MXPA03003867A

MXPA03003867A - Desagregacion mejorada de proteina y replegamiento utilizando alta presion.

Info

Publication number: MXPA03003867A
Application number: MXPA03003867A
Authority: MX
Inventors: Jonathan N Webb
Original assignee: Univ Colorado Regents
Priority date: 2000-10-31
Filing date: 2001-10-31
Publication date: 2004-10-15
Also published as: ATE390436T1; WO2002062827A2; WO2002062827A3; DK1434789T3; US20100075399A1; EP1434789B1; JP2009102352A; JP2004530651A; CA2434045A1; EP1434789A2; US7538198B2; US8329878B2; DE60133426D1; US20040038333A1; JP2008031182A; DE60133426T2

Abstract

La presente invencion describe metodos mejorados de desagregacion de agregados de proteina, y replegamiento de proteinas desnaturalizadas, utilizando alta presion; en particular, la presente invencion provee el uso de agitacion, alta temperatura, despresurizacion "en etapas", dialisis y dilucion bajo presion para incrementar la velocidad y el grado de disolucion del agregado y replegamiento de la proteina.

Description

? DESAGREGACION MEJORADA DE PROTEINA Y REPLEGAM1ENTO UTILIZANDO ALTA PRESION ANTECEDENTES DE LA INVENCION 5 CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere generalmente al campo de la bioquímica de proteínas. Más particularmente, se refiere a métodos mejorados 10 para la renaturalización y replegamiento de agregados de polipéptidos.

DESCRIPCION DE LA TECNICA RELACIONADA La agregación de proteínas es de importancia significativa en las 15 comunidades biotecnologicas, farmacéuticas y médicas. In vitro, la agregación se observa virtualmente en cada paso de la producción, replegamiento, purificación, almacenamiento y envío de productos terapéuticos de proteína (Carpenter et al., 1997; Clark et al., 1999). In vivo, varias condiciones patogénicas en humanos (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad 20 de Parkinson y enfermedades del prión (Kelly, 1996; Kelly, 1998; Prusiner, 1998; Scherzinger et al., 1999)) tienen agregación de proteína y formación de depósitos insolubles asociados con la condición y, como un resultado, la investigación sobre la caracterización de los agregados y los mecanismos de agregación en estas enfermedades es un área activa en la investigación médica. La agregación en enfermedades de depositación de proteína en humano, la cual exhibe organización en la forma de fibrillas insolubles, ha traído una mayor importancia al estudio del ensamblaje inadecuado de las proteínas y a los procesos de agregación en general (Wetzel, 1999). La investigación en la reversión de los procesos de agregación y de precipitación tiene implicaciones prácticas inmediatas para la producción, purificación y administración de proteínas terapéuticas. En la producción de proteínas terapéuticas, comúnmente se revierten los precipitados de agregado (por ejemplo, cuerpos de inclusión) mediante la disolución de los agregados de precipitado en la presencia de concentraciones elevadas de caotropo (por ejemplo, hidrocloruro de guanidina 6M). Dichas condiciones severas resultan tanto en la desagregación (solubilización) como en el desplegamiento casi completo de la proteína. Comúnmente, el replegamiento se efectúa mediante la remoción del caotropo mediante diálisis o dilución a concentraciones de proteína de cerca de 10 a 50 9/??? (Clark et al., 1999). Debido a que el replegamiento es comúnmente un proceso de primer orden (en la concentración de proteínas) y la agregación un proceso de segundo orden u orden superior, los rendimientos de replegamiento se mejoran a concentraciones más bajas de proteína (Clark et al., 1999). Los agregados solubles frecuentemente se separan a partir de la proteína nativa mediante cromatografías en columna costosas y consumidoras de tiempo. Los agregados solubles separados se desechan típicamente, reduciendo así los rendimientos generales de la proteína e incrementando substancialmente los costos de producción de la proteína. Una alternativa a la disolución caotrópica para disolver los agregados insolubles o a la purificación en columna para remover agregados solubles es la desagregación mediante presión (Foguel et al., 1999; Gorovits y Horowitz 1998; ST. John et al., 1999). Varios grupos de investigación han explotado la capacidad de la presión para disociar oligómeros de proteína nativa (Silva y Weber 1993). Además, otros han explorado el uso de la presión para desagregar y replegar proteínas a partir de agregados de proteína no nativa solubles (Foguel et al., 1999; Gorovits y Horowitz 1998) y agregados de proteína no nativa precipitados, insolubles (St. John, et al., 1999). Gorovits y Horowitz 1998 utilizaron alta presión para inhibir la formación de agregados solubles en soluciones de rodanasa con urea 3.9 M, y para revertir la formación de agregados solubles. Sin embargo, Gorovits y Horowitz ( 998) reportan que "la presión ... no es capaz de revertir agregados grandes". El tratamiento a 2.4 kbar por 90 minutos de agregados solubles formados a partir de la proteína P22 tailspike redujo los niveles del agregado de 41.1 a 17.6% (Foguel et al., 1999). St. John et al. (1999) utilizaron alta presión para disolver y recuperar proteína nativa a partir de agregados grandes, insolubles a presiones en el orden de 200 Pa, incluyendo agregados formados como cuerpos de inclusión. Se lograron obtener rendimientos elevados a concentraciones altas de proteína a partir de agregados de precipitados insolubles de hormona del crecimiento de humano activa, lisozima y ß-lactamasa replegada utilizando concentraciones no desnaturalizantes de hidrocloruro de guanidina en combinación con presión o presión en la ausencia de hidrocloruro de guanidina (St. John et al., 1999). En el caso específico de los agregados insolubles de lisozima que contienen enlaces disulfuro covalentes intermoleculares no nativos que sirven para entrecruzar los precipitados insolubles, se utilizaron los agentes de cambio redox tales como mezclas de glutationa reducida y oxidada en combinación con alta presión y guanidina HCl 0.8M para obtener altos rendimientos de proteína biológicamente activa, plegada. En el caso específico de los agregados y precipitados y agregados de la hormona de crecimiento de humano, se utilizaron bajos niveles de un caotropo tal como guanidina HCl para optimizar la recuperación de proteína nativa, soluble. En el caso específico de los cuerpos de inclusión de la ß-lactamasa, la adición de guanidina HCl no incrementó el rendimiento de la ß-lactamasa biológicamente activa, pero resultó en una mayor solubilización de las proteínas contaminantes. No obstante, se desean métodos mejorados para la disociación mediante alta presión de agregados de proteína y replegamiento de proteínas solubilizadas.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Por lo tanto, de conformidad con la presente invención, se proveen métodos mejorados para el uso de alta presión en la desagregación y replegamiento de proteína. En una modalidad, se proveen un método para producir proteína desagregada biológicamente activa a partir de agregados de proteína que comprende: (i) proveer un agregado de proteína; (ii) mezclar dicho agregado de proteína con un agente reductor en cantidad suficiente para reducir los enlaces disulfuro del mismo; (iii) someter la mezcla del paso (ii) a alta presión, en comparación con la presión ambiental, en donde dicho agregado de proteína se disuelve; (iv) dializar la mezcla bajo presión, en donde dicho agente reductor se remueve y los enlaces disulfuro se forma de nuevo; y (v) remover la proteína disuelta a partir de la presión incrementada, en donde dicha proteína se repliega de tal manera que se retiene la actividad biológica. El método puede comprender adicionalmente el paso de agitar dicho agregado de proteína y/o proteína disuelta para mejorar la disolución y/o replegamiento; o puede comprender adicionalmente el paso de someter dicho agregado de proteína, antes del replegamiento, a una temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 125°C. El método puede excluir opcionalmente un agente caotrópico. Los agentes reductores adecuados incluyen ditiotreitol, glutationa, ditioeritritol, o ß-mercaptoetanol. La presión incrementada puede comprender de aproximadamente 500 atmósferas a aproximadamente 10,000 atmósferas. Los pasos (ü)-(v) pueden llevarse a cabo de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 12 horas, particularmente en aproximadamente 6 horas. Los pasos (ii) y (iii) pueden llevarse a cabo en la presencia de un agente caotrópico, y dicho método puede comprender adicionalmente el paso de remoción de dicho agente caotrópico. Los agentes caotrópicos adecuados incluyen guanidlna, sulfato de guanidina, hidrocloruro de guanidina, urea, tiocianato, sarcosil, dodecilsulfato de sodio, u octilsulfato de sodio. El agregado de proteína puede comprender cuerpos de inclusión, precipitados solubles e insolubles, oligómeros no nativos solubles, gel, fibrillas, películas, filamentos, protofibrillas, depósitos de amiloide, placas, u oligómeros intracelulares no nativos dispersos. El agregado de proteína también se puede someter a una presión a concentración elevada, por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 5 a 20 mg/ml, o más particularmente, de aproximadamente 10 mg/ml. El agregado de proteína puede entonces diluirse bajo presión, por ejemplo, a aproximadamente 1 mg/ml. En otra modalidad, se provee un método para producir proteína desagregada biológicamente activa a partir de agregados de proteína que comprende: (i) proveer un agregado de proteína; (ii) someter dicho agregado de proteína a una presión incrementada, en comparación con la presión ambiental, y a agitación, en donde dicho agregado de proteínas se disuelve; y (iii) remover la proteína disuelta a partir de la presión incrementada, en donde dicha proteína se repliega de tal manera que se retiene la actividad biológica. El método puede comprender adicionalmente el paso de agitación de la proteína disuelta para mejorar el replegamiento. La agitación se puede proveer mediante energía de ultrasonido, agitación mecánica, agitación, o bombeo mediante dispositivos estáticos. Esta puede comprender adicionalmente someter dicho agregado de proteína, antes del replegamiento, a una temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 80°C. Opcionalmente, el método no utiliza un agente caotrópico. La presión incrementada puede comprender de aproximadamente 500 atmósferas a aproximadamente 10,000 atmósferas. Los pasos (ii)-(v) pueden llevarse a cabo de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 12 horas, particularmente en aproximadamente 6 horas. Los pasos (ii) y (iii) pueden llevarse a cabo en la presencia de un agente caotrópico, y dicho método puede comprender adicionalmente el paso de remoción de dicho agente caotrópico. Los agentes caotropicos adecuados incluyen guanidina, sulfato de guanidina, hidrocloruro de guanidina, urea, tiocianato, sarcosil, dodecilsulfato de sodio, u octilsulfato de sodio.

El método puede comprender adicionalmente el mezclado de dicho agregado de proteína con un agente reductor en una cantidad suficiente para reducir los enlaces disulfuro en el mismo; y puede comprender adicionalmente la diálisis de dicha mezcla bajo presión, en donde dicho agente reductor se remueve y los enlaces disulfuro se forman de nuevo. El agente reductor puede formarse mediante diafiltración o ultrafiltración, o puede ser anulado mediante la adición de un agente oxidante. El agente reductor adecuado es ditiotreitol, glutationa, ditioeritritol, o ß-mercaptoetanol. El agregado de proteína puede comprender cuerpos de inclusión, precipitados solubles e insolubles, ollgómeros no nativos solubles, gel, fibrillas, películas, filamentos, protofibrillas, depósitos de amiloide, placas, u oligómeros ¡ntracelulares no nativos dispersos. El agregado de proteína también puede someterse a una presión a concentración elevada, por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 5 a 20 mg/ml, o más particularmente, a aproximadamente 10 mg/ml. El agregado de proteína puede entonces diluirse bajo presión, por ejemplo, a aproximadamente 1 mg/ml. En incluso otra modalidad, se provee un método para producir proteína desagregada biológicamente activa a partir de agregados de proteína que comprende: (i) proveer un agregado de proteína; (ii) someter dicho agregado de proteína a una presión incrementada, en comparación con la presión ambiental, y a una temperatura elevada de aproximadamente 30°C a aproximadamente 125°C, en donde dicho agregado de proteína se disuelve; y (iii) remover la proteína disuelta a partir de la presión incrementada y temperatura elevada, en donde dicha proteína se repliega de tal manera que se retiene la actividad biológica. Opcionalmente, el método no incluye el uso de un agente caotrópico. El método puede comprender adicionalmente el paso de agitación de dicho agregado de proteína y/o proteína disuelta para mejorar la disolución y/o replegamiento; o puede comprender adicionalmente el mezclado de dicho agregado de proteína con un agente reductor en cantidad suficiente para reducir los enlaces disulfuro en éste. La mezcla se puede dializar bajo presión, en donde dicho agente reductor se remueve y los enlaces disulfuro se forman de nuevo. Alternativamente, el agente reductor es removido mediante diafiltración o ultrafiltración, o anulado mediante la adición de un agente oxidante. Los agentes reductores adecuados incluyen ditiotreitol, glutationa, ditioeritritol, o ß-mercaptoetanol. La presión incrementada puede comprender de aproximadamente 500 atmósferas a aproximadamente 10,000 atmósferas. Los pasos (ii)-(v) pueden llevarse a cabo de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 12 horas, particularmente en aproximadamente 6 horas. Los pasos (ii) y (iii) pueden llevarse a cabo en la presencia de un agente caotrópico, y dicho método puede comprender adicionalmente el paso de remoción de dicho agente caotrópico. Los agentes caotrópicos adecuados incluyen guanidina, sulfato de guanidina, hidrocloruro de guanidina, urea, tiocianato, sarcosil, dodecilsulfato de sodio, u octilsulfato de sodio. El agregado de proteína puede comprender cuerpos de inclusión, precipitados solubles e insolubles, oiigómeros no nativos solubles, gel, fibrillas, películas, filamentos, protofibrillas, depósitos de amiloide, placas, u oiigómeros intraceiulares no nativos dispersos. El agregado de proteína también puede someterse a una presión a concentración elevada, por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 5 a 20 mg/ml, o más particularmente, a aproximadamente 10 mg/ml. El agregado de proteína puede entonces diluirse bajo presión, por ejemplo, a aproximadamente 1 mg/ml. En incluso otra modalidad, se provee un método para producir proteína desagregada biológicamente activa a partir de agregados de proteína que comprende: (i) proveer un agregado de proteína; (¡i) mezclar dicho agregado de proteína con un agente reductor en una cantidad suficiente para reducir los enlaces disulfuro en el mismo; (iii) someter la mezcla del paso (¡i) a una presión incrementada, en comparación con la presión ambiental, y a una temperatura elevada de aproximadamente 30°C a aproximadamente 125°C, y a agitación, en donde dicho agregado de proteínas se disuelve; (¡v) remover o neutralizar dicho agente reductor, en donde los enlaces disulfuro se forman de nuevo; y (v) remover la proteína disuelta a partir de la presión incrementada y de la temperatura elevada, en donde dicha proteína se repliega de tal manera que se retiene la actividad biológica. Opcionalmente, el método no incluye el uso de un agente caotrópico. El método puede comprender adicionalmente la diálisis de dicha mezcla bajo presión, en donde dicho agente reductor se remueve y los enlaces disulfuro se forman de nuevo; o el método puede comprender adicionalmente la remoción de dicho agente reductor mediante diafiltración o ultrafiltración. Alternativamente, el efecto de dicho agente reductor es anulado por la adición de un agente oxidante. Los agentes reductores adecuados incluyen ditiotreitol, glutationa, ditioeritritol, o ß-mercaptoetanol. La presión incrementada puede comprender de aproximadamente 500 atmósferas a aproximadamente 10,000 atmósferas. Los pasos (ii)-(v) pueden llevarse a cabo de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 12 horas, particularmente en aproximadamente 6 horas. El agregado de proteína puede comprender cuerpos de inclusión, precipitados solubles e insolubles, oligómeros no nativos solubles, gel, fibrillas, películas, filamentos, protofibrillas, depósitos de amiloide, placas, u oligómeros intracelulares no nativos dispersos. El agregado de proteína también puede someterse a una presión a concentración elevada, por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 5 a 20 mg/ml, o más particularmente, a aproximadamente 10 mg/ml. El agregado de proteína puede entonces diluirse bajo presión, por ejemplo, a aproximadamente 1 mg/ml. Los pasos (¡i) y (iii) pueden llevarse a cabo en ia presencia de un agente caotrópico, y dicho método puede comprender adicionaimente el paso de remoción de dicho agente caotrópico. Los agentes caotrópicos adecuados incluyen guanidina, sulfato de guanidina, hidrocloruro de guanidina, urea, tiocianato, sarcosil, dodecilsulfato de sodio, u octilsulfato de sodio. En una modalidad adicional, se provee un método para producir proteína desagregada biológicamente activa a partir de agregados de proteína que comprende: (i) proveer un agregado de proteína; (ii) someter dicho agregado de proteína a una primera presión incrementada, en comparación con la presión ambiental, en donde dicho agregado de proteína se disuelve; (iii) someter la proteína disuelta a una segunda presión que es menor que dicha primera presión incrementada, pero que aún así es una presión incrementada en comparación con la presión ambiental, y (iv) remover la proteína disuelta a partir de dicha segunda presión incrementada, en donde dicha proteína se repliega de tal manera que se retiene la actividad biológica. La primera presión incrementada puede ser de aproximadamente 200 MPa a aproximadamente 1000 MPa. La segunda presión incrementada puede ser de aproximadamente 100 MPa. El método puede comprender adicionalmente la agitación de la proteína bajo presión, o el método puede comprender adicionalmente el someter dicha proteína a una temperatura elevada, por ejemplo una temperatura elevada de aproximadamente 30°C a aproximadamente 125°C. El método puede comprender adicionalmente el mezclado del agregado de proteína, antes de la presión incrementada, con un agente reductor. El método también puede comprender la diálisis de dicha mezcla bajo presión, en donde dicho agente reductor se remueve y los enlaces disulfuro se forman de nuevo. Alternativamente, el agente reductor es removido mediante diafiltración o ultrafiltración, o es anulado mediante la adición de un agente oxidante. Los agentes reductores adecuados incluyen ditiotreitol, glutationa, ditioeritritol, o ß-mercaptoetanol. El agregado de proteína también se puede someterse a una presión a una concentración elevada, por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 5 a 20 mg/ml, o más particularmente, a aproximadamente 10 mg/ml. El agregado de proteína puede entonces diluirse bajo presión, por ejemplo, a aproximadamente 1 mg/ml. Los pasos (ii)-(iv) pueden llevarse a cabo de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 12 horas, o más particularmente en aproximadamente 6 horas. Opcionalmente, el método excluye a los agentes caotrópicos. Los pasos (ii)-(iv) pueden llevarse a cabo en la presencia de un agente caotrópico, y dicho método puede comprender adicionalmente el paso de remoción de dicho agente caotrópico. Los agentes caotrópicos adecuados incluyen guanidina, sulfato de guanidina, hidrocloruro de guanidina, urea, tiocianato, sarcosil, dodecilsulfato de sodio, u octilsulfato de sodio. El agregado de proteína puede comprender un multímero de proteína, por ejemplo, un heteromultímero o un homomultímero. Los multímeros puede seleccionarse a partir del grupo que consiste de un dímero, un trímero, un tetrámero, un pentámero, un hexámero, un heptámero, un octámero y un nonámero. Los ejemplos de proteínas multlméricas incluyen interferón-?, hemoglobina, ácido láctico deshidrogenasa, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. Todos los métodos precedentes también pueden llevarse a cabo en proteínas desnaturalizadas solubles. En modalidades adicionales, se proveen: Un método para volver a un agregado de proteína susceptible a la disolución por caotropos, detergentes y/o temperatura incrementada que comprende someter dicho agregado de proteína a una alta presión en combinación con uno o más caotropos, detergentes y/o temperatura incrementada; un método para incrementar la vida de anaquel de una muestra de proteína que comprende los pasos de remover agregados de proteína soluble mediante la aplicación de alta presión, seguido por despresurización; un método para seleccionar una composición de proteína para condiciones de replegamiento que comprende: (i) proveer una composición de proteína en muestras por duplicado físicamente distintas; (ii) someter dichas muestras por duplicado a condiciones diferentes que comprenden alta presión y temperatura variable, diversos reguladores de pH, reguladores de diversas concentraciones de sales, diversas concentraciones de proteína, diversas concentraciones de agente reductor, diversos agentes estabilizantes, diversos agentes caotrópicos, diversos detergentes, diversos agentes tensioactivos; y (iii) remover dichas muestras por duplicado a partir de la alta presión; y (iv) evaluar el replegamiento de la proteína; un método para inactivar virus en una muestra que contiene una proteína de interés que comprende: (i) proveer una muestra que contiene una proteína deseada, dicha proteína estando en un estado nativo o no nativo; (ii) tratar a dicha muestra para reducir o eliminar las partículas de virus infeccioso de la misma; y (iii) someter dicha muestra a un procedimiento de replegamiento de proteína mediante alta presión; y un método para producir proteína desagregada biológicamente activa a partir de agregados de proteína que comprende: (i) proveer un agregado de proteína; (ii) someter la mezcla del paso (i) a una presión incrementada, en comparación con la presión ambiental, a una temperatura elevada de aproximadamente 30°C a aproximadamente 125°C, y a agitación, en donde dicho agregado de proteína se disuelve; (iii) alterar el pH de la mezcla del paso (ii) mediante diálisis; y (iv) remover la proteína disuelta a partir de la presión incrementada y de la temperatura elevada, en donde dicha proteína se repliega de tal manera que se retiene la actividad biológica.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención también puede entenderse mejor con referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de modalidades específicas presentadas aquí. Figura 1 : Recuperamiento mediante alta presión de agregados de rhGH tanto en regulador de pH solo como en GdmHCI 0.75 M. Los estándares atmosféricos están marcados con símbolos abiertos, mientras que las muestras presurizadas están marcados con símbolos sólidos. Los reguladores de pH para replegamiento no contienen GdmHCI.

Figuras 2A-1 , 2A-2 y 2B: Micrografías por TEM de agregados de rhlFN-? inducidos térmicamente (figura 2A) y agregados inducidos por hidrocloruro de guanidina (figura 2B). Los marcos 2A1 y 2B están a una amplificación de 40,000 (barra = 200 µ?t?) y 2A2 a 80,000 (barra = 100 µt?). Figuras 3A y 3B: Concentración de masa porcentual contra diámetro EM como se mide mediante GEMMA para agregados de rhlFN-? nativos (línea gruesa) e inducidos térmicamente (línea delgada). (A) región del diámetro EM para el monómero (de cerca de 4.4 nm) y el dímero (de cerca de 5.5 nm) y (B) región del diámetro EM para los agregados. Nótese que la distribución del tamaño de partículas se divide en dos ventanas para claridad y que las dos ventanas tienen diferentes escalas de masa porcentual. La respuesta para rhlFN-? nativo en el intervalo de 7 a 10 nm (ventana B) está dentro del nivel de ruido de fondo del instrumento. Figura 4: Espectro UV de segunda derivada de agregados de rhlFN-? inducidos térmicamente (?) e inducidos por hidrocloruro de guanidina ( ) antes del tratamiento con presión. Incluidos junto con el espectro de los agregados están el control líquido del rhlFN-? a 0.1 MPa (línea sólida) y los disociados mediante presión a 250 (X) MPa. El extremo cerca de 286 nm en el espectro nativo y en el espectro disociado con presión se utilizó para seguir el evento de replegamiento después de la disociación de los agregados. Excepto para el espectro a 250 MPa, todos espectros se recolectaron a 0.1 MPa. Figura 5: Area normalizada de la segunda derivada del espectro para FTIR de los agregados inducidos térmicamente (?) y de los agregados inducidos por hidrocloruro de guanidina ( ) con el tratamiento con presión. El espectro de rhlFN-? está incluido para propósitos de comparación y se representa como una línea sólida. Todos los espectros se recolectaron a O.I MPa. Figuras 6A-6B: Figura 6A - Absorbancia a 310 nm contra el tiempo para los agregados inducidos por hidrocloruro de guanidina a 250 MPa en regulador de pH de succinato. La concentración total de rhlFN-? fue de 1.0 mg/mL y la concentración de hidrocloruro de guanidina en solución fue de cerca de 5 mM. La absorbancia del rhlFN-? nativo a 310 nm en la ausencia de agregados es de cerca de 0.06 AU mL/cm mg (datos no mostrados). Figura 6B - La altura del extremo de la segunda derivada (cercana a 286 nm) contra el tiempo a 100 MPa para agregados de rhIFN-y (1 mg/mL) e inducidos por hidrocloruro de guanidina ( ) e inducidos térmicamente (?) disociados a 250 MPa. Las barras de error son de intervalos de 95% de confianza en la altura del espectro. Las alturas espectrales de la forma disociada por presión a 250 MPa (línea de guiones), control con líquido nativo (línea sólida con X) y replegamiento con presión después del equilibrio a 0.1 MPa (línea punteada) están incluidas en la gráfica para referencia. Figuras 7A1-7C-2: Micrografías por TEM de agregados de rhlFN-? inducidos térmicamente (figura 7A), agregados de rhlFN-? inducidos por hidrocloruro de guanidina (figura 7B) y agregados de rhlFN-? control, nativo (sin tratamiento con presión) a amplificaciones de 40,000. Se observaron estructuras cortas fibrosas en tocias las muestras, pero la estructura dominante fue amorfa (por ejemplo, A2). Barra= 200 µ??. Figuras 8A-8B: Segunda derivada del Espectro de UV de agregados inducidos térmicamente (figura 8A) e inducidos por hidrocloruro de guanidina (figura 8B) tratados con presión. Todos los espectros se recolectaron a 0.1 MPa inmediatamente después del término del protocolo de replegamiento con presión. El replegamiento se llevó a cabo a 20 mg/mL (símbolos sólidos), 10 mg/mL (símbolos abiertos) y 1 mg/mL (línea punteada) y los espectros se recolectaron inmediatamente después de la dilución a cerca de 1 mg/mL. El espectro del rhlFN-? control nativo (línea sólida) está superpuesto en ambas ventanas para referencia. Figura 9: Area normalizada de la segunda derivada del espectro FTIR con agregados inducidos térmicamente (figura 9A) tratados con presión y agregados inducidos por hidrocloruro de guanidina (figura 9B) tratados con presión. Todos los espectros se recolectaron a 0.1 MPa dentro de las primeras tres horas después del término del protocolo de replegamiento con presión. Los espectros FTIR se registraron para desempeño de replegamiento a 20 mg/mL (símbolos sólidos), 10 mg/mL (símbolos abiertos). El espectro del rh!FN-? control, nativo (línea sólida) está superpuesto en ambas ventanas para referencia. Figura 10: Segunda derivada del espectro UV de agregados inducidos térmicamente, tratados con presión después de 2 semanas a 4°C, 0.1 MPa y 1 mg/mL. El replegamiento se llevó a cabo a 20 mg/mL (símbolos sólidos), 10 mg/mL (símbolos abiertos) y 1 mg/mL (línea punteada) y las muestras se diluyeron inmediatamente a cerca de 1 mg/mL. El espectro del rhlFN-? control, nativo (línea sólida) está superpuesto para referencia. Figura 1 1 : Efecto de las condiciones redox a distintas presiones sobre el rendimiento de replegamiento. Las condiciones fueron 16 horas de replegamiento a 25°C, con 6 horas de despresurizaron. El rendimiento máximo se obtuvo a partir de las muestras en GGSG 4 mM, DTT 2 mM y se mantuvieron a 2000 bar. Figura 12: Efecto de la temperatura sobre el rendimiento del replegamiento. Las condiciones fueron 2000 bar por 24 horas de replegamiento, GSGG 4 mM, DTT 2 mM, pH 7.2, con 8 horas de despresurización. El rendimiento máximo se obtuvo cuando la temperatura de replegamiento se mantuvo a 25°C. Figura 13: Efecto de la presión sobre el rendimiento del replegamiento. Las condiciones fueron 16 horas de replegamiento, GSGG 4 mM, DTT 2 mM, 22°C, pH 7.2, con 8 horas de despresurización. Se encontró que el rendimiento del replegamiento fue de un máximo a 2000 bar. Figura 14: Espectro de la temperatura sobre el replegamiento de aVEGF. Las condiciones fueron 2000 bar por 16 horas, de despresurización lenta. Un rendimiento del 29% se obtuvo a partir de las muestras mantenidas a 50°C. Las barras de error denotan un nivel de confianza del 95%.

Figura 15: Proteína solubilizada a partir de cuerpos de inclusión GCSF: círculos (·) representan muestras atmosféricas. Cuadrados (¦) representan muestras incubadas a 2000 bar por 24 horas.

DESCRIPCION DE LAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS La presente invención A pesar de que no son visibles, los agregados solubles proponen un problema extremadamente difícil y azaroso cuando se producen productos proteicos. Los agregados solubles disminuyen el valor del producto y, en el caso de las preparaciones farmacéuticas, pueden llevar a reacciones anafilácticas peligrosas en pacientes que pueden ser fatales. Muchos pasos del procesamiento pueden ocasionar formación de agregados solubles, incluyendo: filtración, ultrafiltración, extracción, precipitación, cristalización, secado por aspersión/congelamiento, concentración, y cromatografía. Debido a que la filtración puede ocasionar formación adicional de agregados solubles, la remoción de estos agregados es extremadamente compleja y difícil. De hecho, los productos proteicos comercialmente disponibles frecuentemente están graduados con base en el contexto de los agregados solubles en la formulación, y el valor del producto se puede mejorar dramáticamente por una reducción relativamente pequeña en los agregados solubles (2-5%). La albúmina de suero de humano es un excelente ejemplo de un producto cuyo valor se puede incrementar mediante la reducción de agregados.

Similarmente, los precipitados insolubles de proteínas no nativas se forman frecuentemente durante la producción, purificación, empaquetamiento, almacenamiento, envío y administración de proteínas. Estos agregados son un riesgo para la salud humana en el caso de los productos parenteralmente administrados, debido a que pueden provocar varias respuestas inmunes, incluyendo choque anafiláctico. Además, la síntesis de proteínas de humano en cultivos de célula recombinante frecuentemente resulta en la formación de precipitados insolubles de proteína agregada, no nativa, denominados cuerpos de inclusión. Se debe evidenciar que los cuerpos de inclusión frecuentemente son lo suficientemente grandes para ser observados mediante microscopía electrónica de transmisión, y pueden contener enlaces disulfuro covalentes intermoleculares no nativos. Estos cuerpos de inclusión típicamente se procesan inicialmente mediante su disolución en concentraciones elevadas de agentes caotrópicos tales como urea o guanidina, añadiendo agentes reductores para romper los enlaces disulfuro. Después de la disolución, la proteína no plegada disuelta se diluye típicamente a concentraciones por debajo de 1 mg/ml, y la urea o guanidina se remueve lentamente mediante diafiltración. Las condiciones redox frecuentemente se especifican en varios momentos durante el procedimiento de replegamiento para permitir que los enlaces disulfuro nativos se formen de nuevo. El procedimiento general requiere grandes cantidades de reactivos costosos, el equipamiento el manejo de grandes volúmenes de soluciones y pasos costosos de desecho de residuos. Además, los rendimientos de la proteína nativa, adecuadamente plegada frecuentemente son menores del 50%, y la proteína deseada se encuentra en una solución diluida después del replegamiento, requiriendo pasos adicionales para concentración, que son costosos después de que el replegamiento ha concluido. Previamente, los inventores han descrito su trabajo sobre el uso de alta presión para facilitar la desagregación de agregados de proteína insoluble, y para facilitar el replegamiento de proteínas. St. John et al. (1999), y en el documento U.S. número de serie 09/350, 327, por Randolph et al. Combinando alta presión con concentraciones bajas, no desnaturalizantes de hidrocloruro de guanidina, los agregados de hormona de crecimiento de humano fueron desagregados y se recuperó proteína replegada adecuadamente al 100%. A las 24 horas y en la ausencia de guanidina, la recuperación de la hormona de crecimiento nativa de humano después del tratamiento con presión a 2 kbar por 24 horas fue de solamente el 20%. En particular, el documento U.S. número de serie 09/350, 327 por Randolph et al. (incorporado como referencia) provee métodos efectivos para desagregar y replegar proteínas agregadas, desnaturalizadas en solución, de manera que se recupera proteína biológicamente activa, adecuadamente plegada en solución con un elevado rendimiento. La disociación de los agregados de proteína toma lugar conforme la presión se incrementa de aproximadamente 0.25 kbar hasta no más de aproximadamente 12 kbar. El replegamiento toma lugar a una presión entre aproximadamente 0.25 kbar a aproximadamente 3.5 kbar, ventajosamente de aproximadamente 1.5 kbar a aproximadamente 3 kbar. Típicamente un agente caotrópico está presente a una concentración que no es efectiva para desnaturalizar la proteína a presión atmosférica, y algunas veces está ausente por completo. Opcionalmente, los reactivos de oxido-reducción pueden ser incorporados en la solución de replegamiento de manera que los enlaces disulfuro intermoleculares nativos se pueden formar en donde se desee. El método es aplicable a substancialmente todas las proteínas, especialmente para agregados de proteína insoluble, cuerpos de inclusión, o agregados oligoméricos anormales (solubles). La presente invención extiende este trabajo en los siguientes modos: - la agitación de proteína en varias etapas, en particular mientras la proteína está bajo presión, acelera y mejora la desagregación y el proceso de replegamiento; -el incremento de la temperatura durante varias incubaciones, incluyendo mientras la proteína está bajo desagregación y replegamiento, también acelera el proceso y mejora el rendimiento, particularmente en la ausencia de un caotropo; -la remoción o neutralización del agente reductor mientras está bajo presión; - la dilución de proteína a una concentración de trabajo inmediatamente después de la presurización, lo cual permite volúmenes más pequeños para el equipo de replegamiento mediante alta presión, lo cual provee de un ahorro sustancial en el costo; y - el uso de presiones intermedias durante el replegamiento para permitir las interacciones intramoleculares e intermoleculares para que sean "seleccionadas" independientemente. Utilizando estos elementos en combinación con los métodos previamente descritos, ya sea individualmente o en combinación con otro, los presentes inventores proveen métodos mejorados de desagregación de proteína y replegamiento bajo presión, incluyendo ahorros significativos en el tiempo. Los siguientes párrafos describen varias modalidades de la presente invención.

Aumento de los procesos de replegamiento convencional; pasos de transición En muchos procesos de replegamiento, hay pasos críticos en los que ciertos reactivos o condiciones se remueven o se anulan. Estos pasos proveen oportunidades para las proteínas replegadas, ya sea para desplegarse o agregarse y precipitarse. Con el objeto de prevenir que esto ocurra, uno puede utilizar la presente invención para "hacer un puente" de una condición de tratamiento a la siguiente. Por ejemplo, la remoción de un detergente o de un agente caotrópico, o la reducción de la temperatura, los cuales son críticos para el procesamiento adicional de una muestra de proteína, crean un riesgo de agregación. Mediante el sometimiento de las muestras a presión incrementada a la vez que se hace una transición a una solución libre de detergente o de caotropo, o a temperatura ambiente, uno reduce las posibilidades de precipitación. De manera similar, algunos reactivos o condiciones, los cuales son insuficientes por sí mismos para facilitar la desagregación y/o replegamiento de proteínas, pueden aumentarse mediante el uso de alta presión. A pesar de que ciertos usos prosperan mediante la exclusión de caotropos o detergentes, otros usos pueden no verse afectados por estos tratamientos relativamente riesgosos. Mediante el uso de estos reactivos o condiciones en conjunción con alta presión, es posible mejorar su desempeño y, en algunos casos, crear un proceso de replegamiento operable. Dichas combinaciones incluyen presión + temperatura incrementada, presión + detergente, presión + caotropo, etcétera.

Selección de condiciones de plegamiento para productos qénicos La producción de proteína puede facilitarse mediante la modificación genética de una célula hospedera apropiada de manera que se ocasione que ésta produzca un producto proteináceo conocido o desconocido, utilizando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Véase Sambrook et al. (1989). Desafortunadamente, estos productos frecuentemente se encuentran dentro de la célula hospedera como precipitados insolubles, y puede ser considerablemente difícil el recuperar las proteínas adecuadamente plegadas a partir de estos precipitados. Sin embargo, puesto que cada combinación de proteína- célula hospedera es única, frecuentemente se emplea experimentación empírica laboriosa para determinar las condiciones apropiadas de replegamiento. En un aspecto de la invención, las muestras homogeneizadas de "masa" celular que contienen precipitados insolubles de un producto proteináceo deseado, o preparaciones parcialmente purificadas (por ejemplo, mediante centrifugación para remover los desechos celulares, seguido por lavado del precipitado con soluciones reguladoras de pH que contienen agentes tensioactivos para remover lípidos) pueden seleccionarse para una disolución óptima y condiciones de replegamiento mediante la colocación de éstas en contenedores de muestras individuales. A estos contenedores también se les añaden soluciones acuosas que pueden contener varios reguladores de pH (los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, regulador de pH con fosfato, regulador pH con borato, regulador de pH con carbonato, regulador de pH con citrato, HEPES, MEPS), sales (los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, las sales de cloruro, sulfato y carbonato de sodio, zinc, calcio, amonio y potasio), agentes solubilizantes (los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, urea, hidrocloruro de guanidina, sulfato de guanidina y sarcosina), y agentes estabilizantes (los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, agentes tensioactivos no iónico se tales como Tween 20, Tween 40, Tween 80, Brij, conservadores tal como bencil alcohol, y carbohidratos tales como sacarosa, rafinosa, hidroxietil almidón, dextrán y trehalosa).

Un contenedor preferido es un contenedor de muestra de múltiples pozos (por ejemplo, de 96 pozos), en donde las múltiples muestras de proteína se pueden colocar en un arreglo de pozos de muestra, con cada pozo que contiene posiblemente soluciones de diferentes pH, fuerza iónica, tipo de sal, tipo de regulador de pH, y agentes estabilizantes. Los contenedores de muestra de múltiples pozos pueden sellarse convenientemente utilizando cubiertas plásticas auto-adhesivas comercialmente disponibles. Los contenedores, o todo el contenedor de muestra de múltiples pozos, puede colocarse en una vasija a presión, tal como aquéllas comercialmente disponibles a partir de the Flow International Corp. o High Pressure Equipment Co. el remanente del volumen interior de la vasija a alta presión puede llenar entonces con agua o con otro fluido para la transmisión de la presión. La presión puede elevarse entonces como se describe en las reivindicaciones, y se afecta la disolución y el plegamiento de la muestra de proteína.

Desagregación y repleqamiento de proteínas después de procesos de inactivación viral Los procesos de inactivación viral frecuentemente se utilizan para productos proteicos de plasma de humano, productos proteicos derivados de plasma de humano y para medio de cultivo celular. Estos procesos implican el tratamiento de la solución con calor, ciclos de alta presión o mezclas de solvente-detergente. Para cualesquiera de estos métodos, se origina un problema en tanto que los mismos procesos que inactivan a los virus también ocasionan desnaturalización de la proteína y agregación. Por lo tanto, un protocolo de inactivación viral frecuentemente representa un compromiso entre la inactivación viral óptima y la retención óptima de niveles deseados de proteína activa. El resultado es que ya sea la inactivación es incompleta, se pierden componentes valiosos de proteína, o ambos. El problema adicionalmente se complica por el hecho de que algunas de las proteínas más valiosas en el producto tratado (por ejemplo, factor VIII) son algunas de las más sensibles a la agregación inducida por tensión. Con el proceso de los inventores, la solución que contiene virus puede ser tratada con cualesquiera de los métodos estándares empleados para inactiva a los virus. Después de este tratamiento, la solución se somete entonces a la desagregación por alta presión de los inventores y a procesos de replegamiento para incrementar el nivel de la proteína(s) activa nativa. Además, con la capacidad para renaturalizar proteínas dañadas durante la inactivación viral en su lugar apropiado, se pueden emplear procesos de inactivación viral más efectivos (por ejemplo, exposición más larga a temperaturas altas y/o exposición a temperaturas más altas). Los virus que pueden ser de importancia incluyen VIH-1 , VIH-2, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, parvovirus, virus del herpes simplex I y II, virus Epstein Barr, HHV6 y citomegalovirus. La muestra puede ser plasma, sangre, productos proteicos derivados de plasma, un producto proteico derivado a partir de células humanas cultivadas, suero, o medio de cultivo celular que contiene suero. El procedimiento de replegamiento de proteína con alta presión comprende adicionalmente uno o más tratamientos incluyendo alta temperatura, agente caotrópico, agente solubilizantes, agente reductor, agitación y despresurización "por pasos".

Reducción en los niveles de agregación soluble que sirven como núcleos o prenúcleos para precipitación de proteína Hay varios pasos durante la purificación, almacenamiento y procesamiento de productos proteicos que fomentan la formación de agregados de proteína soluble no nativa y/o precipitados insolubles en agregados de proteína no nativa. Estos Incluyen filtración, diálisis, cromatografía, congelamiento-descongelamiento, exposición a burbujas de aire durante los procedimientos tal como tanques que mantienen el llenado o incluso viales del producto final, etcétera. La remoción o reducción de estos agregados podría reducir el riesgo de pérdida de grandes cantidades de proteína durante el paso de procesamiento subsecuente debido a la precipitación. Esto es debido a que los agregados solubles frecuentemente sirven como núcleos o prenúcleos para precipitación. Como tal, estas especies pueden existir a niveles relativamente bajos (por ejemplo, 1 % de la masa total de proteína) y aún así activar la precipitación rápida de una gran fracción (por ejemplo, > 30-50% o mayor) de la población total de proteínas. La precipitación se puede activar cuando un paso de procesamiento dado fomenta la formación de un nivel de agregados solubles que excede un umbral y/o mediante la exposición de los agregados solubles existentes a una tensión (por ejemplo, filtración) que promueve el ensamblaje a un tamaño crítico de núcleo. También, el mero hecho del almacenamiento a largo plazo puede resultar en la precipitación debido a los agregados solubles. Por lo tanto, en una modalidad, estos núcleos o prenúcleos pueden removerse simplemente mediante el procesamiento de una suspensión celular completa, o suspensión parcialmente purificada, utilizando los procesos de desagregación a alta presión y/o replegamiento de la presente invención. Alternativamente, la proteína precipitada se puede separar de la fracción soluble mediante filtración, cromatografía o centrifugación, y luego replegarse utilizando los mismos métodos a alta presión. La eliminación (o incluso reducción en el nivel) de estos agregados minimiza el riesgo de precipitación de proteínas en los pasos de procesamiento subsecuente, y puede mejorar la vida de anaquel de las preparaciones de proteína replegadas. Varios aspectos de la invención se describirán con detalle en la siguiente discusión.

II. Definiciones Como se utiliza aquí, un "agregado de proteína" se define como que está compuesto de una multiplicidad de moléculas de proteína en donde las interacciones no covalentes no nativas y/o enlaces covalentes no nativos tales como enlaces disulfuro intermoleculares mantienen juntas a las moléculas de proteína. Típicamente, pero no siempre, un agregado contiene suficientes moléculas de manera que es insoluble. También hay proteínas oligoméricas anormales que se presentan como agregados en solución. Además, típicamente (pero no siempre) hay una exposición de al menos un epítope o región en la superficie de agregación que no se exhibe en la superficie de la proteína no agregada, nativa. Los "cuerpos de inclusión" son un tipo de agregado de particular interés, al cual la presente invención es aplicable. Presión "Atmosférica" o "ambiente" se define como aproximadamente 6.75 kg por 2.54 cm2 (psi) o 1 bar. Un "copartícipe de unión," o "ligando," puede incluirse en una mezcla de replegamiento. Un "copartícipe de unión" es un compuesto que se une específicamente (o que ¡nteractúa de otra manera) con una proteína blanco de interés. "Ligandos" incluye, sin limitación, anticuerpos, receptores, péptidos, peptidomiméticos, vitaminas, cofactores, grupos prostéticos, sustratos, productos, inhibidores competitivos, metales y otras moléculas pequeñas o grandes. La presencia de dicho copartícipe de unión es especialmente ventajosa en una mezcla de replegamiento en donde ese copartícipe de unión favorece una conformación nativa de la proteína blanco cuando interactúa con el replegamiento de la proteína blanco. "Actividad biológica" de una proteína como se utiliza aquí, significa al menos 10% de actividad específica máxima conocida como se mide en un ensayo que generalmente se acepta en la técnica, que se correlaciona con la actividad conocida o pretendida de la proteína. Para las proteínas pretendidas para uso terapéutico, el ensayo de elección es uno aceptado por una agencia reguladora a la cual deben someterse los datos sobre seguridad y eficiencia de la proteína. Una proteína que tiene más del 10% de la actividad específica máxima conocida es "biológicamente activa" para los propósitos de la invención. "Desnaturalizada," como se aplica una proteína en el presente contexto, significa que la estructura nativa secundaria y terciaria está alterada hasta un grado en que la proteína no tiene actividad biológica. "Desgasificación" se define como la remoción de gases disueltos en las soluciones utilizadas en la presente invención. El gas es mucho más soluble en líquidos a una elevada presión en comparación con la presión atmosférica y, consecuentemente, cualquier gas que ocupe la parte superior en una muestra será dirigido hacia la solución después de la presurización. Las consecuencias son dobles: el oxígeno adicional en solución puede degradar químicamente el producto de proteína, y la solución sin gas después de la despresurización puede ocasionar agregación adicional. Por lo tanto, las muestras deben prepararse con soluciones desgasificadas y todos los gases que ocupen la parte superior deben llenarse con líquido antes de la presurización. "Despresurización" es un proceso para disminuir la presión, a partir de una alta presión, a una presión más baja (usualmente una presión atmosférica o presión ambiental). La despresurización toma lugar durante un periodo de tiempo predeterminado, que tiene un intervalo de 10 segundos a 10 horas, y puede ser interrumpido en uno o más puntos para permitir el replegamiento óptimo a niveles intermedios de presión (pero aún incrementados en comparación con la presión ambiental). La despresurización o las interrupciones pueden ser de 1 segundo, 2 segundos, 5 segundos, 10 segundos, 20 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 2 horas, 3 horas, 4 horas, y 5 horas. Proteínas "heterólogas" son proteínas que normalmente no se producen por una célula hospedera particular. La tecnología de ADN recombinante ha permitido la expresión de cantidades relativamente grandes de proteínas heterólogas (por ejemplo, hormona del crecimiento) a partir de células hospederas transformadas tales como E. coli. Estas proteínas frecuentemente se secuestran en cuerpos de inclusión insolubles en el citoplasma y/o periplasma de la célula hospedera. Los cuerpos de inclusión o agregados citoplásmicos contienen, al menos en parte, la proteína heteróloga a ser recuperada. Estos agregados frecuentemente aparecen como puntos luminosos bajo un microscopio de contraste de fases. "Alta presión," para los propósitos de la disociación de los agregados de proteína, significa de aproximadamente 0.25 kbar a aproximadamente 12 kbar. Las presiones específicamente contempladas dentro de éste intervalo son 0.30 kbar, 0.35 kbar, 0.40 kbar, 0.50 kbar, 0.55 kbar, 0.60 kbar, 0.65 kbar, 0.70 kbar, 0.75 kbar, 0.80 kbar, 0.85 kbar, 0.90 kbar, 0.95 kbar, 1.0 kbar, 1.1 kbar, 1.2 kbar, 1.3 kbar, 1.4 kbar, 1.5 kbar, 1.6 kbar, 1.7 kbar, 1.8 kbar, 1.9 kbar, 2.0 kbar, 2.1 kbar, 2.2 kbar, 2.3 kbar, 2.4 kbar, 2.5 kbar, 2.6 kbar, 2.7 kbar, 2.8 kbar, 2.9 kbar, 3.0 kbar, 3.1 kbar, 3.2 kbar, 3.3 kbar, 3.4 kbar, 3.5 kbar, 3.6 kbar, 3.7 kbar, 3.8 kbar, 3.9 kbar, 4.0 kbar, 4.1 kbar, 4.2 kbar, 4.3 kbar, 4.4 kbar, 4.5 kbar, 4.6 kbar, 4.7 kbar, 4.8 kbar, 4.9 kbar, 5.0 kbar, 5.1 kbar, 5.2 kbar, 5.3 kbar, 5.4 kbar, 5.5 kbar, 5.6 kbar, 5.7 kbar, 5.8 kbar, 5.9 kbar, 6.0 kbar, 6.1 kbar, 6.2 kbar, 6.3 kbar, 6.4 kbar, 6.5 kbar, 6.6 kbar, 6.7 kbar, 6.8 kbar, 6.9 kbar, 7.0 kbar, 7.1 kbar, 7.2 kbar, 7.3 kbar, 7.4 kbar, 7.5 kbar, 7.6 kbar, 7.7 kbar, 7.8 kbar, 7.9 kbar, 8.0 kbar, 8.1 kbar, 8.2 kbar, 8.3 kbar, 8.4 kbar, 8.5 kbar, 8.6 kbar, 8.7 kbar, 8.8 kbar, 8.9 kbar, 9.0 kbar, 9.1 kbar, 9.2 kbar, 9.3 kbar, 9.4 kbar, 9.5 kbar, 9.6 kbar, 9.7 kbar, 9.8 kbar, 9.9 kbar, 10.0 kbar, 10.1 kbar, 10.2 kbar, 10.3 kbar, 10.4 kbar, 10.5 kbar, 10.6 kbar, 10.7 kbar, 10.8 kbar, 10.9 kbar, 11.0 kbar, 11.1 kbar, 1 1.2 kbar, 1 1.3 kbar, 1.4 kbar, 11.5 kbar, 1 1.6 kbar, 11.7 kbar, 11.8 kbar, 1 1.9 kbar, y 12.0 kbar. "Alta presión" para el propósito de los pasos de replegamiento, significa de aproximadamente 0.25 a aproximadamente 3.3 kbar. Las presiones específicamente contempladas dentro de este intervalo son 0.30 kbar, 0.35 kbar, 0.40 kbar, 0.50 kbar, 0.55 kbar, 0.60 kbar, 0.65 kbar, 0.70 kbar, 0.75 kbar, 0.80 kbar, 0.85 kbar, 0.90 kbar, 0.95 kbar, 1 .0 kbar, 1 .1 kbar, 1.2 kbar, 1.3 kbar, 1.4 kbar, 1.5 kbar, 1.6 kbar, 1.7 kbar, 1.8 kbar, 1.9 kbar, 2.0 kbar, 2.1 kbar, 2.2 kbar, 2.3 kbar, 2.4 kbar, 2.5 kbar, 2.6 kbar, 2.7 kbar, 2.8 kbar, 2.9 kbar, 3.0 kbar, 3.1 kbar, 3.2 kbar, 3.3 kbar.

Una "célula hospedera" es una célula microbiana tal como una bacteria, una levadura u otra célula adecuada incluyendo célula animal o una célula vegetal la cual ha sido transformada para expresar la proteína heteróloga de interés. Las células hospederas que están contempladas por la presente invención incluyen aquellas en las que la proteína heteróloga expresada por la célula está secuestrada en cuerpos refractarios. Una célula hospedera ejemplar es E. coli K12, cepa W3110G (pBGHI), la cual ha sido transformada para afectar la expresión de la proteína heteróloga deseada. La "conformación activa" de una proteína, en el presente contexto, se refiere a las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria de una proteína como ésta ocurre en la naturaleza en su estado completamente activo. "Presurización" es un proceso para incrementar la presión (usualmente a partir de la presión atmosférica o presión ambiental) a una 'presión más alta. La despresurización toma lugar durante un periodo de tiempo predeterminado, que tiene un intervalo de 0.1 segundos a 10 horas. Dichos tiempos incluyen 1 segundo, 2 segundos, 5 segundos, 10 segundos, 20 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 2 horas, 3 horas, 4 horas, y 5 horas. Las "proteínas" incluyen una amplia variedad de moléculas que contienen péptidos, incluyendo proteínas monoméricas, diméricas, multiméricas, heterodiméricas, heterotriméricas, y heterotetraméricas; proteínas con puentes disulfuro; proteínas glucosiladas; proteínas helicoidales; proteínas que contienen láminas a y ß. Las proteínas particulares incluyen hormonas, anticuerpos, enzimas, y proteínas de unión a metal. "Replegamiento," "renaturalización," o "naturalización," en el presente contexto, significa los procesos mediante los cuales una proteína completamente o parcialmente desnaturalizada adopta una estructura secundaria, terciaria y cuaternaria similar a la de la molécula nativa cognada. Una proteína adecuadamente replegada tiene actividad biológica que es süstancialmente la de la molécula no desnaturalizada. Cuando la proteína nativa tiene enlaces disulfuro, la oxidación para formar enlaces disulfuro intramoleculares es un componente deseado del proceso de replegamiento. Un "agente tensioactivo" es un compuesto activo de superficie el cual reduce la tensión superficial del agua.

III. Reactivos y procedimientos A. Agentes caotrópicos Un agente caotrópico es un compuesto, incluyendo, sin limitación, hidrocloruro de guanidina (hidrocloruro de guanidina, GdmHCI), sulfato de guanidina, urea, tiocianato de sodio, sarcosil, dodecilsulfato de sodio, octilsulfato de sodio y/o otros compuestos que alteran los enlaces intermoleculares no covalentes dentro de la proteína, permitiendo que la cadena polipeptídica asuma una conformación süstancialmente aleatoria.

Los agentes caotrópicos, cuando se emplean, se utilizan a concentraciones "bajas". Dichos concentraciones bajas son de 0 a aproximadamente 4.5 M. Incluyendo las concentraciones particulares de 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.75 M, 1.0 M, 1.25 M, 1.5 M, 1.75 M, 2.0 M, 2.25 M, 2.5 M, 3.0 M, 3.5 M, 4.0 M, y 4.5 M.

B. Agentes de reducción y de oxidación Un agente de reducción es capaz de transferir electrones y, al hacer esto, "reducir" los enlaces entre varios átomos. En el contexto de la presente invención, un agente reductor alterará las interacciones intra e ¡ntermoleculares, en particular, aquellas que implican puentes disulfuro. Los agentes reductores ejemplares, de conformidad con la presente invención, son ditiotreitol, glutationa, ditioeritritol, o ß- merca ptoetanol. Los agentes oxidantes pueden ser utilizados para neutralizar a los agentes reductores. Los agentes oxidantes incluyen glutationa oxidada, oxígeno molecular, aire, o peróxidos.

C. Agentes tensioactivos Los agentes tensioactivos son utilizados para mejorar la solubilidad de ciertas proteínas. Los agentes tensioactivos útiles incluyen agentes no iónicos (incluyendo, pero no limitados a, t-octilfenoxipolietoxi-etanol y polietilensorbitano), aniónicos (por ejemplo, dodeciisulfato de sodio) y catiónicos (por ejemplo, cloruro de cetilpiridinio) y agentes amfotéricos. Los agentes tensioactivos adecuados incluyen, pero no se limitan a deoxicolato, octiisulfato de sodio, tetradeciisulfato de sodio, éteres de polioxietileno, colato de sodio, octiltioglucopiranósido, n-octilglucopiranósido, bromuros de alquiltrimetilamonio, cloruros de alquiltrimetilamonio, y sodio bis (2-etilhexil)sulfosuccinato.

D. Agentes reguladores de pH Los agentes reguladores de pH están ventajosamente presentes en las mezclas para desagregación y/o replegamiento para mantener un valor de pH o un intervalo de pH deseado. Los sistemas de reguladores de pH inorgánicos (de fosfato, carbonato, entre otros) y sistemas de reguladores de pH orgánicos (de citrato, Tris, MOPS, MES, HEPES, entre otros) se conocen bien en la técnica.

E. Agentes estabilizantes Los agentes estabilizantes de proteína no específicos actúan para favorecer la conformación más compacta de una proteína. Dichos agentes incluyen, pero no se limitan a, sacarosa, trehalosa, glicerol, betaína, aminoácido(s), y óxido de trimetilamina.

F. Espectroscopia Otra técnica útil para optimizar las condiciones de replegamiento es la medición espectroscópica in situ de muestras bajo presión. Este es un procedimiento bien conocido para examinar la estabilidad en la proteína bajo presión, pero ha sido subutilizado en los estudios de agregación de proteína. Utilizando técnicas espectroscópicas de alta presión para observar agregados que se disuelven bajo presión ayudará a determinar los intervalos óptimos de presión para la recuperación de proteínas a partir de los agregados. Las células que se han habituado a la alta presión han sido utilizadas de manera rutinaria para estudios de desplegamiento a alta presión y pueden ser adaptadas para uso en la desagregación y replegamiento a alta presión.

IV. Metodologías habituales para replegamiento de proteína A continuación se describen varias tecnologías generalizadas de replegamiento de proteína que representan el "estado de la técnica": La patente de E.U.A. 5, 077, 392 (1991 ) describe un procedimiento para la activación de proteína recombinante producida en procariontes, en la que las proteínas agregadas se disuelven en hidrocloruro de guanidina 4-8 M o en urea 6-10 M. Una vez solubilizadas, el regulador de pH se dializa a un pH entre 1 y 4. Finalmente, la solución se diluye para proveer un ambiente no desnaturalizante y oxidante para permitir el replegamiento. La patente de E.U.A. 5, 593, 865 (1997) describe un procedimiento para activar proteínas eucariontes recombinantes que contienen enlaces disulfuro después de la expresión en hospederos procariontes. Las proteínas del cuerpo de inclusión se disuelven en un agente desnaturalizante fuerte (hidrocloruro de guanidina 6M) que contiene agentes reductores. En el paso de replegamiento, las proteínas se introducen dentro de un ambiente que es oxidante y no desnaturalizante. La patente de E.U.A. 4, 677, 196 (1987) también describe la purificación y producción de proteínas biológicamente activas a partir de cuerpos de inclusión insolubles. Este es un método general para la recuperación de proteínas a partir de una forma insoluble que incluye la disolución de los agregados de proteína en SDS. Una vez disuelta, la solución de proteína se separa a partir del SDS mediante cromatografía en columna. En la ausencia de SDS, la proteína se puede replegar. Finalmente, la proteína se eluye de la columna. La urea también ha sido incluida en soluciones de proteína disuelta. Después de la cromatografía de intercambio aniónico, la urea se remueve mediante diálisis a partir de la solución de proteína replegada. La patente de E.U.A 5, 605, 691 (1997) describe la solubilización de las proteínas del cuerpo de inclusión utilizando SDS y calor. Una vez en solución, las proteínas se repliegan mediante la disolución inicial del SDS y luego dializando el SDS a concentraciones no desnaturalizantes. La patente de E.U.A. 4, 659, 568 (1997) describe un procedimiento para la solubilización, purificación y caracterización de proteína a partir de agregados de proteína insoluble o complejos y composiciones de materia de las mismas. Los agregados de proteína insoluble o cuerpos de inclusión están depositados en la parte superior de un gradiente por etapas de urea (urea 3M a 7M). Puesto que las muestras son centrifugadas, los agregados se mueven a través del gradiente hasta que se disuelven. Este método provee un modo para determinar la concentración de urea a la cual se disuelve la proteína. La patente de E.U.A. 5, 728, 804 (1995) describe un procedimiento en el que las proteínas desnaturalizadas o agregadas están suspendidas en un medio acuoso libre de detergente que contiene hidrocloruro de guanidina 5-7 y se incuba durante la noche. Una vez suspendida, la muestra se pone en contacto con suficiente ciclodextrina para ayudar al - replegamiento de las proteínas. Finalmente, la ciclodextrina se remueve mediante diálisis. Las siguientes son patentes que describen procedimientos desarrollados para el replegamiento de proteínas particulares: La patente de E.U.A. 4, 652, 630 (1987) describe un método para producir somatotropina activa. En este método, los agregados o cuerpos de inclusión se solubilizan en una caotropo (urea 3M a 5M), y el pH se ajusta para que permita la solubilización completa. Entonces las condiciones se modifican para permitir la oxidación en la presencia de una concentración no desnaturalizante de caotropo. La patente de E.U.A. 5, 064, 943 (1991 ) también describe un método para solubilizar y renaturalizar somatotropina, pero no requiere el uso de un caotropo. Aquí, el pH se ajusta a entre 11.5 y 12.5 y se mantiene por 5 a 12 horas. Bajo estas condiciones, la somatotropina se solubilizará y se re natural izará. La patente de E.U.A. 5, 023, 323 (1991 ) describe un procedimiento para naturalización de agregados de somatotropina (hormona del crecimiento) en el que los agregados se disuelven en un caotropo desnaturalizante (urea 1M a 8M). El paso de solubilización es seguido por la exposición de la muestra a un ambiente oxidante en la presencia de una concentración no desnaturalizante de caotropo. La patente de E.U.A. 5, 109, 117 (1992) describe un método en el que los agregados de somatotropina se disuelven en la presencia de un alcohol orgánico y caotropo (urea 1M a 8M). Luego las proteínas solubilizadas se renaturalizan en un ambiente oxidante, no desnaturalizante. La patente de E.U.A. 5, 714, 371 (1998) provee un método para replegar agregados de proteasa de virus de hepatitis C. Los agregados se soiubilizan en hidrocloruro de guanidina 5M. Segundo, un agente reductor se añade a la solución, y el pH se ajusta para proveer un pH ácido. Tercero, el agente desnaturalizante se remueve a partir de la solución mediante diálisis, y finalmente el pH se eleva a su punto inicial. La patente de E.U.A. 4, 923, 967 (1990) describe un procedimiento específico para interleucina-2 de humano. Los agregados de proteína se disuelven en hidrocloruro de guanidina 4-8 M con un agente sulfitolizante. Una vez que las proteínas están disueltas, el agente sulfitolizante se remueve mediante intercambio de solvente. Finalmente, la temperatura se eleva para precipitar la interleucina-2 en forma pura. Para permitir el replegamiento, los precipitados se disuelven de nuevo en hidrocíoruro de guanidina más un agente reductor. Finalmente, la solución se diluye para replegar a las proteínas. La patente de E.U.A. 5, 162, 507 (1992) describe un procedimiento para recuperación de interleucina-2 recombinante purificada, oxidada, renaturalizada a partir de microorganismos. La interleucina-2 insoluble aislada a partir de microorganismos se solubiliza en hidrocíoruro de guanidina 2 a 4 . La solución de hidrocíoruro de guanidina se diluye entonces hasta que las proteínas se precipitan de la solución. Los precipitados se redisuelven luego en una solución de hidrocíoruro de guanidina. Las proteínas se oxidan para formar de nuevo los enlaces disulfuro nativos. Finalmente, la solución se diluye y la interleucina-2 permanece en solución. La patente de E.U.A. 4, 985, 544 (1991) describe un procedimiento para renaturalizar la hormona de crecimiento de pez. En este procedimiento, los agregados o cuerpos de inclusión se disuelven utilizando guanidina, urea, SDS, ácido o álcali. El agente reductor se remueve entonces, y se añade un agente oxidante. Finalmente, el agente desnaturalizante se remueve para permitir el replegamiento. La patente de E.U.A. 5, 410, 026 (1995) describe un método en el que el factor de crecimiento -1 semejante a insulina (IGF- ) plegado de manera errónea, insoluble se repliega hacia una conformación activa. Una vez que el IGF-1 está aislado, éste se incuba con urea 1-3M o hidrocloruro de guanidina 1 M hasta que los agregados están solubilizados y replegados. Otras Patentes de E.U.A que se refieren al replegamiento de proteína incluyen las Patente de E.U.A 5, 708, 148; 4, 929, 700 y 4, 766, 224.

V. Agitación Los estudios previos han demostrado que la agitación de proteínas puede resultar en la agregación y precipitación. Bam et al. (1998). Sin embargo, los efectos generales de la transferencia de masa han sido ignorados por mucho tiempo en el replegamiento de proteínas. Los presentes inventores han encontrado, sorprendentemente, que la mezcla o "agitación" física (agitación, vibración, rotación, etc.) incrementa tanto la velocidad como el grado de replegamiento de la proteína. Por lo tanto, de conformidad con la presente invención, la agitación de proteínas puede emplearse para ayudar o mejorar el replegamiento de proteínas bajo presión. La agitación se puede aplicar a los agregados de precipitados de proteínas suspendidas en un medio acuoso bajo alta presión. Optimamente, dicha agitación será aplicada a intensidades de tal manera que los agregados de proteína precipitada se dispersan uniformemente en toda la solución acuosa, pero por debajo de los niveles en donde se favorece la agregación inducida por agitación. Dicha agitación debe ser aplicada como sea necesaria para mantener la dispersión hasta dicho momento en que la proteína se desagregue. La agitación se puede lograr utilizando ultrasonido o mediante bombeo a través de dispositivos de mezclado estáticos.

VI. replegamiento con temperatura elevada A pesar de que las temperaturas incrementadas frecuentemente se utilizan para ocasionar agregación de proteínas, los presentes inventores han determinado que las temperaturas incrementadas pueden mejorar la recuperación por replegamiento efectuada por el tratamiento con alta presión, con la condición de que la temperatura no sea tan alta que ocasione desnaturalización irreversible. Generalmente, la temperatura incrementada para replegamiento debe ser de aproximadamente 20°C inferior que la temperatura a la cual ocurre la pérdida de actividad irreversible. Temperaturas relativamente altas (por ejemplo, de aproximadamente 60°C a aproximadamente 125°C, de aproximadamente 80°C a aproximadamente 110°C, incluyendo de aproximadamente 100°C, aproximadamente 105°C, aproximadamente 1 10°C, aproximadamente 1 15°C, aproximadamente 120°C y aproximadamente 125°C) pueden ser utilizadas mientras que la solución está bajo presión, siempre y cuando la temperatura esté reducida a una temperatura adecuadamente baja antes de la despresurización. Dicha temperatura adecuadamente baja se define como una por debajo de la cual ocurre la desnaturalización inducida térmicamente o agregación a condiciones atmosféricas.

VII. Diálisis y dilución bajo presión El replegamiento de proteína bajo presión parece ser independiente de la concentración de proteína. Esto es sorprendente dado que se sabe que una concentración elevada de proteína induce la agregación de proteína. Sin embargo, aunque es posible obtener proteína desagregada, adecuadamente replegada a concentraciones elevadas, la remoción de la presión a la proteína mientras aún está a concentraciones elevadas puede resultar en re-agregación. Por el mismo motivo, la realización de todos los pasos de presurización bajo una baja concentración incrementa grandemente el volumen del material que debe ser procesado, y por lo tanto incrementa el factor tiempo. Alternativamente, el escalamiento de la maquinaria para el manejo de volúmenes mayores incrementará la velocidad. Sin embargo, el costo del escalamiento de los aspectos presurizados de la maquinaria es prohibitivo. Por lo tanto, los presentes inventores proponen llevar a cabo la desagregación y los experimentos de replegamiento bajo concentraciones elevadas de proteína. A concentraciones "altas", dependiendo de la proteína en cuestión, pueden tener un intervalo de 1 mg/ml a 100 mg/ml. Seguido por desagregación, y ya sea durante o después del replegamiento, la proteína se diluye a una concentración adecuada para almacenamiento de 0.1 mg/ml a 10 mg/ml, preferiblemente 1 mg/ml. Esta concentración se ajusta utilizando varias de las soluciones de regulación de pH discutidas anteriormente.

Además, la diálisis y dilución bajo presión permite los cambios en el ambiente químico que rodea las proteínas mientras están bajo presión, por ejemplo, con agente reductores. La diálisis puede ser llevada a cabo en un modo de lote, en donde las soluciones de proteína están colocadas en un lado de la membrana para diálisis, y los químicos se dejan difundir a través durante el tiempo. Sin embargo, las proteínas son demasiado grandes para difundir a través de la membrana utilizada. En contraste, la dilución podría requerir una inyección o mezclado de dos soluciones mientras está bajo presión, creando un cambio más repentino en las condiciones químicas. Además, uno podría desear cambiar el pH de las soluciones que se van a utilizar en los procedimientos de replegamiento. Por ejemplo, las velocidades de intercambio de disulfuro en la presencia de agentes redox típicamente son superiores al pH 10-11 , mientras que la estabilidad estructural secundaria de las proteínas típicamente es mayor a pH's inferiores. Por lo tanto, además de permitir la remoción de agentes redox, la diálisis bajo presión permite un cambio concomitante en el pH.

VIII. Despresurización "en etapas" En otro aspecto de la presente invención, los solicitantes proveen despresurización "en etapas". Este procedimiento comprende la caída de la presión, de la presión más alta utilizada a al menos un nivel secundario que es intermedio entre el nivel más alto y la presión ambiental. El objetivo es proveer un periodo de incubación en o aproximadamente en esta zona de presión intermedia que permite que una proteína adopte una conformación deseada. En una modalidad, la presente invención contempla solamente una incubación de presión intermedia que yace de alguna manera entre la presión más elevada y la presión ambiental. Alternativamente, hay un intervalo de presión particular que puede ser adecuado como etapas de presión "intermedias", incluyendo pero no limitadas de aproximadamente 50 MPa -500 MPa, de aproximadamente 100 MPa - 400 MPa, y de aproximadamente 200 MPa- 300 MPa. Los niveles particulares para presurización intermedia incluyen de aproximadamente 100 MPa, de aproximadamente 150 MPa, de aproximadamente 200 MPa, de aproximadamente 250 MPa, de aproximadamente 300 MPa, de aproximadamente 350 MPa, de aproximadamente 400 MPa, de aproximadamente 450 MPa y de aproximadamente 500 MPa. La única limitación es que, cuando se utilizan, las presiones precedentes deben ser más bajas que el primer nivel o el nivel más alto de presurización. El tiempo empleado para las etapas de despresurización intermedias incluyen periodos de incubación de 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 1 1 horas y 12 horas.

IX. Procesamiento en lote contra procesamiento continuo Mecánicamente, hay dos métodos principales para procesamiento de alta presión: en lote y continuo. El procesamiento en lote simplemente implica el llenado de una cámara específica, presurizado de la cámara por un periodo de tiempo, y despresurizado del lote. En contraste, el procedimiento continuo constantemente adiciona agregados dentro de una cámara a presión y las proteínas solubles, replegadas se mueven fuera de la cámara de presión. En ambas configuraciones, es esencial una buena temperatura y control de presión, puesto que las fluctuaciones en estos parámetros pueden ocasionar inconsistencias en los rendimientos. Tanto la temperatura como la presión deben medirse dentro de la cámara de presión y controlarse adecuadamente.

Muestras en lote Hay muchos métodos para manejar muestras en lote dependiendo de los datos de estabilidad específicos de cada proteína. Las soluciones de proteína puede cargarse directamente dentro de una cámara a presión, en cuyo caso se puede utilizar un regulador de pH para replegamiento a presión media. Alternativamente, las muestras se pueden cargar dentro de una variedad de contenedores sellados, flexibles. Esto permite una mayor flexibilidad en la presión media, así como a las superficies a las que la proteína está expuesta. Las vasijas para muestras pueden actuar incluso de manera concebible para proteger a las proteínas de interés de la degradación química (por ejemplo, están disponibles plásticos eliminadores de oxígeno).

Procesamiento continuo Con el procedimiento continuo, el escalamiento es simple.

Volúmenes pequeños bajo presión se pueden utilizar para replegar volúmenes grandes de soluciones de proteína. Además, utilizando un filtro apropiado en la salida de un procedimiento continuo se liberarán de manera selectiva proteínas replegadas adecuadamente a partir de la cámara mientras que se retienen tanto los agregados solubles como los insolubles.

X. Proteínas multiméricas Muchas proteínas que tienen usos potenciales en las terapias para enfermedad de humano, aplicaciones profilácticas, y aplicaciones diagnósticas están compuestas de múltiples cadenas de proteína. La producción de estas proteínas mediante técnicas recombinantes requiere que las cadenas apropiadas se ensamblen para formar la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria nativa. Las cadenas asociadas de manera inadecuada o no asociadas son particularmente propensas a formar agregados no nativos y precipitados. En un ejemplo, estos agregados no nativos pueden suspenderse en una formulación adecuada en un contenedor de muestra, colocado en una vasija de alta presión comercialmente disponible tales como aquellos comercialmente disponibles a partir de the Flow International Corp. o High Pressure Equipment Co., y se presurizan para desagregar la proteína y promover el replegamiento y ensamblaje de la estructura nativa. En otro ejemplo, las cadenas individuales pueden ser sintetizadas separadamente a través de técnicas recombinantes bien conocidas. Las soluciones purificadas o semi-purificadas de cadenas individuales pueden combinarse en un contenedor de muestra en una formulación adecuada, y colocarse en la vasija de alta presión anteriormente mencionada, y presurizarse para afectar el replegamiento y ensamblaje de la proteína multimérica nativa. En modalidades particulares, la invención se provee para el replegamiento de proteínas multiméricas, tales como dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros, hexámeros, septámeros, octámeros, nonámeros, etcétera. Las subunidades polipeptídicas pueden ser idénticas (homodímeros, etc.) o una u más pueden diferir dentro de la proteína nativa (heterodímeros, etc.). En un ejemplo específico discutido a continuación, la proteína es ¡nterferón- ? de humano producido de manera recombinante, el cual es un homodímero.

A. Interferón El rhlFN-? forma agregados de morfología completamente diferente cuando se expone a temperaturas justo por debajo del inicio de la transición térmica en comparación con los agregados formados mediante la exposición a concentraciones moderadas de hidrocloruro de guanidina. Los agregados de rhlFN-? inducidos térmicamente son de estructura fibrosa, mientras que los agregados inducidos por hidrocloruro de guanidina forman un precipitado amorfo. Las estructuras secundarias y tercianas de los agregados, que son distintos a partir del estado nativo, son independientes de la morfología del agregado. La presión es efectiva en la disolución tanto de los agregados fibrosos como amorfos del rhIFN-y y en la recuperación de la estructura nativa, como se mide mediante la derivada secundaria de UV y FTIR. La velocidad de disolución de los agregados amorfos es rápida y la adquisición del estado disociado mediante presión se logra dentro de los primeros 30 minutos a 250 MPa. La adquisición del estado disociado mediante presión a partir de agregados inducidos térmicamente es aproximadamente cuatro veces más lento que el de los agregados amorfos. Sin embargo, una vez que se logra el estado disociado mediante la presión, la velocidad y el grado de recuperación del estado nativo (por ejemplo, velocidad de replegamiento y rendimiento), como se mide mediante la segunda derivada de UV, es independiente de la forma del agregado inicial. El grado de replegamiento a 100 MPa por 1.5 horas fue dependiente de la concentración de proteína durante el replegamiento, con la recuperación de la estructura similar a la nativa incrementando con la concentración de proteína deseada. Para las muestras diluidas a 1 mg/mL después del protocolo de replegamiento, el grado de replegamiento fue independiente de la concentración de proteína durante el replegamiento. Las diferencias en la dependencia de la concentración de proteína se atribuyen a una población significativa de monómero remanente en las muestras de concentración elevada de proteína después de la despresurización. La dilución rápida de las muestras con alta concentración de proteína a 1 mg/mL siguiendo al protocolo de replegamiento resultaron en condiciones favorables al replegamiento sobre la agregación, lo cual procede vía el monómero. Como tal, la adquisición del dímero es esencialmente completa y no se ve afectada por la concentración de proteína durante el replegamiento. Las deficiencias para diluir las muestras con alta concentración de proteína después del tratamiento a presión resulta en condiciones que favorecen la agregación durante el replegamiento y la concentración elevada de monómeros lleva a una agregación significativa. El equilibrio de la reacción de rhlFN-? mediante la presión hasta de 250 MPa puede ser seguida por la segunda derivada UV de espectroscopia. Este equilibrio de la reacción es dependiente de la concentración y por lo tanto es dependiente de la disociación del dímero nativo. La disociación tiene un AV igual a -209 +/- 13 mL/moles de dímero, lo cual es independiente de las concentraciones de proteína y de sacarosa. La sacarosa estabiliza la disociación en contra del rhlFN-?, mediante la exclusión preferencial en la superficie de la proteína, por el cambio de equilibrio hacia el estado nativo más compacto. El cambio de área de superficie de la disociación se midió como el 12.7 +/- 1.6 nm2/molécula de dímero, lo cual representa un incremento de cerca del 30% en el área de superficie expuesta al solvente sobre el dímero nativo. Una ecuación comprensible se desarrolló a partir de los datos experimentales que pronostican el AGdiss de rhlFN-? como una función de la presión, y de las concentraciones de sacarosa y de proteína. Utilizando criterios similares al equilibrio de disociación, la segunda derivada de espectroscopia UV se puede utilizar para seguir la velocidad de agregación del rhlFN-?. Sin embargo, debido a que se utilizan criterios similares, las condiciones de la solución debe elegirse de manera que la disociación significativa no ocurra de manera coincidente con la agregación. Los inventores han mostrado que la Ea para la agregación inducida por hidrocloruro de guanidina de primer orden se midió como del 130 +/- 30 kJ/moles de dímero, lo cual es significativamente diferente de la Ea de los procedimientos de agregación inducidos térmicamente de segundo orden. La disparidad en las energías de activación para las reacciones de agregación inducidas por las diferentes tensiones es la confirmación de que las cinéticas de agregación para la agregación inducida por hidrocloruro de guanidina son dominantes por la disociación N a 2M. Como se reportó previamente (Kendrick et al., 1998a), la sacarosa reduce la velocidad de agregación del rhlFN-? en la presencia del hidrocloruro de guanidina mediante la exclusión preferencial de la sacarosa a partir de la superficie de la proteína, cambiando el equilibrio hacia el estado nativo compacto, N, y lejos del estado de transición expandida, N*. Sin embargo, la presión desestabiliza al rhlFN-? hacia la agregación por hidrocloruro de guanidina mediante la solvatación incrementada de la proteína. La solvatación incrementada incrementa el área de superficie expuesta de la proteína, cambiando el equilibrio lejos de N y hacia N* y, de esta manera, contrarresta el efecto estabilizante de la sacarosa. El cambio en el área de superficie expuesta y el cambio en el volumen molar parcial entre la N* expandida y N se encontró que es de 3.5 +/- 0.2 nm2/molécula y -39 +/- 9 mL/moles del dímero, respectivamente. Por lo tanto, la perturbación requerida para la formación de las especies del estado de transición, que lleva a la formación del monómero competente para agregado, es pequeña en comparación con la diferencia entre los estados nativos y disociados.

B. Otros multímeros Ejemplos de otras proteínas multiméricas que pueden ser replegadas de conformidad con la presente invención incluyen hemoglobina, ácido láctico deshidrogenasa, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos.

XI. Ejemplos Los siguientes ejemplos se Incluyen para demostrar las modalidades preferidas de la invención. Debe apreciarse por aquellos expertos en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos a continuación representan técnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la práctica de la invención, y por lo tanto pueden ser consideradas para constituir modos preferidos para esta práctica. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica deben, a la luz de la presente descripción, apreciar que muchos cambios pueden elaborarse en las modalidades específicas que se describen y aún así obtener un resultado similar o parecido sin apartarse el espíritu y alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Desagregación con alta presión v repleqamiento Procedimiento 1 : Desagregación de proteína con alta presión v replegamiento a temperatura variable.

Agregación de proteína La hormona de crecimiento recombinante de humano (rhGH) se suspendió en regulador de pH de citrato de sodio 10 mM (pH 6.0, EDTA 1 mM, azida de sodio al 0.1 %) a una concentración de 1.5 mg/ml. 10 mL de solución de rhGH se revolvió de nuevo en un tubo falcon cónico de 15 mi a 8 rpm por al menos 24 horas. Los agregados mostraron un daño estructural mayor cuando se revolvieron bajo condiciones idénticas con la adición de hidrocloruro de guanidina 0.75 M en el regulador de pH de citrato.

Preparación de la muestra Una mitad del volumen requerido se centrifugó a 13,000 g por 15 minutos para sedimentar los agregados ¡nsolubles. El sobrenadante se decantó y se reemplazó con el volumen final del regulador de pH (regulador de pH de citrato de sodio 10 mM, pH 6.0, EDTA 1 mM, azida de sodio al 0.1 %). El concentrado agregado se resuspendió con un sonicador marca Ultrasonics (50% de rendimiento, pulso de ciclo de 1 segundo). Una vez resuspendidas, las muestras se colocaron en jeringas de 1 mi (extremo sellado mediante calor y émbolo en su lugar para remover todo el espacio de aire en la parte superior).

Presurización y análisis Después de que la temperatura se había equilibrado, las muestras se colocaron dentro de la cámara a presión. La presión se incrementó a 2 kbar por 24 horas. Las muestras a presión atmosférica se colocaron a una temperatura idéntica. La presión se liberó suavemente y se hizo homogénea durante 15 minutos. Después de la despresurización, las muestras se centrifugaron a 13,000 g por 15 minutos. El sobrenadante se analizó para proteína soluble mediante absorbencia a 278 nm. Los componentes que dispersan la luz se sustrajeron utilizando el método descrito por Leach y Scheraga (1960). El coeficiente de extinción para rhGH es de 18, 890 (cm mol/I)"1.

Resultados de la de desagregación de proteína mediante alta presión y repleqamiento con temperatura variable En la ausencia de guanidinio, los rendimientos de la hormona de crecimiento de humano replegada después del tratamiento con presión se incrementó con incrementos en la temperatura, alcanzando aproximadamente 100% a una temperatura de 60%. La exposición a temperaturas similares sin tratamiento con alta presión no resultó en mejorías significativas en el rendimiento de proteínas nativas, plegadas.

Procedimiento 2: replegamiento de agregados utilizando diálisis a alta presión Agregación de proteína y preparación de la muestra La lisozima de la clara de huevo de gallina (40 mg/ml) a partir de Sigma Chemical Co. fue desnaturalizada y reducida en hidrocloruro de guanidina 8M (GdmHCI), DTT 40 mM por una hora. La solución de proteína se diluyó 20 veces en montón con regulador de pH de Tris-HCI 50 mM (pH 8.0, EDTA 1 mM) para inducir la agregación. Las muestras se diluyeron entonces dos veces de manera adicional con regulador de pH de Tris-HCI (pH 8.0 + GdmHCI + DTT) para crear la solución de replegamiento final que se colocó dentro del tubo para diálisis (1 mg/mL de lisozima en regulador de pH de Tris-HCI 50 mM pH 8.0, GdmHCI 0.8 M, DTT 100 mM). La muestra se inyectó entonces dentro de los tubos para diálisis (límite de peso molecular de 3500, empapados durante la noche en regulador de pH de Tris-HCI, pH 8.0). Justo antes de la presurización, los tubos para diálisis se colocaron en un exceso de volumen de 25 veces del regulador de pH de Tris-HCI (pH 8.0, GdmHCI 0.8 M, glutationa oxidada 3 mM) y se sellaron para presurización.

Presurización y análisis Tan rápidamente como fue posible después de la inserción de los tubos para diálisis dentro del regulador de pH para intercambio, las muestras se presurizaron a 2 kbar. La presión se mantuvo por 5 días. Las muestras se despresurizaron suavemente durante 15 minutos. Una vez a la temperatura atmosférica, las muestras se centrifugaron por 15 minutos a 13,000 g para sedimentar los agregados insolubles. El sobrenadante se analizó para actividad enzimática como se describió previamente (St. John et al., 1999).

EJEMPLO 2 Replegamiento con alta presión de agregados fibrosos y amorfos de rhlFN^y Materiales y métodos El ADN recombinante purificado derivado a partir de rhlFN-? en succinato de sodio 5 mM, pH 5.0 (regulador de pH de succinato) se proveyó por Genentech Inc., se almacenó a 4°C hasta su uso y se utilizó sin purificación adicional. Se utilizó acetato de piridina 40 mM, regulador de pH 5.0 (regulador de pH PyrAc) para el análisis de movilidad de masa electroforética en fase gaseosa (GEMMA). El regulador de pH de succinato se utilizó en todos los demás experimentos. Los estándares de proteína (albúmina de suero de bovino, glucosa oxidasa, hemoglobina, ubiquitina y tiroglobulina) se obtuvieron a partir de Sigma. Todos los químicos fueron de grado reactivo o de grado superior y se obtuvieron a partir de Sigma también.

Preparación del agregado Los agregados se prepararon mediante la inducción de agregación ya sea por la elevación de la temperatura de la solución a 40°C o mediante la adición de hidrocloruro de guanidina a la solución de proteína, de tal manera que la concentración final de hidrocloruro de guanidina fue de 0.45 M. Los alcances de las reacciones de agregación estuvieron en exceso de 95% en todos casos. Los inventores habían determinado el grado de reacciones a partir de las velocidades de agregación bien caracterizadas tanto para la agregación inducida térmicamente, y encontraron un segundo orden en la concentración de proteína; y para la reacción de agregación inducida por hidrocloruro de guanidina, un primer orden en la concentración de proteína. Los agregados inducidos por hidrocloruro de guanidina se lavaron con suficiente regulador de pH recientemente hecho de manera que la concentración final de solución de hidrocloruro de guanidina estuvo por debajo de 5 mM. Los agregados para los experimentos de replegamiento se suspendieron en regulador de pH recientemente hecho a concentraciones aproximadas de 1 , 10 y 20 mg/mL de rhlFN-?.

Experimentos a alta presión El equipo para alta presión utilizando para los experimentos de replegamiento consistió de un reactor para alta presión, una celda para espectroscopia UV a alta presión, un manómetro metálico (precisión a +/- 2 MPa) y un generador. El reactor a alta presión y la celda para espectroscopia UV a alta presión fueron diseñados y fabricados en el laboratorio de los inventores. El manómetro y el generador se obtuvieron a partir de High Pressure Equipment, Co, (Erie, PA). Para cualquier experimento dado, se empleó ya sea el reactor a alta presión o la celda para espectroscopia UV para alta presión. La celda para espectroscopia UV para alta presión se realizó de acero inoxidable 316, sellada con anillos O durometer Buna-N 90 y tuvo un diámetro de puerto óptico de 6 mm y una longitud de ruta de 7.65 mm. La celda utilizó ventanas de safiro cilindrico (16 mm de diámetro, 5.1 mm de grosor) y fue capaz de experimentos de hasta 250 MPa. La separación de la muestra a partir del fluido de transmisión de presión (aceite de silicón) se facilitó mediante un dispositivo de pistón externo a la celda. Todas las superficies de metal soldado fueron construidas de acero inoxidable 316. Todos los experimentos de UV a alta presión in situ se llevaron a cabo a una concentración de proteína de cerca de 1 mg/mL. Para los experimentos realizados en el reactor con alta presión, las suspensiones de agregado fueron cargadas dentro de bulbos de polipropileno de cerca de 1 mL, sellados con calor y cargados dentro del reactor. El reactor se selló y la presión se incrementó a 250 MPa, lo cual es una presión suficiente para asegurar que, en el equilibrio, rhlFN-? está completamente disociado en monómeros, como se determinó por los inventores. Las muestras se mantuvieron a 250 MPa por tiempo suficiente para disolver los agregados y para el equilibrio de la proteína, basándose en la segunda derivada de las mediciones UV in situ (véase a continuación). La presión se disminuyó entonces a 100 MPa y de nuevo se mantuvo por tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio para las concentraciones de rhlFN-? de cerca de 1 mg/mL (véase a continuación), después de lo cual la presión se redujo a 0.1 MPa y las muestras se removieron del reactor a alta presión.

Microscopía electrónica de transmisión (TEM) La TEM se llevó a cabo en muestras de agregados de rhlFN-? nativos, agregados de rhlFN-? agregados y agregados de rhlFN-? tratados con presión que habían sido negativamente teñidos con una solución al 2% de acetato de uranilo a una concentración total de proteína de cerca de 1 mg/mL. Los especímenes fueron teñidos en una rejillas de cobre formvar/carbono de malla 400 y fueron observados en un TEM JOEL 100CX con un voltaje acelerante de 80,000 kV. Las micrografías de las estructuras agregadas se obtuvieron a amplificaciones de 20,000 a 80,000.

Análisis de movilidad electroforética de masa en fase de gas (GEMMA) El procedimiento para el análisis de tamaño de partícula por GEMMA se basó en el método de Kaufman et al. (1996) (Kaufman et al., 1996). El instrumento se calibró utilizando estándares conocidos de peso molecular (PM) de proteína. Una curva de calibración lineal se desarrolló a partir del logaritmo natural de los diámetros de movilidad electroforética (EM) contra el logaritmo natural del PM. Las muestras de los agregados de rhlFN-? nativo, agregados de rhIFN- ? agregados y agregados de rhIFN- ? tratados con presión se diluyeron acerca de 1 a 2 µg/mL en regulador de pH PyrAc, el cual tiene una conductividad de cerca de 2 G?O"1 cm, y se analizaron inmediatamente utilizando un analizador GEMMA a partir de TSI (St. Paul, MN). El regulador de pH PyrAc se empleó debido al requerimiento de GEMMA de menos de 1 ppm de material no volátil en la muestra. El analizador GEMMA consistió de un modelo de generador de aerosol por electroaspersión modelo 3480, un analizador de movilidad diferencial (DMA) modelo 3085, un contador de partícula ultrafina por condensación (CPC) modelo 3025A. El aire secado y filtrado se administró a una velocidad de 1 Lpm a partir de la instalación del abastecimiento de aire a través de un filtrador/secador modelo 307402 y se administró dióxido de carbono grado instrumento a una velocidad de 0.05 a 0.1 Lpm. La capilaridad por electroaspersión de sílice fundido fue de 25 cm de largo y tuvo un diámetro interno de 25 µ??. El flujo de la muestra (cerca de 100 nL/min) se facilitó mediante una presión diferencial de 25 kPa (3.7 psi) a lo largo del capilar. Un potencial eléctrico de 2 kV se mantuvo a través del capilar, con una corriente correspondiente de 200 a 250 nA. La adquisición de los datos se realizó mediante un software de Aerosol Instrument Manager (AIM©) versión ß4.10 a partir de TSI en una PC compatible con IBM que maneja Windows 95© de Microsoft. El software para adquisición de datos utilizó 64 canales con espaciado logaritmo por decena de diámetro EM. El análisis de muestra se realizó a partir de cerca de 2.5 a 58 nm y los tiempos de adquisición a partir de 3 a 6 minutos, utilizando valores asumidos para viscosidad del aire (µ) de 1.82 x 10"5 kg/(m s), media de la ruta libre (?) de 7.75 x 10"8 m y densidad de proteína (s) de 1.2 g/ml_. Los archivos de datos, en unidades de concentración de masa porcentual, se exportaron como archivos de texto y se importaron dentro del programa Excel© de Microsoft. Los diámetros EM se determinaron mediante el máximo de un pico dado. Las relaciones de monómero a dímero y el alcance de la reacción (basado en el dímero de masa porcentual) fueron determinados por una integración finita de los picos individuales en las distribuciones de masa porcentual.

Dispersión dinámica de luz (DLS) Las mediciones de la dispersión dinámica de luz fueron llevadas a cabo en agregados de rhlFN-? inducidos térmicamente utilizando un medidor de partícula para Submicras Nicomp 370 (Partióle Sizing Systems, Santa Bárbara, CA). La concentración total de proteína fue de 1 mg/mL.

Espectroscopia UV derivativa Los espectros de absorción fueron medidos utilizando un espectrofotómetro de haz dual de Perkin- Elmer Lambda 3B a concentraciones de rhlFN-? de cerca de 1 mg/mL. Los barridos se midieron a partir de 310 nm a 250 nm con una velocidad del barrido de 15 nm por minuto. La adquisición de los datos se realizó mediante un tablero para adquisición de datos de National Instruments (Austin, TX) modelo AT-MIO-16E-10 a una velocidad de 5 muestras por segundo. El software de National Instruments LabView© se utilizó para el control de la adquisición de datos y Excel© de Microsoft para convertir la longitud de onda y los datos de absorción a partir de los volts a nm y unidades de absorbancia, respectivamente. Las segundas derivadas del espectro de absorción (d2A/d 2) fueron calculadas en el software Grams/386 (v. 3.02) (Galactic Industries) utilizando el método de Savitzky-Golay con un segundo orden polinomial corregido sobre +/- 2 nm. La temperatura se controló utilizando fluido recirculante con un termostato mediante un controlador para temperatura de baño recirculante de Lauda modelo M3. Los espectros para las muestras tratadas en el reactor a alta presión fueron recolectados a presión atmosférica con las muestras en las cubetas de cuarzo a longitud de ruta estándar de 10 mm y el blanco apropiado se colocó en la celda de referencia del espectrofotómetro. Para los experimentos llevados a cabo en la celda a alta presión, los espectros de absorción se recolectaron a partir de la muestra y del regulador de pH separadamente, sin muestra de referencia en el espectrofotómetro. La sustracción del espectro del regulador de pH, recolectado en la presión apropiada, a partir del espectro de proteína se llevó a cabo con el software Grams/386 (v. 3.02) antes del cálculo de la segunda derivada.

Espectroscopia IR transformada por Fourier (FTIR) Los espectros IR se recolectaron utilizando una celda de longitud de ruta ajustable a 8 µ??. Los espectros del regulador de pH blanco se recolectaron utilizando la misma celda bajo una condición de solución idéntica, sin proteína presente. Todos los espectros se recolectaron a presión atmosférica en un espectrómetro Nicolet Magna-IR© serie II (Madison, Wl) equipado con un detector DTGS. Los interferogramas fueron recolectados en el modo de un solo haz de señal promedio durante 256 (para las muestras a cerca de 20 mg/mL) y 1024 (para las muestras a cerca de 10 mg/mL) barridos a una resolución de 4 cm"1 utilizando el software Omnic© (v. 2.1 ) a partir de Nicolet. La mesa de trabajo óptico y la cámara de muestra se purgaron continuamente con aire seco abastecido a partir de un generador de gas para purga FTIR de Whatman modelo 75-52 (Haverhill, MA). El espectro de haz particular tanto de la proteína en el regulador de pH como del regulador de pH se procesaron de nuevo en el espectro de absorbancia mediante la sustracción del espectro de fondo a partir de cada uno. El software Nicolet se utilizó para sustraer las contribuciones del regulador de pH y del vapor de agua a partir del espectro de la proteína en regulador de pH y para calcular la segunda derivada. El espectro remanente fue corregido 7 puntos para remover el ruido de fondo del blanco y se importó dentro del software Grams/386© (Galactic Industries) en donde se corrigió para línea basal y el área se normalizó por el método de Dong et al., 1995.

Cromatografía por exclusión de tamaño (SEO La presencia de agregados solubles y del contenido de monómero/dímero de los agregados tratados con presión se midió mediante SEC y se comparó con el líquido control. Los agregados insolubles se removieron mediante centrifugación y el sobrenadante se ensayó mediante cromatografía por exclusión de tamaño (SEC). Alícuotas de 50 del sobrenadante, diluidas a 1 mg/mL en regulador de pH de succinato, fueron cargadas sobre una columna TSK-GEL G2000SWXL Tosohaas basada en sílice. La fase móvil, KCI 1.2 M, se bombeó a una velocidad de 0.8 mL/min y la absorbancia a 214 nm se monitoreó como una función del tiempo. Los cromatogramas resultantes fueron importados dentro del software Grams/386© (v. 3.02) en donde se les normalizó el área y se ajustó la curva para determinar las contribuciones porcentuales y tiempos de elución para el monómero y el dímero. La función de ajuste de curva Autofind se empleó con los parámetros establecidos para un máximo de dos picos, curva Gaussiana, sensibilidad media y línea basal de compensación. El instrumento se calibró utilizando estándares de proteína de PM conocido. Una curva de calibración lineal se desarrolló a partir del logaritmo natural del tiempo de elución contra el logaritmo natural del PM.

Resultados y discusión Caracterización de agregados: Caracterización física A las concentraciones de proteína superiores a 5 mg/mL, los agregados de rhlFN-? inducidos térmicamente formaron un gel incoloro, transparente con alta viscosidad que no pudo concentrarse mediante centrifugación. A las concentraciones de cerca de 1 mg/mL, la concentración de proteína fue suficientemente baja que el incremento de viscosidad después de la agregación fue mínimo y fue posible la separación mediante centrifugación. De manera similar a los agregados formados a concentraciones de proteína superiores, los agregados formados a concentraciones de cerca de 1 mg/mL fueron incoloros y dispersaron relativamente poco la luz. En contraste a los agregados formados por temperaturas altas, la adición de hidrocloruro de guanidina a las soluciones de rhlFN-? resultó en la formación de un precipitado blanco, opaco que fue fácilmente centrifugado a partir de la solución, sin importar la concentración de la proteína de agregación. Las micrografías electrónicas de los agregados revelaron que los agregados inducidos térmicamente formaron una matriz de hebras similares a fibras de longitud indeterminada (figura 2A), pero los agregados inducidos por hidrocloruro de guanidina formaron un precipitado amorfo (figura 2B). Las fibrillas agregadas inducidas térmicamente tienen un diámetro consistente en el orden de 10 nm. Las estructuras no amorfas se observaron en los agregados inducidos térmicamente. Contrariamente, no se encontraron estructuras fibrosas en las muestras de agregado inducido con hidrocloruro de guanidina. La distribución del diámetro EM de los agregados de rhlFN-? nativos y de los agregados inducidos térmicamente se midió mediante GEMMA y los resultados están presentes en la figura 3. La proteína nativa, equilibrada a 25°C y 1 mg/mL en regulador de pH PyrAc, se encontró que tiene dos picos significativos centrados a 4.4 y 5.5 nm (figura 3A). Los picos correspondieron a partículas que tienen pesos moleculares de 16 y 32 kD, respectivamente, basándose en la curva de calibración con los estándares de proteína conocidos. Los pesos moleculares están de acuerdo con los pesos moleculares conocidos del monómero y del dímero de rhlFN-? (16.45 y 32.9 kD, respectivamente). No se detectaron ningunos otros picos significativos en la muestra nativa y la concentración de la muestra se mantenía por debajo de cerca de 3 µg mL. El monómero porcentual de masa detectado por GEMMA (cerca de 12% en la figura 3A) ha sido determinado como artificialmente alto a partir de los experimentos de equilibrio de disociación. La tendencia hacia el monómero está ocasionada por la disociación inducida por la superficie del dímero nativo en la electroforesis capilar. La masa porcentual corregida del monómero a partir del rhlFN-? nativo, y los diámetros EM y los pesos moleculares efectivos para el monómero y para el dímero, como se determinan por GEMMA, están reportados en el cuadro 1A.

CUADRO 1A Comparación de los resultados GEMMA entre los agregados de rhlFN-? control nativo y los agregados de rhlFN^y tratados con presión CUADRO 1B Comparación de los resultados SEC entre los agregados de rhlFN^y control nativo y los agregados de rhlFN^y tratados con presión Control nativo Agregado tratado con presión Masa porcentual del monómero2 6.4 +/- .5% 4.2 +/- 1.5% Tiempo de elución del monómero 889 +/- 1 s 889 +/- 1 s Tiempo de elución del dímero 830 +/- 1 s 821 +/- 1 s PM efectivo del monómero4 16 kD 16 kD PM efectivo del dímero4 33 kD 35 kD * No se observó ningún efecto con el tipo de agregado o con la concentración para replegamiento. 1 Masa porcentual corregida del monómero calculada a partir de la constante de equilibrio medida. 5 2 Calculado para el ajuste de curva Gaussiana utilizando Gram/386© (v. 3.02) como se describió en el texto. 3 Curva de calibración presentada en otra parte. 4 Curva de calibración no mostrada. La muestra de agregado inducido térmicamente, agregado a í o 40°C y 21 mg/mL por 48 horas en regulador de pH con succinato, tuvo cerca de 1 y 4% por masa de monómero y de dímero, respectivamente. Los agregados (figura 3B), en exceso del 95% en masa, tuvieron un diámetro promedio de masa de 16.5 nm, correspondiendo a un PM promedio efectivo de 980 kD basándose en la curva de calibración con los estándares de 15 proteína conocidos. El diámetro efectivo a partir de GEMMA concordó escasamente con los resultados de DLS, lo cual indica un diámetro hidrodinámico efectivo de 1900 nm, y el hecho de que los agregados fueron visibles a simple vista. Es probable que, conforme las gotas se forman a la salida del capilar, los agregados fibrosos se dividen en agregados más 0 pequeños (Kaufman, 2000). Por lo tanto, se determinó que GEMMA no es una técnica apropiada para evaluar el tamaño de los agregados, pero es apropiada para detectar la presencia de agregados y determinar la masa porcentual del agregado. El diámetro de la partícula obtenida a partir de las mediciones con DLS se consideró poco exacto debido a la morfología de los agregados inducidos térmicamente y se utilizó solamente para comparación gruesa con los resultados GEMMA. Los agregados inducidos por hidrocloruro de guanidina no fueron analizados por GEMMA debido al requerimiento de menos de 1 ppm de material no volátil en la muestra.

Caracterización de agregados: Caracterización estructural La región entre 270 y 295 nm de la segunda derivada del espectro UV refleja los microambientes de lo residuos de triptofanos y tirosina y están afectados por el estado conformacional de las proteínas (Balestrieri et al., 1978; Ragone et al., 1984; Servillo et al., 1982). Puesto que la derivada del espectro UV de la tirosina y del triptofano son mínimamente afectadas por la presión (Lange et al., 1996), los cambios a la segunda derivada del espectro UV de rhlFN-? por la presión resultan partir de los cambios a la conformación nativa, como se muestra por los inventores en la presente invención. La segunda derivada del espectro UV de la proteína nativa, soluble, disociada por presión y del agregado inducido por hidrocloruro de guanidina y del agregado inducido térmicamente que se forma del rhlFN-? en regulador de pH de succinato de sodio 5 mM están presentados en el cuadro 4. La posición de la longitud de onda del extremo localizado cerca de 286 nm para las formas de rhlFN-? nativo y disociado es independiente del grado de disociación y se ha mostrado por los inventores su altura relativa la cual indica el grado de disociación del rhlFN-?. Por lo tanto, la altura relativa de este extremo también puede ser utilizada para seguir el grado de reasociación y replegamiento del rhlFN-? en la ausencia de agregados. El espectro de las dos formas agregadas (inducida térmicamente e inducida por hidrocloruro de guanidina) muestra desviaciones similares a partir de la segunda derivada del espectro UV nativo y son distintas tanto del espectro nativo como del espectro disociado con presión (figura 4). El espectro de agregado exhibe un disminución de la amplitud de la señal y un cambio hacia el azul en el espectro del absorbancia, ambos indicando una exposición incrementada a los ambientes hidrófilos de los residuos de triptofano y de tirosina relativos a la estructura nativa (Lange et al., 1996; Mach y Middaugh, 1994). Adicionalmente, ambos espectros del agregado muestran una reducción significativa en la profundidad del mínimo localizado cerca de 280 nm. Sin embargo, hay diferencias notables entre la segunda derivada del espectro UV agregado. El grado de perturbación a partir del espectro nativo, como se mide mediante la reducción de amplitud y el cambio en la longitud de onda, es menos severo con el espectro del agregado inducido térmicamente en comparación con el espectro del agregado inducido por hidrocloruro de guanidina. Además, hay una banda significativa que se ensancha en la zona máxima localizada cerca de 288 y 280 nm para el espectro del agregado inducido por hidrocloruro de guanidina que no es evidente en el espectro del agregado inducido térmicamente. Para comparar las estructuras secundarias de los dos agregados entre sí, así como de la forma nativa, los espectros de absorbancia FTIR de los tres estados fueron recolectados y se calcularon y compararon las segundas derivadas de los espectros. La figura 5 es una gráfica de la segunda derivada del espectro FTIR del rhlFN-? nativo en regulador de pH y de tanto los agregados de rhlFN-? inducidos térmicamente como los inducidos por hidrocloruro de guanidina. Las perturbaciones significativas a partir del estado nativo se observan en ambas formas de agregado, con un cambio en la longitud de onda y una pérdida de la absorbancia en la banda de la hélice-a (cerca de 1656 cm"1 en el espectro nativo) y la aparición concomitante de bandas intermoleculares de lámina-ß cerca de 1620 y 1695 cm"1 (figura 5). Las contribuciones de las bandas intermoleculares de cadena-ß cerca de 1620 y 1695 cm"1 son comparables para ambas formas de agregado, como lo es el grado de pérdida en hélice-a. Solamente son evidentes las diferencias menores en las estructuras de iámina-ß (región cerca de 1630 a 1645 cm"1) y estructuras en giro (región cerca de 1670 y 1685 cm"1) entre los agregados inducidos térmicamente y los agregados inducidos por hidrocloruro de guanidina.

Disolución a alta presión y cinéticas de repleqamiento Se sabe que la presión no favorece la asociación de orden-superior de las subunidades de proteína (Silva y Weber 1993) y por lo tanto puede emplearse para disociar agregados, como se ha demostrado previamente (Foguel et al., 1999; Gorovits y Horowitz 1998; Silva et al., 1989; St. John et al., 1999). Cuando los agregados de rhlFN-? inducidos por hidrocloruro de guanidina fueron expuestos a 250 MPa, hubo una pérdida rápida y total de los agregados que dispersan de la luz, como se mide mediante la absorbancia a 310 nm (figura 6A). La concentración total de rhlFN-? fue de 1 mg/mL y la concentración de hidrocloruro de guanidina en solución fue de cerca de 5 mM. Una vez que la disolución de los agregados fue total, los barridos de absorbancia se recolectaron a 250 MPa y se calculó la derivada del espectro. La presión se mantuvo a 250 MPa hasta que la segunda derivada del espectro ya no cambió con el tiempo (cerca de 30 minutos). Los inventores encontraron que la segunda derivada del espectro de los agregados inducidos por hidrocloruro de guanidina a 250 MPa equilibrados al espectro obtenido cuando el rhlFN-? nativo está disociado con la presión a 250 MPa (figura 4), indica una desorganización completa de la estructura del agregado y la disociación de la estructura dimérica a monómero. Una vez que el segundo derivado del espectro ya no exhibe cambios con el tiempo a 250 MPa, la presión se redujo a 100 MPa y el espectro de absorbancia se recolectó durante el tiempo. La segunda derivada del espectro se calculó de nuevo y se comparó hasta que ya no se observaron cambios con el tiempo. A 100 MPa, el extremo cerca de 286 nm (un máximo en el espectro disociado con la presión, véase figura 4) disminuyó en altura con el tiempo y eventualmente se volvió un mínimo conforme la proteína empezaba a asumir una conformación más nativa. La figura 6B es una gráfica de la altura del extremo cerca de 286 nm contra el tiempo a 100 MPa para la reasociación/replegamiento de rhlFN-? a 1 mg/mL, después de que los agregados inducidos por hidrocloruro de guanidina se disociaron a 250 MPa. Superpuestas en la figura 6B están las alturas de los espectros para las formas de rhlFN-? disociadas con presión y en forma nativa así como para la forma replegada con presión en equilibrio (rhlFN-? 1 mg/mL), lograda mediante la disminución de la presión a 0.1 MPa. El replegamiento a 100 MPa está completo en cerca de 1 hora y la altura máxima a 286 nm de los agregados tratados con presión ha regresado casi completamente a la del control nativo. La velocidad de disolución de los agregados inducidos térmicamente a presión no pudo cuantificarse mediante los cambios en absorbancia 310 nm con el tiempo, debido a que los agregados no dispersan suficientemente la luz. También, la disolución a presión de los agregados no pudo seguirse en la región entre 275 y 295 nm ya sea debido a que la disolución del agregado y la migración estructural a la forma disociada mediante presión (figura 4) ocurre simultáneamente. Por lo tanto, la velocidad de disolución del agregado inducido térmicamente a presión no puede compararse directamente con la presión de disolución de los agregados inducidos por hidrocloruro de guanidina. Sin embargo, el tiempo requerido para que el agregado inducido térmicamente asuma el estado disociado mediante presión (cerca de 2 horas), medido mediante la segunda derivada UV, es significativamente menor en comparación con el tiempo requerido para que los agregados inducidos por hidrocloruro de guanidina (cerca de 30 minutos) asuman el estado disociado mediante presión (datos no mostrados).

Pero una vez que el estado disociado con presión se logra, las velocidades de replegamiento son comparables (figura 6B).

Caracterización de los agregados tratados con presión Los agregados de rhlFN-? inducidos térmicamente e inducidos con hidrocloruro de guanidina en regulador de pH a concentraciones de proteína de cerca de 1 , 10 y 20 mg/mL fueron presurizados a 250 MPa por cinco horas. La presión se disminuyó entonces a 100 MPa por una y media horas, luego de nuevo se disminuyó a 0.1 Mpa. El análisis de ios agregados tratados con presión se realizó tanto inmediatamente después de dos semanas después del tratamiento con presión para evaluar la efectividad del tratamiento con presión en la adquisición de las características semejantes al compuesto nativo a partir de agregados y la estabilidad de los agregados tratados con presión en contra de la re-agregación, respectivamente. Se emplearon TEM, GEMMA y CLAR para caracterizar físicamente a los agregados tratados con presión y la segunda derivada UV y las espectroscopias por FTIR se utilizaron para caracterizar estructuralmente a los agregados tratados con presión. La comparación de los resultados para cada técnica se realizó entre los agregados tratados con presión, los agregados control y el control rhlFN-? líquido nativo.

Caracterización física después del tratamiento con presión Después de la despresurización, todas las muestras de agregado inducidos térmicamente y agregado inducidos por hidrocloruro de guanidina se observaron ópticamente claras sin partículas visibles a la observación. Adicionalmente, las muestras de agregados inducidos térmicamente a 10 y 20 mg/mL, las cuales fueron sólidos gelatinosos antes del tratamiento con presión, fueron líquidos con viscosidades indistinguibles (juzgadas cualitativamente) a partir de los controles líquidos nativos. Se llevó a cabo TEM sobre el control líquido y en las muestras de 1 y 20 mg/mL (presurizada y control) para ambos tipos de agregados a una concentración total de proteína de cerca de 1 mg/mL (20 mg/mL de las muestras se diluyeron inmediatamente después del tratamiento con presión). La figura 7 contiene micrografías TEM representativas de los agregados de rhlFN-? inducidos térmicamente (A) e inducidos con hidrocloruro de guanidina (B) tratados con presión, junto con el control líquido (C). Los controles del agregado no cambiaron las estructuras inicialmente observadas y, por lo tanto, las micrografías de los controles del agregado no se presentan en la figura 7 (véase figura 2 para estructuras representativas de los controles del agregado). Todas las micrografías en la figura 7 están a una amplificación de 40,000. Tanto en las muestras tratadas con presión como en el control líquido, se observaron estructuras amorfas y fibrosas, con el material amorfo más prevalente que el fibroso. La figura 7A2 exhibe una estructura amorfa a partir de agregados inducidos térmicamente tratados con presión, la cual es representativa de la estructura dominante encontrada para todas las tres muestras de rhlFN-?. Las estructuras observadas y la frecuencia del material amorfo relativo al material fibroso tanto en los agregados tratados con presión como en el control líquido fueron consistentes. Adicionalmente, no hubo diferencias observadas entre la muestra que se trató con presión a 1 ó 20 mg/mL tanto para los agregados inducidos térmicamente como para los agregados inducidos con hidrocloruro de guanidina (comparación no mostrada). La red fibrosa observada en las muestras de agregado inducido térmicamente antes del tratamiento con presión se destruyó y una gran proporción del agregado inducido térmicamente tratado con presión fue amorfo. También, el material fibroso que se observó en la muestra tratada con presión inducida con hidrocloruro de guanidina no se encontró en los controles de agregado inducidos con hidrocloruro de guanidina. Las estructuras fibrosas observadas para los agregados tratados con presión y el control líquido fueron más cortas en longitud y fueron más variadas en diámetro que las estructuras fibrosas observadas en los controles del agregado inducido térmicamente. Las longitudes de las estructuras fibrosas en los agregados tratados con presión y el control líquido fueron generalmente de 100 a 1000 nm en longitud y los diámetros fueron típicamente de cerca de 12 nm pero tuvieron intervalo de hasta cerca de 25 nm. Algunas redes de fibrillas entretejidas se observaron en las series de tres muestras como se da en las figuras 7A3 y 7C2. Se concluyó que la morfología de los agregados tratados con presión son distintas del control y de la preparación de la muestra por TEM, lo cual implica el secado de la muestra de proteína, induciendo estructuras consistentes tanto con agregados amorfos como fibrosos.

Caracterización estructural después del tratamiento con presión Después del tratamiento con presión, los espectros de absorbancia UV y FTIR se recolectaron y la segunda derivada UV y el espectro FTIR se calcularon para muestras presurizadas y muestras control. Las muestras de 10 y 20 mg/mL fueron diluidas inmediatamente después de la despresurización de tal manera que todos los análisis UV fueron llevados a cabo a 1 mg/mL de rhlFN-?. Debido a las limitaciones en la concentración de la técnica, la espectroscopia FTIR se llevó a cabo solamente en las muestras de 10 y 20 mg/mL. La figura 8 es una gráfica de la segunda derivada del espectro UV de los agregados inducidos térmicamente tratados con presión (A) y de los agregados inducidos con hidrocloruro de guanidina tratados con presión (B). Los espectros se registraron a 0.1 MPa después del protocolo de tratamiento con presión. Para referencia, la segunda derivada del espectro UV del rhlFN-? nativo está superpuesta en ambas ventanas de la figura 8. Los espectros del agregado control se omiten a partir de la figura 8 para claridad (véase figura 4 para los espectros de los agregados). El grado de recuperación de la segunda derivada nativa del espectro UV es independiente de la forma del agregado. Pero, el grado de recuperación de la segunda derivada del espectro UV nativo es dependiente de la concentración, con una mayor recuperación del espectro nativo a concentraciones bajas de proteína. A 1 mg/mL, los agregados tratados con presión recuperan una segunda derivada del espectro UV casi idéntica a la del control líquido del rhlFN-? nativo. El cuadro 2 contiene el resumen de la recuperación porcentual del espectro nativo medido por la segunda derivada de espectroscopia UV, utilizando la relación de las diferencias en alturas del extremo cercano a 286 nm entre el estado disociado con presión y replegado con respecto a los estados disociados por presión y nativos.

CUADRO 2 Recuperación de las características de! espectro nativo para los agregados de rhlFN^y replegados por presión medidos por la segunda derivada de UV y FTIR La figura 9 es una gráfica del área normalizada de la segunda derivada del espectro FTIR de los agregados de rhlFN-? tratados con presión, térmicamente inducidos (figura 9A) e inducidos por hidrocloruro de guanidina (figura 9B) para los tratamientos con presión conducidos a 10 y 20 mg/mL. Debido a la preparación y a los tiempos de recolección de la muestra asociados con la técnica de FTIR, los espectros FTIR fueron recolectados dentro de las tres primeras horas de la despresurización. Para propósitos comparativos, la segunda derivada del espectro FTIR del rhlFN-? nativo está superpuesta en ambas ventanas de la figura 9. Como fue el caso con los resultados espectroscópicos UV, la recuperación de la estructura secundaria nativa, medida cualitativamente mediante FTIR, es independiente de la forma del agregado, como de la segunda derivada del espectro FTIR a 10 y 20 mg/mL son las mismas para ambas formas de agregado, respectivamente. Sin embargo, la recuperación de la estructura secundaria semejante a la nativa es dependiente de la concentración de la proteína durante el tratamiento con presión. Hay una reducción sustancial en las bandas intermoleculares de lámina-ß cercana a 1620 y 1695 cm"1 con el tratamiento con presión tanto para las muestras de 10 como de 20 mg/mL. Pero, la reducción de estas bandas intermoleculares de lámina-ß a los niveles observados en el espectro nativo casi es completo para el espectro a 10 mg/mL, aunque bandas significativas aún están presentes cercanas a 1620 y 1695 cm 1 en cada uno de los espectros a 20 mg/mL. Como se mide mediante la segunda derivada por FTIR, las muestras tratadas con presión a 10 mg/mL recuperan toda la hélice-a observada en la estructura nativa (bandas cercanas a 1656 cm"1). La recuperación de la estructura secundaria nativa, como se mide por el área sobrepuesta (Kendrick et al., 1996), son cercanas al 90 y al 70% para los tratamientos con presión a 10 y 20 mg/mL, respectivamente. El cuadro 2, para la recuperación de la estructura nativa mediante FTIR, como se mide mediante el área sobrepuesta, con la recuperación de la estructura nativa por la segunda derivada de espectroscopia UV. El porcentaje de recuperación de las características semejantes a la nativa, como se mide por UV y FITR, están de acuerdo de forma razonable para ambas muestras tratadas con presión a 10 y 20 mg/ml, puesto que la repetición de cada método es cercana al 5%.

Estabilidad de los agregados tratados con presión: Caracterización física Después del análisis inicial siguiendo al tratamiento con presión, las muestras de agregado tratadas con presión, controles agregados y controles nativos se colocaron a 4°C. Dos semanas después del tratamiento con presión, las muestras tratadas con presión a 10 y 20 mg/mL tanto de los agregados inducidos térmicamente como de los agregados inducidos por hidrocloruro de guanidina habían formado geles incoloros, transparentes, similares a los agregados inducidos térmicamente que no fueron tratados con presión. Sin embargo, las viscosidades de estas muestras Guzgadas cualitativamente) fueron evidentemente más bajas que las viscosidades observadas para los agregados control inducidos térmicamente. Las diferencias cualitativas dependientes del tiempo entre los agregados que fueron tratados con presión a 1 mg/mL no fueron evidentes.

GEMMA y SEC fueron llevados a cabo en agregados tratados con presión que habían sido diluidos a 1 mg/mL en regulador de pH con succinato inmediatamente después del tratamiento con presión y se almacenaron subsecuentemente por dos semanas a 4°C. Los resultados a partir del GEMMA y SEC para las muestras tratadas con presión se compararon con los controles líquido y del agregado. No se observaron efectos, obtenidos mediante ya sea GEMMA y SEC, con el tipo de agregado inicial o con la concentración de proteína para replegamiento. Como se mide mediante GEMMA y SEC, los agregados tratados con presión contenían solamente dos especies, las cuales fueron identificadas como monómeros y como dímeros, y no se detectaron agregados de órdenes superiores en ninguna de las muestras de agregado tratado con presión o en los controles nativos. El análisis GEMMA del agregado control inducido térmicamente mostró una población más grande (mayor del 95% en masa) de agregados (figura 3) (de nuevo, el análisis GEMMA no se llevó a cabo en el control inducido con hidrocloruro de guanidina). Un resumen de los resultados entre los agregados control nativo y los agregados tratados con presión para GEMMA y SEC se presenta en los cuadros 1A y 2B, respectivamente. Puesto que no se observaron efectos con el tipo de agregado inicial o con la concentración de proteína para replegamiento, los datos para los agregados tratados con presión en el cuadro 1 han sido promediados con respecto al tipo de agregado inicial y a la concentración de la proteína para replegamiento. Los dos picos en las distribuciones de tamaño de los agregados tratados con presión, como se miden mediante GEMMA, se centraron en 4.6 y 5.7 nm, los cuales fueron mayores en diámetros EM que sus contrapartes respectivas en la distribución del control (monómero y dímero). Adicionalmente, por GEMMA, se observó una mayor masa porcentual de monómero en los agregados replegados en comparación con el control nativo. Por SEC, el tiempo de elución para el dímero fue más corto para los agregados tratados con presión que para el control, pero no hubo una diferencia medida en el tiempo de elución del monómero. Por SEC no se observaron diferencias capaces de ser medidas en la masa porcentual del monómero entre los agregados control y los agregados tratados con presión. Puesto que los datos GEMMA y SEC son contradictorios con respecto a un incremento en la masa porcentual del monómero, estos datos no apoyan una conclusión de una masa porcentual del monómero incrementada en las muestras de agregados tratados con presión con respecto al control. Tanto para los datos GEMMA como SEC, las estimaciones del PM para el monómero y para el dímero en el agregado tratado con presión y en las muestras del control nativo se realizaron a partir de curvas de calibración elaboradas con proteína de peso molecular conocido y estas estimaciones de PM se presentan en el cuadro 1. Las estimaciones del PM para el monómero y para el dímero de las muestras control se ajustaron tanto para GEMMA como para SEC, puesto que el PM del monómero y del dímero de rhlFN-? son de 16.45 y 32.9 kD, respectivamente. Los estimados del PM para el dímero de las muestras de agregado tratadas con presión fueron más grandes tanto por GEMMA como para SEC que el PM del dímero estimado para las muestras control. Se cree que el incremento evidente en el PM del dímero resulta a partir de un dímero en un estado expandido, ocasionado por un plegamiento inadecuado. El PM aparente del monómero fue mayor por GEMMA, pero no cambió por SEC, con relación al control.

Estabilidad de los agregados tratados con presión: Caracterización estructural Dos semanas después de que el replegamiento bajo presión había sido realizado, las muestras tuvieron que diluirse inmediatamente a 1 mg/mL después de que la despresurización fuera removida a partir del almacenamiento a 4°C y se analizaran mediante UV. Las limitaciones de concentración prohibieron análisis de estas muestras por FTIR. La figura 10 es una gráfica de la segunda derivada del espectro UV de agregados tratados con presión, inducidos térmicamente que se trataron con presión a 1 , 10 y 20 mg/mL. Para referencia, la segunda derivada del espectro UV del rhlFN-? nativo está superpuesta en la figura 10. El espectro de la muestra del agregado tratado con presión a 1 mg/mL fue la misma que el espectro tomado inmediatamente después del tratamiento con presión y mostró una recuperación esencialmente completa de las características semejantes a la estructura nativa. Sin embargo, el espectro de las muestras de agregado tratados con presión a 10 y 20 mg/mL cambiaron del espectro respectivo tomado inmediatamente después de tratamiento con presión (figura 8). Después del almacenamiento a 1 mg/mL a 4°C por dos semanas, la recuperación de la estructura nativa, como se mide por la altura del extremo cercano a 286 nm, fue de 100, 97 y 94% para los agregados inducidos térmicamente, tratados con presión, a 1 , 10 y 20 mg/mL, respectivamente. La recuperación de la estructura nativa para los agregados inducidos térmicamente, tratados con presión, a 10 y 20 mg/mL se incrementaron de 89 y 79% (cuadro 2) medido inmediatamente después de tratamiento con presión, respectivamente. Como fue el caso inmediatamente después del tratamiento con presión, el grado de recuperación de la segunda derivada del espectro UV nativo dos semanas después del tratamiento con presión fue independiente de la forma del agregado. No se presenta la segunda derivada del espectro UV de las muestras del agregado Inducido con hidrocloruro de guanidina, tratado con presión, pero la recuperación de la estructura nativa, como se mide por la altura del extremo cercano a 286 nm, fue de 100, 97 y 95% para las muestras a 1 , 10 y 20 mg/mL, respectivamente. La recuperación de la estructura nativa, como se mide por la segunda derivada del UV, después del almacenamiento a 1 mg/mL y a 4°C muestra una tendencia a la disminución con la concentración de proteína durante el replegamiento, pero las diferencias en la recuperación están dentro de la precisión del método.

Dependencia de la concentración en la recuperación del dímero nativo. La recuperación del dímero nativo a partir de los agregados mostró una interesante dependencia de la concentración de la proteína. Los datos espectroscopios UV y FTIR se tomaron poco después de que el protocolo de replegamiento fuera terminando indicando una fuerte dependencia de la concentración en el grado de recuperación. Adicionalmente, la segunda derivada del espectro FTIR después del tratamiento con presión mostró signos claros de agregación, particularmente para las muestras replegadas a 20 mg/mL (la presencia de las bandas intermoleculares de lámina-ß a 1620 y 1695 cm"1 en la figura 9). Adicionalmente, después de dos semanas de almacenamiento a 4°C, las muestras no diluidas de agregado tratado con presión a 10 y 20 mg/mL mostraron evidencia macroscópica de agregación por el incremento visible en las viscosidades de estas muestras. Sin embargo, las mismas muestras tratadas con presión, las cuales habían sido diluidas a 1 mg/mL inmediatamente después del tratamiento con presión, no mostraron signos de agregados por GEMMA o SEC, fueron indistintas del control líquido por TEM y mostraron casi una recuperación total de la estructura nativa mediante análisis UV, sin importar la concentración de proteína durante el replegamiento. Para explicar esta dependencia interesante de la concentración de proteína, es necesario entender el efecto de la presión sobre el rhlFN-? y la ruta de agregación del rhlFN-?.

Se sabe que la presión hidrostática disocia proteínas oligoméricas (Gross y Jaenicke 1994; Silva y Weber 1993) y se ha observado por los inventores que disocia a rhlFN-? en la región de presión empleada aquí para la disolución de los agregados. Los datos UV in situ recolectados durante el protocolo de replegamiento indicaron que después de cerca de una hora a 100 MPa el replegamiento estaba esencialmente completo. Los datos UV in situ fueron recolectados a 1 mg/mL, pero no a 10 y 20 mg/mL debido a la limitación de la absorbancia de la técnica. Por lo tanto, se desconoce la velocidad de replegamiento como una función de la concentración a 100 MPa. Si la velocidad de replegamiento a 100 MPa se reduce a concentraciones mayores de proteína, entonces puede estar presente un monómero substancial en las muestras a 10 y 20 mg/mL después de 1.5 horas de tiempo de replegamiento a 100 MPa. Los inventores mostraron que las segundas derivadas del espectro UV de las muestras a 10 y 20 mg/mL recolectadas inmediatamente después de la despresurización (figura 8) son consistentes con la concentración en incremento del monómero. Además, se ha establecido por los inventores que rhlFN-? se agrega vía el monómero, y, por lo tanto, se espera que la presencia del rhlFN-? monomérico después de la despresurización lleve a la agregación. Por lo tanto, es probable que la dependencia de la concentración observada (inmediatamente después del tratamiento con presión) en la segunda derivada del espectro UV de los agregados tratados con presión (figura 8) refleje una población incrementada de monómero a concentraciones incrementadas de proteína.

Así, para las muestras de agregado tratado con presión a 10 y 20 mg/mL, porqué se observa agregación en las muestras no diluidas y no en las muestras que fueron diluidas a 1 mg/mL de rhIFN-y? La respuesta yace en la relación entre la agregación de la proteína y e! plegamiento de la proteína. Debido a que la agregación de la proteína procede a través de un intermediario de plegamiento, la agregación y el plegamiento son procesos competitivos (Betts et al., 1997; Clark et al., 1999; Fink, 998). Los pasos en el replegamienío de proteína generalmente son procesos de primer orden (Clark et al., 1999), pero los inventores han determinado que la agregación del rhIFN-y en la ausencia de concentraciones mayores de electrolitos es de segundo orden en la concentración de proteína. Si el paso limitante de velocidad de plegamiento del rhlFN-? es de un orden inferior que dos (por ejemplo, de primer orden), entonces las concentraciones bajas de proteína favorecerán el replegamienío sobre la agregación. Es razonable prever que las cinéticas de replegamienío del rhlFN-? sean de primer orden cuando se considera la naturaleza entreíejida del dímero (Ealick et al., 1991 ). Si el paso limitante de velocidad en la adquisición del dímero no es la velocidad de colisión de los monómeros, sino la velocidad para asumir la conformación correcta que permite que ocurra el replegamienío, entonces se pueden observar cinéticas de primer orden. También, disminuyendo la temperaíura se puede conlribuir a la inhibición de la agregación y a la adquisición del dímero, puesto que la reacción de agregación tiene una gran energía de activación, pero la reacción de asociación que lleva a la formación del dímero es relativamente insensible a la temperatura (Boteva et al., 1996). Por lo tanto, las temperaturas menores favorecen la reacción de replegamiento sobre la agregación.

EJEMPLO 3 Replegamiento de lisozima Se generó presión utilizando nitrógeno a alta presión (40 MPa) conectado a un intensificador hidráulico por 10 veces (High Pressure Equipment Company, Erie, PA). Suspensiones de un mg/ml de agregados de lisozima en Tris 50 mM (pH 8.0, a 24°C), con cantidades variables de GdnHCI, DTT 2 mM y GSSG a la relación final deseada (GSSG:GSH; una relación óptima fue de 1 :1) se prepararon en bulbos sellados por calor de pipetas para transferencia SAMCO®, selladas con una bolsa de agua, y se colocaron dentro de un reactor de cuatro bucles de dos litros fijado a 200 MPa y llenado con aceite. Las muestras se presurizaron lentamente (durante 20 minutos) a una presión deseada para minimizar el calentamiento inducido por la presión. La despresurización se llevó a cabo con incrementos de 20 MPa, con cada paso de despresurización requiriendo aproximadamente 5 minutos. Las muestras se incubaron a cada presión intermedia durante una despresurización de 15 minutos, produciendo una velocidad de despresurización general de 1 MPa/minuto (10 bar/minuto). Las transiciones térmicas ocasionadas por el calentamiento inducido por la presión fueron mínimas (< 2°C) a esta velocidad de presurizaclón, como se monitoreó por pares termoeléctricos montados en la vasija a presión. A menos que se establezca de otra manera, todos los experimentos a presión se llevaron a cabo a 24°C.

EJEMPLO 4 Replegamiento de bicunina Los estudios de replegamiento se llevaron a cabo en bicunina, una proteína de 170 aminoácidos con seis enlaces disulfuro. Esta proteína frecuentemente forma un agregado durante la fermentación. El agregado está compuesto de enlaces disulfuro no nativos y es un oligómero de cuatro a ocho monómeros. Los experimentos se llevaron a cabo para determinar si la presión hidrostática alta (1000- 3000 bar) pudiera ser utilizada para replegar estos agregados disulfuro de proteína mezclada Los agregados de bicunina se colocaron en jeringas selladas y se mantuvieron bajo presión en varias condiciones de reactor. Presión, pH, condiciones redox, temperatura y velocidad de despresurización estuvieron todas controladas. Como un caso base, las siguientes condiciones fueron utilizadas: 1 mg/ml de muestra de agregado de bicunina se mantuvo a 200 MPa, 25°C, en glutationa oxidada 4 mM (GGSG), ditiotreitol (DTT) 2 mM por 6 horas. Las muestras fueron entonces despresurizadas por 10 MPa cada 30 minutos hasta que se alcanzó una presión de 100 MPa. Las muestras fueron despresurizada adicionalmente a 25 MPa cada quince minutos hasta que se alcanzó una presión de 0.1 MPa. Después de la presurización, las muestras fueron analizadas con cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) para determinar el rendimiento del replegamiento. Una curva de calibración se utilizó para asegurarse que el balance de masas se mantuviera durante la experimentación. Las muestras también se enviaron a un laboratorio secundario para análisis a través de cromatografía de fase reversa (RP) y un ensayo de actividad. Estos estudios secundarios mostraron que SEC sobreestimó el rendimiento de replegamiento por aproximadamente 10% debido a la presencia de proteínas monoméricas no activas. SEC se utilizó incluso como una herramienta opcional, sin embargo los rendimientos de replegamiento final fueron confirmados con un ensayo de actividad. Se obtuvo un rendimiento de replegamiento del 45% +/- 4% por el ensayo de actividad en las condiciones del "caso base" descritas anteriormente. Una optimización rápida de las condiciones de replegamiento se obtuvo mediante condiciones variables de la solución alrededor de las condiciones del "caso base". Se utilizó un algoritmo no sofisticado; experimentos más sofisticados diseñados, bien conocidos por los científicos industriales podrían producir probablemente condiciones más óptimas con menos experimentos. Sin embargo, incluso utilizando la técnica simple de las condiciones redox variables, temperatura, presión y velocidad de despresurización separadamente alrededor de las condiciones del caso base, se encontró rápidamente un óptimo razonable.

La glutationa oxidada y reducida puede ser utilizada para controlar las condiciones redox dentro de la solución para replegamiento. Estos compuestos son necesarios para romper enlaces disulfuro no nativos y reformar enlaces disulfuro nativos. Típicamente, las condiciones redox óptimas existen cuando la concentración total de glutationa está entre 6- 16 mM, con relaciones de glutationa reducida a oxidada específicas al sistema, frecuentemente entre 1 y 3. Las muestras se hicieron con condiciones redox variables y se evaluaron a tres condiciones de presión diferentes para determinar el efecto de rendimiento del replegamiento. La relación del pico SEC monomérico con respecto al pico SEC del agregado se utilizó para medir la efectividad del replegamiento. Los resultados se muestran en la figura 1 . Para estos estudios, se encontró que el caso más óptimo fue el de glutationa oxidada 4 mM, DTT 2 mM a 2000 bar. El cambio del sistema de glutationa fue necesario para obtener cualquier rendimiento de replegamiento significativo, como se podría esperar a partir de un agregado de proteína que contiene enlaces disulfuro no nativos. La presión y el DTT juntos no fueron efectivos. La optimización adicional de las condiciones redox pudo hacerse potencialmente; sin embargo, los rendimientos obtenidos en GGSG 4 mM, DTT 2 mM a 2000 bar fueron suficientemente adecuados para determinar los efectos de las condiciones remanentes del replegamiento. Se evaluó el efecto de la temperatura para replegamiento. Las muestras se mantuvieron a 12 horas a temperaturas variables para replegamiento, luego se llevaron a temperatura ambiente y se mantuvieron por doce horas adicionales. Fueron utilizadas las presiones a 2000 bar y las condiciones redox previamente optimizadas. El replegamiento se encontró máximo a 25°C. Estos resultados se muestran en la figura 12. Se evaluó el efecto de la presión para replegamiento. Las muestras se mantuvieron por 16 horas a presiones variables para replegamiento, y luego se despresurizaron lentamente durante un periodo de ocho horas. Las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente, con las condiciones redox previamente utilizadas. Se encontró que 2000 bar era la presión óptima para replegamiento, con un rendimiento de replegamiento disminuyendo a partir de 1000 bar y 3000 bar. Estos resultados se muestran en la figura 13. El monómero de proteína se sometió a velocidades de despresurización rápida y lenta para determinar el impacto de la despresurización sobre el rendimiento de la proteína. Las muestras se mantuvieron a 2000 bar, 25°C, por 16 horas en las condiciones redox estándares (GGSG 4 mM, DTT 2 mM). Una serie de muestras fue despresurizada durante un periodo de 30 segundos. La segunda serie de muestras se despresurizó de conformidad con el procedimiento descrito en los métodos experimentales (las muestras se despresurizaron por 10 MPa cada 30 minutos hasta que se alcanzó una presión de 100 MPa, luego se despresurizaron adicionalmente 25 MPa cada quince minutos hasta que se alcanzó una presión de 0.1 MPa). Las muestras que fueron despresurizadas lentamente perdieron 21% +/- 3% del monómero a los agregados. Este valor fue mucho menor que la pérdida del 59% +/- 16% cuando la muestra se despresurizó rápidamente. Este estudio verificó la necesidad de utilizar despresurización lenta durante un periodo de horas para asegurar que las proteínas mantengan su conformación nativa.

EJEMPLO 5 Replegamiento de aVEGF Los estudio de replegamiento a alta presión se llevaron a cabo en agregados quiméricos no nativos de un anticuerpo en contra del factor de crecimiento endotelial vascular de humano (aVEGF), un anticuerpo heterotetramérico, glucosilado, unido por enlaces disulfuro, de longitud total que lleva a cabo optimización irreversible durante la producción en cultivo de células de ovario de hámster chino (CHO). Los estudios de replegamiento se llevaron a cabo para determinar si la presión hidrostática alta podía ser utilizada para obtener monómeros aVEGF nativos. Adicionalmente, los experimentos se llevaron a cabo para determinar el efecto de la temperatura sobre el rendimiento del replegamiento. Los experimentos se llevaron a cabo para determinar el rendimiento del replegamiento de las muestras mantenidas a 2000 bar a tres temperaturas diferentes. El procedimiento experimental es como sigue: aVEGF (22%o de agregado, 78% de monómero) se diluyó a una concentración de 1 mg/ml en regulador de pH con ácido 2- (4-Morfolino)-etansulfónico (MES) 25 mM a pH 6.0. Cada muestra se elaboró de 0.4 mi de la solución de proteína MES (1 mg/ml) y se cargó dentro de una jeringa sellada. La jeringa se requirió para asegurar la transferencia adecuada de presión a la muestra. Tres muestras se crearon para cada condición y se colocaron en vasijas de presión a temperatura ambiente. Las muestras se presurizaron a 2000 bar y la temperatura de las vasijas de presión se ajustó a 0°C, 25°C, o 50°C. La presión se monitoreó durante este tiempo para mantener una presión de 2000 bar a pesar de los cambios en la temperatura. Las muestras se mantuvieron a la temperatura deseada y a la presión por 16 horas, se enfriaron o se calentaron a temperatura ambiente, y se despresurizaron. La despresurización se realizó por incremento de 100 bar cada 30 minutos, con caídas de 250 bar cada quince minutos una vez que se alcanzó una presión de 1000 bar. Las muestras se removieron de las vasijas de presión y se almacenaron a 4°C por dos días. La cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) se utilizó para determinar las fracciones de masa de los monómeros y de los dímeros. Tres muestras fueron evaluadas a 0°C, 25°C, y 50°C y a 2000 bar a lo largo de todo el procedimiento descrito anteriormente. El rendimiento del replegamiento (RY%) se calculó a partir de los resultados SEC utilizando la siguiente ecuación: En donde Mf- fracción final del monómero y Mi- fracción inicial del monómero. Se encontró que la temperatura influye en el rendimiento del replegamiento. Estos estudios mostraron que se puede lograr un rendimiento de replegamiento del 29% (+/- 1%) a 50°C. Esto se muestra en la figura 14.

EJEMPLO 6 Replegamiento a alta presión de los cuerpos de inclusión GCSF Cuerpos de inclusión purificados, concentrados abastecidos a partir de Amgen, Inc. (Thousand Oaks, CA) fueron suspendidos en regulador de pH para replegamiento (Tris-HCI 50 mM, EDTA 1 mM, NaN3 0.1 %) que contenía concentraciones variables de hidrocloruro de guanidina (GdnHCI). Las muestras por triplicado fueron presurízadas a 2000 bar y se incubaron por 24 horas. La presión se liberó mediante la disminución de la presión de la vasija en incrementos de 200 bar. Las muestras se mantuvieron en cada presión incremental por 15 minutos. Después de la despresurización completa, las muestras se centrifugaron a 13,000 g por quince minutos. El sobrenadante resultante se analizó con el ensayo para proteína total Pierce® TPA. Los estándares de albúmina de suero de bovino (BSA) se utilizaron para calibrar el ensayo. Los resultados se muestran en la figura 15.

Todas las composiciones, métodos y aparatos descritos y reclamados aquí pueden realizarse y ejecutarse sin llevar a cabo experimentación a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos de esta invención han sido descritos en términos de las modalidades preferidas, será evidente a aquel experto en la técnica que se pueden aplicar variaciones a las composiciones, métodos y aparatos y a los pasos o en la secuencia de pasos del método descrito aquí sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que ciertos agentes que están tanto químicamente como fisiológicamente relacionados pueden ser sustituidos por los agentes descritos aquí en tanto que los mismos resultados o resultados similares puedan alcanzarse. Todos los sustitutos similares y modificaciones aparentes por aquellos expertos en la técnica se consideran que están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como se define por las reivindicaciones anexas.

XII. Referencias Las siguientes referencias, hasta el grado que se proveen como precedimiento ejemplar u otros detalles suplementarios a aquellos establecidos aquí, están específicamente incorporadas aquí como referencias. Patente de E.U.A. 4,652,630 Patente de E.U.A. 4,659,568 Patente de E.U.A. 4,677,196 Patente de E.U.A. 4,766,224 Patente de E.U.A. 4,923,967 Patente de E.U.A. 4,929,700 Patente de E.U.A. 4,985,544 Patente de E.U.A. 5,023,323 Patente de E.U.A. 5,064,943 Patente de E.U.A. 5,077,392 Patente de E.U.A. 5,109,1 17 Patente de E.U.A. 5,162,507 Patente de E.U.A. 5,410,026 Patente de E.U.A. 5,593,865 Patente de E.U.A. 5,605,691 Patente de E.U.A. 5,708,148 Patente de E.U.A. 5,714,371 Patente de E.U.A. 5,728,804 Balestrieri, C, Colonna, G., Giovane, A., Irace, G., y Servillo, L. (1978). "2nd-Derivative Spectroscopy of Proteins - ethod For Quantitative-Determination of Aromatic Amino-Acids in Proteins." European Journal Of B/ochem/stry, 90(3), 433-440. Benson, S. W. (1960). The Founcfations of Chemfca/ Kfnetícs, McGraw-Hill, New York. Betts, S., Haase-Pettingell, C, y King, J. (1997). "Mutational effects on inclusión body formation." Advances in Protein Chemistry, Vol 50, Academic Press lnc, San Diego, 243-264.

Booth, D. R., Sunde, M., Bellotti, V., Robinson, C. V., Hutchinson, W. L., Fraser, P. E., Hawkins, P. N., Dobson, C. M., Radford, S. E., Blake, C. C. F., y Pepys, A B. (1997). "Instability, unfolding and aggregation of human lysozyme variants underlying amyloid fibrillogenesis." Nature, 385(6619), 787-793. Carpenter, J. F., Kendrick, B. S., Chang, B. S., Manning, . C, y Randolph, T. W. (1999). "Inhibition of stress-induced aggregation of protein therapeutics." Amyloid, Prions, and Other Protein Aggregates, R. Wetzel, ed., Academic Press Inc, San Diego, 236255. Carpenter, J. F., Pikal, M. J., Chang, B. S., y Randolph, T. W. (1997). "Rational design of stable lyophilized protein formulations: Some practica! advice." Pharmaceut/ca/ Research, 14(8), 969-975. Clark, E. D., Schwarz, E., y Rudolph, R. (1999). "Inhibition of aggregation side reactions during in vitro protein folding." Amyloid, Prions, and Other Protein Aggregates, Academic Press Inc, San Diego, 217-236. Clark, E. D. B. (1998). "Refolding of recombinant proteins." Current Op/nfon /n Bíotechno/ogy, 9(2), 157-163. Dong, A., Prestrelski, S. J., Allison, S. D., y Carpenter, J. F. (1995). "Infrared spectroscopic studies of lyophilization- and temperature-induced protein aggregation." Journaí of Pñarmaceut/caf Sciences, 84(4), 415-24. Ealick, S. E., Cook, W. J., Vijaykumar, S., Carson, M., Nagabhushan, T. L, Trotta, P. P., y Bugg, C. E. (1991 ). "3 -Dimensional Structure of Recombinant Human Interferon Gamma." Sc/enca, 252(5006), 698-702. Fink, A. L (1998). "Protein aggregation: folding aggregates, inclusión bodies and amyloid." Fo/d/ng & Design, 3(l), R9-R23. 5 Foguel, D., Robinson, C. R., de Sousa, P. C, Silva, J. L., y Robinson, A. S. (1999). "Hydrostatic pressure rescues native protein from aggregates." B/otechno/ogy and B/oeng/neeríng, 63(5), 552-558. Gillmore, J. D., Hawkins, P. N., y Pepys, M. B. (1997). "Amyloidosis: A review of recent diagnostic and therapeutic developments." i o Br/t/sh Journal of /-aemato/ogy, 99 (2 ) , 245-256. Gorovits, B. M., y Horowitz, P. M. (1998). "High hydrostatic pressure can reverse aggregation of protein folding intermediates and facilítate acquisition of native structure." B/ocñem/stry, 37(17), 6132-6135. Gross, M., y Jaenicke, R. (1994). "Proteins Under Pressure - the 15 Influence of High Hydrostatic- Pressure On Structure, Function and Assembly of Proteins and Protein Complexes." European Journa/ of B/ochemistry, 221 (2), 617-630. Heremans, K., y Smeller, L. (1998). "Protein structure and dynamics at high pressure." B/ocñ/m/ca Et B/ophys/ca Acta-Prote/n Structure 0 and Mo/ecu/ar Enzy o/ogy 1386(2), 353-370. Kauzman, W. (1959). "Some factors in the interpretation of protein denaturation." Advances in Protein Chemistry, Academic Press, San Diego, 1-63.

Kayed, R., Bemhagen, J., Greenfield, N., Sweimeh, K., Brunner, H., Voelter, W., y Kapurniotu, A. (1999). "Conformational transitions of islet amyloid polypeptide (IAPP) in amyloid formation in vitro." Journa/ of Mo/ecu/ar B/o/ogy, 287(4), 781-796. Kendrick, B. S., Carpenter, J. F., Cleland, J. L, y Randolph, T. W. (1998a). "A transient expansión of the native state precedes aggregation of recombinant human ¡nterferon gamma." Proceed/ngs oftrie Nat/ona/ Acade y of Sciences ofthe United States of America, 95(24), 14142-14146. Kendrick, B. S., Chang, B. S., Arakawa, T., Peterson, B., Randolph, T. W., Manning, M. y Carpenter, J. F. (1997). "Preferential exclusión of sucrose from recombinant interleukin- 1 receptor antagonist: Role in restricted conformational mobility and compaction of native state." Proceed/n' gs o f trie Nat/ona/ Academy of Sc/ences of ne Un/ted States ofAmerica, 94(22), 1917-11922. Kendrick, B. S., Cleland, J. L, Lam, X., Nguyen, T., Randolph, T. W., Manning, M. C, y Carpenter, J. F. (1998b). "Aggregation of recombinant human ¡nterferon gamma: Kinetics and structural transitions." Journa/ of Priarmaceut/ca/ 'Sc/ences, 87(9), 1069-1076. Kim, Y. S., Wall, J. S., Meyer, J., Murphy, C, Randolph, T. W., Manning, M. C, Solomon, A., y Carpenter, J. F. (2000). "Thermodynamic modulation of light chain amylold fibril formation." Journa/ of B/o/og/ca/ Chem/stry, 275(3), 1570-1574.

King, J., HaasePettingell, C, Robinson, A. S., Speed, M., y Mitraki, A. (1996). "Thermolabile folding ¡ntermediates: Inclusión body precursors and chaperonin substrates." Faseb Journaf, 10(f), 57-66. Laidler, K. J. (1965). Chem/cai Kinet/cs, McGraw-Hill, New York. 5 Lange, R., Frank, J., Saldana, J. L, y Balny, C. (1996). "Fourth derivative UV-spectroscopy of proteins under high pressure. 1. Factors affecting the fourth derivative spectrum of the aromatic amino acids." European Biophysics Journal ' W/tfi Biopfjysics Letters, 24(5), 277-283. Leach, S. J. y Scheraga, H. A. (1960) Journal of the American i o Chem/cai Soc/ety 82, 4790-4792. Lee, J. C, y Timasheff, S. N. (198 1 ). "The stabilization of proteins by sucrose." Journai of Bio/ogicai Chemistry, 256(14), 7193-201. Lilie, H., Schwarz, E., y Rudolph, R. (1998). "Advances in refolding of proteins produced in E-coli." Current Opinión in B/otechnology 9(5), 15 497-501. Liu, Y. F., y Bolen, D. W. (1995). "The Peptide Backbone Plays a Dominant Role in Protein Stabilization By Naturally-Occurring Osmolytes." Biochemistry, 34(39), 12884-12891. Lumry, R., y Eyring, H. (1954). "Conformation changes of 0 proteins." Journai of Physicai Chemistry, 58, 1 10-120. NIST. (1998). "NIST webbook." http://webbook.NIST.gov.

Pace, C. N., Shirley, B. A., y Thomson, J. A. (1989). "Measuring the conformational stabüity of a protein." Protein structure: A practical approach, T. E. Creighton, ed., IRL Press, Oxford. Prusiner, S. B. (1998). "Prions." Proceedfngs of t e Natíona/ Academy of Sc/ences of the Un/ted States ofAmer/ca, 95(23), 13363-13383. Ragone, R.( Colonna, G., Balestrieri, C, Servillo, L., e Irace, G. (1984). "Determination of Tyrosine Exposure ¡n Proteins By 2nd- Derivative Spectroscopy." B/ochem/st/y, 23(8), 1871-1875. Sambrook et a/., (1989), Molecular Cloning, Cold Spn'ng Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Scherzinger, E., Sittler, A., Schweiger, K., Heiser, V., Lurz, R., Hasenbank, R., Bates, G. P., Lehrach, H., y Wanker, E. E. (1999). "Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: Implications for Huntington's disease pathology." Proceed/n' gs of fhe Nat/onaf Academy of Sc/ences of the Un/ted States Of America, 96(8), 4604-4609. Servillo, L, Colonna, G., Balestrieri, C, Ragone, R., e Irace, G. (1982). "Simultaneous Determination of Tyrosine and Tryptophan Residues in Proteins By 2nd-Derivative Spectroscopy." Ana/yt/ca/ B/ochem/st/y, 126(2), 251-257. St. John, R. J., Carpenter, J. F., y Randolph, T. W. (1999). "High pressure fosters protein refolding from aggregates at high concentrations." Proceecfíngs of tñe Naí/onaf Academy of Sciences of the United States of America, 96(23), 13029-13033. Supran, M. K., Acton, J. C, Howell, A. J., y Saffie, R. L. (1971 ). "Surface tensión of common aqueous and organic phases ¡n food emulsions." Journat of Miik and Food Technotogy, 34(12), 584-585. Timasheff, S. N. (1998). "Control of protein stability and reactions by weakly interacting cosolvents: The simplicity of the complicated." Advances in Protein Chemistry, Vol 51 , Academic Press Inc, San Diego, 355-432. Arakawa, T., Hsu, Y. R., e Yphantis, D. A. (1987). "Acid Unfolding and Self-Association of Recombinant Escherichia- Coli Derived Human Interferon-Gamma." Biochemist/y) 26(17), 5428-5432. Barn efai., (1998), J Pharm. Sci. 87:1554-1559. Boteva, R., Zlateva, T., DorovskaTaran, V., Visser, A., Tsanev, R., y Salvato, B. (1996). "Dissociation equilibrium of human recombinant interferon gamma." Bioche istry, 35(47), 14825-14830. Kaufman, S. L, Skogen, J. W., Dormán, F. D., Zarrin, F., y Lewis, K. C. (1996). "Macromolecule analysis based on electrophoretic mobility in air: Globular proíems " Anaíyticai Chem/st/y 68(1 1 ), 1895-1904. Kelly, J. W. (1996). "Altemative conformations of amyloidogenic proteins govern their behavior." Currenf Opinión in Structurai Bioiogy 6(l), 11-17.

Kelly, J. W. (1998). "The environinental dependency of protein folding best explains prion and amyloíd diseases." Proceedings ofthe A/ationai Academy of Sciences ofthe United States of America, 95(3), 930-932. Kendrick, B. S., Dong, A. C, Allison, S. D., Manning, M. C, y Carpenter, J. F. (1996). "Quantitation of the área of overlap between second-derivative amide I infrared spectra to determine the structural similarity of a protein in different states." Journal of Pharmaceutica/ Sciences, 85(2), 155-158. Mach, H., y Middaugh, C. R. (1994). "Simultaneous Monitoring of the Environment of Tryptophan, Tyrosine, and Phenylalanine Residues in Proteins By Near- Ultraviolet 2nd-Derivative Spectroscopy." Anatyticai Biochemistry, 222(2) 323-331. Silva, J. L, Villasboas, M., Bonafe, C. F. S., y Meirelles, N. C. (1989). "Anomalous Pressure Dissociation of Large Protein Aggregates - Lack of Concentration Dependence and Irreversibility At Extreme Degrees of Dissociation of Extracellular Hemoglobin." Journai of Biológica/ Chemistry, 264(27) 15863-15868. Silva, J. L, y Weber, G. (1993). "Pressure Stability of Proteins." Annuai Review of Physicai Chemistry, 44, 89-113. Speed, M. A., Morshead, T., Wang, D. I. C, y King, J. (1997).

"Conformation of P22 tailspike folding and aggregation intermediates probed by monoclonal antibodies." Protein Science, 6(1) 99-108.

Weber, G. (1993). "Pressure Dissociation of the Smaller Oligomers: Dimers and Tetramers." High Pressure Chemistry, Biochemistry and Materials Science, R. Winter y J. Joñas, eds., Kluwer Academic Press, Dordrecht, Los Países Bajos, 471-487. Wetzel, R. (1994). "Mutations and Off-Pathway Aggregation of Proteins." Trencfs ¡n B/ofechnotogy, 12(5) 193-198. Wetzel, R. (1999). "Amyloid, prions and other protein aggregates." Methods in Enzymology, J. N. Abelson y M. I. Simón, eds., Academic Press, San Diego, 820. Patente de E.U.A. No.de serie 60/244, 080, presentada el 31 de octubre ofe>2000.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un método para producir proteína desagregada biológicamente activa a partir de agregados de proteína que comprende: (i) proveer un agregado de proteína; (ii) mezclar dicho agregado de proteína con un agente reductor en cantidad suficiente para reducir los enlaces disulfuro del mismo; (iii) someter la mezcla del paso (ii) a alta presión, en comparación con la presión ambiental, en donde dicho agregado de proteína se disuelve; (iv) dializar la mezcla bajo presión, en donde dicho agente reductor se remueve y los enlaces disulfuro se forman de nuevo; y (v) remover la proteína disuelta a partir de la presión incrementada, en donde dicha proteína se repliega de tal manera que se retiene la actividad biológica. 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente el paso de agitar dicho agregado de proteína y/o proteína disuelta para mejorar la disolución y/o el replegamiento. 3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente someter dicho agregado de proteína, antes del replegamiento, a una temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 25°C. 4. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho método no utiliza un agente caotrópico. 5. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho agente reductor es ditiotreitol, giutationa, ditioeritritol, o ß-mercaptoetanol. 6. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicha presión incrementada comprende de aproximadamente 500 atmósferas a aproximadamente 10,000 atmósferas. 7. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque los pasos (ii)-(v) se llevan a cabo de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 12 horas. 8. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque los pasos (ii)-(v) se llevan a cabo en aproximadamente 6 horas. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque los pasos (ii) y (iii) se llevan a cabo en la presencia de un agente caotrópico, y dicho método comprende adicionalmente el paso de remoción de dicho agente caotrópico. 10.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dicho agente caotrópico es guanidina, sulfato de guanidina, hidrocloruro de guanidina, urea, tiocianato, sarcosil, dodecilsulfato de sodio, u octilsulfato de sodio. 11. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho agregado de proteína comprende cuerpos de inclusión, precipitados solubles e insolubles, oligómeros solubles no nativos, gel, fibrillas, películas, filamentos, protofibrillas, depósitos de amiloide, placas, u oligómeros intracelulares no nativos dispersos. 12. - Un método para producir proteína desagregada biológicamente activa a partir de agregados de proteína que comprende: (i) proveer un agregado de proteína; (¡i) someter dicho agregado de proteína a una presión incrementada, en comparación con la presión ambiental, y a agitación, en donde dicho agregado de proteínas se disuelve; y (iii) remover la proteína disuelta a partir de la presión incrementada, en donde dicha proteína se repliega de tal manera que se retiene la actividad biológica. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque comprende adicionalmente el paso de agitación de la proteína disuelta para mejorar el replegamiento. 14. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque comprende adicionalmente someter dicho agregado de proteína, antes del replegamiento, a una temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 80°C. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho método no utiliza un agente caotrópico. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicha presión incrementada comprende de aproximadamente 500 atmósferas a aproximadamente 10,000 atmósferas. 17. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque los pasos (ii)-(iii) se llevan a cabo de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 12 horas. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque los pasos (¡i)-(iii) se llevan a cabo en aproximadamente 6 horas. 19. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque los pasos (ii) y (iii) se llevan a cabo en la presencia de un agente caotrópico, y dicho método comprende adicionalmente el paso de remoción de dicho agente caotrópico. 20. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque dicho agente caotrópico es guanidina, sulfato de guanidina, hidrocloruro de guanidina, urea, tiocianato, sarcosil, dodecilsulfato de sodio, u octilsulfato de sodio. 21. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque comprende adicionalmente mezclar dicho agregado de proteína con un agente reductor en una cantidad suficiente para reducir los enlaces disulfuro del mismo. 22. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque comprende adicionalmente dializar dicha mezcla bajo presión, en donde dicho agente reductor se remueve y los enlaces disulfuro se forman de nuevo. 23. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque comprende adicionalmente remover dicho agente reductor mediante diafiltración o ultracentrifugación. 24. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque comprende adicionalmente anular el efecto de dicho agente reductor mediante la adición de un agente oxidante. 25. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho agente reductor es ditiotreitol, glutationa, ditioeritritol, o ß-mercaptoetanol. 26. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicho agregado de proteína comprende cuerpos de inclusión, precipitados solubles e insolubles, oligómeros solubles no nativos, gel, fibrillas, películas, filamentos, protofibrillas, depósitos de amiloide, placas, u oligómeros intracelulares no nativos dispersos. 27. - Un método para producir proteína desagregada biológicamente activa a partir de agregados de proteína que comprende: (i) proveer un agregado de proteína; (ii) someter dicho agregado de proteína a una presión incrementada, en comparación con la presión ambiental, y a una temperatura elevada de aproximadamente 30°C a aproximadamente 125°C, en donde dicho agregado de proteínas se disuelve; y (¡ii) remover la proteína disuelta a partir de la presión incrementada y temperatura elevada, en donde dicha proteína se repliega de tal manera que se retiene la actividad biológica. 28. - El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque dicho método no incluye el uso de un agente caotrópico. 29. - El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque comprende adicionalmente el paso de agitación de dicho agregado de proteína y/o proteína disueita para mejorar la disolución y/o replegamiento. 30.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque comprende adicionalmente mezclar dicho agregado de proteína con un agente reductor en una cantidad suficiente para reducir los enlaces disulfuro del mismo. 31 - El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque comprende adicionalmente dializar dicha mezcla bajo presión, en donde dicho agente reductor se remueve y los enlaces disulfuro se forman de nuevo. 32. - El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque comprende adicionalmente remover dicho agente reductor mediante diafiltración o ultracentrifugación. 33. - El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque comprende adicionalmente anular el efecto de dicho agente reductor mediante la adición de un agente oxidante. 34. - El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicho agente reductor es ditiotreitol, glutationa, ditioeritritol, o ß-mercaptoetanol. 35. - El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque dicha presión incrementada comprende de aproximadamente 500 atmósferas a aproximadamente 10,000 atmósferas. 36. - El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque los pasos (ii)-(iii) se llevan a cabo de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 12 horas. 37.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque los pasos (ii)-(iii) se llevan a cabo en aproximadamente 6 horas. 38. - El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque dicho agregado de proteína comprende cuerpos de inclusión, precipitados solubles e insolubles, oligómeros solubles no nativos, gel, fibrillas, películas, filamentos, protofibrillas, depósitos de amiloide, placas, u oligómeros intracelulares no nativos dispersos. 39. - El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque los pasos (ii) y (iii) se llevan a cabo en la presencia de un agente caotrópico, y dicho método comprende adicionalmente el paso de remoción de dicho agente caotrópico. 40. - El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque dicho agente caotrópico es guanidina, sulfato de guanidina, hidrocloruro de guanidina, urea, tiocianato, sarcosil, dodecilsulfato de sodio, u octilsulfato de sodio. 41.- Un método para producir una proteína desagregada biológicamente activa a partir de agregados de proteína que comprende: (i) proveer un agregado de proteína; (ii) mezclar dicho agregado de proteína con un agente reductor en una cantidad suficiente para reducir los enlaces disulfuro en el mismo; (iii) someter la mezcla del paso (ii) a una presión incrementada, en comparación con la presión ambiental, y a una temperatura elevada de aproximadamente 30°C a aproximadamente 125°C, y a agitación, en donde dicho agregado de proteína se disuelve; (iv) remover o neutralizar dicho agente reductor, en donde los enlaces disulfuro se forman de nuevo; y (v) remover la proteína disuelta a partir de la presión incrementada y temperatura elevada, en donde dicha proteína se repliega de tal manera que se retiene la actividad biológica. 42.- El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque dicho método no incluye el uso de un agente caotrópico. 43.- El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque comprende adicionalmente dializar dicha mezcla bajo presión, en donde dicho agente reductor se remueve y los enlaces disulfuro se forman de nuevo. 44. - El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque comprende adicionalmente remover dicho agente reductor mediante diafiltración o ultracentrifugación. 45. - El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque comprende adicionalmente anular el efecto de dicho agente reductor mediante la adición de un agente oxidante. 46. - El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque dicho agente reductor es ditiotreitol, glutationa, ditioeritritol, o ß-mercaptoetanol. 47.- El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque dicha presión incrementada comprende de aproximadamente 500 atmósferas a aproximadamente 10,000 atmósferas. 48. - El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque los pasos (íi)-(iii) se llevan a cabo de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 12 horas. 49. - El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado además porque los pasos (ii)-(iii) se llevan a cabo en aproximadamente 6 horas. 50 - El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque dicho agregado de proteína comprende cuerpos de inclusión, precipitados solubles e insolubles, oligómeros solubles no nativos, gel, fibrillas, películas, filamentos, protofibrillas, depósitos de amiloide, placas, u oligómeros intracelulares no nativos dispersos. 51.- El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque los pasos (ii) y (iii) se llevan a cabo en la presencia de un agente caotrópico, y dicho método comprende adicionalmente el paso de remoción de dicho agente caotrópico. 52.- El método de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque dicho agente caotrópico es guanidina, sulfato de guanidina, hidrocloruro de guanidina, urea, tiocianato, sarcosil, dodecilsulfato de sodio, u octilsulfato de sodio. 53. - Un método para producir una proteína desagregada biológicamente activa a partir de agregados de proteína que comprende: (i) proveer un agregado de proteína; (¡i) someter dicho agregado de proteína a una primera presión incrementada, en comparación con la presión ambiental, en donde dicho agregado de proteína se disuelve; (¡ii) someter la proteína disuelta a una segunda presión que es menor que dicha primera presión incrementada, pero que aún así es una presión incrementada en comparación con la presión ambiental, y (iv) remover la proteína disuelta a partir de dicha segunda presión incrementada, en donde dicha proteína se repliega de tal manera que se retiene la actividad biológica. 54. - El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque dicha primera presión incrementada es de aproximadamente 200 MPa a aproximadamente 1000 MPa. 55. - El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque dicha segunda presión incrementada es de aproximadamente 100 Pa. 56. - El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque comprende adicionalmente la agitación de la proteína bajo presión. 57. - El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque comprende adicionalmente someter dicha proteína a temperatura elevada. 58. - El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado además porque dicha temperatura elevada es de aproximadamente 30°C a aproximadamente 125°C. 59. - El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque comprende adicionalmente mezclar el agregado de proteína, antes de incrementar la presión, con un agente reductor. 60. - El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque comprende adicionalmente dializar dicha mezcla bajo presión, en donde dicho agente reductor se remueve y los enlaces disulfuro se forman de nuevo. 61. - El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque comprende adicionalmente remover dicho agente reductor mediante diafiltración o ultracentrifugación. 62. - El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque comprende adicionalmente anular el efecto de dicho agente reductor mediante la adición de un agente oxidante. 63. - El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque dicho agente reductor es ditiotreitol, glutationa, ditioeritritol, o ß-mercaptoetanol. 64. - El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque el agregado de proteína se somete a presión a concentración elevada. 65. - El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado además porque la concentración elevada es de 5 a 20 mg/ml. 66. - El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado además porque la concentración elevada es de aproximadamente 10 mg/ml. 67. - El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado además porque dicho agregado de proteína se diluye bajo presión. 68. - El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado además porque dicho agregado de proteína se diluye a aproximadamente 1 mg/ml. 69. - El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque los pasos (ii)-(iv) se llevan a cabo de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 12 horas. 70. - El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque los pasos (ii)-(iv) se llevan a cabo en aproximadamente 6 horas. 71. - El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque no se utiliza agente caotrópico. 72. - El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque los pasos (ii)-(iv) se llevan a cabo en la presencia de un agente caotrópico, y dicho método comprende adicionalmente el paso de remoción de dicho agente caotrópico. 73.- El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado además porque dicho agente caotrópico es guanidina, sulfato de guanidina, hidrocloruro de guanidina, urea, tiocianato, sarcosil, dodecilsulfato de sodio, u octilsulfato de sodio. 74. - El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado además porque dicho agregado de proteína comprende multímeros de proteína. 75. - El método de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado además porque dichos multímeros son hetero-multiméricos. 76. - El método de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado además porque dichos multímeros son homo-multiméricos. 77. - El método de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado además porque dichos multímeros se seleccionan a partir del grupo que consiste de un dímero, un trímero, un tetrámero, un pentámero, un hexámero, un heptámero, un octámero y un nonámero. 78. - El método de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado además porque dichos multímeros se seleccionan a partir del grupo que consiste de interferón-?, hemoglobina, ácido láctico deshidrogenasa, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. 79. - Un método para replegar proteína desnaturalizada que comprende: (i) proveer una composición de proteína desnaturalizada; (¡i) mezclar dicha composición de proteína con un agente reductor en cantidad suficiente para reducir los enlaces disulfuro de la misma; (iii) someter la mezcla del paso (ii) a alta presión, en comparación con la presión ambiental; (iv) dializar la mezcla bajo presión, en donde dicho agente reductor se remueve y los enlaces disulfuro se forma de nuevo; y (v) remover la composición de proteína a partir de la presión incrementada, en donde dicha proteína se repliega de tal manera que se retiene la actividad biológica. 80 - Un método para replegar proteína desnaturalizada que comprende: (i) proveer una composición de proteína; (ii) someter dicha composición de proteína a una presión incrementada, en comparación con la presión ambiental, y a agitación, en donde dicho agregado de proteína se disuelve; y (iii) remover la composición de proteína de la presión incrementada, en donde dicha proteína se repliega de tal manera que se retiene la actividad biológica. 81. - Un método para replegar proteína desnaturalizada que comprende: (i) proveer una composición de proteína; (ii) someter dicha composición de proteína a una presión incrementada, en comparación con la presión ambiental, y a una temperatura elevada de aproximadamente 30°C a aproximadamente 125°C, y (¡ii) remover la proteína disuelta a partir de la presión incrementada y temperatura elevada, en donde dicha proteína se repliega de tal manera que se retiene la actividad biológica. 82. - Un método para replegar proteína desnaturalizada que comprende: (i) proveer una composición de proteína; (¡i) mezclar dicha composición de proteína con un agente reductor en una cantidad suficiente para reducir los enlaces disulfuro en la misma; (iii) someter la mezcla del paso (ii) a una presión incrementada, en comparación con la presión ambiental, a una temperatura elevada de aproximadamente 30°C a aproximadamente 125°C, y a agitación, (iv) remover o neutralizar dicho agente reductor, por medio del cual los enlaces disulfuro se forman de nuevo; y (v) remover la composición de proteína disuelta a partir de la presión incrementada y temperatura elevada, en donde dicha proteína se repliega de tal manera que se retiene la actividad biológica. 83. - Un método para replegar proteína desnaturalizada que comprende: (i) proveer una composición de proteína; (ii) someter dicha composición de proteína a una primera presión incrementada, en comparación con la presión ambiental; (iii) someter dicha composición de proteína a una segunda presión que es menor que dicha primera presión incrementada, pero que aún así es una presión incrementada en comparación con la presión ambiental, y (iv) remover la proteína a partir de dicha segunda presión incrementada, en donde dicha proteína se repliega de tal manera que se retiene la actividad biológica. 84. - Un método para volver a un agregado de proteína susceptible a disolución por caotropos, detergentes y/o temperatura elevada que comprende someter dicho agregado de proteína a alta presión en combinación con uno o más caotropos, detergentes y/o temperatura incrementada. 85. - Un método para seleccionar una composición de proteína para condiciones de replegamiento que comprende: (i) proveer una composición de proteína en muestras por duplicado físicamente distintas; (ii) someter dichas muestras por duplicado a condiciones diferentes que comprenden alta presión y temperatura variable, diversos reguladores de pH, reguladores de diversas concentraciones de sales, diversas concentraciones de proteína, diversas concentraciones de agente reductor, diversos agentes estabilizantes, diversos agentes caotrópicos, diversos detergentes, diversos agentes tensioactivos; y (iii) remover dichas muestras por duplicado a partir de la alta presión; y (iv) evaluar el replegamiento de la proteína. 86. - Un método para inactivar un virus en una muestra que contiene una proteína deseada que comprende: (i) proveer una muestra que contiene dicha proteína deseada, dicha proteína estando en un estado nativo o no nativo; (ii) tratar a dicha muestra para reducir o eliminar las partículas de virus infeccioso de la misma; y (iii) someter dicha muestra a un procedimiento de replegamiento de proteína mediante alta presión. 87. - El método de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado además porque dicha muestra contiene o se sospecha que contiene VIH-1 , VIH-2, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, parvovirus, virus del herpes simplex I y II, virus Epstein Barr, HHV6 y citomegalovirus. 88. - El método de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado además porque dicha muestra es plasma, sangre, productos proteicos derivados de plasma, un producto proteico derivado a partir de células humanas cultivadas, suero, o medio de cultivo celular que contiene suero. 89. - El método de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado además porque dicho procedimiento para replegamiento de proteína con alta presión comprende adicionalmente uno o más de un tratamiento seleccionado a partir del grupo que consiste de temperatura elevada, agente caotrópico, agente solubilizante, agente reductor, agitación y despresurización "en etapas". 90. - Un método para incrementar la vida de anaquel de una muestra de proteína que comprende los pasos de remover agregados de proteína soluble medíante la aplicación de alta presión, seguida por despresurización. 91.- Un método para producir proteína desagregada biológicamente activa a partir de agregados de proteína que comprende: (i) proveer un agregado de proteína; (ii) someter la mezcla del paso (i) a una presión incrementada, en comparación con la presión ambiental, a una temperatura elevada de aproximadamente 30°C a aproximadamente 125°C, y a agitación, en donde dicho agregado de proteína se disuelve; (¡ii) alterar el pH de la mezcla del paso (ii) mediante diálisis; y (iv) remover la proteína disuelta a partir de la presión incrementada y de la temperatura elevada, por medio de la cual dicha proteína se repliega de tal manera que se retiene la actividad biológica.