ES2293701T3 - Vector de expresion para prolilendopeptidasas de flavobacterium meningosepticum. - Google Patents

Abstract

Un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica a la prolilendopeptidasa de Flavobacterium meningosepticum como se muestra en la SEQ ID NO: 1 que se extiende desde la posición del nucleótido 317 hasta el 2374 y una secuencia señal como se observa en la SEQ ID NO: 1 que se extiende desde la posición del nucleótido 260 hasta el 316, clonada en un plásmido multicopia bajo el control del promotor tac de E. coli.

Description

Vector de expresión para prolilendopeptidasas de Flavobacterium meningosepticum.

La presente invención se relaciona con ADN recombinante que codifica para prolilendopeptidasa y un proceso para la producción de dicho ADN, un huésped transformado con el ADN recombinante y un proceso para la producción de dicho huésped transformado, un proceso para la producción de prolilendopeptidasa utilizando el huésped transformado, y el uso de la prolilendopeptidasa para producir un péptido aminado en posición N-terminal fisiológicamente activo.

Antecedentes de la invención

La prolilendopeptidasa fue encontrada primero en útero humano por Walter y colaboradores, en 1971 como una endopeptidasa específica que escinde a un péptido en el lado carboxi terminal de un residuo de prolina (Walter, R. y colaboradores Science, 1971, 173, 827-829), y desde entonces la enzima ha sido constantemente estudiada con relación a su papel fisiológico.

Por otro lado, se encontró una endopeptidasa que muestra una especificidad muy similar a la prolilendopeptidasa de mamífero a partir de una bacteria, la Flavobacterium meningosepticum en 1978 (Yoshimoto, T., y colaboradores Agric. Biol. Chem. 1978, 42, 2417-2419). Este hallazgo permitió preparar una gran cantidad (pero aún a escala de laboratorio) de la enzima, y la prolilendopeptidasa se hizo disponible para escisión específica (Yoshimoto, T., y colaboradores J. Biol. Chem. 1980, 255, 4786-4792) de proteínas y péptidos. Su especificidad única, que reconoce residuos de prolina, hace a la enzima muy útil como una herramienta básica de la ingeniería de proteínas y atrae más atención al estudio de la relación entre estructura y función. La preparación de prolilendopeptidasa de F. meningosepticum, sin embargo, tiene los siguientes dos inconvenientes cruciales que surgen de la bacteria. 1) La bacteria es patógena (Yoshimoto, T. y colaboradores, 1978, ver más arriba, Buchanan, R.E. y colaboradores "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8ava ed. 1974, The Williams & Wilkins Co., Baltimore.) y 2) esto produce no solamente prolilendopeptidasa sino también cantidades significativas de otras peptidasas específicas o no específicas (Yoshimoto, T. y colaboradores, 1978 ver más arriba). Estos problemas han evitado la producción de la endopeptidasa, a pesar de una demanda creciente por la enzima.

La Publicación de la Patente Japonesa No Examinada (KOKAI) No. H2-5880 describe la clonación del gen de la peptidasa post-prolina derivado de Bacteroides gingivalis, pero esta enzima es claramente diferente de la presente enzima en que aquella escinde a la glicil-prolina-4-metoxi-\beta-naftilamida que no puede ser escindida por la presente prolilendopeptidasa.

Yoshimoto y colaboradores, J. Biol Chem. 255 (10), 4786-4792, 1980 describe el aislamiento y la caracterización de una endopeptidasa específica para la prolina del Flavobacterium meningosepticum. Yoshimoto y colaboradores, no divulgan el aislamiento o la expresión del gen que codifica a la prolilendopeptidasa.

D. Rennex y colaboradores, Biochemistry 30, 2195-2203, 1991 describe una clonación del ADNc para la prolilendopeptidasa del cerebro de porcino, buro no describe una expresión del ADNc.

Se cree que la prolilendopeptidasa es útil para la modificación de péptidos, por ejemplo, amidación C-terminal de péptidos biológicamente activos tales como LH-RH, oxitocina, calcitoninas o similares, pero para este propósito, es necesario obtener una gran cantidad de la enzima. Además, la preparación de la enzima debe estar libre de otras peptidasas, para garantizar la reacción deseada. Por lo tanto, la producción de la enzima por un proceso de recombinación de genes es esencial.

Resumen de la invención

Por lo tanto, la presente invención provee un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica a la prolilendopeptidasa del Flavobacterium meningosepticum como se muestra en la SEQ ID NO: 1 que se extiende desde la posición del nucleótido 317 hasta el 2374 y una secuencia señal como se observa en la SEQ ID NO: 1 que se extiende desde la posición del nucleótido 260 hasta el 316, clonada en un plásmido multicopia bajo el control del promotor tac de E. coli, así como un huésped transformado con la molécula de ADN recombinante y un proceso para la producción de la misma.

En particular, la invención se relaciona con un método de producción de un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica a la prolilendopeptidasa del Flavobacterium meningosepticum como se muestra en la SEQ ID NO: 1 que se extiende desde la posición del nucleótido 317 hasta el 2374 y una secuencia señal como se observa en la SEQ ID NO: 1 que se extiende desde la posición del nucleótido 260 hasta el 316, clonada en un plásmido multicopia bajo el control del promotor tac de E. coli que comprende las etapas
de:

preparar ADNc o ADN genómico que codifica para la prolilendopeptidasa del Flavobacterium meningosepticum como se muestra en la SEQ ID NO: 1 o preparar dicho ADN por medio de síntesis química;

insertar el ADN en un vector de clonación del plásmido multicopia bajo el control del promotor tac de E. coli;

seleccionar un vector de expresión híbrido que contiene y expresa al ADN que codifica para la prolilendopeptidasa del Flavobacterium meningosepticum como se muestra en la SEQ ID NO: 1.

La invención también se relaciona con un método para producir un organismo huésped, pero particularmente E. coli, que comprende un vector de expresión recombinante de acuerdo con la invención que comprende transformar dicho organismo huésped con un vector de expresión recombinante de acuerdo con la invención.

La presente invención provee por lo tanto un huésped transformado con el vector de expresión de acuerdo con la invención que comprende al gen que codifica para la prolilendopeptidasa de cualquier origen, y capaz de producir la prolilendopeptidasa.

Descripción detallada de la invención Preparación del gen que codifica par la prolilendopeptidasa

Más adelante, el término prolilendopeptidasa incluye a la prolilendopeptidasa derivada de Flavobacterium meningosepticum, más preferiblemente de la cepa IFO 12535 (ATCC 13253) de F. meningosepticum.

Por lo tanto, se puede clonar un ADN de la presente invención que codifica para una prolilendopeptidasa a partir de una bacteria que pertenece a Flavobacterium meningosepticum, más preferiblemente la cepa IFO 12535 (ATCC 13253) de F. meningosepticum.

Ya que el ADN derivado de un procariota tal como una bacteria, por ejemplo, F. meningosepticum, no incluye intrones, se puede utilizar un ADN genómico para clonar al ADN que codifica a la prolilendopeptidasa si se escoge una célula procariota como fuente. En este caso, las células bacterianas de F. meningosepticum, que producen prolilendopeptidasa, se homogenizan y se extrae ADN genómico entero de acuerdo a un procedimiento convencional (Saito, H. y colaboradores Biochim. Biophys. Acta, 1963, 72, 619-629). El AND extraído es luego digerido complete o parcialmente con una enzima de restricción apropiada tal como Bgl II, Eco RI, Hinc II, Hind III, Pst I o Bam HI. El producto de digestión es luego preferiblemente sometido a electroforesis preparativa con gel de agarosa de bajo punto de fusión para enriquecer las fracciones de ADN de una cierta longitud. Se pretende enriquecer los fragmentos de ADN que codifican a la prolilendopeptidasa. Luego, se clonan los fragmentos de ADN en un vector de clonación adecuado. El vector de clonación se puede derivar de cualquier vector útil en el arte de la ingeniería genética, tal como a partir de virus, fagos, cósmidos, plásmidos o ADN cromosomal, por ejemplo derivados de SV40, virus del Herpes, virus de Papiloma, Retrovirus, Baculovirus, fago l, por ejemplo, NM989 o EMBL4, o el fago M13, plásmidos bacterianos, por ejemplo, pBR322, pUC18, pSF2124, pBR317 o pPLMu, o plásmidos de levadura, por ejemplo el plásmido 2 P de levadura, o también ADN cromosomal que contiene un origen de replicación o una secuencia de replicación autónoma (ARS). Preferiblemente, el vector de clonación es un vector bacteriano tal como pBR322, pUC18, pUC19 o similares.

Alternativamente, se puede preparar una biblioteca de ADNc a partir de una célula de F. meningosepticum más preferiblemente una cepa IFO 12535 (ATCC 13253) de F. meningosepticum que expresa a la prolilendopeptidasa. Luego, se construye una biblioteca de ADNc de acuerdo con un procedimiento convencional tal como el método de Okayama-Berg (Okayama, H. y colaboradores Mol. Cell. Biol. 1982, 2, 161-170), el método de Gubler y Hoffman (Gubler, U. y colaboradores Gene, 1983, 25, 263-270) o similares.

Se conocen una variedad de métodos en el arte para la incorporación de ADNc bicatenario o de ADN genómico en un vector apropiado. Por ejemplo, se pueden añadir regiones complementarias de homopolímero al ADN bicatenario y al ADN del vector por medio de incubación en presencia de los correspondientes trifosfatos de desoxinucleósido y una enzima tal como la desoxinucleotidil transferasa terminal. Se unen luego el vector y el ADN bicatenario por medio del apareamiento de bases entre las colas homopoliméricas complementarias y finalmente ligadas por medio de enzimas específicas de unión tal como las ligasas. Otras posibilidades son la adición de enlazadores sintéticos a los terminales del ADN bicatenario, o la incorporación del ADN bicatenario en el vector por medio de ligación en el extremo romo o escalonado.

La selección de la biblioteca de ADN genómico o la biblioteca de ADNc se lleva a cabo preferiblemente utilizando una sonda de hibridación de ADN. Las sondas adecuadas de ADN son los ADN de una secuencia conocida de nucleótidos que consta al menos de 17 nucleótidos, por ejemplo los ADN sintéticos, los ADNc derivados de ARNm que codifica para la prolilendopeptidasa, o fragmentos de ADN genómico que comprenden por ejemplo secuencias adyacentes de ADN que se aíslan de una fuente natural o a partir de un microorganismo genéticamente modificado por ingeniería genética.

Para diseñar sondas sintéticas de ADN para seleccionar la biblioteca de ADN genómico anteriormente mencionada o la biblioteca de ADNc, se purifica la prolilendopeptidasa para la cual se clona una región de codificación de ADN, y se determina su secuencia parcial de aminoácidos de acuerdo con un procedimiento convencional. Luego, se diseñan secuencias de ADN sobre la base de una secuencia parcial de aminoácidos determinada de este modo. Donde no se conozca una secuencia exacta de nucleótidos que codifique para la secuencia de aminoácidos, se puede utilizar una combinación de secuencias de nucleótidos que cubre parcial o totalmente a posibles secuencias de nucleótidos presentes debido a la degeneración del codón genético. Alternativamente, el tercer nucleótido en un codón puede ser reemplazado con inosina.

Las sondas de ADN sintético se sintetizan de acuerdo a métodos conocidos, por ejemplo por medio de una condensación en etapas utilizando el método de fosfotriéster en fase sólida, del fosfito triéster o de la fosforamidita, por ejemplo, la condensación de unidades de acoplamiento dinucleótidas por medio del fosfotriéster. Estos métodos se adaptan a la síntesis de mezclas de los oligonucleótidos deseados por medio del uso de mezclas de dos, tres o cuatro nucleótidos dA, dC, dG y/o dT en forma protegida o las correspondientes unidades de acoplamiento dinucleótidas en la etapa de condensación apropiada como lo describen Y. IKe y colaboradores (Nucleic Acids Research 11, 477, 1983).

Para la hibridación, se marcan las sondas de ADN, por ejemplo en forma radioactiva por medio de la bien conocida reacción de la quinasa. La hibridación se lleva a cabo de acuerdo con procedimientos conocidos, esto es, en soluciones salinas y de amortiguador que contienen aditamentos, por ejemplo, queladores de calcio, compuestos reguladores de la viscosidad, proteínas, ADN no homólogo y similares, a temperaturas que favorecen la hibridación selectiva, por ejemplo, entre 0ºC y 80ºC, por ejemplo entre 25ºC y 50ºC.

En la modalidad preferida, se utiliza la biblioteca de ADN de F. meningosepticum para transformar a un huésped apropiado tal como las células de E. coli, que se siembran luego en placa y se cultivan sobre un medio sólido para desarrollar colonias, y se seleccionan los clones positivos por medio de un método de hibridación de colonias utilizando las sondas de ADN mencionadas anteriormente. La transformación de las células huésped apropiadas con la biblioteca de ADN y la selección y multiplicación de las células huésped transformadas es bien conocida en el estado del arte. Los ejemplos de tales métodos se dan más abajo.

La secuencia de nucleótidos de ADN seleccionada como se describió anteriormente se puede determinar por medio de métodos conocidos en sí mismos; por ejemplo, por medio del método de Maxam-Gilbert utilizando ADN marcado en el extremo o por medio del método didesoxi o de terminación de cadena de Sanger.

Una secuencia de nucleótidos de ADN genómico de origen en el Flavobacterium meningosepticum que codifica para la prolilendopeptidasa y una secuencia correspondiente de aminoácidos son mostradas en el Listado de Secuencia, SEQ ID No. 1.

Una vez que se determina una secuencia de nucleótidos que codifica para, o una secuencia de aminoácidos de prolilendopeptidasa, se puede preparar también un ADN que codifica para la enzima por medio de una síntesis in vitro de acuerdo con métodos convencionales. Los métodos adecuados de síntesis de ADN han sido presentados en forma de resumen por S.A. Narang (Tetrahedron 39, 3, 1983). Las técnicas conocidas de síntesis permiten la preparación de polinucleótidos hasta de 120 bases de longitud, con buen rendimiento, alta pureza y en un tiempo relativamente corto. Los nucleótidos adecuadamente protegidos se enlazan entre sí por medio del método del fosfodiéster (K.L. Agarwal y colaboradores, Angew. Chemie 84, 489, 1972), el método más eficiente del fosfotriéster (C.B. Reese, Tetrahedron 34, 3143, 1978), el método del fosfito triéster (R.L. Letsinger y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 98, 3655, 1976) o el método de la fosforamidita (S.L. Beaucage y M.H. Carruthers, Tetrahedron Letters 22, 1859,1981).

La simplificación de la síntesis de los oligonucleótidos y de los polinucleótidos se hace posible por medio del método en fase sólida, en el cual las cadenas de nucleótido se enlazan a un polímero adecuado. H. Rink y colaboradores (Nucl. Acids Reserach 12, 6369, 1984) utilizan trinucleótidos en vez de nucleótidos individuales y se enlazan a ellos por medio del método del fosfotriéster en la síntesis en fase sólida. Se puede preparar de este modo un polinucleótido en corto tiempo y con buenos rendimientos. El ADN bicatenario real se construye enzimáticamente a partir de los oligonucleótidos que se traslapan preparados químicamente a partir de ambas cadenas de ADN, que se mantienen juntas en la ordenación correcta por medio del apareamiento de bases y luego se enlazan químicamente por medio de la enzima ADN ligasa. Otra posibilidad comprende la incubación de los oligonucleótidos individuales que se traslapan a partir de las dos cadenas de ADN en presencia de los cuatro trifosfatos desoxinucleósidos requeridos con una ADN polimerasa, por ejemplo ADN polimerasa I, el fragmento Klenow de la polimerasa I o la T4DNA polimerasa, o con la transcriptasa inversa AMV (virus de mieloblastosis aviaria). Los dos oligonucleótidos se mantienen por lo tanto juntos en el orden correcto por medio apareamiento de bases y se suplementan con los nucleótidos requeridos por la enzima para producir un ADN bicatenario completo (Scarpulla y colaboradores, Anal. Biochem. 121, 356, 1982).

Vector híbrido que contiene al gen que codifica para la prolilendopeptidasa

En la presente invención, los vectores híbridos incluyen a un vector híbrido para clonación o amplificación de un gen que codifica para la prolilendopeptidasa, y vectores de expresión. Un vector híbrido de expresión de la invención comprende una secuencia de ADN que codifica para la prolilendopeptidasa definida aquí anteriormente.

Los vectores híbridos de expresión se derivan de cualquier vector útil en el arte de la ingeniería genética, tal como virus, fagos, cósmidos, plásmidos o ADN cromosomal, por ejemplo derivados de SV40, virus del Herpes, virus de Papiloma, Retrovirus, Baculovirus, fago \lambda, por ejemplo, NM989 o EMBL4, o el fago M13, plásmidos bacterianos, por ejemplo, pBR322, pUC18, pSF2124, pBR317 o pPLMu, o plásmidos de levadura, por ejemplo el plásmido \mu de levadura, o también ADN cromosomal que contiene un origen de replicación o una secuencia de replicación autónoma (ARS), o un virus defectuoso, fago o plásmido en presencia de un virus auxiliar, fago o plásmido que permite la replicación de dicho virus defectuoso, fago o plásmido, por ejemplo el vector M13(+)KS en presencia de, por ejemplo el fago auxiliar M13K07. Los Baculovirus que pueden ser utilizados en la presente invención son, por ejemplo, el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcMNPV), Trichoplusia ni MNPV, Rachiplusia ou MNPV, Galleria mellonella MNPV, virus de polihedrosis nuclear Bombyx mori (BmNPV), y similares. Un kit que comprende una combinación de un virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica y vectores baculovirus de transferencia pAc700, pAc701, pAc702, pVL1392 y pVL1393 se encuentra comercialmente disponible con Invitrogen.

Un vector adecuado de expresión de la invención es un vector que es operable en la célula huésped microbiana escogido por multiplicación del vector híbrido para la expresión de la prolilendopeptidasa. Los vectores adecuados contienen un replicón completo y un gen marcador, que hace posible la selección e identificación de los microorganismos transformados por los plásmidos de expresión por medio de un rasgo fenotípico.

De este modo, los vectores híbridos de expresión de la invención permiten la replicación de un ADN para la prolilendopeptidasa en un huésped adecuado, ya sea como un elemento extracromosomal o por medio de la integración en el cromosoma huésped. Diferentes sistemas posibles de vectores están disponibles para integración y expresión del ADN clonado de la invención. En principio, todos los vectores que replican y/o que contienen un gen recombinante que se puede expresar en el huésped escogido son adecuados. El vector se selecciona dependiendo de las células huésped contempladas para transformación. En general, tales células huésped pueden ser microorganismos procariotas o eucariotas tales como bacterias, hongos tales como levaduras u hongos filamentosos, o células de origen eucariota superior tal como animal, por ejemplo células de mamífero o de insecto. Las células huésped adecuadas serán discutidas en detalle aquí más adelante. En principio, los vectores híbridos de la invención comprenden un ADN que codifica prolilendopeptidasa, un origen de replicación o una secuencia de replicación autónoma, opcionalmente secuencias marcadoras dominantes, y, opcionalmente, sitios adicionales de restricción.

Se provee un origen de replicación o una secuencia de replicación autónoma (un elemento de ADN que confiere capacidades de replicación autónoma para elementos extracromosomales) ya sea por construcción del vector para incluir un origen exógeno tal como el derivado del virus Simio (SV40) u otra fuente viral, o por medio de los mecanismos cromosomales de la célula huésped.

Un vector híbrido de expresión de la invención puede contener marcadores selectivos dependiendo del huésped que va a ser transformado, seleccionado y clonado. Cualquier gen marcador puede ser utilizado que facilite la selección de transformantes debido a la expresión fenotípica del marcador. Los marcadores adecuados son particularmente genes a partir de los cuales se puede expresar un polipéptido que provee resistencia contra compuestos tóxicos para el organismo que lo recibe o que completa el sistema enzimático de un mutante que carece de tal polipéptido esencial, por ejemplo de un mutante autotrófico. Los genes marcadores adecuados expresan, por ejemplo, resistencia a los antibióticos, por ejemplo contra la tetraciclina, la ampicilina, o la cicloheximida o mantienen prototrofía en un mutante auxotrófico, por ejemplo en una levadura deficiente en el gen ura3, leu2, his3 o trpl. También es posible emplear como marcadores genes estructurales que están asociados con un segmento de replicación autónoma siempre que el huésped que va a ser transformado sea auxotrófico para el producto expresado por el marcador.

Dentro del significado de vectores híbridos de la invención están también los vectores híbridos de expresión para la expresión de prolilendopeptidasa. Ellos tienen en general las mismas características que los vectores híbridos descritos aquí anteriormente, y adicionalmente contienen secuencias de control de expresión que permiten la expresión y, opcionalmente, la secreción de prolilendopeptidasa. El vector híbrido de expresión de la invención contiene una región promotora de tac operativamente enlazada con un gen estructural que codifica a la prolilendopeptidasa y, opcionalmente, un fragmento de ADN que codifica a un péptido líder o señal, un reforzador transcripcional, un sitio de enlazamiento ribosomal, una región terminadora transcripcional y/o secuencias reguladoras
adicionales.

Los reforzadores útiles para la expresión son secuencias de ADN que estimulan la transcripción, por ejemplo derivadas de virus tales como el virus Simio, Citomegalovirus, virus de papiloma, virus de papiloma bovino o virus del sarcoma de Moloney, o de origen genómico. Una secuencia reforzadora se puede derivar también del ADN ribosomal extracromosomal de Physarum polycephalum (PCT WO 86/00089), o puede ser el sitio de activación secuencia arriba del gen PH05 para la fosfatasa ácida (EP-B-0 213 593), o el híbrido PH05, trp, PH05-GAPDH (EP-B-0 213 593), o el promotor análogo.

Las secuencias de señal que se utilizan para la presente invención se extienden desde el aminoácido 1 hasta el 19 de la secuencia de aminoácidos descrita en el listado de secuencia bajo SIQ ID No. 1. Esta secuencia de señal sola así como una molécula de ADN que codifica a la misma, preferiblemente la molécula de ADN representada por los nucleótidos 260 a 316 de la SEQ ID No. 1 está cubierta también por la presente invención.

Un sitio de enlazamiento ribosomal (Secuencia Shine-Dalgamo) está o bien naturalmente enlazado al promotor utilizado o puede estar localizado sobre una secuencia corta de nucleótidos que puede estar covalentemente enlazada al extremo 5' de la región de codificación para la prolilendopeptidasa. Los sitios de enlazamiento ribosomal son conocidos en el arte.

El promotor tac escogido para la construcción de un vector híbrido de expresión de la invención puede ser regulado por medio de una proteína reguladora y la producción de prolilendopeptidasa en la célula huésped transformada puede ser entonces inducida o se puede eliminar la represión. El gen para la proteína reguladora se puede localizar ya sea en el genoma de la cepa huésped, sobre un vector plásmido adicional donde la cepa huésped se puede cotransformar con, o sobre el vector híbrido de la invención. La selección de un gen adecuado para una proteína reguladora depende del promotor utilizado. Las condiciones para la inducción o la eliminación de la represión de la producción de prolilendopeptidasa dependen también del promotor y de la proteína reguladora. Una proteína reguladora que puede ser utilizada en la presente invención es, por ejemplo, una proteína represora, por ejemplo, un producto del gen trpR, lacI, \lambdacro, o \lambdacI, o un mutante de los mismos sensible a la temperatura.

Los vectores híbridos de expresión preferidos de la invención son vectores de expresión adecuados para la expresión de prolilendopeptidasa madura representada por la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID No. 1 en E. coli, que comprende la secuencia señal del gen que codifica para la prolilendopeptidasa mostrada bajo la SEQ ID No. 1, operativamente enlazada con el gen que codifica a la prolilendopeptidasa madura.

Los vectores de expresión más preferidos son los plásmidos pFPH5-KD50, pUK-FPEP-a y pUK-FPEP-b caracterizados en los ejemplos acompañantes.

Huéspedes transformados y preparación de los mismos

La invención se relaciona con una célula huésped transformada para la multiplicación de moléculas de ADN recombinante de la invención o particularmente para la expresión de un gen estructural que codifica para la prolilendopeptidasa comprendido en una molécula de ADN recombinante de la invención.

Las cepas huésped microbianas transformadas se cultivan en un medio líquido que contiene fuentes de carbono y de nitrógeno que pueden ser asimiladas por la célula microbiana, y sales inorgánicas, aplicando métodos conocidos en el arte. El cultivo de los huéspedes se lleva a cabo en un medio nutriente convencional que puede ser suplementado con, o privado de compuestos químicos permitiendo la selección negativa o positiva de los transformantes, esto es, huéspedes tales que contienen a la molécula deseada de ADN junto con un marcador de selección, de los no transformantes, esto es, huéspedes tales que carecen de la molécula deseada de ADN.

Se puede utilizar a cualquiera de los huéspedes transformables útiles en el arte, por ejemplo bacterias, tales como E. coli, hongos, tales como Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, u hongos filamentosos, tales como Aspergillus Spec., por ejemplo A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori o A. niger. Sin embargo, el uso de huéspedes adecuados que están desprovistos de o que son pobres en enzimas o en enzimas modificadas, puede ser conveniente. Ejemplos de tales huéspedes son bacterias, por ejemplo Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus y otras, y levaduras, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, y en particular cepas de Escherichia coli, por ejemplo la cepa X1776 de E. coli, la cepa Y1090 de E. coli, la cepa W3110 de E. coli, la cepa HB 101/LM1035 de E. coli, la cepa JA 221 de E. coli, la cepa DH5a de E. coli, o preferiblemente la cepa DH5aF'de E. coli, JM109, MH1 o HB101, o la cepa K12 de E. coli. Huéspedes adecuados adicionales son las células de organismos superiores, en particular líneas de células humanas o animales continuas establecidas, por ejemplo, fibroblastos L132 de pulmón embrionario humano, células de Bowes de melanoma humano maligno, células HeLa, células de riñón transformadas con el virus SV40 de mono verde africano COS-7 o células de ovario de hámster chino (CHO). Otras células huésped adecuadas están establecidas en líneas celulares de insectos, por ejemplo, Spodoptera frugiperda, tal como Sf21 o preferiblemente Sf9 (ATCC CRL1711), Mamestra brassicae, sistemas de células Bombyx mori utilizando al virus de la polihedrosis nuclear Bombyx mori (BmNPV) y similares.

La invención se relaciona también con un método para la preparación de tales huéspedes transformados que comprende el tratamiento de una célula huésped adecuada bajo condiciones de transformación con una molécula de ADN recombinante de la presente invención, especialmente un vector híbrido de la invención, opcionalmente junto con un gen marcador de selección y opcionalmente seleccionando los transformantes.

La transformación de microorganismos se lleva a cabo de acuerdo con métodos convencionales como se describe en la literatura, por ejemplo para S. cerevisiae (A. Hinnen y colaboradores, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 75, 1929, 1978), para B. subtilis (Anagnostopoulos y colaboradores, J. Bacteriol. 81, 741, 1961), y para E. coli (M. Mandel y colaboradores, J. Mol. Biol. 53, 159, 1970).

Por lo tanto, el procedimiento de transformación de las células de E. coli incluye, por ejemplo, el pretratamiento de las células con Ca^{2+} para permitir la incorporación del ADN, y la incubación con el vector híbrido. La selección posterior de las células transformadas se puede lograr, por ejemplo, transfiriendo las células a un medio de cultivo selectivo que permite la separación de las células transformadas de las células originales dependiendo de la naturaleza de la secuencia marcadora del ADN del vector. Preferiblemente, se utiliza el medio de cultivo que no permite el crecimiento de células que no contengan al vector. La transformación de levaduras comprende, por ejemplo, etapas de remoción enzimática de la pared de la célula de levadura por medio de glucosidasas, el tratamiento de los esferoplastos obtenidos con el vector en presencia de polietilén glicol y iones de Ca^{2+}, y la regeneración de la pared celular embebiendo los esferoplastos en agar. Preferiblemente, la regeneración en agar se prepara en una forma que permita la regeneración y la selección de las células transformadas como se describió anteriormente al mismo tiempo.

La transformación de las células de origen eucariota superior, tal como líneas celulares de mamífero, se logra preferiblemente por medio de transfección. La transfección se lleva a cabo por medio de técnicas convencionales, tales como precipitación con fosfato de calcio, microinyección, fusión de protoplastos, electroporación, esto es, introducción de ADN por medio de un pulso eléctrico corto que incrementa en forma transitoria la permeabilidad de la membrana celular, o en la presencia de compuestos auxiliares tal como dietilaminoetildextrano, dimetil sulfóxido, glicerol o polietilén glicol, y similares. Después del procedimiento de transfección, las células transfectadas se identifican y se seleccionan por ejemplo por medio del cultivo en un medio selectivo escogido dependiendo de la naturaleza del marcador de selección, por ejemplo un medio de cultivo estándar tal como el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo, medio RPMI 1640 y similares, que contienen por ejemplo al antibiótico correspondiente.

Las células huésped transformadas se cultivan por medio de métodos conocidos en el arte en un medio líquido que contiene fuentes asimilables de carbono, por ejemplo carbohidratos tales como glucosa o lactosa, nitrógeno, por ejemplo aminoácidos, péptidos, proteínas o sus productos de degradación tales como peptonas, sales de amonio o similares, y sales inorgánicas, por ejemplo sulfatos, fosfatos y/o carbonatos de sodio, potasio, magnesio y calcio. El medio contiene además, por ejemplo, sustancias promotoras de crecimiento, tales como elementos traza, por ejemplo hierro, zinc, manganeso y similares.

El medio se escoge preferiblemente de tal manera que ejerza una presión seleccionada y evite el crecimiento de las células que no han sido transformadas o han perdido al vector híbrido. De esta forma, por ejemplo, se añade un antibiótico al medio si el vector híbrido contiene un gen de resistencia al antibiótico como marcador. Si, por ejemplo, se utiliza una célula huésped que es auxotrófica en un aminoácido esencial mientras que el vector híbrido contiene un gen que codifica para una enzima que complementa el defecto del huésped, se utiliza un medio mínimo deficiente de dicho aminoácido para cultivar las células transformadas.

Las células de origen eucariota superior tales como las células de mamífero se cultivan bajo condiciones de cultivo de tejidos utilizando un medio comercialmente disponible, por ejemplo, medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo, medio RPMI 1640 y similares como se mencionó anteriormente, opcionalmente suplementado con sustancias que promueven el crecimiento y/o sueros de mamífero. Las técnicas para cultivo celular bajo condiciones de cultivo de tejidos son bien conocidas en el arte e incluyen un cultivo en suspensión homogénea, por ejemplo, en un reactor de transporte aireado o en un reactor agitador continuo, o inmovilizado o cultivo celular entrapado, por ejemplo en fibras huecas, microcápsulas, microperlas, perlas de vidrio poroso, cartuchos cerámicos, u otros microportadores.

El cultivo se efectúa por medio de procesos conocidos en el arte. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el valor del pH del medio y el tiempo de fermentación, se escogen de modo que se obtenga el máximo nivel de expresión del polipéptido o derivado de la invención. De esta forma, se cultiva preferiblemente una cepa de levadura o de E. coli cultivada bajo condiciones aeróbicas por medio de un cultivo sumergido con agitación a una temperatura aproximadamente de 20ºC hasta 40ºC, preferiblemente aproximadamente 30ºC, y un valor de pH de 4 a 8, preferiblemente aproximadamente de 7, para aproximadamente 4 a 30 horas, preferiblemente hasta alcanzar un rendimiento máximo del polipéptido o derivado de la invención.

Producción de prolilendopeptidasa

Para la expresión de la prolilendopeptidasa, se pueden utilizar ya sea células huésped procariotas o eucariotas, por ejemplo cepas de E. coli deficientes en genes para la proteasa, por ejemplo en el gen Ion para la proteasa, y genes involucrados en la regulación de la síntesis de proteína inducida por choque térmico, por ejemplo en el gen htpR (Patente Estadounidense No. 4.758.512; Buell, G. y colaboradores, Nucleic Acids Res. 13: 1923-1938, 1985).

Preferiblemente, se produce prolilendopeptidasa utilizando E. coli. En este caso, para mejorar la expresión, se remueve preferiblemente una región no codificadora 5' terminal del ADN clonado mientras se mantiene la longitud total de la región de codificación, particularmente la región de codificación del polipéptido maduro mostrado bajo la SEQ ID No. 1. La región de codificación está más preferiblemente funcionalmente enlazada con una secuencia de señal permitiendo la secreción de la prolilendopeptidasa. Además, el gen estructural está funcionalmente enlazado con una región promotora funcional en E. coli, ya sea heteróloga a o enlazada originalmente con la región de codificación de la prolilendopeptidasa. El enlace se realiza de acuerdo con un procedimiento convencional, por ejemplo, utilizando un sitio apropiado para la enzima de restricción o la supresión por medio de digestión con una exonucleasa tal como la exonucleasa III de E. coli y el embotamiento sucesivo con una nucleasa, por ejemplo la nucleasa mung bean.

En una de las modalidades más preferible, se enlaza un ADN genómico que tiene una secuencia enlazadora inmediatamente secuencia arriba de una región de codificación de longitud completa para prolilendopeptidasa con un promotor tac en un vector de expresión, por ejemplo, un plásmido basado en el plásmido pUC119. Muy particularmente, una región de codificación en el ADN genómico de Flavobacterium meningosepticum codifica a una proforma de prolilendopeptidasa, por ejemplo, como consistiendo de una forma madura de la enzima, por ejemplo consistiendo del residuo aminoácido 1 para el extremo de la secuencia mostrada bajo la SEQ ID No. 1, y un péptido señal, por ejemplo los residuos aminoácidos -19 a -1 de la secuencia mostrada bajo la SEQ ID No. 1. Cuando se utiliza un tipo así de plásmido de expresión para transformar al huésped E. coli, y se cultiva el transformante, entonces se produce prolilendopeptidasa en células de E. coli y se la segrega en la región periplasmática. En el proceso de secreción se remueve el péptido señal para producir una forma madura de la enzima que no se incorpora en los cuerpos de inclusión, y por lo tanto, se recupera fácilmente la prolilendopeptidasa producida.

La prolilendopeptidasa expresada puede ser extraída de células microbianas tales como las células de E. coli o un sobrenadante de un cultivo celular por medio de métodos convencionales, por ejemplo, que comprenden la homogenización de las células, cromatografía tal como la de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba o de exclusión por tamaño, precipitación, por ejemplo, con sulfato de amonio o ácido, electroforesis preparativa tal como electroforesis sobre gel de poliacrilamida o enfoque isoeléctrico, y similares. Particularmente, la prolilendopeptidasa de Flavobacterium meningosepticum que se expresa en E. coli, se extrae fácil y selectivamente de las células con un método de choque osmótico si la enzima es segregada a la región periplasmática. La enzima cruda obtenida puede ser purificada adicionalmente con métodos usuales, por ejemplo que comprenden cromatografía tal como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba o de exclusión por tamaño, electroforesis preparativa tal como electroforesis sobre gel de poliacrilamida, o enfoque isoeléctrico, y similares.

La presente invención se relaciona en particular con las modalidades divulgadas en los ejemplos.

Ejemplos

La presente invención será ilustrada ahora adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos, pero no significa que se limite a ellos.

En los Ejemplos, se utilizan comúnmente los siguientes materiales y métodos.

Las cepas bacterianas y los plásmidos utilizados se enlistan en la Tabla I.

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TABLA I Cepas y plásmidos

1

Transformación, mapeo de restricción, preparación de plásmidos, y otros procedimientos de clonación molecular son hechos por medio de métodos estándar (Sambrook, J. y colaboradores, "Molecular cloning: a laboratory manual", 2nd ed. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor; Silhavy, T.J. y colaboradores, "Experiments with gene fusions", 1984, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor.) Las enzimas de restricción y las enzimas que modifican el ADN se utilizan de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes. La suppression con exonucleasa III se realize por medio del uso de un kit Kilo-Sequence Deletion (Yanisch-_Perron, C. y colaboradores, Gene, 1985, 33, 103-119; Henikoff, S. Gene, 1984, 28, 351-359). Las secuencias de nucleótidos se determinan por medio del método didesoxi, por medio del uso de un kit Sequenase. El AND genómico de F. meningosepticum se aísla por medio del método de Saito y Miura (Saito, H. y colaboradores, Biochim. Biophys. Acta, 1963, 72, 619-629).

Las enzimas de restricción, las enzimas que modifican el ADN, el kit Kilo-Sequence Deletion y el kit MEGALABEL se adquieren con Takara Shuzo Co. Ltd. (Kyoto). El kit de la Sequenase Versión 2.0 kit es tel producto de U.S. Biochemical Corp. (Cleveland, Ohio). La prolilendopeptidasa de F. meningosepticum y la Endoproteinasa Asp-N se adquieren con Seikagaku Corp. (Tokio) y Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co. Ltd. (Tokio), respectivamente. Los sustratos de la enzima, Z-Gly-Pro-\beta-naftilamida y Z-Gly-Pro-P-nitroanilida, se obtienen con Novabiochem AG (Laeufelfingen, Suiza). Los radioisótopos se adquieren con Amersham Japan Co. Ltd. (Tokio) y otros productos bioquímicos se obtienen con Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri), Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Osaka) y Nacalai Tesque Inc. (Kioto).

Ejemplo 1 Preparación de sondas de ADN

La prolilendopeptidasa obtenida comercialmente se purifica por medio de HPLC en fas reversa sobre una columna TSKgel Octadecyl NPR de 4,6 x 35 mm (Tosoh Co. Ltd.). Se eluye la columna con TFA al 0,01% en agua y una mezcla 3:1 de CH_{3}CN e i-PrOH, con una velocidad de flujo de 1 ml/min. El gradiente del 35-70% de la mezcla de solvente orgánico se aplica durante 40 min y se recolecta el pico principal.

Ya que el N-terminal de la endopeptidasa está bloqueado, la enzima debe ser sometida a escisión proteolítica para determinar su estructura primaria parcial. Las proteasas comúnmente utilizadas para la escisión como la tripsina no producen resultados satisfactorios. Por lo tanto, las proteasas y las condiciones de la escisión hidrolítica son sistemáticamente investigadas y se encontró que la Endoproteinasa Asp-N produce los mejores resultados.

La enzima purificada (0,5 mg) en carbonato de amonio 10 mM, pH 7,9, que contiene urea 4 mM se hidroliza por medio de 1 \mug de Endoproteinasa Asp-N a 37ºC durante 24 horas. La mezcla del péptido obtenido por esta digestión se separa por medio de HPLC en fase reversa sobre una columna Vydac C18 de 4,6 x 250 mm (Separations Group Corp.) con la fase móvil de TFA al 0,01% en agua y una mezcla 3:1 de CH_{3}CN e i-PrOH, con una velocidad de flujo de 1 ml/min. Los péptidos aislados se purifican adicionalmente por medio de recromatografía. La secuencia de aminoácidos de los fragmentos purificados se determina por medio del manual Edman de degradación utilizando los métodos descritos por Kobayashi y Tarr (Kobayashi, R. y colaboradores, Tanpakushitsu Kakusan Koso, 1986, 31, 991-1002; Tarr, G.E. "Methods in protein sequencing analysis" (ed. Elzinga, M.), 1982, 223-232, Humana Press, New Jersey).

Las secuencias de nucleótidos para las sondas no se determinan únicamente a partir de las secuencias de aminoácidos debido a la utilización de un codón múltiple. Fuera de las 23 secuencias parciales de aminoácidos, se escogen seis que producen relativamente menos combinaciones de posibles secuencias de nucleótidos para elaborar las sondas de ADN (Tabla II). El uso del codón preferido en F. meningosepticum no se conoce, y se adoptan dos guías en el diseño de las sondas de nucleótidos. Especialmente, tres de las 6 sondas (A-12, 13 y 19) se diseñan para que consistan de una única secuencia de oligonucleótidos, seleccionando el codón más estable para cada residuo aminoácido asumiendo que el ADN genómico de F. meningosepticum es rico en GC. Los otros tres (A-3, 9 y 18) son mezclas de oligonucleótidos de las secuencias posibles. Para reducir más el número de las secuencias posibles en la mezcla, se coloca inosina (I) en la posición que puede ser una de cuatro bases, A, G, C y T, ya que la inosina forma pares estables de bases con las cuatro.

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TABLA II Secuencias parciales de aminoácidos determinadas de los fragmentos de prolilendopeptidasa obtenidos por digestión de la Endoproteinasa Asp-N (mostradas por el residuo aminoácido No. SEQ ID No. 1), y las correspondientes posiciones de nucleótidos en la SEQ ID No. 1 de las sondas diseñadas de las secuencias de aminoácidos

2

Los oligonucleótidos se sintetizan con un sintetizador de ADN Modelo 381A de Applied Biosystems. Después de remover al grupo dimetoxitritilo del extremo de la secuencia sintética se desprotegen los oligonucleótidos y se escinden de los soportes, de acuerdo con los protocolos del fabricante. El ADN sintetizado es sometido entonces a electroforesis preparativa con gel de poliacrilamida al 8% en urea 7 M. Los oligonucleótidos purificados se extraen de las bandas separadas y se desionizan por medio del uso de columnas C-18 Sep-Pack de Waters.

Ejemplo 2 Evaluación de las sondas

Se aísla el ADN cromosomal de F. meningosepticum y se digiere por medio del uso de 4 clases de enzimas de restricción comúnmente utilizadas que reconocen a la secuencia hexanucleótida, esto es, PstI, HindIII, EcoRI y BglII.

Las sondas de oligonucleótidos se marcan en forma radiactiva por medio del uso de un kit MEGALABEL con [\gamma^{-32}P]ATP para producir una actividad específica aproximadamente de 1 x 10^{6} cpm/pmol. Los fragmentos cromosomales se someten a electroforesis sobre un gel de agarosa al 0,7% y se transfieren a un filtro de nitrocelulosa de Millipore por medio del método descrito por Sambrook y colaboradores (Sambrook y colaboradores, 1989, ver más arriba).

Después de la prehibridación de acuerdo con un protocolo estándar (Sambrook y colaboradores, 1989, ver más arriba), se lleva a cabo la hibridación en una solución para hibridación 6x SSC con 0,2 pmol/ml de la sonda marcada a 45ºC durante 16 horas. Se lava el filtro con 6x SSC tres veces durante 3 min a temperatura ambiente y luego una vez durante 1 min a 45ºC. Se realiza una autorradiografía con un analizador Bio-image de Fuji BAS 2000. Únicamente se encontró que la sonda A-3 producía una señal clara y específica con cada uno de los ADN digeridos.

Ejemplo 3 Preparación de una biblioteca genómica y evaluación de la misma

Se encontró el peso molecular de la prolilendopeptidasa bastante grande, 76.000 por medio e electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (Yoshimoto y colaboradores, 1980, ver más arriba). El tamaño de la enzima corresponde a 2kb de la región de codificación en el genoma. Entre más grande es el fragmento de ADN clonado, mayor la posibilidad de incluir la longitud completa del marco de lectura abierta. Por lo tanto, en vez de un fragmento largo se desea un fragmento suficientemente pequeño para conseguir una alta eficiencia en la transformación y se selecciona un fragmento de 7 kb de Bg1II. Especialmente, se somete ADN genómico digerido por medio de Bg1II a electroforesis preparativa con agarosa de bajo punto de fusión y se corta la fracción del gel que contiene fragmentos de 7 kb. La pieza de gel cortada se disuelve en una mezcla para ligación y los fragmentos cromosomales extraídos se clonan en el sitio BamHI de pUC19. Por medio de esta mezcla de ligación, se transforma HB101 de E. coli para producir una biblioteca genómica que contiene aproximadamente 4.000 recombinantes.

Se evalúa la biblioteca genómica con la sonda A-3 por medio de hibridación de colonias y se obtienen 119 clones positivos. Se escogen dieciséis clones positivos y se analizan además por medio de digestión con una endonucleasa de restricción y se analiza la enzima. Se encontró que un clon con un inserto de 7 kb muestra una actividad comparativamente alta de la prolilendopeptidasa. El plásmido es llamado pFPEP02 y caracterizado adicionalmente.

Ejemplo 4 Mapeo de restricción y secuenciación del ADN de los clones aislados

El mapa de restricción del inserto de pFPEP02 es mostrado en la Fig. 1. Para localizar la región de codificación se escinde el ADN del inserto por medio de enzimas de restricción apropiadas y se subclona en pUC 118 o pUC 119. El clon que tiene 2,6 kb del fragmento HincII - EcoRI (pFPH6) muestra la actividad más alta de la enzima. Para determinar la secuencia completa de nucleótidos de este fragmento, se generan una serie de subclones de supresión ya sea del extremo de un fragmento más grande que incluye al fragmento de 2,6 kb (pFPEP03, depositado como FERM BP-3466). A partir de los mutantes de supresión y de los fragmentos de restricción subclonados, se determina la secuencia completa del fragmento de 2,6 kb por medio del método didesoxi (SEQ ID No. 1).

El gen para la prolilendopeptidasa se representa por medio de la caja abierta en la Fig. 1. Se encuentra que el gen tiene un marco de lectura abierta de 2.118 pb, que está precedido por una secuencia promotora putativa separada por 28 pb del codón de iniciación ATG. La endopeptidasa, predicha a partir de la secuencia de nucleótidos, consiste de 705 residuos aminoácidos con un peso molecular calculado de 78.700, de acuerdo con el valor de 77.500 determinado por equilibrio de sedimentación (Yoshimoto, T. y colaboradores, Agric. Biol. Chem. 1982, 46, 2157-2158). Se ha considerado que la enzima es una serina proteasa con base en el estudio del inhibidor (Yoshimoto y colaboradores, 1980, ver más arriba). De acuerdo con el supuesto existe una secuencia de consenso del sitio catalítico de serina proteasa, Gly-X-Ser-X-Gly, en la región C-terminal. El contenido de G-C del fragmento clonado HincII-EcoRI es del 38,4% y bastante bajo, contrario a las expectativas. En los bancos de datos de proteína, NBRF-PIR y SWISS-PROT, no se encontró proteína que tenga una homología significativa con la prolilendopeptidasa.

Ejemplo 5 Expresión de prolilendopeptidasa

Para la expresión de la prolilendopeptidasa, se cultiva E. coli transformado con un plásmido en medio TY a 37ºC con agitación en un agitador rotatorio (120 rpm). El caldo TY utilizado para la expresión de prolilendopeptidasa en E. coli contiene 1% de Bacto-triptona, 0,1% de extracto Bacto-levadura, 0,1% de glucosa, 0,8% de NaCl, pH 7. Se cultiva F. meningosepticum en un medio de polipeptona que contiene 1% de polipeptona, 0,2% de extracto Bacto-levadura, 0,1% de MgSO_{4}.7H_{2}O y 2,5% de NaCl (pH 7), de acuerdo con las instrucciones de una recopilación de medios.

Se emplean dos métodos de análisis (A y B) para estimación cualitativa de la actividad de la enzima y para la evaluación cuantitativa, respectivamente. En el método A, se utiliza Z-Gly-Pro-\beta-naftilamida (Z=N-bencilcarbonilo) como sustrato. A 0,8 ml de amortiguador Tris-HCl 20 mM, pH 7,0, se le añaden 0,1 ml de cultivo de E. coli o una suspensión diluida de células y se incuba previamente la mezcla a 37ºC durante 3 min. Se inicia la reacción por medio de la adición de 0,1 ml de la solución del sustrato (5 mM) en 40% de dioxano y se termina después de 10 min por medio de la adición de 0,5 ml de solución Fast Garnet GBC (1 mg/ml) que contiene 10% de Triton X-100 en amortiguador de acetato 1M, pH 4,0. Se mantiene la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 20 min y se centrifuga a 12.000 g durante 5 min. Se mide la absorbancia del sobrenadante a 550 nm.

En el análisis cuantitativo (B), se cosechan las células de E. coli por medio de centrifugación, se lavan con HEPES 0,1 M (pH 7,4), y se suspende en el mismo volumen de la solución de HEPES como el cultivo. Se sonica la suspensión de células sobre hielo durante 60 segundos con intervalos de 3 min ara producir un lisado celular. A 0,94 ml de amortiguador de fosfato de potasio 0,1 M, pH 7,0 se le añaden 0,05 ml de Z-Gly-Pro-p-nitroanilida 4 mM en 40% de dioxano. Después de 3 min de incubación previa a 30ºC, se añaden 0,01 ml del lisado diluido a la mezcla y el cambio de absorbancia es seguido a 410 nm con un espectrofotómetro Hitachi U-3210 a 30ºC. Una unidad de la actividad de la enzima se define como la cantidad de la enzima que libera 1 \mumol de p-nitroanilina por minuto, que corresponde a 8,87 OD/min con este procedimiento estándar.

Aunque el clon que tiene al fragmento HincII-EcoRI (pFPH6) muestra claramente la actividad de la prolilendopeptidasa, la actividad es mucho más pequeña que aquella de la bacteria original. Para mejorar el nivel de expresión, se prepara otro conjunto de mutantes de supresión a partir del clon que tiene al fragmento HincII-BamHI (pFPH5). Como la supresión se extiende desde el extremo 5' del fragmento, la actividad de la enzima se incrementa gradualmente hasta alcanzar un máximo con pFPH-KD50 (Figura 1). Y luego disminuye la actividad pero aún moderada (pFPFH5-KD7), cuando la supresión alcanza a la parte inicial del marco de lectura. Se detecta muy poca actividad a partir de un clon con supresión adicional (pFPH-KD6). Por lo tanto, la expresión de la enzima en KD50 es investigada adicionalmente en detalle.

El plásmido pFPH5-KD50 contiene 120 pb de la región no codificadora secuencia arriba que comprende a la secuencia promotora putativa, junto con la longitud completa del marco de lectura abierta. E. coli (JM83) transformada por este plásmido se cultiva en medio TY, y la expresión durante el transcurso del tiempo de la prolilendopeptidasa es seguida con la actividad de la enzima de la proteína total en el homogenizado de la célula lavada (Tabla III). Entre 6 y 12 horas, mientras se detiene el crecimiento bacteriano, se incrementa rápidamente la actividad total de la enzima y alcanza el valor máximo de 3.371 unidades/L, que corresponde a 10 veces la actividad de la enzima alcanzada por F. meningosepticum (346 unidades/L). La actividad total permanece constante hasta 24 horas y luego disminuye lentamente. Por otro lado, la actividad específica muestra el incremento rápido alrededor de 6 a 12 horas, similar a la actividad total, pero se incrementa gradualmente aún después de 24 h. Se alcanza una actividad máxima específica de 10,6 unidades/mg de proteína alrededor de las 36 h. Ya que la actividad específica típica de la prolilendopeptidasa purificada es de aproximadamente 115 unidades/mg de proteína, el nivel de expresión de la prolilendopeptidasa alcanza la cantidad aproximada de 1/10 de la proteína total.

Tal nivel alto de expresión de prolilendopeptidasa se demuestra también en el análisis SDS-PAGE. La muestra para SDS-PAGE se prepara mezclando los lisados descritos antes con un volumen igual de amortiguador para la muestra que contiene SDS y \beta-mercaptoetanol y se incuba a 96ºC durante 5 min. La electroforesis se realiza utilizando una placa de premoldeo (12,5%, 84 x 90 x 1,0 mm) y el aparato obtenido de Daiichi Pure Chemicals Co. Ltd. (Tokio), de acuerdo con los protocolos dados por el fabricante. El gel se colorea con azul Brillante de Coomassie
R250.

A las 12 h se distingue claramente una nueva banda en la misma posición que el estándar de prolilendopeptidasa de F. meningosepticum. La intensidad de esta banda es más alta alrededor de las 12-14 horas, concomitantemente con el cambio de la actividad total de la enzima.

La producción de la prolilendopeptidasa se muestra en la siguiente Tabla III.

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TABLA III Expresión de la prolilendopeptidasa en E. coli (JM83) que hospeda a pFPH5-KD50

3

TABLA III (continuación)

4

Ejemplo 6 Mejora adicional de la expresión

La expresión en la cepa JM83 de E. coli que hospeda a pFPH5-KD50 ha alcanzado un nivel bastante alto, pero un nivel aún más alto sería preferible para la producción industrial de prolilendopeptidasa. En pFPH5-KD50 se encuentra una secuencia promotora putativa, originaria de F. meningosepticum, y se asume que funciona en E. coli. Para mejorar adicionalmente el nivel de expresión, se reemplaza el promotor nativo por el promotor híbrido fuerte trp-lac (o el promotor tac), como sigue.

El plásmido pFPEPO2 se digiere con HincII para obtener un fragmento de HincII de 3,1 k pb que contiene al gen para la prolilendopeptidasa, que es luego subclonado en el sitio SmaI de pUC118 por ligación en el extremo romo para producir pFPEPO4. Después de la ligación, se escinden los puntos de inserción en ambos extremos del fragmento ni por HincII ni por SmaI (Fig. 2). Para suprimir los sitios Scal y PvuII en la región de codificación se prepara el fragmento de oligonucleótido bicatenario sintético que corresponde a la secuencia entre los sitios SmaI y PvuII pero está mutada en dos posiciones (Fragmento Sintético I, ver la SEQ ID No. 2) por templado de la cadena inferior y de la cadena superior únicamente cuyos extremos 5' hayan sido previamente fosforilados por la polinucleótido quinasa de T4.

Por otro lado, se escinde el plásmido pFPEPO4 en el sitio único SmaI que existe en el maro de lectura abierta, y se liga el fragmento mutado SmaI-PvuII mencionado anteriormente al plásmido linealizado en ambos sitios SmaI terminales. El producto de ligación es luego digerido por SacI y el fragmento más largo, que contiene la porción 5' de la región de codificación, se aísla por medio de electroforesis en gel de agarosa. Después de kinasión del fragmento aislado, se liga la pieza perdida entre los sitios PvuII y SacI, preparada separadamente a partir de pFPEPO4, a la construcción del plásmido pFPEPO4'. Ya que un nucleótido en el terminal generado por PvuII ha sido cambiado en el fragmento sintético, el sitio PvuII no se regenera por esta ciclización.

Luego, se crea un nuevo sitio EcoRI inmediatamente secuencia arriba del codón de iniciación del gen que codifica para la prolilendopeptidasa de la siguiente manera (ver Fig. 3). El fragmento sintético II (SEQ ID No. 3) se prepara por ligación de los cuatro oligonucleótidos U1, U2, L1 y L2 (ver SEQ ID Nos. 4, 5, 6 y 7, respectivamente), donde dos de ellos (U2 y L1) han sido fosforilados en sus terminales 5'. El fragmento preparado corresponde desde el codón de iniciación hasta el sitio PvuII en la región de codificación secuencia arriba y tiene un terminal cohesivo 5' que empuja inmediatamente secuencia arriba del sitio de iniciación para introducir el sitio EcoRI después de ligación. Para la siguiente ligación ambos extremos 5' del fragmento preparado son fosforilados por la polinucleótido quinasa de T4.

El plásmido pFPEPO4', en el cual uno de cuatro PvuII han sido suprimidos, es digerido con PvuII, y el fragmento que contiene la mayor parte de la región de codificación se aísla por medio de electroforesis en gel de agarosa y se liga al segundo fragmento sintético descrito anteriormente. El producto obtenido por medio de ligación se digiere con EcoRI para aislar al marco de lectura abierta completo con los extremos cohesivos 5' que empujan en ambos terminales, que es luego subclonado en el sitio EcoRI de pUC119. Las dos regiones sintéticas en el plásmido obtenido, pFPEP-EE, se secuencian y se confirman las secuencias de nucleótidos mutadas. El plásmido resultante es pFPEP-EE.

En la siguiente etapa de la construcción del vector, como se muestra en la Fig. 4, la región de codificación completa, junto con una corta región no codificadora secuencia abajo, se escinde fuera de pFPEP-EE por medio de EcoRI. Se inserta luego el fragmento en el sitio EcoRI del vector de expresión, pKK223-3, para proveer pKK-FPEP en el cual la transcripción del gen que codifica para la prolilendopeptidasa está bajo el control del promotor tac.

El origen de replicación de pKK223-3 se origina a partir de pBR322 y el número de copias de este vector de expresión en una célula sencilla es usualmente bajo. Debido al efecto de dosis mayores del gen, es preferible un alto número de copias del plásmido como vector de expresión para un mayor nivel de expresión. Por lo tanto, a) un juego del promotor y de la región de codificación o b) un juego del promotor, la región de codificación y el terminador es cortado por BamHI o BbiII, respectivamente, y trasplantado en el plásmido de alto número de copias, pUC119. Ya que el gen que codifica para la peptidasa se transfiere desde pKK-FPEP junto con el promotor tac, se remueve el promotor original lac de pUC119 por medio de PvuII con el propósito de evitar al promotor doble. En medio de los extremos romos generados por esta digestión de PvuII ya sea el juego a) o el juego b) del gen, que ha sido embotado por la ADN polimerasa T4, se inserta para producir pUK-FPEP-a o pUK-FPEP-b, respectivamente (Fig. 4).

Por la sobreexpresión de la prolilendopeptidasa, la cepa JM 109 de E. coli se transforma por medio de pUK-FPEP-a o pUK-FPEP-b. Los transformantes se seleccionan sobre placas LB que contienen 50 \mug/ml de ampicilina y se cultivan en medio LB con la ampicilina durante la noche. Para la expresión de la prolilendopeptidasa, se inoculan 100 ml de medio CIRCLEGROW (BIO 101, Inc., Vista, California) (sin ampicilina) con 2 ml del cultivo durante la noche y se agita a 37ºC. En un experimento preliminar se encontró que el nivel de expresión máximo en el transformante que hospeda a pUK-FPEP-a (13.500 unidades/L) es dos veces más alto que aquel para pUK-FPEP-b (6.600 unidades/L) cuando se refuerza la expresión con IPTG 1 mM medio día después de la inoculación. Sin la IPTG, los niveles de expresión basal para ambos clones son aún bastante altos; en el caso de pUK-FPEP-b es aún más alto (8.060 unidades/L) que el nivel obtenido por la adición de IPTG.

Ya que pUK-FPEP-a muestra el nivel de expresión más alto, alcanzando 39 veces el de la actividad de la enzima obtenida por F. meningosepticum y 4 veces el nivel de expresión logrado con el pFPH5-KD50, el tiempo de la expresión es seguido con o sin la adición de IPTG (Tabla IV). Mientras el crecimiento, monitoreado por medio de la absorbancia del caldo de cultivo a 550 nm, disminuyó aproximadamente 4 h después de la inoculación, la actividad de la enzima se incrementa linealmente con el transcurso del tiempo. Sin el refuerzo de la expresión por la IPTG, la actividad se incrementa además linealmente hasta las 20 h hasta lograr el máximo nivel de 7.400 unidades/L a las 24 h y luego disminuye. La actividad específica de la endopeptidasa permaneció constante alrededor de 11 unidades/mg de proteína después de 12 h. Por otro lado, cuando se añade IPTG 1 mM a las 12 h, se mejora claramente el incremento inmediatamente después de la adición, alcanzando el nivel de expresión más alto de 13.500 unidades/L a las 28 h. Se observa también un incremento significativo en la actividad específica simultáneamente con el agudo incremento en el nivel de expresión y se observa la actividad específica máxima, 40 unidades/mg de proteína, a las 28 h y más tarde, demostrando claramente el efecto de la inducción de IPTG sobre el promotor tac. Ya que se reportó que una preparación típica pura de prolilendopeptidasa de F. meningosepticum muestra una actividad específica de 115 unidades/mg de proteína (Yoshimoto, T. y colaboradores, 1978, ver más arriba), la enzima expresada da cuenta de más del 30% de la proteína total extraída de E. coli.

Una expresión tan alta de prolilendopeptidasa es demostrada también en el análisis SDS-PAGE. Casi 6 horas después de la inoculación, se observa claramente la aparición de una nueva banda en la misma posición que el estándar de prolilendopeptidasa, y la expansión de esa banda demuestra el incremento en el nivel de expresión claramente durante el tiempo entre 12 h y 28 h, concomitantemente con el cambio de la actividad total de la enzima.

TABLA IV

5

Ejemplo 7 Producción de la prolilendopeptidasa recombinante

Ya que la prolilendopeptidasa se expresa en E. coli en una forma soluble y activa y el nivel de expresión es tan alto (más del 30% de la proteína total extraída), el aislamiento de la enzima expresada es bastante directo.

Las células de E. coli transformadas con el plásmido de expresión pUK-FPEP-a se cultivan en el medio CIRCLEGROW con refuerzo de IPTG durante 28 horas a 37ºC, Las células de E. coli se recolectaron por medio de centrifugación (3.000 g durante 10 min) y se lavaron con amortiguador HEPES frío 0,1 M, pH 7,4. Las células lavadas se resuspenden en HEPES 0,1 M y se rompen por medio de sonicación de forma intermitente durante 20 min con un SONIFIER 450 (BRANSON Sonic Power Co.). El lisado es luego fraccionado con precipitación en sulfato de amonio. La proteína precipitada en sulfato de amonio saturado al 65-95% se disolvió en amortiguador de fosfato 20 mM, pH 6,2 y se dializó contra el mismo amortiguador. Se aplicó el dializado a una columna CM52 (Whatman BioSystems Ltd.) equilibrada con el mismo amortiguador. Se eluye la enzima por medio de un gradiente lineal de NaCl. Se combinan las fracciones activas, se concentran por medio de ultracentrifugación con una celda Amicons y una membrana YM30 (Amicon Div., W.R. Grace & Co.) y se dializan contra amortiguador de fosfato 20 mM, pH 6,8. Se purifica adicionalmente la prolilendopeptidasa sobre una columna Mono S HR 10/10 (Pharmacia LKB Biotechnology AB). Con un gradiente de NaCl (0-0,075 M) se eluye la endopeptidasa en un pico agudo alrededor de 0,035 M de NaCl. La enzima purificada parece ser homogénea produciendo únicamente una banda única en
SDS-PAGE.

Ejemplo 8 Producción de la hormona que libera la hormona luteinizante (LH-RH)

Ya que LH-RH (un decapéptido) tiene un residuo de prolina en la penúltima posición, se prepara a partir de un precursor no péptido y glicinamida. En presencia de una cantidad catalítica de prolilendopeptidasa (0,08 \muM), se incuban 1 mM del precursor y 2,0 M de glicinamida en 60% de glicerol a pH 7,0 y 30ºC. En 48 h el acoplamiento llega al equilibrio con la hidrólisis y se obtiene LH-RH en la conversión del 67% de rendimiento cuantitativo (97% de rendimiento en el aislamiento). El resto del precursor se recupera en la purificación por HPLC y no se observa una reacción secundaria.

Ejemplo 9 Producción de oxitocina

La oxitocina, un nonapéptido que tiene un residuo de prolina en la tercera posición forma su C-terminal, se obtiene por medio del acoplamiento del precursor de los primeros siete residuos a la leucilglicinamida con prolilendopeptidasa. En un ejemplo típico se incuban 1 mM del precursor de oxitocina [1-7] y 0,8 M de leucilglicinamida con 0,13 \muM de prolilendopeptidasa en 60% de glicerol a pH 6,5 y 30ºC. El acoplamiento procede hasta alcanzar un equilibrio después de 48 h y 55% del precursor se convierte a oxitocina en un rendimiento cuantitativo (91% de rendimiento en el aislamiento). No se detectaron productos secundarios y se recuperó 43% del material de partida.

Ejemplo 10 Método alternativo para la purificación de prolilendopeptidasa recombinante

Las células de E. coli que expresan prolilendopeptidasa se recolectan por centrifugación (10.000 g por 10 min) y se lavan con amortiguador Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0. La células lavadas se resuspenden en solución de sacarosa 0,5 M que contiene EDTA 5 mM amortiguado a pH 8,0 con Tris-HCl 0,1 M. Se añade lisozima (160 \mug/ml) a la suspensión y se deja la mezcla sobre hielo durante 2 min antes de la dilución con el mismo volumen de agua enfriada con hielo. La suspensión diluida de células se deja posteriormente sobre hielo durante 30 min y luego se centrifuga a 10.000 g durante 20 min. El sobrenadante se diluye nuevamente con el mismo volumen de agua enfriada con hielo y se ajusta su pH en 7,0 con NaOH 1 N. La solución obtenida de enzima cruda (una fracción de periplasma) es aplicada directamente a una columna CM 52 (Whatman BioSystems Ltd.) equilibrada con amortiguador de fosfato 20 mM, pH 6,8. Se eluye la enzima en un pico único con un gradiente lineal (0-0,25 M) de NaCl. En este método alternativo de purificación con el procedimiento por choque osmótico, se purifica la prolilendopeptidasa hasta homogeneidad de acuerdo a lo juzgado por el análisis SDS-PAGE con una etapa única de cromatografía.

Ejemplo 11 Propiedades de la prolilendopeptidasa recombinante de Flavobacterium meningosepticum expresada en E. coli

El método (B) descrito en el Ejemplo 5 se modifica para analizar la prolilendopeptidasa purificada. Se incluyen DTT (1 mM) y BSA (100 \mug/ml) en la solución amortiguadora de fosfato 0,1 M (pH 7,0) para el análisis para mejorar la reproducibilidad y la precisión de la medición cinética. A 0,94 ml de esta solución amortiguada se le añaden 0,05 ml de Z-Gly-Pro-p-nitroanilida 4 mM en 40% de dioxano. Después de 3 min de incubación previa a 30ºC, se añaden 0,01 ml de la solución de la enzima obtenida en el ejemplo 10 a la mezcla y se siguen los cambios de la absorbancia a 410 nm a 30ºC.

En una purificación típica se obtiene la enzima con una actividad específica superior a 120 unidades/mg de proteína. Se estima que el peso molecular es de 71.000 y de 74.000 por filtración en gel con una columna TSK-GEL G3000SW (Tosoh Corp.) y SDS-PAGE, respectivamente. La enzima muestra un coeficiente de extinción E (1%/280 nm) de 15,5. Existen dos residuos de cisteína de acuerdo con la secuencia de aminoácidos deducida con SEQ ID No. 1, pero no es detectable un grupo sulfhidrilo libre por titulación con ácido p-cloromercuribenzóico bajo una condición desnaturalizada con urea 8 M.

Se encuentra que la secuencia N-terminal de la prolilendopeptidasa recombinante inicia con Ala y es seguida por Gln, Asn, Ser, Asn, X (desconocido), Leu, Lys, Tyr, y Pro, siempre que los primeros 19 residuos aminoácidos mostrados en la secuencia con la SEQ ID No. 1 codifiquen una secuencia señal y estén ausentes del N-terminal de la enzima madura.

Microorganismos Depositados

TG1/pFPEPO3 de E. coli fue depositado bajo el Tratado de Budapest en el Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FRI), 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón, el 5 de julio de 1991, como FERM BP-3466.

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Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

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Documentos de patente citados en la descripción

\bullet JP H25880 A [0004]

\bullet EP 0213593 B [0033] [0033]

\bullet WO 8600089 A [0033]

\bullet US 4758512 A [0050]

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Literatura citada en la descripción que no es de patente

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\bulletYOSHIMOTO, T y colaboradores, J. Biol. Chem., 1980, vol. 255, 4786-4792 [0003]

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\bulletKOBAYASHI, R y colaboradores, Tanpakushitsu Kakusan Koso, 1986, vol. 31, 991-1002 [0062]

\bulletTARR, G.E. Methods in protein sequencing analysis. Humana Press, 1982, 223-232 [0062]

\bulletYOSHIMOTO, T y colaboradores, Agric. Biol. Chem., 1982, vol. 46, 2157-2158 [0071]

SEQ ID No. 1

TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido con la proteína correspondiente
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 2636 pares de bases
ENTRELAZAMIENTO: doble
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
FUENTE ORIGINAL
ORGANISMO: Flavobacterium meningosepticum
FUENTE EXPERIMENTAL INTERMEDIA
NOMBRE DEL PLÁSMIDO: pFPEP03
CARACTERÍSTICA: ADN genómico que codifica para prolilendopeptidasa
	de 1 a 259, región promotora
	de 260 a 316, secuencia de señal
	de 317 a 2374, región de codificación de la prolilendopeptidasa madura
	de 2375 a 2377, codón de detención

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

6

7

8

9

10

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID No. 2

TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 44 pares de bases

ENTRELAZAMIENTO: doble

TOPOLOGÍA: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGTAGGA GTTCTGGATA TGCTTCGTTA TAATAAGTTT ACTG

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID No. 3

TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 54 pares de bases

ENTRELAZAMIENTO: doble

TOPOLOGÍA: lineal

DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

13

SEQ ID No. 4

TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 23 bases

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

TOPOLOGÍA: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTCATGAA GTACAACAAA CTT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID No. 5

TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 31 bases

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

TOPOLOGÍA: lineal

DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTGTGGCAG TTGCAGCCTT TGCTTTTGCA G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID No. 6

TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 25 bases

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

TOPOLOGÍA: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACAGAAAGT TTGTTGTACT TCATG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID No. 7

TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 25 bases

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

TOPOLOGÍA: lineal

TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGCAAAAGC AAAGGCTGCA ACTGC

\hfill

25

Claims (6)

1. Un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica a la prolilendopeptidasa de Flavobacterium meningosepticum como se muestra en la SEQ ID NO: 1 que se extiende desde la posición del nucleótido 317 hasta el 2374 y una secuencia señal como se observa en la SEQ ID NO: 1 que se extiende desde la posición del nucleótido 260 hasta el 316, clonada en un plásmido multicopia bajo el control del promotor tac de E. coli.

2. Un organismo huésped transformado con un vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Un organismo huésped de acuerdo con la reivindicación 2, que es E. coli.

4. Un método de producir un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica a la prolilendopeptidasa de Flavobacterium meningosepticum como se muestra en la SEQ ID NO: 1 que se extiende desde la posición del nucleótido 317 hasta el 2374 y una secuencia señal como se observa en la SEQ ID NO: 1 que se extiende desde la posición del nucleótido 260 hasta el 316, clonada en un plásmido multicopia bajo el control del promotor tac de E. coli, que comprende las etapas de:

preparar ADNc o ADN genómico que codifica para la prolilendopeptidasa del Flavobacterium meningosepticum como se muestra en la SEQ ID NO: 1 o preparar dicho ADN por medio de síntesis química;

insertar el ADN en un vector de clonación del plásmido multicopia bajo el control del promotor tac de E. coli;

seleccionar un vector de expresión híbrido que contiene y expresa al ADN que codifica para la prolilendopeptidasa del Flavobacterium meningosepticum como se muestra en la SEQ ID NO: 1.

5. Un proceso para producir un organismo huésped de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende la transformación de dicho organismo huésped con un vector de expresión recombinante de la reivindicación 1.

6. Un proceso d acuerdo a la reivindicación 5, en donde el huésped es E. coli.