CN110747271A - 关于pci术后血管损伤-再狭窄程度的标记物 - Google Patents

Abstract

本申请涉及用增殖蛋白‑1(Proliferin‑1)来反映PCI术后血管损伤‑再狭窄的程度。

Description

关于PCI术后血管损伤-再狭窄程度的标记物

技术领域

本申请涉及一种反应PCI术后血管损伤-再狭窄程度的标记物，更具体地，所述标记物是增殖蛋白-1(Proliferin-1，PLF-1)。

背景技术

近年来随着经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)的发展，对急性冠脉综合征的预后有了极大的改善，PCI已经成为治疗急性冠脉综合征的首选方法。但是PCI术后局部血管功能紊乱导致的再狭窄的问题日益突出，已经成为医学界研究的热点。引起血管功能紊乱的主要原因一方面是球囊扩张的机械性损伤；另一方面是置入支架后，涂层支架的药物(化疗药物：西罗莫司、紫杉醇)所致的局部损伤及炎症反应；多方面原因导致平滑肌细胞凋亡及增殖，血管内皮化延迟，内皮细胞覆盖不良，术后血管再狭窄的发生。

临床上，现有的技术方案没有能够反应PCI术后血管损伤程度的标记物，不能够有效评估患者PCI术后血管的损伤程度。

目前，支架上的涂层药物主要为化疗药物：西罗莫司、紫杉醇等，非人体本身物质，抑制细胞增殖同时，引起局部的组织细胞凋亡及剧烈炎症反应，严重影响内皮细胞功能，损伤部位血管内皮化不完全，导致PCI术后血管再狭窄的发生。目前已有很多诊断冠心病的生物标志物(如高敏C反应蛋白等)，但仍然没有一个适用于判断PCI术后血管损伤程度及PCI术后预后的生物标志物。

发明内容

本申请者在研究中发现，PCI球囊扩张术后，局部血管损伤越重，术后增殖反应越强烈，而进一步研究发现，其增殖的程度与proliferin-1(PLF-1)的水平密切相关。

PLF-1属于催乳素/生长激素超家族，最初在灵长类胎盘中被发现，现有的研究认为PLF-1能够调控血管生成，促进内皮细胞和毛囊角质细胞的迁移，对肿瘤细胞的增殖具有正调控作用。目前主要用于肿瘤治疗中的血管再生相关方面。

本申请人通过动物实验研究发现，血管损伤后的细胞以及相关凋亡细胞本身可释放大量的促增殖因子，PLF-1就是其中之一。确切的说，血管损伤后，损伤的血管平滑肌细胞可释放PLF-1，且PLF-1的水平与血管损伤程度呈正相关。

动物实验中，通过基因沉默、中和抗体等方法阻断PLF-1的表达及其活性，可明显减轻或抑制损伤血管的平滑肌细胞增殖。

临床研究中，通过检测100例冠心病患者PCI术后第二天的PLF-1水平，发现PLF-1均有不同程度的增高，因此，我们首次提出PLF-1可作为反映PCI术后血管损伤-再狭窄程度的临床标记物。

本申请涉及PLF-1用于预测PCI术后血管损伤-再狭窄程度。为了进行预测，可以制成试剂盒，其中包含测试PLF-1水平(例如血浆水平)的测试剂。

因此，本申请涉及针对PLF-1的基因或蛋白产物的测试剂，包括但不限于，多核苷酸和多肽。所述多核苷酸例如基因探针和引物。所述多肽例如抗体、抗体片段。所述抗体例如多克隆抗体或单克隆抗体。

本申请的多核苷酸测试剂是与PLF-1基因或其互补链特异性杂交的多核苷酸，包括探针、引物、核苷酸和核苷酸衍生物。

本申请还提供了与PLF-1结合的抗体，包括用本发明的PLF-1多肽免疫动物(如兔)获得的抗血清、所有类别的多克隆和单克隆抗体、以及各种抗体片段。

本文中，术语“抗体”用其最广泛的意义，尤其包含完整的单克隆抗体，多克隆抗体，以及任何抗体片段，只要它们能显示所需生物学活性。

本文中，“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选包括抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab’，F(ab’)2，和Fv片段；二价抗体；线性化抗体；单链抗体分子；和由抗体片段构成的多特异性抗体。

“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)构成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，免疫球蛋白不同种型的重链中二硫键数目不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每个重链在其一个端有可变区(VH)，紧接着多个恒定区。每个轻链一端有可变区(VL)，而另一端有恒定区；轻链恒定区与重链第一恒定区并列，轻链的可变区与重链的可变区并列。认为轻链和重链的可变区有特定氨基酸形成一个界面。

抗体经木瓜蛋白酶消化产生两个相同的称为“Fab”的抗原结合片段和一个残余“Fc”片段，每个Fab片段具有单个抗原结合位点，Fc的名称反映了其容易形成结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab')2片段，它有两个抗原结合位点并仍能与抗原交叉结合。

“Fv”是最小抗体片段，包含一个完整的抗原识别和抗原结合位点。这个区域是由一条重链和一个轻链可变区紧密、非共价结合成的二聚体。在VH-VL二聚体表面，每个可变区的三个高变区在构型上相互作用，从而限定一个抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特性。但即使单个可变区(或Fv中仅包含三个抗原特异性高变区的那一半)也能识别并结合抗原，只是比完整结合位点的亲和力低。

脊椎动物任何物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以是两种完全不同的型(κ和λ)之一，型别区分的依据是其恒定区氨基酸序列。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，这些结构域存在于单个多肽链上。优选Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含一个多肽接头，它能使scFv形成抗原结合所需的结构。

“二价抗体(diabodies)”是指具有两个抗原结合位点的小分子抗体片段，这些片段在一条多肽链(VH-VL)上含有相连的一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)。利用一种非常短的接头，其使得同一条链上的两个结构域无法配对，不得不与另一条链上的互补结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。

本文中，术语“单克隆抗体”指从实质上均一的抗体群获得的抗体，即包含该群体的单个抗体除了可能自然发生的很少量突变以外都相同。单克隆抗体均以高度特异性直接针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体直接针对抗原上的单个表位。单克隆抗体除了具有特异性，其优势还在于，它们是通过杂交瘤培养而合成的，无其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆的”指抗体获自实质上均一的抗体群的特征，不应理解为限定由任何具体方法产生抗体。例如根据本发明使用的单克隆抗体可以用杂交瘤方法来制备，或用重组DNA法来制备，还可以是从噬菌体抗体库中分离得到。

多克隆抗体优选通过多次给动物皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂而产生。将所述相关抗原与针对所免疫的物种具有免疫原性的蛋白(如匙孔血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)用双功能试剂或衍生试剂，如马来酰亚氨苯甲酰基硫代琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基结合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(R和R1是不同烷基)，进行偶联是有效的。

可以用所述抗原、免疫原性偶联物或衍生物免疫动物，方法是，将100μg或5μg蛋白或偶联物(分别针对兔或鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混合，在多位点皮内注射该溶液。1个月后，多位点皮内注射起始量的1/5-1/10的肽或与弗氏完全佐剂的偶联物来加强免疫。7-14天后，对动物采血，测定血清中的抗体效价。对动物的加强免疫直到效价达到平台期为止。优选给动物加强注射相同抗原的偶联物，但也可以是偶联至不同蛋白和/或通过不同的交联剂偶联的偶联物。偶联物还可以是重组细胞培养物产生的融合蛋白。此外，可用明矾等聚集剂增强免疫应答。

单克隆抗体可以用杂交瘤方法制备。如上述免疫小鼠或其它适合的宿主动物如仓鼠，以激发那些产生或能产生特异性结合免疫用蛋白的抗体的淋巴细胞。另外，可体外免疫淋巴细胞。然后用适当融合剂，如聚乙二醇，使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。

将如此制备的杂交瘤细胞接种至适当培养基中并培养，优选该培养基含有一或多种能抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤培养基通常将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT-缺陷型细胞的生长。

优选骨髓瘤细胞是那些能有效融合、支持所选抗体生成细胞以稳定的高水平产生抗体，并对诸如HAT培养基等类似培养基敏感的细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，如可从ATCC获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。也可以用人骨髓瘤以及小鼠-人异质性骨髓瘤细胞系来产生人单克隆抗体。

可在含有生长的杂交瘤的细胞培养基中分析抗所述抗原的单克隆抗体的产生。杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性可通过免疫沉淀来分析，或通过诸如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)等体外结合试验来分析。

一旦鉴定出能产生具有所需特异性、亲和力、和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，将这些克隆通过有限稀释法进一步克隆并用标准方法进行培养。适于此目的的培养基包括如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可作为腹水中肿瘤的形式在动物体内生长。

由亚克隆分泌的单克隆抗体可用常规免疫球蛋白纯化方法如蛋白-A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基、腹水或血清中分离。

编码单克隆抗体的DNA可用常规方法很容易的分离和测序(如利用能与编码小鼠抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是这类DNA的优选来源。DNA分离后，可将其插入表达载体中，然后用此表达载体转染宿主细胞，如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以便在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。

也可从抗体噬菌体文库分离抗体或抗体片段，参见例如McCafferty等，Nature，348：552-554(1990)描述的技术制备。Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)和Marks etal.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)分别描述了用噬菌体文库分离鼠和人的抗体。后来的文献描述了通过链改组制备高亲和力(nM范围)的人型抗体(Marks et al.，Bio/Technology，10：779-783(1992))，以及用于构建大规模噬菌体文库的组合感染和体内重组方法(Waterhouse et al.，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))。因此，这些技术都可取代传统单克隆抗体杂交瘤技术来分离克隆抗体。

DNA也可通过用人类重链和轻链的恒定区编码序列取代小鼠同源序列来修饰，或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价结合来修饰。

通常用所述非免疫球蛋白多肽取代抗体恒定区，或取代抗体上一个抗原结合点的可变区，可形成二价嵌合抗体，其中一个抗原结合位点特异于一种抗原而另一个抗原结合位点特异于另一种抗原。

抗体片段的制备方法迄今已有多种。传统的方法是通过对完整抗体的蛋白水解性消化获得这些片段。但现在可直接通过重组宿主细胞产生这些片段。例如，可从上述抗体噬菌体库分离抗体片段。还可直接从重组宿主细胞培养中分离F(ab')2片段。其它产生抗体片段的技术对本领域技术人员是显而易见的。

本申请的测试剂还可带有标记，例如，可以用于链霉亲和素偶联物染色的生物素、磁珠、荧光染料(如荧光素、得克萨斯红(Texas red)、罗丹明(rhodamine)、绿色荧光蛋白等)、放射性标记(如3H，125I，.35S，14C，或32P)、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶以及其它常用于ELISA的酶)、热量测定标记(calorimetric labels)如胶体金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。放射性标记可以用照相胶片或闪烁计数器检测，荧光标记可以用光电探测器检测激发光。酶标记一般通过使酶与底物接触并检测酶作用于底物产生的反应产物来检测，热量测定标记通过简单观察着色的标记来检测。

本申请的测试剂盒可以直接通过商业途径购买或者用本领域已知的任何方法制得，只要所制得的测试剂能特异性识别PLF-1的核酸或蛋白。

在各个方面，本申请的方法利用体内或体外表达系统。在其他方面，本申请的方法采用了经过重组、合成或半合成方式产生的多核苷酸或抗体，或经过内源方式产生的多核苷酸或抗体(例如，天然存在的组分)。相应地，本申请还涉及用于产生本申请的多核苷酸的表达载体、以及宿主细胞，或者用于产生本申请的单克隆抗体的杂交瘤。

本申请还涉及检测PLF-1的试剂盒，其中包含一或多种PLF-1测试剂，例如上述例举的那些测试剂，但不限于此。

在另外的方面，根据本发明的试剂盒可进一步包含一或多个对照样品，所述对照样品包含已知水平的PLF-1。

本申请还涉及预测PCI术后血管再狭窄的方法，包括将血液样品与一或多种本申请所述测试剂进行接触，检测样品中的PLF-1水平。在本申请的预测方法中，可以采用商业购买的PLF-1标准品制作标准曲线来帮助确定PLF-1的测量值。

本申请的预测PCI术后血管再狭窄的方法可选自ELISA，RIA，免疫沉淀，蛋白质印迹，免疫组化染色，竞争结合测定等等，但不限于此。

附图说明

图1A：颈动脉球囊损伤模型：在距离颈总动脉分叉1.5cm处给予球囊压迫导致血管损伤(不同压力机械性损伤)。

图1B：显示球囊压力越大，血管损伤的内膜面积越大，并呈压力依赖性增高。

图1C：球囊损伤术后第4天，损伤血管局部的PLF-1蛋白表达增多，表达水平与球囊压力大小成正相关。

图1D-F：野生型小鼠(CatK^+/+)和Cat K基因敲除小鼠(KO小鼠；CatK^-/-)均给予双重血管损伤(见双损伤模型1D)，发现两组小鼠均出现血浆PLF-1水平增高，从第4天开始增高，14天时到达峰值，在较高水平维持至28天。虽然血管损伤后，Cat K基因敲除小鼠的PLF-1水平也有增高，但是与野生型小鼠比较，其增高幅度显著低。单损伤和双损伤颈动脉血管组织内PLF-1蛋白也高表达。

图1G：免疫染色显示：损伤血管(主要内膜)显示出很强的PLF-1阳性染色信号。

图2A：临床研究发现，冠心病患者接受PCI术后，其血中PLF-1水平较术前明显增高(备注：PCI过程中需球囊扩张)。

图2B：冠心病患者接受PCI术前及术后肌钙蛋白(Troponin：心肌梗死标记物)水平无明显变化，提示血浆PLF-1水平与球囊扩张性损伤明显相关，可能主要来至于血管。

图2C：与对照组相比，冠心病患者本身血浆PLF-1水平是增高的。

图3A：在检测的54种增殖刺激因子表中，高浓度H₂O₂刺激平滑肌细胞PLF-1的表达高于对照组(超过6倍)，在组织蛋白酶基因敲除小鼠只检测到微量。

图3B：在不同浓度的H₂O₂刺激下PLF-1表达分泌呈浓度依赖性。

实施例

经皮冠状动脉介入治疗(PCI)的原理为给予狭窄(粥样斑块位置)的冠状动脉进行球囊扩张，扩张后置入冠脉支架。球囊扩张的压力为血管内膜损伤的基础。因此，本申请选择了模拟球囊损伤的颈总动脉球囊损伤模型。通过体内实验及体外实验两方面验证。

1、颈动脉气囊损伤模型的体内实验

实验动物：10周龄大鼠(Waster，日本SLC股份有限公司，日本静同県浜松市)，体重220-250g。

模型组：穿刺股动脉，将球囊导管送至颈总动脉分叉前，给予球囊不同的压力(0，1.8，3.5.4.0，4.5大气压)，造成颈总动脉内膜损伤(图1A)。

对照组：股动脉穿刺及球囊导管插入处理(无气囊扩张)。

给予气囊压力越大，损伤血管内膜面积越大，凋亡细胞数量越多，同时损伤血管内膜中PLF-1的表达越多(见图1B-C)。

2、颈动脉气囊损伤模型的体内实验

实验动物：7周龄野生小鼠(C57BC/6j，日本SLC股份有限公司，日本静同県浜松市)和Cat K基因敲除小鼠(C57BC/6j，美国哈佛大学医学部，施国平教授提供)，体重20-30g。

模型组：于颈内外动脉球分叉直下，给于结扎造成单损伤模型(图1D左)；结扎后再套塑料套管，造成双损伤模型(图1D右)。

对照组：颈部皮肤切开，只做颈总动脉分离术，不做任何处理。

血浆PLF-1用兔多克隆抗PLF-1经ELISA测定。以鼠rPLF-1短变异体(PA-0659；Bioclone，San Diego，CA)生成标准曲线。用酶标仪(BioTex，Tokyo，Japan)检测450和600nm处的最佳吸光度。鼠血PLF-1值用ng/mL来表示，批间和批内变异系数均＜8％。每个样本检测两次取平均值。TUNEL染色：凋亡细胞染色。内膜面积大小：H&E染色。PLF-1蛋白表达：免疫印迹(Western Blot)。

发现损伤术后0、4、14、28天检测两种基因型小鼠的血浆PLF-1的水平发现PLF-1水平均在损伤第4天开始增高，14天时最高，持续至28天，见图1E。虽然血管损伤后，Cat K基因敲除小鼠的PLF-1水平也有增高，但是与野生型小鼠比较，其增高幅度显著低。蛋白印迹法检测结果显示单损伤和双损伤颈动脉血管组织内PLF-1蛋白也高表达(见图1F)

总之，这些图表明，血管内膜损伤后，凋亡细胞增多，PLF-1的水平增高，且与损伤后内膜增生程度呈正相关。

3.体外的H₂O₂刺激实验

鉴于平滑肌细胞为血管内膜的主要组成细胞，本实验采用野生型小鼠的平滑肌细胞。以H₂O₂模拟体内氧化应激损伤：给予不同浓度的H₂O₂(0μM，750μM)刺激24小时，蛋白质组剖面仪阵列(proteom profiler arrays：54种增殖因子检测/R&D systems公司)试剂盒检测到54种增殖刺激因子表达，其中PLF-1的表达高于对照组6倍(见图3A)，并在不同浓度刺激(0，250，750μM)时呈浓度依赖性，见图3B。但，组织蛋白酶基因敲除小鼠只检测到微量。可见，PLF-1是H₂O₂刺激所致受损平滑肌细胞分泌的。

4.临床实验

1)名古屋大学附属医院住院冠状动脉造影(coronary angiograph，CAG；狭窄≥75％)诊断冠心病稳定型心绞痛患者，择期行PCI手术患者100名(62.8土11.9岁)术前和术后2天血浆PLF-1水平比较。

方法：分别测定两组的PLF-1的基础值及PCI前2小时和术后24小时的血PLF-1的水平。

2)冠心病患者(日本名古屋大学附属医院住院CAG诊断冠心病55例；63.5土10.4岁)和非冠心病作为对照组(日本名古屋中日医院健康体检人群49例；60.9土12.4岁)。

结果：冠心病患者本身PLF-1的水平是增高的，提示冠脉动脉粥样硬化斑块本身存在凋亡-增殖过程。PCI术后，患者的血浆PLF-1水平明显增高(图2A)，提示损伤的血管内膜细胞(平滑肌细胞)开始释放PLF-1，启动损伤后的增殖反应。但血浆肌钙蛋白T的水平无变化(图2B)，由于肌钙蛋白T反映心肌损伤，故图2B提示与心肌损伤无关。

这里针对人血PLF-1检测方法，与上文中针对小鼠PLF-1的检测方法相同。

本实施例表明，PCI术后损伤的血管内膜平滑肌细胞开始释放PLF-1，刺激内膜的增生。PLF的水平变化可以反应增生的程度，即术后再狭窄的程度。因此，PLF-1可以成为PCI术后血管损伤-再狭窄的标记物。

Claims (8)

1.PLF-1可作为PCI术后血管损伤-再狭窄程度的标记物。

2.预测PCI术后血管损伤-再狭窄程度的试剂盒，包含PLF-1测试剂。

3.权利要求2的试剂盒，其中PLF-1测试剂选自PLF-1蛋白测试剂和PLF-1核酸测试剂。

4.权利要求3的试剂盒，其中PLF-1蛋白测试剂是抗体。

5.权利要求4的试剂盒，其中的抗体是多克隆抗体。

6.权利要求3的试剂盒，其中PLF-1核酸测试剂是多核苷酸。

7.PLF-1或其测试剂在制备预测PCI术后血管损伤-再狭窄程度的试剂盒中的用途。

8.预测PCI术后血管损伤-再狭窄程度的方法，通过检测血液标本中PLF-1的水平来判定血管损伤-再狭窄程度。

Images