CN100420746C

CN100420746C - 重组降压肽的设计与发酵生产

Info

Publication number: CN100420746C
Application number: CNB2005100777406A
Authority: CN
Inventors: 陈劲春; 李冬冬; 张佳; 秦伟涛
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2005-06-24
Filing date: 2005-06-24
Publication date: 2008-09-24
Anticipated expiration: 2025-06-24
Also published as: CN1884516A

Abstract

本发明涉及一种制备重组降压肽的方法，应用DNA重组技术，通过基因工程菌发酵法来制备。具体涉及重组降压肽相关基因设计与合成，构建重组降压肽表达载体，用所述表达载体转化宿主构建基因工程菌，利用所述基因工程菌发酵生产重组降压肽。先设计出一条前体肽，该肽可以是一种降压肽的重复体也可是多种降压肽的混合体。例如本发明采用混合肽，LRP，LYPVK，AVNPIR，GHKIATFQER，AVPYPQR。然后采用大肠杆菌BL21(DE3)表达系统pET-28a(+)，并将该前体肽的氨基酸序列转换为一段DNA序列。随后设计由这五种降压肽构成的融合蛋白的编码基因，采用化学法合成基因并连接到表达载体上，经转化及鉴定选择出适合的阳性克隆。并配以优化的发酵工艺条件和产品分离纯化工艺条件，所得的重组降压肽具有类似天然物的生物活性。

Description

重组降压肽的设计与发酵生产

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及降压肽的发酵生产以及所生产的重组降压肽。

背景技术

1965年Ferreira首次从美洲茅头蝮蛇(Bothrops jararaca)毒液中发现降压肽，后来人们相继从牛奶蛋白、人乳酪蛋白、玉米蛋白、明胶、大豆蛋白、发酵豆制品、小麦蛋白、沙丁鱼肉、清酒糟等发现这种功能小肽。但以食物为原料通过降解蛋白生产这种小肽，生产成本高难以实施。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种生产降压肽的新方法以及由此所生产的降压肽，即利用基因工程菌发酵生产重组降压肽。所述重组降压肽是指采用基因工程研发生产的小肽，长度为2个到10多个氨基酸；它们能够独立抑制人血管紧张素酶I(Angiotensin I-Converting Enzyme，ACE I)，降低人体血压。且其氨基酸顺序与以天然食物为原料所得的相同。这种降压肽的另一个名称是血管紧张素酶I抑制剂。

发明内容

本发明涉及一种制备重组降压肽的方法，应用DNA重组技术，通过基因工程菌发酵法来制备。具体涉及重组降压肽相关基因设计与合成，构建重组降压肽表达载体，用所述表达载体转化宿主构建基因工程菌，利用所述基因工程菌发酵生产重组降压肽。

可根据不同需求先设计出一条前体肽，该肽可以是一种降压肽的重复体也可是多种降压肽的混合体。然后根据选择的表达系统将该前体肽的氨基酸序列转换为一段DNA序列。例如本发明采用混合肽，LRP，LYPVK，AVNPIR，GHKIATFQER，AVPYPQR。本发明中5种降压肽，易用其它降压肽替换其中若干种甚至全部替换。

随后设计由这五种降压肽构成的融合蛋白的编码基因，采用化学法合成基因并连接到表达载体上，经转化及鉴定选择出适合的阳性克隆。并配以优化的发酵工艺条件和产品分离纯化工艺条件。

本发明使用表达载体为pET-28a(+)，受体菌为大肠杆菌BL21(DE3)。由于商品化pET表达载体有几十种，市售的受体菌亦多种多样；所以替换该表达载体或该表达载体上某一个遗传元件如启动子、抗性基因等都易于操作，也可获得重组降压肽。

另外，采用大肠杆菌以外的宿主如酵母、真菌、动植物细胞也能发酵生产重组降压肽，

发酵生产重组降压肽的工艺流程：挑选单菌落工程菌→种子液→放大培养→诱导表达→下罐收集菌体→细胞破碎→离心得胞含体→破胞含体及目标蛋白变性与复性→过Ni螯合柱获目标蛋白→酶解→超滤得重组降压肽→脱盐及去杂→冷冻干燥样品→样品质检。

本发明还涉及通过所述发酵方法所制备的重组降压肽。

附图说明

图1为重组降压肽的表达载体构建及基因的核苷酸排列顺序示意图；

图2为重组降压肽从Sephadex G10柱洗脱出峰图，收集第2，3，4，5峰；

图3为重组降压肽电泳图谱，其中1，3，5为酶切之前；2，4，6为酶切之后；M代表分子量大小的marker。

具体实施方式

实施例1

1.基因设计与合成：根据动物实验或人体食用效果，将确有降压效果且源于人类食物的小肽收集形成小肽库(specifie peptide library)。从中选出一条或多条构成一个融合蛋白，依据大肠杆菌偏爱密码，将该融合蛋白的氨基酸排列顺序转换为编码基因的核苷酸排列顺序。采用化学合成办法全合成该基因。

GAATCCCGCGGCCACAAAATCGCGACCTTTCAGGAACGCCTGTATCCGG

TGCGCGCGGTGAACCCGATTCGCGCGGTGCCGTATCCGCAGCGCCTGC

GCCCGTAAAAGCTT

2.构建表达载体及获得工程菌：选择Novagen公司商品化的质粒pET-28a(+)为载体，将目的基因和载体DNA进行双酶切(Eco R I+Hind III)后用T₁DNA连接酶连接，连接反应的产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离纯化，再用化学法转化进感受态大肠杆菌BL21(DE3)。转化反应之后平铺于含卡那霉素(30ug/ml)的LB固体平板上，置37℃恒温箱培养，随后从该平板上挑选10个单菌落进行摇瓶培养，依碱法制备各菌落的质粒DNA，采用Sanger双脱氧末端终止法测定目的基因的核苷酸排列顺序。保存序列正确的菌落待用。

3.挑选生产菌株：将阳性克隆接种于含卡那霉素(30ug/ml)的LB培养液的摇瓶，置于培养箱37℃震荡培养，待菌细胞密度达OD₆₀₀＝0.6左右加入诱导剂IPTG达1mM，继续培养3小时。然后离心收集菌体，7Krpm，10min。再用20mM Tris-HCl(pH 8.0)洗涤菌泥2次。经超声波(600Hz，20min，5sec间隔)破细胞后离心获得胞含体(12krpm，10min)。洗涤胞含体后用6xSDS上样缓冲液混匀，经SDS-PAGE鉴定，挑选出符合试产要求的菌落。

4.发酵生产：以LB培养基为基础培养基，发酵液体积视需求而定，装罐料液不超过罐体60％，若生产需要可设一级、二级种子罐和发酵罐。装料后通入高温湿热水蒸汽灭菌(121℃，30分钟)，灭菌后待料液温度降至37℃时，按10％比例接进种子液，并加进卡那霉素(30ug/ml)和葡萄糖(0.05％)，控制温度37℃、溶氧(D0)40％以上，用氨水维持pH7.5，搅拌速率与通气量调节由溶氧浓度决定。当发酵液中菌密度达到OD值为1.0时加入诱导剂IPTG达1mM，继续培养8-16h左右。发酵过程需在线或离线监测发酵动态。

5.获得胞含体：发酵完毕，下罐并采用离心收集菌体，照5.3.操作。

6.获取融合蛋白：将干净的胞含体称重后，按1∶10的质量体积比加入6M盐酸胍水溶液，在冰浴条件下磁力搅拌4小时。变性完毕透析脱盐，采用尿素梯度浓度(4M，2M，0.5M，0M)的Tris-HCl(pH 7.5)的复性液边透析边复性，每种尿素浓度液中透析复性时间不少于3小时。逐步复性之后离心(12Krmp，10分钟)去沉淀物。SDS-PAGE检测。如果电泳胶上主带虽明显但也存在杂带，可通过金属螯合柱或离子交换层析柱纯化出目标融合蛋白。

7.获取目标重组降压肽：按质量比1∶200用酶量，将胰蛋白酶加入上述融合蛋白液中，在25℃酶解4小时以上。酶解后样品采用超滤装置截留分子量10kD以下小肽。从而得LRP，LYPVK，AVNPIR，AVPYPQR，GHKIATFQER降压肽

实施例2：

将本发明发酵生产所得小肽用于降压测试，其结果与天然来源所得降压肽的效果相同。

降压肽抑制ACE I活性的测试方法引自：尤新主编《功能性发酵制品》p：220-221，中国轻工业出版社，2000.1，第一版。

表1.出食品制得的降压肽抑制ACE I效果

序号	降压肽氨基酸序列	来源	IC<sub>50</sub>/(μmol/L)	测试用ACE来源
序号	降压肽氨基酸序列	来源	IC<sub>50</sub>/(μmol/L)	测试用ACE来源	1	LRP	α-玉米蛋白	0.27	兔子肺脏
2	LYPVK	无花果树乳胶	4.5	兔子肺脏	1	LRP	α-玉米蛋白	0.27	兔子肺脏
2	LYPVK	无花果树乳胶	4.5	兔子肺脏	3	AVNPIR	无花果树乳胶	13	兔子肺脏
4	AVPYPQR	酪蛋白	15	兔子肺脏	3	AVNPIR	无花果树乳胶	13	兔子肺脏
4	AVPYPQR	酪蛋白	15	兔子肺脏	5	GHKIATFQER	酵母	0.4	牛肺脏

表2.本发明中重组降压肽抑制ACE I效果

序号	降压肽氨基酸序列	来源	IC<sub>50</sub>/(μmol/L)	测试用ACE来源
序号	降压肽氨基酸序列	来源	IC<sub>50</sub>/(μmol/L)	测试用ACE来源	1	LRP	本发明发酵生产所得	0.3	兔子肺脏
2	LYPVK	本发明发酵生产所得	4.8	兔子肺脏	1	LRP	本发明发酵生产所得	0.3	兔子肺脏
2	LYPVK	本发明发酵生产所得	4.8	兔子肺脏	3	AVNPIR	本发明发酵生产所得	13.3	兔子肺脏
4	AVPYPQR	本发明发酵生产所得	15.2	兔子肺脏	3	AVNPIR	本发明发酵生产所得	13.3	兔子肺脏
4	AVPYPQR	本发明发酵生产所得	15.2	兔子肺脏	5	GHKIATFQER	本发明发酵生产所得	0.5	牛肺脏

注明：IC₅₀(μmol/L)系指ACE I活性受抑达一半时所需的降压肽浓度。该值越小，降压效果越强。

Claims

1. 一种制备重组降压肽的方法，包括如下步骤：a、重组降压肽融合基因设计与合成，b、构建重组降压肽表达载体，c、用所述表达载体转化宿主，构建基因工程菌，d、利用所述基因工程菌发酵生产重组降压肽；所述重组降压肽为LRP，LYPVK，AVNPIR，GHKIATFQER和AVPYPQR；所述融合基因结构为GAATCCCGCGGCCACAAAATCGCGACCTTTCAGGAACGCCTGTATCCGGTGCGCGCGGTGAACCCGATTCGCGCGGTGCCGTATCCGCAGCGCCTGCGCCCGTAAAAGCTT。

2. 如权利要求1所述的方法，所述的表达载体为pET-28a(+)，宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。

3. 如权利要求1所述的方法，其中发酵生产重组降压肽的工艺流程如下：挑选基因工程菌单菌落，进行种子液和放大培养，诱导表达，下罐收集菌体进行细胞破碎，离心得包涵体，破包涵体及目标蛋白变性与复性，过Ni螫合柱获目标蛋白，进行酶解、超滤得重组降压肽，再脱盐及去杂，冷冻干燥样品，质检得最终样品。