JP2005525123A - 進化分子工学的手法により配列特異的プロテアーゼを生成する方法及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
s=−log(Q)
により表され、式中Qは全ての可能なペプチド基質に対する、認識された全てのペプチド基質の比である。いくつかのプロテアーゼの定量的特異性を表Iに例示する。定量的特異性の計算は20種の天然アミノ酸に基づき、そして、これらの20種のアミノ酸の全ての組み合わせが可能であるという推定に基づいている。その結果、全ての可能なペプチドのうち僅か一部のみを認識するプロテアーゼは高い特異性を有するのに対し、極端な例としては、如何なるペプチド基質も切断するプロテアーゼの特異性は理論的にはゼロである。
即ち本発明は、下記工程:
(1)標的基質特異性により配列特異的プロテアーゼを生成する方法であって、以下の工程を含む。
(a)1個の第1プロテアーゼ変異体、又は、2個若しくはそれ以上の第1プロテアーゼ変異体若しくはキメラを含むプロテアーゼの集団を提供し、ここで前記第1プロテアーゼは第1ペプチド基質の特定のアミノ酸配列に対して基質特異性を有するものであり;
(b)前記プロテアーゼ集団に、標的ペプチド基質のアミノ酸配列に類似しているが第1ペプチド基質内に存在しない少なくとも1個の特異的アミノ酸配列を含む、1個又はそれ以上の第2基質1を接触させること;及び、
(c)第2基質内の前記特異的なアミノ酸配列1個を好ましくは認識して加水分解するプロテアーゼを同定しうる条件下で、工程(b)において提供された第2基質の前記特異的アミノ酸配列に対して特異性を有する工程(a)において提供されたプロテアーゼの集団から1個又はそれ以上のプロテアーゼ変異体を選択すること;
(2)上記(1)の好ましい実施形態において、1つの第2基質のみが(a)〜(c)の1個又はそれ以上のサイクルで用いられ、すなわち、第2基質は標的基質と同一であり;
(3)上記(1)のさらに好ましい実施形態としては、異なる第2基質が用いられ、第2基質は第1基質及び標的基質に関して中間的な特質を有し、そして、用いられる最後の第2基質が標的基質と同一であり;
(4)上記(1)〜(3)の特に好ましい実施形態において、標的プロテアーゼが組織型プラスミノーゲン活性化物質と同様の特異性を有し、そして、標的基質CPGR↓VVGGを切断し;そして、
(5)上記(1)〜(4)の方法、好ましくは上記(4)の方法により得ることができる配列特異的プロテアーゼ、
に関する。
(a)プロテアーゼの集団を提供し、ここで各変異体は1個又はそれ以上の第1プロテアーゼに関連し、これらの第1プロテアーゼは第1基質特異性を有すること;
(b)標的ペプチド基質に類似した少なくとも1個のアミノ酸配列を含む1個又はそれ以上のペプチド基質を提供し;
(c)標的配列を好ましく認識して切断するプロテアーゼを同定しうる条件下、工程(b)において提供された提供された基質に対するその特異性に関して工程(a)において提供されたプロテアーゼの集団から1個又はそれ以上のプロテアーゼ変異体を選択する。
そして、工程(a)〜(c)は、標的配列特異性を有する1個又はそれ以上のプロテアーゼ変異体が同定されるまで循環的に実施される。
ペプチドの加水分解によりスペクトル特性が変化する1個又はそれ以上の蛍光団又は発色団であって、これにより、スペクトル特性の変化の測定によりスクリーニングを実施するもの;又は、
蛍光特性により識別可能であり、第2基質の両端に結合している2個の蛍光団であって、これにより、1μM未満の蛍光団濃度において共焦点蛍光スペクトル分析によりスクリーニングを実施するもの;又は、
蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)対を形成し第2基質の両端に結合している2個の蛍光団であって、これにより、2個の蛍光団の間のエネルギー移動の低下の測定によりスクリーニングを実施するもの;又は、
第2基質にフランキングする第1及び第2の自己蛍光タンパク質であって、これにより、1μM未満の基質濃度における共焦点蛍光スペクトル分析によりスクリーニングを実施するもの;又は、
第2基質の両端に結合した蛍光団及びクエンチャー分子であって、これにより、蛍光団のクエンチング減少の測定によりスクリーニングを実施するもの;又は、
第2基質の両端に結合した蛍光団又は発色団及び結合部分であって、これにより特異的結合相手への結合部分の結合の測定によりスクリーニングを実施するもの;又は、
第2基質の両端に結合した放射標識及び結合部分であって、これにより、シンチレーションプロキシミティアッセイの使用によりスクリーニングを実施するもの;又は、これらのいずれかの組み合わせ、
である。
(a)プロテアーゼの集団を提供し、ここで各変異体は1個又はそれ以上の第1プロテアーゼに関連し、これらの第1プロテアーゼはあるスペクトルのペプチド基質又は単一のペプチド基質に対する特異性を有するものであり;
(b)第1ペプチド基質及び標的基質に関して中間的特質を有する1個又はそれ以上のペプチド基質を提供し;
(c)工程(a)で提供されたプロテアーゼの集団から工程(b)で提供された基質に対する特異性に関して1個又はそれ以上のプロテアーゼ変異体を選択し;
(d)工程(b)で提供された中間的基質に対する活性を有する1個又はそれ以上のプロテアーゼ変異体が同定されるまで工程(a)〜(c)を反復し;
(e)工程(a)及び(b)における第1ペプチド基質を中間的基質により、そして、工程(a)における第1プロテアーゼを工程(c)において選択されたプロテアーゼ変異体により置換すること;
及び標的基質特異性を有する1個又はそれ以上のプロテアーゼ変異体が同定されるまで工程(a)〜(e)を反復する。
(i)WLGLVPGG
(ii)WLGQVPGG
(iii)WLGRVPGG
(iv)WLGRVVGG
(v)CPGRVVGG
本発明はまた、上記の方法により獲得しうる配列特異的プロテアーゼに関する。好ましい実施形態としては、配列特異的プロテアーゼは組織型プラスミノーゲン活性化物質と同様の特異性を有し、そして、標的基質CPGR↓VVGGを切断する。原料プロテアーゼは、限定されるものではないが、BAR1プロテアーゼ、例えば配列番号8に記載するものが好ましい。さらに、200aaまで、好ましくは100〜200aaの範囲、より好ましくは120〜180aaの範囲、最も好ましくは140〜160aaの範囲で、C又はN末端において切断により改変体されたBAR1プロテアーゼを原料プロテアーゼとして使用しうる。さらに、前記配列特異的プロテアーゼは前記BAR1由来プロテアーゼであり、改変体L33I、Y45D、T47A、T59I、N82D、E96V、M107I、N123D、E143D,N151V、I152F、K161E、A163T、T165A、R178S、T221I、E231V、D321N、D367G、M369L、V370I、A399S、K404R及びS440Lを含む群から選択される突然変異が少なくとも1個あるものがより好ましい。このようなプロテアーゼのうち特に好ましいのはD367G、V370I、M107I、I152F、E143D及びE231Vのうち少なくとも1つである。BAR1プロテアーゼの特に好ましい突然変異は、さらに例えばそのC又はN末端において10aaまで切断により、又は、その配列内で50aaまで、好ましくは20aaまで、最も好ましくは10aaまでの欠失、挿入又は置換により改変体されうる。
図面の簡単な説明
図1は、本発明の方法の2個の選択肢A及びBを模式的に示す。第1プロテアーゼから出発して、本発明の目標は、アミノ酸配列から特定される標的ペプチド基質に対して特異性が高い進化したプロテアーゼの生成である。この図の目的上、異なる形状は異なるアミノ酸残基を示し、そして、形状が逆転している輪郭はそれぞれプロテアーゼの認識部位を示す。上部の屈曲した波型の形状はその位置におけるいずれかのアミノ酸残基を示す。酵素の活性部位はアステリクスで示し、矢印は基質内の切断部位を示す。第1プロテアーゼとして使用される1個又はそれ以上のプロテアーゼ1の型は、選択肢A又は選択肢Bのいずれが採用されるかにより決定される。選択肢Aにおいて、第1プロテアーゼは、定義された第1基質に対する特異性が十分高いことにより特徴づけられる。本発明の方法によれば、この特異性は標的特異性に定性的に変化させなければならない。選択肢Bにおいて、第1プロテアーゼは特異性が比較的低く、即ち、例えばP1、P1'及び/又はP2'の位置において異なる基質のプール内では判別しえない。
プロテアーゼ変異体をコードする遺伝子を酵母であるS. cerevisiaeによるタンパク質の細胞外発現に適するベクターにクローニングした。使用したベクターはプラスミドpYES2の誘導体であり、これはInvitrogen,Inc.より市販されている。プラスミドの地図は図6に示す。ベクターはS. cerevisiaeの増幅の2μ起点、大腸菌の増幅のpMB1起点、S. cerevisiaeの選択のためのURAマーカー、大腸菌の選択のためのアンピシリン耐性マーカー、並びに、S. cerevisiae中の誘導性発現のためにGALプロモーター及びCyc1転写ターミネーターを含む。S. cerevisiaeのBAR1遺伝子からのシグナルペプチドをコードするリーダー配列を含む90bpの断片をGAL1プロモーターの下流に導入した。制限部位KpnI及びXhoIは発現すべき異種遺伝子のための挿入部位とした。プロテアーゼ変異体をコードする遺伝子のクローニングは以下の通り行った:即ち、成熟タンパク質のコード配列は5’末端にKpnI部位、3’末端にXhoI部位を導入するプライマーを用いたPCRにより増幅した。このPCR断片をベクターの適切な部位にクローニングし、同一性を配列決定により確認した。
プロテアーゼ変異体の集団は、公知の基質特異性を有するプロテアーゼをコードする遺伝子をランダム改変した後、適当な宿主生物としてS. cerevisiaeを用いて、この改変遺伝子によりコードされるプロテアーゼ変異体を発現することにより提供された。第1に、公知の基質特異性を有するプロテアーゼ変異体をコードする遺伝子は、本質的にはCadwell,R.C.and Joyce,G.F.(PCR Methods Appl.2(1992)28-33)に記載の通り、易エラー性の条件下にPCR増幅した。易エラー性PCRは、10mMトリス塩酸pH7.6、50mM KCl、7mM MgCl2、0.5mM MnCl2、0.01%ゼラチン中、30pmolの各プライマー、20nmol dGTP及びdATP、100nmol dCTP並びにdTTP、20fmol鋳型及び5UのTaqDNAポリメラーゼを用いて、94℃1分間、65℃1分間、72℃1分間を20サイクル行った。得られたDNAライブラリは入手元の取扱説明書に従ってQiaquick PCR精製キットを用いて精製した。PCR産物は制限酵素XhoI及びKpnIを用いて消化し、実施例1に記載の通り精製した。その後、PCR産物をXhoI及びKpnIで消化したベクター内に連結し、ゲル精製し、脱リン酸化した。ライゲーション産物を大腸菌内に形質転換し、マーカーとしてアンピシリンを含有するLB中で増幅し、プラスミドを入手元の取扱説明書に従ってQiagenプラスミド精製キットを用いて精製した。得られたプラスミドをS. cerevisiae細胞に形質転換した。プロテアーゼ変異体の集団は、培地に2%ガラクトースを添加することにより形質転換されたS. cerevisiae中で発現を誘導することにより提供した。あるいは、公知の基質特異性を有するプロテアーゼ変異体をコードする遺伝子は、本質的にWO0134835に記載の通り、組換え連鎖反応を用いて相同的位置において統計学的に組換えた。プロテアーゼ変異体をコードする遺伝子のPCR産物は、入手元の取扱説明書に従ってQiaquick PCR精製キットを用いて精製し、アガロースゲル電気泳動により正確な大きさであることを確認し、そして、等モル量で混合した。150mMトリス塩酸pH7.6、6.6mM MgCl2中のこのPCRミックス80μgを94℃で5分間加熱し、その後0.05℃/秒で37℃まで冷却することにより鎖を再アニーリングし、これにより確率論的な方法でヘテロ2本鎖を作成した。次に、DNAμg当たり2.5UのエキソヌクレアーゼIIIを添加し、20、40又は60分間37℃でインキュベートすることによりヘテロ2本鎖の両方の3’末端から種々の長さで消化した。部分的に消化されたPCR産物は、入手元の取扱説明書に従って0.17mM dNTPs及びPfuポリメラーゼ緩衝液中72℃で15分間インキュベートすることによりDNAμg当たり0.6UのPfuポリメラーゼで再充填した。単回のPCRサイクルを実施した後、得られたDNAを入手元の取扱説明書に従ってQIAquickPCR精製キットを用いて精製し、KpnI及びXhoIで消化し、線状化されたベクター内に連結した。ライゲーション産物を大腸菌内に形質転換し、マーカーとしてアンピシリンを含有するLB中で増幅し、プラスミドを入手元の取扱説明書に従ってQiagenプラスミド精製キットを用いて精製した。得られたプラスミドをS. cerevisiae細胞に形質転換した。プロテアーゼ変異体の集団は、培地に2%ガラクトースを添加することにより形質転換されたS. cerevisiae中で発現を誘導することにより提供した。
全てのペプチド基質は、Merrifield等の方法を用いてペプチド合成装置で合成した(Nature.207(1965)522-523)。標的配列に類似するペプチド基質は、1以上の第1ペプチド基質の位置におけるアミノ酸残基を1以上の位置における標的基質のアミノ酸残基で置換することにより設計した。あるいは、第1ペプチド基質の1以上の位置におけるアミノ酸残基を、第1ペプチド基質のアミノ酸残基及び標的ペプチド基質のアミノ酸残基に関して中間的な特質を有するアミノ酸残基で置換した。アミノ酸残基の中間的特質は、表IIIを参照して決定しうる。マーカー蛍光団は、N末端のアミノ基を介するか、C末端のカルボキシ基を介して、ペプチド基質に結合させた。あるいは、ペプチドのN末端又はC末端においてシステイン残基を付加し、マーカー蛍光団をシステイン残基のチオール基に化学的に結合させた。
所望の基質特異性を有する酵素変異体を同定するために、WO9416313に開示された共焦点蛍光スペクトル分析条件に基づいたスクリーニング方法を用いた。S. cerevisiaeの培養液の細胞懸濁液を直接、又は、無細胞上清の一部のいずれかを、分泌されたプロテアーゼ変異体を含有する試料として使用した。基質を試料に添加して所定時間インキュベートした後、試料を共焦点蛍光スペクトル分析により測定した。必要に応じて、この操作法を数回反復することでタンパク質分解切断の速度論的動態を測定した。その結果、試料をタンパク質分解活性に従ってランク付けし、特定の活性閾値を超過した試料を同定して対応するプロテアーゼ変異体をコードする遺伝子を単離した。本操作法により得られたプロテアーゼ変異体のタンパク質分解活性の分布を図8に示す。
標的ペプチド基質に対して親和性が上昇したプロテアーゼ変異体は、低基質濃度におけるスクリーニングに基づいて、本発明の方法により生成させた。易エラー性PCR(Cadwell,R.C.and Joyce,G.F.、PCR Methods Appl.2(1992)28-33)により、比較的特異性が低い(s=0.82)枯草菌由来のアルカリプロテアーゼサブチリシンEに関連するプロテアーゼ変異体の集団を生成した。これは、150〜200μMの範囲内にある比較的高いKMに相関する。プロテアーゼ変異体の集団は、10nMの範囲の基質濃度を用いた共焦点蛍光スペクトル分析により106変異体のコンプレキシティーでスクリーニングした。この初回のスクリーニングで単離された変異体を、別のプロテアーゼ変異体集団を得るための第2のサイクルにおける第1プロテアーゼとして使用した。同様にして、次のサイクルで単離された変異体をその後のサイクルにおける第1プロテアーゼとして使用した。第2のサイクル及びその後の全サイクルにおいて得られた変異体の集団は、易エラー性PCR(上記参照)及びインビトロ相同的組換え(WO0134835による)の組み合わせにより生成させた。本操作法の最初の4サイクルから単離された変異体を速度論的に分析した。4ラウンドにわたる基質に対する親和性の増大は、図9に示す各サイクルの最良の性能のKMの低下に対応する。
組織型プラスミノーゲン活性化物質(t-PA)の特異性に対して特異性が変化したプロテアーゼを本発明の方法により生成した。S. cerevisiae由来のBAR1プロテアーゼ(配列番号8)を第1プロテアーゼとして使用した。本プロテアーゼはアスパラギン酸プロテイナーゼのグループに属する(MacKayら,;Structure an Function of the Aspartic Proteinases (1991)161-172)。これは、アミノ酸配列WLQLKPGQを含むペプチド基質に対して特異的であり、第2のロイシンとリジン残基との間のペプチド結合における切断を触媒する。BAR1プロテアーゼ又はその後のスクリーニングサイクルにおいて単離されるプロテアーゼに関連するプロテアーゼ変異体の集団は、易エラー性PCR(Cadwell,R.C.and Joyce,G.F.、PCR Methods Appl.2(1992)28-33)及び組換え連鎖反応を用いたインビトロ相同的組換え(WO0134835)により生成させた。プロテアーゼ変異体は、共焦点蛍光スペクトル分析により106変異体のコンプレキシティーでタンパク質分解活性についてスクリーニングした。第1プロテアーゼとして使用したBAR1プロテアーゼは、既に、標的特異性の範囲で特異性が比較的高かった。従って、親和性方法と中間的方法の組み合わせを使用した。低濃度におけるスクリーニングはプロテアーゼの特異性を高いまま維持し、中間的基質に対するスクリーニングは新しい特異性を目標とした進化が可能となった。4種の中間的基質を構築した。中間的基質1はアミノ酸配列WLGLVPGGを有し、中間的基質2はアミノ酸配列WLGQVPGGを有し、中間的基質3はアミノ酸配列WLGRVPGGを有し、そして中間的基質4はアミノ酸配列WLGRVVGGを有していた。t-PAの標的基質特異性はアルギニン残基と第1のバリン残基との間の切断を有するCPGRVVGGを指向している。全基質を表IVに示す。
Claims (17)
- 標的基質特異性を有する配列特異的プロテアーゼを生成するための方法であって、下記工程:
(a)1個の第1プロテアーゼ変異体、又は、第1プロテアーゼ2個若しくはそれ以上の変異体若しくはキメラを含むプロテアーゼの集団を提供し、ここで前記第1プロテアーゼは第1ペプチド基質の特定のアミノ酸配列に対して基質特異性を有するものであり;
(b)標的ペプチド基質のアミノ酸配列に類似しているが第1ペプチド基質内に存在しない少なくとも1個の特異的アミノ酸配列を含む1個又はそれ以上の第2基質に、前記プロテアーゼ集団を接触させ;及び、
(c)第2基質内の前記特異的なアミノ酸配列1個を好ましくは認識して加水分解するプロテアーゼを同定することを可能とする条件下で、工程(b)において提供された第2基質の前記特異的アミノ酸配列に対して特異性を有する工程(a)において提供されたプロテアーゼの集団から1個又はそれ以上のプロテアーゼ変異体を選択すること;
を含む、前記方法。 - 工程(c)における選択条件が下記:
(i)低基質濃度下でプロテアーゼ活性をスクリーニングし、それにより、第2基質に対する親和性を増大させること、
(ii)比較において2個又はそれ以上の基質を用いることによりプロテアーゼ活性をスクリーニングし、それにより酵素の選択性を増大させること、
(iii)第2のペプチド以外のペプチドを過剰に添加することによりプロテアーゼ活性をスクリーニングし、それにより、競合物として添加したペプチドを使用すること、又は、
(iv)これらのいずれかの組み合わせ、
により達成される、請求項1に記載の方法。 - 第2基質に対する特異性を有する1個又はそれ以上のプロテアーゼ変異体が同定されるまで工程(a)〜(c)を循環的に反復し、そして、1つのサイクルにおいて選択されたプロテアーゼ変異体をその後のサイクルにおける第1プロテアーゼとして使用し、そして、少なくとも1サイクル〜100サイクル未満で実施する、請求項1又は2に記載の方法。
- 1サイクル以上において1個の第2基質のみを使用し、ここで、第2基質は標的基質と同一である、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 異なる第2基質を使用し、ここで、第2基質は第1基質及び標的基質に関して中間的な特質を有するものであり、そして、使用される最後の第2基質は標的基質と同一である、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 異なる第2基質を連続するサイクルにおいて使用し、そして、各第2基質は先に使用された第2基質及び標的基質に関して中間的な特質を有する、請求項5に記載の方法。
- 少なくとも1サイクルにおいて工程(b)〜(c)を異なる第2基質を並行して用いて実行し、そして、このような並行方式において単離されたプロテアーゼ変異体を組合わせ、次のサイクルにおいて第1プロテアーゼとして使用する、請求項5又は6に記載の方法。
- 中間的基質の中間的特質が下記:
(i)アミノ酸組成、
(ii)アミノ酸配列、
(iii)特定のアミノ酸配列内のアミノ酸残基の物理的及び/又は化学的特性、ここで好ましくは以下のアミノ酸の特性、即ち、表面、体積、等電点、側鎖pKa、電荷、極性、疎水性よりなる群から選択される1個又はそれ以上の特性が使用される上記特性、
(iv)これらのいずれかの組み合わせ、
に基づくものである、請求項5から7のいずれかに記載の方法。 - 前記第2基質は前記1〜5における第1基質と異なっており、好ましくは特定のアミノ酸配列内のアミノ酸残基が置換されている、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1から9のいずれか1項に記載の方法であって、第2基質が、前記基質の加水分解の検出を可能にする官能基を担持しており、前記官能基は下記:
(i)ペプチドの加水分解によりスペクトル特性が変化する1個又はそれ以上の蛍光団又は発色団であって、これにより、スペクトル特性の変化の測定によりスクリーニングを実施するもの;又は、
(ii)蛍光特性により識別可能であり、第2基質の両端に結合している2個の蛍光団であって、これにより、1μM未満の蛍光団濃度において共焦点蛍光スペクトル分析によりスクリーニングを実施するもの;又は、
(iii)蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)対を形成し、第2基質の両端に結合している2個の蛍光団であって、これにより、2個の蛍光団の間のエネルギー移動の低下の測定によりスクリーニングを実施するもの;又は、
(iv)第2基質にフランキングする第1及び第2の自己蛍光タンパク質であって、これにより、1μM未満の基質濃度における共焦点蛍光スペクトル分析によりスクリーニングを実施するもの;又は、
(v)第2基質の両端に結合した蛍光団及びクエンチャー分子であって、これにより、蛍光団のクエンチングの減少の測定によりスクリーニングを実施するもの;又は、
(vi)第2基質の両端に結合した蛍光団又は発色団及び結合部分であって、これにより特異的結合相手への結合部分の結合の測定によりスクリーニングを実施するもの;又は、
(vii)第2基質の両端に結合した放射標識及び結合部分であって、これにより、シンチレーションプロキシミティー試験の使用によりスクリーニングを実施するもの;又は、
(viii)これらのいずれかの組み合わせ、
である、前記方法。 - 請求項1から10のいずれか1項に記載の方法であって、
(i)ランダム核酸突然変異誘発、カセット突然変異誘発、部位飽和突然変異誘発、部位特異的又はランダム挿入及び/又は欠失突然変異誘発、相同的インビトロ組換え、相同的インビボ組換え、非相同的組換え又はこれらの組み合わせによりプロテアーゼの集団が得られ;及び/又は、
(ii)プロテアーゼの発現は好ましくは細菌、酵母、昆虫、ウイルス又は哺乳類起源の宿主細胞の使用により行われるか、又は、無細胞タンパク質発現系の使用により行われ、及び/又は、
(iii)プロテアーゼの遺伝子型及び表現型のカップリングが試料の区画化を可能とする試料キャリアの使用により達成され、そして、試料キャリアへの遺伝子型の分布が表現型の十分な分化を可能にする区画当たりの多重度において行われる、
前記方法。 - 請求項1から11のいずれかに記載の方法であって、第1プロテアーゼがセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ及びメタロプロテアーゼよりなるプロテアーゼ群から選択され、そして、第1プロテアーゼが好ましくはパパイン、ブロメライン、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、サブチリシン、SET、ヒトエラスターゼ、カテプシン、キマーゼ、サッカロマイコプシス・フィブリゲラPEP I、カリクレイン、ウロキナーゼ、サーモリシン、コラゲナーゼ、シュードモナス・アエルギノーサ エラスターゼ、TEVプロテアーゼ、HIV-1プロテアーゼ、BAR1プロテアーゼ、第Xa因子、トロンビン、組織型プラスミノーゲン活性化物質、Kex2プロテアーゼ、TVMV−プロテアーゼ、RSVプロテアーゼ、MuLVプロテアーゼ、MPMVプロテアーゼ、MMTVプロテアーゼ、BLVプロテアーゼ、EIAVプロテアーゼ、SIVmacプロテアーゼよりなるプロテアーゼ群から選択される、前記方法。
- 標的プロテアーゼが組織型プラスミノーゲン活性化物質と類似の特異性を有し、そして、標的基質CPGR↓VVGGを切断する、請求項1から12のいずれか1項、好ましくは請求項5から12のいずれか1項に記載の方法。
- 出発プロテアーゼがS. cerevisiae由来のBAR1プロテアーゼであり、好ましくは以下:
(i)WLGLVPGG
(ii)WLGQVPGG
(iii)WLGRVPGG
(iv)WLGRVVGG
(v)CPGRVVGG
の第2/中間的基質を利用する、請求項13に記載の方法。 - 請求項1から14のいずれか1項に記載の方法、好ましくは請求項13又は14に記載の方法により得られうる配列特異的プロテアーゼ。
- 組織型プラスミノーゲン活性化物質と類似の特異性を有し、標的基質CPGR↓VVGGを切断し、そして、S. cerevisiae由来のBAR1プロテアーゼから誘導される、配列特異的プロテアーゼ、好ましくは請求項15に記載の配列特異的プロテアーゼ。
- 前記配列特異的プロテアーゼが配列番号8に示す配列を有する野生型(wt)BAR1プロテアーゼ、又は、C末端において200aaまで切断されたその修飾型から誘導され、そして、好ましくはそのアミノ酸配列内に、BAR1プロテアーゼのナンバリングに基づいて改変体L33I、Y45D、T47A、T59I、N82D、E96V、M107I、N123D、E143D,N151V、I152F、K161E、A163T、T165A、R178S、T221I、E231V、D321N、D367G、M369L、V370I、A399S、K404R及びS440Lよりなる群から選択される少なくとも1個の突然変異を有する、請求項16に記載の配列特異的プロテアーゼ。
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