CN109929826A - 一种糜蛋白酶的纯化工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种糜蛋白酶的纯化工艺。碎浆；盐析，过滤；加入硫酸铵至0.4饱和度，冷室中放置过夜；过滤，用50kDa的超滤膜进行超滤；用5‑10kDa的超滤膜进行超滤；滤液加硫酸铵至0.7饱和度，低温放置过夜；过滤，析晶；活化；沉淀；用10kDa的超滤膜进行超滤；SP离子交换柱纯化；用10‑30kDa的超滤膜进行超滤，除菌，即得。使用超滤膜与离子交换柱的结合来纯化糜蛋白酶，纯化效果好，得到的产品纯度高；本发明工艺得到的糜蛋白酶酶活性高，效价大于1500U/mg，可以减少用药量，减少患者医疗支出，也提高了该酶的用药安全性。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药技术中糜蛋白酶领域，特别涉及一种糜蛋白酶的纯化工艺。
背景技术
糜蛋白酶是从牛胰脏或猪胰脏中提取分离纯化得到的一种蛋白酶。它能切断蛋白质肽链中酪氨酸和苯丙氨酸的羧端肽链，故能有效酶解蛋白质，因而具有清创消脓，消化脓汁和去除坏死组织，助长新生肉芽生长的功能。在临床上主要用于抗炎消肿，有报道称其在辅助抗癌方面也具有不错效果。此外，在皮革工业上，糜蛋白酶常用于脱去动物皮上的毛等。目前国内已对该酶做了大量的研究，提取纯化工艺多采用盐析多重结晶结合透析的方法。盐析多重结晶纯化能力弱，耗费时间长；低温激活耗费时间长，激活效率低；透析工艺耗时长，不便于工业化生产；且得到的产品纯度低，杂蛋白多，增加了用药的不良反应； 传统工艺所得产品的酶活性一般在1000-1200单位/毫克左右，产品纯度为80-85%。酶活性低，产品中的杂蛋白增加了过敏反应风险。因此，提高糜蛋白酶的纯度，提高其活性可以提高该酶的用药安全性，是研究人员需关注的问题。
发明内容
为了解决以上糜蛋白酶活性含量低，纯度低的问题，本发明提供了一种活性含量高、纯度高的糜蛋白酶的纯化工艺。本发明是通过以下方式实现的
一种糜蛋白酶的纯化工艺，包括以下步骤
(1)取牛胰，将脂肪、结缔组织除去，绞碎成胰浆；
(2)向胰浆中加入硫酸溶液进行盐析，过滤；
(3)滤液中加入硫酸铵至0.4饱和度，冷室中放置过夜；
(4)过滤，滤液用截留分子量50kDa的超滤膜进行超滤；
(5)滤出液用截留分子量5-10kDa的超滤膜进行超滤；
(6)滤液加硫酸铵至0.7饱和度，低温放置过夜；
(7)过滤，将滤饼溶于冷纯化水中，冷纯化水的体积数为滤饼质量数的3-5倍，加硫酸调pH为2.0，搅拌使溶解，加入饱和硫酸铵溶液，饱和硫酸铵溶液的体积数为滤饼质量数的 2倍，调pH至5.0，250℃，孵育2-5 h，有晶体析出，过滤收集晶体；
(8)晶体用冷纯化水加硫酸溶解，冷纯化水的体积数为晶体质量数的3-5倍，调节pH7.6，加入胰蛋白酶，20℃活化2-4 h ；
(9)调节pH至4.0，加入固体硫酸铵使达0. 7饱和度，过滤收集沉淀；
(10)沉淀用冷纯化水加硫酸溶解，用截留分子量10KDa的超滤膜进行超滤；
(11)将上述超滤脱盐的料液加至已用0.05mol/L NaAC缓冲液平衡好的SP离子交换柱上，用3倍柱体积的含0.2 mol/L NaCl的缓冲液洗柱，用3倍柱体积的含0.4 mol/L NaCl的缓冲液洗脱得洗脱液；
(12)将上述洗脱液用截留分子量10-30kDa的超滤膜进行超滤，除菌，既得。所述的纯化工艺，步骤(3)中滤液中加入硫酸铵至0. 4饱和度，加入硅藻土助滤。
所述的纯化工艺，步骤(7)中用5N NaOH调节pH至5.0，加入的硫酸为5N的硫酸。所述的纯化工艺,步骤(8)中胰蛋白酶加入量为5mg/100g晶体,加入晶体重量1倍的体积的pH7. 6的0. 5 mol/L磷酸盐缓冲液，以5N NaOH调节pH 7. 6。
所述的纯化工艺，步骤(10)中超滤时添加pH 3.0的冷纯化水，至母液电导与0.05mol/L NaAC缓冲液电导相同为止。冷纯化水是指10℃以下的纯化水。本发明的有益效果本发 明的糜蛋白酶的纯化工艺，使用超滤膜与离子交换柱的结合来纯化糜蛋白酶，纯化效果好，得到的产品纯度高，降低了以往因产品中的杂蛋白而导致的过敏反应风险；本发明工艺得到的糜蛋白酶酶活性高，效价大于1500 U/mg，提高了该酶的用药安全性。
具体实施例1
(1)取新鲜牛胰10kg，去除脂肪、结缔组织等，用绞肉机绞碎成胰浆；
(2)加入20L(胰浆体积量的2倍)0.25 N硫酸溶液，于冷室中搅拌提取24h，过滤，滤饼用10 L冷的0. 25 N硫酸同法搅拌提取1h，过滤，合并两次滤液；
(3)滤液搅拌并逐渐加入硫酸铵至0.4饱和度，冷室中低温放置过夜；
(4)过滤，滤液用截留分子量50kDa的超滤膜进行超滤，收集滤出液，
(5)用截留分子量10kDa的超滤膜进行超滤；
(6)滤液加硫酸铵至0.7饱和度，低温放置过夜；
(7)过滤收集滤饼390g，将滤饼溶于冷纯化水中，冷纯化水的体积数为滤饼质量数的5倍，滴加5 N硫酸使pH达2.0，搅拌使溶解，缓慢加入饱和硫酸铵溶液，用5 N NaOH调节pH 至5. 0，于25℃，孵育2-5 h，即有针状晶体析出，过滤收集晶体；
(8)晶体用冷纯化水加硫酸溶解，冷纯化水的体积数为晶体质量数的3倍，加适量5N 硫酸使溶解，加入晶体重量1倍体积量的pH 7.6的0.5 mol/L磷酸盐缓冲液，以5 N NaOH 调节pH 7.6，加入少量胰蛋白酶(5mg/100g晶体)，于室温活化2-4 h ；
(9)激活结束后，用5N硫酸调节pH至4.0，加入固体硫酸铵使达0.7饱和度，过滤收集沉淀；
(10)沉淀用冷纯化水加5N硫酸溶解，于冷室中用截留分子量10kDa的超滤膜进行超滤，不断添加pH 3.0左右的冷纯化水，至母液电导与0.05mol/L NaAC缓冲液电导相同为止;
(11)将上述超滤脱盐的料液加至已用0.05mol/L NaAC缓冲液平衡好的SP离子交换柱上，用3倍柱体积的含0.2 mol/L NaCl的缓冲液洗柱，用3倍柱体积的含0.4 mol/L NaCl的缓冲液洗脱的洗脱液；
(12)将上述洗脱液于冷室中用截留分子量10kDa的超滤膜进行超滤，不断添加pH3.0左右的冷纯化水，至HPLC检测母液中蛋白纯度大于95%。将上述超滤液通过0.22μm的滤膜除菌，冻干得产品65g，所得成品的效价为1536 U/mg。
实施例2
(1)取5kg冷冻的牛胰，将脂肪、结缔组织等去除，绞碎成胰浆；
(2)加入15L (胰浆体积量的3倍)0.25 N硫酸溶液，于冷室中搅拌提取24h，过滤，滤饼再用胰浆体积量1倍的冷的0. 25 N硫酸同法搅拌提取1h，过滤，合并两次滤液；
(3)滤液搅拌并逐渐加入硫酸铵至0.4饱和度，加入硅藻土助滤，冷室中低温放置过夜；
(4)过滤，滤液用截留分子量50kDa的超滤膜进行超滤；
(5)滤出液用截留分子量10kDa的超滤膜进行超滤；
(6)滤液加硫酸铵至0.7饱和度，低温放置过夜，次日过滤；
(7)过滤收集滤饼186g，将滤饼溶于冷纯化水中，冷纯化水的体积数为滤饼质量数的3倍，滴加5 N硫酸使pH达2.0，搅拌使溶解，缓慢加入饱和硫酸铵溶液，饱和硫酸铵溶液的体积数为滤饼质量数的2倍，用5N NaOH调节pH至5.0，于250℃，孵育2-5 h，即有针状晶体析出，过滤收集晶体；
(8)晶体用冷纯化水加硫酸溶解，冷纯化水的体积数为晶体质量数的3倍，加入晶体重量1倍体积量的pH 7. 6的0.5mol/L磷酸盐缓冲液，以5N NaOH调节pH 7. 6，加入少量胰蛋白酶(5mg/100g晶体)，于室温20℃活化2-4 h ；
(9)激活结束后，用5N硫酸调节pH至4.0，加入固体硫酸铵使达0.7饱和度，过滤收集沉淀；
(10)上述沉淀用冷纯化水加5N硫酸溶解，于冷室中用截留分子量10kDa的超滤膜进行超滤，不断添加pH 3.0左右的冷纯化水，至母液电导与0.05mol/L NaAC缓冲液电导相同为止；
(11)将上述超滤脱盐的料液加至已用0.05mol/L NaAC缓冲液平衡好的SP离子交换柱上，用3倍柱体积的含0.2mol/L NaCl的缓冲液洗柱，用3倍柱体积的含0.4mol/L NaCl的缓冲液洗脱得洗脱液；
(12)将上述洗脱液于冷室中用截留分子量30kDa的超滤膜进行超滤，不断添加pH3.0左右的冷纯化水，至HPLC检测母液中蛋白纯度大于95%为止，将上述超滤液通过O. 22 μ m 的滤膜除菌，冻干得产品32g，所得成品的效价为1525U/mg。
对比实施例
(I)取5kg冷冻的牛胰，去除脂肪、结缔组织，绞碎成胰浆；
(2)加入10L 0.25 N硫酸溶液，于冷室中搅拌提取24h，过滤，滤饼再用胰浆体积量1倍的冷的0.25 N硫酸同法搅拌提取1h，过滤，合并两次滤液；
(3)滤液搅拌并逐渐加入硫酸铵至0.4饱和度，加入少量硅藻土助滤，冷室中低温放置过夜；
(4)过滤收集滤液，滤液加硫酸铵至0.7饱和度，低温放置过夜，次日过滤收集滤饼；
(5)将滤饼溶于冷纯化水中，冷纯化水的体积数为滤饼质量数的3倍，滴加5N硫酸使 pH达2.0，搅拌使溶解，缓慢加饱和硫酸铵溶液，饱和硫酸铵溶液的体积数为滤饼质量数的 2倍，用5N NaOH调节pH至5. 0，于25℃，孵育48 h，过滤收集晶体；
(6)再按上述步骤重复结晶五次，过滤收集糜蛋白酶糜原结晶。
(7)晶体用冷纯化水加硫酸溶解，冷纯化水的体积数为晶体质量数的3倍，加入晶体重量1倍体积量的pH 7. 6的0. 5mol/L磷酸盐缓冲液，以5N NaOH调节pH 7. 6，加入少量胰蛋白酶(5mg/100g晶体)，于室温5℃活化48 h ；
(9)激活结束后，用5N硫酸调节pH至4.0，加入固体硫酸铵使达0.7饱和度，过滤收集盐析品；
(10)加入上述滤饼重量1.3倍量的纯化水溶解，装入透析袋中，置于5℃冷水中透析48-72h，过滤取清液，冻干的成品45g，效价为1250 U/mg，产品纯度84. 1%。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (5)
1.一种糜蛋白酶的纯化工艺，其特征在于所述方法包括以下步骤：(1)取牛胰，将脂肪、结缔组织除去，绞碎成胰浆；(2)向胰浆中加入硫酸溶液进行盐析，过滤；(3)滤液中加入硫酸铵至0.4饱和度，冷室中放置过夜；(4)过滤，滤液用截留分子量50kDa的超滤膜进行超滤；(5)滤出液用截留分子量5-10kDa的超滤膜进行超滤；(6)滤液加硫酸铵至0.7饱和度，低温放置过夜；(7)过滤，将滤饼溶于冷纯化水中，冷纯化水的体积数为滤饼质量数的3-5倍，加硫酸调pH为2.0，搅拌使溶解，加入饱和硫酸铵溶液，饱和硫酸铵溶液的体积数为滤饼质量数的 2倍，调pH至5.0，250℃，孵育2-5 h，有晶体析出，过滤收集晶体；(8)晶体用冷纯化水加硫酸溶解，冷纯化水的体积数为晶体质量数的3-5倍，调节pH 7. 6，加入胰蛋白酶，20℃活化2-4 h ；(9)调节pH至4.0，加入固体硫酸铵使达0.7饱和度，过滤收集沉淀；(10)沉淀用冷纯化水加硫酸溶解，用截留分子量10kDa的超滤膜进行超滤；(11)将上述超滤脱盐的料液加至已用0.05mol/L NaAC缓冲液平衡好的SP离子交换柱上，用3倍柱体积的含0.2 mol/LNaCl的缓冲液洗柱，用3倍柱体积的含0.4 mol/L NaCl的缓冲液洗脱得洗脱液；(12)将上述洗脱液用截留分子量10-30kDa的超滤膜进行超滤，除菌，既得。
2.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于步骤(3)中滤液中加入硫酸铵至0.4 饱和度，加入硅藻土助滤。
3.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于步骤(7)中用5N NaOH调节pH至5.0， 加入的硫酸为5N的硫酸。
4.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于步骤(8)中胰蛋白酶加入量为 5mg/100g晶体，加入晶体重量1倍的体积的pH 7.6的0.5 mol/L磷酸盐缓冲液，以5N NaOH 调节pH 7.6。
5.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于步骤(10)中超滤时添加pH3.0的冷纯化水，至母液电导与0.05mol/L NaAC缓冲液电导相同为止。
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| CN111117989A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-05-08 | 江西浩然生物制药有限公司 | 一种从动物胰脏中提取三种酶的工艺方法 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190625 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |