物：
    Ｘ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｙ）−ＮＨ２（この化合物は、ＸまたはＹにおいて硬酸陽イオンキレート剤を含み、残りのＸまたはＹにおいて軟酸陽イオンキレート剤を含む）。
  2. 硬酸陽イオンキレート剤が、カルボン酸基またはアミン基を含むものである、請求項１に記載の化合物。
  3. 硬酸陽イオンキレート剤が、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、およびＴＥＴＡからなる群から選択されるものである、請求項１に記載の化合物。
  4. 軟酸陽イオンキレート剤がチオール基を含むものである、請求項１に記載の化合物。
  5. 軟酸陽イオンキレート剤が、Ｔｓｃｇ−ＣｙｓおよびＴｓｃａ−Ｃｙｓからなる群から選択されるものである、請求項１に記載の化合物。
  6. 硬酸陽イオンキレート剤および軟酸陽イオンキレート剤が、相互に異なる陽イオンで標識化されている、請求項１に記載の化合物。
  7. 少なくとも１種の放射性核種、治療剤または診断剤をさらに含んでなる、請求項１に記載の化合物。
  8. 放射性核種が、２２５Ａｃ、１１１Ａｇ、７２Ａｓ、７７Ａｓ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、１１Ｃ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１６６Ｄｙ、１６９Ｅｒ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１５４Ｇｄ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５７Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１９４Ｉｒ、１７７Ｌｕ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、９９Ｍｏ、１３Ｎ、１５Ｏ、３２Ｐ、３３Ｐ、２１１Ｐｂ、２１２Ｐｂ、１０９Ｐｄ、１４９Ｐｍ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、２２３Ｒａ、８２ｍＲｂ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１０５Ｒｈ、４７Ｓｃ、１５３Ｓｍ、７５Ｓｅ、８３Ｓｒ、８９Ｓｒ、１６１Ｔｂ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、８６Ｙ、９０Ｙ、９０Ｙ、および８９Ｚｒからなる群から選択されるものであり、ターゲッティング可能な構築物が１を超える放射性核種を含む場合、それらの放射性核種が異なる放射性核種であり得る、請求項７に記載の化合物。
  9. ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２で表される、請求項１に記載の化合物。
  10. Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−ＮＨ２で表される、請求項１に記載の化合物。
  11. 硬酸陽イオンキレート剤が、第IIa族および第IIIa族の金属陽イオンからなる群から選択される陽イオンを含むものである、請求項１に記載の化合物。
  12. 軟酸陽イオンキレート剤が、遷移金属、Ｂｉ、ランタニド類およびアクチニド類からなる群から選択される陽イオンを含むものである、請求項１に記載の化合物。
  13. 軟酸陽イオンキレート剤が、Ｔｃ、Ｒｅ、およびＢｉからなる群から選択される陽イオンを含むものである、請求項１に記載の化合物。
  14. Ｘ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｙ）−ＮＨ−Ｒを含んでなるターゲッティング可能な構築物であって、
    ＸまたはＹにおいて硬酸陽イオンキレート剤を含み、残りのＸまたはＹにおいて軟酸陽イオンキレート剤を含み、かつ、Ｒにおいて治療剤、診断剤または酵素を含む、ターゲッティング可能な構築物。
  15. Ｒが共有結合によってターゲッティング可能な構築物に連結されている、請求項１４に記載のターゲッティング可能な構築物。
  16. Ｒがリンカー部分によってターゲッティング可能な構築物に連結されている、請求項１４に記載のターゲッティング可能な構築物。
  17. リンカー部分が少なくとも１つのアミノ酸を含むものである、請求項１６に記載のターゲッティング可能な構築物。
  18. 硬酸陽イオンキレート剤および軟酸陽イオンキレート剤が、相互に異なる陽イオンで標識化されている、請求項１４に記載のターゲッティング可能な構築物。
  19. 硬酸キレート剤および軟酸キレート剤の少なくとも１つに結合した少なくとも１種の放射性核種をさらに含んでなる、請求項１４に記載のターゲッティング可能な構築物。
  20. 放射性核種が、２２５Ａｃ、１１１Ａｇ、７２Ａｓ、７７Ａｓ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、１１Ｃ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１６６Ｄｙ、１６９Ｅｒ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１５４Ｇｄ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５７Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１９４Ｉｒ、１７７Ｌｕ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、９９Ｍｏ、１３Ｎ、１５Ｏ、３２Ｐ、３３Ｐ、２１１Ｐｂ、２１２Ｐｂ、１０９Ｐｄ、１４９Ｐｍ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、２２３Ｒａ、８２ｍＲｂ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１０５Ｒｈ、４７Ｓｃ、１５３Ｓｍ、７５Ｓｅ、８３Ｓｒ、８９Ｓｒ、１６１Ｔｂ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、８６Ｙ、９０Ｙ、９０Ｙ、および８９Ｚｒからなる群から選択されるものであり、ターゲッティング可能な構築物が１を超える放射性核種を含む場合、それらの放射性核種は異なる放射性核種であり得る、請求項１９に記載のターゲッティング可能な構築物。
  21. 前記治療剤が、放射性核種、薬物、プロドラッグまたは毒素を含む、請求項１４に記載のターゲッティング可能な構築物。
  22. 前記プロドラッグが、エピルビシングルクロニド、ＣＰＴ−１１、エトポシドグルクロニド、ダウノマイシングルクロニドおよびドキソルビシングルクロニドからなる群から選択されるものである、請求項２１に記載のターゲッティング可能な構築物。
  23. 前記毒素が、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼ Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素からなる群から選択されるものである、請求項２１に記載のターゲッティング可能な構築物。
  24. 前記治療剤が、ドキソルビシン、ＳＮ−３８、エトポシド、メトトレキサート、６−メルカプトプリンまたはリン酸エトポシドを含んでなるものである、請求項１４に記載のターゲッティング可能な構築物。
  25. 前記診断剤が光線力学的療法のための１以上の薬剤を含む、請求項１４に記載のターゲッティング可能な構築物。
  26. 光線力学的療法のための前記薬剤が光増感剤である、請求項２５に記載のターゲッティング可能な構築物。
  27. 前記光増感剤が、ベンゾポルフィリン一酸環Ａ（ＢＰＤ−ＭＡ）、錫エチオプルプリン（ＳｎＥＴ２）、スルホン化アルミニウムフタロシアニド（ＡＩＳＰｃ）およびルテチウムテキサフィリン（Ｌｕｔｅｘ）からなる群から選択されるものである、請求項２６に記載のターゲッティング可能な構築物。
  28. 前記診断剤が磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用の１以上の画像増強剤を含んでなる、請求項１４に記載のターゲッティング可能な構築物。
  29. 前記画像増強剤が、Ｍｎ、Ｆｅ、ＬａおよびＧｄを含む、請求項２８に記載のターゲッティング可能な構築物。
  30. 前記診断剤が、Ｘ線またはコンピューター断層撮影用の１以上の放射線不透過剤または造影剤を含んでなる、請求項１４に記載のターゲッティング可能な構築物。
  31. 前記放射線不透過剤または造影剤が、バリウム、ジアトリゾエート、エチオド化オイル、クエン酸ガリウム、イオカルム酸、イオセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパン酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメ酸、イオタスル、イオテトル酸、イオサラム酸、イオトロキシ酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポデート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリオドン、または塩化タリウムを含む、請求項３０に記載のターゲッティング可能な構築物。
  32. 前記診断剤が１以上の超音波造影剤を含んでなる、請求項１４に記載のターゲッティング可能な構築物。
  33. 前記超音波造影剤がリポソームまたはデキストランを含む、請求項３２に記載のターゲッティング可能な構築物。
  34. 前記リポソームがガス充填されている、請求項３３に記載のターゲッティング可能な構築物。
  35. 被験体において罹患組織を処置または同定するのに有用なキットであって、
    （Ａ）請求項１に記載の化合物を含んでなるターゲッティング可能な構築物、
    （Ｂ）標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、前記ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体または抗原結合抗体フラグメント（ここで、該ターゲッティング可能な構築物は、該二重特異性抗体または抗原結合抗体フラグメントの少なくとも１つの他のアームによって認識可能な少なくとも１つのエピトープを含む、またはこれを担持するキャリア部分と、結合した１以上の治療剤もしくは診断剤、または酵素とを含む）、ならびに
    （Ｃ）所望により、局在していない抗体および抗体フラグメントのクリアリングに有用なクリアリング組成物
    を含んでなる、キット。
  36. 前記診断剤が、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂおよび８３Ｓｒからなる群から選択されるものである、請求項３５に記載のキット。
  37. 前記治療剤が、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕおよび２１１Ｐｂからなる群から選択されるものである、請求項３５に記載のキット。
  38. 前記ターゲッティング可能な構築物が、少なくとも１種の診断用もしくは治療用陽イオン、および／または１以上の錯化した、もしくは化学的に結合した治療剤、診断剤もしくは酵素をさらに含んでなるものである、請求項３５に記載のキット。
  39. 前記標的組織が腫瘍である、請求項３５に記載のキット。
  40. 前記腫瘍が、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｉａ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＰＡＭ−４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、Ａ３、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、Ｓ１００、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、テネイシン、葉酸受容体、ＶＥＧＦＲ、壊死抗原、ＩＬ−２、Ｔ１０１、ＭＡＧＥからなる群から選択される抗原を産生する、または該抗原に関連するものである、請求項３９に記載のキット。
  41. 標的組織に特異的に結合する少なくとも１つの前記アームが、ヒト、キメラもしくはヒト化抗体、またはヒト、キメラもしくはヒト化抗体の抗原結合フラグメントである、請求項３５に記載のキット。
  42. 前記二重特異性抗体が、抗ＣＥＡ抗体のＦｖおよび抗ＨＳＧ抗体のＦｖを含んでなるものである、請求項３５に記載のキット。
  43. 抗ＣＥＡ抗体および／または抗ＨＳＧ抗体がキメラ化またはヒト化されている、請求項４２に記載のキット。
  44. 抗ＣＥＡ抗体および／または抗ＨＳＧ抗体がヒト抗ＣＥＡ抗体およびヒト抗ＨＳＧ抗体である、請求項４２に記載のキット。
  45. 前記二重特異性抗体が抗ＣＥＡ抗体のＣＤＲを含んでなるものである、請求項４２に記載のキット。
  46. 前記二重特異性抗体が抗ＨＳＧ抗体のＣＤＲを含んでなるものである、請求項４２に記載のキット。
  47. 前記二重特異性抗体が融合タンパク質である、請求項４２に記載のキット。
  48. 請求項１に記載の化合物を含んでなる、ターゲッティング可能な構築物。
  49. 哺乳類において正常な組織をイメージングするのに有用なキットであって、
    二重特異性抗体または抗原結合抗体フラグメント、ならびに
    請求項１に記載の化合物を含んでなるターゲッティング可能な構築物
    を含んでなり、
    前記二重特異性抗体または抗原結合抗体フラグメントが、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、前記ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを含んでなるものである、キット。
  50. 前記正常組織が、卵巣、胸腺、副甲状腺、子宮内膜、骨髄または脾臓に由来する組織である、請求項４９に記載のキット。
  51. 前記ターゲッティング可能な構築物が、少なくとも１種の放射性核種、治療剤、診断剤または酵素をさらに含んでなるものである、請求項４９に記載のキット。
  52. 被験体において罹患組織を手術中に同定するのに有用なキットであって、
    二重特異性抗体または抗原結合抗体フラグメント、ならびに
    請求項１に記載の化合物を含んでなるターゲッティング可能な構築物
    を含んでなり、
    前記二重特異性抗体または抗原結合抗体フラグメントが、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、前記ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを含んでなるものである、キット。
  53. 前記ターゲッティング可能な構築物が、少なくとも１種の診断用もしくは治療用陽イオン、および／または１以上の錯化した、もしくは化学的に結合した治療剤、診断剤もしくは酵素をさらに含んでなるものである、請求項５２に記載のキット。
  54. 前記標的組織が腫瘍である、請求項５２に記載のキット。
  55. 前記腫瘍が、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｉａ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＰＡＭ−４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、Ａ３、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、Ｓ１００、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、テネイシン、葉酸受容体、ＶＥＧＦＲ、壊死抗原、ＩＬ−２、Ｔ１０１、ＭＡＧＥからなる群から選択される抗原を産生する、または該抗原に関連するものである、請求項５４に記載のキット。
  56. 前記二重特異性抗体が、抗ＣＥＡ抗体のＦｖおよび抗ＨＳＧ抗体のＦｖを含んでなるものである、請求項５２に記載のキット。
  57. 抗ＣＥＡ抗体および／または抗ＨＳＧ抗体がキメラ化またはヒト化されている、請求項５６に記載のキット。
  58. 抗ＣＥＡ抗体および／または抗ＨＳＧ抗体がヒト抗ＣＥＡ抗体およびヒト抗ＨＳＧ抗体である、請求項５６に記載のキット。
  59. 前記二重特異性抗体が抗ＣＥＡ抗体のＣＤＲを含んでなるものである、請求項５６に記載のキット。
  60. 前記二重特異性抗体が抗ＨＳＧ抗体のＣＤＲを含んでなるものである、請求項５６に記載のキット。
  61. 前記二重特異性抗体が融合タンパク質である、請求項５６に記載のキット。
  62. 被験体における罹患組織の内視鏡による同定に有用なキットであって、
    二重特異性抗体または抗原結合抗体フラグメント、ならびに
    請求項１に記載の化合物を含んでなるターゲッティング可能な構築物
    を含んでなり、
    前記二重特異性抗体または抗原結合抗体フラグメントが、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、前記ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを含んでなるものである、キット。
  63. 前記ターゲッティング可能な構築物が、少なくとも１種の診断用もしくは治療用陽イオン、および／または１以上の錯化した、もしくは化学的に結合した治療剤、診断剤もしくは酵素をさらに含んでなるものである、請求項６２に記載のキット。
  64. 前記標的組織が腫瘍である、請求項６２に記載のキット。
  65. 前記腫瘍が、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｉａ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＰＡＭ−４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、Ａ３、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、Ｓ１００、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、テネイシン、葉酸受容体、ＶＥＧＦＲ、壊死抗原、ＩＬ−２、Ｔ１０１、ＭＡＧＥからなる群から選択される抗原を産生する、または該抗原に関連するものである、請求項６４に記載のキット。
  66. 前記二重特異性抗体が、抗ＣＥＡ抗体のＦｖおよび抗ＨＳＧ抗体のＦｖを含んでなるものである、請求項６２に記載のキット。
  67. 抗ＣＥＡ抗体および／または抗ＨＳＧ抗体がキメラ化またはヒト化されている、請求項６６に記載のキット。
  68. 抗ＣＥＡ抗体および／または抗ＨＳＧ抗体がヒト抗ＣＥＡ抗体およびヒト抗ＨＳＧ抗体である、請求項６６に記載のキット。
  69. 前記二重特異性抗体が抗ＣＥＡ抗体のＣＤＲを含んでなるものである、請求項６６に記載のキット。
  70. 前記二重特異性抗体が抗ＨＳＧ抗体のＣＤＲを含んでなるものである、請求項６６に記載のキット。
  71. 前記二重特異性抗体が融合タンパク質である、請求項６６に記載のキット。
  72. 被験体における罹患組織を静脈内において同定するのに有用なキットであって、
    標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを含んでなる二重特異性抗体または抗原結合抗体フラグメント、ならびに
    請求項１に記載の化合物を含んでなるターゲッティング可能な構築物
    を含んでなる、キット。
  73. 前記ターゲッティング可能な構築物が、少なくとも１種の診断用もしくは治療用陽イオン、および／または１以上の錯化した、もしくは化学的に結合した治療剤、診断剤もしくは酵素をさらに含んでなるものである、請求項７２に記載のキット。
  74. 前記標的組織が腫瘍である、請求項７２に記載のキット。
  75. 前記腫瘍が、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｉａ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＰＡＭ−４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、Ａ３、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、Ｓ１００、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、テネイシン、葉酸受容体、ＶＥＧＦＲ、壊死抗原、ＩＬ−２、Ｔ１０１、ＭＡＧＥからなる群から選択される抗原を産生する、または該抗原に関連するものである、請求項７４に記載のキット。
  76. 前記二重特異性抗体が、抗ＣＥＡ抗体のＦｖおよび抗ＨＳＧ抗体のＦｖを含んでなるものである、請求項７２に記載のキット。
  77. 抗ＣＥＡ抗体および／または抗ＨＳＧ抗体がキメラ化またはヒト化されている、請求項７６に記載のキット。
  78. 抗ＣＥＡ抗体および／または抗ＨＳＧ抗体がヒト抗ＣＥＡ抗体およびヒト抗ＨＳＧ抗体である、請求項７６に記載のキット。
  79. 前記二重特異性抗体が抗ＣＥＡ抗体のＣＤＲを含んでなるものである、請求項７６に記載のキット。
  80. 前記二重特異性抗体が抗ＨＳＧ抗体のＣＤＲを含んでなるものである、請求項７６に記載のキット。
  81. 前記二重特異性抗体が融合タンパク質である、請求項７６に記載のキット。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140004530A (ko) * 2012-07-03 2014-01-13 한국생명공학연구원 ＩｇＧ Ｆｃ 위치선택적 결합 펩티드 및 이를 포함하는 하이브리드 분자

Families Citing this family (116)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7011812B1 (en) * 1996-05-03 2006-03-14 Immunomedics, Inc. Targeted combination immunotherapy of cancer and infectious diseases
US7387772B1 (en) * 1999-06-22 2008-06-17 Immunimedics, Inc. Chimeric, human and humanized anti-CSAP monoclonal antibodies
US6962702B2 (en) * 1998-06-22 2005-11-08 Immunomedics Inc. Production and use of novel peptide-based agents for use with bi-specific antibodies
US7405320B2 (en) * 1998-06-22 2008-07-29 Immunomedics, Inc. Therapeutic and diagnostic conjugates for use with multispecific antibodies
US7138103B2 (en) * 1998-06-22 2006-11-21 Immunomedics, Inc. Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
US7833528B2 (en) * 1998-06-22 2010-11-16 Immunomedics, Inc. Use of multispecific, non-covalent complexes for targeted delivery of therapeutics
DE60129741T2 (de) * 2000-06-20 2008-04-30 Immunomedics, Inc. Zielgerichtete kombinationsimmuntherapie für krebs und infektionskrankheiten
US7011816B2 (en) * 2001-12-26 2006-03-14 Immunomedics, Inc. Labeling targeting agents with gallium-68 and gallium-67
US8435529B2 (en) 2002-06-14 2013-05-07 Immunomedics, Inc. Combining radioimmunotherapy and antibody-drug conjugates for improved cancer therapy
US8491896B2 (en) * 2002-06-14 2013-07-23 Immunomedics, Inc. Anti-pancreatic cancer antibodies
US7282567B2 (en) * 2002-06-14 2007-10-16 Immunomedics, Inc. Monoclonal antibody hPAM4
US8877901B2 (en) 2002-12-13 2014-11-04 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US7591994B2 (en) 2002-12-13 2009-09-22 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US7597876B2 (en) * 2007-01-11 2009-10-06 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for improved F-18 labeling of proteins, peptides and other molecules
US7238786B2 (en) * 2002-06-14 2007-07-03 Immunomedics, Inc. Monoclonal antibody cPAM4
US8821868B2 (en) 2002-06-14 2014-09-02 Immunomedics, Inc. Anti-pancreatic cancer antibodies
US9599619B2 (en) 2002-06-14 2017-03-21 Immunomedics, Inc. Anti-pancreatic cancer antibodies
US7563433B2 (en) * 2007-01-11 2009-07-21 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for F-18 labeling of proteins, peptides and other molecules
US7993626B2 (en) * 2007-01-11 2011-08-09 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for F-18 labeling of proteins, peptides and other molecules
US7601351B1 (en) 2002-06-26 2009-10-13 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against protective antigen
US7651689B2 (en) * 2002-11-15 2010-01-26 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Methods of applying ionization radiation for therapy of infections
MXPA05008222A (es) * 2003-01-31 2005-10-05 Immunomedics Inc Metodos y composiciones para administrar agentes terapeuticos y de diagnostico.
US7402385B2 (en) * 2003-02-11 2008-07-22 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Radiolabeled antibodies for treatment of tumors
DE10318205A1 (de) * 2003-04-22 2004-11-25 Siemens Ag Bildgebungsverfahren für ein kapselförmiges Endoskopiegerät
PL2604285T3 (pl) * 2003-05-01 2015-02-27 Cornell Res Foundation Inc Sposób i kompleksy nośnikowe do dostarczania cząsteczek do komórek
CA2529027C (en) 2003-06-13 2013-09-10 Immunomedics, Inc. D-amino acid peptides
US9005613B2 (en) 2003-06-16 2015-04-14 Immunomedics, Inc. Anti-mucin antibodies for early detection and treatment of pancreatic cancer
AU2004255216B2 (en) * 2003-07-01 2010-08-19 Immunomedics, Inc. Multivalent carriers of bi-specific antibodies
KR100579153B1 (ko) * 2003-07-11 2006-05-12 김종오 암 치료 또는 암 진단용 방사성 자성유체, 이를 제조하는방법 및 용도
US9045739B2 (en) * 2004-01-16 2015-06-02 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Forderung Der Angewandten Forschung E.V. Immunokinases
WO2005069994A2 (en) * 2004-01-22 2005-08-04 Immunomedics, Inc. Folate conjugates and complexes
US8652484B2 (en) 2004-02-13 2014-02-18 Immunomedics, Inc. Delivery system for cytotoxic drugs by bispecific antibody pretargeting
JP5057967B2 (ja) 2005-03-31 2012-10-24 中外製薬株式会社 ｓｃ（Ｆｖ）２構造異性体
US8475794B2 (en) 2005-04-06 2013-07-02 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy with anti-CD74 antibodies provides enhanced toxicity to malignancies, Autoimmune disease and other diseases
US9241994B2 (en) 2005-06-10 2016-01-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2
KR101367544B1 (ko) 2005-06-10 2014-02-26 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 메글루민을 함유하는 단백질 제제의 안정화제, 및 그의이용
CA2619941C (en) * 2005-08-31 2014-04-01 Immunomedics, Inc. F-18 peptides for pre targeted positron emission tomography imaging
JP2009517402A (ja) * 2005-11-28 2009-04-30 ディー． ロウェ，バーノン 腎毒性の低減に有用な組成物及びその使用方法
EP1800695A1 (en) * 2005-12-21 2007-06-27 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Immuno-RNA-constructs
US20070242790A1 (en) * 2006-03-30 2007-10-18 The Regents Of The University Of California 10B(d,n)11C REACTION BASED NEUTRON GENERATOR
WO2007133728A1 (en) * 2006-05-12 2007-11-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Photodynamic therapy-generated mesothelioma vaccine
MX2008015524A (es) * 2006-06-12 2009-01-13 Trubion Pharmaceuticals Inc Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora.
US20100086522A1 (en) * 2006-07-18 2010-04-08 Ottawa Health Research Institute Disparate suicide carrier cells for tumor targeting of promiscuous oncolytic viruses
WO2012024223A2 (en) * 2010-08-17 2012-02-23 Immunomedics, Inc. Combination therapy with anti-cd74 antibodies provides enhanced toxicity to malignancies, autoimmune disease and other diseases
US8709382B2 (en) 2007-01-11 2014-04-29 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for improved F-18 labeling of proteins, peptides and other molecules
US8545809B2 (en) 2007-01-11 2013-10-01 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for improved 18F labeling of proteins, peptides and other molecules
US8153100B2 (en) * 2007-01-11 2012-04-10 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for F-18 labeling of proteins, peptides and other molecules
US20150086482A1 (en) * 2007-01-11 2015-03-26 Immunomedics, Inc. Dye Conjugated Peptides for Fluorescent Imaging
US8889100B2 (en) 2007-01-11 2014-11-18 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for improved F-18 labeling of proteins, peptides and other molecules
US8398956B2 (en) 2007-01-11 2013-03-19 Immunomedics, Inc. In vivo copper-free click chemistry for delivery of therapeutic and/or diagnostic agents
CN101002947B (zh) * 2007-01-16 2010-08-25 湖南农业大学 一种用于细菌病治疗的靶向药物及其制备方法
EP2118344B1 (en) * 2007-02-12 2014-07-23 Proteonova, Inc. GENERATION OF LIBRARY OF SOLUBLE RANDOM POLYPEPTIDES LINKED TO mRNA
CN101828113B (zh) * 2007-07-25 2014-04-16 德国弗劳恩霍夫协会债权安格万特学术研究所 自结合重组抗体融合蛋白
US8450106B2 (en) * 2007-10-17 2013-05-28 The Ohio State University Research Foundation Oncolytic virus
WO2009073236A1 (en) * 2007-12-05 2009-06-11 Marval Biosciences, Inc. Nano-scale contrast agents and methods of use
AU2014259570B2 (en) * 2007-12-19 2016-06-09 Immunomedics, Inc. Improved methods and compositions for F-18 labeling of proteins, peptides and other molecules
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
CN101716353B (zh) * 2008-10-09 2012-06-27 复旦大学 一种用于肿瘤及淋巴转移肿瘤影像学诊断的叶酸复合物
WO2010085984A1 (en) * 2009-02-02 2010-08-05 Okairos Ag Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof
EP3903829B1 (en) 2009-02-13 2023-05-03 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
KR101431318B1 (ko) 2009-04-02 2014-08-20 로슈 글리카트 아게 전장 항체 및 단일쇄 ｆａｂ 단편을 포함하는 다중특이성 항체
CA2757931C (en) * 2009-04-07 2019-03-26 Roche Glycart Ag Trivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
WO2011003780A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Bi-specific digoxigenin binding antibodies
SG179196A1 (en) 2009-09-16 2012-04-27 Genentech Inc Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
EP2478110B1 (en) 2009-09-16 2016-01-06 Immunomedics, Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
GB0916749D0 (en) * 2009-09-23 2009-11-04 Mologic Ltd Peptide cleaning agents
WO2011056721A2 (en) * 2009-11-05 2011-05-12 Center For Molecular Medicine And Immunology Immunoconjugates comprising poxvirus-derived peptides and antibodies against antigen-presenting cells for subunit-based poxvirus vaccines
CA2782194C (en) 2009-12-02 2018-01-16 Immunomedics, Inc. Combination of radiolabelled antibodies (rait) and antibody-drug conjugates (adc) for treatment of pancreatic cancer
CA2782223A1 (en) 2009-12-04 2011-06-09 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for improved f-18 labeling of proteins, peptides and other molecules
CA2782398C (en) * 2009-12-09 2017-09-26 Immunomedics, Inc. Delivery system for cytotoxic drugs by bispecific antibody pretargeting
CN102713623A (zh) 2010-01-22 2012-10-03 免疫医疗公司 早期胰腺腺癌的检测
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
WO2012025530A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized - fv fragment
US9718862B2 (en) 2010-10-06 2017-08-01 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Polypeptides and their use in treating and limiting respiratory syncytial virus infection
WO2012085111A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
WO2012095644A1 (en) 2011-01-12 2012-07-19 Siemens Aktiengesellschaft A compact, low energy neutron source
CA2825589A1 (en) * 2011-01-25 2012-08-02 George A. Luiken Method for combined imaging and treating organs and tissues
US9468660B2 (en) 2011-02-01 2016-10-18 Technion Research And Development Foundation Ltd. Antinematodal methods and compositions
CN103429263A (zh) * 2011-02-15 2013-12-04 免疫医疗公司 用于胰腺癌早期检测和治疗的抗粘蛋白抗体
JP5764677B2 (ja) 2011-02-28 2015-08-19 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗原結合タンパク質
CA2824824A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent antigen binding proteins
CA2831572C (en) 2011-05-02 2019-11-26 Immunomedics, Inc. Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration
WO2013113326A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Curevac Gmbh Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and at least one protein or peptide antigen
BR112014019579A2 (pt) 2012-02-10 2019-10-15 Genentech, Inc Anticorpo de cadeia única, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo de cadeia única, heteromultímero e método de produção do heteromultímero
EP2825553B1 (en) 2012-03-14 2018-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
WO2013152274A1 (en) 2012-04-05 2013-10-10 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Epitope- scaffold immunogens against respiratory syncytial virusm (rsv)
CA2871880A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for selection and production of tailor-made highly selective and multi-specific targeting entities containing at least two different binding entities and uses thereof
RU2015100656A (ru) 2012-06-27 2016-08-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ получения конъюгатов fc-фрагмента антитела, включающих по меньшей мере одну связывающую группировку, которая специфически связывается с мишенью, и их применения
US9382329B2 (en) 2012-08-14 2016-07-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Disease therapy by inducing immune response to Trop-2 expressing cells
US9155804B2 (en) 2012-09-26 2015-10-13 General Electric Company Contrast enhancement agents and method of use thereof
KR102168562B1 (ko) * 2012-11-19 2020-10-22 발리오팜 아게 Cd20 및 cd95에 결합하는 재조합 이중특이성 항체
WO2017004144A1 (en) 2015-07-01 2017-01-05 Immunomedics, Inc. Antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker
HUE057977T2 (hu) 2012-12-13 2022-06-28 Immunomedics Inc Ellenanyagok és SN-38 immunkonjugátumainak dózisai javított hatásossággal és csökkentett toxicitással
US9452228B2 (en) 2013-04-01 2016-09-27 Immunomedics, Inc. Antibodies reactive with an epitope located in the N-terminal region of MUC5AC comprising cysteine-rich subdomain 2 (Cys2)
KR20160044060A (ko) 2013-10-11 2016-04-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 다중특이적 도메인 교환된 통상의 가변 경쇄 항체
KR20160104628A (ko) 2014-01-03 2016-09-05 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이성 항-합텐/항-혈액뇌장벽 수용체 항체, 그의 복합체 및 혈액뇌장벽 셔틀로서 그의 용도
CN106029098A (zh) 2014-02-25 2016-10-12 免疫医疗公司 人源化rfb4抗cd22抗体
KR102127644B1 (ko) 2014-06-10 2020-06-30 삼성전자 주식회사 반도체 소자의 제조 방법
ES2779974T3 (es) 2014-06-13 2020-08-21 Tenboron Oy Conjugados que comprenden un anticuerpo anti-egfr1
GB201411320D0 (en) 2014-06-25 2014-08-06 Ucb Biopharma Sprl Antibody construct
AU2015328370B2 (en) 2014-10-07 2021-08-05 Immunomedics, Inc. Neoadjuvant use of antibody-drug conjugates
PL3227332T3 (pl) 2014-12-03 2020-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Wielospecyficzne przeciwciała
US10071181B1 (en) 2015-04-17 2018-09-11 Teleflex Innovations S.À.R.L. Resorbable embolization spheres
JP6746845B2 (ja) 2015-04-22 2020-08-26 イミューノメディクス、インコーポレイテッドＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ， Ｉｎｃ． 循環ｔｒｏｐ−２陽性癌細胞の単離、検出、診断及び／または特徴付け
CN114796501A (zh) 2015-06-25 2022-07-29 免疫医疗公司 抗体与治疗剂的组合治疗癌症的方法
EA038973B1 (ru) 2015-07-06 2021-11-17 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Полиспецифические антигенсвязывающие молекулы и их применения
US11352446B2 (en) 2016-04-28 2022-06-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making multispecific antigen-binding molecules
BR112018076326B1 (pt) 2016-12-15 2023-03-07 Société des Produits Nestlé S.A. Composição alimentícia para animais de estimação, seu uso, e métodos não terapêutico para modular pelo menos um dentre fósforo, fosfatase alcalina, aspartato aminotransferase ou gamaglutamiltransferase em um animal de estimação e para medir uma alteração na quantidade de pelo menos um dentre fósforo, fosfatase alcalina, aspartato aminotransferase, ou gamaglutamiltransferase
BR112019024127A2 (pt) 2017-05-24 2020-06-23 Pandion Therapeutics, Inc. Imunotolerância alvejada
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
US10174092B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
BR112021020425A2 (pt) 2019-04-12 2021-12-14 Ecolab Usa Inc Composições de limpeza multiuso concentrada e pronta para uso, e, métodos para limpar uma superfície e de fabricação da composição de limpeza multiuso
CN114679909A (zh) 2019-05-20 2022-06-28 潘迪恩运营公司 MAdCAM靶向的免疫耐受
CN113416249B (zh) * 2020-10-21 2023-04-07 北京智仁美博生物科技有限公司 针对破伤风毒素的组合物

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US693762A (en) * 1902-01-15 1902-02-18 William J Ward Car-fender.
US3077499A (en) * 1959-01-27 1963-02-12 Du Pont Preparation of bis(trifluoromethyl)amine
US3121424A (en) * 1961-05-04 1964-02-18 Warren O Russell Outdoor cooking apparatus
US3933592A (en) * 1965-02-17 1976-01-20 Hazleton Laboratories, Incorporated Method of detecting living microorganisms
US4468457A (en) * 1981-06-01 1984-08-28 David M. Goldenberg Method for producing a CSAp tryptic peptide and anti-CSAp antibodies
US4818709A (en) * 1983-01-21 1989-04-04 Primus Frederick J CEA-family antigens, Anti-CEA antibodies and CEA immunoassay
US4737453A (en) * 1984-12-12 1988-04-12 Immunomedics, Inc. Sandwich immunoassay utilizing a separation specific binding substance
US5101827A (en) * 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5776093A (en) * 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US4735210A (en) * 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5078998A (en) 1985-08-02 1992-01-07 Bevan Michael J Hybrid ligand directed to activation of cytotoxic effector T lymphocytes and target associated antigen
US4792521A (en) * 1985-08-15 1988-12-20 Immunomedics, Inc. Non-enzymatic immunohistochemical staining system and reagents
US4863713A (en) * 1986-06-23 1989-09-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. Univ. Method and system for administering therapeutic and diagnostic agents
US6121424A (en) * 1991-11-25 2000-09-19 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
FR2604092B1 (fr) 1986-09-19 1990-04-13 Immunotech Sa Immunoreactifs destines a cibler les cellules animales pour leur visualisation ou leur destruction in vivo
US5225541A (en) 1987-03-05 1993-07-06 Peralta Cancer Research Institute Composition containing CEA/NCA-specific monoclonal antibody XMMBR-B14 conjugated to a detectable moiety and a kit containing the antibody
US4971792A (en) * 1987-03-27 1990-11-20 The Wistar Institute Monoclonal antibodies against glycolipid antigens
US5328679A (en) * 1988-04-01 1994-07-12 Immunomedics, Inc. Methods for technetium/rhenium labeling of proteins
US5128119A (en) * 1989-06-12 1992-07-07 Immunomedics, Inc. Methods for technetium/rhenium labeling of f(ab1)2 fragments
US5851527A (en) * 1988-04-18 1998-12-22 Immunomedics, Inc. Method for antibody targeting of therapeutic agents
US5632990A (en) * 1988-04-22 1997-05-27 Cancer Research Campaign Tech. Ltd. Treatment for tumors comprising conjugated antibody A5B7 and a prodrug
US5183756A (en) * 1988-08-19 1993-02-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Monoclonal antibody (D612) having selective reactivity for gastrointestinal caricinomas and method for employing the same
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
JPH07116721B2 (ja) * 1989-01-31 1995-12-13 油谷重工株式会社 油圧ショベルの油圧回路
CA2047717C (en) * 1989-03-14 2000-08-01 Fred W. Wagner Monoclonal antibodies for small moieties, methods therefor
DE3920358A1 (de) * 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
FR2652004B1 (fr) 1989-09-21 1994-10-28 Immunotech Partners Nouveaux derives hydrophiles, application au diagnostic et a la therapeutique, kits diagnostiques ou therapeutiques et reactifs immunologiques.
US5469854A (en) * 1989-12-22 1995-11-28 Imarx Pharmaceutical Corp. Methods of preparing gas-filled liposomes
US5143715A (en) * 1990-03-28 1992-09-01 Molecular Biosystems, Inc. Organic contrast agent analog and method of making same
US5076998A (en) * 1990-06-21 1991-12-31 Westinghouse Electric Corp. Monitoring of low frequency pulse rate
BE1004372A3 (fr) 1990-08-16 1992-11-10 Staar Sa Dispositif d'extraction d'une fiche de courant electrique.
US5573920A (en) 1991-04-26 1996-11-12 Surface Active Limited Antibodies, and methods for their use
DE4118120A1 (de) * 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US5142023A (en) * 1992-01-24 1992-08-25 Cargill, Incorporated Continuous process for manufacture of lactide polymers with controlled optical purity
DE69334255D1 (de) * 1992-02-06 2009-02-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür
US6096289A (en) * 1992-05-06 2000-08-01 Immunomedics, Inc. Intraoperative, intravascular, and endoscopic tumor and lesion detection, biopsy and therapy
EP0643583B1 (en) * 1992-05-06 2000-07-26 Immunomedics, Inc. Intraoperative, intravascular and endoscopic tumor and lesion detection and therapy
TW244342B (ja) 1992-07-29 1995-04-01 Procter & Gamble
ZA938243B (en) 1992-11-12 1995-05-04 Hybritech Inc Altered affinity polypeptides of metal chelate binding antibodies
JP3720353B2 (ja) * 1992-12-04 2005-11-24 メディカル リサーチ カウンシル 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用
US5502037A (en) * 1993-07-09 1996-03-26 Neuromed Technologies, Inc. Pro-cytotoxic drug conjugates for anticancer therapy
IL113610A0 (en) * 1994-06-03 1995-08-31 Immunomedics Inc A method of radiolabeling a protein, radiolabeled proteins prepared thereby and diagnostic kits containing the same
US5746996A (en) * 1994-06-03 1998-05-05 Immunomedics, Inc. Thiolation of peptides for radionuclide-based radiodetection and radiotherapy
US5686578A (en) 1994-08-05 1997-11-11 Immunomedics, Inc. Polyspecific immunoconjugates and antibody composites for targeting the multidrug resistant phenotype
GB2293299A (en) * 1994-09-15 1996-03-20 Ibm Electric field emission reduction system
US5594828A (en) * 1995-03-27 1997-01-14 Hewlett-Packard Company Invention using fiber optics for light path from close proximity to an image to an area array image sensor
US5753206A (en) * 1995-06-07 1998-05-19 Immunomedics, Inc. Radiometal-binding analogues of luteinizing hormone releasing hormone
US6410690B1 (en) * 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
JP2000510119A (ja) 1996-05-03 2000-08-08 イムノメディクス，インコーポレイテッド ガンに対する標的コンビネーション免疫療法
AU725827B2 (en) * 1996-07-12 2000-10-19 Immunomedics Inc. Radiometal-binding peptide analogues
WO1998008875A1 (de) 1996-08-28 1998-03-05 Viva Diagnostika Diagnostische Produkte Gmbh Kombinationspräparationen und ihre verwendung in der immundiagnostik und immuntherapie
US6187284B1 (en) * 1997-09-03 2001-02-13 Immunomedics, Inc. Fluorination of proteins and peptides for F-18 positron emission tomography
AU760854B2 (en) 1998-06-22 2003-05-22 Immunomedics Inc. Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
US7138103B2 (en) * 1998-06-22 2006-11-21 Immunomedics, Inc. Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
US6962702B2 (en) * 1998-06-22 2005-11-08 Immunomedics Inc. Production and use of novel peptide-based agents for use with bi-specific antibodies
CN1202128C (zh) 1998-12-08 2005-05-18 拜奥威神有限公司 修饰蛋白的免疫原性
WO2000059547A2 (en) * 1999-04-02 2000-10-12 Center For Molecular Medicine And Immunology Method of detecting endometriosis
CA2529027C (en) * 2003-06-13 2013-09-10 Immunomedics, Inc. D-amino acid peptides

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140004530A (ko) * 2012-07-03 2014-01-13 한국생명공학연구원 ＩｇＧ Ｆｃ 위치선택적 결합 펩티드 및 이를 포함하는 하이브리드 분자
KR102006997B1 (ko) 2012-07-03 2019-08-02 한국생명공학연구원 ＩｇＧ Ｆｃ 위치선택적 결합 펩티드 및 이를 포함하는 하이브리드 분자

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