DE60216434T2

DE60216434T2 - Neues protein und dieses codierende dna

Info

Publication number: DE60216434T2
Application number: DE60216434T
Authority: DE
Inventors: Shigeru Nakamori; Hiroshi Takagi; Masakazu Takahashi; Kazuhisa Tsujimoto; Hideyuki Yamada
Original assignee: Seiren Co Ltd
Current assignee: Seiren Co Ltd
Priority date: 2001-03-02
Filing date: 2002-03-01
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2022-03-02
Also published as: US7314745B2; EP1375656A4; US20040096862A1; EP1375656B1; EP1375656A1; JPWO2002070688A1; JP3883961B2; WO2002070688A1; DE60216434D1

Description

Erfindungshintergrund
Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Protein, das aus der mittleren Spinndrüse der Seidenraupe stammt, und eine DNA, die dieses Protein kodiert.
Stand der Technik
Üblicherweise wird eine große Zahl von Proteasen aus Organismen, wie etwa Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen, isoliert. Sie werden in den unterschiedlichsten Gebieten verwendet, wie in der Lebensmittelverarbeitung, beim Zartmachen von Fleisch, in der Lederindustrie, bei der Enantiomerentrennung, als Waschmittelzusatzstoffe, zum fermentativen oder eingeschränkten Abbau von Proteinen und Peptiden, zur Analyse, Identifizierung, zum Abbau oder zur Synthese verschiedener Peptide oder Proteine und darüber hinaus als Testreagenzien oder Pharmazeutika für Krankheiten.
Da sich der Bereich der industriellen Anwendung von Proteasen erweitert, besteht ein Bedarf an Proteasen, die hochstabil sind und im Hinblick auf die Substratspezifität oder dergleichen für Anwendungen nützlich sind.
Kurzfassung der Erfindung
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben kürzlich ein spezielles Protein entdeckt, das speziell in einer Zelle der Seidenraupe, einem industriell wichtigen Insekt, vorhanden ist, insbesondere in der Spinndrüse der Seidenraupe. Darüber hinaus haben die Erfinder dieser Erfindung kürzlich eine DNA kloniert, die dieses neue Protein kodiert, das vorherrschend in der mittleren Spinndrüse der Seidenraupe exprimiert wird, haben eine Basensequenz dieser DNA-Sequenz und eine aus dieser Basensequenz erwartete Aminosäuresequenz bestimmt und haben darüber hinaus erfolgreich diese DNA in einer Wirtszelle zur Herstellung exprimiert. Das auf diese Weise erhaltene Expressionsprodukt wies Proteaseaktivität auf. Dieses Expressionsprodukt wurde Bm-SGSP (oder „aus Spinndrüsen von Bombyx mori stammende Serinprotease") genannt. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen Forschungsergebnissen.
Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Protein, das aus der mittleren Spinndrüse der Seidenraupe stammt, und eine dieses Protein kodierende DNA bereitzustellen.
Das Protein ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus folgendem besteht:

(a) einem Protein, das die Aminosäuresequenz umfasst, die durch SEQ ID NO: 1 repräsentiert wird;
(b) einem Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 55 % Homologie mit einem Protein aufweist, das die Aminosäuresequenz umfasst, die durch die SEQ ID NO: 1 repräsentiert wird, und Proteaseaktivität besitzt.

Hierbei ist die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 die folgende Sequenz.
Bei der oben erwähnten Sequenz können Aminosäurereste in Klammern einer von den beiden sein.
Erfindungsgemäß wird darüber hinaus eine DNA bereitgestellt, die das oben erwähnte Protein (a) oder (b) kodiert. Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird eine DNA bereitgestellt, die eine Basensequenz umfasst, die 60 % oder mehr Homologie zur Basensequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 2 repräsentiert wird, und Proteaseaktivität aufweist.
Hierbei ist die Basensequenz der SEQ ID NO: 2 die folgende Sequenz.
Bei der oben erwähnten Sequenz können Basen in Klammern eine von den beiden sein.
Erfindungsgemäß kann eine DNA, die Serinprotease kodiert, insbesondere Bm-SGSP, das vorherrschend in der Spinndrüse der Seidenraupe exprimiert wird, kloniert werden und darüber hinaus kann ein durch diese DNA kodiertes Protein isoliert und gereinigt werden. Das erfindungsgemäße Protein ist zur Analyse von Proteinstrukturen oder für die funktionelle Veränderung durch Spaltung spezifischer Aminosäuresequenzen bei Ausnutzung der Substratspezifität oder für Pharmazeutika, bei denen auf einen spezifischen Proteinabbau abgezielt wird, oder in verschiedenen Gebieten, wie etwa der Lebensmittelverarbeitung, beispielsweise dem Zartmachen von Lebensmitteln und zur Aromaverbesserung, sehr nützlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 stellt einen Zusammenhang zwischen einer konservierten Sequenz von Serinprotease und auf Primern aufgebauten Sequenzen dar.
2 zeigt die Schritte des Konstruierens eines Plasmids, das die vollständige Länge des Seidenraupenspinndrüsen-Serinprotease-Gens aufweist.
3a und 3b zeigen die Basensequenz und Aminosäuresequenz von Bm-SGSP.
4 stellt die Seidenraupenspinndrüse dar.
5 ist eine Photographie, die das Ergebnis der Elektrophorese zur Bestätigung der Hrn-SGSP-ortsspezifischen Expression (Schritt 9 im Beispiel) demonstriert.
6 ist eine Photographie, die das Ergebnis der Elektrophorese zur Bestätigung der Produktion von Bm-SGSP durch Insektenzellen (Schritt 11 im Beispiel) demonstriert.
7 ist das Ergebnis der Messung der Proteaseaktivität von Bm-SGSP.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Erfindungsgemäßes Protein
Das erfindungsgemäße Protein ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus folgendem besteht:

(c) einem Protein, das die Aminosäuresequenz umfasst, die durch SEQ ID NO: 1 repräsentiert wird;
(d) einem Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 55 % Homologie mit einem Protein aufweist, das die Aminosäuresequenz umfasst, die durch die SEQ ID NO: 1 repräsentiert wird, und Proteaseaktivität besitzt.

Bei der vorliegenden Erfindung ist mit einem Protein, das Proteaseaktivität besitzt, ein Protein gemeint, das durch einen Fachmann als Proteaseaktivität aufweisend erkannt wird. Beispielsweise ist ein Protein gemeint, das als Proteaseaktivität aufweisend bewertet wird, wenn es unter den gleichen Bedingungen gemessen wird, wie sie in Schritt 9 im Beispiel beschrieben sind.
Bei der vorliegenden Erfindung ist die Proteaseaktivität des Proteins vorzugsweise Serinproteaseaktivität. Und zwar ist das erfindungsgemäße Protein vorzugsweise aus Seidenraupenspinndrüsen stammende Serinprotease (Bm-SGSP).
Darüber hinaus wird beschrieben, dass das Protein ein Derivat des Proteins einschließen kann. Mit dem Derivat ist hierin ein Protein (Peptid) gemeint, das die oben erwähnte Proteaseaktivität aufweist, bei dem die Aminogruppe des Aminoterminus (N-Terminus) des Proteins oder alle Aminogruppen oder ein Teil davon an ihren Seitenketten der jeweiligen Aminosäure und/oder die Carboxylgruppe des Carboxylterminus (C-Terminus) des Peptids oder alle Carboxylgruppen oder ein Teil davon an ihren Seitenketten der jeweiligen Aminosäure und/oder alle anderen funktionellen Gruppen als Aminogruppen und Carboxylgruppen oder ein Teil davon an Seitenketten der jeweiligen Aminosäure (beispielsweise Wasserstoffgruppe, Thiolgruppe und Amidgruppe) durch eine geeignete Substitutionsgruppe modifiziert sind. Solche Modifikationen durch andere geeignete werden gelegentlich zum Zweck des Blockierens von funktionellen Gruppen, die in einem Peptid vorhandenen sind, und Verbesserns der Sicherheit und Gewebemobilität oder Erhöhens der Aktivität verwendet.
Bei der vorliegenden Erfindung impliziert der Ausdruck „Aminosäure" ihre optischen Isomere, und zwar sowohl die D- als auch die L-Form. Darüber hinaus muss die Aminosäure hierin nicht allein die 20 Arten von α-Aminosäuren einbeziehen, die die natürlichen Proteine aufbauen, sondern auch andere α-Aminosäuren sowie β-, γ- und δ-Aminosäuren und nichtnatürliche Aminosäuren.
Es wird beschrieben, dass das bei (b) erwähnte Protein ein Protein ist, das eine modifizierte Aminosäuresequenz der oben bei (a) beschriebenen Aminosäuresequenz umfasst, bei der eine oder mehrere Aminosäurereste konservativ substituiert sind, und Proteaseaktivität aufweist.
Der Ausdruck „konservative Substitution" hierin bedeutet die Substitution von einem oder mehreren Aminosäureresten durch andere chemisch homologe Aminosäurereste, ohne die Proteinaktivität wesentlich zu ändern. Beispielsweise kann ein bestimmter hydrophober Rest durch einen anderen hydrophoben Rest substituiert sein, ein bestimmter polarer Rest kann durch einen anderen polaren Rest, der die gleiche Ladung aufweist, substituiert sein oder eine bestimmte aromatische Aminosäure kann durch eine andere aromatische Aminosäure substituiert sein. Funktionell homologe Aminosäuren, die auf solche Art und Weise konservativ substituiert werden können, sind im Fachgebiet für einzelne Aminosäuren bekannt. Die folgenden sechs Gruppen sind spezifische Beispiele. Die Aminosäuren in der gleichen Gruppe können jeweils gegenseitig konservativ substituiert werden.

(i) Alanin (Ala), Serin (Ser) und Threonin (Thr)
(ii) Asparaginsäure (Asp) und Glutaminsäure (Glu)
(iii) Asparagin (Asn) und Glutamin (Gln)
(iv) Arginin (Arg) und Lysin (Lys)
(v) Isoleucin (Ile), Leucin (Leu), Methionin (Met) und Valin (Val)
(vi) Phenylalanin (Phe), Tyrosin (Tyr) und Tryptophan (Trp)

Erfindungsgemäß wird ein Protein bereitgestellt, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die 55 % oder mehr Homologie mit einem Protein aufweist, das aus der Aminosäuresequenz besteht, die durch SEQ ID NO: 1 repräsentiert wird, und Proteaseaktivität besitzt. Die zuvor erwähnte Homologie beträgt 55 % oder mehr, vorzugsweise 60 % oder mehr und noch besser 70 % oder mehr.
Der Grad der „Homologie" hierin kann durch Vergleich mit der Aminosäuresequenz bestimmt werden, die durch SEQ ID NO: 1 repräsentiert wird, beispielsweise unter Verwendung des Homologiesuchprogramms BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), das von NCBI (National Center for Biotechnology Information) entwickelt wurde und über das Internet erhältlich ist, oder des Computerprogramms zur Verarbeitung genetischer Information GENETYX (Software Development Co.).
Es wird beschrieben, dass das Protein die folgenden Proteine (a') oder (b') umfassen kann:

(a') ein Protein, das die Aminosäuresequenz umfasst, die durch SEQ ID NO:3 repräsentiert wird;
(b') ein Protein, das eine modifizierte Aminosäuresequenz der oben bei (a) beschriebenen Aminosäuresequenz umfasst, bei der ein oder mehrere (vorzugsweise 1 bis 24, besser 1 bis 10 und am besten 1 bis 5) Aminosäurereste entfernt, substituiert, eingesetzt oder hinzugefügt sind und das Proteaseaktivität besitzt.

Erfindungsgemäße DNA
Eine erfindungsgemäße DNA ist eine DNA, die das oben erwähnte Protein kodiert. Demgemäß ist die erfindungsgemäße DNA eine DNA, die eines der folgenden Proteine (a) oder (b) kodiert:

Im Allgemeinen kann bei gegebener Aminosäuresequenz eines Proteins eine Basensequenz, die es kodiert, leicht unter Bezugnahme auf die so genannte Codontabelle bestimmt werden. Demgemäß können verschiedene Basensequenzen geeignet ausgewählt werden, die die Aminosäuresequenz kodieren, die durch SEQ ID NO: 1 repräsentiert wird. Demgemäß impliziert die DNA, die das Protein kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst, bei der vorliegenden Erfindung die DNA, die die Basensequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 2 repräsentiert wird, sowie jegliche DNA, die die gleiche Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 kodiert, welche degenerative Codons in der Basensequenz aufweist.
Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung umfasst eine DNA der vorliegenden Erfindung eine Basensequenz, die 60 % oder mehr Homologie zu einer DNA aufweist, die die Basensequenz umfasst, die durch SEQ ID NO: 2 repräsentiert wird, und ein Protein kodiert, das Proteaseaktivität besitzt. Die oben erwähnte Homologie beträgt 60 % oder mehr, bevorzugt 70 % oder mehr, noch besser 80 % oder mehr und am besten 90 % oder mehr.
Bei der vorliegenden Erfindung können durch im Fachgebiet bekannte Verfahren aus der DNA, die die Basensequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst, Mutanten hergestellt werden, beispielsweise durch ortspezifische Mutationsinduktion, Punktmutation, Deletion, Überlappung, Inversion, Insertion, Translokation und konservative Alteration, bei der nur Basensequenzen unter Anwendung der Degeneration von Gencodes geändert werden, ohne die Aminosäuresequenz zu verändern.
Es wird eine DNA beschrieben, die mit einer DNA, die die Basensequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 2 repräsentiert wird, unter strengen Bedingungen hybridisiert und ein Protein kodiert, das Proteaseaktivität aufweist.
Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung umfasst eine erfindungsgemäße DNA die Basensequenz, die durch SEQ ID NO: 2 repräsentiert wird, und noch besser die Basensequenz, die durch SEQ ID NO: 3 repräsentiert wird.
Herstellung des Proteins
Das erfindungsgemäße Protein kann entweder unter Verwendung verschiedener üblicher Synthetisierungsverfahren hergestellt oder aus einer natürlichen Quelle gewonnen werden. Das erfindungsgemäße Protein kann vollständig durch Synthese erhalten werden oder kann unter Verwendung einer Teilsequenz einer natürlich gewonnenen Sequenz und weiteres Synthetisieren auf der Grundlage der Teilsequenz erhalten werden, da dessen Aminosäuresequenz festgelegt ist. Gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung kann das erfindungsgemäße Protein aus einer natürlichen mittleren Spinndrüse der Seidenraupe erhalten werden.
Wenn eine DNA, die ein erfindungsgemäßes Protein kodiert, erhältlich ist oder aufgebaut werden kann, kann das Protein darüber hinaus in transformierten Zellen produziert werden, die durch Transformieren von Wirtszellen mit solche einer DNA erhalten werden. Um genau zu sein, das erfindungsgemäße Protein kann durch Gewinnen einer DNA, insbesondere in der Form eines rekombinanten Vektors, die in einer Wirtszelle replizierbar ist und ein DNA-Fragment, das das Protein kodiert, in einem exprimierbaren Zustand enthält, Transformieren der Wirtszelle unter Verwendung der DNA oder des Vektors und Kultivieren der auf diese Weise erhaltenen transformierten Zelle hergestellt werden. Und zwar kann bei der vorliegenden Erfindung zur Herstellung des Proteins ein so genanntes Wirt-Vektor-System verwendet werden. Bei der vorliegenden Erfindung können zum Anwenden eines solchen Wirt-Vektor-Systems verschiedene herkömmliche Verfahren, die auf diesem Technikgebiet verwendet werden, zum Aufbau der Expressionsvektoren (rekombinanten Vektoren) und zur Transformation verwendet werden.
Dementsprechend wird gemäß einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Proteins bereitgestellt, das die Schritte des Kultivierens der oben erwähnten transformierten Zellen und Gewinnung des Proteins von Interesse aus den sich ergebenden Zellen und/oder Zellkulturen. Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Protein gemäß einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel ein Protein, das durch das oben erwähnte Verfahren hergestellt wurde.
Rekombinanter Vektor
Erfindungsgemäß wird ein rekombinanter Vektor bereitgestellt, der eine DNA umfasst, die ein erfindungsgemäßes Protein kodiert.
Solch ein Vektor kann durch Einbau eines DNA-Fragments, das ein erfindungsgemäßes Protein kodiert, in ein konventionelles Vektorsystem erhalten werden. Bei der vorliegenden Erfindung kann dieser Vektor wenigstens zwei Wiederholungen des oben erwähnten DNA-Fragments enthalten.
Der bei der vorliegenden Erfindung zu verwendende Vektor kann unter Berücksichtigung der Art der zu verwendenden Wirtszelle aus konventionellen Vektoren ausgewählt werden, für die sich das Wirt-Vektor-System bewährt hat, wie etwa Plasmide, Viren, künstliche Chromosomen, Phagen und Cosmid-Vektoren. Um genau zu sein, es können beispielsweise die Plasmide pBR, pCU oder pQE oder λ-Phage-Bakteriophagen verwendet werden, wenn Escherichia coli als Wirtszelle verwendet wird, es können pUB-Plasmide für Bacillus subtilis verwendet werden, es können YEp- oder YCp-Vektoren für Hefen verwendet werden und es kann pSV2dhfr, das einen Hauptpromotor von SV 40 aufweist (siehe Subramani, S. et al., Mol. Cell. Biol. 1, 854–864 (1981)), für Wirbeltierzellen verwendet werden. Ein Beispiel für den Vektor für Pflanzen sind pBI121, das den Hauptpromotor des Blumenkohl-Mosaikvirus aufweist, d. h. den 35s-Promotor, und eine polyadenylierte Sequenz des Nopalinsynthesegens von Agrobacterium tumefaciens sowie die Gentransfersequenz für Agrobacterium tumefaciens (siehe Jefferson, R. A. et al., EMBO J. 6, 3901–3907 (1987)). Der bei der vorliegenden Erfindung zu verwendende Vektor ist vorzugsweise ein Plasmid.
Bei der vorliegenden Erfindung kann der Vektor einen oder mehrere selektive Marker enthalten, um eine transformierte Zelle auszuwählen, die mit der DNA der vorliegenden Erfindung transfiziert oder transformiert ist. Beispiele solcher selektiven Marker schließen ein Resistenzgen für Antibiotika, wie etwa Kanamycin, Chloramphenikol, Tetracyclin und Neomycin, ein einen Nährstoffbedarf ergänzendes Gen und die Steuerung durch ein mit dem Zelltod zusammenhängendes Gen ein.
Darüber hinaus ist der erfindungsgemäße rekombinante Vektor vorzugsweise ein Vektor, bei dem für die Expression des zuvor erwähnten Proteins nötige DNAs, beispielsweise ein Promotor oder andere Regulationssequenzen (beispielsweise eine Ribosombindungsstelle, ein Polyadenylierungssignal, ein Transkriptionspromotor, eine Transkriptionsterminierungssequenz, ein Translationstoppsignal, ein stromaufwärts befindlicher Regulationsbereich, ein Verstärker, ein Operator und eine Signalsequenz zur bakteriellen Expression), an die DNA der vorliegenden Erfindung ligiert sind.
Hier sind der Promotor und die anderen Regulierungssequenzen nicht besonders eingeschränkt und jegliche dem Fachmann bekannte Sequenzen können verwendet werden, solange die DNA der vorliegenden Erfindung exprimiert werden kann. Beispiele solcher Sequenzen schließen den lac-Promotor, den T7-Promotor, den trp-Promotor, den tac-Promotor, den SV40-Promotor, den CMV-Promotor, Retrovirus-LTR, den EF-Promotor und einen Teil dieser Promotoren ein. Der rekombinante Vektor kann zusätzlich zu den oben erwähnten Regulationssequenzen eine Regulationssequenz enthalten, die die Proteinexpression steuert.
Transformierte Zelle
Erfindungsgemäß wird eine transformierte Zelle bereitgestellt, die durch Transfizieren oder Transformieren einer Wirtszelle mit dem oben erwähnten rekombinanten Vektor erzeugt wird.
Eine bei der vorliegenden Erfindung zu verwendende Wirtszelle kann jegliche Zelle sein, für die sich das Wirt-Vektor-System bewährt hat. Solch eine Wirtszelle kann entweder eine prokaryotische oder eine eukaryotische Zelle sein.
Bei der vorliegenden Erfindung schließen Beispiele der als eine Wirtszelle zu verwendenden prokaryotischen Zelle Escherichia coli und Bacillus subtilis ein. Um die DNA von Interesse in solch einer Wirtszelle zu exprimieren, kann die Wirtszelle mit einem Plasmidvektor transformiert werden, der eine Replikationsquelle und eine Promotorsequenz enthält, die mit dem Wirt kompatibel sind.
Beispielsweise wird häufig der aus E. coli K12 stammende JM109-Stamm als ein E.-coli-Wirt verwendet und in einem solchen Fall kann im Allgemeinen ein pBR322- oder pUC-Plasmid als ein rekombinanter Vektor verwendet werden. Allerdings sind diese nicht als Einschränkung der vorliegenden Erfindung gedacht und es können verschiedene bekannte Stämme und Vektoren verwendet werden. Beispiele für den Promotor in E. coli schließen den Lactosepromotor (lac) und den Tryptophan-/Lactosepromotor (trc) ein.
Bei der vorliegenden Erfindung schließen Beispiele für die eukaryotische Zelle, die als Wirtszelle zu verwendend ist, Zellen von Wirbeltieren, Insekten, Hefen, Pilzen und Pflanzen ein.
Beispiele für die Wirbeltierzellen beinhalten Affen-COS-Zellen (siehe Gluzman, Y., Cell 23, 175–182 (1981)), menschliche Niere, Keimzellen und COS-Zellen.
Beispiele für die Insektenzellen schließen Zellen, die aus dem Heerwurm aus der Familie der Noctuidae, Spodoptera frugiperda, stammen (siehe Smith, G. E. et al., Mol. Cell. Biol. 3, 2156–2165 (1983), und Drosophila-Zellen ein. Körper wie Seidenraupen können ebenso verwendet werden.
Beispiele für die Hefen beinhalten Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) und Spalthefe (Schizosaccharomyces pombe).
Beispiele für die Pflanzenzellen schließen Tabakpflanzenzellen (Nicotiana tabacum) und Reispflanzenzellen (Oryza sativa) ein. Bei der vorliegenden Erfindung sind als eine Wirtszelle zu verwendende Zelle vorzugsweise eukaryotische Zellen. Bevorzugte eukaryotische Zellen sind beispielsweise aus Hamster stammende CHO-Zellen, Hefezellen und Insektenzellen.
Bei eine besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die Wirtszelle eine Insektenzelle. Insektenzellen können bei der vorliegenden Erfindung vorteilhaft verwendet werden, weil sie einfach zu handhaben sind, im Fachgebiet gut bekannt sind, zur Massenproduktion einer DNA oder eines Proteins von Interesse in großem Maßstab kultiviert werden können und darüber hinaus ermöglichen, dass sich das Protein korrekt faltet.
Ein Beispiel für solch eine Insektenzelle ist eine Insektenzelle aus der Familie Noctuidae, Spodoptera frugiperda, für den das Baculovirus-Expressionssystem bekannt ist. Ein Beispiel für die Insektenzelle aus der Familie Noctuidae ist eine Zelle der bewährten Zelllinie Sf9 (Invitrogen) aus einer Oozyte von Spodoptera frugiperda, die der Familie Noctuidae angehört.
Proteinreinigung
Das erfindungsgemäße Protein, das durch das oben erwähnte Verfahren erhalten wird, kann unter Ausnutzung ihrer chemischen oder physikalischen Eigenschaften gewonnen und unter Verwendung verschiedener gewöhnlicher Isolationsverfahren adäquat gereinigt werden. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Protein durch Behandlung mit einem Protein-Koagulierungsmittel, Ultrafiltration, Adsorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Molekularsiebchromatographie, Dialyse und dergleichen, einzeln oder in Kombination, isoliert und gereinigt werden.
Beispiel
Die vorliegende Erfindung wird darüber hinaus durch die folgenden Beispiele erläutert, die nicht als Beschränkung der Erfindung gedacht sind.
Schritt 1: Herstellung der vollständigen RNA aus der mittleren Spinndrüse der Seidenraupe
Die Spinndrüsen der reifen Larven der Seidenraupe wurden 4 Tage nach der Häutung exzidiert, um unter Verwendung eines TRIZOL-Reagens (Life Technologies Oriental, Inc.) die vollständige RNA herzustellen. Die verwendete Seidenraupe war eine allgemein erhältliche heimische Seidenraupe Bombyx mori.
Schritt 2: Entwurf und Synthese von Primern für die cDNA-Synthese
Eine charakteristische konservierte Sequenz ist in verschiedenen Serinproteasen vorhanden. Auf der Grundlage dieser Sequenz wurden 3 unterschiedliche degenerierte PCR-Primer, nämlich der folgende Primer 1, Primer 2 und Primer 3, entworfen und durch das Phosphoamiditverfahren unter Verwendung eines DNA-Synthesizers chemisch synthetisiert.
Die konservierte Sequenz von Serinprotease und die Positionen der Primer sind in 1 gezeigt.
(Synthetisierte Primer)

Primer 1: 5'-GTNBTNWCNGCNGCNCAYTG-3' (SEQ ID NO: 4)
Primer 2: 5'-AVNGGNCCNCCNGARTCNCC-3' (SEQ ID NO: 5)
Primer 3: 5'-CCNGARTCNCCNTKRCANG-3' (SEQ ID NO: 6)

Bei den obigen Sequenzen repräsentiert
N: A, C, G oder T,
B: C, G oder T,
V: A, C oder G,
W: A oder T,
Y: C oder T,
R: A oder G und
K: G oder T.
Schritt 3: Herstellung von cDNA durch das RT-PCR-Verfahren (Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion)
Aus der in Schritt 1 hergestellten vollständigen RNA der mittleren Spinndrüse der Seidenraupe Wurde unter Verwendung des in Schritt 2 synthetisierten Primers 2 und Super Script^TM II RNase H Reverse Transkriptase (Life Technologies Oriental, Inc.) eine cDNA synthetisiert.
Die Reaktion wurde wie folgt ausgeführt. Die Reaktionsmischung, die die vollständige RNA und den Primer enthielt, wurde 10 Minuten lang bei 70 °C und dann 2 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, worauf Superscript II RNase H Reverse Transkriptase hinzugefügt wurde, um 1 Stunde lang bei 37 °C die reverse Transkriptionsreaktion auszuführen.
Schritt 4: Screening von cDNA, die ein Teilprotein von Serinprotease kodiert
Die erste PCR wurde mit dem Primer 1 und dem Primer 2, die oben in Schritt 2 synthetisiert. wurden, unter Verwendung der in Schritt 3 erhaltenen cDNA als Templat ausgeführt. Die Reaktionsbedingungen waren 2 Minuten langes Inkubieren bei 94 °C, gefolgt von DNA-Amplifikation in 30 Zyklen, wobei jeder Zyklus aus 30 Sekunden langer Inkubation bei 94 °C, 30 Sekunden langer Inkubation bei 55 °C und 1 Minute langer Inkubation bei 72 °C bestand.
Als nächstes wurde mit dem Primer 1 und dem Primer 3, die oben in Schritt 2 synthetisiert wurden, die zweite PCR ausgeführt, wobei das erste PCR-Produkt als ein Templat verwendet wurde.
Die Bedingungen für diese Reaktion waren 2 Minuten langes Inkubieren bei 94 °C, gefolgt von DNA-Amplifikation in 30 Zyklen, wobei jeder Zyklus aus 30 Sekunden langer Inkubation bei 94 °C, 30 Sekunden langer Inkubation bei 55 °C und 1 Minute langer Inkubation bei 72 °C bestand.
Zu einer Probe der durch die obige PCR erhaltenen Reaktionslösung wurde ein Äquivalent von TE-gesättigtem Phenol hinzugefügt und die Beimischung wurde sorgfältig vermischt und dann zentrifugiert (12000 g ×, 5 Minuten) (Phenolbehandlung). Der sich ergebende Überstand wurde abgetrennt und mit Chloroform behandelt, um das Phenol zu entfernen. Um die DNA zu gewinnen, wurden darüber hinaus 0,1 × Probevolumen an 5 M Ammoniumacetat und 2,5 × Probevolumen an Ethanol hinzugefügt und dann wurde die Mischung zentrifugiert (12000 g ×, 30 Minuten) (Ethanolfällung).
Das auf diese Weise erhaltene PCR-Produkt wurde in einer TE-Pufferlösung gelöst.
Schritt 5: Klonieren des PCR-Produkts
Das PCR-Produkt wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen und eine Bande für die vervielfältigte DNA von etwa 0,47 kbp wurde herausgeschnitten und geborgen. Um einen rekombinanten Vektor zu erhalten, wurde das auf diese Weise erhaltene DNA-Fragment durch das TA-Klonierungsverfahren in eine pGEM-T-Plasmid (Promega, Inc.) subkloniert.
Mit dem auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Vektor wurde ein E. coli JMI09-Stamm transformiert. Als nächstes wurden die sich ergebenden E. coli-Zellen auf einem LB-Agarmedium aufgetragen, das mit Ampicillin versetzt war, und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Kolonien von E. coli, die sich auf dem mit Ampicillin versetzten LB-Agarmedium entwickelt haben, wurden ausgewählt und durch das gewöhnliche Verfahren wurde ein Plasmid aus den transformierten E. coli-Zellen hergestellt.
Als nächstes wurde eine Basensequenz der DNA bestimmt, die in das auf diese Weise erhaltene Plasmid eingefügt wurde. Die Sequenzierungsreaktion wurde mit zwei verschiedenen Sequenzprimern, die unten gezeigt sind (T7-Primer und SP6-Primer), unter Verwendung des ThermoSequenase^TM Farbstoffterminator-Zyklussequenzierungs-Kit V2.0 (Amersham, Inc.) ausgeführt. Die Reaktionsbedingungen waren 1 Minute lange Inkubation bei 96 °C, gefolgt von 25 Reaktionszyklen, die jeweils aus 30 Sekunden langer Inkubation bei 96 °C, 15 Sekunden langer Inkubation bei 50 °C und 4 Minuten langer Inkubation bei 60 °C bestanden.
(Primer)

T7-Primer: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3' (SEQ ID NO: 7)
SP6-Primer: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3' (SEQ ID NO: 8)

Das auf diese Weise erhaltene PCR-Produkt wurde dem Sequenzieren durch einen DNA-Auto-Sequenzer (PRISM^TM Modell 377, ABI, Inc.) unterzogen, welches eine DNA-Sequenz bestätigte, die voraussichtlich eine neue Serinprotease kodiert.
Schritt 6: Klonieren von 5'-terminaler cDNA aus Seidenraupen-Serinprotease durch das 5'-RACE-Verfahren (Schnelle Amplifikation von cDNA-Enden)
Die Sequenzen der fünf verschiedenen Primer waren wie folgt:
(Primersequenzen)

GSP1-L-Primer: 5'-CCACGTCGTAGTCATAATTG-3' (SEQ ID NO: 9)
GSP2-L-Primer: 5'-TAACCCTGAGCTGCCGATGCTGT-3' (SEQ ID NO: 10)
GSP2-L-Primer: 5'-GCTGGAAACATCGTGTTCTCCAA-3' (SEQ ID NO: 11) Abridged Universal Amplification Primer (AUAP): 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3' (SEQ ID NO: 12) Abridged Anchor Primer: 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3' (SEQ ID NO: 13)

Um eine cDNA zu gewinnen, wurde die vollständige RNA, die wie bei Schritt 1 beschrieben aus der Spinndrüse der Seidenraupe hergestellt wurde, unter Verwendung des oben erwähnten Primers GSPI-L wie bei Schritt 3 beschrieben der reversen Transkriptionsreaktion unterworfen.
Als nächstes wurde die 5'-terminale cDNA unter Verwendung eines 5'-RACE-Systems (5'-RACE-System zur schnellen Amplifikation von cDNA-Enden, Version 2.0, Life Technologies Oriental, Inc.).
Die für die PCR verwendeten Primer waren der Abridged Anchor Primer und GSP2-L. Die Bedingungen für die PCR-Reaktion waren 5 Minuten lange Inkubation bei 94 °C, gefolgt von DNA-Amplifikation in 30 Zyklen, die jeweils aus 1 Minuten langer Inkubation bei 94 °C, 30 Sekunden langer Inkubation bei 55 °C und 3 Minuten langer Inkubation bei 72 °C bestanden.
Die zweite PCR wurde mit den Primern AUAP und GSP3-L unter Verwendung des durch die erste PCR erhaltenen Produkts als Templat ausgeführt. Die Bedingungen für die PCR-Reaktion waren 5 Minuten lange Inkubation bei 94 °C, gefolgt von DNA-Amplifikation in 30 Zyklen, die jeweils aus 1 Minuten langer Inkubation bei 94 °C, 30 Sekunden langer Inkubation bei 55 °C und 3 Minuten langer Inkubation bei 72 °C bestanden.
Agarose-Gelelektrophorese des auf diese Weise erhaltenen PCR-Produkts bestätigte die Amplifikation mehrerer Banden, von denen eine Bande von ungefähr 0,75 kbp dominant war.
Das DNA-Fragment von etwa 0,75 kbp wurde auf die gleiche Art und Weise gewonnen, wie es bei Schritt 4 beschrieben wurde, und ferner wurde das gewonnene PCR-Produkt in das pBluescript II SK Plasmid eingesetzt, wie es bei Schritt 5 beschrieben wurde, woraufhin eine Transformation und DNA-Autosequenzierung ausgeführt wurden.
Schritt 7: Klonieren von 3'-terminaler cDNA aus Seidenraupen-Serinprotease durch das 3'-RACE-Verfahren
Die Sequenzen von vier verschiedenen verwendeten Primern waren wie folgt:
(Primersequenzen)

GSP1-U-Primer: 5'-TTCTTGGTTGGGGAACGTTATTC-3' (SEQ ID NO: 14)
GSP2-U-Primer: 5'-ACGTCTAATGTTCTCCGTAAGGT-3' (SEQ ID NO: 15)
AUAP: 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3' (SEQ ID NO: 16) 3'-RACE-Adapterprimer: 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' (SEQ ID NO: 17)

Um eine cDNA zu gewinnen, wurde die vollständige RNA, die wie bei Schritt 1 beschrieben aus der Spinndrüse der Seidenraupe hergestellt wurde, unter Verwendung des oben erwähnten 3'-RACE-Adapterprimers wie bei Schritt 3 beschrieben der reversen Transkriptionsreaktion unterworfen.
Als nächstes wurde mit den Primern GSP1-U und AUAP unter Verwendung der cDNA, die wie oben beschrieben erhalten wurde, als Templat die erste PCR ausgeführt. Die Bedingungen für die PCR-Reaktion waren 5 Minuten lange Inkubation bei 94 °C, gefolgt von DNA-Amplifikation in 30 Zyklen, die jeweils aus 1 Minuten langer Inkubation bei 94 °C, 30 Sekunden langer Inkubation bei 55 °C und 3 Minuten langer Inkubation bei 72 °C bestanden.
Die zweite PCR wurde mit den Primern GSP2-U und AUAP unter Verwendung des durch die erste PCR erhaltenen PCR-Produkts als Templat ausgeführt. Die Bedingungen für die PCR-Reaktion waren 5 Minuten lange Inkubation bei 94 °C, gefolgt von DNA-Amplifikation in 30 Zyklen, die jeweils aus 1 Minuten langer Inkubation bei 94 °C, 30 Sekunden langer Inkubation bei 55 °C und 3 Minuten langer Inkubation bei 72 °C bestanden.
Agarose-Gelelektrophorese des auf diese Weise erhaltenen PCR-Produkts bestätigte die Amplifikation mehrerer Banden, von denen eine Bande von ungefähr 0,45 kbp dominant war.
Das DNA-Fragment von etwa 0,45 kbp wurde auf die gleiche Art und Weise gewonnen, wie es bei Schritt 4 beschrieben wurde, und ferner wurde das gewonnene PCR-Produkt in das pBluescript II SK Plasmid eingesetzt, wie es bei Schritt 5 beschrieben wurde, woraufhin eine Transformation und DNA-Autosequenzierung ausgeführt wurden.
Als Ergebnis der Sequenzierung wurden mehrere 5'-RACE- und 3'-RACE-Klone erhalten, die mit dem beim obigen Schritt 5 erhaltenen cDNA-Klon überlappen. Es hat sich aus der vorhergesagten Aminosäuresequenz, die durch diese DNA kodiert wird, gezeigt, dass die aus der Seidenraupen-Spinndrüse stammende Serinprotease 292 Aminosäuren umfasst, die durch die DNA mit der Gesamtlänge von 1,179 bp vom Startcodon bis zum Stoppcodon kodiert wird.
Schritt 8: Ermitteln der Gesamtlänge des cDNA-Klons der Seidenraupen-Spinndrüsen-Serinprotease
Die Gesamtlänge der Seidenraupen-Spinndrüsen-Serinprotease-cDNA wurde wie folgt aus dem cDNA-Fragment ermittelt, das durch 5'-RACE- und 3'-RACE erhalten wurde.
2 stellt die allgemeinen Schritte zur Ermittlung der Gesamtlänge des cDNA-Klons dar.
Zur PCR-Amplifikation der cDNA, die die gesamte Länge der Seidenraupen-Spinndrüsen-Serinprotease kodiert, wurden auf der Grundlage des Startcodons und des Stoppcodons, die in Schritt 6 und Schritt 7 aufgedeckt wurden, spezielle PCR-Primer (SGSP-5-Rsr und SGSP-3-Hind) entworfen und gemäß dem üblichen Verfahren chemisch synthetisiert. Die Sequenzen der Primer sind wie folgt.
(Primersequenzen)

SGSP-5-Rsr-Primer: 5'-TCTCGGTCCGTCAGAAATGTGCCTTGAACTTGTA-3' (SEQ ID NO: 18)
SGSP-3-Hind-Primer: 5'-CCAAGCTTATTTCCTGCAGAAGTTATATTGCG-3' (SEQ ID NO: 19)

Als nächstes wurde auf die gleiche Art und Weise wie bei Schritt 3 beschrieben mit den oben erwähnten Primern (SGSP-5-Rsr und SGSP-3-Hind) eine PCR unter Verwendung der aus den Seidenraupen-Spinndrüsen stammenden cDNA als Templat durchgeführt.
Das sich ergebende PCR-Produkt wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen, die die Amplifikation einer Bande von etwa 1,2 kbp bestätigte.
Das vervielfältigte DNA-Fragment von etwa 1,2 kbp wurde wie oben bei Schritt 4 beschrieben gewonnen.
Das wie oben beschrieben erhaltene PCR-Produkt wurde in Restriktionsschnittstellen (RsrII und HindIII) des Transfervektors HT-CH für Baculovirus subkloniert. Das sich ergebende Transferplasmid für Baculovirus, das das Bm-SGSP-Gen bindet, wird hierin als pHm-SGSP bezeichnet.
Die DNA-Autosequenzierung bestätigte, dass pHm-SGSP die cDNA mit der kompletten Länge der Seidenraupen-Spinndrüsen-Serinprotease aufwies.
Die Basensequenz und die Aminosäuresequenz der vollständigen Länge der auf diese Weise klonierten cDNA sind in 3 gezeigt.
Die Gesamtlänge des Klons betrug 1,179 bp in der Länge und kodierte für ein aus 392 Aminosäureresten bestehendes Protein, das die Eigenschaften von Serinprotease aufwies, die im aktiven Zentrum Reste wie etwa His, Asp und Ser aufweist. Darüber hinaus wurde auf der N-terminalen Seite eine stark hydrophobe Sequenz, vermutlich ein Signalpeptid, gefunden.
Schritt 9: Bestätigung der Expression von Seidenraupen-Spinndrüsen-Serinprotease in verschiedenen Abschnitten der Spinndrüse durch das RT-PCR-Verfahren
Als nächstes wurde die Expression von Seidenraupen-Spinndrüsen-Serinprotease in verschiedenen Abschnitten der Spinndrüse durch das RT-PCR-Verfahren bestätigt. Aus der vorderen Spinndrüse, der mittleren Spinndrüse (vorderes, mittleres und hinteres Teil) und hinteren Spinndrüse der reifen Seidenraupenlarve 4 Tage nach Häutung wurde jeweils auf die gleiche Art und Weise wie bei Schritt 1 beschrieben die gesamte RNA hergestellt.
4 zeigt die jeweiligen Abschnitte der Spinndrüse.
Als nächstes wurde unter Verwendung der vollständigen RNA, die aus den jeweiligen Abschnitten der Spinndrüse hergestellt wurde, und dem oben erwähnten Primer (3'-RACE-Adapterprimer) wie bei Schritt 3 beschrieben die reverse Transkriptionsreaktion durchgeführt, um eine cDNA zu synthetisieren. Die PCR wurde dann unter Verwendung von 4 μl dieser cDNA-Probe und des bei Schritt 8 synthetisierten Primers (SGSP-5-Rsr und SGSP-3-Hind, jeweils 200 pmol) synthetisiert. Die Bedingungen für die PCR waren 30 Zyklen, die jeweils aus 30 Sekunden langer Inkubation bei 94 °C, 30 Sekunden langer Inkubation bei 55 °C und 2 Minuten langer Inkubation bei 72 °C bestanden. Um die Amplifikation zu bestätigen, wurde die sich ergebende Probe einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen.
Das Ergebnis ist in 5 gezeigt.
5 zeigt, dass Bm-SGSP vorherrschend im Mittelabschnitt der Seidenraupen-Spinndrüse exprimiert wird.
Schritt 10: Sekretorische Produktion von Bm-SGSP unter Verwendung von Insektenzellen (Sf9)
Zur Proteinproduktion in Insektenzellen wurde Baculovirus (Live Technologies Oriental, Inc.) verwendet.
Durch das übliche Verfahren wurde E. coli DH10Bac, das AcNPV-Visus-DNA in der Zelle trägt, mit dem Transfervektor für Baculovirus transformiert, der das oben in Schritt 8 aufgebaute Bm-SGSP-Gen (pBm-SGSP) enthält.
In den transformierten Zellen von E. coli findet eine homologe Rekombination statt und auf diese Weise wird das Bm-SGSP-Gen in die AcNPV-Visus-DNA eingebaut. Das LacZ-Gen ist in der AcNPV-Visus-DNA im DH10Bac vorhanden, so dass Zellen ohne homologe Rekombination, wenn sie auf einem mit X-gal (50 ng/ml) versetzten Medium inkubiert werden, blaue Kolonien bilden, während Zellen mit homologer Rekombination, die das LacZ-Gen zerstört, weiße Kolonien bildet.
Dementsprechend wurden weiße Kolonien ausgewählt, um durch das übliche Verfahren eine rekombinante Virus-DNA herzustellen.
Als nächstes wurde die auf diese Weise hergestellte Virus-DNA für die Transfektion der Insektenzelle Sf9 (aus Spodoptera frugiperda aus der Familie Noctuidae stammende Zelle, erhältlich von Invitrogen).
Um eine Virusflüssigkeit zu erhalten, wurden die Sf9-Zellen (2 × 10⁶ Zellen/ml) in einer Petrischale unter Verwendung von SF900II SFM (+ 10 % FCS) Medium kultiviert und nach 4 Tagen wurde der Kulturüberstand gewonnen. Unter Verwendung dieser Virusflüssigkeit (1 × 10⁹ pfu/ml) wurden die Sf9-Zellen weiter mit dem Baculovirus, in dem das Bm-SGSP-Gen rekombiniert wurde, transfiziert und 4 Tage lang bei 27 °C inkubiert, so dass 30 ml eines Kulturüberstands erhalten wurden.
Schritt 11: Reinigung des in Insektenzellen exprimierten rekombinanten Bm-SGSP-Proteins
Der Kulturüberstand wurde über Nacht gegen Dialysepuffer (20 mM Tris (pH 8,5), 100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂) dialysiert. Bei diesem Experiment wies Bm-SGSP, das in den Kulturüberstand abgesondert wurde, auf dessen C-terminaler Seite ein aus 6 Histidinen bestehendes His-tag auf. Deshalb wurde nach der Dialyse die Reinigung des Bm-SGSP aus dem Kulturüberstand unter Verwendung einer eine hohe Affinität zu His-tag aufweisenden Ni-NTA-Säule (Ni-NTA Proteinreinigungssystem; Qiagen, Inc.) durchgeführt. Das an Ni-NTA (Nickel-Nitrilotriessigsäure) absorbierte Bm-SGSP-Protein wurde mit einer 100 mM Imidazollösung eluiert. Um das gereinigte Protein zu bestätigen, wurde ein Teil (1 μg) des gereinigten Proteins einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen.
6 zeigt das Ergebnis der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
Nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde die Reinheit des Proteins durch Silberfärbung des Gels bestimmt. Wie es in 6 gezeigt ist, wurde die vollständige Reinigung des ein Molekulargewicht von etwa 42 kDa aufweisenden Bm-SGSP-Proteins aus dem Kulturüberstand der Bm-SGSP-Zellen bestätigt.
Aus 30 ml der Insektenzellkultur wurden 28,0 μg des gereinigten Bm-SGSP-Proteins erhalten.
Schritt 12: Bestimmung der Proteaseaktivität von aus Seidenraupen stammender Serinprotease Bm-SGSP
Die Proteaseaktivität wurde unter Verwendung eines synthetisierten Substrats bestimmt, welche spezifisch durch eine Serinprotease vom Trypsin-Typ gespalten wird, d. h. Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Lys-P-Nitroanilid (oder durch „Suc-AAPK-pNA" ausgedrückt).
Eine Kulturflüssigkeit von Bm-SGSP produzierenden Sf9-Zellen wurde zentrifugiert (15000 U/min, 10 Minuten), so dass eine Zellfraktion erhalten wurde. Um eine Flüssigkeit mit aufgeschlossenen Zellen herzustellen, wurden die Zellen dann in 10 mM Tris-Puffer (pH 7,5) suspendiert und die Suspension wurde mit Ultraschall behandelt. Die sich ergebende Flüssigkeit mit den aufgeschlossenen Zellen wurde zentrifugiert (15000 U/min, 10 Minuten), um den Überstand zu gewinnen, und auf diese Weise wurde eine Enzymlösung erhalten.
In einem Kontrollexperiment wurden die gleichen Schritte unter Verwendung der Sf9-Zelle (HT-CH) ausgeführt, die kein Bm-SGSP produziert.
Eine Mischung aus 5 μl an 10 mM Substrat (Suc-AAPK-pNA), 345 μl an 1 mM CaCl₂ und 375 μl einer Pufferlösung (50 mM Piperazin-N,N'-bis(2-ethansulfonsäure), 2 mM CaC1₂, pH 6,0) wurde 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Als nächstes wurden 25 μl der Bm-SGSP-Enzymlösung, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, hinzugefügt und die Reaktion wurde 150 Minuten lang bei 37 °C durchgeführt. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde gemäß dem üblichen Verfahren durch Messung der optischen Dichte (410 nm) die Enzymaktivität bestimmt.
Das Ergebnis ist in 7 gezeigt.
Hier ist 1 U die Menge an Enzym, die zur Freisetzung von 1 nmol p-Nitroanilin pro 1 Minute nötig ist. Der molekulare Absorptionskoeffizient bei 410 nm für p-Nitroanilin beträgt 8900 (M^–1 cm^–2). Demgemäß wird die Enzymaktivität durch die folgende Formel erhalten: U/mg = ΔA410/(8,9 × X × Y × Z) × 106 wobei U/mg die Enzymaktivität pro 1 mg an Protein (Einheiten/mg) ist, ΔA410 die Änderung der optischen Dichte bei 410 nm ist, X das Volumen der Enzymlösung (μl) ist, Y die Reaktionszeit (Minuten) ist und Z die Proteinkonzentration (mg/ml) ist.
Wie es in 7 gezeigt ist, bestätigte sich, dass das aus Seidenraupen-Spinndrüsen stammende Bm-SGSP, das bei der vorliegenden Erfindung gewonnen wurde, Serinproteaseaktivität aufwies, weil es ein Substrat Suc-AAPK-pNA gespalten hat, welches durch eine Serinprotease vom Trypsintyp spezifisch gespalten wird. Das HT-CH ist eine Negativkontrolle. Sequenzprotokoll

Claims

Protein, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgendem besteht: a) einem Protein, das die Aminosäuresequenz umfasst, die durch SEQ ID NO: 1 repräsentiert wird; b) einem Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 55 % Homologie mit einem Protein aufweist, das die Aminosäuresequenz umfasst, die durch SEQ ID NO: 1 repräsentiert wird, und das Proteaseaktivität besitzt.
DNA, die das Protein von Anspruch 1 kodiert.
DNA, die ein Protein kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 60 % Homologie mit einem Protein aufweist, das die Aminosäuresequenz umfasst, die durch SEQ ID NO: 2 repräsentiert wird, und das Proteaseaktivität besitzt.
DNA nach Anspruch 2 oder 3, die die Basensequenz umfasst, die durch SEQ ID NO: 2 repräsentiert wird.
DNA nach Anspruch 2 oder 3, die die Basensequenz umfasst, die durch SEQ ID NO: 3 repräsentiert wird.
Rekombinater Vektor, der die DNA eines der Ansprüche 2 bis 5 umfasst.
Transformierte Zelle, die durch den rekombinaten Vektor von Anspruch 6 transformiert ist.
Transformierte Zelle nach Anspruch 7, wobei die transformierte Zelle eine eukaryotische Zelle ist.
Transformierte Zelle nach Anspruch 8, wobei die eukaryotische Zelle eine Insektenzelle ist.
Verfahren zur Herstellung des Proteins von Anspruch 1, das die Schritte des Kultivierens der transformierten Zelle nach einem der Ansprüche 7 bis 9 und des Gewinnens des Proteins von Interesse aus den sich ergebenden Zellen und/oder der sich ergebenden Zellkultur.