DK167192B1

DK167192B1 - Fremgangsmaade til rensning og aktivering af proteiner fra uoploeselige inklusionslegemer

Info

Publication number: DK167192B1
Application number: DK426386A
Authority: DK
Inventors: Steven K Rausch; Hsi Meng
Original assignee: Int Minerals & Chem Corp
Priority date: 1985-09-06
Filing date: 1986-09-05
Publication date: 1993-09-13
Also published as: IE862370L; CA1267496C; CA1267496A; IL79957A0; EP0218374B1; EP0218374A1; IE60644B1; ATE73138T1; US4677196A; IL79957A; DK426386D0; JPS6269998A; DE3684078D1; JPH082313B2; DK426386A

Description

i DK 167192 B1

Den foreliggende opfindelse angår fremgangsmåder til oprensning og aktivering af proteiner, der produceres som uopløselige, biologisk inaktive inklusionslegemer i mikroorganismer, 5 som er blevet transformeret med rekombinerede DNA-ekspres- sionsvektorer for at dirigere ekspressionen af det pågældende protein.

Teknologien med rekombineret DNA muliggør indsættelsen af 10 en vektor, som bærer fremmed (heterologt) DNA,i en mikro organisme på en måde, som muliggør, at det heterologe DNA kan udtrykkes. Dvs. at vektoren indeholder genetiske instruktioner, som dirigerer mikroorganismen til at producere et protein, som der kodes for af en del af den heterologe DNA-se-15 kvens. Ved at dyrke transformerede mikroorganismer i en fer mentor og underkaste dem betingelser, hvorunder det heterologe DNA udtrykkes, kan der fremstilles værdifulde proteiner i stor mængde med relativt små omkostninger.

20 Mange heterologe proteiner, som produceres i transformerede mikroorganismer, folder desværre ikke i deres naturlige tredimensionale konformation inde i værtscellemiljøet. Denne urigtige foldning af det udtrykte protein har flere uheldige konsekvenser. For det første har de urigtigt foldede prote-25 iner en tendens til at danne aggregater, som er uoløselige inde i værtscellen. Disse uopløselige aggregater kan genkendes inde i cellen som "inklusionslegemer”, der somme tider også omtales som "refraktionslegemer" og/eller "proteinkorn". Dannelsen af inklusionslegemer kan også delvis skyldes oligome-30 risering af proteinet, dvs. dannelsen af kovalente, inter- molekylære disulfidbindinger. De urigtigt foldede proteiner er ikke blot uopløselige, men de er også biologisk inaktive. Som eksempler på heterologe proteiner, der danner uopløselige, biologisk inaktive inklusionslegemer ved ekspression i en 35 værtscelle, kan der nævnes animalske væksthormoner og vækst faktorer, såsom bovint -væksthormon, porcint væksthormon og somatomedin.

DK 167192 B1 2

For at fremstille nyttige proteiner er det nødvendigt at omdanne de urigtigt foldede inklusionslegemeproteiner til deres naturlige konformationer, hvori de er opløselige og biologisk 5 aktive. Det er desuden nødvendigt at oprense proteinet for at fjerne forurenende nedbrudt cellemateriale og andre proteiner, der produceres af værtscellen. Der er blevet foreslået et antal planer til omdannelse af inklusionslegemeproteiner til deres opløselige, naturlige konfigurationer. Desværre 10 er disse planer ofte uforligelige med proteinoprensningspro cedurer, såsom ionbytningskromatografi. Oprensningsbetingelserne har en tendens til at hæmme evnen til at bibeholde proteinet i opløsning, hvilket ofte resulterer i et væsentligt proteintab på grund af genaggregering og udfældning. De fle-15 ste af de planer, der foreslås til udvinding af proteiner fra inklusionslegemer i oprenset, opløselig, biologisk aktiv form har resulteret i meget lave udbytter af de proteiner, der produceres af mikroorganismerne.

20 I US patentskrift nr. 4.511.503 beskrives en typisk plan for udvinding af proteiner fra inklusionslegemer i transformerede mikroorganismer. Inklusionslegemeproteinerne behandles med et stærkt denaturerende middel, som forårsager, at de urigtigt foldede proteinmolekyler folder ud og bliver opløse-25 lige. Denatureringsmidlet fjernes derefter ved f.eks. dialyse for at lade proteinet folde igen i sin naturlige konformation. Det mest almindeligt anvendte stærke denatureringsmiddel i planer af denne type har været guanidinhydrochlorid.

30 I US patentskrift nr. 4.511.502 beskrives en tilsvarende frem gangsmåde, hvori opløsningen af opløseliggjort protein/de-natureringsmiddel føres over en molekylsigte eller centrifugeres ved høj hastighed for at fjerne komponenter med højere molekylvægt.

I US patentskrift nr. 4.518.526 beskrives også en tilsvarende fremgangsmåde. Ved denne fremgangsmåde behandles den transformerede cellekultur med en pufret opløsning af tilstrækkelig 35 DK 167192 B1 3 ionstyrke til at opløseliggøre det meste af værtscelleproteinet, mens det heterologe protein forbliver uopløseligt. Cellerne lyseres derpå, supernatanten indeholdende det opløse-5 liggjorte værtscelleprotein fjernes, og de uopløselige inklu sionslegemer opløseliggøres i det stærke denatureringsmiddel.

Andre publikationer, hvori beskrives denaturerings-/gennature-ringsplaner til omdannelse af inklusionslegemeproteiner til 10 deres opløselige, naturlige konformationer omfatter PCT pub likation WO 83/04418, europæisk patentansøgning med publi-kationsnr. 0 123 928, europæisk patentansøgning med publika-tionsnr. 0 121 775, europæisk patentansøgning med publikations-nr. 0 116 778 og europæisk patentansøgning med publikationsnr. 15 0 114 507.

Som angivet tidligere har de fleste af de foreslåede dena-turerings-/gennatureringsplaner anvendt guanidinhydrochlorid som denatureringsmidlet. Selv om guanidinhydrochlorid er ka-20 rakteriseret ved en fremragende evne til at opløseliggøre inklusionslegemeproteiner, medfører anvendelsen heraf nogle problemer. Ved dialyse mod denatureringsmiddelfri puffer for at fjerne guanidinhydrochloridet genaggregerer en væsentlig mængde af det opløseliggjorte protein, tilsyneladende på grund 25 af urigtig genfoldning. Når guanidinopløseliggjort protein oprenses ved metoder, såsom ionbytningskromatografi - som er nødvendig for at opnå den renhedsgrad, der kræves i slutproduktet - sker der endvidere væsentlige proteintab på grund af genaggregering. Tilsmudsning og tilstopning af søjlen har 30 en tendens til at forekomme i løbet af uforholdsmæssig kort tid, hvilket alvorligt begrænser søjlens nyttelevetid. Det har typisk vist sig, at guanidinopløseliggørelse af inklusionslegemer af bovint væksthormon, efterfulgt af ionbytningskromatografi, kun gav 4-12% produktudvinding.

Et andet hovedproblem, som er forbundet med anvendelsen af guanidinhydrochlorid, et problem som er særligt vigtigt ud fra et kommercielt produktionssynspunkt - er dets høje pris.

35 DK 167192 B1 4

Det ville være meget ønskeligt at anvende et opløseliggørende middel, som er sammenligneligt med guanidinhydrochlorid i dets evne til at opløseliggøre inklusionslegemeproteiner,

5 men uden den hermed forbundne høje pris for guanidin. I US

patentskrift nr. 4.511.503 foreslås anvendelsen af detergenter, såsom natriumdodecylsulfat (SDS) som denatureringsmidler. Der er imidlertid ingen påvisning af dets brug, og der er heller ikke foreslået en fremgangsmåde til fjernelse af deter-10 genten fra proteinet og oprensning af proteinet.

Detergenter, såsom SDS, er meget effektive denatureringsmidler. Desuden er SDS et meget billigere reagens end guanidinhydrochlorid. Dets mulige anvendelse til udvinding af inklu-15 sionslegemeproteiner er derfor attraktivt ud fra et kommer cielt produktionsøkonomisk synspunkt. Sammenlignet med guanidinhydrochlorid binder SDS imidlertid meget stærkere til det denaturerede protein, hvilket gør dets fuldstændige fjernelse fra proteinet problematisk.

20 O.H. Kapp og S. W. Vinogradov påviste, at SDS kunne fjernes fra flere proteiner ved kromatografi på ionforsinkelsesharpiksen AGI1A8 (Anal. Biochem., 91:230-233 [1978]). Det blev sagt, at der forblev fra 0,1 til 1,4 mol SDS på hvert mol 25 protein, der var behandlet på denne måde. K. Weber og D.J.

Kuter påviste, at SDS kunne fjernes fra aspartattranscarba-mylase ved inkubering i urinstof og efterfølgende anionbyt-ningskromatografi (J. Biol. Chem., 246:4504-4509 [1971]).

I begge tilfælde var udgangsproteinerne imidlertid i ren, 3ø biologisk aktiv form. Der er ingen forslag om en fremgangs måde til effektivt at udvinde protein i en ren biologisk aktiv form fra uopløselige, intracellulære inklusionslegemer.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en effektiv, øko-35 nomisk metode til udvinding af proteiner, som produceres som uoløselige, biologisk inaktive inklusionslegemeproteiner i transformerede mikroorganismer. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen anviser omdannelse af proteinet til dets opløselige, DK 167192 B1 5 naturlige konformation og den ledsagende oprensning af proteinet. I fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes en detergent, såsom SDS, som et denatureringsmiddel i stedet for et 5 dyrere denatureringsmiddel, såsom guanidinhydrochlorid. Gan ske overraskende har det vist sig, at proteintab ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen til oprensning og aktivering af proteinet er væsentligt mindre end med gua-nidinhydrochloridmetoden. Ved anvendelse af SDS som denatu-10 reringsmidlet i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen er der opnået udvindingsudbytter på op til ca.

30%, baseret på den proteinmængde, som er til stede i inklusionslegemerne. Disse udbytter er signifikant højere end de, der kan opnås med kendte fremgangsmåder under anvendelse af 15 guanidinhydrochlorid som denatureringsmidlet. Det proteinpro dukt, som opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er opløseligt, i alt væsentligt homogent og i alt væsentligt fri for SDS.

2o Opfindelsen tilvejebringer nærmere bestemt en fremgangsmåde til oprensning og aktivering af et protein, som produceres som et uopløseligt, biologisk inaktivt inklusionslegeme i en transformeret mikroorganisme, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man: 25 (a) ekstraherer inklusionslegemerne over i en pufret opløsning af natriumdodecylsulfat for at opløseliggøre proteinet, (b) kromatograferer proteinopløsningen på en ionforsinkelses- 30 harpiks for at fjerne resten af natriumdodecylsulfatet fra proteinet og (c) kromatograferer proteinopløsningen fra trin (b) på en anionbytterharpiks.

I en foretrukket udførelsesform for opfindelsen behandles den proteinholdige natriumdodecylsulfatopløsning for at fjerne en væsentlig mængde af natriumdodecylsulfatet før kro- 35 5 DK 167192 B1 6 matografi på ionforsinkelsesharpiksen. Fjernelse af en del af natriumdodecylsulfatet kan udføres ved dialyse mod en pufferopløsning eller ved afkøling af opløsningen.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes til at oprense og aktivere proteiner, som produceres i form af uopløselige, biologisk inaktive inklusionslegemer i transformerede mikroorganismer, dvs. mikroorganismer, der er blevet transforme-10 ret med rekombinerede DNA vektorer, som dirigerer ekspressio nen af gener, der koder for heterologe proteiner. Sædvanligvis er de proteiner, der kan oprenses og aktiveres ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, negativt ladede proteiner, som er basiske under de bearbejdningsbetingelser, der er be-15 skrevet nedenfor i detaljer. I specifikke udførelsesformer for opfindelsen er de proteiner, som oprenses og aktiveres, animalske væksthormoner, såsom bovint væksthormon (bGH) eller porcint væksthormon (pGH).

2Q Det må forstås, at henvisning heri til proteiner generelt - f.eks. hormoner og enzymer - eller til specifikke proteiner, såsom bGH og pGH, ikke skal opfattes som en begrænsning til molekyler, der indeholder det naturlige proteins hele amino-syresekvens. Det er nærmere hensigten, at den også skal omfatte 25 fragmenter af proteinet med forskellige dele af sekvensen fjernet, og proteiner eller fragmenter deraf med forskellige substitutioner eller modifikationer i deres naturlige sekvenser (dvs. analoger), som ikke ødelægger molekylernes biologiske aktivitet.

30

Generne for bGH og pGH er blevet klonet på ekspressionvektorer og anvendt til transformering af E. coli-værtsceller.

I europæisk patentansøgning med publikationsnr. 0 103 395 beskrives konstruktionen af en transformeret stamme af E.

35 coli indeholdende et første plasmid, som koder for Å9(Ser)bGH

(bGH minus dets 9 N-terminale aminosyrer og med en yderligere serinrest ved N-enden) under kontrol af λΡτ-promotor-opera- JLi DK 167192 B1 7 toren, og som har en Shine-Dalgarno-region hidrørende fra bakteriophag mu. Tranformanten indeholder også et andet plasmid, pcI857, som koder for produktionen af.det temperatur-5 følsomme cl857-repressorprotein. Repressorproteinet kan in- aktiveres ved at forøge temperaturen til ca. 42°C, hvorved der induceres ekspression af A9(Ser)bGH. En transformeret stamme af denne type, E. coli HB101 (Ρτ-mu-A9(Ser)bGH og pcI857) er blevet deponeret, under betegnelsen E. coli, IMC 0 nr. 1, ved The American Type Culture Collection, Rockville,

Maryland, med accessionsnr. 53030.

Konstruktion af en tilsvarende transformeret stamme, som koder for produktionen af A7pGH (procint væksthormon minus dets 15 først 7 N-terminale aminosyrer) er beskrevet i europæisk pa tentansøgning med publikationsnr. 0 104 920. En transformeret stamme af denne type, E. coli HB101 (P^-mu-A7pGH og pcI857) er blevet deponeret, med betegnelsen E. coli IMC nr. 2, ved The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, 20 under accessionsnr. 53031.

E. coli IMC nr. 1 og E. coli IMC nr. 2 er produktive fremstillere af henholdsvis A9(Ser)bGH og A7pGH. I begge tilfælde udskilles det udtrykte protein inde i cellen i form af uop-25 løselige, biologisk inaktive inklusionslegemer, som er syn lige under et mikroskop.

Efter at de transformerede celler er blevet dyrket i en fermentor, og proteinet af interesse er blevet udtrykt og har 30 fået lov til at akkumulere inde i cellerne som inklusionsle gemer, lyseres de transformerede celler sædvanligvis, enten mekanisk, kemisk eller enzymatisk, for at muliggøre isolering af inklusionslegemerne, som er udskilt inde i cellerne.

Før anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan inklu-35 sionslegemerne adskilles fra hovedparten af resten af celle materialet ved centrifugering og vask i en puffer til fremstilling af en våd inklusionslegemepasta.

DK 167192 B1 8

Inklusionslegemerne ekstraheres over i en pufret opløsning af SDS for at opløseliggøre proteinet. SDS-mængden i den puf-rede opløsning er en mængde, som er tilstrækkelig til at op-5 løse proteinet. Den pufrede opløsning indeholder fortrinsvis fra ca. 0,1% til 5,0% SDS, mest foretrukket ca. 1%. Det har vist sig, at puffere med høj pH-værdi, dvs. fra ca. pH-værdi 8,5 til pH 11, er bedst egnede til at bibeholde proteinet i en opløseliggjort form. En egnet pufferopløsning er 0,02 10 M til 0,1 M ethanolamin-HCl-, carbonat-bicarbonat- eller bo- ratpuffer. Om ønsket kan et reducerende middel, såsom 2-mer-captoethanol, også være til stede i SDS-opløsningen i en mængde, som er tilstrækkelig til at forhindre dannelsen af inter-molekylære disulfidbindinger under udvindingsprocessen. Det 15 har imidlertid ikke vist sig, at anvendelsen af reducerende midler resulterer i en signifikant forøgelse af udbyttet af opløseligt, biologisk aktivt protein. Disaggregering af inklusionslegemerne i SDS-opløsningen sker sædvanligvis over en periode fra ca. 4 til 18 timer.

20 Når inklusionslegemeproteinerne først er blevet opløseliggjort i SDS-opløsningen og har fået lov til at blive disaggre-gerede, foretrækkes det at fjerne en væsentlig mængde af SDS'et fra opløsningen før kromatografi på ionforsinkelsesharpik-25 sen. Fjernelsen af en væsentlig mængde af SDS'et kan udføres ved dialyse mod en ikke-SDS-holdig pufferopløsning eller ved at reducere temperaturen af den SDS-holdige opløsning. Skønt det er muligt at påføre den SDS-holdige opløsning direkte på ionforsinkelsesharpiksen uden et indledende SDS-fjernel-30 sestrin, er det upraktisk at gøre dette, eftersom fjernelse af al SDS ved hjælp af ionforsinkelsesharpiksen alene ville kræve en upraktisk stor ionforsinkelsesharpikssøjle eller ville medføre et uacceptabelt lavt gennemløb ud fra et kommercielt produktionssynspunkt. Den mængde SDS, der fjernes 35 i det indledende trin før ionforsinkelseskromatografien kan variere, primært afhængig af proteinkoncentration..Der fjernes typisk fra ca. 40% til ca. 70% af den mængde SDS, der i begyndelsen er til stede i opløsningen.

DK 167192 B1 9

Anvendt heri betyder udtrykket "dialyse" enhver teknik, hvorved SDS fjernes fra proteinopløsningen ved selektiv transport af SDS-ioner over en semipermeabel membran_med tilbagehol-5 delse af de ønskede proteinmolekyler på den anden side af membranen. Der kan anvendes enhver af de kendte dialysemetoder med forskellige typer udstyr. SDS kan f.eks. dialyseres fra opløsningen under anvendelse af ultrafiltreringssystemer med hule fibre. I disse systemer cirkuleres en SDS-fri puf-1Q feropløsning med lav ionstyrke rundt om bundter af semiper meable, hule fibre. Eksempler på pufferopløsninger med lav ionstyrke til brug ved dialyse omfatter 0,02 til 0,1 M ethanol aminpuf fer , carbonat-bicarbonatpuffer (HCC>3 /CO^ ) eller natriumboratpufffer. Pufferopløsninger under ca. 0,02 M kan 15 resultere i opløselighedsproblemer, medens puffere på over ca. 0,1 M er unødvendige (skønt de er anvendelige). Små molekyler i proteinopløsningen, som strømmer gennem fibrene, er i stand til at passere gennem membranfibervæggen, hvorved de reducerer proteinopløsningens ionstyrke. Andre kendte dia-2o lyseteknikker som omfatter, men ikke er begrænset til, dia filtrering og posedialyse, kan også anvendes til at fjerne SDS fra proteinopløsningen.

Som nævnt ovenfor kan afkøling af den SDS-holdige protein-25 opløsning anvendes til at fjerne en del af SDS'et fra proteinet.

Opløsningen indeholdende det opløseliggjorte inklusionslegemeprotein er sædvanligvis en pufferopløsning med lav ionstyrke, såsom 0,02 til 0,1 M carbonat-bicarbonatpuffer eller bo-ratpuffer. En del af SDS kan fjernes fra proteinet ved at 30 afkøle pufferopløsningen til en temperatur mellem opløsningens frysepunkt og ca. 2°C i en periode på ca. 4 timer, hvorved SDS fælder ud af opløsningen og kan fjernes ved filtrering eller centrifugering.

35 Dialyse- eller afkølingstrinnet fjerner en væsentlig mængde af SDS'et fra proteinopløsningen. Noget af SDS*et vil imidlertid forblive tæt bundet til proteinet. For at fuldende fjernelsen af SDS fra proteinet kromatograferes proteinopløsningen DK 167192 B1 10 på en ionforsinkelsesharpiks. En ionforsinkelsesharpiks er en harpiks, som indeholder både anion- og kationbytningsste-der, og som er i stand til selektivt at forsinke strømmen 5 af ioniske stoffer. Den er derfor i stand til at adskille de svagt ioniske proteinmolekyler fra SDS-ionerne, som passerer langsommere gennem harpiksen. En foretrukket ionforsinkelsesharpiks til brug ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er den harpiks, der kendes som AG11A8, og som er kom-10 mercielt tilgængelig fra Bio-Rad Laboratories, Richmond, Cali fornien. Den fremstilles ved at polymerisere acrylsyre inde i harpiksen AG1X8 (en styren-divinylbenzencopolymer med tilknyttede kvaternære ammoniumgrupper) og indeholder således - , -|-stærkt basisk ladede kationer, <j>CH2N (CH3)3 og svagt sure 15 anioner, RC^COO .

Ionforsinkelsesharpiksen anvendes sædvanligvis i form af en pakket søjle. Søjlen ækvilibreres ved at føre pufferopløsningen (uden protein) gennem søjlen, indtil pH-værdi og led-20 ningsevne af føde og elueringsmiddel passer sammen. Protein opløsningen indeholdende SDS føres derpå til søjlen. Selv om der kan anvendes forskellige elueringsmidler til at elu-ere proteinet fra søjlen, foretrækkes det at eluere søjlen ved anvendelse af en pufret opløsning af 0,02 til 0,1 M etha-25 nolamin, fortrinsvis ca. 0,05 M ethanolamin. Proteinet, som passerer gennem søjlen hurtigere end SDS, opsamles i eluatet fra de tidlige trin. En AGllA8-søjle kan regenereres ved at vaske med flere volumener 1,0 M NH^Cl, efterfulgt af flere volumener deioniseret vand eller ved blot at vaske med store 30 mængder vand.

Eluatet fra ionforsinkelsesharpiksen indeholder SDS-frit protein, som er blevet genfoldet i sin naturlige konfiguration. Eluatet fra ionforsinkelsesharpiksen påføres på en anionbyt-35 terharpiks, som sædvanligvis foreligger i form af en pakket søjle. Man kan som blot· en illustration på egnede anionbyt-terharpikser nævne DE-52, DE-53, DEAE-Sepharose CL-6B, Cel-lufine AM, QAE-Sephadex, Q-Sepharose, QAE-cellulose og DEAE- DK 167192 B1 11

Trisacryl. Anionbytterharpiksen indeholder fortrinsvis en høj grad af substitution med kationiske grupper, såsom kva-ternære ammoniumioner, der er knyttet til en polysaccarid-5 bærer, såsom dextran, agarose eller cellulose, eller knyt tet til en polyacrylatbærer. Eksempler på sådanne foretrukne harpikser er DE-53. For nyligt udviklede syntetiske harpikser, som vides at være anvendelige i proteinoprensningssøjler, såsom Trisacryl (kommercielt tilgængeligt fra LKB Instruments) jø kan anvendes. Proteinet i anionbyttersøjleeluatet kan om øn sket koncentreres under anvendelse af kendte teknikker, såsom ultrafiltrering.

Det oprensede protein kan elueres fra anionbytterharpiksen 25 under anvendelse af pufret saltopløsning, fortrinsvis ved pH-værdi 8,5 eller derover, med en saltkoncentration på 0 til 0,1 molær.

Efter hvert trin i fremgangsmåden ifølge opfindelsen, dvs.

20 efter ekstraktion over i SDS, dialyse eller afkøling, kroma tografi på ionforsinkelsesharpiksen og anionbytterkromato-grafi, kan den proteinholdige opløsning centrifugeres, såfremt det findes ønskeligt eller nødvendigt, for at fjerne ethvert bundfald, der kan være blevet dannet. Bundfaldene kan enten 25 smides bort eller recirkuleres.

De følgende eksempler skal yderligere illustrere udøvelsen af opfindelsen.

30

Eksempel I.

Oprensning og aktivering af Δ7 porcint væksthormon.

35 Inklusionslegemer blev opnået fra E. coli IMC nr. 2 (ATCC

53031), som var blevet dyrket under A7pGH-producerende betingelser. Cellerne fra fermentoren blev høstet ved centrifugering fra fermentorvæsken (eng.:fermentor beer), suspenderet i 0,1 M phosphatpuffer, pH-værdi 7,8, 10 mM EDTA og lyseret ved flere ganges passage gennem en Manton-Gaulin-homo- DK 167192 B1 12 genisator. De rå inklusionslegemer blev høstet ved centrifugering og vasket to gange i den samme puffer.

5 24 g af disse inklusionslegemer blev ekstraheret i 1000 ml 0,1 M ethanolamin-HCl, pH-værdi 9,0, 1% SDS, ved omrøring natten over ved stuetemperatur. Den resulterende ekstrakt blev dialyseret to gange mod 16 liter 20 mM ethanolamin-HCl, pH-værdi 9,0, over en periode på 48 timer. Resterende uoplø-10 seligt materiale blev fjernet ved centrifugering ved 15000 x g i 30 minutter. Den klarede ekstrakt blev kromatograferet på en 10 x 30 cm søjle af AGllA8-ionforsinkelsesharpiks, æk-vilibreret i 50 mM ethanolamin-HCl, pH-værdi 9,8. Søjlen blev behandlet i denne samme puffer ved en lineær strømningsha-15 stighed på 0,3 cm/minut. Fraktionerne indeholdende protein blev derpå kromatograferet på en 4,4 x 25 cm søjle af DE-53-cellulose ækvilibreret i 50 mM ethanolamin-HCl, pH-værdi 9,0. Efter påfyldning af ekstrakten blev søjlen vasket med to søjlevolumener af denne puffer for at eluere forurenende stoffer 20 i dødvolumenet. NaCl blev derefter sat til pufferen til en slutkoncentration på 0,1 M, hvilket forårsagede eluering af A7pGH.

Fraktionerne indeholdende rent A7pGH blev koncentreret ti 25 gange over en ultrafiltreringsmembran (cut-off på 10.000 dalton) under nitrogentryk, dialyseret omfattende mod 0,25 mM natri-umbicarbonat, 0,21 mM natriumcarbonat, pH-værdi 9,7, koncentreret yderligere tre gange, og lyofiliseret. Slutproduktet (992 mg) var i alt væsentligt rent A7pGH. Det totale udbytte, 30 baseret på den oprindelige fermentortiter, var 20,2%.

Eksempel II.

Oprensning og aktivering af Δ7 porcint væksthormon.

Inklusionslegemer blev opnået fra E. coli IMC nr. 2 (ATCC 53031), som var blevet dyrket under A7pGH-producerende betingelser. Cellerne blev centrifugeret ud af fermentervæsken 35 DK 167192 B1 13 og gensuspenderet i 0,1 M Tris-HCl, pH-værdi 7,8, 10 mM EDTA og 5% saccharose. Lysozym tilsattes til 200 mg/liter, og der inkuberedes ved 28°C i 40 minutter, på hvilket tidspunkt cel-5 lerne igen blev centrifugeret ud. De blev gensuspenderet i 0,1 M phosphatpuffer, pH-værdi 7,8, indeholdende 10 mM EDTA og 0,5 mM reduceret glutathion, og lyofiliseret ved at passere to gange gennem en Manton-Gaulin-homogenisator ved 6000-8000 psi. Phenylmethylsulfonylfluorid blev tilsat til 0,5 mM for 1Q at hæmme proteaseaktivitet, og de rå inklusionslegemer blev centrifugeret ud. Pellet blev vasket tre gange ved gensuspendering i 0,1 M Tris-HCl, pH-værdi 7,8, 2 M urinstof, 1% Triton X-100, 0,5 mM dithioerythritol (DTE) efterfulgt af centrifugering. Den resterende pellet blev vasket yderligere 15 to gange med 0,1 M Tris-HCl, pH-værdi 7,8, 0,5 mM DTE.

Et halvt gram af denne pellet blev ekstraheret i 100 volumener (50 ml) "Cornell buffer minus NaCl" ("CB": 25 mM natrium-bicarbonat, 21 mM natriumcarbonat, pH-værdi 9,8), 1 vægt/vol% 2o SDS, 10 mM DTE, 1 mM EDTA ved omrøring i 4 timer og under et nitrogendække. Denne ekstrakt blev derefter fortyndet til 400 ml med CB/10 mM DTE/1 mM EDTA og dialyseret mod 10 volumener CB/5 mM 2-mercaptoethanol (BME)/1 mM EDTA. Den dialyserede ekstrakt blev kromatograferet ved en strømningshastighed på 25 100 ml/time over en 2,5 x 35 cm søjle af AGI1A8—ionforsin- kelsesharpiks ækvilibreret i CB/5 mM BME/1 mM EDTA. Det pro-teinholdige eluat blev derefter kromatograferet ved en strømningshastighed på 180 ml/time på en 4,4 x 15 cm søjle af DEAE-Trisacryl ækvilibreret i denne samme puffer. En enkelt 30 top viste sig at blive elueret i dødvolumenet af søjlen og indeholdt >95% rent A7pGH. De relevante fraktioner blev opsamlet, koncentreret tre gange over en ultrafiltreringsmembran (cut-off 5000 dalton), dialyseret omfattende mod 1% CB (0,25 mM natriumbicarbonat, 0,21 mM natriumcarbonat) og lyofilise-35 ret. Slutproduktet (26,5 mg protein) repræsenterede en ud vinding på 14,5%, baseret på den totale proteinmængde i den oprindelige ekstrakt.

DK 167192 B1 14

Eksempel III.

Oprensning og aktivering af Δ7 porcint væksthormon.

5

Inklusionslegemer blev opnået fra E. coli IMC nr. 2 (ATCC 53031), som var blevet dyrket under A7pGH-producerende betingelser, på samme måde som angivet i eksempel I. 1 g af disse inklusionslegemer blev ekstraheret i 100 volumener (100 10 ml) CB/1% SDS/20 mM BME/1 mM EDTA ved omrøring i 3 timer under et nitrogendække. Ekstrakten blev dialyseret mod 2 x 40 volumener CB/1 mM EDTA og fortyndet til 400 ml med CB/5 mM BME/1 mM-EDTA. Den blev derefter kromatograferet på 4,4 x 30 cm søjle af AGIlA8-harpiks ved 250 ml/time i CB/5 mM BME/1 mM 15 EDTA. Fraktionerne indeholdende protein blev opsamlet og kro- matograferet over en 4,4 x 30 cm søjle af DEAE-Trisacryl ved 150 ml/time i denne samme puffer. Når der ikke blev elueret noget protein i dødvolumenfraktionerne, blev NaCl tilsat til en slutkoncentration på 0,2 M, hvilket forårsagede, at der 20 elueredes en enkelt top indeholdende stærkt oprenset A7pGH.

Fraktionerne indeholdende pGH blev opsamlet, dialyseret omfattende mod 1% CB, koncentreret 15 gange over en ultrafiltreringsmembran under 65 psi (cut-off 5000 dalton) og lyofili-seret. Det resulterende produkt indeholdt 27 mg A7pGH, som 25 var >95% rent ved gelelektroforetisk analyse. Det totale ud bytte, baseret på totalt proteinindhold i den oprindelige ekstrakt, var 21%.

Eksempel IV.

30

Oprensning og aktivering af Δ7 porcint væksthormon.

De anvendte inklusionslegemer blev fremstillet ud fra E. coli IMC nr. 2 (ATCC 53031), som var blevet dyrket under A7pGH-35 producerende betingelser på samme måde som angivet i eksempel I. 3 g af disse inklusioner blev ekstraheret over i 100 volumener CB/1,8% SDS/20 mM DTE/1 mM EDTA ved omrøring i 3,5 timer. Denne ekstrakt blev derefter dialyseret mod 2 x 16 DK 167192 B1 15 volumener CB/5 mM BME/1 mM EDTA og kromatograferet på en'4,4 x 24 cm AGIlA8-søjle, ækvilibreret i den samme puffer. Søjlen blev behandlet med denne puffer ved en lineær strømnings-5 hastighed på 0,3 cm/minut. Fraktionerne indeholdende protein blev opsamlet og dialyseret omfattende mod 50 mM ethanolamin-HCl, pH-værdi 9,0, og kromatograferet på en 4,4 x 20 cm søjle af DE-53 i den samme puffer. Der blev ikke elueret noget protein i gennembrudsfraktionerne, men tilsætning af 0,1 M NaCl 10 til pufferen forårsagede eluering af A7pGH. De -relevante frak tioner blev opsamlet, diafiltreret i en omrørt celle over en membran med en cut-off på 5000 dalton mod 5 mM Tris-HCl, pH-værdi 7,4, koncentreret ca. 10 gange og lyofiliseret. Slutproduktet var 29 mg pulver, som var ^90% rent A7pGH ved gel-15 analyse. Det totale udbytte, baseret på inklusionslegemer nes oprindelige A7pGH-indhold, var 5,8%.

Eksempel V.

20 Oprensning og aktivering af A9(Ser)bGH.

Inklusionslegemer blev opnået fra E. coli IMC nr. 1 (ATCC 53030), som var blevet dyrket under Δ9(Ser)bGH-producerende betingelser. Levende celler høstet fra fermentorvæsken (830,6 25 g cellepasta) blev temporært oplagret ved -85°C og derpå op tøet, behandlet med lysozym, homogeniseret, centrifugeret og gensuspenderet i 0,1 M phosphatpuffer, pH-værdi 7,8, 10 mM EDTA. Cellerne blev derefter lyseret ved tre passager gennem en Manton-Gaulin-homogenisator ved 6000 psi. Efter cen-30 trifugering (14.000 x g, 20 minutter) udvandtes 357,5 g in klusioner. Disse blev gensuspenderet i 500 ml 100 mM Tris-HCl, pH-værdi 7,5, 0,5 mM dithiothreitol, 0,5 mM PMSF og lagret ved -85°C. Ca. 1/3 af dette materiale (131,5 g) blev optøet og anvendt i oprensnings-/aktiveringsprocessen. De rå inklu-35 sioner blev vasket en gang med 10 volumener 0,2 M Na^PO^, 10 mM EDTA, pH-værdi 7,8, og centrifugeret til opnåelse af 109,3 g pellet. De vaskede inklusioner blev opløseliggjort ved 60 sekunders homogenisering i 6.560 ml 0,1 M ethanolamin-HCl, DK 167192 B1 16 pH-vaerdi 9,0, 1% SDS. Efter omrøring natten over blev denne ekstrakt diafiltreret mod ti volumener 20 mM ethanolamin-HCl, pH-værdi 9,0, hvilket sænkede SDS-niveauet.til 4,8 mg/ml.

5 Ekstrakten blev centrifugeret ved 8000 o/m i 30 minutter for at fjerne partikelformet materiale, fortyndet 1:1 i 20 mM ethanolamin-HCl, pH-værdi 9,0, og kromatograferet på en 15 liter AG11A8-SØjle. Δ(Ser)bGH-materialet fra AGllA8-søjlen blev derefter kromatograferet på en 1,85 liter DE-52-søjle ækvilibreret i 50 mM ethanolamin-HCl, pH-værdi 9,0 ved 16 ml/minut. Der var en betragtelig mængde protein i gennembrudsfraktionen som angivet ved ^gf). Denne plus en et søjlevolumen vask med 50 mM ethanolamin-HCl, pH-værdi 9,0, udgjorde 18 liter materiale. Eftersom eluatet stadig udviste en ik-ke-nul-A2g0, blev der opsamlet yderligere 8 liter materiale.

Der fulgte vask med ca. 2 søjlevolumener af både 0,1 og 1,0 M NaCl. Disse blev opsamlet separat. Gennembrudsfraktionerne indeholdt >95% rent A9(Ser)bGH ved SDS-PAGE-analyse. Proteinbestemmelse ved Coomasie Blue-farvebindingsanalyse viste 20 ^3,2 g protein i det opsamlede eluat. Materialerne fra NaCl- vask indeholdt også A9(Ser)bGH, men det var næsten fuldstændigt kovalent aggregeret. De 18 liter DE-52-elueringsmiddel fra DE-52-søjlenoblev: koncentreret 4,5 gangeii:'en Amicon DC2-ul-trafiltreringsenhed, hvorefter luft indsprøjtet under recirkula-2g tion forårsagede skumning og udfældning.

Bundfaldet blev fjernet ved filtrering gennem filtrerpapir Whatman nr. 2, og en slutkoncentration til ca. 2 liter blev opnået over en YM-10-membran. Proteinopløsningen blev derefter 20 dialyseret (posedialyse) tre gange mod 36 liter 1% Cornell-puf- fer minus NaCl og lyofiliseret til opnåelse af 2,8 g produkt.

De 8 liter yderligere materiale, der blev vasket af DE-52-søjlen, blev analyseret og viste sig at bestå af i alt væsent-35 ligt rent A9(Ser)bGH. Efter koncentrering til 1,3 liter i en omrørt celle angav Bradford-analyser tilstedeværelsen af 1,25 g protein.

DK 167192 B1 17

Baseret på den oprindelige titer i fermentoren repræsenterer det samlede A9(Ser)bGH, udvundet i ren, opløselig form i 18 liter gennembrudsfraktionen og 8 liter vasken fra DE-52-søj-len et samlet udbytte i størrelsesordenen ca. 30%.

ϋ

Eksempel VI.

Oprensning og aktivering af A9(Ser)bGH.

10

Inklusionslegemer opnået fra E. coli IMC nr. 1 (ATCC 53030) ekstraheres i 100 volumener CB indeholdende 1% SDS ved omrøring natten over. Den resulterende ekstrakt afkøles til 0°C i 4 timer. Udfældet SDS og resterende uopløseligt inklusions-15 legememateriale fjernes ved centrifugering. Den klarede eks trakt kromatograferes, efter at være kommet til stuetemperatur, over en pakket AGllA8-søjle ækvilibreret med CB ved en lineær strømningshastighed på 0,3 cm/minut. Fraktionener indeholdende protein opsamles og føres til en søjle af DEAE-Sepha-20 rose Fast Flow, som var blevet ækvilibretet i CB, og hvis pH-værdi var blevet justeret til 9,0 med koncentreret HC1. Søjlen behandles med CB indeholdende 0,1 M NaCl. De A9(Ser)-bGH-holdige fraktioner opsamles, koncentreres ca. 5 gange over en PM-10-ultrafiltreringsmembran, dialyseres over i 5 25 mM TrisHCl, pH-værdi 7,4, og lyofiliseres til opnåelse af slutproduktet.

Eksempel VII.

30 Bestemmelse af resterende SDS i oprensede, aktiverede proteiner.

Hvert af de i eksemplerne I til IV opnåede sluttelige protein-opløsninger blev analyseret for at bestemme den mængde resterende SDS, om nogen, som var til stede. Slutproduktets SDS-35 indhold blev bestemt ved fremstilling af en 10 mg/ml opløsning i CB. En 100 μΐ prøve af denne opløsning blev blandet med samme volumen 1% acridinorange i 0,5 M NaHSO^. Tre ml toluen tilsattes, og røret blev lukket og rystet kraftigt i 3 minut-

Claims

1. Fremgangsmåde til oprensning og aktivering af et protein, som produceres som et uopløseligt, biologisk inaktivt inklusionslegeme i en transformeret mikroorganisme, kendetegnet ved, at den omfatter, at man 2 0 (a) ekstraherer inklusionslegemerne over i en pufret opløsning af natriumdodecylsulfat for at opløseliggøre proteinet, (b) kromatograferer proteinopløsningen på en ionforsinkelses-2 5 harpiks for at fjerne natriumdodecylsulfatet fra proteinet og (c) kromatograferer proteinopløsningen fra trin (b) på en anionbytterharpiks. 30

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den yderligere omfatter, at man fjerner en del af natrium- dodecylsulfatet fra proteinopløsningen før kromatografering heraf på ionforsinkelsesharpiksen. 35

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at SDS fjernes delvis, før ionforsinkelseskromatografi, ved dialyse af proteinopløsningen mod en SDS-fri pufferopløsning. DK 167192 B1

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at der fjernes ca. 40% til ca. 70% af SDS'et før kromatografi på ionforsinkelsesharpiksen. 5

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at SDS'et fjernes, før ionforsinkelseskromatografi, ved afkøling af proteinopløsningen til en temperatur mellem opløsningens frysepunkt og ca. 5°C. 10

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at der fjernes ca. 40% til ca. 70% af SDS’et før kromatografi på ionforsinkelsesharpiksen. 15 o

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at proteinet er et animalsk væksthormon.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det animalske væksthormon er bovint væksthormon eller et 20 fragment eller en analog deraf.

9. ·Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det animalske væksthormon er porcint væksthormon eller et fragment eller en analog deraf. 25

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at inklusionslegemerne ekstraheres over i en pufret opløsning indeholdende fra ca. 0,1% til 5,0% natriumdodecylsulfat. 30

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at inklusionslegemerne ekstraheres over i en pufret opløsning indeholdende ca. 1% natriumdodecylsulfat.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 35 at natriumdodecylsulfatopløsningen har en pH-værdi fra ca. pH-værdi 8,5 til pH-værdi 11. DK 167192 B1

13. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at ionforsinkelsesharpiksen er AG11A8. 5

14. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at anionbytterharpiksen er DE-53.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at proteinet er A9(Ser)bGH. 10

16. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at proteinet er Δ7 pGH. 15 25 30 35