KR100864380B1 - 두뇌기능 향상과 뇌신경계 질환 예방 또는 치료용 펩타이드 - Google Patents

두뇌기능 향상과 뇌신경계 질환 예방 또는 치료용 펩타이드 Download PDF

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Abstract

본 발명의 다음의 일반식 1로 표시되는 실크 단백질-미미킹(mimicking) 펩타이드, 이를 포함하는 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 조성물, 두뇌 또는 인지 기능의 증진을 위한 조성물 및 산화 스트레스 관련 질환, 질병 또는 이상의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다:
일반식 1
Gly-Xaa1-Gly-Xaa2
상기 일반식에서, Xaa1은 Ala, Val, Ser, Tyr, Asp, Glu, Thr, Met, Ile, Leu, Phe, His, Lys 또는 Arg이고, Xaa2는 Ala, Tyr, Val, Ser, Asp, Glu, Thr, Met, Ile, Leu, Phe, His, Lys 또는 Arg이거나 또는 Ala, Tyr, Val, Ser, Asp, Glu, Thr, Met, Ile, Leu, Phe, His, Lys 또는 Arg에 추가적으로 Gly-Xaa3가 결합되어 있는 것이며, 상기 Xaa3는 Tyr, Val, Ala, Ser, Asp, Glu, Thr, Met, Ile, Leu, Phe, His, Lys 또는 Arg이다.
실크, 단백질, 미미킹, 펩타이드, 신경, 뇌신경질환, 치매, 파킨슨 질병

Description

두뇌기능 향상과 뇌신경계 질환 예방 또는 치료용 펩타이드{Peptides for Improving Brain Function and Preventing or Treating Brain Neuronal Diseases}
도 1은 6-OHDA(6-hydroxydopamine)에 의한 도파민 신경세포 사멸에 있어서 본 발명의 펩타이드의 보호 효과를 보여주는 사진이다. 대조군은 6-OHDA만을 처리한 네거티브 대조군이다.
도 2는 6-OHDA를 이용한 도파민성 신경세포 사멸 동물 모델(파킨슨 질환 동물 모델)에서 본 발명 펩타이드들의 처리에 의한 행동 이상 보호 효과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 아밀로이드 단백질에 의한 해마내 신경세포 사멸에서 본 발명의 펩타이드의 신경세포 보호 효과를 보여주는 사진이다.
도 4는 아밀로이드 베타 단백질에 의한 신경독성에 대한 본 발명의 펩타이드의 보호효과를 수동회피 행동 실험으로 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5a-5b는 아밀로이드 베타 단백질에 의한 신경독성에 대한 본 발명의 펩타이드의 보호효과를 수중미로 학습 기억 행동 실험으로 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6a-6b는 아밀로이드 베타 단백질에 의한 신경세포 사멸에 에 대한 본 발명의 펩타이드의 보호효과를 보여주며, 도 6a는 핵 분절에 의한 세포 사멸 분석 결과이고, 도 6b는 신경세포 생존율에 대한 분석 결과이다. 도면에서, oligo 1 및 oligo 2는 각각 SMP-1 및 SMP-4를 나타낸다.
도 7a-7c는 활성기 산소의 발생에 의한 신경세포 사멸에 있어서 본 발명의 펩타이드의 보호 효과를 보여준다.
도 8a-8c는 미토콘드리아의 기능 이상을 통한 신경세포 사멸에 있어서 본 발명의 펩타이드의 보호 효과를 나타낸다.
본 발명은 신경보호 및 두뇌기능 향상 효과를 갖는 실크 단백질－미미킹 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다.
뇌졸중은 뇌혈관이 터지거나 막혀서 결과적으로 국소 뇌조직의 기능 이상을 가져오는 뇌혈관 질환으로 흔히 중풍이라고도 하며, 우리나라에서는 사망원인 중 선두를 달리고 있다. 더욱이 산업화와 의학의 발전에 의한 평균수명의 연장으로 인하여 그 발병률이 점차 증가하는 추세이다. 뇌졸중은 뇌의 어느 부위에서나 발생할 수 있고 따라서 신체의 거의 모든 기능에 장애를 초래할 수 있다. 의학적으 로 뇌졸중은 크게 뇌의 혈관이 막혀서 특정 부위에 혈액 순환이 안 되어 나타나는 '허혈성 뇌졸중'과 뇌출혈에 의한 '출혈성 뇌졸중'으로 분류할 수 있으며, 그 중 성인병의 원인으로 알려진 고혈압, 동맥경화증과 밀접한 연관성이 있는 허혈성 뇌졸중의 발생 비율이 더 높은 편이다. 허혈성 뇌졸중은 목 부분에 있는 경동맥, 추골뇌저동맥부터 뇌 안의 가느다란 동맥에 이르기까지 어디든지 혈관이 막히면 발병하게 되며, 이로 인해 그 혈관이 지배하던 뇌 조직이 죽는 현상, 즉 '뇌경색(infarction)'이 발생하게 된다. 일단 발생된 뇌경색 부위는 그 기능을 되살릴 수 없으며, 따라서 뇌경색에 의한 중추신경계 장애는 회복되지 않고 영구적으로 남게 된다. 그러므로 뇌졸중 치료에 있어서 제일 중요한 것은 뇌졸중 발병 위험인자로 알려진 고혈압, 당뇨병, 고지혈증 등의 예방법과 더불어 뇌 허혈 자체에 대한 예방이다. 또한 뇌졸중 발병에 의해 뇌경색이 왔을 때 뇌부종을 감소시키고, 허혈 상태인 곳은 적절하게 순환되게 하여 이차적인 뇌손상을 줄이는데 그 초점을 두고 있다.
현재 신경 세포의 보호를 위해 사용하고 있는 물질로는 흥분성 아미노산 길항제인 갱글리오사이드 (ganglioside), 니모디핀 (Nimodipine), GABA 항진제인 클로메치아졸 (clomethiazole) 등이 있고 황산 마그네슘과 글리신 길항제는 2상 임상연구중이며, 피라세탐 (piracetam)이 현재 대규모 임상 연구가 진행중이다. 그러나 현재 시도되고 있는 신경 세포 보호제들은 허혈 진행 과정의 각기 다른 단계에 작용하는 제제들로, 이러한 여러 가지 과정에 동시에 작용하는 복합요법의 개발이 필요하지만 부작용과 약물 상호간섭의 문제를 해결해야 하는 과제를 안고 있다.
또한, 허혈성 뇌졸중의 증상은 특별한 예후 없이 급작스레 찾아오므로 뇌 허혈 발병 당시에 투여되는 약물을 통하여 치료를 기대하기보다는 지속적인 허혈 예방과 허혈 후의 신경세포의 아폽토시스의 억제를 위한 기능성 식품의 섭취가 더욱 효과적이라 판단되고 있다.
미합중국 특허 제 6,245,757 호는 허혈에 의한 세포 손상을 치료하는 용도로서의 프로게스틴 (progestin)를 개시하고 있고, 미합중국 특허 제 6,380,193 호는 폴리(아데노신 5'-디포스포-리보스)폴리머라아제 억제제를 포함하는 뇌졸중 치료용 조성물을 개시하고 있다. 또한, 미합중국 특허 제 6,288,041 호는 시알산 유도체를 포함하는 뇌졸중 치료용 조성물을 개시하고 있으며, 미합중국 특허 제 5,580,866 호는 1,4-티아제틴을 유효 성분으로 포함하는 뇌졸중 치료용 조성물을 개시하고 있다.
신경 퇴행성 질환의 일종인 파킨슨병(Parkinson's disease, PD)은 운동 및 인지 장애를 일으키는 퇴행성 뇌질환으로 1817년 제임스 파킨슨에 의해 처음 보고되었다. 이 질환의 발병률은 미국에서 인구 10만 명 당 100-150명 정도로 약 75만-100만 명의 환자가 보고되고 있으며, 매년 6만여 명이 새로이 진단되는 추세로, 국내에서도 인구의 노령화에 따라 그 발병률 및 유병률이 계속 증가할 것으로 예상된다. 조직병리학적으로는 흑질 (substantia nigra)에 위치하는 도파민 신경세포의 소실이 특징적으로 나타나며, 그 신경 섬유의 투사 부위인 미상핵 (caudate nucleus)과 조가비핵(putamen)의 도파민이 감소하여 특징적인 진전 (tremor), 운동지연 (bradykinesia), 경직 (rigidity), 자세의 장애 (disturbance of posture) 등 운동 및 두뇌 기능 장애가 나타난다.
파킨슨병에 사용되는 주된 치료 약물은 뇌에서 부족해진 도파민의 기능을 보충해 주는 약제 또는 그 외 신경 세포의 파괴를 예방 혹은 지연시키고자 하는 목적이나 기타 우울증 등의 부수적인 증상을 조절하기 위한 약물 치료 등이 있다. 대표적인 약물로 도파민 전구 물질인 레보도파 (levodopa, L-dopa) 성분의 마도파(Madopar), 도파민 수용체 효현제 (agonist) 성분의 브로미딘 (bromidine), 리슈라이드(lisuride), 그리고 항 아세틸콜린성 약물인 알탄 (artane), 코젠틴 (cogentin) 등의 다양한 신경약리학적 보상성 치료법이 개발되어 있다. 이중 도파민의 전구체인 레보도파는 부족한 뇌 내 도파민의 농도를 보충시킴으로써 파킨슨병의 증상을 개선시키는데 가장 효과적으로 사용되고 있으나, 3-5년 이상 장기간 투여하면 약물효과 시간이 점점 짧아지거나 (wearing-off), 약물의 효과에 대한 운동조절 기능의 변동이 심해지는 현상 (on-off 현상), 이상운동증 (diskinesia) 등의 부작용이 나타나고 있다(Freed et. al., N. Engl. J. Med. 327:1549-55(1992)). 그밖에도 파킨슨병의 외과적 치료법으로 시상절단술(thalamotomy)과 담창구절단술(pallidotomy), 심부 뇌자극술(deep brain stimulation), 신경세포 이식술(Neuronal cell transplantation)등이 시행되고 있다. 그러나 치료효과의 지속 기간이 환자에 따라 큰 차이를 나타내며, 드물게 수술에 따른 발성부전(hypophonia), 구음장애(dysarthria; 말더듬증), 기억력 감쇠 등의 부작용을 동반한다고 알려져 있다(Ondo et. al., Neurology 50:266-270 (1998); Shannon et. al., Neurology 50:434-438(1998)).
알츠하이머병에 대한 최근 치료 기조는 대뇌피질 (cerebral cortex)과 해마 (hippocampus)에서 기능 손상된 콜린성 시그널링 및 전달 (cholinergic signaling and transmission)에 의해 알츠하이머병이 유래된다는 가능성에 중심을 두고 있다 (Bartus et al., Science. 217(4558): 408-14(1982)); 및 Coyle et al., Science. 219(4589):1184-90(1983)). 이런 뇌의 영역은 기억 및 지능과 연결되어 있으므로, 뇌의 이들 부분의 기능적인 결함은 기억 및 판단에 대한 확실한 손상을 주고 지적 능력을 상실케 한다. 신경 신호전달 (neuronal signaling)에 손상이 이루어지는 정확한 과정이 논쟁 대상이 되고는 있지만, 감각성 플라크 (senile plaque) 및 신경원 섬유 농축체 (neurofibrillary tangle: NFT)이 신경 손상의 주 원인으로 여겨진다. 아밀로이드 베타 (Aβ)의 축적으로 인한 감각성 플라크는 이병의 가장 큰 특징으로, 알쯔하이머병은 사후 부검으로 확진이 가능하다(Khachaturian, Arch. Neurol. 42(11):1097-105(1985)).
알쯔하이머병의 경우, 콜린성 시그널링의 손상을 억제 할 수 있도록 아세틸콜린의 양을 증가시키거나, 아세틸콜린이 장기간 존재할 수 있도록 하거나 또는 신경세포의 전달에 아세틸콜린이 더욱 효과적으로 작용하도록 하는 약물과 치료법이 제시되고 있어서, 알쯔하이머병 환자들의 아세틸콜린 활성도를 높이는 많은 화합물들이 사용되고 있다. 현재 가장 효과적인 접근 방법은 시냅스에서 아세틸콜린을 빠르게 분해하여 신경 신호 전달을 막는 아세틸콜린에스테라아제의 활성을 억제하는 방법이다. 실제로 이런 저해제 (예: tacrine, donepezil 및 rivastigmine)들은 현재 FDA에서 인정한 알쯔하이머병 치료 약물로 시장에서 유통되고 있다. 많은 경우 상기 약물들은 병의 파괴적인 진행을 막는데 유효하나, 신경계의 병 이전 상태로의 회복에는 잘 적용되지 않고 있다.
어떤 화합물들은 신경의 일반적인 건강 상태를 개선하여 나이가 들어감에 따른 세포의 기능을 정상적으로 유지하는데 목적을 두고 있다. 예를 들어, NGF와 에스트로겐 같은 몇몇 약물들은 신경의 퇴화를 늦추어 주는 신경보호 역할을 하며, 항산화제와 같은 다른 약물들은 세포의 산화를 감소시켜 정상적인 노화의 결과로 나타나는 해로운 세포의 손상의 증가를 감소시킨다. 아밀로이드 베타 펩타이드가 축적되는 정도가 많으면 알쯔하이머병이 심각해지는데, 신경염 공간 (neuritic space)에 아밀로이드 베타의 축적을 낮추어 주면 알쯔하이머병의 진행을 늦추게 될 것으로 생각되고 있다. 아밀로이드 전구체 단백질 (Amyloid precursor protein: APP)이 α-, β-, γ-세크레타아제들과 같은 세포내의 단백질 분해효소들과 조합으로 많은 다양한 형태들로 진행되는 것으로 생각된다. 하지만, 아밀로이드 베타 단백질의 형성 과정이 실제 과학적으로 완전히 규명되지 않았기 때문에, 아밀로이드 베타의 형성을 조절하는 것은 아직은 가능하지 않다.
아밀로이드 베타 단백질의 축적이 신경신호 전달에 이상을 주는 과정은 명확하지 않다. APP가 이상하게 절단되어 아밀로이드 베타가 많이 생성되어 신경염에 축적되게 되면 플라크 형성이 유발된다. 따라서 이런 절단 반응에 관여하는 많은 다른 요인들(예: 염증반응 등)은 타우 (tau) 단백질의 인산화를 증가시키고, NFT들과 쌍나선형 필라멘트 (paired helical filament: PHF)들의 축적을 증가시켜서 결국 신경의 손상을 증가시킨다. 이런 요인들 모두 신경의 기능 장애를 유발하고 긍극적으로 알츠하이머 형태의 치매로 진행을 가속시킨다.
비록 알츠하이머 병의 영향을 줄이기 위한 치료 방법에 대한 개발이 많이 진행되고 있으나, 현재로써는 일시적인 증상의 개선을 제공하는 것이다. 결론적으로 현재 알쯔하이머병 치료는 병의 진행 과정을 되돌리는 것이 아니라 병의 증상을 개선하는데 초점을 두고 있다. 병의 생물학적인 지식에 대해서는 보다 많이 알고 있으나, 임상에로의 적용 결과는 아직 성공적이지는 않다.
미합중국 특허 제 5,532,219 호는 4,4'-디아미노디페닐술폰 등을 포함하는 알쯔하이머병 치료용 조성물을 개시하고 있고, 미합중국 특허 제 5,506,097 호는 파라-아미디노페닐메탄술포닐 플루오리드 또는 에베락톤 A를 포함하는 알쯔하이머병 치료용 조성물을 개시하고 있으며, 미합중국 특허 제 6,136,861호는 비시클로[2.2.1]헵탄을 포함하는 알쯔하이머병 치료용 조성물을 개시하고 있다.
한편, 스트레스는 현대 사회인들에게 중요한 건강상의 문제로 대두되고 있으며, 우리나라 20세 이상의 성인의 경우 1/3 이상이 평상시 많은 스트레스를 받고 있으며, 10대인 경우 남자들보다 여자들이, 그리고 연령이 높을수록 더 많은 스트레스를 느끼고 있다. 스트레스는 개인의 성격, 취미, 해소법, 주변환경, 통제능력 등에 따라 그 강도가 다르나, 대부분 우울증을 수반한다. 우울증은 스트레스에 의해서도 발병되는 정신질환으로 자살과 같은 극단적인 결과를 보이기도 하며, 높은 재발율과 함께 빠른 환자 발생률로 인해 매우 중요한 질환으로 인식되고 있다. 우울증의 원인은 아드레날린, 도파민 또는 세로토닌 등과 같은 뇌신경 전달물질의 장애로 밝혀지고 있으며, 해마 부위의 위축 및 성인 신경 생성의 억제 등의 뇌 손상도 수반한다. 현재 알려진 대표적인 우울증 치료제로는 삼환계 항우울제 (tricyclic antidepressant: TCA)가 있으나 부작용이 크다는 단점을 갖고 있다. 특히, 아미트립틸린 등은 국내에서 광범위하게 처방되고 있으나 다양한 부작용 등 많은 문제점을 갖고 있다. 80년대 미국에서 선택적 세로토닌 차단제 (selective serotonin re-uptake inhibitor: SSRI)인 플루옥세틴 (fluoxetine)이 개발되어, TCA들의 부작용을 극복하여 약물 순응도를 크게 높이고, 치료 실패율을 낮출 수 있었으며, 1996년도 세계 20대 판매 의약품 중 7위에 오를 정도였다. 그러나, SSRI는 효과 측면에서 TCA와 비교하여 큰 차이를 보이지 않으며 또한 약물상호간섭이 심각하다는 문제점이 있다.
또한 스트레스로 인한 신경계 교란은 지속적으로 유발되며, 현재의 치료 방법은 우울증 약제 처방 후 재발 방지를 위한 조치가 특별히 없기 때문에, 투여 약물의 함량을 낮춰 지속적으로 투여하는 수준에 그치고 있다. 따라서 스트레스로 인한 신경세포 아폽토시스나 신경 전달물질 체계의 교정에 뛰어난 효과가 있는 물질의 개발이 중요하다. 또한, 스트레스로 인한 우울증의 치료를 위해 치료 기관을 방문하는 것을 기피하거나, 스트레스로 인해 세로토닌 신경계 교란과 뇌손상 등이 유발되는 것 등에 대해 간과하는 경향도 많아서 실제로 스트레스성 우울증 치료기능을 갖는 기능성 식품의 필요성은 매우 크다.
이미 세계 여러 나라에서는 신경 퇴행성 질환의 예방과 치료제 개발에 심혈을 기울이고 있으며, 그 대표적인 예로 미합중국 특허 제 6,020,127 호는 인간의 염색체 5q13에서 신경성 아폽토시스 억제 단백질을 인코딩하는 유전자를 개시하고 있고, 미합중국 특허 제 6,288,089 호는 도파민 뉴런의 아폽토시스를 억제하여 신경 퇴행성 질환을 치료할 수 있는 피리딜 이미다졸을 개시하고 있다.
하지만, 현재까지 다양한 뇌신경계 질환을 상대로 뛰어난 신경보호 효능과 뇌기능 향상 효과를 갖는 예방 및 치료용 물질은 물론이고, 정확한 서열을 갖는 합성 펩타이드에 대한 효능 보고 및 적용에 대해서는 전무한 실정이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 천연(natural-occurring) 실크 단백질 또는 실크 펩타이드의 기능을 발휘할 수 있는 합성 펩타이드를 얻기 위하여 다양한 방식으로 펩타이드를 디자인 하고, 이들 펩타이드들에 대한 활성을 조사하였다. 결국, 특정의 아미노산 서열 패턴을 가지는 펩타이드가 천연(natural-occurring) 실크 단백질 또는 실크 펩타이드와 거의 동일한 활성 수준을 나타낸다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 실크 단백질-미미킹(mimicking) 펩타이드를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 두뇌 또는 인지 기능의 증진을 위한 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 산화 스트레스 관련 질환, 질병 또는 이상의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 일반식 1로 표시되는 실크 단백질-미미킹(mimicking) 펩타이드를 제공한다:
일반식 1
Gly-Xaa1-Gly-Xaa2
상기 일반식에서, Xaa1은 Ala, Val, Ser, Tyr, Asp, Glu, Thr, Met, Ile, Leu, Phe, His, Lys 또는 Arg이고, Xaa2는 Ala, Tyr, Val, Ser, Asp, Glu, Thr, Met, Ile, Leu, Phe, His, Lys 또는 Arg이거나 또는 Ala, Tyr, Val, Ser, Asp, Glu, Thr, Met, Ile, Leu, Phe, His, Lys 또는 Arg에 추가적으로 Gly-Xaa3가 결합되 어 있는 것이며, 상기 Xaa3는 Tyr, Val, Ala, Ser, Asp, Glu, Thr, Met, Ile, Leu, Phe, His, Lys 또는 Arg이다.
본 발명자들은 천연(natural-occurring)-유래 실크 단백질 또는 실크 펩타이드의 기능을 발휘할 수 있는 합성 펩타이드를 얻기 위하여 다양한 방식으로 펩타이드를 디자인 하고, 이들 펩타이드들에 대한 활성을 조사하였다. 결국, 상기 일반식 1의 아미노산 서열 패턴을 가지는 펩타이드가 천연(natural-occurring) 실크 단백질 또는 실크 펩타이드와 거의 동일한 활성 수준을 나타낸다는 것을 확인하였다.
본 발명은 신규한 아미노산 서열을 가지는 실크 단백질-미미킹(mimicking) 펩타이드를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "실크 단백질-미미킹(mimicking) 펩타이드"는 천연(natural-occurring)-유래 실크 단백질 또는 실크 펩타이드의 생리학적 활성을 가지는 합성 펩타이드를 의미한다. 본 발명자에 의해 개발된 실크 단백질-미미킹(mimicking) 펩타이드는 약어로 "SMP(Silk Mimicking Peptide)"라 한다.
본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미하며, 아미노산 잔기 4-50개, 바람직하게는 4-40개, 보다 바람직하게는 4-30개, 가장 바람직하게는 4-20개로 이루어져 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 Xaa1은 Ala, Val, Ser 또는 Tyr이 며, 보다 바람직하게는 Ala 또는 Val이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 Xaa2는 Ala, Tyr, Val 또는 Ser이며, 보다 바람직하게는 Ala 또는 Tyr이며, 가장 바람직하게는 Ala이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 Xaa2는 Ala, Tyr, Val 또는 Ser에 추가적으로 Gly-Xaa3가 결합되어 있는 것이며, 상기 Xaa3는 Tyr, Val, Ala 또는 Ser이다. 이 경우, 일반식 1은 다음과 같이 일반식 2로 표시될 수 있다.
일반식 2
Gly-Xaa1-Gly-Xaa2-Gly-Xaa3
상기 일반식에서, 상기 Xaa3는 Tyr, Val, Ala 또는 Ser이다.
보다 바람직하게는, 상기 일반식 2에서 Xaa3는 Tyr 또는 Val이다.
본 발명의 다른 변형예에 따르면, 상기 Xaa4에는 Gly-Xaa4가 추가적으로 결합되어 있으며, Xaa5는 Tyr, Ala, Val, Ser, Asp, Glu, Thr, Met, Ile, Leu, Phe, His, Lys 또는 Arg이다.
바람직하게는, 상기 Xaa5는 Tyr, Ala 또는 Val이다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 실크단백질-미미킹 펩타이드는 서열목록 제1서열 내지 제4열 중 어느 하나의 서열목록의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).
본 발명의 펩타이드는 그 자체로도 우수한 안정성을 나타내지만, 안정성을 더 크게 향상시키기 위하여 다양한 보호기(protection group)가 결합될 수 있다. 보호기의 예는, 아미노산, 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 포함하며, 가장 바람직하게는 아세틸기가 본 발명의 펩타이드에 결합되어 있다.
상기 보호기는 본 발명의 펩타이드의 다양한 아미노산 잔기에 결합될 수 있지만, 바람직하게는 N- 또는 C-말단에 결합되어 있다.
본 발명의 펩타이드 서열의 특징은 Gly 잔기가 한 잔기 건너 주기적으로 위치한다는 것이다. 따라서 상기 일반식 1에 속하는 서열을 포함하면서 Gly 잔기가 아미노산 서열에서 한 잔기 건너 위치하는 패턴을 나타낸다면, 아미노산 서열 길이에 무관하게 본 발명의 범위에 속하는 것이다. 즉, 상기 일반식 1은 본 발명의 펩타이드 서열의 길이를 한정하기 위한 것이 아니라, 본 발명의 펩타이드를 명확하게 표현하기 위하여 사용한 것이다.
본 발명의 실크단백질-미미킹 펩타이드는 천연-유래 실크단백질 또는 실크펩타이드(실크단백질의 가수분해물, 참조: 본 발명자들의 특허 제0494357호)의 생리활성, 예컨대, 신경세포 보호, 뇌신경 질환 또는 질병의 치료, 두뇌 또는 인지 기능의 개선, 산화 스트레스 억제, 숙취 방지 및 피부 보습 개선 등의 활성을 가지면 서도 매우 우수한 안정성을 나타낸다. 특히, 본 발명의 실크단백질-미미킹 펩타이드는 신경세포 보호, 뇌신경 질환 또는 질병의 치료, 두뇌 또는 인지 기능의 개선, 그리고 산화 스트레스 억제 등에 매우 유효하다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 종래의 천연-유래 실크단백질 또는 실크 펩타이드와 비교하여 분자량이 작고 안정된 구조를 가지기 때문에, 생체 내 타깃으로 하는 조직 등에 운반(delivery)하기 용이하며(SMPs 자체가 생체 내 운반이 잘 되며, 다른 약물운반시스템에 의해 도움을 받는 경우에도 생체 내 운반이 잘 이루어진다), 이에 의약 또는 기능성 식품으로 개발하는 데 매우 유리하다.
종래의 실크단백질 또는 실크 펩타이드 원료들은 균질하지 못하기 때문에 많은 한계를 가지고 있다. 예를 들어, 종래의 실크단백질 또는 실크 펩타이드는 의약 및 기능성 식품으로 개발하는 데 있어서 일정한 품질을 가지는 원료를 공급하는 것이 매우 어려웠다.
본 발명의 SMPs는 종래의 실크단백질 또는 실크 펩타이드와 거의 동일한 생리학적 활성을 나타내면서도 상술한 문제점을 해결할 수 있는 방안을 제시한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 실크 단백질-미미킹(mimicking) 펩타이드의 유효량을 포함하는 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 실크 단백질-미미킹(mimicking) 펩타이드의 유효량을 포함하는 두뇌 또는 인지 기능의 증진을 위한 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 실크 단백질-미미킹(mimicking) 펩타이드의 유효량을 포함하는 산화 스트레스 관련 질환, 질병 또는 이상의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 다양한 뇌신경질환에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 신경 퇴행성 질환, 허혈 또는 재관류에 의한 질환 및 정신 질환에 적용된다. 본 발명의 조성물에 의해 치료되는 상기 신경 퇴행성 질환은 바람직하게는, 치매, 헌팅톤 질병, 파킨슨씨 질병 및 근위축성 측삭 경화증이다. 본 발명의 조성물에 의해 치료되는 상기 허혈 또는 재관류에 의한 질환은 바람직하게는 허혈성 뇌졸중이다. 본 발명의 조성물에 의해 치료되는 상기 정신질환은 우울증, 정신분열증 및 심적 외상후 스트레스 장애이다.
또한, 본 발명의 조성물은 두뇌 또는 인지 기능의 증진하는 데 매우 효과적이다. 바람직하게는, 상기 두뇌 또는 인지 기능은 학습 능력, 기억 능력 또는 집중력이다. 또한, 본 발명의 조성물은 뇌신경질환에 수반되는 두뇌 또는 인지 기능의 악화를 개선하는 데 매우 유효하다.
이와 같은 본 발명의 조성물의 효능 중 신경계와 관련된 것은 대체적으로 신경 세포의 보호 작용을 통하여 나타난다. 본 명세서에서 용어 "신경 세포"는 중추 신경계, 뇌, 뇌간, 척수, 중추 신경계와 말초 신경계의 접합부분 등의 구조를 이루는 뉴런, 신경지지 세포, 글리아, 슈만 세포 등을 포함한다. 본 명세서에서 용어 "신경 세포의 보호"는 신경성 인설트(nervous insult)를 경감 또는 개선 (amelioration)하는 작용, 또는 신경성 인설트에 의해 손상을 입은 신경 세포의 보호 또는 회복시키는 작용을 의미한다. 또한, 본 명세서에서 용어 "신경성 인설트"는 다양한 원인(예: 대사성 원인, 독성 원인, 신경 독성 원인 및 화학적 원인, 등)에 의해 초래되는 신경 세포 또는 신경 조직의 손상을 의미한다.
본 발명의 실크 펩타이드에 의한 신경 세포의 보호 작용은 다양한 기전을 통해 발휘될 수 있으며, 예를 들어 신경 세포의 사멸을 억제함으로써 발휘되며, 이러한 신경 세포의 사멸은 신경 세포의 괴사(necrosis) 및 아폽토시스(apoptosis)를 포함한다. 본 발명의 조성물에 의한 신경 세포의 사멸은 활성기 산소의 발생 억제 또는 미토콘드리아의 기능 보호를 통하여 달성된다(참조: 실시예).
한편, 본 발명의 조성물은 산화 스트레스 관련 질환, 질병 또는 이상을 예방 또는 치료하는 데에도 매우 효과적이다.
산화 스트레스는 다양한 질병의 원인이 되는 것으로서, 일반적으로 산화력이 매우 큰 물질, 예컨대, 활성기 산소(reactive oxygen species, 예: 수퍼옥사이드, 퍼옥사이드, 등)에 의해 초래된다. 이와 같은 산화 스트레스는 노화의 주 원인으로 작용한다. 본 발명의 펩타이드는 생체 내의 산화 스트레스를 감소시키는 작용을 하며, 예를 들어, 활성기 산소의 생성을 억제하여 산화 스트레스를 감소시킨다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 치료될 수 있는 산화 스트레스 관련 질환, 질병 또는 이상은 노화; 트로마 (외상), 뇌성마비, 당뇨병성 신경병증을 포함하는 중추 신경계 질환; 당뇨병성 말초 신경병증 및 외상 적 신경 손상을 포함하는 말초 신경계 질환; 간헐성 파행 및 동맥경화를 포함하는 심혈관계 질환; 백내장 및 관절염을 포함하는 근-골격계의 질환; 또는, 이온 조사(ionizing radiation)에 따른 이상, 항암제의 처치에 따른 이상 및 발암물질에 대한 노출에 따른 이상을 포함하는 활성 산소기를 초래하는 외부 환경에 의해 발생하는 이상이다.
본 발명의 조성물은 약제학적 조성물 및 식품 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물인 경우, 본 발명의 조성물은 (i) 본 발명의 실크 단백질-미미킹(mimicking) 펩타이드의 유효량; 및 (ii) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 명세서에서 용어 "유효량"은 상술한 본 발명의 치료 효능을 발휘하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물 (예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름 (예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담 체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 적합한 1일 투여량은, 0.001-100 mg/kg(체중)이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 식품, 특히 기능성 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서의 후박나무 추출물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점(advantages)을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명의 실크 단백질-미미킹(mimicking) 펩타이드는 천연-유래 실크 단백질 또는 실크 펩타이드의 생리학적 활성을 거의 동일한 수준으로 유지하면서도, 펩타이드 고유의 우수한 특성, 예컨대 우수한 안정성 등을 갖는다.
(ⅱ) 본 발명의 펩타이드는 분자량이 작기 때문에, 분자량이 큰 종래의 실크 단백질 또는 실크 펩타이드가 적용(application)될 수 없는 범위까지 적용 범위를 넓힐 수 있다.
(ⅲ) 본 발명의 펩타이드는 분자량이 작기 때문에 생체 내 적용시 운반(delivery)이 매우 유리하며, 따라서 생체이용성(bioavailability)이 우수하다.
(ⅳ) 본 발명의 합성 펩타이드를 이용하면 균질한 의약 또는 식품 조성물을 제조할 수 있다. 따라서, 일정한 품질을 가지는 의약 또는 식품 조성물을 제공할 수 있어, 의약 또는 기능성 식품으로 개발하는 데 매우 유리하다.
(ⅴ) 본 발명의 펩타이드는 특히, 신경보호 활성이 매우 우수하여, 다양한 뇌신경질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
제조예 1: 본 발명의 펩타이드의 제조
실크 단백질의 생리학적 기능을 발휘할 수 있는 실크 단백질-미미킹(mimicking) 펩타이드 서열을 디자인 하였다. 디자인된 본 발명의 펩타이드들은 (주) 펩트론 회사에 의뢰하여 화학적으로 합성하여 제조하였다. 합성된 펩타이드는 다음 표 1에 정리되어 있다. 합성된 펩타이드를 "SMP(Silk Mimicking Peptide)"라 명명하였다.
펩타이드 명 아미노산 서열
SMP-1 GAGAGVGY
SMP-2 GVGY
SMP-3 GAGAGY
SMP-4 GVGAGY
실시예 1: 6-OHDA에 의한 도파민 신경세포 사멸에 있어서 여러 가지 펩타이드들의 보호 효과
본 발명의 펩타이드들, SMPs의 신경세포 보호 효과를 확인하기 위하여, 파킨슨 질환의 주 원인인 도파민성 세포의 사멸억제 효과를 분석하였다. 스테레오탁식 시스템(stereotaxic system)을 이용하여 6-OHDA(6-hydroxydopamine)를 뇌 조직내에 주입하고 도파민성 신경세포의 사멸을 면역조직 염색방법을 이용하여 확인하였다.
6-OHDA에 의한 동물 신경 독성을 확인하기 위해서, 5주령 수컷 마우스(SAMTACO, Korea)를 이용하였다. 4주령 된 쥐를 주문하여 1주 동안 적응 시키고 스테레오탁식 시스템(KOFT, CA, USA)을 이용해서 신경세포 사멸을 유도하였다. 적응화 한 5주된 마우스를 이용해서 실험을 진행하였다. 본 실험에서는 스테레오탁식 시스템을 이용하여 원하는 부위(0.0 mm posterior to bregma; 2.0 mm lateral to midline; 3.0 mm ventral to the dura)에 6-OHDA(염수 내 3 μg/㎕)을 주입하여 모델을 제작하였다. 본 연구에서는 6-OHDA를 흑색질에 주입하였다. 이곳은 도파민 신경세포의 신경 돌기와 연결되어 있는 곳으로서 천천히 도파민성 신경세포를 사멸시키기에 적당한 위치이다. 6-OHDA 주입 후 효과를 확인하고자 하는 SMPs을 5 mg/kg의 농도로 2주간 복강 투여하였으며, 2주 후에 동물 행동 실험을 진행한 각 실험군을 4% 파라포름알데하이드를 이용해서 고정하였다. 이렇게 고정한 쥐의 뇌를 적출하여 4% 파라포름알데하이드가 첨가된 상태에서 24시간 그리고 생리 식염수에 15, 20, 25 및 30%의 수크로오스를 이용하여 4일에 걸쳐서 고정된 쥐 뇌에서 탈수를 진행하였다. 그리고 이렇게 처리된 뇌를 냉동 조직 절편기를 이용하여 절편을 만들었다. 30 mm 두께의 뇌 절편을 메틸 그린 조직화학염색방법을 이용하여 염색한 다음, 공초점 현미경(LSM 510 meta, Zeiss, Feldbach, 스위스)을 이용하여 그 영향을 촬영하였다.
도 1에서 볼 수 있듯이, 대조군(비처리군)에서는 6-OHDA를 주입한 쪽의 뇌조직 내에 염색된 도파민성 신경세포를 발견할 수 없었다. 그러나 양성대조군인 MD(효소가수분해산물)와 멜라토닌을 주입한 동물의 경우 효과적으로 6-OHDA의 독성을 보호하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 SMPs를 주입한 경우, 양성대조군과 유사하게 뇌조직 내에 염색된 도파민성 신경세포를 발견할 수 있었고, 이에 본 발명의 펩타이드는 신경세포 사멸을 억제하는 활성을 갖는다는 것을 알 수 있다.
한편, 양성대조군에 사용되는 MD는 본 발명자들의 선특허인 대한민국 특허 제0494357호에 개시된 실크 단백질의 효소가수분해물인 BG101이다.
실시예 2: 6-OHDA를 이용한 도파민성 신경세포 사멸 동물 모델(PD 동물 모델)에서 본 발명 펩타이드들의 처리에 의한 행동 이상 보호효과
도파민성 신경세포 보호효과를 동물 모델에서 행동 실험을 통해서 확인하였다. 본 연구는 6-OHDA로 도파민성 신경세포가 파괴된 동물에서 암페타민(Amphetamin)을 주입하여 편향성 회전 행동이상을 유도하였으며 신경세포 보호물질들에 의해 행동 이상이 얼마나 정상화 될 수 있는지에 대해서 확인했다.
본 연구에서 알츠하이머 동물 모델은 5주령 된 수컷 마우스(SAMTACO, Korea)를 이용하였다. 4주령 된 마우스를 주문하여 1주 동안 적응 시키고 스테레오탁식 시스템(KOFT, CA, USA)을 이용해서 동물모델을 만들었다. 적응화 한 5주된 마우스를 이용해서 실험을 진행하였다. 본 실험에서는 스테레오탁식 시스템을 이용하여 원하는 부위(0.0 mm posterior to bregma; 2.0 mm lateral to midline; 3.0 mm ventral to the dura)에 6-OHDA(염수 내 3 μg/㎕)을 주입하여 모델을 제작하였다. 본 연구에서는, 6-OHDA를 흑색질에 주입한다. 이곳은 도파민 신경세포의 신경 돌기와 연결되어 있는 곳으로서 천천히 도파민성 신경세포를 사멸시키기에 적당한 위치이다. 마우스에 6-OHDA를 주입한 뒤 2주후부터 암페타민(amphetamine at 0.1 mg/kg i.p.)에 의한 편향성을 1분 30초 동안 확인하였다. 결과를 통해서 적어도 400회 이상의 편향성을 보이는 동물 모델만을 이용하여 독성 보호효과를 확인하였다. 5mg/kg의 농도로 각각의 SMPs를 2주간 복강 투여한 후 2주 뒤부터 그 효과를 각 행동 실험으로 확인했으며 시간이 지나면서 대조군에 비해 편향성이 매우 빠르게 회복되는 것을 확인할 수 있었다.
본 실험은 파킨슨 질환 동물모델에서, 본 발명의 실크 단백질-미미킹 펩타이드가 효과를 나타내는 지 여부를 확인하는 것이다. 도 2에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 SMPs, MD 및 멜라토닌 모두 동물개체 수준에서 도파민성 신경세포의 사멸을 효과적으로 억제하여 동물의 행동이상을 정상화시키고 있음을 알 수 있다.
실시예 3: 본 발명의 펩타이드의 아밀로이드 단백질에 의한 해마내 신경세포 사멸에서 신경세포 보호 효과
본 연구는 아밀로이드 단백질에 의한 해마부위의 신경 독성을 SMPs가 효과적으로 보호할 수 있는 지 여부를 분석하는 것이다. 신경세포 염색(methyl green)을 통해서 아밀로이드 단백질의 스테레오탁식 시스템을 이용한 주입에서 해마부위에 신경세포 사멸을 관찰하였다.
아밀로이드 베타 단백질에 의한 동물 독성을 확인하기 위해서 5주령 된 수컷 마우스(SAMTACO, Korea)를 이용하였다. 4주령 된 쥐를 주문하여 1주 동안 적응 시키고 스테레오탁식 시스템(KOFT, CA, USA)을 이용하여 질병 동물을 만들었다. 적응화 한 5주된 마우스를 이용해서 실험을 진행하였다. 본 실험에서는 스테레오탁식 시스템을 이용하여 원하는 부위에 아밀로이드 베타 1-42 단백질(Biosource CA USA)을 4 nmol/5 ㎕ 주입하여 모델을 제작하였다. 본 연구에서는 아밀로이드 베타 단백질을 실내 부위(intraventricular zone)에 주입해준다. 이곳은 좌우 연결되어 있는 뇌실로서 좌우반구 모두에서 아밀로이드 베타 단백질의 영향을 받게 된다. 아밀로이드 베타 단백질 주입 후 효과를 확인하고자 하는 SMPs을 5 mg/kg의 농도로 2주간 복강 투여하였으며, 2주 후에 동물 행동 실험을 진행한 각 실험군을 4% 파라포름알데하이드를 이용해서 고정하였다. 이렇게 고정한 마우스의 뇌를 적출하여 4% 파라포름알데하이드가 첨가된 상태에서 24시간 그리고 생리 식염수에 15, 20, 25, 30%의 수크로스를 이용하여 4일에 걸쳐서 고정된 쥐 뇌에서 탈수를 진행하였다. 이렇게 처리된 뇌를 냉동 조직 절편기를 이용하여 절단하여 30 mm 두께의 절편을 제조하고, 메틸 그린 조직화학염색방법을 이용하여 염색한 다음, 공초점 현미경(LSM 510 meta, Zeiss, Feldbach, 스위스)을 이용하여 그 영향을 촬영하였다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 SMPs가 아밀로이드 단백질에 의한 신경세포 사멸을 효과적으로 억제하고 있다는 것을 알 수 있다. 가쪽 뇌실에 주입한 SMPs는 효과적으로 해마내의 치아이랑 부위의 신경세포 사멸을 보호하였다.
실시예 4: 본 발명의 펩타이드의 아밀로이드 베타 단백질에 의한 신경독성 보호효과(수동회피 행동 실험)
본 실험은 신경세포 독성 물질에 의한 동물 모델의 학습 및 기억력 저하에 있어서 각 펩타이드별 보호효과를 수동회피 동물 실험 방법을 통하여 확인하는 것이다. 학습 실험을 진행하기 전에 아밀로이드 베타 단백질을 스테레오탁식 시스템을 통해 가쪽뇌실을 통해 주입하여 알츠하이머 질환 동물 모델을 확립하였다. 그리고 3일 이후부터 지속적으로 실험이 진행되는 동안 각각의 펩타이드 SMPs을 5 mg/kg의 농도로 2주간 복강 투여하였다.
각 펩타이드별 보호효과를 확인하기 위한 수동회피 행동 실험기구로는 자동화된 셔틀 상자 (Model PACS-30, Columbus Instruments International Company)를 이용하였다. 셔틀 상자는 칸막이문 (3″L x 2.625″W)에 의하여 같은 크기 (19″L x 9″W x 10.875″H)의 두 개의 방으로 나누어져 있으며 방바닥에는 전류가 흐를 수 있게 장치되어 있으며, 힌지 플렉시글래스 리드 (hinged plexiglass lid)에 올려놓은 20W 전구로 각 방을 조명할 수 있도록 하였다. 백서는 칸막이 문을 통하여 소음이 60 dB 이하이고, 조명을 어둡게 한 어두운 방으로 들어갈 수 있다. 백서를 처음에는 불이 켜져 있는 방에 넣고 칸막이 문을 열어 주면 방안을 이리저리 살피다가 어두운 방으로 넘어가게 되는데 이때 칸막이 문이 자동으로 닫히면서 조명이 꺼지게 된다. 이런 훈련 과정을 백서가 20초 내로 어두운 방으로 들어가게 될 때까지 계속 실시하였다. 훈련 과정을 마친 24시간 후 다시 백서를 조명이 있는 방에 넣은 후 어두운 방으로 들어가게 되면 칸막이 문이 닫히고 셔틀 상자 바닥에 3초 동안 전류 (1 mA)가 흐르게 하였다. 아밀로이드 베타 단백질(8 nmol/5 μl in normal saline)의 가쪽 뇌실 주입 2주 후, 다시 이 백서를 셔틀 상자의 조명이 있는 방에 넣은 후 어두운 방으로 넘어갈 때까지의 시간을 측정하였다. 최대로 어두운 방으로 들어가지 않는 시간을 5분으로 하여 실시하였다.
도 4에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 SMPs는 MD와 멜라토닌과 거의 동일한 수준으로 신경세포 보호를 통한 학습 및 기억력 저하를 억제하는 것을 확인 할 수 있었다. 전기 자극을 주기 전에 학습이 진행되는 속도를 보아도 확실히 대조군과 비교했을 때 30초 이하로 유지되는 것을 확인 할 수 있었으며, 24시간이 지난 후 전기 자극에 대한 기억 유지의 확인에서도 대조군과 비교했을 때 의미 있는 결과를 나타내었다.
실시예 5: 본 발명의 펩타이드의 아밀로이드 베타 단백질에 의한 신경독성 보호효과(수중미로 학습 기억 행동 실험)
본 실험은 신경세포 독성 물질에 의한 동물 모델의 학습 및 기억력 저하에 있어서 각 물질별 보호효과를 수중 미로 동물 실험 방법을 통하여 확인하는 것이다. 학습 실험을 진행하기 전에 아밀로이드 베타 단백질을 스테레오탁식 시스템을 통해 가쪽뇌실을 통해 주입하여 알츠하이머 질환 동물 모델을 확립하였다. 그리고 수술 후 3일 이후부터 지속적으로 수중 미로 행동실험이 진행되는 7일 동안 각각의 물질들을 복강 투여하였다. 우선 5일 동안 학습의 진행 정도 및 주위 환경을 인지하고 기억을 형성하는 시간을 확인할 수 있는 레퍼런스 테스트를 확인했다.
아밀로이드 베타 단백질을 주입한 모델 제작을 한 후, 2주 동안 지속적으로 각각의 펩타이드 SPMs를 5mg/kg의 농도로 주입한 쥐에게 수중 미로 실험을 시작하였다. 검정색의 플라스틱 재질의 수조를 케이쥐로 이용하였고 직경이 120 cm 이고, 검은색으로 칠해진 금속 재질의 원형의 플랫폼(14 x 14 cm)을 물 선 밑으로 1 cm 위치시키고 실험을 진행하였다. 플랫폼은 수조를 4구역으로 나누고 가운데에서 벽 사이에 위치시켰다. 동서남북으로 나눈 수조의 4구역에서 각각 출발하되 무작위적으로 출발점을 정하였다. 잠복시간(Latency time)은 출발지점에서 플랫폼으로 도착한 시간으로 정의 내렸다. 이미지 분석기기(SMART software basic version, Frame Grabber board, Panlab s.l., Denmark)가 연결된 컴퓨터를 이용하여 수조에서의 수영 행동 양상을 관찰하였다. 처음 수조에 마우스를 넣은 후, 3초 뒤에 분석과 기계작동이 시작되며 플랫폼에서 2초간 머무르면 자동으로 기록이 멈출 수 있도록 디자인 하였다. 본 실험은 4일 동안 각각 4번씩 출발위치를 다르게 하여 같은 조건을 가지고 실험이 진행되며 각각 잠복시간을 기록하여 분석 비교하였다. 이때 분석은 워킹 메모리로서 분석 되며, 이것은 단기 기억으로도 분석 될 수 있다. 그리고 5일째는 같은 조건에서 플랫폼만을 제거하고 원래 플랫폼이 존재하던 위치를 찾아가는 횟수를 확인하였다. 이것은 레퍼런스 기억으로 분석되며, 장기 기억으로도 분석 될 수 있다. 이때 가장 오랜 걸린 시간의 기준은 5분으로 하며 플랫폼을 찾아가는 횟수를 분석하는 시간도 5분을 기준으로 하였다. 잠복 시간 (Latency time)의 변화는 기억력의 감퇴와 회복을 나타내는데 이 시간이 길어질수록 기억력이 상승되었음을 의미한다.
도 5a 및 도 5b에서 볼 수 있듯이, 대조군과 비교하여 투여한 모든 물질들이 비슷한 효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 실제로 오차범위 안에서 효과가 동일한 것을 확인할 수 있는 결과이다. 그리고 5일 동안 학습이 마무리 된 후에 24시간 이후에 다시 수중미로 테스트를 진행 했을 때 기억이 얼마나 유지되는지 워킹 테스트를 통해서 확인할 수 있었다. 본 결과에 의하면 학습의 유지에 있어서 5일째 테스트의 속도와 7일째 테스트의 속도를 비교했을 때 학습과 기억의 유지에 있어서도 모든 물질들이 거의 차이가 없는 것을 확인 할 수 있었다.
따라서 본 발명의 SMPs는 신경독성으로부터 신경세포를 보호하여, 인지에 의한 학습과 기억의 형성뿐 아니라 기억의 유지에 우수한 효능을 발휘한다는 것을 알 수 있다.
실시예 6: 본 발명의 펩타이드의 아밀로이드 베타 단백질에 의한 신경세포 사멸에 대한 보호효과(신경세포 생존율 및 핵 분절에 의한 세포 사멸 분석)
아밀로이드 베타의 신경세포 독성에 대한 본 발명의 SMPs의 보호효과를 확인하기 위하여, 신경세포 생존율과 세포사멸의 증거인 핵분절 형태를 분석하였다. 동물실험을 통한 아밀로이드 베타 단백질에 대한 보호효과가 어떤 경로를 통해 일어나는지 확인하고자 신경세포종의 세포 독성영향과 그 세포의 핵손상 보호를 관찰하였다. 실험에 사용되는 "cosmo"물질은 MD 물질과 같은 방식으로 제조된 것으로서, 다른 배치에서의 제조된 것을 나타낸다.
아밀로이드 베타 단백질에 의한 신경세포종의 세포 독성 영향을 확인하기 위하여, MTT 환원 분석을 시행하였으며, 이를 위해 사람 신경모세포종(neuroblastoma cell)인 SK-N-SH 세포(ATCC)를 PEI-코팅 96-웰 플레이트에 40,000 cells/웰의 밀도로 깔아주었다. SK-N-SH 세포는 DMEM에 10% FBS(fetal bovine serum)를 보충한 배양액으로 배양하였으며, 실험하기 2시간 전에 저혈청 배지(DMEM with 1% FBS)로 바꾸어주고 각각의 물질을 일정 시간동안 처리하였다. MTT 환원 분석은 기존에 보고 된 방법을 변형하여 시행하였다(Shearman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91(4):1470-4(1994), Shearman et al., J. Neurochem. 65(1):218-27(1995), 및 Kaneko et al., J. Neurochem. 65(6):2585-93(1995)). 배양된 세포에 아밀로이드 베타 단백질을 처리한 뒤 37ㅀC, 5% CO2 항온기에서 배양한 후, 48시간 후에 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Sigma) 용액을 최종농도가 0.5 mg/ml 농도가 되도록 각 웰에 첨가한 후에 4시간 반 동안 더 배양하였다. SMPs 처리는 아밀로이드 베타 처리 전에 2시간 동안 10 fM의 농도로 실시하였다. MTT의 환원에 의해서 형성된 포르마잔 침전물(formazan precipitate)을 용해액(0.1 N HCl in 무수 이소프로판올)에 녹인 후에 ELISA 리더를 이용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 값은 해당되는 용매만을 추가한 대조군 값을 100%로 하고 0.9% Triton X-100에 의해 세포가 완전히 파괴되었을 때의 MTT 환원 정도를 0%로 하여 상대적인 값으로 표시하였다.
아밀로이드 베타 단백질에 의한 핵 염색체 등의 형태변화는 DNA-결합 플루오로크롬 비스-벤즈(Hoechst 33258 dye)로 염색하여 관찰하였다. 배양된 SK-N-SH 세포에 SMPs를 10 fM의 농도로 처리하였으며, 2시간 이후, 아밀로이드 베타 단백질을 20μM의 농도로 24시간 동안 처리하였다. 처리된 0.5-3.0 x 106 세포를 300 x g에서 10분간 원심 분리하여 모은 후 PBS로 세척하고, 세포를 50 ㎕의 파라포름알데하이드에 현탁한 후 상온에서 10분간 고정하였다. 세포를 PBS로 세척한 후 16 μg/ml의 비스-벤지미드를 포함한 PBS 15 ㎕를 넣어서 상온에서 15분간 방치한 후 10 ㎕ 분획을 슬라이드 글래스에 놓고 형광현미경 하에서 아폽토시스 핵 염색체의 변화를 관찰하였다.
도 6a 및 6b는 각각 핵분절 및 세포생존율 실험결과이다. 도면에서, oligo 1 및 oligo 2는 각각 SMP-1 및 SMP-4를 나타낸다.
우선 신경세포 SK-SNSY에 알츠하이머 유발 주요 물질인 아밀로이드 베타 단백질을 처리했을 때 약 55% 정도의 세포 사멸이 유발되었고, 본 발명의 oligo 1 및 oligo 2를 처리했을 때 MD 및 cosmo 수준으로 세포 사멸을 극적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
Hoechst 33258 염색을 이용하여 SK-N-SH 세포의 핵 형태변화를 관찰한 결과, 아밀로이드 베타 단백질을 처리한 경우 대조군에 비해 심각한 핵 응축과 분절 현상을 관찰할 수 있었으며, 본 발명의 oligo 1 및 oligo 2를 전 처리 하였을 때, 아밀로이드 베타 단백질 단독 처리군에서 관찰되었던 핵 응축과 분절 현상이 MD 및 cosmo 수준으로까지 뛰어난 저해 효과를 나타내었다.
따라서, 본 발명의 SMPs는 신경독성 물질에 의한 핵 분절을 억제함으로써, 신경세포의 사멸을 막고 궁극적으로 신경세포의 보호 작용을 한다는 것을 알 수 있다.
실시예 7: 활성기 산소의 발생에 의한 신경세포 사멸에 있어서 본 발명의 펩타이드의 보호 효과
본 발명자들은 상술한 본 발명의 펩타이드의 신경세포 독성에 대한 보호가 어떤 경로를 통해 일어나는지 확인하기 위하여 아밀로이드 베타 단백질에 의한 신경세포 독성에서 중요한 신호전달 경로로 알려진 활성산소(ROS)의 양을 분석하였다. DCF-DA염색 방법을 이용해 활성산소의 양을 정량화 하였으며 형광 현미경을 이용하여 그 형태도 관찰하였다.
먼저, 배양한 SK-N-SH 세포(ATCC)에 SMPs를 10 fM의 농도로 처리하였으며, 이어 2시간 이후, 아밀로이드 베타 단백질을 20 μM 의 농도로 처리하였다. 그런 다음, 세포를 HCSS 완충액(20 mM HEPES, 2.3 mM CaCl2, 120 mM NaCl, 10 mM NaOH, 5 mM KCl, 1.6 mM MgCl2, 15 mM 글루코오스)에 용해시킨 10 μM의 DCF-DA(6-carboxy-2',7'-dichloro-dihydro fluoresceine diacetate, dicarboxym-ethylester)와 현탁보조제인 2% Pluronic F-127을 37℃에서 30분간 처리하였다. 세포 내 자유라디칼에 의한 DCF 형광은 실온에서 수은 램프 형광 부속을 갖춘 Olympus IX70 도립 현미경 상에서 관찰하였으며(Excitation=488 nm, Emission=510 nm), CCD 카메라로 화상을 포착한 후 NIH Image 1.65 프로그램을 이용하여 영상분석하거나, 유세포 분석기(GENios, Tecan, NC, USA)를 이용하여 485 nm 여기 파장과 510 nm 방사 파장에서 측정하였다.
도 7a에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 oligo 1과 oligo 2는 MD 및 cosmo와 동일한 수준으로 활성 산소의 양을 감소시키는 것을 확인하였으며, oligo 2가 1에 비해서 상대적으로 약간 효과가 더 우수하였다. 이는 앞서 행동실험을 통해 규명한 내용과 어느 정도 일치한다. 또한, 도 7b 및 7c의 형광현미경 분석결과에서도, 본 발명의 펩타이드가 활성기 산소를 효과적으로 억제한 다는 것을 확인할 수 있다.
따라서 본 발명의 펩타이드는 활성기 산소의 발생을 방해함으로써, 신경 세포사멸을 억제한다는 것을 알 수 있다.
실시예 8: 미토콘드리아의 기능 이상을 통한 신경세포 사멸에 있어서 보호 효과
최종적으로, 세포내 에너지 대사에 매우 중요한 역할을 하는 세포 미토콘드리아에 대한 본 발명의 펩타이드의 효과를 분석하였다. 실제 아밀로이드 베타 단백질의 존재시 세포내 활성기 산소의 양이 증가하며 동시에 핵의 분절과 미토콘드리아 막의 기능이상과 사립체 기능 손실까지 유발되는 것이 이미 보고 되었다. 따라서 본 실험을 통해, 세포 생존과 밀접한 영향을 관계를 갖는 미토콘드리아의 기능 유지에 본 발명의 SMPs가 어떤 역할을 할 수 있는지 관찰할 수 있었다.
아밀로이드 베타 단백질에 의해 미토콘드리아의 기능 저하가 수반되는지를 확인하기 위해 미토콘드리아 막전위차에 특이적인 형광 염색 시료인 TMRE(tetramethyl rhodamine-ethylester, Molecular Probe)에 의한 형광염색을 이용하여 아밀로이드 베타 단백질에 의해 미토콘드리아의 막전위차 붕괴가 유발되는지의 여부를 확인하였다. 양성을 나타내는 TMRE는 미토콘드리아의 막전위차에 의해 미토콘드리아 막 안쪽으로 이동하고, 염색되는 형광 세기에 따라 막전위차가 정상적으로 유지가 되고 있는지 나타낸다. 배양된 SK-N-SH 세포(ATCC)에 SMPs를 10 fM의 농도로 처리하였으며, 이어 2시간 이후 아밀로이드 베타 단백질을 20 μM의 농도로 6시간 동안 처리하였다. 처리된 SK-N-SH 세포(ATCC)에 TMRE를 100 nM의 농도로 37℃에서 15분간 처리한 후, Flouremetry를 이용하여 여기 549 nm, 방사 574 nm에서 형광 세기를 측정하였으며, 형광 영상은 형광 현미경(Olympus IX70)을 이용하고 CCD 카메라를 이용하여 관찰하였다.
본 연구에서 아밀로이드 베타 단백질을 처리했을 때 신경세포의 미토콘드리아 막의 전위차 이상이 유발되고 막 이상을 측정할 수 있는 TMRE 염색방법을 적용했을 때 수치가 낮아지는 것을 확인하였다(도 8a). 그러나 본 발명의 펩타이드 oligo 1과 oligo 2을 처리한 세포에서는 이런 미토콘드리아 막 이상이 관찰되지 않았으며 형광현미경으로 관찰한 형태학적 관찰에서도 건강하게 그 기능을 유지하고 있는 것을 확인하였다(도 8a-8c).
상기의 결과는, 본 발명의 펩타이드 oligo 1과 oligo 2가 세포의 생존에 중요한 역할을 하는 미토콘드리아의 기능을 보호하고 효과적으로 유지시킬 수 있다는 것을 보여준다. 즉, 본 발명의 펩타이드가 미토콘드리아의 기능 유지 등을 통해서 아밀로이드 베타 등의 독성에서 세포를 효과적으로 보호하고 세포 사멸을 억제한다는 것을 알 수 있다.
위에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 실크 단백질-미미킹(mimicking) 펩타이드는 천연-유래 실크 단백질 또는 실크 펩타이드의 생리학적 활성을 거의 동일한 수준으로 유지하면서도, 펩타이드 고유의 우수한 특성, 예컨대 우수한 안정성 등을 갖는다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 분자량이 작기 때문에, 분자량이 큰 종래의 실크 단백질 또는 실크 펩타이드가 적용(application)될 수 없는 범위까지 적용 범위를 넓힐 수 있으며, 생체 내 적용시 운반(delivery)이 매우 유리하고, 따라서 생체이용성(bioavailability)이 우수하다. 한편, 본 발명의 합성 펩타이드를 이용하면 균질한 의약 또는 식품 조성물을 제조할 수 있다. 따라서, 일정한 품질을 가지는 의약 또는 식품 조성물을 제공할 수 있어, 의약 또는 기능성 식품으로 개발하는 데 매우 유리하다. 본 발명의 펩타이드는 특히, 신경보호 활성이 매우 우수하여, 다양한 뇌신경질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> BrainGuard, Co., Ltd. <120> Silk Protein-Mimicking Peptides and Compositions for Preventing or Treating Cranial Neuropathies Comprising the Same <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMP-1 <400> 1 Gly Ala Gly Ala Gly Val Gly Tyr 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMP-2 <400> 2 Gly Val Gly Tyr 1 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMP-3 <400> 3 Gly Ala Gly Ala Gly Tyr 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMP-4 <400> 4 Gly Val Gly Ala Gly Tyr 1 5

Claims (28)

  1. 다음의 일반식 1로 표시되는 실크 단백질-미미킹(mimicking) 펩타이드:
    일반식 1
    Gly-Xaa1-Gly-Xaa2
    상기 일반식에서, Xaa1은 Ala, Val, Ser, Tyr, Asp, Glu, Thr, Met, Ile, Leu, Phe, His, Lys 또는 Arg이고, Xaa2는 Ala, Tyr, Val, Ser, Asp, Glu, Thr, Met, Ile, Leu, Phe, His, Lys 또는 Arg이거나 또는 Ala, Tyr, Val, Ser, Asp, Glu, Thr, Met, Ile, Leu, Phe, His, Lys 또는 Arg에 추가적으로 Gly-Xaa3가 결합되어 있는 것이며, 상기 Xaa3는 Tyr, Val, Ala, Ser, Asp, Glu, Thr, Met, Ile, Leu, Phe, His, Lys 또는 Arg이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 Xaa1은 Ala, Val, Ser 또는 Tyr인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 Xaa2는 Ala, Tyr, Val 또는 Ser인 것을 특징으로 하 는 펩타이드.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 Xaa2는 Ala, Tyr, Val 또는 Ser에 추가적으로 Gly-Xaa3가 결합되어 있는 것이며, 상기 Xaa3는 Tyr, Val, Ala 또는 Ser인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 Xaa3에는 Gly-Xaa4가 추가적으로 결합되어 있으며, Xaa4는 Tyr, Ala, Val, Ser, Asp, Glu, Thr, Met, Ile, Leu, Phe, His, Lys 또는 Arg인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열목록 제1서열 내지 제4열 중 어느 하나의 서열목록의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  7. 상기 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 실크 단백질-미미킹(mimicking) 펩타이드의 유효량을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 삭제
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환은 치매 또는 파킨슨씨 질병인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제 7 항에 있어서, 상기 펩타이드는 신경 세포의 보호 작용을 하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 펩타이드는 신경 세포의 사멸을 억제하여 신경 세포의 보호 작용을 하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 펩타이드는 활성기 산소의 발생 억제 또는 미토콘드리아의 기능 보호를 하여 신경 세포의 사멸을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 상기 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 실크 단백질-미미킹(mimicking) 펩타이드의 유효량을 포함하는 두뇌 또는 인지 기능의 증진을 위한 식품 조성물.
  17. 삭제
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 두뇌 또는 인지 기능은 학습 능력, 기억 능력 또는 집중력인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  19. 제 16 항에 있어서, 상기 조성물은 뇌신경질환에 수반되는 두뇌 또는 인지 기능의 악화를 개선하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  20. 제 16 항에 있어서, 상기 펩타이드는 신경 세포의 보호 작용을 하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 펩타이드는 신경 세포의 사멸을 억제하여 신경 세포의 보호 작용을 하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 펩타이드는 활성기 산소의 발생 억제 또는 미토콘드리아의 기능 보호를 하여 신경 세포의 사멸을 억제하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  23. 삭제
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  27. 제 7 항에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
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