CN104531651A - 一种高效价胰蛋白酶 - Google Patents

Abstract

本发明阐述一种高效价的胰蛋白酶的制备方法，其步骤如下：（1）原料绞碎，抽提酶原；（2）分级盐溶、盐析，得胰蛋白酶粗品；（3）粗品投料，多重结晶；（4）活化；（5）结晶；（6）透析；（7）冻干。本发明建立起一套规模化的生产工艺，具有简单、低成本等优点，制备的胰蛋白酶精品效价达2500单位/毫克以上，符合《中国药典》（2010版）要求，具有极大的市场竞争力。

Description

一种高效价胰蛋白酶

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及药用胰蛋白酶的分离纯化技术。具体地说是采用盐析、多重结晶结合透析等技术来提取胰蛋白酶。

背景技术

胰蛋白酶是从牛胰腺或猪胰腺中分离纯化得到的一种蛋白酶。它主要的功用有：能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用。临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。喷雾吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治疗毒蛇咬伤。还常用于动物细胞培养前对组织的处理。

糜蛋白酶和胰蛋白酶都是典型的丝氨酸蛋白酶，二者的性质极为相似，不易分开，但是对蛋白质的专一性却各异。胰蛋白酶至作用于碱性氨基酸L-精氨酸或赖氨酸的所及所构成的C-末端肽键，而糜蛋白酶则选择性地水解由芳族或脂族氨基酸（如苯丙氨酸、络氨酸）所组成的肽键。胰蛋白酶能选择性地水解蛋白质中赖氨酸或精氨酸的羧基端肽键，能消化溶解变性蛋白质，对未变性的蛋白质无作用，因此，对活细胞的蛋白质以及有活性的消化酶不起作用。

目前市场上都在致力于高纯度蛋白的开发和应用，来替代普通的低纯度产品，以克服普通低纯度产品中的杂蛋白造成的过敏反应。用传统的方法仅提取胰蛋白酶是相当困难的。2006年7月上海阿敏制药有限公司公开了一种糜胰蛋白酶的制备方法（200610023582.0），其采用低温酸提、梯度盐析、冰水透析、亲和层析、乙醇醇析的产品工艺，得到糜胰蛋白酶。2011年1月马忠仁等申请了一种提取糜胰蛋白酶的方法（200910170682.X），其采用了CaCl2激活糜胰蛋白酶原成为糜胰蛋白酶的同时加入饱和度的（NH4）2SO4，使其生成硫酸钙沉淀吸附糜胰蛋白酶，经过洗脱、盐析、超滤和冻干获得白色的糜胰蛋白酶的冻干粉末。产品均为糜胰蛋白酶，没有单纯的胰蛋白酶提取分离纯化。

发明内容

本发明的目的就是为了生产高效价的胰蛋白酶而又降低生产成本，对传统工艺加以改造，尤其是参数的改造，生产了一种高效价的胰蛋白酶。

本发明的技术方案是：利用硫酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后根据等电点沉淀的原理，调节pH，硫酸铵分级盐溶、盐析将胰蛋白酶原等沉淀析出，再将胰蛋白酶粗品溶解后，经盐溶、盐析，再用活性胰蛋白酶激活，被激活的酶溶液再经结晶透析、冻干的方法，即可得较高纯度的胰蛋白酶，包括如下步骤：

1、胰蛋白酶粗制生产操作：

（1）提取工序：将新鲜的胰脏绞碎成胰浆，称重。按每千克胰浆加入2~3L的0.1~0.2mol/L硫酸溶液，浸渍20~28小时，将浸渍物置滤袋过滤，滤干后弃去滤渣，留取滤液；

（2）盐溶工序：浸渍液中加入硫酸铵，达到30~50%饱和度，静置10~16小时，过滤，留取滤液；

（3）盐析工序：滤液中加入硫酸铵，达到50~80%饱和度，静置10~16小时，过滤，留取滤饼；

（4）每克滤饼加入2~5ml的水溶解，重复上述（2）、（3）操作；

（5）每克滤饼用1~3ml的水溶解，然后每克滤饼中加入0.1~1ml的饱和硫酸铵溶液，调节pH至4.0~6.0；

（6）结晶工序：溶液在20~30℃温度中静置24~72小时，有针状糜蛋白酶结晶析出；离心，调节pH至2.0~5.0，每1000ml溶液中加300~400g固体硫酸铵，达到50~80%饱和度，静置12~16小时，抽滤；

（7）干燥工序：取沉淀物，干燥，即得胰蛋白酶粗品。

2、胰蛋白酶精制生产操作：

（1）投料：称取胰蛋白酶粗品，按每克胰蛋白酶粗品加2～4ml的水搅拌溶解，调节pH至3.0±0.5，以助其溶解，搅拌10～16小时；计量溶液体积，按400～500g/L比例加入固体硫酸铵，待其溶解后，静置沉淀10～16小时；

（2）盐溶：将溶液过滤，称量滤饼重量，先按每克滤饼加入2~4ml的水，搅拌溶解后，调节pH至3.0±0.4，再按每克滤饼加入1～3ml的饱和硫酸铵溶液静止沉淀10～16小时；

（3）盐析：将溶液过滤，量取滤液体积，加入等体积量的饱和硫酸铵溶液，静置沉淀10～16小时；

（4）洗镁：将上清液弃去，沉淀物真空抽滤，并在滤饼上加入饱和硫酸镁溶液，静置1分钟，抽滤，待滤液开始流出，将漏斗上剩余的硫酸镁溶液倾去，将滤饼取出称重，待活化；

（5）活化：称滤饼重量为A千克，将滤饼溶于3A～5A升的0.001～0.01mol/L盐酸溶液，另加入0.5～2mol/L氯化钙溶液A～3A升及pH7.5～8.5硼酸缓冲液4A～6A升，再加入6A～9A升的水，调节pH至7.0～8.0，最后每克滤饼加5～15mg的结晶胰蛋白酶进行活化，将溶液置0～10℃中静置60～80小时进行活化， pH控制在7.0～8.0；

（6）除钙：活化后的溶液，调节pH至3.0±0.4，再按200～300g/L加入固体硫酸铵，搅拌溶解，在0～10℃中存放32～60小时使硫酸钙沉淀，过滤，滤液按150～250g/L加入固体硫酸铵，在0～10℃中静置10～14小时，过滤，得滤饼；

（7）结晶：按每克滤饼加入1～2mlpH8.0～10.0硼酸缓冲液，调节pH至8.0±0.4，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，0～10℃时浸于外透液中，结晶3～7天；

（8）透析：取出结晶液过滤得结晶物，再按每克结晶物加入1～3ml水溶解，调节pH至3.0±0.5；将溶液透析2～4天，去除杂质，每10～14小时左右透析池换水一次，温度控制在0～10℃；

（9）冻干：取出透析液，加入少量硅藻土，抽滤，得滤液，调节pH至6.0±0.4，进冻干机冻干后得结晶胰蛋白酶成品。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

本发明采用盐析、多重结晶结合透析等技术来提取胰蛋白酶，通过对传统工艺的改进和创新，不仅生产出了高质量的胰蛋白酶，同时又具有简单、低成本等优点。

本发明已建立起一套规模化的生产工艺，制备的胰蛋白酶精品效价高达2500单位/毫克以上，符合《中国药典》（2010版）要求，具有极大的市场竞争力。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

1、胰蛋白酶粗制生产操作：

1.提取工序：

1.1新鲜的胰脏，用镊子和剪刀将脂肪结缔组织等除去，置绞碎机中绞碎，称重15Kg；

1.2绞碎物置塑料桶中，用0.125mol/L硫酸溶液30L浸渍24小时，在浸渍期中每小时搅拌1次；

1.3将浸渍物置滤袋过滤，滤渣再用0.125mol/L硫酸溶液15L浸渍1小时，滤干后弃去滤渣；

2.盐溶、盐析工序：

2.1将两次浸渍液合并，体积为44.9L，置塑料桶中，每1000ml溶液中加入固体硫酸铵242g，达到40%饱和度，共加10.866Kg固体硫酸铵，静置12小时；

2.2过滤，留取过滤液，滤液体积为44L，固体弃去；

2.3在每1000ml清液中加入固体硫酸铵205g，达到70%饱和度，共用硫酸铵9.020kg，静置12小时；

2.4过滤，留取滤饼，称重269.2g，弃滤液；

2.5用807.6ml水溶解，再按2.1、2.2、2.3、2.4步骤分次加固体硫酸铵近40%和70%饱和度沉淀；

2.6取70%饱和度沉淀物，称重178.5g，用267.8ml水溶解，加入89.3ml饱和硫酸铵溶液，并用5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至5.00；

2.7将溶液静置25℃恒温箱中48小时，有针状的糜蛋白酶粗品结晶析出；

2.8过滤，母液用0.25mol/L硫酸调节pH至3.0，其体积为328.4ml加入硫酸铵100.8g，静置12小时；

3.干燥工序：

取沉淀物，置真空干燥箱内干燥，即得胰蛋白酶粗品，称重100.0g，即每千克胰脏可得6.67克胰蛋白酶.

2、胰蛋白酶精制生产操作：

1.投料

1.1称取胰蛋白酶粗品100.0g，先用300ml纯化水搅拌溶解，加2.5mol/L硫酸溶液调节pH至3.0，以助其溶解，搅拌12小时；

1.2计量溶液体积298.4ml，加入固体硫酸铵140.9g，待其溶解后，静置沉淀12小时；

1.3将溶液真空过滤，称量滤饼重量96.6g，加纯化水289.9ml，搅拌溶解后加2.5mol/L硫酸溶液调节pH至3.0，加入饱和硫酸铵溶液193.2ml，静止沉淀12小时；

1.4将溶液过滤，量取滤液体积479.3ml，加入饱和硫酸铵溶液479.3ml，静置沉淀12小时；

1.5洗镁：将上清液弃去，沉淀物真空抽滤，并在滤饼上加入饱和硫酸镁溶液，静置1分钟，抽滤，待滤液开始流出，将漏斗上剩余的硫酸镁溶液倾去，将滤饼取出称重93.3g，待活化；

2.活化

将滤饼溶于373.2ml0.005mol/L盐酸溶液，另加入1mol/L氯化钙溶液186.6ml及pH8.0硼酸缓冲液466.5ml，再加入746.4ml纯化水，调节pH至7.4，最后加933mg活力较高的结晶胰蛋白酶进行活化处理，将溶液在5～10℃中静置72小时进行活化，第二天测pH值为7.4；

3.除钙

活化后的溶液用2.5mol/L硫酸溶液调节pH至3.1，溶液体积为1873ml，再加入固体硫酸铵455.2g，搅拌溶解，在0～10℃中存放48小时使硫酸钙沉淀，过滤，滤液加入固体硫酸铵369.0g，在 0～10℃静置12小时，过滤，得滤饼重量45.6g；

4.结晶

滤饼加入pH9.0硼酸缓冲液68.4ml，用2.5mol/L硫酸溶液调节pH至8.0，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，5～10℃浸于外透液中，结晶5天，每2小时摇包一次；

5.透析

取出结晶液过滤得结晶物28.7g，加纯化水43.1ml溶解，用2.5mol/L硫酸调节pH至3.0；将溶液装透析袋，然后挂于透析池中透析3天，去除盐类杂质，每12小时左右透析池换水一次，温度控制在5～10℃；

6.冻干

取出透析液，加入少量硅藻土，用布氏漏斗抽滤，得滤液，用5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.0，进冻干机冻干后得结晶胰蛋白酶成品6.2g，经测定其活性效价为2600iu/mg；

实施例2

1、胰蛋白酶粗制生产操作：

1.提取工序：

1.1新鲜的胰脏，用镊子和剪刀将脂肪结缔组织等除去，置绞碎机中绞碎，称重10Kg；

1.2绞碎物置塑料桶中，用0.150mol/L硫酸溶液25L浸渍24小时，在浸渍期中每小时搅拌1次；

1.3将浸渍物置滤袋过滤，滤渣再用0.150mol/L硫酸溶液12.5L浸渍1小时，滤干后弃去滤渣；

2.盐溶、盐析工序：

2.1将两次浸渍液合并，体积为37.4L，置塑料桶中，每1000ml溶液中加入固体硫酸铵225g，达到35%饱和度，共加8.415Kg固体硫酸铵，静置12小时；

2.2过滤，留取过滤液，滤液体积为36.8L，固体弃去；

2.3在每1000ml清液中加入固体硫酸铵186g，达到65%饱和度，共用硫酸铵6.845kg，静置12小时；

2.4过滤，留取滤饼，称重180.2g，弃滤液；

2.5用720.8ml水溶解，再按2.1、2.2、2.3、2.4步骤分次加固体硫酸铵近35%和65%饱和度沉淀；

2.6取65%饱和度沉淀物，称重90.5g，用181ml水溶解，加入54.3ml饱和硫酸铵溶液，并用5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至5.10；

2.7将溶液静置25℃恒温箱中48小时，有针状的糜蛋白酶粗品结晶析出；

2.8过滤，母液用0.25mol/L硫酸调节pH至2.9，其体积为234.7ml加入硫酸铵82.1g，静置15小时；

3.干燥工序：

取沉淀物，置真空干燥箱内干燥，即得胰蛋白酶粗品，称重60.9g，即每千克胰脏可得6.09克胰蛋白酶

2、胰蛋白酶精制生产操作：

1.投料

1.1称取胰蛋白酶粗品60.9g，先用152.25ml纯化水搅拌溶解，加3.0mol/L硫酸溶液调节pH至3.1，以助其溶解，搅拌12小时；

1.2计量溶液体积160.3ml，加入固体硫酸铵64.1g，待其溶解后，静置沉淀12小时；

1.3将溶液真空过滤，称量滤饼重量50.1g，加纯化水21.1ml，搅拌溶解后加2.5mol/L硫酸溶液调节pH至3.2，加入饱和硫酸铵溶液15.8ml，静止沉淀12小时；

1.4将溶液过滤，量取滤液体积36.5ml，加入饱和硫酸铵溶液36.5ml，静置沉淀15小时；

1.5洗镁：将上清液弃去，沉淀物真空抽滤，并在滤饼上加入饱和硫酸镁溶液，静置1分钟，抽滤，待滤液开始流出，将漏斗上剩余的硫酸镁溶液倾去，将滤饼取出称重48.2g，待活化；

2.活化

将滤饼溶于241.0ml0.01mol/L盐酸溶液，另加入1.5mol/L氯化钙溶液96.4ml及pH8.5硼酸缓冲液192.8ml，再加入337.4ml纯化水，调节pH至7.5，最后加480mg活力较高的结晶胰蛋白酶进行活化处理，将溶液在5～10℃中静置72小时进行活化，第二天测pH值为7.4；

3.除钙

活化后的溶液用3.0mol/L硫酸溶液调节pH至3.2，溶液体积为820ml，再加入固体硫酸铵205.0g，搅拌溶解，在0～10℃中存放54小时使硫酸钙沉淀，过滤，滤液加入固体硫酸铵160.0g，在 0～10℃静置12小时，过滤，得滤饼重量24.0g；

4.结晶

滤饼加入pH9.0硼酸缓冲液48.0ml，用3.0mol/L硫酸溶液调节pH至8.1，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，5～10℃浸于外透液中，结晶5天，每2小时摇包一次；

5.透析

取出结晶液过滤得结晶物15.1g，加纯化水30.2ml溶解，用3.0mol/L硫酸溶液调节pH至2.9；将溶液装透析袋，然后挂于透析池中透析3天，去除盐类杂质，每12小时左右透析池换水一次，温度控制在5～10℃；

6.冻干

取出透析液，加入少量硅藻土，用布氏漏斗抽滤，得滤液，用5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.2，进冻干机冻干后得结晶胰蛋白酶成品3.8g，经测定其活性效价为2590iu/mg；

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种高效价胰蛋白酶，其特征在于是由以下方法制备而成：（1）原料绞碎，抽提酶原；（2）分级盐溶、盐析；（3）结晶，得胰蛋白酶粗品；（4）粗品投料，多重结晶；（5）活化；（6）结晶；（7）透析；（8）冻干。

2.根据权利要求1所述，其特征在于，各步骤具体为：

（1）提取：将动物的胰脏绞碎成胰浆，用硫酸溶液浸渍，过滤，留取滤液；

（2）盐溶、盐析：滤液中加入硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达到30-50%，静置，过滤，留取滤液；滤液中加入硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达到50-80%，静置，过滤，留取滤饼；所得滤饼加水溶解，加入饱和硫酸铵溶液，调节pH值至4.0-5.5；

（3）结晶：溶液静置至有针状糜蛋白酶结晶析出；离心，调节pH值至2.0-5.0，在溶液中加入固体硫酸铵，抽滤；取沉淀物，干燥，即得胰蛋白酶粗品；

（4）投料：取胰蛋白酶粗品，加水溶解，调节pH，搅拌； 加入硫酸铵，溶解，静置；过滤，滤饼加水，搅拌溶解，调节pH，加入饱和硫酸铵溶液，静置；过滤，滤液中加入饱和硫酸铵溶液，静置；洗镁，待活化；

（5）活化：将滤饼溶于盐酸溶液，加入氯化钙溶液及硼酸缓冲液，再加水，调节pH，最后加入结晶胰蛋白酶进行活化，将溶液静置；

（6）结晶：将活化后的溶液调节pH，加入固体硫酸铵，搅拌溶解，静置，过滤，滤液加入固体硫酸铵，静置，过滤，得滤饼；滤饼中加入硼酸缓冲液，调节pH，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，浸于外透液中；

（7）透析：过滤得结晶物，加水溶解，调节pH；将溶液透析，去除杂质；

（8）冻干：取出透析液，抽滤，得滤液，调节pH，冻干后得结晶胰蛋白酶成品。

3.根据权利要求2所述的一种高效价胰蛋白酶制备工艺，其特征在于，步骤（1）中，所述动物胰脏为新鲜的牛胰脏、新鲜的猪胰脏；硫酸溶液的浓度为0.1~0.2mol/L ；胰浆与硫酸溶液的重量比为1：2~1：3；浸渍时间是20~28小时。

4.根据权利要求2所述的一种高效价胰蛋白酶制备工艺，其特征在于，所述步骤（2）中，水与滤饼的重量比为1：1~3：1；调节pH值至4.0~6.0；加入的饱和硫酸铵溶液与滤饼的重量比为1：10~1：1。

5.根据权利要求2所述的一种高效价胰蛋白酶制备工艺，其特征在于，所述步骤（3）中溶解静置环境温度为20~30℃；调节pH值至2.0~5.0；每1000ml溶液中加入固体硫酸铵的重量为300~400g。

6.根据权利要求2所述的一种高效价胰蛋白酶制备工艺，其特征在于，步骤（4）中,胰蛋白酶粗品与水的重量比为1：2-1：4，调节pH至3.0±0.５，搅拌10～16小时；每升溶液加入400～500g固体硫酸铵，待其溶解后，静置沉淀10～16小时。

7.根据权利要求2所述的一种高效价胰蛋白酶制备工艺，其特征在于，步骤（5）中，称滤饼重量，加0.001～0.01mol/L盐酸溶液将滤饼溶解，加入0.5～2mol/L氯化钙溶液，以及pH7.5～8.5的硼酸缓冲液，再加入水，调节pH7.0～8.0，最后每克滤饼加5～15mg的结晶胰蛋白酶进行活化处理，pH值控制在7.0～8.0；所述盐酸溶液的加入量为滤饼重量的3～5倍，所述氯化钙溶液的加入量为滤饼重量的1～3倍，所述硼酸缓冲液的加入量为滤饼重量的4～6倍。

8.根据权利要求2所述的一种高效价胰蛋白酶制备工艺，其特征在于，步骤（6）中，活化后的溶液调节pH至3.0±0.4，再按200～300g/L加入固体硫酸铵，搅拌溶解，在0～10℃中存放32～60小时使硫酸钙沉淀，过滤，滤液中按150～250g/L加入固体硫酸铵，0～10℃时放置10～14小时，过滤，得滤饼；按每克滤饼加入1～2mlpH8.0～10.0硼酸缓冲液，调节pH至8.0±0.4，搅拌均匀，再将溶液装透析袋，浸于外透液中，温度控制在0～10℃。

9.根据权利要求2所述的一种高效价胰蛋白酶制备工艺，其特征在于，步骤（7）中，按每克结晶物加入1～3ml水溶解，调节pH至3.0±0.5，温度控制在0～10℃，透析2～4天。

10.根据权利要求2所述的一种高效价胰蛋白酶制备工艺，其特征在于，步骤（8）中，调节pH至6.0±0.4。