246055

Vynález se týká zlepšeného způsobu izo-lace aminoacylasy z ledvin savců, zvláštěvepřů.

Je známo, že enzym aminoacylasa se vy-skytuje v nejvyšších koncentracích v led-vinách vepřů, a proto se při popsaných způ-sobech izolace aminoacylasy používá jakosuroviny těchto ledvin.

Podle metody popsané v časopisu J. Biol.Chem.ťl78, 503 (1949) se aminoacylasa izo-luje z kůry vepřových ledvin následujícímzpůsobem: vodný extrakt z kůry vepřovýchledvin se smísí se 78% ethanolem tak, abykonečná koncentrace ethanolu byla 15%,směs se nechá stát 12 hodin při —6 °C, pakse odstředí a množství ethanolu v super-natantu se upraví na obsah 30 %. Kapalinase okyselí na pH 6,3 a směs se nechá státdalších 12 hodin při —15 °C. Vyloučená lát-ka se odcentrifiguje, pH supernatantu seupraví na hodnotu 5,1 a směs se opět nechástát 12 hodin. Vyloučená sraženina, kteráobsahuje aminoacylasu, se izoluje odstředě-ním. Specifická aktivita získaného produktuje asi čtyřnásobně vyšší než aktivita výcho-zího extraktu, což odpovídá velmi nízkémustupni čištění. V časopisu J. Biol. Chem. 194, 455 (1952)je pro izolaci aminoacylasy z vodného ex-traktu vepřových ledvin popsána série ope-rací sestávající ze šesti frakcionačníchstupňů a následujícího lyofilizačního' stup-ně. Touto metodou lze připravit žádaný en-zym asi ve třicetinásobném stupni čistoty(to je ještě v relativně nízkém stupni), při-čemž je tento způsob mnohem pracnější nežshora uvedená první metoda. Specifická ak-tivita lyofilizovaného produktu jest pouze4 640 jednotek/mg.

Aminoacylasu lze izolovat ve velmi čistémstavu, o specifické aktivitě 15 686 jednotek//mg, z vodného extraktu z vepřových ledvinmetodou zveřejněnou v časopisu Biochem.Z. 336, 162 (1962). Nevýhodou této metodyvšak je, že se skládá z devíti zdlouhavých,časově náročných a pracných separačnícha čisticích stupňů. Při metodě popsané v časopisu Biochi-miya 22, 838 (1957) se jako výchozí látkyk izolaci aminoacylasy používá acetonové-ho odparku získaného extrakcí vepřovýchledvin. Rozmělněný acetonový odparek seextrahuje fosfátovým pufrem, extrakt senasytí ve dvou stupních síranem amonnýma získaná suspenze se dialyzuje. Roztokzískaný po dialyse se zahřívá 5 minut na60 C'C a pak se frakcionuje ve dvou stupníchnasycených roztokem síranu amonného. Zís-kaná sraženina se rozpustí ve vodě, roztokse opět dialysuje a pak se frakcionuje vedvou stupních acetonem. Sraženina získanáv posledním frakcionačním stupni se roz-pustí ve vodě, roztok se dialysuje proti desti-lované vodě a pak se lyofilisuje. Touto me-todou, skádající se ze 12 operací, lze zís-kat produkt o specifické aktivitě asi 15 000jednotek/mg.

Jak je zřejmé ze shora uvedeného popisu,společnou nevýhodou známých metod je, žeposkytují žádaný enzym v nízké nebo* střed-ní čistotě, a příprava přiměřeně čistého pro-duktu vyžaduje komplexní série operací,skládající se z 9 až 12 čisticích stupňů. Předložený vynález je zaměřen na odstra-nění zmíněných nevýhod známých metod.Nový způsob izolace aminoacylasy podle vy-nálezu se skládá jen z několika málo čisti-cích operací, které lze snadno provádět, aposkytuje žádanou aminoacylasu o< vysokéspecifické aktivitě.

Podstata vynálezu spočívá v poznatku,že když se vodný extrakt z vepřových led-vin podrobí působení tepla, pak se odstředí,supernatant se nasytí solí jednomocnéhokationtu s minerální kyselinou, sraženinaze vzniklé suspenze se oddělí, rozpustí vevodě, roztok se dialysuje proti vodě a en-zym se z dialyzovaného roztoku izoluje,získá se práškovitá aminoacylasa o speci-fické aktivitě asi 3 000 až 3 600 jednotek/mg,která se dá používat přímo, bez dalšího čiš-tění, při výrobě preparátů s Imobilizovanouaminoacylasou. Podrobí-li se však shora po-psaným způsobem získaný práškovitý enzymdvěma dalším chromatografickým čisticímstupňům, získá se velmi čistá aminoacylasao specifické aktivitě asi 15 000 jednotek/mg.Uvedeným způsobem, který se skládá pou-ze ze tří separačních a dvou čisticích stup-ňů, se získá žádaný enzym aminoacylasa vmimořádně čistém stavu. Bylo* rovněž zjiš-těno, že shora popsaným způsobem lze izo-lovat velmi čistou aminoacylasu ve vynika-jících výtěžcích z ledvin jiných savců (jakonapříklad z koňských, hovězích nebo králi-čích ledvin), které obsahují zmíněný en-zym v mnohem nižších koncentracích a do-provázený mnohem větším podílem balast-ních bílkovin než vepřové ledviny.

Vynález se podle shora uvedeného týkázlepšeného způsobu izolace enzymu amino-acylasy z ledvin savců. Podle vynálezu sepři izolaci enzymu postupuje tím způsobem,že se vodný extrakt z ledvin, připravený osobě známým způsobem, zahřívá při 60 až80 °C po dobu 5 až 12 minut. Teplem zpra-covaná směs se odstředí, k supernatantuse přidá 200 až 300 g/litr amonné soli, vý-hodně síranu amonného’. Vzniklá suspenzese odstředí, oddělená sraženina se rozpustíve vodě. Roztok se dialysuje proti vodě apopřípadě se podrobí dialysovaný roztoknebo roztok enzymu izolovaného z dialysá-tu v pufru o pH 6,5 až 8,5, chromatografiina anexu. Dále se popřípadě podrobí aktiv-ní frakce získané z chromatografickéhostupně, nebo roztok enzymu vysráženého zaktivních frakcí amonnou solí v pufru ,o pH6,0 až 8,0, gelové chromatografii na gelo-vém filtru, jehož horní hranice frakciono-vaných molekulárních hmotností je vyššínež 70 000. Enzym se z aktivních frakcí vy-sráží amonnou solí. 246055 V prvním stupni způsobu podle vynálezuse vcdný extrakt z ledvin zahřívá na 60 až80 °C po dobu 5 až 15 minut, výhodně na70 "C po dobu 10 minut. Tímto působenímtepia se denaturuje většina bílkovin dopro-vázejících enzym, který se má izolovat. De-naturované bílkoviny se oddělí z vodnéhoroztoku jako sraženina o velké povrchovéploše. Tato sraženina působí rovněž jakočisticí složka, neboť absorbuje většinu ne-čistot, které zůstaly v rozpuštěném stavu.Tím lze vysvětlit, proč stupeň čistoty zís-kaný po šesti separačních stupních podlepostupu popsaného v časopisu J. Biol. Chem.184, 455 [1352) lze porovnat s čistotou pro-duktu získaného způsobem podle vynálezujiž po třech separačních stupních (působe-ní tepla, srážení, dialysa). K vodnému roztoku získanému po odstra-nění denaturovaných bílkovin se za účelemvysrážení surového· enzymu přidá 200 až300 g/litr, výhodně 250 až 280 g/litr, ob-zvláště výhodně 260 až 270 g/litr, amonnésoli. Jako srážecího činidla se výhodně po-užívá síranu amonného, avšak lze rovněžpoužít i jiných solí, jako chloridu amonné-ho, chloridu sodného a podobných. Vzniklásraženina se oddělí, rozpustí ve vodě a vod-ný roztok se o sobě známým způsobem dia-lysuje proti vodě. Z dialysovaného roztoku se může popří-padě izolovat o sobě známým způsobem, ja-ko lyofilisací, sušením za rozprašování, od-pařením a podobně, pevný produkt obsa-hující enzym. Specifická aktivita takto zís-kaného produktu, stanovená při 37 °C, jeasi 3 000 až 3 600 jednotek/mg, což odpoví-dá 20- až 25násobné účinnosti čištění Uve-dený produkt lze používat jako takový, bezjakéhokoliv dalšího čištění, pro různé prů-myslové účely, na příklad pro výrobu pří-pravků obsahujících imobilizovaný enzym. Má-li se shora popsaným způsobem zís-kat s”rový enzym dále čistit, není naprostonutné izolovat enzym z dialysovaného roz-toku v pevné formě. Dialysovaný roztok lzepřímo, popřípadě po úpravě jeho pH, apli-kovat na sloupec anexové pryskyřice. Jakoanexcvé pryskyřice se s výhodou používáSephadexových pryskyřic, jako DEAE-Sepha-dexu A-50. Použije-li se při chromatograflina anexové pryskyřici jako výchozí látkypevného surového enzymu, aplikuje se ten-to produkt na sloupec anexu ve formě roz-toku ve vhodném puf™, na příklad v 0,05molárním vodném pufru fosforečnanu dra-selného (pH = 7,0). Sloupec se ekvilibrujepřed nanesením enzymu stejným pufrem.Icntoměničová kolona se eluuje s výhodou0,05 molárním vodným pufrem fosforečnanudraselného o pH 7,0, obsahujícím rovněžchlorid sodný, výhodně v množství 0,3 moluchloridu sodného na litr roztoku; k uvede-nému účelu však lze použít i roztoků jinýchsolí s příslušnou iontovou silou.

Aktivní frakce eluátu se spojí a popřípa-dě se z nich vysráží pevný produkt obsahu- jící enzym způsobem popsaným výše. Jakosrážecí činidlo se přidává obvykle 200 až300 g, výhodně 250 až 280 g, zvláště výhod-ně 260 až 270 g amonné soli na jeden litrroztoku. Pro tento účel se s výhodou použí-vá síranu amonného. Specifická aktivitavysráženého produktu, stanovená při 37 °C,je 6 000 až 6 600 jednotek/mg, což odpovídá40- až 45násobné účinnosti čištění vzhledemk výchozímu extraktu. Má-li se částečně vyčištěný enzym získa-ný shora popsaným způsobem dále čistit,není absolutně nutné izolovat enzym z aktiv-ních frakcí eluátu v pevné formě. Aktivnífrakce lze na sloupec gelu aplikovat přímo,popřípadě po úpravě jejich pH. Při čištěnígelovou chromatografií se s výhodou po-užívá Sephadexových gelů, jako SephadexuG-200. V tomto čisticím stupni lze však po-užívat pouze takových gelů, jejichž horníhranice frakcionovaných molekulárníchhmotností je vyšší než 70 000. Použije-li sepři gelové chromatografii jako výchozí lát-ky pevného· produktu obsahujícího enzym,aplikuje se tato látka na sloupec gelu veformě roztoku v pufru, jako v 0,05 molárnímvodném pufru fosforečnanu draselného opH 7,0. Sloupec gelu se před aplikací en-zymu ekvilibruje stejným pufrem. Enzym seze sloupce gelu eluuje s výhodou 0,05 mo-lárním vodným pufrem fosforečnanu dra-selného· o pH 7.0; lze však používat i jinýchzředěných vodných pufrů. Aktivní frakceefluentu se spojí a enzym se z roztoku izo-luje vysrážením shora popsaným způsobem.Jako srážecí činidlo se přidává obvykle 200až 300 g, výhodně 250 až 280 g, zvláště vý-hodně 260 až 270 g amonné soli na jedenlitr roztoku. Pro· 'tento účel se s výhodou po-užívá síranu amoného. Specifická aktivitatakto získaného enzymu, stanovená při 37 °C,je asi 15 000 jednotek/mg, to je stupeň čis-toty je vynikající.

Surových, částečně přečištěných a čistýchpevných produktů obsahujících enzym, zís-kaných způsobem podle vynálezu, lze s vý-hodou používat pro přípravu imobilizovanéaminoacylasy. Jak je známo, preparátů s mo-bilizovanou aminoacylasou se široce používápři štěpení DL-aminokyselin.

Způsob podle vynálezu je podrobně ob-jasněn v následujících příkladech provede-ní, které však rozsah vynálezu žádným způ-sobem neomezují. Příklad 1 1 kg přečištěných vepřových ledvin serozmělní a pak zhomogenizuje se 2 litrychladné (+4°CJ destilované vody. Zhomo-genizovaná směs se míchá jednu hodinuv ledové lázni a pak se odstředí. Superna-tant se zahřeje na 60 C,C, udržuje se na tétoteplotě 15 minut, pak se směs ochladí vlázni s ledovou vodou a odstředí. K super-natantu se přidá 280 g síranu amonného, 246055 směs se ponechá stát přes noc a vzniklásuspenze se odstředí. Oddělená sraženinase rozpustí v malém množství chladné (+4°Celsia) destilované vody a roztok se dialy-suje až je prostý solí proti destilované vo-dě. Zdialysovaný roztok se paik zfiltruje afiltrát se lyofilizuje; získá se 4,2 g amino-acylasy. Aktivita: zhydrolyzování 1 000 ^mo-lů N-acetyl-L-methioninu/hodinu/mg bílko-viny. P ř í k 1 a d 2 1 kg přečištěných vepřových ledvin serozmělní a pak zhomogenizuje se 2 litrychladné (+4°C) destilované vody. Zhomo-genizovaná směs se míchá 1 hodinu v ledo-vé lázni a pak se odstředí. Supernatant sezahřeje na 80 °C, udržuje se na této teplotě5 minut, pak se směs ochladí v lázni s le-dovou vodou a odstředí. K supernatantu sepřidá 359 g síranu amonného, směs se po-nechá stát přes noc a vzniklá suspenze seodstředí. Oddělená sraženina se rozpustí vmalém množství chladné (+4°C) destilova-né vody a roztok se dialysuje proti destilo-vané vodě až je prostý solí. Zdialysovanýroztok se zfiltruje a filtrát se lyofilizuje;získá se 1,1 g aminoacylasy. Aktivita: zhyd-rolyzování 800 μΐηοΐύ N-acetyl-l-methioni-nu/hodinu/mg bílkoviny. Příklad 3 8 kg přečištěných vepřových ledvin serozmělní a paik zhomogenizuje se 16 litrychladné (+4qC) destilované vody. Zhomo-genizovaná směs se míchá 1 hodinu v ledo-vé lázni a pak se odstředí. Supernatant sezahřeje na 70 °C, udržuje se na této teplotě10 minut, pak se směs ochladí v lázni s le-dovou vodou a odstředí. K supernatantu sepřidá 2 554 g síranu amonného, směs se ne-chá stát přes noc a vzniklá suspenze seodstředí. Oddělená sraženina se rozpustí vmalém množství chladné (+4°C) destilova-né vody a roztok se dialysuje proti destilo-vané vodě až je prostý solí. Zdialysovanýroztok se zfiltruje a filtrát se lyofilizuje;získá se 7,2 g aminoacylasy. Aktivita: hyd-rolysa 2 735 μΐηοΐύ N-acetyl-L-methioninu zahodinu/mg bílkoviny. Příklad 4 3,6 kg přečištěných hovězích ledvin serozmělní a pak zhomogenizuje se 7,2 litrychladné (+4°C) destilované vody. Zhomo-genizovaná směs se míchá jednu hodinu vledové lázni a pak se odstředí. Supernatantse zahřeje na 70 °C, udržuje se na této tep-lotě 10 minut, pak se směs ochladí v láznis ledovou vodou a odstředí. K supernatantuse přidá 1 234 g síranu amonného, směs senechá stát přes noc a vzniklá suspenze seodstředí. Oddělená sraženina se rozpustí vmalém množství chladné (+4°C) destilova- né vody a roztok se dialysuje proti destilo-vané vodě až je prostý solí. Zdialysovanýroztok se zfiltruje a filtrát se lyofilizuje;získá se 3,4 g aminoacylasy. Aktivita: hydro-lysa 791 (umol N-acetyl-L-methioninu/hodi-nu/mg bílkoviny. Příklad 5 2,5 kg přečištěných koňských ledvin serozmělní a pak zhomogenizuje s 5 litrychladné (+4°'C) destilované vody. Zhomo-genizovaná směs se míchá jednu hodinuv ledové lázni a pak se odstředí. Superna-tant se zahřeje na 70 °C, udržuje se na tétoteplotě 10 minut, pak se směs ochladí v láz-ni s ledovou vodou a odstředí. K superna-tantu se přidá 1 200 g síranu amonného,směs se nechá stát přes noc a vzniklá sus-penze se odstředí. Oddělená sraženina serozpustí v malém množství chladné (+4°C)destilované vody a roztok se dialysuje pro-ti destilované vodě až je prostý solí. Zdia-lysovaný roztok se zfiltruje a filtrát se lyo-filizuje; získá se 3,8 g aminoacylasy. Akti-vita: hydrolysa 319 μΐηοΐύ N-acetyl-L-me-thioninu/hodinu/mg bílkoviny. Příklad 6 K roztoku 3 g aminoacylasy z vepřovýchledvin, připravené způsobem popsaným vpříkladu 3, v 0,05 molárním pufru fosforeč-nanu draselného o pH 7,0 se přidá 50 gDEAE Sephadexu A-50, předem ekvilibrova-ného stejným roztokem pufru. Suspenze semíchá 3 hodiny v lázni s ledovou vodou apak se nechá stát přes noo v ledničce při(-4 °C. Příští den se pryskyřice promyje tře-mi dávkami po 1 litru shora uvedeného puf-ru, pak se rozmíchá v 1 litru stejného puf-ru a suspenze se naplní do trubice o prů-měru 5,3 cm a o výšce 55 cm. Sloupec prys-kyřice se pak vymývá 0,05 molárním puf-rem fosforečnanu draselného (pH = 7,0),který obsahuje 0,3 molu chloridu sodného,průtokovou rychlostí 200 ml/hodinu. Eflu-ent se jímá ve frakcích po 100 ml. Frakce,které vykazují enzymatickou aktivitu, sespojí a k roztoku se přidá 80 g síranu amon-ného; vyloučí se 0,7 g aminoacylasy. Akti-vita: hydrolysa 5 240 μΐηοΐύ N-acetyl-L-me-thioninu/hodinu/mg bílkoviny. Příklad 7 25 ml suspenze enzymu získané způsobempopsaným v příkladu 6, obsahující 57 mgbílkoviny, se odstředí a oddělená sraženinase rozpustí v 9 ml 0,05 molárního pufrufosforečnanu draselného o pH 7,0. Roztokse nanese na horní konec trubice o· průměru 2,4 cm a výšce 43 cm, naplněné gelem Se-phadex G-200, který byl předem ekvilibro-ván stejným pufrem. Sloupec se pak eluujestejným pufrem průtokovou rychlostí 60 ml/