FI101381B - Nukleotidisekvenssi ja menetelmä polypeptidin HSA(1-387) tuottamiseksi - Google Patents

Description

101381

Nukleotidisekvenssi ja menetelmä polypeptidin HSA(l-387) tuottamiseksi Tämä keksintö koskee uutta nukleotidisekvenssiä, joka voidaan tuottaa yhdistelmä-DNA-tekniikalla ja jota voidaan käyttää useisiin olemassa oleviin ihmisen seerumin albumiinin sovellutuksiin.

Ihmisen seerumin albumiini (HSA) on runsain plasmaproteiini, ja se muodostaa 60 % paino/paino plasman kokonaisproteiini-sisällöstä. HSA-molekyyli koostuu yksittäisestä ei-glyko-syloidusta 585 aminohapon polypeptidiketjusta kaavamolekyy-lipainon ollessa 66 500. HSA:n aminohapposekvenssi on osoitettu proteiinisekvenssianalyysillä (Meloun et ai., 1975, "Complete amino acid sequence of human serum albumin" FEBS. Letters: 59:1, 136-317; Behrens et al., 1975, "Structure of human serum albumin" Fed. Proc. 34., 591) ja äskettäin geneettisellä analyysillä (Lawn et ai., 1981, Nucleic Acids Research 9., 6102-6114) . Vaikkakin julkaistujen aminohapposekvenssien välillä on ollut poikkeavuuksia (jotkin on luettava polymorfismin tiliin), esittää kuvio 1 sitä aminohapposekvenssiä, jonka uskotaan olevan tällä hetkellä ihmispopulaatiossa olevalle HSA:lie kuvaavimman.

Suhteellisen pienen molekyylipainonsa ja fysiologisessa pH:ssa • · · \·' olevan negatiivisen nettovarauksensa takia (Peters, 1970, ’·*·* "Serum albumin", Adv. Clin. Chem. 13., 37-111), HSA on 85 % normaalin plasman osmoottisesta tehosta. Täten HSA on plasma- \\* tilavuuden pääasiallinen säätelijä. HSA:n sekundaarinen tehtä- • · : vä on kataboliittisissa prosesseissa tuotettujen pienien mole- kyylien sitominen (esimerkiksi rasvahapot ja bilirubiini) .

• · ... Albumiini on pääasiallinen keino näiden avainmetaboliittien, jotka ovat huonosti liukenevia fysiologisessa pH:ssa, kuljet-• '.· tamiseksi. HSA:n fysiologiset, kemialliset, immunologiset ja *:*·: rajoitetut proteolyyttiset tutkimukset ovat osoittaneet, että molekyyli koostuu polypeptidiketjualueista, jotka säilyttävät rakenteensa sen jälkeen, kun ne on erotettu emämolekyylistä 2 101381 entsymaattisesti. Nämä polypeptidiketjut säilyttävät sitomis-kykynsä helpottaen täten bi1irubiinin, rasvahappojen ja muiden pienten molekyylien sitoutumiskohtien kartoittamista tietyille polypeptidiketjun alueille (Kragh-Hansen, 1981, "Molecular aspects of ligand binding to serum albumin". A. Soc. Pharm. Expt . Ther. 33., 1, 17-53), Tämän alueen informaatiosta on tehty runsaasti katsauksia (Brown ja Shockley, 1982, "Serum albumin: structure and characterisation of its ligand binding sites " ) .

Syyt, miksi HSA:ta käytetään kliinisesti terapeuttisina kon-eentraatioina, liittyvät pääasiassa sen turvottavaan toimintaan plasmatilavuuden laajentajana. HSA-konsentraatteja on käytetty terapeuttisesti 1940-luvulta lähtien, erityisesti shokki-, palohaava-, aikuisen hengityshäiriösyndrooma- ja kardiopulmonaarissa ohitustapauksissa. Albumiinia on käytetty myös akuuttieissa maksan toimintavajaustapauksissa, jotka seuraavat, kun kirroosipotilaa1ta poistetaan vesivatsanesteet, leikkauksen jälkeen, akuuttisessa nefroosissa, munuaisdialyy-sissä, ja kuljetusproteiinina toksisten aineiden, kuten vastasyntyneiden hemolyyttisessä taudissa, vakavassa keltataudissa, poistamiseksi.

. . Sen lisäksi että HSA:ta käytetään terapeuttisena aineena, se l * on pääkomponenttina seerumissa, jota lisätään alustaan nisä- *·*·* kässolujen kasvattamiseksi kudosvil jelmässä . Seerumin käyttö, ja täten albumiinin, on lisääntynyt viime vuosina, kun biotekniikka ja farmaseuttiset yhtiöt ovat laajentaneet kudos-viljelyä tutkimukseen ja tuotantoon. Näitä tarkoituksia varten on yleismaailmallinen tarve saada alhaisemmat kustannukset ja : seerumien paremmat säätelyt.

• · • · ‘ * On tunnettua manipuloida HSA:ta koodaavaa DNA-sekvenssiä re- kombinanttipolypeptidin ekspressoitumiseksi mikro-organismis-ea. Tällainen rekombinantti-HSA-polypeptidi on tuotettu bak-;’· j teerilajeissa kuten Escherichia coli <GB-patentti 2 147 903B) ja Bacillus subtilis (EP-patenttihakemus 86304656.1) 3 101381 ja hiivassa Saccharomyces cerevisiae (EP-patenttijulkaisu 201 239,); täten on yleisesti hyväksytty, että rekombinanttipoly-peptidiä, joka on pääosin identtinen luonnollisen HSA:n kanssa, voidaan tuottaa erilaisissa mikrobi-isännissä käyttämällä tunnettuja menetelmiä. Kuitenkin kaikissa tapauksissa, joissa on tuotettu rekombinantti-HSA:ta, päämääränä on ollut tuottaa molekyyli, joka on "identtinen luonnon" HSAtn kanssa rakenteeltaan ja biologiselta toiminnaltaan.

Nyt on huomattu, että on edullista tuottaa lyhyempiä HSA-muotoja. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Eräässä tämän keksinnön suoritusmuodossa saadaan polypeptidi, joka sisältää ihmisen seerumin albumiinin N-terminaalisen osan aminohappotähteeseen n asti, jossa n on 369:stä 419:ään, ja sen muunnelmia.

Keksinnön uusia polypeptidejä nimitetään jäljempänä "HSA-(1-n)".

Ilmaisun "ihmisen seerumin albumiinit" on tarkoitettu sisältävän (mutta ei välttämättä rajoittuvan) tunnettuja tai vielä , keksittävien HSA:den polymorfisia muotoja. Esimerkiksi albu- '. miini Naskapilla on Lys-372 Glu-372:n paikalla ja pro-albu- m*/‘. miini Christchurchillä on muuttunut pro-sekvenssi. Ilmaisun • · · "muunnelmat" on tarkoitus sisältää (mutta ei välttämättä ra- • · · *·*·’ joittua) pieniä keinotekoisia muunnelmia jäännöksiä 1-n (kuten molekyylejä, joilta puuttuu yksi tai muutama jäännös, joilla • · V.* on konservatiiviset substituutiot tai pieniä jäännösten in- ·«· : sertioita tai joilla on pieniä aminohapporakenteen muunnok- siä) . Täten polypeptidejä, joilla on 80 %, mieluummin 85 %, • · ... 90 % tai 99 %, homologiaa minkä tahansa HSA (1-n) -yhdisteen kanssa, pidetään "muunnelmana". Sellaiset muunnelmat ovat ; *.; mieluummin 360-430 aminohappoa pitkiä, mieluiten 369-419 ami- nohappoa pitkiä ja kaikkein mieluimmin 386-388 aminohappoa pitkiä. Sellaisille muunnelmille on edullista olla fysiologi- 101381 4 eesti samanarvoisia HSA <1-n)-yhdisteiden kanssa; tämä tarkoittaa, että muunnelmilla on ainakin yksi yhteinen farmakologinen hyödyllisyys HSA (l-n)-yhdisteen kanssa. Lisäksi jokaisen oletetun muunnelman, jota aiotaan käyttää farmakologisesti, pitäisi olla ei-immunogeeninen eläimessä (etenkin ihmisessä), jossa sitä käytetään.

Konservatiiviset substituutiot ovat sellaisia, joissa yksi tai useampia aminohappoja korvataan toisilla, joilla on samankaltaisia ominaisuuksia niin, että taitava polypeptidikemisti odottaisi ainakin polypeptidin sekudäärirakenteen ja mieluummin tertiäärirakenteen olevan pääkohdittain muuttumaton. Esimerkiksi tyypillisiä sellaisia substituutioita on alaniinin tai valiinin korvaaminen glysiinillä, arginiinin tai aspara-giinin korvaaminen glutamiini 1la, seriinin korvaaminen aspa-ragiinilla ja histidiinin korvaaminen lysiinillä. Muunnoksilta voi vaihtoehtoisesti, tai yhtä hyvin, puuttua kymmenenkin (mieluummin vain yksi tai kaksi) aminohappotähdettä verrattuna mihin tahansa annettuun HSA (l-n):ään; mieluummin mikä ' ; tahansa sellainen poisjättäminen tapahtuu molekyylin 100- 369 osassa (verrattuna kypsään HSA:aan itseensä). Samalla lailla kymmenenkin aminohappoa, mutta mieluummin vain yksi tai kaksi, voidaan lisätä, taas etusijassa 100-369 osaan. II-maisu "fysiologisesti toiminnalliset ekvivalentit" sisältää ♦ ♦ ♦ • * myös suurempia molekyylejä käsittäen mainitun l-n-sekvenssin • · · • ·* sekä lisäksi sekvenssin N-terminaalissa (esimerkiksi pro-HSA- (1-n), pre-pro-HSA(1-n), met-HSA(1-n), ja HSA(l-n), joilla on sopiva johtosekvenssi, joka ei välttämättä ole luonnostaan HSA:lie kuuluva).

• · · ♦ · · • · · :V: Jos HSA (1-n) valmistetaan viljelemällä transformoitua hiivaa • · ! (S. cerevieiae) kuten jäljempänä kuvataan yksityiskohtaisem- min, johtosekvenssi voi olla esimerkiksi se, joka löytyy *···* luonnostaan hiivan alfa-faktori-proteiinin kanssa. C-termi- • t ; ' ; naalifuusiotuotteita muiden kiinnostavien polypeptidien kanssa ;’· | voidaan tuottaa. HSA:n tunnetut muodot ja fragmentit voidaan 101381 5 selvästi pitää jätettyinä aiemman kuvauksen ulkopuolelle, esimerkiksi HSA (1-387), joka oli peptinen, alhaisella saannolla tuotettu fragmentti (Geisow ja Beaven, Biochem. 3.

161 . 619-624, 1977 ja ibid. 163. 477-484, 1977). Nämä aikaisemmat artikkelit tunnistavat fragmentin l-386:ksi, mutta sen jälkeen on tullut selväksi (katso esimerkiksi Lawn et ai, opcit.), että tämä johtuu kirjoittajien käyttämästä väärin julkaistusta sekvenssi-informaatiosta ja että fragmentti oli itse asiassa 1-387). Samaten, C-terminaalifuusioproteiinia, joka sisältää HSA (1-n) ja jäljelle jäävät HSA-jäännökset (numerot n+1 - 585) ei ole vaadittu osaksi keksintöä.

Erityisen edulliset uudet HSA (1-n)-yhdisteet sisältävät HSA (1-373) (se on C-terminaalinen Vai), HSA (1-388) (se on C-terminaalinen Ile), HSA (1-389) (se on C-terminaalinen Lys), HSA (1-390) (se on C-terminaalinen Gin) ja HSA (1-407) (se on C-terminaalinen Leu).

HSA (1-n)-molekyylit tuotetaan edullisemmin rekombinantti- ‘ ; DNA-tekniikalla (vaihtoehtoisesti sitä seuraa proteolyyttinen , pilkkominen) kuin luonnollisen HSA:n kemiallisella tai ent- '. symaattisel la hajottamisella, tai peptidisynteesillä. Entsy- maattisen hajottamisen tapauksessa esimerkiksi trypsiinin .. tapainen entsyymi leikkaa HSA:n Lys(389):n ja Gln(390):n vä- * · · Γ’ listä, mutta myös samanaikaisesti muista leikkauskohdista.

• · · • · · *· Tulevaisuudessa, peptidisynteesi voi tulla mahdollisemmaksi molekyyleille, jotka ovat 419:n aminohapon pituisia, mutta tällä hetkellä se ei ole käytännön tehtävä. Hiivassa eks-pressoituminen on erityisen edullista.

··♦ -· ► * • · « * ·

On havaittu, että ainakin joissakin tilanteissa, joissa HSA .·. ; ( 1-n)-yhdis t et tä tuotetaan kasvattamalla transformoitua isän- ,···_ tää, systeemissä luonnostaan olevat entsyymit leikkaavat pro- teolyyttisesti joitakin HSA ( 1-n) -yhdisteitä, jotka ovat pi- « « 9 '...· dempiä kuin HSA ( 1-387), takaisin HSA (1-387) :ksi. Täten voidaan käyttää haluttaessa, annettua HSA ( 1-n)-yhdistettä 101381 6 vastaavaa nukleotidisekvenssiä toisen HSA <1-n)-yhdisteen valmistamiseen.

Tässä kuvattuja uusia molekyylejä voidaan käyttää tehokkaina substituutteina joko luonnon HSA:lie tai rekombinantti-HSA:lle, joka on identtinen luonnon HSA:n kanssa, plasmatilavuuden laajentajana. HSA <l-n):n etu verrattuna luonnon HSA:han ja rekombinantti-HSA:hän, joka on identtinen luonnon HSA:n kanssa, liittyy tehoon, jolla nostetaan veren kolloidista osmoottista painetta. Tämän keksinnön proteiinin pienempi molekyy1ipaino (noin 44 kiloda1tonia) tarkoittaa, että vain 1/2-2/3 luonnon HSA:ta tai luonnon HSA:n kanssa identtistä rekombinantti-HSA:ta yksittäisestä proteiiniannoksesta tarvitaan ekvivalenttiseen kolloidiseen osmoottiseen tehoon. Siis mikä tahansa menetelmä tämän uuden polypeptidin tuottamiseksi rekombinantti-DNA-tekniikalla voi tarjota huomattavia taloudellisia etuisuuksia verrattuna tunnettuihin menetelmiin, joilla tuotetaan rekombinantti-HSA:ta, joka on identtinen luonnon HSA:n kanssa, sillä huomattavasti vähemmän proteiini-pitoista materiaalia tarvitaan tuottamaan tehokas annos.

Täten keksinnön toinen suoritusmuoto antaa farmaseuttisen koostumuksen, joka sisältää HSA(1-n)plus:n, jossa HSA (1-n)- ·_ plus on HSA (1-n) kuten aiemmin on kuvattu tai mitä tähän- • * · I I sa HSA (1-n)-molekyylejä, jotka tunnetaan per se, mutta niitä ei ole ehdotettu farmaseuttiseen käyttöön.

HSA (1-387), joka kuten aiemmin selostettiin, oli fragmentti, joka tuotettiin sattumalta tekniikan tason mukaisessa HSA:n • · · · peptieeesä pilkkomisessa, on erityisen edullinen HSA(l-n)plus: • · ::: na sellaisessa farmaseuttisessa koostumuksessa. Koostumus voi ·’ J sisältää HSA (l-387):n "muunnelmia’' kuten aiemmin määritel- ... * t i i n .

101381 7

Kolmas suoritusmuoto antaa menetelmän käsitellä ihmistä shokki-, palo- ja muissa olosuhteissa, joissa albumiinia indikoidaan, ja menetelmässä annetaan laskimonsisäisesti ei-toksinen määrä verenmäärää laajentavaa tai verta selvittävää tehokasta steriiliä ei-kuumetta aiheuttavaa HSA(1-n)plus:aa sisältävää polypeptidiliuosta.

Keksinnön muut suoritusmuodot sisältävät <a) vektoreita, plas-mideja ja transformoituja mikro-organismeja, mukaan lukien solulinjat, jotka koodaavat HSA (l-n)plus:n ekspressoitumieta; <b) menetelmiä HSA <l-n)plus:n tuottamiseksi, jotka menetelmät sisältävät mikro-organismien fermentaation sopivissa olosuhteissa (mukaan lukien solukirje) transformoituna niin, että HSA (l-n)plus ekspressoituu; ja (c) laboratorioaluetat, jotka sisältävät HSA (l-n)plus:n.

Ainakin joidenkin HSA (1-n)plus-molekyy1 ien lisäetuja verrattuna rekombinantti-HSA:han, joka on identtinen luonnon HSA:n kanssa, on niiden pienempi koko ja täten vähentynyt aminohap-: .· poeisältö, joiden on havaittu johtavan kasvaneeseen saantoon, : (molekyyliä solukuivapainoa kohti), joka saadaan mikrobi-isän- : : nissä verrattuna tämänhetkisiin luonnon HSA:n kanssa ident- ·· tisiin rekombinantti-HSA-saantoihin . Täten ei olla ainoas- taan havaittu, että prosessin mittakaavaa voidaan pienentää, • · mutta myös tuottavuutta rekombinantti-isäntäorganismissa voidaan 1isätä.

Keksinnön yhdisteitä voidaan käyttää veren määrää laajentavina (plasmatilan laajentajana) tekijöinä analogisilla tavoilla ja • * · *·* ' analogisissa formuloinneissa kuin itse HSA:ta, paitsi että • · HSA (1-n)plus-yhdisteen annos (painona) on yleensä vähemmän : kuin HSA: ta, sillä edellisen turvotus va ikutus on suurempi.

.···. Apteekkari tai k 1 iinikkoammattimies kykenee helposti ratkaiee- maan rutiini- ja ei-keksimiskokeilulla HSA < l-n)plus-yhdisteen '...· optimaalisen annoksen. Yleensä annettavan HSA (l-n)plus:n * · ·; määrä on kaks ikolmannesta annettavasta HSA-määrästä .

101381 8 HSA (l-n)plus-yhdieteitä voidaan käyttää myös: (1) korvaamaan HSA:ta tai yleisemmin naudan seerumin albumiinia <BSA) kudosviljelyalustoissa, jolloin alustan kontaminaation vaaraa vähennetään esimerkiksi viruksilla tai mykoplas-moilla; (2) korvaamaan BSA:ta nestekromatografiän stationää-rifaasissa enantiomeerien hajottamiseksi ja niin edelleen.

Keksintöä valaistaan nyt esimerkein ja viittaamalla kuvioihin, joissa: kuvio 1 kuvaa aminohapposekvenssiä, jonka ajatellaan olevan tällä hetkellä luonnon HSA:n tyypillisin edustaja, jolla on HSA(l-n):n vaihtoehtoinen (laatikoitu) C-terminaali; kuvio 2 kuvaa kypsää HSA:ta koodaavaa DNA-sekvenssiä; kuvio 3 valaisee kaaviollisesti mHOB16:n rakennetta; kuvio 4 valaisee kaaviollisesti pHOB31:n rakennetta; ja kuvio 5 on kopio rakettielektroforetogrammista ja siinä nähdään HSA < 1-389) :n kasvanut saanto verrattuna täydelliseen HSA:hän.

Standardi rekombinantti-DNA-menetelmät ovat kuten Maniatis et ai. (1982) ovat kuvanneet, ellei toisin mainita. M13-rekombi-nanttikloonien rakentaminen ja analyysi oli kuten Messing ( 1983) ja Sanger et ai, ( 1977) kuvasivat.

• · • · • · · • · ·

Seuraavien molekyylien valmistuksessa käytetty ihmisen seerumin albumiinin koodaussekvensei on johdettu plasmidista Ml3mpl9.7 (EP-patenttihakemus no 201 239, tai oiigonukleoti-dien synteesillä, jotka ovat vastaavia osalle tätä sekvenssiä.

• · · V * Oligonukleotidit syntetoitiin käyttämällä fosforiamidiittike- miaa Applied Biosystems 380B o1igonukleotidisyntetisaattori1la ; tuottajan suositusten mukaan (AB Inc., Warrington, Cheshire,

Englant i).

101381 9

Esimerkki 1: HSA (1-389)

Rakennettiin sellainen ekspressiovektori, jossa DNA, joka koodaa HSA-erityssignaalia ja kypsää HSA:ta 389:nteen (tämä mukaan lukien) aminohappoon, lysiini, asetettiin S. cerevi-siaen fosfoglyseraattikinaasigeenin (PGK) promoottorin alapuolelle ja sitä seurasi lopetuskodoni ja transkription PGK-terminaattori. Tämä vektori vietiin sitten S. cerevisiaehen transformaatiolla ja se ohjasi soluista molekyylin, joka edusti HSA:n N-terminaalisia 389:ää aminohappoa, ekspressoitu-mista ja erittymistä.

Syntetisoitiin oligonukleotidi (kytkijä 1), joka edusti osaa HSA:n tunnetusta koodaussekvenssistä (kuvio 2) Pet I-paikasta (1092, kuvio 2) väliini 381 kodoniin asti, missä tuo kodoni muutettiin GTG:stä GTC:ksi,

Kytkijä 1

DPHECYAKVFDE : V 5' GAT CCT CAT GAA TGC TAT GCC AAA GTG TTC GAT GAA

3' ACGT CTA GGA GTA CTT AC G ATA CGG TTT CAC AAG CTA CTT

V : 1100 1120

F K P L V

• * t TTT AAA CCT CTT GTC 3' • · · AAA TTT GGA GAA CAG 5'

Kytkijä 1 ligoitiin M13mpl9-vektoriin (Norrander et ai, 1983), joka oli leikattu Pstl:llä ja Hindi :11a ja ligaatio- • · · *·’ seosta käytettiin transfektoimaan E. coli-kanta XLl-Blue • · V.: (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA). Rekombinantti- •\j kloonit tunnistettiin niiden kyvyttömyydestä kehittää sinistä väriä alustaan, jossa oli väriä synnyttävää indikaattoria X-gal <5-bromi-4-kloori-3-indoli-/3-D-galaktosidi) IPTG:n läs- « « • · 101381 10 näollessa ( ieopropyylitio-^3-galaktosidi ) . Rekombinanttikloo-nien bakteriofagipartikkeleieta valmistetun templaatti-DNA:n DNA-sekvessianalyysi tunnisti molekyylin, jolla oli vaadittu DNA-sekvenssi, jota merkittiin mHOB12 (kuvio 3).

Ml3mpl9.7 koostuu M13mpl9:ssä olevan kypsän HSA:n koodaus-alueesta (Narrander et ai, 1983), niin että HSA:n ensimmäisen aminohapon kodoni, CAT, ulottuu osin ainutlaatuisen Xhol-pai-kan yli, täten:

Asp Ala 5 ' le ψ T C G A g! A T G C A 3' 3' |G A G C T.p C( T A C G T 5'

Xho I

(EPÄ no 210 239 AI). M13mpl9.7 leikattiin XhoI:llä, tehtiin tasapäiseksi Sl-nukleaaeikäsittelyllä ja ligoitiin sitten seuraavan oligonukleotidin kanssa (kytkijä 2):

Kytkijä 2 5' TCTTTTATCC >A1 2 3A G C T Τ' GGATAAAAGA3' 3' AGAAAATAGG ,Τ T C G Af>Ai CCTATTTTCT5'

Hindlll • % « · · 2 • · · • · »

Ligaatioeeosta käytettiin sitten transfektoimaan E.coli XL1-Blue ja templaatti-DNA valmistettiin useista plakeista ja analysoitiin sitten DNA-sekvennoinnilla kloonin, pDBDl (kuvio 4), jolla on oikea sekvenssi, tunnistamiseksi.

3 * · ♦ • · V,· 1.1 ke Hindi 11-Pst I-fragmentti, joka edustaa HSA:n koodaus- « · .·. : alueen 5'-päätä ja puolta insertoidusta oiigonukleotidikytki- ,· <( jäetä, eristettiin pDBDl:Itä agaroosigee1ielektroforeesi1la.

V. Tämä fragmentti ligoitiin sitten kaksijuosteisen mHOB12:n '...· kanssa, joka oli aikaisemmin leikattu HindIII:lla ja Pstl:llä ja ligaatioseosta käytettiin sitten transfektoimaan E. coli 101381 11 XLl-Blue. Yksijuoeteinen templaatti-DNA valmistettiin useiden plakkien kypsistä bakteriofagipartikkeleista. DNA tehtiin kaksijuosteiseksi in vitro pidentämällä siihen liitettyä sek-ventointialuketta DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentilla deoksinukleosiditrifosfataasin läsnäollessa. Tämän DNA:n rest-riktioentsyymianalyysi salli kloonin, jolla oli oikea konfiguraatio, mHOB15 (kuvio 4), tunnistamisen.

Seuraava oligonukleotidi (kytkijä 3) esittää kypsän HSA:n 382 aminohapon kodonista (glutamaatti, GAA) lysiinin 389 ko-doniin, jota seuraa lopetuskodoni (TAA) ja Hindi II-paikka ja sitten BamHI kohesiivinen pää.

Kytkijä 3 EEPQNLIKJ 5' GAA GAG CCT CAG AAT TTA ATC AAA TAA GCTTG 3' 3' CTT CTC GGA GTC TTA AAT TAG TTT ATT CGAACCTAG 5' : Tämä ligoitiin kaksijuosteiseen mHOB15:een, joka oli aiemmin katkaistu HincII:lla ja BamHI:llä. Ligaation jälkeen DNA leikattiin HincII:lla kaikkien ei-rekombinanttimolekyylien tuhoamiseksi ja käytettiin sitten transfektoimaan E. coli XL1- ·;; Blue. Yks i juos t e inen DNA valmistettiin useiden kloonien bak- » « · teriofagipartikkeleista ja sille tehtiin DNA-sekvenesiana- • ♦ · lyysi. Kloonia, jolla oli oikea DNA-sekvenssi , merkittiin mHOB16 (kuvio 4).

Molekyyli, jossa kypsää HSA:ta koodaava alue oli fuusioitunut HSA:n erityseignaaliin, saatiin aikaan ineertoimalla kytkijä 4: • · · 12 101381

Kytkijä 4

MKWVSFI SLLFL 5' GATCC ATG AAG TGG GTA AGC TTT ATT TCC CTT CTT TTT CTC G TAC TCC ACC CAT TCG AAA TAA AGG GAA GAA AAA GAG

FSSAYSRGVFRR TTT AGC TCG GCT TAT TCC AGG GGT GTG TTT CG 3' AAA ACG AGC CGA ATA AGG TCC CCA CAC AAA GCAGCT 5'

BamHI:llä ja XhoI:llä leikattuun M13mpl9.7:ään pDBD2:n (kuvio 5) muodostamiseksi. Tässä kytkijässä on kodoni neljännelle aminohapolle ensimmäisen metioniinin jälkeen, ACC treoniini, HSA:n pre-pro johto-sekvenssissä (Lawn et ai, 1981), vaihdettu AGC:ksi, seriini, Hind I I I-paikan luomiseksi.

Tämän rakenteen 5'-pää poistettiin BamHI-PvuI I-fragmenttina ja ligoitiin kaksijuosteisen mHOB16:n PvuI I-BamHI-fragmentin kanssa (joka edustaa lyhennetyn HSA-geenin 3'-päätä) pMA91:een (Mellor et ai, 1983) BglI I-kohtaan pHOB31:n muodostamiseksi (kuvio 4). Tällä molekyylillä on lyhennetyn HSA:n koodausalue HSA:n erityssignaalin kanssa S. cerevisiaen PGK-geenipro- moottorin ja terminaattorin välillä, niin että geenin 5'-pää ;·; rajoittuu promoottoriin. Molekyylillä on myös hiivatranefor- • » · *·*·* maatiota varten selektiomarkkeri LEU2, ja osa hiivan 2um-plas- *.·.· midia, näin sallien autonomisen replikaation hiivassa.

pHOB31-plasmidi vietiin S.cerevisiae AH22:een (Hinnen et ai, 1978) transformaatiolla käyttäen standardimenetelmiä (Beggs, 1978). Puhdistetut transformantit kasvatettiin YEPD-alustaesa (1 % hiivaekstrakti, 2 % peptoni, 2 % glukoosi) 3 päivää *.*.· o • · 30 C:ssa ja vi1jelmäsupernatantista analysoitiin, onnistu- '· '· neesti, HSA:han liittyvän materiaalin läsnäolo rakettigeeli- *...’ elektroforeesilla. Kuviossa 5 nähdään elektroforetogrammi .··*. HSA:hän liittyvän materiaalin saanto transf ormanteista , joil- .·. : la on HSA ( 1-389) : ää koodaava plasmidi, on todistettavasti suurempi kuin saanto transformanteista, jotka erittävät kypsää, luonnon HSA:ta.

13 101381

Kuitenkin HSA (1-389):n tuottaminen antoi HSA (1-387):stä erottumattoman tuotteen (katao esimerkki 2) sekä aminotermi-naali- että karboksiterminaalisekvenssianalyysissä. Tämä voidaan mahdollisesti selittää COOH-terminaalisen sekvenssin Ile-Lys tehokkaalla poistamisella.

Esimerkki 2 HSA (1-387):ää koodaavan plasmidin rakentaminen oli identtinen HSA (1-389)-plasmidin, pHOB31, rakentamismenetelmän kanssa, paitsi että kytkijä 3 korvattiin kytkijä 5:llä (näytetty jäljempänä), joka edustaa aluetta kypsän HSA:n 382:n aminohapon kodonista (glutamaatti, GAA) leusiinin 387 kodoniin, jota seuraa lopetuskodoni ja Hind 11 I-paikka ja sitten BamHI kohesiivinen pää.

Kytkijä 5 E E P Q N L Stop 5' GAA GAG CCT CAG AAT TTA TAA GCTTG 3' : 3' CTT CTC GGA GTC TTA AAT ATT CGAACCTAG 5'

Rakentamisen loppu oli kuten yläpuolella seikkaperäisesti selostettiin pHOB31:lle ja tuloksena saatiin pDBD5-plasmidi.

» i * *·*·* Esimerkki 3: ( 1-369) *·*.* HSA (1-369) :ätä koodaavan plasmidin rakentamiseksi syntetoi- tiin kytkijä, joka edusti aluetta kypsän HSA:n Pst I-kohdasta (sijainti 1092, kuvio 3) kystiinin 369 kodoniin, jota seurasi lopetuskodoni (TAA), Hind I I I-paikka ja sitten BamHI-kohesiivi-nen pää: • · · • · · .· ; Kytkijä 6

D P H E C Stop 5 ' GAT CCT CAT GAA TGC TAA GCTTG

.·. : 3' A CGT CTA GGA G TA CTT AC G ATT CGAACCTAG

l4 101381 Tämä kytkijä ligoitiin pDBD2:n BamHI-Pet I-fragmentin kanssa, edustaen pre-proHSA:n 5'-osaa, pMA91:een Bgl11-kohtaan. Plas-midi, jolla oli oikea konfiguraatio, nimitettiin pDBD3:ksi <kuvio 6) .

HSA <1-369):n tuottaminen kasvattamalla pDBD3:lla transformoitua S. cerevisiaeta antoi alhaisia saantoja, mikä oli merkki siitä, että tuote on saattanut olla epästabiili käytetyssä hiiva-ekspressioeysteemiesä.

Esimerkki 4: HSA (1-419) HSA (1-419)tää koodaavan plasmidin rakentamiseksi pDBD2:n BamHI-HincII-f ragmentti ligoitiin

Kytkijä 7 5' ATAAGCTTGGATCCAAGCTTAT 3' ja sitten ligaatioseos leikattiin BamHI:llä ja fragmentti • ·'; ligoitiin pMA91:een, jolloin saatiin pDBD4 (kuvio 7). Tässä rakenteessa pDBD2:n HincII-kohta (1256, kuvio 3) saa aikaan tylpän pään seriinikodonin 419 jälkeiseen toiseen emäkseen ja tämä kodoni uudistetaan kytkijä 6:11a niin, että tätä kodonia ''l seuraa lopetuskodoni , Hind I I I-pa ikka ja BamH I-paikka .

t » 1 • · · • · HSA (1-419) tn ekspressoituminen pDBD5-plasmidin kautta S. ce-revisiaesea tuotti molekyylin, jolla oli oikea aminotermi-naalisekvenssi <Asp-Ala-His...) mutta leusiini eikä seriini oli COOH-terminaalijäännöksenä. Yritykset eristää COOH-termi-;1·1; naalinen peptidi käyttämällä kovalenttista leimaa, jonka pi- täisi kiinnittyä kysteiini 392:een, olivat myös tuloksettomia.

• · · • · 1 Pääteltiin, että tapahtui proteolyysi osalle HSA (1-419)tn • · ’ '· COOH-päätä. Tämä on yhdenmukainen havainnon kanssa, että » · ·...· pieni prosentti proteolyysiä on samassa kohdassa täysipitkää HSAtta, joka on tuotettu analogisella tavalla hiivassa.

: (Sleep et ai, 19ΘΘ).

• « · • · 1β 101381

Esimerkki_5: HSA (l-n)plus:aa tuottavan hiivan fermentaaH»

Laboratoriotermenttori täytetään puoleen sen nimellistyösken-telytilavuudeeta alku "batch"-alustalla, joka sisältää 50 ml/l suolaseosta (sisältäen 114 g/1 KH2P04, 12 g/1 MgS04, 3,0 g/1 CaCl2 6Η20, 2,0 g/1 Na2 EDTA: 10 ml/l hivenaineliuosta, joka sisältää 3 g/1 ZnS04 7H20, 10 g/1 FeS04 7H20, 3,2 g/1 MnS04 4H20, 79 mg/1 CuS04 5H20, 1,5 g/1 H3BO3, 0,2 g/1 KI, 0,5 g/1

Na2Mo04 2H20, 0,56 g/1 CoCl2, 75 ml/l H3P04: 20 g/1 ruokosokeria: 50 ml/l vitamiiniseosta, joka sisältää 1,6 g/1 Ca-pantotenaattia, 1,2 g/1 nikotiinihappoa, 12,8 g/1 m-inosito-lia, 0,32 g/i tiamiini-HCl:a ja 8 mg/1 pyridoksiini-HCl:a ja 8 mg/1 biotiiniä. Yhtä suuri tilavuus "syötettävää" alustaa, jossa on 100 ml/l suolaseosta, 20 ml/l hivenaineliuosta, 500 g/1 ruokosokeria ja 100 ml/l vitamiini 1iuosta, pidetään erillisessä säiliössä, joka on liitetty fermenttoriin mittapum-pulla.

Fermenttori ympätään Saccharomyces cerevisiaellä, joka on transformoitu kuten aiemmin esimerkissä 2 pDBD3-plasmidi1- la. pH pidetään 5,7 +. 0,2 automaattisella ammoniakin tai o rikkihapon lisäämisellä, lämpötila pidetään 30 C:ssa ja sekoi-tusnopeus asetetaan niin, että liuenneen hapen osapaine (DOT) oli >20 % ilmalla kyllästetystä kun ilman virtausnopeus oli 1 t i 1 . /1 i 1 . /min . Kun alkuperäinen alusta on käytetty, mitta- t » · • * pumppu laitetaan päälle, jolloin kasvunopeus pidetään noin « · · — 1 *·*·* 0,15 h . Pumpun nopeutta nostetaan tämän kasvunopeuden yllä pitämiseksi, kunnes sekoittajan nopeus saavuttaa maksimiarvonsa, jossa pisteessä ei ole mahdollista lisätä pumpun nopeutta enempää aiheuttamatta DOT:n putoamisen alle 15 % ilman ;*·*: kyllästymisestä, mikä on sallittu esiintyvä minimiarvo. PPG:tä lisätään vastauksena vaahtosensoriin. Ennen kuin 50 % syöttö- • · / ' liuoksesta on lisätty, ei lisätä yhtään vaahdonestoainetta.

*· ’· Lisäyksen lopputaso on 0,2 g/1.

HSA (1-387) eritetään alustaan.

101381 16

Esimerkki 6: Bilirubiinin sitoutuminen HSA (1-387):ään Hemin metaboliitin, bilirubiinin, sitominen HSA (1-387):ään tehtiin fluoresenseilisäyemenetelmällä (Beaven ja Gratzen (1973) Eur. J. Biochem. 500-510). Kuvio 8 osoittaa, et tä bilirubiinin fluoresenssin lisääminen proteiini/bilirubii-nisuhteen funktiona on tuskin havaittava HSA (1-387):lie ja kliinistä laatua olevalle HSA:lle.

HSA:n ja bilirubiinin vuorovaikutus on hyvin herkkä proteiinin konformaatiolle (Beaven ja Gratzen, loc. cit.) ja nämä tulokset osoittavat, että mitään suurta muutosta ei ole tapahtunut HSA (1-387):n edustamassa HSA-alueen konformaatiossa lyhyemmän molekyylin ekspressoitumisen kautta.

Esimerkki 7: HSA (1-387):n turvotuskävttävtvminen HSA (1-387) konsentroitiin 0,9 %:ssa paino/til. suolaliuoksessa niin, että proteiinin loppukonsentraatio oli 54 mg/ml. Tämän konsentraatin laimennuksia verrattiin yhdessä kliinistä laatua olevien HSA-laimennusten (100 mg/ml) kanssa osmootti- ; seita tehokkuudeltaan kolloidiosmoosimittarissa. Kuvio 9 < , osoittaa, että HSA (1-387) antaa kolloidisen osmoottisen pai-

I I I

neen, joka on noin ykeikolmannes korkeampi kuin täysi pitkän HSA:n annetussa proteiinikonsentraatiossa. Merkityksellisesti Ί'ΐ kolloidisen osmoottisen paineen kasvu proteiinikonsentraation « i · *·*·* mukana on suurinpiirtein lineaarinen 5 %:iin paino/til. asti, ► ·

I I I

·.·,· joka edustaa konsentraatiota plasmassa.

Tämä osoittaa, että HSA (1-387) ei itse assosioidu tuntuvasti käyttökelpoisessa kliinisen työskentelyn konsentraation rajoissa.

• · • » · 11« • · Esimerkki 8: Injektion formulointi ’· 1 Keksinnön HSA (l-n)plus voidaan jakaa astiaan, jonka koot vaihtelevat 20 ml: sta 500 ml:aan, siitä syystä konsentraation vaihdellessa (tyypillisesti) 2 %:sta 17 %:iin, esimerkiksi « · . 3 %, 13 % tai 17 % .

« » I

17 101381

Jaettava liuoe on steriili eikä aiheuta kuumetta. 3 % liuos on osmoottisesti samankaltaista ihmisen plasman kanssa. Ainakin 96 % kokonaisproteiinista on mieluummin albumiinia. Nat-riumionisisältö on tavallisesti 130-160 mmoolia/litra ja ka-liumsisältö ei yleensä ole enempää kuin 2 mmoolia/litra. pH asetetaan 6,9 +. 0,5. Sitraatin koneentraatio ei yleensä ole enempää kuin 20 mmoolia/litra ja voi puuttua kokonaan.

Stabi1isaattoreita voidaan käyttää, esimerkiksi joko 0,16 mil-limoolia, natriumasetyy1itryptofanaattia, tai 0,08 millimoo-lia natriumasetyy1 itryptofanaattia ja 0,08 millimoolia nat-riumkaprylaattia grammaa HSA (l-n)plus kohti.

Viitteet

Beggs, J.D. (1978). Nature. 275. 104-109.

Brown, J.R. and Shockley, P., <1982) "Lipid-Protein Inter actions" 1_, 25-68, toim. Hayes, O. and Joet, P.C.

Hinnen, A. et ai ( 1978). Proc . Natl. Acad. Sei. USA, 75., 1929-1933.

Law, R.M. et ai (1981). Nucl. Acid. Res. £, 6103-6114.

‘•V Maniatis, T. et ai (1982). Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,

New York .

;*·*: Mellor, J. et al (1983). Gene, 24., 1-14.

/ · Messing, J. (1983). Methods Enzymol. 101. 20-78.

Norrander, J. et al (1983). Gene, 26., 101-106.

1β 101381

Sanger, F. et ai < 1977). Proc . Natl. Acad. Sei. USA, 74. 5463-5467.

Sleep, D., Belfield, G.P. and Goodey, A.R. ( 1988) Yeast 4., S16 8 .

Claims (7)

19 101381

1. Rekombinanttinen nukleotidisekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa polypeptidiä, joka käsittää ihmisen täydellisen seerumin albumiinin N-terminaalisen osan aminohappojäännökseen 387 asti, tai sen polypeptidimuunnelmaa, joka on vähintään 80-%:isesti homologinen mainitun N-terminaalisen osan kanssa ja omaa käyttökelpoisen tason onkoottista potentiaalia annettaessa nisäkkään verenkiertoon, jolloin nukleotidisekvenssi ei ole liittynyt 31-päästään sekvenssiin, joka koodaa ihmisen täydellisen seerumin albumiinin C-terminaalista osaa aminohappotähteestä 388 585 reen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen nukleotidisekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa polypeptidiä HSA(l-387) ja sen muunnelmia.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen nukleotidisekvenssi, tunnettu siitä, että se on liittynyt 5'-päästään toiseen nuk-leotidisekvenssiin, joka koodaa peptidiä, joka vastaa HSArn pro-, pre- tai pre-pro-asemaa, metioniinijäännöstä tai toista esisekvenssiä.

4. Ekspressiovektori, tunnettu siitä, että se on sopiva transformoimaan ja ekspressoitumaan valikoidussa isännässä, jolla vektorilla on jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen *;** nukleotidisekvenssi ja mainittu nukleotidisekvenssi on DNA- • · » ***** sekvenssi. • · • · · • · « • ·

5. Isäntäorganismi, tunnettu siitä, että se on transformoitu • ♦ V.· patenttivaatimuksen 4 mukaisella vektorilla. • · · • · · • · · ..[.j 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen isäntäorganismi, tunnettu • ♦ ... siitä, että se on Saccharomyces cerevisiae.

7. Menetelmä polypeptidin HSA(l-387) tuottamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukaisen isäntäorganismin kasvatuksen sopivissa olosuhteissa, jolloin mainittu nukleotidisekvenssi koodaa mainittua polypeptidiä. 20 1 0 1 381