DE60315014T2

DE60315014T2 - Verfahren zur herstellung sequenzspezifischer proteasen durch gezielte evolution

Info

Publication number: DE60315014T2
Application number: DE60315014T
Authority: DE
Inventors: Andre Koltermann; Ulrich Kettling; Ulrich Haupts; Jan Tebbe; Peter Scholz; Jens Pilling; Susanne Werner; Markus Rarbach
Original assignee: Direvo Biotech AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2002-05-10
Filing date: 2003-05-09
Publication date: 2008-04-10
Anticipated expiration: 2023-05-10
Also published as: ES2289288T3; CA2485452A1; EP1361284A1; ATE367450T1; WO2003095670A3; AU2009200749B2; AU2009200749A1; EP1504117B1; AU2003233314A1; JP2005525123A; WO2003095670A2; DE60315014D1; DK1504117T3; EP1504117A2; JP4448772B2

Description

Ein Verfahren zur Generierung von sequenzspezifischen Proteasen mittels screeningbasierter zielgerichteter Evolution wird offengelegt. Die Anwendung des Verfahrens stellt Proteasen zur Verfügung, die vom Nutzer bestimmbare Aminosäuresequenzen mit hoher Sequenzspezifität erkennen und spalten. Mittels dieses Verfahrens erhältliche Proteasen können in einer Vielzahl von medizinischen, diagnostischen und industriellen Anwendungsgebieten eingesetzt werden.
Hintergrund der Erfindung

Proteolytische Enzyme oder Proteasen sind eine Klasse von Enzymen, die eine herausragende Position unter den unterschiedlichen Enzymen einnehmen, da die Reaktion die durch Proteasen kalatysiert wird, die Spaltung von Peptidbindungen in anderen Proteinen darstellt. Proteasen sind nicht nur in der Natur sehr verbreitete Enzyme, sondern zählen auch zu den wichtigsten Enzymen für den medizinischen und den industriellen Gebrauch. Vom gesamten, weltweiten Verkauf von Enzymen, der auf mehr als eine Milliarde US-Dollar pro Jahr geschätzt wird, machen Proteasen etwa 60% aus. Basierend auf der funktionalen Gruppe an der aktiven Stelle werden Proteasen in vier Gruppen eingeteilt, d.h., Serin-Proteasen (EC 3.4.21), Cystein-Proteasen (EC 3.4.22), Aspartat-Proteasen EC 3.4.23), und Metallo-Proteasen (3.4.24). Die Einstufung in eine der vier Gruppen wird üblicherweise durch experimentelle Bestimmung der Empfindlichkeit gegen unterschiedliche Arten von Proteasehemmstoffen vorgenommen. Darüber hinaus unterscheiden sich die Proteasen der vier Gruppen in ihren biochemischen Eigenschaften. Zum Beispiel sind Serin-Proteasen empfindlich gegen die Hemmstoffe 3,4-DCI, DFP, PMSF und TLCK, und ihr pH-Optimum liegt zwischen pH 7 und 11. Aspartat-Proteasen werden von Pepstatin, DAN und EPNP gehemmt, ihr pH-Optimum liegt überwiegend zwischen pH 3 und 4. Cystein-Proteasen sind empfindlich gegen Sulfhydrylhemmstoffe, wie PCMB und haben, von ein paar Ausnahmen abgesehen, neutrale pH-Optima. Metallo-Proteasen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie für ihre Aktivität ein zweiwertiges Metallion benötigen. Daher werden sie durch Chelatbildner wie EDTA gehemmt und haben neutrale oder alkalische pH-Optima. Unter diesen vier Gruppen werden weitere Klassifizierungen in der Regel auf der Basis von strukturellen Ähnlichkeiten vorgenommen. Neben einer solchen kombinierten biochemischen und strukturellen Klassifizierung können Proteasen auch nach ihrem Substratspektrum eingestuft werden. Die zwei gebräuchlichsten Gruppen, die hierbei zu unterscheiden sind, sind Exoproteasen und Endoproteasen. Exoproteasen spalten Peptidbindungen nur am äußersten Ende eines Peptids, während Endoproteasen die Spaltung von Bindungen überall in einem Peptidstrang katalysieren. Die Spezifität von Proteasen, nämlich ihr Vermögen speziell bestimmte Peptidsubstrate zu erkennen und zu hydrolysieren während andere ungespalten bleiben, kann qualitativ und quantitativ dargestellt werden. Die qualitative Spezifität bezieht sich auf die Art von Aminosäureresten, die von einer Protease an bestimmten Positionen des Peptidsubstrats akzeptiert werden. So sind sich zum Beispiel Trypsin und der Tissue-type-Plasminogen-Aktivator im Bezug auf ihre qualitative Spezifität ähnlich, da beide an der Stelle P1 einen Arginin- oder einen ähnlichen Rest benötigen (Nomenklatur von Peptidsubstratpositionen gemäß der Nomenklatur von Schlechter & Berger (Biochem. Biophys. Res. Commun. 27 (1967) 157-162). Demgegenüber bezieht sich die quantitative Spezifität auf die jeweilige Anzahl von Peptidsubstraten, die als Substrate angenommen werden. Die quantitative Spezifität kann durch den Ausdruck S = –log(Q)angegeben werden, wobei Q das Verhältnis aller akzeptierten Peptidsubstrate gegenüber allen möglichen Substraten darstellt. Die quantitativen Spezifitäten einiger Substrate werden exemplarisch in Tabelle 1 gezeigt. Die Ermittlung der quantitativen Spezifitäten basiert auf den zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren, und auf der Annahme, dass alle Kombinationen dieser zwanzig Aminosäuren möglich sind. Folglich haben Proteasen, die nur einen kleinen Teil aller möglichen Peptide akzeptieren, eine hohe Spezifität, während die Spezifität von Proteasen, die, als ein Extrem, jedes Peptidsubstrat spalten, theoretisch gleich null wäre. Tabelle I: Quantitative Eigenschaften von Proteasen

Protease	Substratanforderungen									Quantitative Spezifität
Protease	P6	P5	P4	P3	P2	P1	P1'	P2'	P3'	Q	S = –log Q
	x	x	x	x	x	x	x	x	x	1,00E + 00	0
Chymotrypsin	x	x	x	x	x	F/Y/W	x	x	x	1,50E – 01	0,82
Papain	x	x	x	x	F/V/L	x	x	x	x	1,50E – 01	0,82
Trypsin	x	x	x	x	x	K/R	x	x	x	1,00E – 01	1,00
Pepsin	x	x	x	x	x	F/Y/L	W/F/Y	x	x	2,25E – 02	1,65
TEV	E	x	x	Y	x	Q	S/G	x	x	1,25E – 05	4,90
Plasmin	x	x	K/V/I/F	x	F/Y/W	R/K	N	A	x	7,50E – 06	5,12
Thrombin	x	x	L/I/V/F	x	P	R	N	A	x	1,25E – 06	5,90
t-PA	x	x	C	P	G	R	V	V	G	7,81E – 10	9,11

(Aminosaurereste werden, wie in Tabelle II gezeigt, abgekürzt. x bezieht sich auf irgendeinen Aminosäurerest.)

Die quantitative Spezifität von Proteasen variiert innerhalb eines weiten Bereichs. Es sind sehr unspezifische Proteasen, wie Papain, bekannt, die alle Polypeptide spalten, die einen Phenylalanin-, einen Valin- oder einen Leucinrest (s = 0,82) beinhalten, oder Trypsin, das alle Polypeptide spaltet, die einen Arginin- oder Lysinrest enthalten (s = 1,0). Demgegenüber sind hochspezifische Proteasen, wie zum Beispiel der Tissue-type-Plasminogen-Aktivator (t-PA) bekannt, der Plasminogen ausschließlich an einer einzigen spezifischen Sequenz spaltet (s = 9,11). Proteasen mit hoher Substratspezifität spielen bei der Steuerung von Proteinfunktionen in lebenden Organismen eine wichtige Rolle. Die spezifische Spaltung von Polypeptidsubstraten aktiviert zum Beispiel Vorläuferproteine oder deaktiviert aktive Proteine oder Enzyme und steuert so ihre Funktionen. Einige Proteasen mit hoher Substratspezifität werden bei medizinischen Anwendungen eingesetzt. Pharmazeutische Beispiele für die Aktivierung oder die Deaktivierung durch Spaltung von spezifischen Polypeptidsubstraten sind bei akutem Herzinfarkt die Anwendung von t-PA, welches Plasminogen aktiviert Fibrinogengerinnsel aufzulösen, oder bei Schlaganfällen die Anwendung von Ancrod, welches Fibrinogen deaktiviert und dadurch die Blutviskosität senkt und seine Transportkapazität erhöht. Während es sich bei t-PA um eine humane Protease mit einer für die menschliche Blutregulierung notwendigen Aktivität handelt, ist Ancrod eine nicht-humane Protease. Es wurde aus der Viper Agkistrodon rhodostoma isoliert und enthält den Hauptbestandteil des Giftes dieser Schlange. Folglich existieren also einige nicht-humane Proteasen mit therapeutischer Anwendbarkeit. Ihre Identifizierung ist allerdings für gewöhnlich höchst zufällig.
Die Behandlung von Erkrankungen durch Verabreichung von Medikamenten basiert für gewöhnlich auf einem molekularen Mechanismus, der durch das Medikament ausgelöst wird, das eine spezifische Proteinfunktion im Körper des Patienten aktiviert oder deaktiviert, sei es ein endogenes Protein oder ein Protein einer infizierenden Mikrobe oder eines Virus. Während die Wirkung von chemischen Medikamenten auf diese Ziele immer noch schwer nachzuvollziehen oder vorherzusagen ist, können Proteinmedikamente diese Zielproteine spezifisch unter Millionen von anderen Proteinen erkennen. Bedeutende Beispiele von Proteinen, die über die intrinsische Fähigkeit zur Erkennung anderer Proteine verfügen, sind Antikörper, Rezeptoren und Proteasen. Obwohl es eine riesige Anzahl von möglichen Zielproteinen gibt, sind heute nur sehr wenige Proteasen erhältlich, die diese Zielproteine ansteuern. Augrund ihrer proteolytischen Aktivität, sind Proteasen besonders für die Deaktivierung oder die Aktivierung von Proteinzielen geeignet. Betrachtet man nur die humanen Proteine, so ist die Zahl der Zielproteine schon enorm groß. Es wird geschätzt, dass das humane Genom zwischen 30.000 und 100.000 Gene umfasst, von denen jedes ein anderes Protein kodiert. Viele dieser Proteine sind an Humanerkrankungen beteiligt und somit mögliche pharmazeutische Ziele. Proteasen, die diese Zielproteine mit einer hohen Spezifität erkennen und spalten sind folglich als mögliche Medikamente von hohem Wert. Die medizinische Anwendung von solchen Proteasen wird allerdings durch ihr Vorkommen beschränkt. Zum Beispiel gibt es theoretisch 25 Milliarden unterschiedliche Möglichkeiten für eine Spezifität von s = 10,4 (entsprechend der spezifischen Erkennung einer einzigartigen Sequenz aus acht Aminosäureresten). Es ist äußerst unwahrscheinlich, eine solche Protease mit einer bestimmten qualitativen Spezifität durch das Screening von natürlichen Isolaten zu finden.
Auswahlsysteme für Proteasen von bekannter Spezifität sind in der Fachwelt beispielsweise durch Smith u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88 (1991) bekannt. Wie beispielhaft erläutert beinhaltet das System den Hefetranskriptionsfaktor GAL4 als selektierbaren Marker, eine festgelegte und spaltbare Zielsequenz, die in GAL4 eingefügt ist in Verbindung mit der TEV Protease. Die Spaltung trennt die DNA-Bindungsdomäne von der Transkriptionsaktivierungsdomäne und inaktiviert so den Transkriptionsfaktor. Die phänotypische Unfähigkeit der entstehenden Zellen Galaktose zu metabolisieren kann mittels eines colorimetrischen Assays oder durch die Selektion auf dem Suizidsubstrat 2-Desoxygalaktose nachgewiesen werden. Des weiteren kann eine Selektion unter Verwendung von Peptidsubstraten mit Modifikationen wie z.B. fluorogenischen Resten basierend auf Gruppen wie ACC, schon beschrieben von Harris u.a. ( US 2002/022243 ), durchgeführt werden.
Labortechniken zur Erzeugung von proteolytischen Enzymen mit veränderten Sequenzspezifitäten sind grundsätzlich bekannt. Sie können anhand ihrer Expressions- und Selektionssysteme klassifiziert werden. Genetische Selektion bedeutet eine Protease in einem Organismus zu produzieren, die die Fähigkeit besitzt ein Vorläuferprotein zu spalten, was wiederum eine Änderung des Wachstumsverhaltens des produzierenden Organismus zur Folge hat. Aus den Populationen von Organismen mit unterschiedlichen Proteasen können diejenigen ausgewählt werden, die ein verändertes Wachstumsverhalten aufweisen. Dieses Prinzip wurde von Davis u.a. ( US 5258289 , WO 96/21009 ) beschrieben. Die Erzeugung eines Phagensystems ist von der Spaltung eines Phagenproteins abhängig, das nur bei Anwesenheit eines proteolytischen Enzyms oder Antikörpers aktiviert werden kann, der das Phagenprotein spalten kann. Ausgewählte proteolytische Enzyme oder Antikörper könnten eine Aminosäuresequenz zur Aktivierung der Phagenproduktion spalten. Darüber hinaus gibt es keine Kontrolle der Spezifität der ausgewählten Proteasen. Das System selektiert nicht nach Proteasen mit geringen Aktivitäten für andere Peptide als die verwendeten Peptidsubstrate. Außerdem lässt dieses System keine genaue Charakterisierung der kinetischen Konstanten der ausgewählten Proteasen (k_cat, K_M) zu. Es wird von verschiedenen anderen Systemen mit interzellulärer Proteaseexpression berichtet, doch alle weisen die oben erwähnten Nachteile auf. Einige von ihnen verwenden ein genetisches Reportersystem, das eine Auswahl mittels Screening anstelle einer genetischen Selektion ermöglicht, jedoch auch nicht über die intrinsische Unzulänglichkeit der intrazellulären Charakterisierung von Proteinen hinweg helfen kann.
Ein System zur Erzeugung proteolytischer Enzyme mit veränderten Sequenzspezifitäten mit membrangebundenen Proteasen wurde beschrieben. Iverson u.a. ( WO 98/49286 ) beschreiben ein Expressionssystem für eine membrangebundene Protease, die auf der Zelloberfläche dargestellt wird. Ein wesentlicher Bestandteil des experimentellen Aufbaus ist, dass die katalytische Reaktion an der Zelloberfläche durchgeführt werden muss, d.h. die Substrate und Produkte müssen mit dem Bakterium, das die Enzyme an der Oberfläche exprimiert, verbunden bleiben. Diese Einschränkung begrenzt die Erzeugung von proteolytischen Enzymen mit veränderter Sequenzspezifität und lässt keine genaue Charakterisierung der kinetischen Konstanten der ausgewählten Proteasen (k_cat, K_M) zu. Auch ermöglicht dieses Verfahren keine Kontrolle über die Position an der das Peptid gespalten wird. Positiv identifizierte Proteasen werden außerdem eine bestimmte Aminosäuresequenz (aa) spalten können, aber sie könnten auch viele andere aa-Sequenzen spalten. Daher gibt es keine Kontrolle der Spezifität der ausgewählten Proteasen.
Ein System zur Erzeugung proteolytischer Enzyme mit veränderten Sequenzspezifitäten mit sich selbst-sekretierenden Proteasen ist ebenfalls bekannt. Duff u.a. ( WO 98/11237 ) beschreiben ein Expressionssystem für eine sich selbst-sekretierende Protease. Ein wesentlicher Bestandteil der experimentellen Anordnung ist, dass die katalytische Reaktion auf die Protease selbst durch eine autoproteolytische Prozessierung des membrangebundenen Vorläufermoleküls einwirkt, um die gereifte Protease aus der zellulären Membran in die extrazelluläre Umgebung zu entlassen. Daher muss an der Stelle, an der die Zielpeptidsequenz die natürliche Spaltstelle für die Autoproteolyse ersetzt, ein Fusionsprotein konstruiert werden. Einschränkungen eines solchen Systems sind, dass die positiv identifizierten Proteasen bestimmte aa-Sequenzen spalten werden können, aber ebenfalls auch viele andere Peptidsequenzen spalten könnten. Daher kann hohe Substratspezifität durch einen solchen Ansatz nicht erreicht werden. Darüber hinaus kann ein solches System nicht kontrollieren, dass ausgewählte Proteasen an einer spezifischen Position in einer bestimmten aa-Sequenz spalten, und lässt auch keine genaue Charakterisierung der kinetischen Konstanten der ausgewählten Proteasen zu (k_cat, K_M).
Broad u.a. ( WO 99/11801 ) veröffentlichen ein für die Veränderung der Spezifität von Proteasen geeignetes heterologes Zellsystem. Das System enthält einen Vorläufer des Transkriptionsfaktors, worin der Transkriptionsfaktor über eine Proteaseschnittstelle mit einer Membranverankerungsdomäne verbunden ist. Die Spaltung an der Proteaseschnittstelle durch eine Protease gibt den Transkriptionsfaktor frei, der wiederum unter der Kontrolle des entsprechenden Promotors die Expression eines Zielgens auslöst. Die experimentelle Anordnung zur Änderung der Spezifität besteht in der Insertion von Proteaseschnittstellen mit veränderten Sequenzen und darin, dass die Protease einer Mutagenese unterworfen wird. Neu erhaltene Proteasen könnten die veränderte Sequenz erkennen, wobei das Ergebnis mittels der Expression des Zielgens überwacht wird. Ein solches System lässt ebenfalls keine genaue Kontrolle der biochemischer Eigenschaften der ausgewählten Proteasen zu.
Die meisten dieser Ansätze wenden Verfahren der gerichteten Evolution zur Erzeugung proteolytischer Enzyme mit veränderten Sequenzspezifitäten an. Etliche verschiedene Mutations- und Rekombinationsverfahren zur Erzeugung von Genbibliotheken werden an anderer Stelle dargestellt und beschrieben. All diese unterschiedlichen Verfahren leiden an ihrem Mangel einer genauen Selektion positiver Proteasevarianten aus großen Bibliotheken. Zum ersten sind die Verfahren nicht in der Lage zwischen Einzel- und Mehrfach-Turnover von Peptidsubstraten zu unterscheiden, was jedoch notwendig ist um die Selektion von Varianten mit niederen K_cat zu verhindern. Zum zweiten ist es nicht möglich Enzym- und Substratkonzentrationen zu steuern um Proteasevarianten nach niedrigem KM zu selektieren. Zum dritten ermöglicht keines dieser Systeme die Selektion einer Protease mit einer erhöhten Aktivität auf dem erwünschten Peptidsubstrat und sinkender Aktivität auf dem ursprünglichen Peptidsubstrat.
Verfahren, die die oben erwähnten drei Selektionskriterien (k_cat, K_M und Substratspezifität) zur Erzeugung proteolytischer Enzyme mit hoher Sequenzspezifität unter Anwendung von screening-basierender gerichteter Evolution erfüllen, waren bis dato noch nicht verfügbar.
Zusammenfassung der Erfindung
Daher ist es das technische Problem, das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, ein Verfahren zur Erzeugung neuer Proteasen mit Nutzer-definierten Substratspezifitäten durch Anwendung gerichteter Evolution bereitzustellen. Insbesondere zielt diese Erfindung auf ein Verfahren zur Evolution von neuem Proteasen hin zur selektiven Erkennung und Spaltung ausschließlich spezifischer Aminosäuresequenzen ab. Dieses technische Problem wurde durch die unten und in den angefügten Ansprüchen beschriebene Ausführungsform der Erfindung gelöst. Die vorliegender Erfindung zielt daher ab auf

(1) ein Verfahren zur Identifizierung sequenzspezifischer Proteasen mit Zielsubstrat-Spezifitäten, welches die folgenden Schritte umfasst (a) Bereitstellung einer Population von Proteasen, welche Varianten einer ersten Protease oder Varianten oder Chimären von zwei oder mehreren ersten Proteasen beinhaltet, wobei diese ersten Proteasen eine Substratspezifität für eine bestimmte Aminosäuresequenz eines ersten Peptidsubstrats aufweisen; (b) Kontaktierung besagter Population von Proteasen mit einem oder mehren zweiten Substraten, wobei mindestens eine spezifische Aminosäuresequenz ähnlich der Aminosäuresequenz des Zielpeptidsubstrats enthalten sein muss, die jedoch nicht im ersten Peptidsubstrat vorhanden ist; und (c) Selektieren von einer oder mehreren Proteasevarianten aus der in Schritt (a) bereitgestellten Population von Proteasen, mit einer Spezifität für besagte spezifische Aminosäuresequenz der in Schritt (b) bereitgestellten zweiten Substrate unter Bedingungen, welche die Identifizierung von Proteasen, welche bevorzugt die eine besagte spezifische Aminosäuresequenz innerhalb der zweiten Substrate erkennen und hydrolysieren, ermöglichen, wobei das Screening nach Proteaseaktivität durch Zugabe eines Überschusses von anderen Peptiden als dem zweiten Peptid erreicht wird, wobei die zugegebenen Peptide als Kompetitoren dienen.
(2) in einer bevorzugten Ausführungsform des oben genannten Anspruchs (1) wird nur ein zweites Substrat in den einen oder mehr Zyklen (a) bis (c) verwendet, d.h. das zweite Substrat ist identisch mit dem Zielsubstrat;
(3) in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des oben genannten Anspruchs (1) werden unterschiedliche zweite Substrate verwendet, die einen intermediären Charakter in Bezug auf das erste Substrat und das Zielsubstrat haben, wobei das zuletzt verwendete zweite Substrat mit dem Zielsubstrat identisch ist; und
(4) in einer besonders bevorzugten Ausführungsform der oben genannten Ansprüche (1) bis (3) weist die Zielprotease eine Spezifität ähnlich dem Tissue-type-Plasminogen-Aktivator auf und spaltet das Zielsubstrat CPGR↓VVGG.

Die Identifizierung und Selektion von Proteasen, die sich zur Zielspezifität hin entwickelt haben, wird durch Screenen nach katalytischen Aktivitäten in unterschiedlichen Peptidsubstraten durchgeführt, entweder durch Screenen nach erhöhter Affinität, oder durch Verwendung zweier Substrate im Vergleich, oder durch Verwendung unspezifischer Peptide als Kompetitoren, oder durch Verwendung intermediärer Peptidsubstrate. Die folgende detaillierte Beschreibung wird die bevorzugten Merkmale, Vorteile und den Nutzen der vorliegenden Erfindung offen legen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die folgenden Zeichnungen werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung in Ergänzung zur detaillierten Beschreibung näher zu erläutern:
Zeichnung 1 stellt die beiden Alternativen A und B des erfindungsgemäßen Verfahrens schematisch dar.
Zeichnung 2 unterscheidet die beiden Alternativen A und B des erfindungsgemäßen Verfahrens durch schematische Darstellung der qualitativen und quantitativen Änderungen in der Spezifität während der Entwicklung hin zur Zielspezifität.
Zeichnung 3 erläutert schematisch wie Proteasen mit veränderten katalytischen Aktivitäten mittels der beiden Alternativen A und B des erfindungsgemäßen Verfahrens entwickelt werden.
Zeichnung 4 stellt in zwei unterschiedlichen Formen den intermediären Ansatz als einen bestimmten Aspekt der Erfindung, die intermediäre Substrate verwendet, schematisch dar.
Zeichnung 5 erläutert schematisch, wie Proteasen mit veränderten katalytischen Aktivitäten erfindungsgemäß mittels des intermediären Ansatzes entwickelt werden.
Zeichnung 6 zeigt exemplarisch einen Expressionsvektor für S. cerevisiae, der für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kann.
Zeichnung 7 zeigt exemplarisch die Hydrolyse eines Peptidsubstrats durch die Tobacco Etch Virus Protease.
Zeichnung 8 zeigt exemplarisch eine Verteilung von katalytischen Aktivitäten, die durch Screenen mittels konfokaler Fluoreszenzspektroskopie erzielt wird.
Zeichnung 9 zeigt exemplarisch den Rückgang von KM während der Entwicklung hin zu höherer Affinität.
Zeichnung 10 zeigt exemplarisch die Änderung der Spezifität während der Entwicklung von Proteasen hin zur Spezifität von t-PA.
Zeichnung 11 stellt eine bevorzugte Variante des intermediären Ansatzes schematisch dar.
Zeichnung 12 zeigt exemplarisch die zeitabhängige Substratumwandlung einer Ausgangsprotease im Vergleich zu einer der entwickelten Varianten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Im Rahmen dieser Erfindung werden die folgenden Bezeichnungen und Definitionen verwendet.
Der Begriff „Protease" steht für jedes in der Hydrolyse von Peptidbindungen tätige Proteinmolekül. Er umfasst sowohl natürlich vorkommende proteolytische Enzyme, als auch Varianten hiervon, die durch ortsgerichtete der Zufallsmutagenese oder durch jedes andere proteintechnische Verfahren erzielt wurden, jedes Fragment eines proteolytischen Enzyms, oder jeden molekularen Komplex oder jedes Fusionsprotein, die eines der zuvor genannten Proteine beinhalten. Eine „Chimäre von Proteasen" ist ein Fusionsprotein aus zwei oder mehr Fragmenten, die aus unterschiedlichen Ursprungsproteasen stammen.
Die Bezeichnung „Substrat" oder „Peptidsubstrat" steht für jedes Peptid, Oligopeptid oder Proteinmolekül einer jeden Aminosäurezusammensetzung, -sequenz oder -länge, das eine Peptidbindung beinhaltet, die von einer Protease katalytisch hydrolysiert werden kann. Die hydrolysierte Peptidbindung nennt man „Schnittstelle". Die Nummerierung der Positionen innerhalb des Substrats wird gemäß des von Schlechter & Berger eingeführten Systems durchgeführt (Biochem. Biophys. Res. Commun. 27 (1967) 157-162). Aminosäurereste, die N-Terminal an die Schnittstelle angrenzen werden mit P1, P2, P3 usw. nummeriert, während Reste, die C-Terminal an die Schnittstelle angrenzen mit P1', P2', P3' usw. nummeriert werden.
Der Begriff „Spezifität" bezeichnet das Vermögen einer Protease bestimmte Peptidsubstrate selektiv zu erkennen und zu hydrolysieren, während andere ungespalten bleiben. Spezifität kann sowohl qualitativ als auch quantitativ ausgedrückt werden. „Qualitative Spezifität" bezieht sich auf die Art von Aminosäureresten, die von einer Protease an bestimmten Positionen des Peptidsubstrats akzeptiert werden. „Quantitative Spezifität" bezieht sich auf die Anzahl der Peptidsubstrate, die als Substrate akzeptiert werden. Die Quantitative Spezifität kann durch die Bezeichnung s ausgedrückt werden, welche den negativen Logarithmus der Anzahl aller akzeptierten Peptidsubstrate geteilt durch die Anzahl aller möglichen Peptidsubstrate darstellt. Proteasen, die nur einen geringen Anteil aller möglichen Peptidsubstrate akzeptieren, haben eine „hohe Spezifität" (s>>1). Proteasen, die nahezu jedes Peptidsubstrat akzeptieren, haben eine „geringe Spezifität". Proteasen mit sehr geringer Spezifität (s ≤ 1) werden auch als „unspezifische Proteasen" bezeichnet.
Die Bezeichnung „erste Protease" steht für jede Protease, die in Schritt (a) dieser Erfindung als Ausgangspunkt verwendet wird, um Populationen von Proteasevarianten zu erzeugen, die dieser ersten Protease ähnlich sind. Der Begriff „erstes Substrat" oder „erstes Peptidsubstrat" bezeichnet ein Substrat, das von der ersten Protease erkannt und hydrolysiert wird. Der Begriff „erste Spezifität" bezeichnet die qualitative und quantitative Spezifität der ersten Protease.
Der Begriff „entwickelte Protease" bezeichnet jede Protease, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erzeugt wurde. Die Bezeichnung „Zielsubstrat" oder „Zielpeptidsubstrat" steht für ein Substrat, das von der entwickelten Protease erkannt und hydrolysiert wird. Die Bezeichnung „Zielspezifität" beschreibt die qualitative und quantitative Spezifität der entwickelten Protease, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erzeugt werden soll. Folglich definiert die Zielspezifität die Spezifität der entwickelten Protease für das Zielpeptidsubstrat, während andere Substrate kaum oder gar nicht erkannt und hydrolysiert werden.
Der Begriff „intermediär" oder „intermediäres Substrat" beschreibt jedes Substrat das einen intermediären Charakter zwischen zwei anderen Substraten aufweist. Der intermediäre Charakter kann auf der Aminosäurezusammensetzung, der Aminosäuresequenz, den Eigenschaften der in den Substraten enthaltenen Aminosäureresten, oder einer Kombination dieser Eigenschaften basieren.
Katalytische Eigenschaften von Proteasen werden mittels der kinetischen Parameter „KM" oder „Michaelis Menten Konstante", „k_cat" oder „katalytische Geschwindigkeitskonstante" und „kca_t/K_M" oder „katalytische Effizienz", gemäß der Definitionen von Michaelis und Menten (Fersht, A.; Enzyme Structure and Mechanism, W. H. Freeman and Company, New York, 1995) ausgedrückt. Der Begriff „katalytische Aktivität" bezeichnet die Geschwindigkeit der Umwandlung der Substrate unter definierten Bedingungen.

Aminosäuren werden gemäß der folgenden Tabelle II entweder in einem Ein- oder Drei-Buchstabencode abgekürzt. Tabelle II: Aminosäureabkürzungen

Abkürzungen		Aminosäure
A	Ala	Alanin
C	Cys	Cystein
D	Asp	Asparaginsäure
E	Glu	Glutaminsäure
F	Phe	Phenylalanin
G	Gly	Glycin
H	His	Histidin
I	Ile	Isoleucin
K	Lys	Lysin
L	Leu	Leucin
M	Met	Methionin
N	Asn	Asparagin
P	Pro	Prolin
Q	Gin	Glutamin
R	Arg	Arginin
S	Ser	Serin
T	Thr	Threonin
V	Val	Valin
W	Trp	Tryptophan
Y	Tyr	Tyrosin

Wie oben dargelegt, ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Erzeugung sequenzspezifischer Proteasen mit einer Zielsubstratspezifität durch die Anwendung von Prinzipien der molekularen Evolution, gerichtet. Erfindungsgemäß wird dies durch Bereitstellung einer Population von miteinander verwandten Proteasen, sowie eines Peptidsubstrats, das dem Zielsubstrat gleicht, und durch Selektieren einer oder mehrerer Proteasevarianten aus der Proteasepopulation unter Berücksichtigung ihrer Spezifität für das bereitgestellte Substrat erreicht. Die Selektion wird unter Bedingungen durchgeführt, die eine Identifikation von Proteasen zulassen, die bevorzugt die Zielsequenz erkennen und hydrolysieren.
Insbesondere Ausführungsform (1) der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung sequenzspezifischer Proteasen mit Zielsubstratspezifitäten, wobei die folgenden Schritte durchgeführt werden:

(a) Bereitstellung einer Population von Proteasen, wobei jede Variante mit einer oder mehr ersten Proteasen verwandt ist, wobei diese ersten Proteasen eine erste Substratspezifität aufweisen;
(b) Bereitstellung eines oder mehrerer Peptidsubstrate umfassend mindestens eine Aminosäuresequenz die dem Zielpeptidsubstrat ähnlich ist;
(c) Selektieren einer oder mehrerer Proteasevarianten aus der in Schritt (a) bereitgestellten Population von Proteasen unter Berücksichtigung ihrer Spezifität für das in Schritt (b) bereitgestellte Substrat unter Bedingungen, die eine Identifizierung von Proteasen zulassen, die bevorzugt die Zielsequenz erkennen und spalten;

Bei der Widerholung der Schritte (a) bis (c) werden die eine oder mehr in Schritt (c) eines Zyklus selektierten Proteasen als die eine oder mehr ersten Proteasen in Schritt (a) des nächsten Zyklus verwendet.
In einer Variante des Verfahrens weisen die eine oder mehr Proteasen, die als Startpunkte in Schritt (a) des Verfahrens dienen, eine hohe Sequenzspezifität auf, die auch aufrechterhalten wird während der gezielten Evolution zur Zielspezifität.
In einer anderen Variante der Erfindung weisen die eine oder mehr Proteasen, die als Startpunkte in Schritt (a) des Verfahrens dienen, eine geringe Sequenzspezifität auf, die während der gerichteten Evolution hin zur Zielspezifität erhöht wird.
Die Schritte (a) bis (c) des obigen Verfahrens werden für mindestens einen Zyklus durchgeführt. Vorzugsweise jedoch werden diese Schritte für mehrere Zyklen durchgeführt wobei jeweils eine oder mehrere Proteasevarianten die in einem Zyklus selektiert wurden, den Ursprung der Population von Proteasevarianten im nächsten Zyklus bilden. Vorzugsweise werden mehr als ein und weniger als hundert, mehr bevorzugt mehr als zwei und weniger als fünfzig, noch mehr bevorzugt mehr als drei und weniger als zwanzig, besonders bevorzugt mehr als vier und weniger als zehn und am meisten bevorzugt fünf Zyklen der Schritte (a) bis (c) durchgeführt, bis eine oder mehr Proteasevarianten mit der Zielsubstratspezifität identifiziert wurden.
Die Erfindung wendet evolutionäre Mittel an, wie sie sehr detailliert in WO9218645 beschrieben sind, womit dieses Dokument in seiner Gesamtheit in jeder Hinsicht mit einbezogen wird.
Einen Überblick über die Anwendung der evolutionären Prinzipien zur molekularen Biotechnologie, die für gewöhnlich als „zielgerichtete Evolution" oder „evolutionäre Biotechnologie" bezeichnet werden, finden Sie im Review von Koltermann & Kettling (Biophys. Chem. 66 (1997) 159-177).
Teil der Erfindung ist die Bereitstellung von Populationen von Proteasevarianten, wobei jede Variante mit einer oder mehr ersten Proteasen verwandt ist. Grundsätzlich kann es eine große Anzahl dieser ersten Proteasen geben, die gemeinsam den Ausgangspunkt für den ersten Zyklus des Verfahrens darstellen. Es wird jedoch bevorzugt, dass diese ersten Proteasen fünfzig oder weniger unterschiedliche Proteasen beinhalten, mehr bevorzugt zehn oder weniger unterschiedliche Proteasen und besonders bevorzugt zwei oder weniger unterschiedliche Proteasen. Am meisten bevorzugt wird nur eine erste Protease verwendet.
Erfindungsgemäß kannjede Protease als erste Protease verwendet werden. Vorzugsweise wird eine Endoprotease als erste Protease verwendet. Es wird bevorzugt, dass die Protease zur Gruppe der Proteasen bestehend aus Serin-Proteasen (EC 3.4.21), Cystein-Proteasen (EC 3.4.22), Aspartat-Proteasen (EC 3.4.23), und Metallo-Proteasen (EC 3.4.24) gehört. Erste Proteasen zeichnen sich durch ihr Vermögen Peptidsubstrate mit einer bestimmten qualitativen und quantitativen Spezifität zu erkennen und zu hydrolysieren aus. Erste Proteasen können eine Spezifität in der selben Größenordnung aufweisen wie die Spezifität der zu erzeugenden Protease. Beispiele für Proteasen mit relativ hoher Spezifität sind TEV-Protease, HIV-1-Protease, BAR1-Protease, Faktor Xa, Thrombin, Tissue-type-Plasminogen-Aktivator, Kex2-Protease, TVMV-Protease, RSV-Protease, MuLV-Protease, MPMV-Protease, MMTV-Protease, BLV-Protease, EIAV-Protease, SIVmac-Protease. Alternativ weisen die ersten Proteasen eine geringere Spezifität als die Spezifität der zu erzeugenden Protease auf. Als ein extremes Beispiel der Letzteren werden Proteasen mit sehr geringer Sequenzspezifität verwendet, zum Beispiel Proteasen wie Papain, Trypsin, Chymotrypsin, Subtilisin, SET (Trypsin-like Serin-Protease aus Streptomyces erythraeus), Elastase, Cathepsin G oder Chymase.
Eine besonders geeignete Protease ist sp |P12630| BAR1 Protease (BAR1_YEAST Barrierpepsin precursor (EC 3.4.23.35) (extrazelluläres „Barriere" Protein) (BAR Proteinase) aus S. cerevisiae (siehe SEQ ID NR:8).
Die Bereitstellung von Populationen von Proteasen wird im Wesentlichen wie in WO9218645 beschrieben durchgeführt. Gemäß der Erfindung werden Proteasevarianten kodierende Gene durch standardmäßige molekulare Klonierungsmethoden in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert (Sambrook, J.F.; Fritsch, E.F.; Maniatis, T.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 1989, New York). Der Vektor wird in eine geeignete Expressionswirtszelle eingeführt, welche die entsprechende Proteasevariante exprimiert. Besonders geeignete Expressionswirte sind bakterielle Expressionswirte, wie Escherichia coli oder Bacillus subtilis, oder Hefe-Expressionswirte, wie Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris, oder Saugetier-Expressionswirte, wie das Chinese Hamster Ovary (CHO) oder Baby Hamster Kidney (BHK) Zell-Linien, oder virale Expressionssysteme, wie das Baculovirus-System. Alternativ können auch Systeme zur in vitro Proteinexpression verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Gene in den Expressionsvektor hinter eine geeignete Signalsequenz eingebunden, was zur Sekretion der Proteasevarianten in den extrazellulären Raum führt, wodurch eine direkte Detektion der Proteaseaktivität im Zellüberstand ermöglicht wird. Besonders geeignete Signalsequenzen für Escherichia coli sind HlyA, für Bacillus subtilis AprE, NprB, Mpr, AmyA, AmyE, Blac, SacB, und für S. cerevisiae Bar1, Suc2, Matα, InulA, Ggplp.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Proteasevarianten intrazellulär exprimiert, und die Peptidsubstrate werden ebenfalls intrazellulär exprimiert. Vorzugsweise wird dies im Wesentlichen wie in WO 0212543 beschrieben, mittels eines Fusionspeptidsubstrates durchgeführt, welches zwei autofluoreszierende Proteine beinhaltet, die durch die Substrataminosäuresequenz verbunden sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Proteasevarianten intrazellulär exprimiert, oder unter Verwendung einer Signalsequenz wie DsbA, PhoA, PelB, OmpA, OmpT oder gIII für Escherichia coli in den periplasmatischen Raum abgesondert, gefolgt von einer Permeabilisierung oder einem Lyseschritt , um die Proteasevarianten in den Überstand freizusetzen. Die Zerstörung der Membranbarriere kann durch mechanische Hilfsmittel wie Ultraschall, French Press oder die Verwendung von membranverdauenden Enzymen wie Lysozym bewirkt werden.
Eine weitere Möglichkeit ist es, die Proteasevarianten kodierenden Gene zellfrei durch die Verwendung eines geeigneten zellfreien Expressionssystems zu exprimieren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der S30-Extrakt aus Escherichia coli Zellen, wie von Lesly et al. (Methods in Molecular Biology 37 (1995) 265-278) beschrieben, für diesen Zweck verwendet.
Die Verwandtschaft zu der einen oder mehr ersten Proteasen kann durch mehrere Verfahren erreicht werden. Zum Beispiel werden die eine oder mehr ersten Proteasen kodierenden Gene durch Verfahren zur Zufallsmutagenese von Nukleinsäure modifiziert. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Zufallsmutagenese durch die Verwendung einer Polymerase, wie in WO 9218645 beschrieben, erreicht. Gemäß dieser Ausführungsform werden das eine oder die mehreren Gene, welche eine oder mehr Proteasen kodieren, mittels einer Polymerase mit hoher Fehlerrate amplifiziert, oder unter Bedingungen, welche die Rate von Fehlinkorporationen steigern, was zu einer Population von Genen führt, in der jedes Gen eine Protease kodiert, die mit der einen oder mehr ersten Proteasen verwandt ist. Es kann zum Beispiel die Methode nach Cadwell, R.C und Joyce, G.F. verwendet werden (PCR Methods Appl. 2 (1992) 28-33). Andere Verfahren zur Zufallsmutagenese, die angewendet werden können, nutzen Mutatorstämme, UV-Strahlung oder chemische Mutagene. Am bevorzugtesten werden Fehler in das Gen an oder in der Nähe, jedoch unterhalb der Fehlerschwelle eingeführt, wie in WO 9218645 beschrieben.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden bestimmte Teile des Proteasevarianten kodierenden Gens hinsichtlich der Aminosäuresequenz vollständig randomisiert und anschließend als Oligonukleotid-Kassette wieder in das Gen eingesetzt. Dieses Verfahren wird für gewöhnlich als Kassettenmutagenese bezeichnet (Oliphant, A.R. et al., Gene 44 (1986) 177-183; Horwitz, M.S., et al. Genome 31 (1989) 112-117). In einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird der Teil des Gens, der Aminosäurereste kodiert, die notwendig zur Erkennung des Substrats sind, mittels Kassettenmutagenese randomisiert. Diese Reste können mittels struktureller Untersuchungen erkannt werden. Insbesondere zielt die Kassettenmutagenese auf Reste ab, die Teile der substratbindenden Tasche beinhalten. Alternativ können solche Reste auch identifiziert werden, indem jeder Aminosäurerest gegen ein Alanin ausgetauscht und dann analysiert wird, ob sich dies auf die katalytische Aktivität auswirkt. In einer weiteren Alternative können diese Reste identifiziert werden, indem zunächst Zufallsmutationen in das Gen eingeführt werden, durch Screening auf eine Auswirkung auf Spezifität, Affinität oder katalytische Aktivität und anschließende Bestimmung der Position der Mutationen in den Varianten, die veränderte Spezifität, Affinität oder katalytische Aktivität zeigen. Als ein Extrem dieses Ansatzes, kann die komplette randomisierte Sequenz eine Länge von nur einem Nukleotid haben. Dieser Ansatz wird für gewöhnlich als Orts-Sättigungs-Mutagenese bezeichnet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Nukleinsäuresequenzen zufällig in die einen oder mehr ersten Proteasegene eingesetzt oder deletiert, um eine Population von Proteasen bereitzustellen. Dieses Verfahren wird als Insertions- und/oder Deletionsmutagenese bezeichnet. Für die Insertionsmutagenese werden Zufallssequenzen bestimmter oder zufälliger Länge zufällig in ein Gen eingesetzt. Beispielsweise kann das Verfahren, beschrieben von Hallet et al.. (Nukleic Acids Res. 1997, vol. 25, p.1866ff), verwendet werden, um eine zufällige 15 nt Sequenz zufällig in ein Gen einzufügen. Alternativ können bestimmte Sequenzen, wie zum Beispiel eine ein spezifisches Proteinsekundärstrukturmotiv kodierende Sequenz, zufällig in ein Gen eingesetzt werden. Auch können Sequenzen bestimmter oder zufälliger Länge an einer bestimmten Stelle in ein Gen eingesetzt werden. Dies kann unter Verwendung von Restriktionsstellen oder von Oligonukleotid-Überlappungs-Extensionsverfahren, wie das von Horton beschriebene Verfahren (Gene 1989, vol. 77, p. 61ff), durchgeführt werden. Für eine Deletionsmutagenese werden Sequenzen bestimmter oder zufälliger Länge zufällig aus einem Gen entfernt. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden Deletions- und Insertionsmutagenese kombiniert, so dass Insertionen an einer Stelle potentiell kombiniert werden und dadurch möglicherweise kompensiert werden können, durch Deletion an einer anderen Stelle.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zur homologen in-vitro Rekombination für die Bereitstellung von Proteaseoopulationen verwendet. Beispiele von anwendbaren Verfahren sind die Recombination Chain Reaction (RCR) gemäß WO 0134835 , das DNA-Shuffling Verfahren gemäß WO 9522625 , das Staggered Extension Verfahren gemäß WO 9842728 oder die Random Priming Recombination gemäß WO 9842728 . Des weiteren können zur nicht-homologen Rekombination Verfahren, wie das Itchy-Verfahren, angewandt werden (Ostermeier, M et al., Nature Biotechnology 17 (1999) 1205-1209). Sämtliche oben erwähnten Referenzen werden hiermit durch ihre Erwähnung in ihrer Gesamtheit in jeder Hinsicht mit einbezogen.
In weiteren Ausführungsformen werden die oben genannten Verfahren miteinander kombiniert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Recombination Chain Reaction mit einer Zufallsmutagenese wie der fehleranfälligen PCR gemäß Caadwell, R.C und Joyce, G.F. (PCR Methods Appl. 2 (1992) 28-33) kombiniert, um Mutationen, die in der vorherigen Runde ausgewählt wurden zu entkoppeln und gleichzeitig eine bestimmte Anzahl neuer Zufallsmutationen in die Population einzusetzen.
Die Kopplung von Protease-Genotypen und -Phänotypen wird durch den Einsatz von Probenträgern erzielt, die eine Kompartimentierung der Proben erlauben, und die Verteilung von Gentypen in die Probenträger wird in einer Vielzahl pro Reaktionsraum durchgeführt, was eine ausreichende Differenzierung von Phänotypen erlaubt.
Die eine oder mehr ersten Proteasen, die als Ausgangspunkt des Verfahrens dienen, weisen entweder eine Spezifität im Bereich der Zielspezifität, die durch das Verfahren erreicht werden soll, auf oder haben eine geringere Spezifität als die Zielspezifität. Dementsprechend wird das erfindungsgemäße Verfahren entweder unter Bedingungen durchgeführt, welche die Spezifität quantitativ erhalten und qualitativ verändern (Alternative A), oder das erfindungsgemäße Verfahren wird unter Bedingungen durchgeführt, welche die Spezifität qualitativ erhalten und quantitativ erhöhen (Alternative B). Darüber hinaus können beide Ansätze kombiniert werden. Diese drei grundsätzlichen Alternativen werden in 2 schematisch dargestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung gemäß Alternative A haben die eine oder mehr ersten Proteasen eine erste Spezifität, die sich quantitativ im Bereich der Zielspezifität befindet, jedoch qualitativ von der Zielspezifität abweicht. Proteasen mit Zielsubstratspezifität werden mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Auswählen von Proteasevarianten unter Bedingungen gewonnen, welche die Identifikation von Proteasen ermöglichen, die die Zielsequenz vorzugsweise erkennen und schneiden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung gemäß Alternative B, ist die Spezifität der ersten oder mehr Proteasen im Vergleich zur Zielspezifität quantitativ geringer. Dies bedeutet, dass sie eine große Anzahl von Peptidsubstraten erkennen und hydrolysieren. Diese geringe erste Spezifität wird folglich durch das erfindungsgemäße Verfahren gesteigert, bis sie den Bereich der Zielspezifität erreicht hat. In der bevorzugten Variante dieser Ausführungsform ist die erste Spezifität qualitativ ähnlich zur Zielspezifität. Folglich ist in der großen Anzahl an Peptidsubstraten, die erkannt und hydrolysiert werden, das Zielsubstrat bereits enthalten. Dementsprechend bleiben Aminosäurereste, die im ersten Substrat unentbehrlich sind auch im Zielsubstrat unentbehrliche Reste. Anschließend werden Proteasen mit Zielsubstratspezifität mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Auswählen von Proteasevarianten unter Bedingungen gewonnen, welche die Identifikation von Proteasen ermöglichen, die die Zielsequenz vorzugsweise erkennen und schneiden.
Einen anderen Teil der Erfindung stellt die Bereitstellung von Peptidsubstraten, die dem Zielsubstrat ähneln, und die Verwendung dieser Substrate zum Screening von Proteasevarianten hinsichtlich ihrer katalytischen Aktivität, dar.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden geeignete Peptidsubstrate mittels des Verfahrens der Festphasen-Peptidsynthese von Merrifield et al. (Nature. 207 (1965) 522-523) synthetisiert. Diese Peptidsubstrate werden anschließend über einen bestimmten Zeitraum in einem Probenpuffer inkubiert, der die zu testende Proteasevariante enthält. Die Peptidhydrolyse wird dann mit Hilfe eines geeigneten Verfahrens analysiert. So kann zum Beispiel die Menge der fragmentierten Peptide durch Chromatographie analysiert werden. Insbesondere Peptidfragmente werden zweckmäßigerweise auf einem Umkehrphasen-HPLC-System analysiert. Alternativ wird das Peptidsubstrat in einer Weise modifiziert, die die Analyse von Peptidhydrolysen ermöglicht. Insbesondere kann das Peptidsubstrat funktionelle Gruppen tragen, die die Erkennung der Hydrolyse des Substrats ermöglichen. Solche funktionellen Gruppen enthalten, sind jedoch nicht begrenzt auf die Folgenden:
ein oder mehr Fluorophore oder Chromophore, deren spektroskopische Eigenschaften sich bei Hydrolyse des Peptids verändern, wobei das Screening mittels Bestimmung der Änderungen der spektroskopischen Eigenschaften erfolgt; oder
zwei Fluorophore, die durch ihre Fluoreszenzeigenschaften unterscheidbar sind und die an den gegenüberliegenden Enden des zweiten Substrates eingebaut sind, wobei das Screening mittels konfokaler Fluoreszenzspektroskopie bei einer Fluorophorkonzentration unter 1 μM erfolgt; oder
zwei Fluorophore, die ein Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET)-Paar bilden und an gegenüberliegenden Enden des zweiten Substrats eingebaut sind, wobei das Screening durch Bestimmung der Abnahme im Energietransfer zwischen den beiden Fluorophoren erfolgt; oder
ein erstes und ein zweites autofluoreszierendes Protein, die das zweite Substrat flankieren, wobei das Screening mittels konfokaler Fluoreszenzspektroskopie bei Substratkonzentrationen unter 1 μM erfolgt; oder
ein Fluorophor und ein Quencher Molekül die an gegenüberliegenden Enden des zweiten Substrates eingebaut sind, wobei das Screening mittels Bestimmung der Abnahme der Quenchung des Fluorophors erfolgt; oder
ein Fluorophor oder ein Chromophor und ein Bindungsrest, die an gegenüberliegenden Enden des zweiten Substrates eingebaut sind, wobei das Screening mittels Bestimmung der Bindung des Bindungsrests an einen bestimmten Bindungspartner erfolgt;
ein radioaktives Label und ein Bindungsrest, die an gegenüberliegenden Enden des zweiten Substrates eingebaut sind, wobei das Screening mittels eines Szintillations-Proximity-Assays erfolgt; oder
jegliche Kombination derselben.
Bezüglich der oben erwähnten funktionellen Gruppen kann eine chemische Gruppe in das Peptid eingebaut werden, welche dessen Eigenschaften verändert wenn das Peptid hydrolysiert wird. Für diesen Zweck kann beispielsweise eine Para-Nitrophenyl-Gruppe verwendet werden. Als ein weiteres Beispiel werden ein oder mehr Fluorophore und/oder ein Quencher-Molekül an das Peptid eingebaut und die Menge von fragmentierten Peptiden wird durch Messung einer Abweichung in der Fluoreszenz des Fluorophors analysiert. Zum Beispiel werden zwei Fluorophore die geeignet sind ein FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer)-Paar zu bilden an gegenüberliegenden Enden des Peptids eingebaut und die Hydrolyse des Peptids wird anhand der Abnahme im Energietransfer zwischen den beiden Fluorophoren gemessen. Beispielsweise können Rhodamin Grün (Molecular Probes Inc., Oregon, USA) und Tetramethylrhodamin (Molecular Probes Inc., Oregon, USA) als Fluorophore, die geeignet sind ein FRET-Paar zu bilden, eingesetzt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden zwei Fluorophore an gegenüberliegenden Enden eines synthetischen Peptidsubstrates eingebaut, die kein substantielles FRET-Paar bilden. Für diesen Zweck können beispielsweise Rhodamin Grün (Molecular Probes Inc., Oregon, USA) und Cy-5 (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg) verwendet werden und eine kovalente Bindung des Farbstoffes kann durch eine Succinimidyl Ester Bindung an eine primäre Aminogruppe des Peptids erreicht werden. Die Hydrolyse dieser Peptide wird vorzugsweise mit Hilfe konfokaler Fluoreszenzspektroskopie analysiert, gemäß der Patentanmeldungen WO 9416313 und WO 9613744 , welche hiermit durch ihre Erwähnung in ihrer Gesamtheit in jeder Hinsicht mit einbezogen werden. Aufgrund der hohen Sensitivität der konfokalen Fluoreszenzspektroskopie werden Substrate mit Konzentrationen von weniger als einem Mikromolar, besonders bevorzugt weniger als 100 Nanomolar und am meisten bevorzugt weniger als zehn Nanomolar verwendet. Folglich wird das Screening gemäß dieser Ausführungsform im Wesentlichen unter der KM typischer Proteasen durchgeführt.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Fusionsproteine, die ein erstes autofluoreszierendes Protein, ein Peptid und ein weiteres autofluoreszierendes Protein enthalten als Peptidsubstrat verwendet. Gemäß WO 0212543 , welches hiermit durch seine Erwähnung in seiner Gesamtheit in jeder Hinsicht miteinbezogen wird, schließen Autofluoreszierende das grün fluoreszierende Protein GFP und seine Mutanten ein, sowie das dsRED und seine Mutanten. Fusionsproteine können durch Expression eines geeigneten Fusionsgens in E. coli, Lyse der Zellen und Aufreinigung des Fusionsproteins mittels Standardverfahren wie Ionenaustauschchromatographie oder Affinitätschromatographie, hergestellt werden.
Ein wesentlicher Bestandteil der Erfindung ist, dass Proteasen mit der Zielsubstratspezifität durch Selektion von Proteasevarianten unter Bedingungen erzeugt werden, die eine Identifizierung von Proteasen zulassen, welche die Zielsequenz vorzugsweise erkennen und schneiden. Diese Selektion kann gemäß der unterschiedlichen Aspekte der Erfindung wie unten umrissen erreicht werden.
In einem ersten Aspekt der Erfindung werden Proteasen, welche die Zielsequenz vorzugsweise erkennen und schneiden, durch Screening nach Proteasen mit hoher Affinität für die Zielsubstratsequenz identifiziert. Hohe Affinität entspricht einer niedrigen KM, welche durch Screening bei Zielsubstratkonzentration deutlich unter der K_M der ersten Protease selektiert wird. Dieser Aspekt wird als „Affinitätsansatz" bezeichnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wird das in Schritt (b) bereitgestellte Peptidsubstrat mit einem oder mehr Fluorophoren verbunden, welche die Erkennung der Hydrolyse des Peptidsubstrates bei einer Konzentration von unter 10 μM, vorzugsweise unter 1 μM, mehr bevorzugt unter 100 nM und am meisten bevorzugt unter 10 nM ermöglichen.
In einem zweiten Aspekt der Erfindung werden Proteasen, die lediglich die Zielsequenz erkennen und schneiden, durch die Bereitstellung von zwei oder mehr Peptidsubstraten in Schritt (b) und durch Screening nach Aktivität auf diese zwei oder mehr Peptidsubstrate im Vergleich erkannt. Dieser Aspekt wird als „Vergleichsansatz" bezeichnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspektes der Erfindung, werden die zwei oder mehr in Schritt (b) bereitgestellten Peptidsubstrate mit unterschiedlichen Markermolekülen verbunden, wodurch die Erkennung der Spaltung der zwei oder mehr Peptidsubstrate nacheinander oder parallel ermöglicht wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden in Schritt (b) zwei Peptidsubstrate bereitgestellt, von denen eines eine Aminosäuresequenz enthält, die identisch oder ähnlich dem ersten Peptidsubstrat ist wodurch es ermöglicht wird die ursprüngliche Aktivität der ersten Proteasen zu kontrollieren, während das andere Peptidsubstrat eine Aminosäuresequenz enthält, die identisch oder ähnlich der Zielsubstratsequenz ist wodurch es ermöglicht wird die Aktivität auf das Zielsubstrat zu kontrollieren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden diese zwei Peptidsubstrate mit fluoreszierenden Markermolekülen verbunden, und die fluoreszierenden Eigenschaften der beiden Peptidsubstrate sind ausreichend unterschiedlich um beide Aktivitäten unterscheiden zu können, wenn sie nacheinander oder gleichzeitig gemessen.. Für diesen Zweck können zum Beispiel ein Fusionsprotein, das ein erstes autofluoreszierendes Protein enthält, ein Peptid und ein zweites autofluoreszierendes Protein gemäß der Patentamneldung WO 0212543 verwendet werden. Alternativ werden Fluorophore, wie Rhodamin, chemisch mit den Peptidsubstraten verbunden.
In einem dritten Aspekt der Erfindung werden Proteasen, welche die Zielsequenz bevorzugt erkennen und schneiden identifiziert, indem in Schritt (b) ein oder mehr dem Zielpeptid ähnelnde Peptidsubstrate zusammen mit kompetierenden Peptidsubstraten im Überschuss bereitgestellt werden. Anschließend wird ein Screening hinsichtlich der Aktivität auf Substrate, die dem Zielsubstrat ähnlich sind im Beisein von kompetierenden Substraten durchgeführt. Proteasen mit einer Spezifität, die qualitativ der Zielspezifität ähnelt, die jedoch lediglich eine geringe quantitative Spezifität aufweisen, werden in solch einem Screen als Negativproben identifiziert. Während Proteasen mit einer Spezifität, welche der Zielspezifität qualitativ und quantitativ ähnlich ist, positiv identifiziert werden. Dieser Aspekt wird als „Kompetitoransatz" bezeichnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspektes der Erfindung werden die eine oder mehr dem Zielsubstrat ähnelnden Peptidsubstrate mit Markermolekülen verbunden, wodurch die Erkennung ihrer Hydrolyse ermöglich wird, während die kompetierenden Peptidsubstrate keine Markermoleküle tragen. Die kompetierenden Peptidsubstrate besitzen eine Aminosäuresequenz, die identisch oder ähnlich zum ersten Peptidsubstrat ist, oder sie weisen zufällige Aminosäuresequemzen auf, wobei sie als kompetitive Hemmstoffe für die Hydrolyse der Marker-tragenden Peptidsubstrate agieren.
In einem vierten erfindungsgemäßen Aspekt werden Proteasen, welche die Zielsequenz vorzugsweise erkennen und schneiden, mittels des Einsatzes von intermediären Substraten identifiziert, um die Protease in Richtung Zielsubstratspezifität zu entwickeln. Dieser Aspekt wird im folgenden auch als „intermediärer Ansatz" bezeichnet. In einer ersten Variante dieses Aspektes der Erfindung wird dies durch Bereitstellung unterschiedlicher Peptidsubstrate in unterschiedlichen Zyklen erzielt, wobei jedes Peptidsubstrat in Bezug auf den vorherigen Zyklus und das Zielpeptidsubstrate einen intermediären Charakter aufweist. Gemäß dieser Variante werden Proteasen schrittweise in Richtung der Zielspezifität entwickelt. 4 zeigt das grundlegende Prinzip dieser Variante des intermediären Ansatzes schematisch.
Allgemeiner betrachtet zielt eine erste Variante dieses Aspektes der Erfindung auf ein Verfahren zur Erzeugung sequenzspezifischer Proteasen mit einer Zielsubstratspezifität ab, wobei die folgenden Schritte durchgeführt werden:

(a) Bereitstellung einer Population von Proteasen, wobei jede Variante einer oder mehr ersten Proteasen ähnelt, und diese ersten Proteasen eine Spezifität für ein Spektrum von Peptidsubstraten oder für ein einzelnes Peptidsubstrat aufweisen;
(b) Bereitstellung von einem oder mehr Peptidsubstraten mit intermediärem Charakter im Bezug auf das erste Peptidsubstrat und das Zielsubstrat;
(c) Auswahl von einer oder mehr Proteasevarianten aus der Population von Proteasen, die in Schritt (a) bereitgestellt wurden, unter Berücksichtigung ihrer Spezifität für das in Schritt (b) bereitgestellte Substrat;
(d) Wiederholung der Schritte (a) bis (c) bis eine oder mehr Proteasevarianten mit Aktivität für das in Schritt (b) bereitgestellte intermediäre Substrat identifiziert sind;
(e) Ersetzen des ersten Peptidsubstrats in Schritt (a) und (b) durch das intermediäre Substrat und der ersten Protease in Schritt (a) durch die in Schritt (c) ausgewählten Proteasevarianten;

In dieser ersten Variante dieses Aspekts der Erfindung wird die Evolution der Proteasespezifität mittels aufeinanderfolgender Selektion auf einer bestimmten Anzahl intermediärer Peptidsubstrate gesteuert, wobei jedes Peptidsubstrat immer mehr der Zielpeptidsequenz ähnelt. Dieser Ansatz basiert auf der Erkenntnis, dass Proteasen, die ähnliche Substrate akzeptieren für gewöhnlich auch einander ähneln. Ähnlichkeit bei Proteasen ist im Zusammenhang dieser Erfindung ein Maß für die Homologie in der Aminosäuresequenz von zwei oder mehr Enzymen. Darüber hinaus basiert dieser Ansatz auf der überraschenden Entdeckung, dass unterscheidbare Untereinheiten in der aktiven Stelle einer Protease separat entwickelt werden können und dass ihre molekulare Struktur unterschiedlichen Resten eines Peptidsubstrates zugeschrieben werden kann (Schlechter & Berger, Biochem. Biophys. Res. Commun. 27 (1967) 157-162).

Intermediäre Substrate können durch Ersetzen von Aminosäureresten an einer oder mehr Positionen der ersten Peptidsequenz durch Aminosäurereste an den gleichen Positionen aus der Zielpeptidsequenz erzielt werden. Derartige Intermediäre werden als „Aminosäurekompositionsintermediäre" bezeichnet. Darüber hinaus kann ein intermediäres Peptidsubstrat einen oder mehr Aminosäurereste an einer oder mehr Positionen beinhalten, welche an der Position weder die Reste der ersten Peptidsequenz noch die Reste der Zielpeptidsequenz, jedoch Aminosäurereste mit einem intermediären Charakter bezüglich der Reste im ersten und im Zielsubstrat sind. Derartige Intermediäre werden als „Aminosäureeigenschaftsintermediäre" bezeichnet. Der intermediäre Charakter dieser Art von Intermediären kann auf einem oder mehr physikalischen oder chemischen Parameter beruhen, welche die Oberfläche des Rests, sein Volumen, den isoelektrischen Punkt, den Seitenketten pKa, die Polarität, das Vermögen Wasserstoffbrückenbindungen herzustellen oder die Hydrophobizität beinhalten, aber nicht darauf beschränkt sind. In der folgenden Tabelle werden die zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäurereste gemäß dieser Parameter klassifiziert. Tabelle III: Klassifizierung der 20 natürlich vorkommenden Aminosäurereste

Aminosäurerest		Typ	Oberfläche [Å²]	Volumen [Å³]	Seitenketten K_a ^c ₍ _Ladung ₎d	Relative Hydrophobizitäte^e	Wasserstoff brückenbindungs-Donator oder. Akzeptor
A	Ala	aliphatisch	115	88,6	-	0,62
C	Cys	aliphatisch	135	108,5	9,1-9,5	0,68	+
D	Asp	aliphatisch	150	111,1	4,5 (–)	0,03	+
E	Glu	aliphatisch	190	138,4	4,6 (–)	0,04	+
F	Phe	aromatisch	210	189,9	-	1,00
G	Gly	aliphatisch	75	60,1	-	0,50
H	His	aliphatisch	195	153,2	6,2	0,17	+
I	Ile	aliphatisch	175	166,7	-	0,94
K	Lys	aliphatisch	200	168,6	10,4 (+)	0,28	+
L	Leu	aliphatisch	170	166,7	-	0,94
M	Met	aliphatisch	185	162,9	-	0,74
N	Asn	aliphatisch	160	114,1	-	0,24	+
P	Pro	aliphatisch	145	112,7	-	0,71
Q	Gin	aliphatisch	180	143,8	-	0,25	+
R	Arg	aliphatisch	225	173,4	~42 (+)	0,00	+
S	Ser	aliphatisch	115	89,0	-	0,36	+
T	Thr	aliphatisch	140	116,1	-	0,45	+
V	Val	aliphatisch	155	140,0	-	0,83
W	Trp	aromatisch	255	227,8	-	0,88	+
Y	Tyr	aromatisch	230	193,6	9,7	0,88	+

^aChothia, C., J. Mol. Biol., 105 (1975) 1-14; ^bZamyatin, A.A., Prog. Biophys. Mol. Biol., 24 (1972) 107-123; ^cTanford, C. Adv. Prot. Chem., 17 (1962) 69-165; ^dLadung bei physiologischem pH; ^eBlack, S.D, Mould, D.R, Anal. Biochem.; 193 (1991) 72-82.

Wäre zum Beispiel das erste Substrat ALY und das Zielsubstrat NRF, wären intermediäre Substrate bezüglich der Aminosäurezusammensetzung zum Beispiel ALF, NRY oder ARF (Änderungen in Bezug auf das erste Substrat sind markiert). Ein bezüglich der Aminosäureeigenschaften intermediäres Substrat wäre zum Beispiel AQF, bei dem der Glutaminrest dem ursprünglichen Leucin in der Hinsicht ähnelt, als dass er ungeladen ist, jedoch mehr noch dem Argininrest des Zielsubstrates im Bezug auf Hydrophobizität und seines Vermögens Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden ähnelt. Ein weiteres Beispiel für diesen Ansatz wäre SLY, wobei S hinsichtlich Volumen und Oberfläche A ähnelt, jedoch mehr noch dem Ziel N in Bezug auf Hydrophobizität und Wasserstoffbrückenbindung ähnelt.
Darüber hinaus hängt die Anzahl der zu verwendenden aufeinanderfolgenden Peptidsubstrate von der Ähnlichkeit der ersten Peptidsequenz zur Zielpeptidsequenz ab, ebenso wie von der quantitativen Spezifität der einen oder mehr ersten Proteasen. Je weniger die erste Peptidsequenz der Zielpeptidsequenz ähnelt, und je höher die Spezifität der einen oder mehr ersten Proteasen ist, um so mehr aufeinanderfolgende intermediäre Peptidsubstrate werden benötigt.
In einer zweiten Variante dieses Aspekts der Erfindung werden in einem ersten Schritt des Verfahrens unterschiedliche Proteasen mit Spezifität für unterschiedliche Intermediäre parallel selektiert. In einem zweiten Schritt werden dann Proteasen mit Zielspezifität aus einer Population mit zufällig rekombinierten Chimären der in Schritt eins selektierten Proteasen selektiert. Vorzugsweiset wird die parallele Rekombination unterschiedlicher Proteasen durch die Verwendung einer in-vitro homologen Rekombinationstechnik, wie zum Beispiel der Rekombinationskettenreaktion, beschrieben in Patentanmeldung WO 0134835 , erreicht. Für diese Variante können beide Formen von Intermediären verwendet werden. Dennoch werden bevorzugt Aminosäurekompositiosintermediäre verwendet. 11 zeigt schematisch das Grundprinzip dieser Variante des vierten Aspekts der Erfindung.
Die im ersten Schritt dieser Variante verwendeten unterschiedlichen Intermediäre werden vorzugsweise derart ausgewählt, dass die Summe aller Modifikationen, die in diese Intermediäre eingefügt wurden, den Charakteristika des Zielsubstrats gleichen oder ähneln. Beispielsweise wären, wenn das erste Substrat ALY und das Zielsubstrat NRF wäre, NLY, ARY und ALF geeignete Aminosäureeigenschaftsintermediäre für diese Ausführungsform. Proteasen mit einer Spezifität für diese drei Substrate würden dann zufällig rekombiniert und auf ihre Spezifität für das Zielsubstrat, in diesem Beispiel NRF, gescreent. Andere Beispiele, Intermediäre mit mehr als einer Modifikation eingeschlossen, müssen analog konstruiert werden.
In einem weiteren Aspekt werden zwei, drei oder alle vier der verschiedenen oben erwähnten Aspekte miteinander kombiniert. In einer bevorzugten Kombination wird das Screening nach Proteasen mit gesunkenen Michaelis-Menten-Konstanten mit der Verwendung von intermediären Substraten kombiniert. In einer anderen bevorzugten Kombination wird das Screening nach Proteasen mit gesunkenen Michaelis-Menten-Konstanten mit dem aufeinanderfolgenden oder parallelen Screening von zwei oder mehr Substraten kombiniert. In einer weiteren bevorzugten Kombination wird das Screening nach Proteasen mit gesunkenen Michaelis-Menten-Konstanten mit der Verwendung eines Überschusses von kompetitierenden, nicht ungelabelten Substraten kombiniert. In einer besonders bevorzugten Kombination werden die vier Aspekte Screening nach Proteasen mit gesunkenen Michaelis-Menten-Konstanten, paralleles Screening von zwei oder mehr Substraten, Verwendung eines Überschusses von kompetitierenden, ungelabelten Substraten und Verwendung von intermediären Substraten, miteinander kombiniert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Zielprotease eine Spezifität ähnlich dem Tissue-type-Plasminogen-Aktivator auf und schneidet das Zielsubstrat CPGR^↓VVGG. Solch eine Zielprotease kann, unter anderen, mittels des oben definierten erfindunggemäßen Verfahrens erzeugt werden, wenn die Ausgangsprotease die BAR1 Protease aus S. cerevisiae ist. In solch einem Verfahren werden vorzugsweise folgende zweite/intermediäre Substrate verwendet:
(i) WLGLVPGG
(ii) WLGQVPGG
(iii) WLGRVPGG
(iv) WLGRVVGG
(v) CPGRVVGG
Die sequenzspezifische Protease, die mittels der zuvor beschriebenen Verfahren erhalten werden kann, weist vorzugsweise eine Spezifität ähnlich dem Tissue-type-Plasminogen-Aktivator auf und schneidet das Zielsubstrat CPGRV^↓VGG. Die Ausgangsprotease ist vorzugsweise die BAR1 Protease, einschließlich, jedoch nicht beschränkt, auf die in SEQ ID NR:8 beschriebene. Darüber hinaus können BAR1 Proteasen, die durch Abschneiden von bis zu 200 aa, vorzugsweise im Bereich von 100 bis 200 aa, mehr bevorzugt im Bereich von 120 bis 180 aa und am meisten bevorzugt in m Bereich von 140 bis 160 aa, am C- oder N-Terminus modifiziert wurden, als Ausgangsproteasen verwendet werden. Noch mehr bevorzugt wird die sequenzspezifische Protease aus besagter BAR1 abgeleiteter Protease abgeleitet und weist mindestens eine Mutation auf, die aus der Gruppe ausgewählt ist, beinhaltend die Modifikationen L33I, Y45D, T47A, T59I, N82D, E96V, M107I, N123D, E143D, N151V, I152F, K161E, A163T, T165A, R178S, T221I, E231V, D321N, D367G, M369L, V370I, A399S, K404R und S440L. Besonders bevorzugt unter besagten Proteasen sind solche mit mindestens einer von D367G, V3701, M107I, I152F, E143D und E231V. Die besonders bevorzugten Mutanten der BAR1 Protease können weiter modifiziert werden, wie zum Beispiel durch Abschneiden von bis zu 10 aa an den C- oder N-terminalen Enden oder durch Deletion, Insertion oder Substitution von bis zu 50 aa, vorzugsweise von bis zu 20 aa und besonders bevorzugt von bis zu 10 aa innerhalb seiner Sequenz.
Detaillierte Beschreibung der Abbildungen
1 stellt die beiden Alternativen A und B des erfindungsgemäßen Verfahrens schematisch dar. Ausgehend von einer ersten Protease, ist das Ziel der Erfindung die Erzeugung einer entwickelten Protease mit einer hohen Spezifität für ein Zielpeptidsubstrat, welches durch seine Aminosäuresequenz charakterisiert ist.
Im Sinne dieser Abbildung repräsentieren unterschiedliche Formen unterschiedliche Aminosäurereste, und das inverse Profil der Formen repräsentiert die entsprechenden Erkennungsstellen der Protease. Formen mit einer Tilde oben, repräsentieren irgendeinen Aminosäurerest an dieser Position. Das aktive Zentrum des Enzyms wird durch ein Sternchen angezeigt, und der Pfeil zeigt die Schnittstelle innerhalb des Substrats an.
Der Typ der einen oder mehr Proteasen, die als erste Proteasen verwendet werden, bestimmt, ob Alternative A oder B angewandt werden muss. In Alternative A wird die erste Protease durch eine bereits hohe Spezifität gegenüber einem bestimmten ersten Substrat charakterisiert. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren muss diese Spezifität qualitativ zur hin Zielspezifität verändert werden. In Alternative B weist die erste Protease eine relativ geringe Spezifität auf, das heißt sie unterscheidet nicht unter einem Pool von Substraten, der sich zum Beispiel an Positionen P2, P1' und/oder P2' unterscheidet. Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens wird lediglich die quantitative Spezifität dieser Proteasen in Richtung des Werts der Zielspezifität erhöht.
2 unterscheidet die beiden Alternativen A und B des erfindungsgemäßen Verfahrens durch schematische Darstellung der qualitativen und quantitativen Veränderungen in der Spezifität während der Evolution hin zur Zielspezifität. Die quantitative Spezifität s, wie im Rahmen dieser Erfindung definiert, bezieht sich auf das Verhältnis zwischen allen angenommenen und allen möglichen Substraten. Die qualitative Spezifität bezieht sich auf die Aminosäurezusammensetzung und Sequenz von angenommenen Substraten. Spezifitäten der ersten Proteasen (offene Kreise) und der entwickelten Protease (gefüllte Kreise) sind schematisch eingezeichnet. In Alternative A weist die erste Protease eine quantitative Spezifität im Bereich der Zielspezifität auf, hat jedoch eine qualitative Spezifität die sich von der Zielspezifität unterscheidet. Um die Zielspezifität zu erzeugen, wird die Spezifität lediglich qualitativ verändert. In Alternative B weist die erste Protease die qualitative Spezifität des Zielsubstrats auf, hat jedoch eine quantitative Spezifität, die weit unter der Zielspezifität liegt. Um die Zielspezifität zu erzeugen, wird die Spezifität quantitativ und qualitativ verändert.
3 veranschaulicht schematisch wie Proteasen mit veränderten katalytischen Aktivitäten unter Verwendung der zwei Alternativen A und B des erfindungsgemäßen Verfahrens entwickelt werden. Entsprechend des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die katalytische Aktivität (abgekürzt als A) als Selektionsparameter benutzt werden. In Alternative A, hydrolysiert die erste Protease lediglich Substrat 1, während andere Substrate einschließlich des Zielsubstrats (T) nicht oder nur langsam hydrolysiert werden. Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Proteasen entwickelt, die spezifisch das Zielsubstrat hydrolysiern, während andere Substrate einschließlich des ersten Substrats nicht oder nur sehr langsam hydrolysiert werden. Diese entwickelten Proteasen werden anhand einer Zunahme der katalytischen Aktivität auf das Zielsubstrat und einer Abnahme der katalytischen Aktivität auf das erste Substrat (Vergleichsansatz) selektiert. Alternativ kann eine Selektion auf der Affinität gegen das Zielsubstrat (Affinitätsansatz) basieren. In Alternative B hydrolysiert die erste Protease alle Substrate einschließlich des Zielsubstrats (T). Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Proteasen entwickelt, die spezifisch das Zielsubstrat hydrolysieren, während andere Substrate einschließlich des ersten Substrats nicht oder nur sehr langsam hydrolysiert werden.
Diese Proteasen werden mittels Screening mit einem Überschuss von kompetitierenden Substraten (Kompetitoransatz) oder mittels Screening nach höherer Substrataffinität (Affinitätsansatz) selektiert. Im Allgemeinen können die entwickelten Proteasen durch den Vergleich der katalytischen Aktivität gegen angebotene Substrate einschließlich der ersten Substrate und des Zielsubstrats identifiziert werden.
4 stellt schematisch zwei verschiedene Formen des intermediären Ansatzes als einen bestimmten Aspekt der Erfindung dar. Für die Beschreibung der Symbole wird auf 1 verwiesen. Der intermediäre Ansatz verwendet ein oder mehr intermediäre Substrate um die Entwicklung der Spezifität graduell in Richtung der Zielspezifität in so kleinen Schritten wie nötig, hin zu lenken. Intermediäre Substrate sind Substrate, die einen intermediären Charakter verglichen mit dem ersten und dem Zielsubstat aufweisen.
Intermediäre können in zwei Arten eingeteilt werden. Erstens können intermediäre Substrate mittels Ersetzten von mindestens einen aber weniger als allen Aminosäureresten des ersten Substrats mit Aminosäureresten des Zielsubstrats bereitgestellt werden (intermediär hinsichtlich der Aminosäurezusammensetzung, Ansatz 1). Zweitens können intermediäre Substrate bereit gestellt werden, indem an bestimmten Positionen des Substrats selektiv Aminosäurereste eingesetzt werden, deren Eigenschaften sich zwischen denen des entsprechenden Aminosäurerests im ersten und im Zielsubstrat bewegen (intermediär hinsichtlich der Aminosäureeigenschaften, Ansatz 2). Als eine weitere Alternative können beide intermediäre Verfahren kombiniert werden. Wie in der Abbildung gezeigt, wird das zweite Verfahren in das erste eingebaut, wann immer der Schritt zwischen zwei Intermediären zu groß ist.
5 zeigt schematisch wie Proteasen mit veränderten katalytischen Aktivitäten mittels des intermediären Verfahrens gemäß der Erfindung entwickelt werden. Die erste Protease weist eine hohe Aktivität auf ein erstes Substrat (1) und keine oder sehr geringe Aktivität auf allen anderen Substraten, das Zielsubstrat (T) eingeschlossen, auf. Der folgende wesentliche Schritt ist die Bereitstellung eines intermediären Substrats (2), wie in 4 veranschaulicht. Durch Screening nach katalytischer Aktivität auf diesem Substrat werden Proteasevarianten mit einer erhöhten Aktivität auf diesem intermediären Substrat ausgewählt. Dieser intermediäre Schritt kann mit einer graduellen Abwandlung des intermediären Substrats zur Beschaffenheit des Zielsubstrats hin wiederholt werden, bis eine entwickelte Protease isoliert wird, die katalytische Aktivität nur auf das Zielsubstrat und keine oder sehr geringe Aktivität auf ersten und anderen Substraten aufweist.
6 zeigt schematisch den Shuttlevektor pPDE, der für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kann. Der Vektor enthält einen S. cerevisiae Origin (2μ ori), einen E. coli Origin (pMB1 ori), einen S. cerevisiae Marker (URA3), einen E. coli Marker (AmpR) und eine Expressionskassette, die sich aus einem Galaktose-induzierbarem S. cerevisiae Promotor (GAL), einer Signalsequenz für die Sekretion des exprimierten Proteins (Signal), einer KpnI und einer XhoI Erkennungsstelle zur Insertion des Gens von Interesse und einem Terminator (Cyc1) zusammensetzt.
7 zeigt exemplarisch die Hydrolyse eines Peptidsubstrats kalatysiert durch die Tobacco Etch Virus Protease, überwacht durch konfokale Kreuzkorrelations-Fluoreszenzspektroskopie (cc-FCS). Das Peptidsubstrat mit der Sequenz ENLYFQS wird spezifisch von der TEV Protease erkannt und hydrolysiert. 100 nM doppelt gelabeltes Peptid (Alexa 488, Cy5) wurden mit (gefüllte Vierecke) und ohne (offene Kreise) Zusatz von 0,01 U/μl Protease in Assaypuffer inkubiert, der 50 mM Tris-HCI pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 10 mM DTT, 0,05% Glycerol enthält.
8 zeigt exemplarisch eine Verteilung von katalytischen Aktivitäten die durch Screening einer Population von Proteasevarianten auf dem Substrat WLGLVPGG (Intermediär 1 siehe Beispiel VI) mittels konfokaler Fluoreszenzspektroskopie, erhalten wurde. Gezeigt ist die Häufigkeit N mit welcher eine bestimmte katalytische Aktivität (Performanz, beliebige Einheiten) identifiziert wird. Niedrige Werte repräsentieren geringe katalytische Aktivitäten, wohingegen hohe Werte hohe katalytische Werte auf dem Substrat repräsentieren. Gene, die für Varianten codieren, die höchste Performanzwerte aufweisen, werden isoliert und mit Hinblick auf ihre Spezifität bewertet. Diese Varianten werden dann als erste Proteasen im nächsten Zyklus eingesetzt. Dieses Verfahren wird wiederholt bis Proteasevarianten identifiziert sind, welche die Zielspezifität aufweisen.
9 zeigt exemplarisch die Abnahme der KM während der Entwicklung hin zu höherer Affinität unter Verwendung des Affinitätsansatzes der Erfindung. Die Protease, die als erste Protease (Wildtyp) in diesem Experiment eingesetzt wurde, war Subtilisin E aus B. subtilis, die eine KM von 194 μM aufwies. Diese K_M wurde unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens schrittweise um einen Faktor von 7,5 hinunter auf 26 μM verringert.
10 zeigt exemplarisch die Veränderung in des Spezifität während der Entwicklung von Proteasen hin zur Spezifität von t-PA. Die Aktivität der Varianten 1, 2 und 3 wurde unter Verwendung der Substrate Intermediär 1, Intermediär 2 und Intermediär 3 aus Beispiel VI untersucht. Die Abnahme in der Substratkonzentration korrespondiert mit der proteolytischen Aktivität. Je schneller die Abnahme ist, desto höher ist die katalytische Aktivität der Proteasevariante. Während die erste Protease sehr geringe Aktivität auf Intermediär 1 und keine Aktivität auf die Intermediäre 2 oder 3 aufweist, zeigen die entwickelten Varianten verschiedene Aktivitäten auf den drei intermediären Substraten.
11 stellt schematisch eine bevorzugte Variante des intermediären Ansatzes der Erfindung (vierter Aspekt, siehe unten) dar, wo Proteasen parallel in einem ersten Schritt gemäß ihrer Spezifität für verschiedene intermediäre Substrate ausgewählt werden. Proteasen werden dann gemäß ihrer Spezifität für das Zielsubstrat aus einer Population, die rekombinierte Varianten der im ersten Schritt ausgewählten Proteasevarianten enthält, ausgewählt.
12 zeigt exemplarisch kinetische Progressionskurven für die erste Protease in Vergleich zu einer entwickelten Protease, die in Runde 5 des erfindungsgemäßen Optimierungsverfahrens erhalten wurde. Im Falle des ersten Substrats ist die Aktivität der entwickelten Protease geringer verglichen mit der ersten Protease. Dies ist umgekehrt im Falle des ersten und vierten Intermediärs, wo die erste Protease jeweils sehr eingeschränkten oder keinen Umsatz des Substrates zeigt.
Die Erfindung wird darüber hinaus durch die folgenden Beispiele erklärt. Es versteht sich, dass die Beispiele und Ausführungsformen die hierin beschrieben sind lediglich illustrativen Zwecken dienen, und dass verschiedene Modifikationen oder Änderungen im Lichte davon Fachmännern vorgeschlagen werden und eingeschlossen sein sollen im Rahmen des Geistes und Bereichs dieser Anmeldung und berücksichtigt werden im Rahmen der angefügten Ansprüche. Alle Publikationen, Patente und Patentanmeldungen die hierin zitiert sind, sind hiermit durch ihre Erwähnung in ihrer Gesamtheit in jeder Hinsicht mit einbezogen.
Beispiele
In den folgenden Beispielen werden Materialien und Verfahren der vorliegenden Erfindung, einschließlich der Bestimmung von katalytischen Eigenschaften von Enzymen, die mittels dieses Verfahrens erhalten wurden, bereitgestellt. Es soll verstanden werden, dass diese Beispiele lediglich illustrativen Zwecken dienen und nicht dahingehend auszulegen sind diese Erfindung in irgend einer Weise einzuschränken.
In den unten beschriebenen experimentellen Beispielen werden Standardverfahren von Rekombinations-DNA-Technologie eingesetzt, die in verschieden Publikation beschrieben wurden, z.B. Samrock et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, oder Ausubel et al. (1987), Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988, Wiley Interscience, Methods in Yeast Genetics (1994) Cold Spring Harbor Laboratory Manual, die hiermit in ihrer Gesamtheit durch ihre Erwähnung mit eingeschlossen sind. Soweit nicht anders angegeben, wurden Restriktionsenzyme, Polymerasen und andere Enzyme sowie DNA Aufreinigungskits gemäß den Vorschriften der Hersteller eingesetzt.
Beispiel I: Molekulare Klonierung von Genen, die Proteasevarianten kodieren
Gene, die Proteasevarianten kodieren, werden in einen Vektor, der für die extrazelluläre Expression von Proteinen durch die Hefe Saccharomyces cerevisiae geeignet ist, kloniert. Der verwendete Vektor ist ein Derivat des Plasmids pYES2, welches im Handel von Invitrogen, Inc. erhältlich ist. Eine Karte des Plasmids wird in 6 gezeigt. Der Vektor beinhaltet einen 2μ Origin zur Amplifikation in S. cerevisiae, einen pMB1 Origin zur Amplifikation in E. coli, einen URA Marker zur Selektion in S. cerevisiae, einen Ampicillin-Resistenzmarker zur Selektion in E. coli, sowie einen GAL Promotor und Cyc1 Transkriptionsterminator zur induzierbaren Expression in S. cerevisiae. Ein 90 bp Fragment, das die Leadersequenz kodierend für das Signalpeptid aus dem BAR1 Gen von S. cerevisiae beinhaltet, wurde hinter dem GAL1 Promotor eingesetzt. Die Restriktionsstellen KpnI und XhoI dienten als Insertionsstellen für zu exprimierende heterologe Gene. Die Klovierung von Genen, die Proteasevarianten kodieren, wurde wie folgt durchgeführt: die kodierende Sequenz des reifen Proteins wurde mittels PCR unter Verwendung von Primern, die eine KpnI Stelle am 5'-Ende und eine XhoI Stelle am 3'-Ende eingeführt haben, amplifiziert. Dieses PCR Fragment wurde in die geeigneten Stellen des Verktors einkloniert und seine Identität wurde mittels Sequenzierung bestätigt.
Beispiel II: Bereitstellung von Populationen von Proteasevarianten
Eine Population von Proteasevarianten wurde mittels zufälliger Modifikation von Genen, die Proteasen mit bekannten Substratspezifitäten kodieren, bereitgestellt, gefolgt von Expression der Proteasevarianten, die von diesen modifizierten Genen kodiert werden, unter Verwendung von S. cerevisiae als geeignetem Wirtsorganismus. Zunächst wurden Gene, die Proteasevarianten mit bekannten Substratspezifitäten kodieren unter fehleranfälligen Bedingungen PCR-amplifiziert, im Wesentlichen wie beschreiben von Cadwell, R.C und Joyce, G.F. (PCR Methods Appl. 2 (1992) 28-33). Fehleranfällige PCR wurde unter Verwendung von 30 pmol von jedem Primer, 20 nmol dGTP und dATP, 100 nmol dCTP und dTTP, 20 fmol Template und 5 U Taq DNA Polymerase in 10 mM Tris HCl pH 7,6, 50 mM KCl, 7 mM MgC12, 0,5 mM MnCl2, 0,01% Gelatine für 20 Zyklen von 1 min bei 94°C, 1 min bei 65°C und 1 min bei 72°C durchgeführt. Die resultierende DNA Bibliothek wurde unter Verwendung des Qiaquick PCR Purifikation Kits unter Befolgung der Anweisungen des Anbieters aufgereinigt. PCR Produkte wurden mit Restriktionsenzymen XhoI und KpnI verdaut und wie in Beispiel I beschrieben aufgereinigt. Anschließend wurden die PCR Produkte in den Vektor, der mit XhoI und KpnI verdaut wurde, ligiert, Gel-aufgereinigt und dephosphoryliert. Die Ligationsprodukte wurden in E. coli transformiert, in LB, das Ampicillin als Marker beinhaltet, amplifiziert, und die Plasmide wurden unter Verwendung des Qiagen Plasmid Purification Kits unter Befolgung der Anweisungen des Anbieters aufgereinigt. Resultierende Plasmide wurden in S. cerevisiae Zellen transformiert. Populationen von Proteasevarianten wurden mittels Induzierung der Expression in den transformierten S. cerevisiae Zellen durch Zugabe von 2% Galaktose zu dem Medium, bereitgestellt.
Alternativ wurden Gene, die Proteasevarianten mit bekannten Substatspezifitäten kodieren, mittels der Rekombinationskettenreaktion statistisch an homologen Positionen rekombiniert, wie im Wesentlichen in WO 0134835 beschrieben. PCR Produkte der Gene, welche die Proteasevarianten kodieren wurden unter Verwendung des QIAquick PCR Purification Kits unter Befolgung der Anweisungen des Anbieters aufgereinigt, mittels Agarosegelelekrtophorese auf ihre richtige Größe hin überprüft und in äquimolaren Mengen miteinander vermischt. 80 μg dieses PCR Mixes in 150 mM TrisHCl pH 7,6, 6,6 mM MgC12 wurden für 5 min bei 94°C erhitzt und anschließend auf 37°C bei 0,05°C/sec herabgekühlt um Stränge zu reannealen und dadurch Hereroduplices in einer stochastischen Weise herzustellen. Dann wurden 2,5 U Exonuklease III pro μg DNA zugefügt und für 20, 40 oder 60 min bei 37°C inkubiert, um verschiedene Längen von beiden 3'-Enden der Heteroduplices zu verdauen. Die teilweise verdauten PCR Produkte wurden mit 0,6 U Pfu Polymerase pro μg DNA durch Inkubation für 15 min bei 72°C in 0,17 mM dNTPs und Pfu Polymerase Puffer unter Befolgung der Anweisungen des Anbieters wieder aufgefüllt Nach der Durchführung eines einzigen PCR Zyklus, wurde die resultierende DNA unter Verwendung des QIAquick PCR Purification Kits unter Befolgung der Anweisungen des Anbieters aufgereinigt, mit KnpI und XhoI verdaut und in den liniarisierten Vektor ligiert. Die Ligationsprodukte wurden in E. coli transformiert, in LB, das Ampicillin als Marker enthält amplifiziert, und die Plasmide wurden unter Verwendung des Qiagen PCR Purification Kits unter Befolgung der Anweisungen des Anbieters aufgereinigt. Resultierende Plasmide wurden in S. cerevisiae Zellen transformiert. Populationen von Proteasevarianten wurden mittels Induzierung der Expression in den transformierten S. cerevisiae Zellen durch Zugabe von 2% Galaktose zu dem Medium, bereitgestellt.
Beispiel III: Bereitstellung von Peptidsubstraten, die dem Zielsubstrat ähneln
Alle Peptidsubstrate wurden an einem Peptidsynthesizer unter Verwendung des Ansatzes von Merrifield et al. (Nature. 207 (1965) 522-523) synthetisiert. Peptidsubstrate, die dem Zielsubstrat ähneln wurden durch Substitution der Aminosäurereste an einer oder mehr Positionen des ersten Peptidsubstrats mit Aminosäureresten an der einen oder mehr Positionen des Zielsubstrats entwickelt. Alternativ wurden die Aminosäurereste an der einen oder mehr Positionen des ersten Peptidsubstrats mit Aminosäureresten substituiert, die einen intermediären Charakter in Bezug auf die Aminosäurereste des ersten Peptidsubstrats und die Aminosäurereste des Zielpeptidsubstrats haben. Zur Bestimmung des intermediären Charakters der Aminosäurereste siehe Tabelle III. Markerfluorophore werden an die Peptidsubstrate entweder über die Amino-Gruppe des N-Terminus oder über die Carboy-Gruppe des C-Terminus angehängt. Alternativ wurde ein Cysteinrest entweder an den N- Terminus oder an den C-Terminus des Peptids angefügt und das Markerfluorophor wurde chemisch an die Thiol-Gruppe des Cysteinrests angefügt.
Alexa 488 (Molecular Probes Inc., Oregon, USA) und Cy-5 (Amersham Biosciences Europe GmbH , Freiburg, Germany) wurden typischerweise als Fluorophormarker verwendet. Proteasespaltung des Peptidsubstrats wurde durch cross-correlation FCS (Proc.Natl.Acad.SciUSA. 95 (1998) 1416-1420) überwacht. Als ein Beispiel wird die Spaltung eines Peptidsubstrats, welches das Zielsubstrat für die Tabacco Etch Virus Protease (TEV Protease) enthält und das Alexa 488 Fluorophor an den C-Terminus des Peptids angehängt hat und das Cy-5 Fluorophor an den N-Terminus des Peptids angehängt hat, in 7 gezeigt. Die TEV Protease weist bereits eine relativ hohe Spezifität auf (s = 4,9, siehe Tabelle I). Die Spaltung wurde bei einer Peptidkonzentration von 100 nM unter Zugabe von 0,01 U/μl TEV Protease in Assaypuffer der 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 10mM DTT und 0,05% Glycerol enthält, durchgeführt.
Beispiel IV: Screeningverfahren
Um Enzymvarianten zu identifizieren, welche die gewünschte Substratspezifitäten haben, wird ein Screeningansatz basierend auf einem konfokalen Fluoreszenzspektroskopieaufbau, wie in WO 9416313 offenbart, verwendet. Entweder wurde die Zellsuspension einer S. cerevisiae Kultur direkt, oder ein Aliquot des zellfreien Überstands als die Probe, welche die sekretierte Proteasevariante enthält, benutzt. Nach Zugabe des Substrats zu der Probe und Inkubation für eine bestimmte Zeitspanne, wurden die Proben einer Messung mittels konfokaler Fluoreszenzspektroskopie unterworfen. Wenn notwendig, wurde dieses Verfahren mehrere Male wiederholt, um Kinetiken der proteolytischen Spaltung zu messen. Infolgedessen wurden die Proben gemäß ihrer proteolytischen Aktivität klassifiziert und Proben, die eine bestimmte Aktivitätsgrenze überschreiten, wurden identifiziert, um das Gen, das für die entsprechende Proteasevariante kodiert, zu isolieren. Die Verteilung der proteolytischen Aktivitäten von Proteasevarianten, die mittels dieses Verfahrens erhalten wurden, ist in 8 gezeigt.
Beispiel V: Erzeugung sequenzspezifischer Proteasen mit erhöhter Affinität gegen das Zielpeptidsubstrat durch Screening bei niedrigen Substratkonzentrationen
Proteasevarianten, die eine erhöhte Affinität gegen das Zielpeptidsubstrat aufweisen, wurden mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens basierend auf Screening bei niedrigen Substratkonzentrationen erzeugt. Mittels fehleranfäliger PCR (gemäß Cadwell, R.C und Joyce, G.F., PCR Methods Appl. 2 (1992) 28-33), wurde eine Population von Proteasevarianten erzeugt, die verwandt mit der alkalischen Protease Subtilisin E aus Bacillus subtilis ist, welche eine relativ geringe Spezifität (s = 0,82) aufweist. Dies korreliert mit dem relativ hohen KM welcher im Bereich von 150-200 μM liegt. Die Population von Proteasevarianten wurde bei einer Komplexität von 10⁶ Varianten mittels konfokaler Fluoreszenzspektroskopie unter Verwendung von Substratkonzentrationen im Bereich von 10 nM gescreent. In diesem ersten Screen isolierte Proteasen wurden als erste Proteasen in einem zweiten Zyklus eingesetzt um eine weitere Population von Proteasevarianten bereitzustellen. Analog wurden Varianten, die in nachfolgenden Zyklen isoliert wurden als erste Proteasen im folgenden Zyklus eingesetzt. Die Population von Proteasevarianten, die im zweiten Zyklus und allen nachfolgenden Zyklen bereitgestellt wurden, wurden durch eine Kombination von fehleranfälliger PCR (siehe oben) und homologer in-vitro Rekombination (gemäß WO 0134835 ) erzeugt. Varianten, die aus den ersten vier Zyklen dieses Verfahrens isoliert wurden, wurden kinetisch analysiert. Die Zunahme der Affinität gegen das Substrat über vier Runden korrespondiert mit der Abnahme der K_M der besten Performer von jedem Zyklus was in 9 gezeigt wird.
Beispiel VI: Erzeugung sequenzspezifischer Proteasen mit einer Zielsubstatspezifität, die der Spezifität des Tissue-type-Plasminogen Aktivators ähnelt
Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden Proteasen erzeugt, welche eine Spezifität hatten, die hin zur Spezifität des Tissue-type-Plasminogen Aktivators (t-PA) verändert wurde. Die BAR1 Protease aus Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NR:8) wurde als erste Protease eingesetzt. Diese Protease gehört zur Gruppe der Aspartat-Proteasen (Mac Kay et al.; Structure an Funktion of the Aspartic Proteinases (1991) 161-172). Sie ist spezifisch für Peptidsubstrate, welche die Aminosäuresequenz WLQLKPGQ enthalten, und katalysiert die Spaltung an der Peptidbindung zwischen dem zweiten Leucin und dem Lysinrest. Populationen von Proteasevarianten, welche ähnlich zu der BAR1 Protease waren oder in nachfolgenden Screeningzyklen isolierte Proteasen wurden mittels fehleranfälliger PCR (gemäß Cadwell, R.C und Joyce, G.F., PCR Methodes Appl. 2 (1992) 28-33) und homologer in-vitro Rekombination unter Verwendung der Rekombinationskettenreaktion ( WO 0134838 ) erzeugt. Proteasevarianten wurden nach proteolytischer Aktivität bei Komplexitäten von 10⁶ Varianten mittels konfokaler Fluoreszenzspektroskopie gescreent. Die BAR1 Protease, die als erste Protease eingesetzt wurde hatte bereits eine relativ hohe Spezifität, welche im Bereich der Zielspezifität lag. Daher wurde eine Kombination des Affinitätsansates und des intermediären Ansatzes verwendet. Screening bei niedrigen Konzentration hielt die Spezifität der Protease hoch, während Screening auf intermediären Substraten die Entwicklung hin zur neuen Spezifität ermöglichte. Vier intermediäre Substrate wurden konstruiert. Das intermediäre Substrat 1 hatte die Aminosäuresequenz WLGLVPGG, das intermediäre Substrat 2 die Aminosäuresequenz WLGQVPGG, das intermediäre Substrat 3 die Aminosäuresequenz WLGRVPGG und Intermediär vier hatte die Sequenz WLGRVVGG. Die Zielsubstratspezifität von t-PA ist gerichtet auf CPGRVVGG mit Spaltung zwischen dem Argininrest und dem ersten Valinrest. Alle Substrate sind in Tabelle N gezeigt.
Tabelle IV
Intermediärl war ein Aminosäurekompositionsintermediär aufgrund der Tatsache, dass es an Positionen P4, P3, P1 und P2' die selben Aminosäurereste wie das erste Substrat beinhaltete, und an Positionen P2, P1' und P4' die selben Reste wie das Zielsubstrat. Intermediär 2 war ein Aminosäureeigenschaftsintermediär in Hinblick auf Intermediär 1 und das Zielsubstrat. Es ähnelte Intermediär 1, beinhaltete jedoch an Position P1 einen Glutaminrest, welcher einen intermediären Charakter verglichen mit dem Leucinrest, der sich an dieser Position in dem ersten Substrat befindet und dem Argininrest, der sich an dieser Position in dem Zielsubstrat befindet, aufweist.
Intermediär 3 als ein weiteres Aminosäurezusammensetzungsintermediär basierte auf Aminosäureresten stammend von beiden, dem ersten Substrat und dem Zielsubstrat, wie auch intermediäres Substrat 1 es tut, jedoch im Gegensatz zu dem Letzteren, eine zusätzliche Position mit dem Zielsubstrat gemeinsam hatte. Verglichen mit Intermediär 3, hat Intermediär 4 eine weitere Aminosäure mit der Zielsequenz an Position P2' gemeinsam. Die veränderten Spezifitäten von verschiedenen Varianten, welche mittels dieses Verfahrens erzeugt wurden, sind in 10 gezeigt.
Eine Zunahme der Substratspezifität kann ebenfalls als zeitabhängige Umwandlung des Substrats gemessen werden, wie exemplarisch dargestellt in 12. Die Substratumwandlung ist dargestellt als der Anteil von nicht-umgewandeltem Substrat über die Zeit. Wie in 12, unterscheiden sich die erste Protease und eine entwickelte Protease aus Runde 5 jeweils in ihrer proteolytischen Aktivität auf dem ersten Substrat, Intermediär 1 und Intermediär 4. Im Falle des ersten Substrats ist die Aktivität der entwickelten Protease geringer in Vergleich zu der ersten Protease. Dies ist umgekehrt im Fall des ersten und vierten Intermediärs, wo die erste Protease jeweils sehr geringen und gar keinen Umsatz des Substrats zeigt, während die entwickelte Protease deutliche Aktivität auf beiden Substraten zeigt.
Auf diesem Weg werden Proteasen entsprechend des erfindungsgemäßen Verfahrens erzeugt, welche eine Substratspezifität ähnlich dem Tissue-type-Plasminogen-Aktivator aufweisen. Die erzeugten Proteasen haben mindestens eine Mutation an einer Position aus der Gruppe: 33, 45, 47, 59, 82, 96, 107, 123, 143, 151, 152, 161, 163, 165, 178, 221, 231, 321, 367, 369, 370, 399, 404, 440 (basierend auf der Nummerierung der Aminosäuresequenz der Protease BART verzeichnet als SEQ ID NR:8). Vorzugsweise weist eine Proteasevariante, die aus der BAR1 wt Protease hin auf die Spezifität des humanen Tissue-type-Plasminogen-Aktivators entwickelt wurde, mindestens eine Mutation aus der Gruppe D367G, M369L, V370I, M107I, 1152F, E143D, E231V, R178S, T221I, D321N, A399S, K404R und S440L auf.
12 stellt das katalytische Verhalten einer Protease, die entsprechend des erfindungsgemäßen Verfahrens entwickelt wurde, im Vergleich zur Anfangs-(ersten) Protease dar. Beginnend mit BAR1 Protease (SEQ ID NR:8) werden Varianten mit unterschiedlichen Mutationen erhalten. 12 zeigt Plots, welche die Zunahme der Substratspezifität einer Variante aus Runde 5 wiedergeben. Untersuchungen, die bei der Aminosäuresequenz der beispielhaft erläuterten Variante der Runde 5 vorgenommen wurden, offenbarten eine bestimmte Kombination von Aminosäuresubstitutionen (mit Nummerierung äquivalent zur Nummerierung der BART Protease) wie Y45D, T47A, N82D, M107I, E143D, I152F, T165A, E231V, D367G, V370I.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Identifizierung sequenzspezifischer Proteasen mit Zielsubstratspezifitäten, umfassend die folgenden Schritte (a) Bereitstellung einer Population von Proteasen, welche Varianten einer ersten Protease oder Varianten oder Chimären von zwei oder mehr ersten Proteasen beinhaltet, wobei diese erste Protease eine Substratspezifität für eine bestimmte Aminosäuresequenz eines ersten Peptidsubstrats aufweist; (b) Kontaktierung besagter Population von Proteasen mit einem oder mehreren zweiten Substraten, umfassend mindestens eine spezifische Aminosäuresequenz, welche identisch zum Zielpeptidsubstrat ist, oder welche einen intermediären Charakter in Bezug auf das erste Substrat und das Zielsubstrats hat, aber nicht im ersten Peptidsubstrat vorhanden ist; und (c) Selektieren von einer oder mehreren Proteasevarianten aus der Population von Proteasen, bereitgestellt in Schritt (a), mit einer Spezifität für besagte spezifische Aminosäuresequenz des zweiten Substrats, bereitgestellt in Schritt (b) unter Bedingungen, welche die Identifizierung von Proteasen zulassen, welche bevorzugt besagte spezifische Aminosäuresequenz innerhalb des zweiten Substrats erkennen und hydrolysieren, wobei das Screening nach Proteaseaktivität durch Zugabe eines Überschusses von anderen Peptiden als dem zweiten Peptid erreicht wird, wobei die zugegebenen Peptide als Kompetitoren dienen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Selektionsbedingungen in Schritt (c) zudem umfassen (i) Screenen nach Proteaseaktivität bei geringen Substratkonzentrationen, wodurch die Affinität für das zweite Substrat erhöht wird, und/oder (ii) Screenen nach Proteaseaktivität unter Verwendung von zwei oder mehr Substraten im Vergleich, wodurch die Selektivität des Enzyms erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei Schritte (a) bis (c) zyklisch wiederholt werden, bis eine oder mehr Proteasevarianten mit Spezifität für das zweite Substrat identifiziert sind, und wobei die in einem Zyklus selektierten Proteasevarianten als erste Proteasen im folgenden Zyklus eingesetzt werden, und wobei mindestens ein Zyklus und weniger als 100 Zyklen ausgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei nur ein zweites Substrat in dem einen oder mehr Zyklen eingesetzt wird, und wobei das zweite Substrat mit dem Zielsubstrat identisch ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei unterschiedliche zweite Substrate eingesetzt werden, und wobei die zweiten Substrate einen intermediären Charakter in Bezug auf das erste Substrat und das Zielsubstrats haben und wobei das zweite Substrat, das im letzten Zyklus eingesetzt wird, identisch mit dem Zielsubstrat ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei unterschiedliche zweite Substrate in aufeinanderfolgenden Zyklen eingesetzt werden, und wobei jedes zweite Substrat einen intermediären Charakter in Bezug auf das zuvor eingesetzte zweite Substrat und das Zielsubstrat hat.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei in mindestens einem Zyklus Schritte (b) bis (c) mit unterschiedlichen zweiten Substraten parallel ausgeführt werden, und wobei die in solch einer parallelen Weise isolierten Proteasevarianten kombiniert und als erste Proteasen für den nächsten Zyklus verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei der intermediäre Charakter des intermediären Substrates basiert auf (i) der Aminosäurezusammensetzung, (ii) der Aminosäuresequenz, (iii) den physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften der Aminosäurereste innerhalb der spezifischen Aminosäuresequenz, wobei bevorzugt eine oder mehr Eigenschaften aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Aminosäureeigenschaften genutzt wird: die Oberfläche, das Volumen, der isoelektrische Punkt, der Seitenketten pKa, die Ladung, die Polarität, die Hydrophobizität, oder (iv) jegliche Kombination derselben.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei sich die zweiten Substrate von den ersten Substraten insofern unterscheiden, als dass 1 bis 5 Aminosäurereste innerhalb der spezifischen Aminosäuresequenz ausgetauscht werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die zweiten Substrate funktionelle Gruppen tragen welche die Detektion der Hydrolyse des Substrats ermöglichen, wobei besagte funktionelle Gruppen sind (i) ein oder mehr Fluorophore oder Chromophore, deren spektroskopische Eigenschaften sich bei Hydrolyse des Peptids ändert, wodurch das Screening mittels Bestimmung der Änderungen der spektroskopischen Eigenschaften erfolgt; oder (ii) zwei Fluorophore, die durch ihre Fluoreszenzeigenschaften unterscheidbar sind und an die gegenüberliegenden Enden des zweiten Substrats eingebaut sind, wodurch das Screening mittels konfokaler Fluoreszenzspektroskopie bei Fluorophorkonzentrationen unter 1 μM erfolgt; oder (iii) zwei Fluorophore die ein Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer(FRET)-Paar bilden, und welche an gegenüberliegenden Enden des zweiten Substrats eingebaut sind, wodurch das Screening durch Bestimmung der Abnahme im Energietransfer zwischen den beiden Fluorophoren erfolgt; oder (iv) ein erstes und zweites autofluoreszierendes Protein, welche das zweite Substrat flankieren, wodurch das Screening mittels konfokaler Fluoreszenzspektroskopie bei Substratkonzentrationen unter 1 μM erfolgt; oder (v) ein Fluorophor und ein Quencher Molekül, welche an gegenüberliegenden Enden des zweiten Substrats eingebaut sind, wodurch das Screening mittels Bestimmung der Abnahme der Quenchung des Fluorophors erfolgt; oder (vi) ein Fluorophor oder ein Chromophor und ein Bindungsrest, welche an gegenüberliegenden Enden des zweiten Substrats eingebaut sind, wodurch das Screening durch Bestimmung der Bindung des Bindungsrests an einen spezifischen Bindungspartner erfolgt; oder (vii) ein radioaktives Label und ein Bindungsrest, welche an gegenüberliegenden Enden des zweiten Substrats eingebaut sind, wodurch das Screening mittels Anwendung eines Scintillations-Proximity-Assays erfolgt; oder (viii) jegliche Kombination derselben.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei (i) die Population von Proteasen durch zufallsbestimmte Nukleinsäure Mutagenese, Kassetten-Mutagenese, Orts-Sättigungs-Mutagenese, ortsspezifische oder zufallsbestimmte Insertions- und/oder Deletionsmutagenese, homologe in-vitro-Rekombination, homologe in-vivo-Rekombination, nicht-homologe Rekombination oder einer Kombination derselben erhalten wird; und/oder (ii) die Expression der Population der Proteasen durch Wirtszellen, bevorzugt durch aus Bakterien, Hefen, Insekten, Viren oder Säugetieren stammenden Wirtszellen, oder durch ein zellfreies Protein-Expressionssystem erfolgt, und/oder (iii) die Kopplung von Protease-Gentyp und -Phänotyp durch den Einsatz von Probenträgem erfolgt, die eine Kompartimentierung der Proben erlauben, und wobei die Verteilung von Gentypen in die Probenträger in einer Vielzahl pro Reaktionsraum erfolgt, die eine ausreichende Differenzierung von Phänotypen erlaubt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die erste Protease aus der Gruppe von Proteasen bestehend aus Serin-Proteasen, Cystein-Proteasen, Aspartat-Proteasen und Metalloproteasen ausgewählt wird, und wobei die erste Protease bevorzugt aus der Gruppe von Proteasen bestehend aus Papain, Bromelain, Trypsin, Pepsin, Chymotrypsin, Subtilisin, SET, humaner Elastase, Kathepsin, Chymase, Saccharomycopsis fibuligera PEP I, Kallikrein, Urokinase, Thermolysin, Kollagenase, Pseudomonas aeruginosa Elastase, TEV Protease, HIV-1 Protease, BAR1-Protease, Faktor Xa, Thrombin, Tissue-type-Plasminogen Aktivator, Kex2 Protease, TVMV Protease, RSV Protease, MuLV Protease, MPMV Protease, MMTV Protease, BLV Protease, EIAV Protease, SIVmac Protease ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bevorzugt nach einem der Ansprüche 5 bis 12, wobei die Zielprotease eine ähnliche Spezifität wie der Tissue-type-Plasminogen-Aktivator besitzt und das Zielsubstrat CPGR^↓VVGG spaltet.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Startprotease die BAR1 Protease aus S. cerevisiae ist und bevorzugt folgende sekundären/intermediären Substrate verwendet werden: (i) WLGLVPGG (ii) WLGQVPGG (iii) WLGRVPGG (iv) WLGRVVGG (v) CPGRVVGG.