JP7386552B2 - プロテアーゼバリアントのスクリーニング方法および得られたプロテアーゼバリアント - Google Patents
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Description
本出願は、2018年10月10日に出願された、発明の名称が「TEVプロテアーゼバリアント、その融合タンパク質、調製方法および使用」である、出願番号がCN201811177105.9である中国特許出願と、2018年12月17日に出願された、発明の名称が「プロテアーゼバリアントのスクリーニング方法および得られたプロテアーゼバリアント」である、出願番号がCN201811540344.6である中国特許出願との優先権を主張するものであり、それらの全体を参照により本出願の一部をなすものとして引用する。
本発明は、タンパク質分野に関し、具体的に、プロテアーゼバリアントのスクリーニング方法およびTEVプロテアーゼバリアントに関する。
(1)プロテアーゼランダム変異ライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ウイルスライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ファージライブラリーを構築する工程;
(2)前記のプロテアーゼランダム変異ライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ウイルスライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ファージライブラリーについて、宿主内または同様の条件下でプロテアーゼの酵素切断活性が弱く、且つ生体外変性条件下でプロテアーゼの酵素切断活性を有するプロテアーゼバリアントをスクリーニングする工程;および
(3)必要に応じて、プロテアーゼバリアントを同定する工程;
ここで、前記のプロテアーゼは、好ましくは、TEVプロテアーゼまたはエンテロキナーゼである。
フォワードプライマー:5’-CCACCATGGCCGGTCTGAATGATATTTTTGAAGC-3’
リバースプライマー:5’-TTGTTCTGCGGCCGCAAATTCCAGC-3’
配列番号1に示される配列の第111位に対応する位置でのロイシン(L)からフェニルアラニン(F)またはヒスチジン(H)への変異;
配列番号1に示される配列の第138位に対応する位置でのイソロイシン(I)からリジン(K)への変異;
配列番号1に示される配列の第28位に対応する位置でのヒスチジン(H)からロイシン(L)への変異;
配列番号1に示される配列の第196位に対応する位置でのグルタミン酸(Q)からヒスチジン(H)への変異;
配列番号1に示される配列の第135位に対応する位置でのセリン(S)からグリシン(G)への変異;および
配列番号1に示される配列の第187位に対応する位置でのメチオニン(M)からイソロイシン(I)への変異。
配列番号1に示される配列の第111位に対応する位置でのロイシン(L)からフェニルアラニン(F)への変異、および配列番号1に示される配列の第138位に対応する位置でのイソロイシン(I)からリジン(K)への変異;
配列番号1に示される配列の第28位に対応する位置でのヒスチジン(H)からロイシン(L)への変異、配列番号1に示される配列の第111位に対応する位置でのロイシン(L)からフェニルアラニン(F)への変異、および配列番号1に示される配列の第196位に対応する位置でのグルタミン酸(Q)からヒスチジン(H)への変異;ならびに
配列番号1に示される配列の第111位に対応する位置でのロイシン(L)からヒスチジン(H)への変異、配列番号1に示される配列の第135位に対応する位置でのセリン(S)からグリシン(G)への変異、および配列番号1に示される配列の第187位に対応する位置でのメチオニン(M)からイソロイシン(I)への変異;
好ましくは、前記のTEVプロテアーゼバリアントは、配列番号1に示される配列の第219位に対応する位置でのセリン(S)からバリン(V)への変異を含み;
好ましくは、前記のTEVプロテアーゼバリアントは、宿主での発現において低い酵素切断活性を有し、好ましくは配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するS219Vバリアントよりも低い酵素切断活性を有すること、および/または前記のTEVプロテアーゼバリアントは、中/高程度の変性条件下で、好ましくは3M~5Mの尿素、好ましくは3.5M~4.5Mの尿素、より好ましくは4Mの尿素または1M~2Mのグアニジン塩酸塩、好ましくは1.5Mのグアニジン塩酸塩の生体外環境下で、高い酵素切断活性を有し、好ましくはS219Vバリアントの生体外酵素切断活性を保持することという条件下で、前記のTEVプロテアーゼバリアントは、上記の変異以外の1つまたは複数の変異をさらにを含む。
(1)本発明の細胞の培養に適した条件下で、培地中で前記の細胞を培養する。
(2)培地を回収するか、または細胞を溶解して、ライセートを回収する。
(3)精製して前記のプロテアーゼバリアント、好ましくはTEVプロテアーゼバリアントを得る。
(1)本発明の融合タンパク質を適当な条件下で培地中で培養する。
(2)融合タンパク質の封入体を得る。
(3)約8Mの尿素または約6Mのグアニジン塩酸塩のような高変性条件下で、封入体を溶解する。
(4)中/高程度変性条件下、好ましくは3M~5M尿素、好ましくは3.5M~4.5M尿素、より好ましくは4M尿素または1M~2Mグアニジン塩酸塩、好ましくは1.5Mグアニジン塩酸塩の条件下で、一定の温度、例えば20~40℃、好ましくは25℃で、例えば10~24時間、例えば12時間インキュベートする。
(5)緩衝液、例えばTris-HCl、好ましくは50mMのTris-HClで希釈した後、プロテアーゼバリアント、好ましくはTEVプロテアーゼを沈殿させる。
(6)プロテアーゼバリアント、好ましくはTEVプロテアーゼの沈殿物を遠心分離で除去し、前記の標的ポリペプチドを得る。
(7)前記の標的ポリペプチドを精製し;好ましいは、前記の精製は、塩析、限外濾過、有機溶媒沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーカラム、逆相高速液体クロマトグラフィーからなる群から選択される技術によって実施される。
1.本発明のTEVプロテアーゼバリアントは、天然のN末端を有する様々なポリペプチドまたはタンパク質を産生するために広く使用される。
2.本発明のTEVプロテアーゼバリアントは、スクリーニングにより得られるが、直接得られた変異体は、要件を満たすことができないか、または部分的に要件を満たす。一連の変異点の組み合わせにより、さらに改善された独特の特性を備える改良型突然変異体を得ることが可能である。例えば、L111Fと他の変異点との組み合わせは、生体内活性がないかまたは極めて低いが、中程度の生体外変性条件下ではより高い活性を有することを特徴とする。
3.本発明の方法は、標的タンパク質を発現させるために、DNA組換え技術および原核生物発現系を採用しており、幅広い適用性を有する。
4.ブタ下垂体からACTHを抽出する方法と比較して、本発明の方法を使用してヒトまたはブタ由来のACTHを調製する場合の製造コストは、従来のブタの脳からの抽出による製造技術の製造コストよりも数百倍も低くすることができる。この方法は、生産サイクルを大幅に短縮し、生産時間およびコストを節約し、ブタの下垂体を得るために大量のブタの屠殺に依存する必要がなくなり、ブタ由来のACTHの使用による免疫原性アレルギー反応のリスクを回避し、薬の安全性を大幅に向上させることができる。また、本発明の方法で調製されたACTHは、人体から分泌されるACTHと全く同じものであるため、アミノ酸配列の精度および製品の純度が極めて高く、優れた生物活性を持ち、薬効を向上させ、副作用の発生を抑えることができる。本方法は、有機合成法に比べて、ヒト由来の全長ACTHの調製の難易度およびコストを大幅に低減し、操作が簡単で、高価な触媒や高圧装置を必要とせず、収率が高く、大量生産に適している。つまり、本方法は、製造プロセスが明確で簡単であり、再現性が良く、大規模生産の実現が容易であり、環境汚染を低減することができる。
TEVプロテアーゼは、融合タンパク質を効率的に切断するためによく用いられるが、切断は両方が可溶性である場合に限られている。現在、ほとんどのポリペプチド薬は、溶解性が悪く、通常、封入体として発現しており、TEVプロテアーゼの切断条件と一致しない。封入体は、高濃度の尿素またはグアニジン塩酸塩で溶解させる必要があるが、このような条件での切断が極めて困難である。従来のTEVプロテアーゼは、基質と同条件下で、効率的な切断活性と、同時溶解とを両立させることが困難であった。
本発明において、大容量のTEVランダム変異ファージライブラリーが構築され、その重要な遺伝子構造はAvi-TEV-sTEV-Y1-PIIIであり、即ち、プロテアーゼがこのような形でファージPIIIタンパク質の末端に提示される。ここで、Avi tagは、15個のアミノ酸残基からなる短いペプチドタグ(GLNDIFEAQKIEWHE)であり、生体内または生体外においてビオチンリガーゼによってリジン残基(K)で1つのビオチンに結合されることで、タンパク質のビオチン化を達成し、さらに、ビオチン化されたタンパク質は、ストレプトアビジンに特異的に結合することができる。これらの2つの反応に基づいて、本発明のTEVファージは、生体内でビオチン化され、ビオチン化されたファージライブラリーは、ストレプトアビジン磁気ビーズで固定化することができる。理想的な条件下では、細胞内で発現したときに酵素切断活性を有するTEVバリアントは、発現過程で自己切断され、その結果、最終的に組み立てられたファージPIIIタンパク質の末端にAvi tagなしで、ポリペプチドY1のみを有し、磁気ビーズによって捕捉されない。また、細胞内で発現したときに酵素切断活性を有しないTEVバリアントは、発現過程で自己切断が起こらず、最終的に組み立てられたファージPIIIタンパク質の末端はAvi-TEV-sTEV-Y1であり、N末端のAvi tagはビオチン化されており、ストレプトアビジンを含む磁気ビーズで捕捉することができる。磁気ビーズに捕捉されたファージは、中/高濃度の尿素中でインキュベートされる。このような条件下で酵素切断を受けたファージは、自己切断により磁気ビーズから脱落し、溶液に入る。この溶液を回収することで、最初の標的ファージが得られる。これを増殖した後に、次回のスクリーニングに供する。数回のスクリーニングの後、生体内で酵素切断活性が弱く、且つ生体外変性条件下で酵素切断活性を有するTEVプロテアーゼバリアントがエンリッチ化される。遺伝子配列解析により、発現ベクターにクローニングした後に1つずつ確認できるエンリッチ化された配列を得る。それにより、本発明のTEVバリアントをスクリーニングする。
酵素切断活性は、SDS-PAGEゲルの結果に基いて算出することができる。具体的には、TEVプロテアーゼバリアントの封入体を10倍希釈した後、10%のβ-メルカプトエタノールを含む5×SDSローディング緩衝液を添加し、100℃で5分間煮沸し、ローディングしてゲルで電気泳動を行う。終了後、ゲルをクマシーブリリアントブルー染色液に入れて30分間染色した後、クマシーブリリアントブルー脱色液に入れ、背景が無色になるまで約20分間加熱して脱色する。次に、ゲルをゲルイメージングシステムに設置して撮影する。取得した画像をImage Jソフトウェアで処理し、バンドのグレー値を定量する。生体内酵素切断活性=1-融合タンパク質バンドのグレー値/(融合タンパク質バンドのグレー値+Avi-TEVバンドのグレー値*融合タンパク質の分子量/Avi-TEVの分子量)。
生体外酵素切断効率=1-酵素切断後の融合タンパク質バンドのグレー値/酵素切断前の融合タンパク質バンドのグレー値
実施例1:TEVプロテアーゼバリアントの取得
1. 大容量TEVプロテアーゼランダム変異ライブラリーの構築
1.1 実験材料
大腸菌TG1:supE hsd Δ5thiΔ(lac-proAB)F’[traD36proAB+lacIq lacZΔM15](Bio-viewshine Bio Technology社から購入)。ファージミドベクターpHEN1(BioVector NTCC plasmid vector strain cell gene collection centerから購入、カタログ番号Biovector786623)。DNAポリメラーゼ、T4 DNAリガーゼ、制限エンドヌクレアーゼはInvitrogen Trading社から購入した。プラスミド抽出キットおよびアガロースゲルDNA回収キットは、Tiangen Biotechen(Beijing)社から購入した。ランダム変異誘発キット(GeneMorph II Random Mutagenesis Kit)はAgilent Technologies社から購入した。プライマーの合成および遺伝子配列の決定は、Nanjing Genscript Biotech Corporationで行った。
1.2.1 ランダムミューテーションPCRによるTEVP DNA断片の調製
TEVP S219V遺伝子の大範囲のランダム変異は、pQE30-TEV(S219V)(この27kDaのTEV NIaプロテアーゼバリアント遺伝子は、Nanjing Genscript社により合成され、pQE30ベクターのBamH1とHindIIIの間にクローニングされた)をテンプレートとして使用したランダム変異誘発キット(GeneMorph II Random Mutagenesis Kit)で行った。PCRプライマーは、以下の通りである。
TEV-F:5-AATCTCGAGGGATCTAAAGGTCCTGGAGAAAGCTTGTTTAAGGGACCAC-3
TEV-R:5-AATGGATCCTTGCGAGTACACCAATTC-3
ファージミドベクターpHEN1(BioVector NTCC plasmid vector strain cell gene collection centerから購入、カタログ番号Biovector786623)を線形化する前に、修飾を行った。まず、Aviタグ配列であるGLNDIFEAQKIEWHEをシグナルペプチドの下流に挿入し、得られた融合タンパク質をビオチン化してから、ストレプトアビジン磁気ビーズで固定化した。pET28b-PD1-Avi(Nanjing Genscript社で合成した。遺伝子構造はNco1-PD1遺伝子-Not1-BamHI-GGGSリンカー-aviタグ-Xho1である。PD1遺伝子のGenebankアクセッション番号は、NM_005018である。プラスミドマップを図7に示す。)を、AviタグのPCR増幅用テンプレートとして使用し、PCRプライマーは次のとおりである。
Avi-F:5-ACTCCATGGCCGGTCTGAATGATATTTTTGAAGC-3
Avi-R:5-AATCTCGAGCTCGTGCCACTCGATTTTCTG-3
ACTH-F:AATCTCGAGGGATCTGGATCCGGAGGTGGCGGTAGCGAAAATCTGTATTTTCAGAGCTATAGCATGGAAC-3
ACTH-R:5-AATGCGGCCGCAAATTCCAGCGGAAATGC-3
消化して回収したベクター(pHEN1-Avi-sTEV-ACTH)を、インサートフラグメント(ランダムに変異したTEVP遺伝子)と1:3、1:5、1:10でライゲーションした。具体的に、まず、ベクターpHEN1-Avi-sTEV-ACTHを調製(1.2.2 線形化されたベクターの調製を参照)し、次に、インサートフラグメントを調製(1.2.1 ランダムミューテーションPCRによるTEVP DNA断片の調製を参照)し、両方をT4 DNAリガーゼ(Thermo Fisher Scientific)でライゲーションして、pHEN1-Avi-TEVp-sTEV-ACTHを得た。ライゲーションシステムはキットのプロトコールに従った。20μl反応系を例にとると、PCRチューブに、150ngの線形化されたベクター、対応する量のインサートフラグメント(ベクターに対するモル比は1:3または1:5または1:10)、2μlの10×T4 DNAリガーゼバッファー、1μlのT4 DNAリガーゼを順次に添加し、最後にddH2Oで容量を20μlになるように容量を調整した。形質転換によって生成されたクローンの数を計算することにより、最適なライゲーション比は1:5であると判定された。プラスミドマップを図9に示す。最適なライゲーション比は1:5であると判定された。異なる濃度のライゲーション生成物を用いて形質転換を行い、最適な形質転換生成物量を0.2μg(10μl)と判定した。ライゲーション生成物をフェノール-クロロホルム抽出で精製し、タンパク質および塩イオンを除去して、ddH2Oに溶解した。
電気穿孔法によりライゲーション生成物を宿主細菌TG1にトランスフェクトした。電気形質転換用コンピテント細胞の調製方法は、分子クローニング実験ガイド(第3版)に従った。10μlのライゲーション生成物を200μlの電気形質転換用コンピテント細胞と穏やかに混合して、氷浴に2分間入れ、0.2cmの孔隙を備えた予冷した電気形質転換キュベットに移して電気形質転換を行った。電気形質転換装置(Bio-Rad Gene-Pulser)のパラメーターは、2.5KV、25μF、200Ωであった。電撃した後、直ちに1mlのSOC培地を加え、吸い出した後、1mlのSOC培地で電撃キュベットを2回濯いだ。3mlの細菌液を合わせ、37℃、200rpmで45~60分間振とうした。10-2、10-3、および10-4の勾配で細菌液を希釈し、各勾配で100μlの菌体を採取して、SOC(25μg/mlのカルベニシリンを含む)の小プレートに広げ、残量を5000×gで5分間遠心分離し、菌体を回収した。再懸濁した後に、SOC(25μg/mlカルベニシリンを含む)の正方形の大きなプレート(25×25cm)に広げた。倒立したプレートを37℃で12~16時間インキュベートした後、小プレートでカウントを行った。そして、2YT培地で大プレート上のコロニーをすすぎ、塗布ロッドで軽く掻き取り、最終濃度が50%になるようにグリセロールを加えた後、チューブに分注し、-80℃で凍結保存した。ライブラリー容量の計算方法:容量プレート上のクローン数*希釈倍率*希釈前の細菌液の総体積。ライブラリー容量が1×109以上になるまで、電気形質転換を数回繰り返した。
一部の元の細菌クローンをランダムに選択し、コロニーPCRによって組換えプラスミドを検証した。PCR検証プライマーは次の通りである。
フォワードプライマー:5-CCACCATGGCCGGTCTGAATGATATTTTTGAAGC-3
リバースプライマー:5-TTGTTCTGCGGCCGCAAATTCCAGC-3
PCR陽性の組換えプラスミドを配列決定を委託(Genscript Biotechnology社)し、構築されたライブラリーのランダム性、ライブラリー容量、および存在度を評価した。
ベクターとインサートフラグメントとのモル比は1:5であり、10μlのライゲーション生成物を利用して電気形質転換を行った。形質転換効率は9×108cfu/μgDNAである。複数回の形質転換を組み合わせた容量は2.02×109で、スクリーニングのニーズを満たした。ペプチドライブラリーから20個のクローンをランダムに選び、配列を決定した。結果(表1)は、全体的な変異頻度が中/低程度(1.5~7個/kb)であることを示す。実際の値と理論値の間には一定の偏差がある。考えられる理由の1つは、同義突然変異がカウントされていないことであり、もう1つは、サンプル数が少ないことである。配列決定用サンプルの数が増えるにつれて、このような偏差は減少していく。上記の結果は、構築されたTEVPランダムファージライブラリーが、基本的なフレームワーク、ライブラリー容量、および多様性の観点から、設計要件を満たしたことを示す。
2.1 実験材料
HRP-M13抗体はBeijing Sino Biological社から購入し、96ウェルELISAプレートおよびELISA試薬はSangon Biotech(Shanghai)社から購入し、ストレプトアビジン磁気ビーズはNEBから購入し、D-ビオチン、IPTGなどの試薬はSangon Biotech(Shanghai)社から購入した。
少なくとも1つのライブラリー容量の細菌を採取し、2xYT-CG(2xYT+100μg/mlカルベニシリンおよび2%グルコース)を含む2L三角フラスコに、初期OD600値=約0.1になるように加え、OD600が約0.5になるまで37℃、200rpmで振とうした。ヘルパーファージM130K07(Beijing Bio-viewshine Bio Technology社から購入)を加えて感染(MOI=20)させ、100rpmでゆっくり回転させながら37℃で1時間インキュベーションを続けた。その後、遠心分離(2000×gで20分間)により細菌を回収し、上清を可能な限り除去して廃棄した。1Lの2xYT-CK(2xYT+100μg/mlカルベニシリンおよび50μg/mlカナマイシン+200μmD-ビオチン)で菌体を再懸濁し、250rpm、25℃で一晩インキュベートした。翌日、パッケージされたファージを回収して精製した。細胞培養物を750mlの遠心分離ボトルに移し、氷中でわずかに冷却した。次に、大型ベンチトップ遠心分離機によって4500rpm、4℃で30分間遠心分離した。上清が濁った場合は、別の清潔なボトルに移し、このステップを繰り返した。上層の80%の上清(細胞ペレットを攪拌しないように)を別の新しい750ml遠心分離ボトルに移し、1/6容量のPEG/NaCl溶液(20%[w/v]のPEG-8000、2.5MのNaCl)を加え、混合した後、氷中に少なくとも2時間放置し、4500rpm、4℃で30分間遠心分離した。すべての上清を注意深く取り除き、10mlのPBSを加えた。ピペットで沈殿物を再溶解させ、2mlのEPチューブに移した。15000×g、4℃で20分間遠心分離して、残った菌体や破片を取り除いた。ピペットで上清を新しいEPチューブに注意深く移し、そこに1/6容量のPEG/NaCl溶液を加え、氷上に1時間置いてファージを再び沈殿させた後、15000×g、4℃で20分間遠心分離し、ファージ沈殿物を回収した。すべての上清を注意深く取り除き、廃棄した。さらに、ファージ沈殿物を適量のPBSで再溶解し、完全に溶解した後、15000×g、4℃で10分間遠心分離して、残った不溶性不純物を除去した。上清を新しいEPチューブに分注し、50%のグリセリンを加え、-80℃で長期間保存した。
Carol M Y Leeらの方法(M Y Lee,Carol & Iorno,Niccolб & Sierro,Frederic & Christ,Daniel.(2007).Selection of human antibody fragments by phage display.Nature protocols.2.3001-8.10.1038/nprot.2007.448.)に参照して、ファージライブラリーを2×YTで勾配希釈した。10-9、10-10、および10-11の希釈液について、それぞれ10μlを採取し、対数増殖期まで培養した新鮮なTG1細菌液200μlに加え、均一に混合し、37℃で30分間インキュベートし、2×YT-CGを含むプレートにすべて広げた。プレートを30℃のインキュベーター内で一晩インキュベートし、翌日、単一コロニーの数をカウントし、力価を算出した。
本発明のTEVPバリアントをパンニングする原理は以下の通りである。Aviタグは、15アミノ酸残基(GLNDIFEAQKIEWHE)で構成される短いペプチドタグであり、生体内および生体外の両方でもビオチンリガーゼによってリジン残基にビオチンをライゲーションすることにより、タンパク質のビオチン化を実現する。ビオチン化タンパク質は、特にストレプトアビジンによって結合される。これらの2つの反応に基づいて、本発明のTEVpファージは、生体内でビオチン化することができ、ビオチン化ファージライブラリーは、ストレプトアビジン磁気ビーズで固定化することができる。理想的な条件下では、細胞内で酵素切断活性を持つTEVPバリアントは、発現プロセスにおいて自己切断され、その結果、最終的に組み立てられたファージPIIIタンパク質は、末端にACTHのみを有し、Aviタグを有しないため、磁気ビーズで捕捉することができない。一方、細胞内で発現させた場合、酵素切断活性を有しないTEVPバリアントは、発現プロセスにおいて自己切断をすることがなく、その結果、最終的に組み立てられたファージPIIIタンパク質は、末端がAvi-TEVP-sTEV-ACTHであり、N末端のAviタグがビオチン化されているため、ストレプトアビジンを含む磁気ビーズで捕捉することができる。磁気ビーズによって捕捉されたファージは、中/高濃度の尿素中でインキュベートされる。生理学的条件下で不溶性であるTEVPバリアントは、この条件下で溶解してその活性を回復し、酵素切断ができる。この条件下で消化されたファージは、自己切断により磁気ビーズから脱落し、溶液に入る。溶液を回収して、最初の標的ファージを取得し、増幅した後、次のスクリーニングを行うことができる。数回のスクリーニングの後、弱い生体内酵素切断活性を有し、且つ生体外変性条件下で酵素切断活性を有するTEVプロテアーゼバリアントがエンリッチ化される。遺伝子配列解析により、発現ベクターにクローニングした後に1つずつ確認できるエンリッチ化された配列を得る。各回のパンニング結果を以下の表2に示します。
(1)ファージの固定化:清潔な2mlのEPチューブで、100倍のライブラリー容量のファージをTBST緩衝液(50mM Tris-HCl PH7.5、150mM NaCl、0.1%[v/v]Tween-20)に希釈し、適量のストレプトアビジン磁気ビーズを添加して混合し、4℃で回転させ、20分間インキュベートした。磁石で磁気ビーズを沈殿させた後、TBSTで5回洗浄して未結合のファージを除去した。
上記の7つの候補配列を消化(Nco1/Not1)し、発現ベクターpET28b(Novagen社から購入)にクローニングし、Rosetta2(DE3)(Hunan Youbio社から購入)にトランスフェクトして発現させた。発現条件:LB培地、37℃でOD600=約0.6になるまで培養した。誘導条件:37℃で250rpmで振とうし、2mM IPTG、4時間誘導した。細菌処理:遠心分離で細菌を回収し、細菌を再懸濁し、超音波によって破壊し、遠心分離で封入体の沈殿物を回収し、封入体を洗浄し、最後に、8M尿素(50mM Tris-HCl、1mM EDTA、2mM DTT、8M尿素、pH8.0)で封入体を溶解した。
4D:S219Vの第111位のアミノ酸はロイシン(L)からフェニルアラニン(F)に変異し、第138位のアミノ酸はイソロイシン(I)からリジン(K)に変異している。
12D:S219Vの第28位のアミノ酸はヒスチジン(H)からロイシン(L)に変異し、第111位のアミノ酸はロイシン(L)からフェニルアラニン(F)に変異し、第196位のアミノ酸はグルタミン酸(Q)からヒスチジン(H)に変異している。
32C:S219Vの第111位のアミノ酸はロイシン(L)からヒスチジン(H)に変異し、第135位のアミノ酸はセリン(S)からグリシン(G)に変異し、第187位のアミノ酸はメチオニン(M)からイソロイシン(I)に変異している。
1.TEVP-ACTH融合タンパク質発現ベクターの構築
実施例1において、融合タンパク質の酵素切断によって放出されたACTHのカルボキシル末端は、実際の生産において除去される必要があるHisタグを有する。したがって、PCRによってACTH遺伝子の下流に終止コドンを導入する必要がある。具体的には、実施例1の工程3で最も効果があったTEVプロテアーゼバリアント12Dを含むプラスミドをテンプレートとして、PCRによりベクターのオープンリーディングフレームにおけるAvi-TEVP-sTEV-ACTH領域を増幅した(TEVPバリアント12Dの配列は配列番号5であり、ACTH遺伝子の配列は配列番号13である。)。増幅は、KOD-plus DNAハイフィデリティポリメラーゼ(東洋紡)を使用して行った。増幅プログラムは、95℃で2分間の前変性、98℃で10秒間の変性、60℃で30秒間のアニーリング、68℃で1分間12秒間の伸長、30サイクル増幅である。遺伝子の下流に終止コドンを導入した。プライマーは次のとおりである。
TEV-ACTH-F:5-CCACCATGGCCGGTCTGAATGATATTTTTGAAGC-3
TEV-ACTH-R:5-AGAGCGGCCGCTTATTAAAATTCCAGCGGAAATGCTTCTGC-3
構築された発現ベクターを形質転換した。具体的には、50ngのプラスミドpET-28b-TEVP-sTEV-ACTHを、対応する化学コンピテント細胞Rosetta2(DE3)に加え、氷浴に30分間入れ、42℃で45秒間加熱ショックを与え、氷浴に2分間入れた。抗生物質を含まない1mlのLB培地を添加し、37℃で1時間培養した。100μlの細菌溶液を採取して、カナマイシン(50μg/ml)+クロラムフェニコール(34μg/ml)を含むLBプレートに塗布し、単一のコロニーが出現するまで37℃でインキュベートした。
0.22μmメンブレンフィルターでACTH原液をろ過して不純物を除去し、1kの限外ろ過遠心管理(Millipore社)で濃縮しながら脱塩し、50%の硫酸アンモニウムで沈殿させた。ACTHは、溶液の上層に懸濁物を形成し、これを注意深く回収してPBSで溶解し、限外濾過によって濃縮および脱塩を行い、高純度のヒトまたはブタ由来の組換えACTHの溶液を得て、次に凍結乾燥して保存した。
精製されたACTHの分子量を質量分析計で測定した結果、測定された分子量は理論値と一致した。その結果を図10に示す。
2週齢の健康なSDラットを1%ペントバルビタールナトリウム(40mg/kg)で麻酔し、無菌状態で副腎を摘出し、皮膜と髄質を取り除き、ハンクス平衡塩溶液に入れた。1mm3の大きさにカットした後、I型コラゲナーゼおよびDNaseを含む消化液に移し、5分間隔で振とうしながら1時間消化した。ピペットを使用して数回ピペッティングすることにより細胞を機械的に分離して懸濁液を形成した。次に、これをセルシーブ(cell sieve)で濾過して50mlの遠心管に入れ、1000×gで10分間遠心分離した。上清を注意深く除去し、沈殿した細胞をハンクス溶液で2回洗浄し、最後に、20%のウシ胎児血清を含むDMEM/F12培地(Gibco)で再懸濁して、濃度を2×105個/mlに調整し、90mmシャーレに接種し、37℃、5%CO2の条件下でインキュベートした。倒立型位相差顕微鏡で副腎細胞の成長過程および形態変化を観察した。48時間の培養後、顕微鏡下で、副腎細胞は、付着して成長すること、細胞体積が増加していること、細胞体が円形または多角形になること、細胞体が大きいこと、細胞質が透明であること、細胞質中に規則的な大きさの粒子が多数存在していることが観察された。このようにして、ラット副腎皮質細胞を得た。
GESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICLVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSSDGIFWKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWGLNADSVLWGGHKVFMSKPEEPFQPVKEATQLMNELVYSQ
配列番号2(ヒトACTHアミノ酸配列)
SYSMEHFRWGKPVGKKRRPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF
配列番号3:TEVP(219V)ヌクレオチド配列
GGAGAAAGCTTGTTTAAGGGACCACGTGATTACAACCCGATATCGAGCACCATTTGTCATTTGACGAATGAATCTGATGGGCACACAACATCGTTGTATGGTATTGGATTTGGTCCCTTCATCATTACAAACAAGCACTTGTTTAGAAGAAATAATGGAACACTGTTGGTCCAATCACTACATGGTGTATTCAAGGTCAAGAACACCACGACTTTGCAACAACACCTCATTGATGGGAGGGACATGATAATTATTCGCATGCCTAAGGATTTCCCACCATTTCCTCAAAAGCTGAAATTTAGAGAGCCACAAAGGGAAGAGCGCATATGTCTTGTGACAACCAACTTCCAAACTAAGAGCATGTCTAGCATGGTGTCAGACACTAGTTGCACATTCCCTTCATCTGATGGCATATTCTGGAAGCATTGGATTCAAACCAAGGATGGGCAGTGTGGCAGTCCATTAGTATCAACTAGAGATGGGTTCATTGTTGGTATACACTCAGCATCGAATTTCACCAACACAAACAATTATTTCACAAGCGTGCCGAAAAACTTCATGGAATTGTTGACAAATCAGGAGGCGCAGCAGTGGGTTAGTGGTTGGGGATTAAATGCTGACTCAGTATTGTGGGGGGGCCATAAAGTTTTCATGGTTAAACCTGAAGAGCCTTTTCAGCCAGTTAAGGAAGCGACTCAACTCATGAATGAATTGGTGTACTCGCAA
配列番号4(4D TEVP)
GESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICFVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSSDGKFWKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWGLNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMNELVYSQ
配列番号5(12D TEVP)
GESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGLTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICFVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSSDGIFWKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAHQWVSGWGLNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMNELVYSQ
配列番号6(32C TEVP)
GESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICHVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSGDGIFWKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFIELLTNQEAQQWVSGWGLNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMNELVYSQ
配列番号7
ENLYFQS
配列番号8
ENLYFQH
配列番号9
EXXYXQ(G/S)
配列番号10(S219V)
GESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICLVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSSDGIFWKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWGLNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMNELVYSQ
配列番号11
EXXYXQS
配列番号12:sTEV(実施例で使用されたTEVp制限部位のヌクレオチド配列)
GAAAATCTGTATTTTCAGAGC
配列番号13:ACTH DNAヌクレオチド配列
AGCTATAGCATGGAACATTTTCGTTGGGGTAAACCGGTTGGTAAAAAACGTCGTCCGGTTAAAGTTTATCCGAATGGTGCAGAAGATGAATCGGCAGAAGCATTTCCGCTGGAATTT
配列番号14:TEV(4D)
GGAGAAAGCTTGTTTAAGGGACCACGTGATTACAACCCGATATCGAGCACCATTTGTCATTTGACGAATGAATCTGATGGGCACACAACATCGTTGTATGGTATTGGATTTGGTCCCTTCATCATTACAAACAAGCACTTGTTTAGAAGAAATAATGGAACACTGTTGGTCCAATCACTACATGGTGTATTCAAGGTCAAGAACACCACGACTTTGCAACAACACCTCATTGATGGGAGGGACATGATAATTATTCGCATGCCTAAGGATTTCCCACCATTTCCTCAAAAGCTGAAATTTAGAGAGCCACAAAGGGAAGAGCGCATATGTTTTGTGACAACCAACTTCCAAACTAAGAGCATGTCTAGCATGGTGTCAGACACTAGTTGCACATTCCCCTCATCTGATGGCAAATTCTGGAAGCATTGGATTCAAACCAAGGATGGGCAGTGTGGCAGTCCATTAGTATCAACTAGAGATGGGTTCATTGTTGGTATACACTCAGCATCGAATTTCACCAACACAAACAATTATTTCACAAGCGTGCCGAAAAACTTCATGGAATTGTTGACAAATCAGGAGGCGCAGCAGTGGGTTAGTGGTTGGGGATTAAATGCTGACTCAGTATTGTGGGGGGGCCATAAAGTTTTCATGGTTAAACCTGAAGAGCCTTTTCAGCCAGTTAAGGAAGCGACTCAACTCATGAATGAATTGGTGTACTCGCAA
配列番号15:TEV(12D)
GGAGAAAGCTTGTTTAAGGGACCACGTGATTACAACCCGATATCGAGCACCATTTGTCATTTGACGAATGAATCTGATGGGCTCACAACATCGTTGTATGGTATTGGATTTGGTCCCTTCATCATTACAAACAAGCACTTGTTTAGAAGAAATAATGGAACACTGTTGGTCCAATCACTACATGGTGTATTCAAGGTCAAGAACACCACGACTTTGCAACAACACCTCATTGATGGGAGGGACATGATAATTATTCGCATGCCTAAGGATTTCCCACCATTTCCTCAAAAGCTGAAATTTAGAGAGCCACAAAGGGAAGAGCGCATATGTTTTGTGACAACCAACTTCCAAACTAAGAGCATGTCTAGCATGGTGTCAGACACTAGTTGCACATTCCCTTCATCTGATGGCATATTCTGGAAGCATTGGATTCAAACCAAGGATGGGCAGTGTGGCAGTCCATTAGTATCAACTAGAGATGGGTTCATTGTTGGTATACACTCAGCATCGAATTTCACCAACACAAACAATTATTTCACAAGCGTGCCGAAAAACTTCATGGAATTGTTGACAAATCAGGAGGCGCATCAGTGGGTTAGTGGTTGGGGATTAAATGCTGACTCAGTATTGTGGGGGGGCCATAAAGTTTTCATGGTTAAACCTGAAGAGCCTTTTCAGCCAGTTAAGGAAGCGACTCAACTCATGAATGAATTGGTGTACTCGCAA
配列番号16:TEV(32C)
GGAGAAAGCTTGTTTAAGGGACCACGTGATTACAACCCGATATCGAGCACCATTTGTCATTTGACGAATGAATCTGATGGGCACACAACATCGTTGTATGGTATTGGATTTGGTCCCTTCATCATTACAAACAAGCACTTGTTTAGAAGAAATAATGGAACACTGTTGGTCCAATCACTACATGGTGTATTCAAGGTCAAGAACACCACGACTTTGCAACAACACCTCATTGATGGGAGGGACATGATAATTATTCGCATGCCTAAGGATTTCCCACCATTTCCTCAAAAGCTGAAATTTAGAGAGCCACAAAGGGAAGAGCGCATATGTCATGTGACAACCAACTTCCAAACTAAGAGCATGTCTAGCATGGTGTCAGACACTAGTTGCACATTCCCTTCAGGTGATGGCATATTCTGGAAGCATTGGATTCAAACCAAGGATGGGCAGTGTGGCAGTCCATTAGTATCAACTAGAGATGGGTTCATTGTTGGTATACACTCAGCATCGAATTTCACCAACACAAACAATTATTTCACTAGCGTGCCGAAAAACTTCATTGAATTGTTGACAAATCAGGAGGCGCAGCAGTGGGTTAGTGGTTGGGGATTAAATGCTGACTCAGTATTGTGGGGGGGCCATAAAGTTTTCATGGTTAAACCTGAAGAGCCTTTTCAGCCAGTTAAGGAAGCCACTCAACTCATGAATGAATTGGTGTACTCGCAA
配列番号17:GenBank accession No.AAB40026.1
[請求項1]
(1)プロテアーゼランダム変異ライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ウイルスライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ファージライブラリーを構築する工程;
(2)前記のプロテアーゼランダム変異ライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ウイルスライブラリー、好ましくはプロテアーゼランダム変異ファージライブラリーについて、宿主内または同様の条件下でプロテアーゼの酵素切断活性が弱く、且つ生体外変性条件下でプロテアーゼの酵素切断活性を有するプロテアーゼバリアントをスクリーニングする工程;および
(3)必要に応じて、プロテアーゼバリアントを同定する工程を含み、
ここで、前記のプロテアーゼは、好ましくは、TEVプロテアーゼまたはエンテロキナーゼである、
プロテアーゼバリアントのスクリーニング方法。
[請求項2]
ランダム突然変異誘発キットで前記の変異ライブラリーを生成することをさらに含む、
請求項1に記載の方法。
[請求項3]
工程(1)において、例えばTEVプロテアーゼテンプレート(例えば配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するS219V TEVプロテアーゼ)のような適切なプロテアーゼテンプレートをテンプレートとして、ランダム変異を行い、前記のライブラリーを構築し、
好ましくは、プロテアーゼバリアントが、宿主内または同様の条件下で、最初のプロテアーゼよりも低い酵素切断活性を有し、且つ生体外変性条件下で最初のプロテアーゼの酵素切断活性を保持し;
好ましくは、前記のTEVプロテアーゼバリアントが、宿主内または同様の条件下で、配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するS219Vプロテアーゼよりも低い酵素切断活性を有し、且つ生体外変性条件下で配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するS219Vプロテアーゼの酵素切断活性を保持する、
請求項1または2に記載の方法。
[請求項4]
プロテアーゼバリアント、好ましくはTEVプロテアーゼバリアントが、プロテアーゼ-プロテアーゼ切断配列-Y1(例えばTEVp-sTEV-Y1)を含む融合タンパク質として提示され;プロテアーゼバリアント、好ましくはTEVプロテアーゼバリアントが、ファージの表面に提示されることが好ましく;ここで、TEVpがTEVプロテアーゼであり、sTEVがTEVプロテアーゼの切断配列であり、Y1が標的タンパク質であり;好ましくは、前記のTEVプロテアーゼの切断配列がEXXYXQG/S/Hであり、ここで、Xが任意のアミノ酸残基であり、好ましくは、前記のTEVプロテアーゼの切断配列が配列番号7および8から選択される、
前記の請求項のいずれかに記載の方法。
[請求項5]
宿主内で、前記のプロテアーゼバリアント、好ましくはTEVプロテアーゼバリアントのN末端に、直接的、またはリンカーを介して間接的に部分Aを付加することを含み、
ここで、好ましくは、前記の部分Aが、親和性タグ、ビオチン、抗体、抗原、ハプテン、ポリストレプトアビジン、リガンド、受容体、核酸、酵素、基質およびアプタマーのうちの1つである、
前記の請求項のいずれかに記載の方法。
[請求項6]
前記のプロテアーゼに適した生体外条件下で、部位Aに特異的な部位Bを固定化した固体支持体とともに、部分Aを付加したファージライブラリーを一定期間インキュベートし、標的ファージを含む溶液と支持体とを分離することを含み、必要に応じて、前記の標的ファージのスクリーニングを1回以上繰り返し、
ここで、好ましくは、前記の部分Bが部分Aに特異的に結合するという条件で、部分Bが、ビオチン、抗体、抗原、ハプテン、ポリストレプトアビジン、リガンド、受容体、核酸、酵素、基質およびアプタマーのうちの1つである、
前記の請求項のいずれかに記載の方法。
[請求項7]
プロテアーゼ、好ましくはTEVプロテアーゼが、Avi-プロテアーゼ-プロテアーゼ切断部位-Y1-PIII、好ましくはpHEN1-Avi-TEVp-sTEV-Y1構築物を介してAvi-TEVp-sTEV-Y1-PIIIとして、ファージPIIIタンパク質の末端に提示され、ここで、Aviタグが15個のアミノ酸残基GLNDIFEAQKIEWHEからなる短いペプチドタグであり;好ましくは、前記のTEVプロテアーゼの切断配列がEXXYXQG/S/Hであり、ここで、Xが任意のアミノ酸残基であり、好ましくは、前記のTEVプロテアーゼの切断配列が配列番号7および8から選択され;
好ましくは、前記の酵素切断活性が、前記のプロテアーゼおよびその切断配列(例えばプロテアーゼ-プロテアーゼ切断配列-Y1)を含む融合タンパク質、好ましくは前記のTEVプロテアーゼバリアントおよびその切断配列を含む融合タンパク質、好ましくはTEVp-sTEV-Y1に対して測定されるものであり;
好ましくは、前記のスクリーニングが、宿主内で前記のプロテアーゼ、好ましくはTEVプロテアーゼランダム変異ファージライブラリーをビオチン化することを含み;
好ましくは、前記のスクリーニングが、ビオチン化されたファージライブラリーをストレプトアビジン磁気ビーズで処理し、磁気ビーズによって捕捉されたファージを中/高濃度の尿素中で一定期間インキュベートし、標的ファージを含む溶液から磁気ビーズを分離することを含み、必要に応じて、前記の標的ファージのスクリーニングを1回以上繰り返し;
好ましくは、前記のライブラリーが、コロニーPCRによって検証され、好ましくは、前記のコロニーPCRに使用されるプライマーが、
フォワードプライマー:5’-CCACCATGGCCGGTCTGAATGATATTTTTGAAGC-3’
リバースプライマー:5’-TTGTTCTGCGGCCGCAAATTCCAGC-3’
であり;
好ましくは、ライブラリーの容量は1×109以上、好ましくは2×109であり;好ましくは、全体の変異頻度は1.5~7個/kbの中/低程度である、
前記の請求項のいずれかに記載の方法。
[請求項8]
Y1がヒトまたはブタのACTHまたはGLP-1であり、好ましくは、前記の宿主が大腸菌である、
前記の請求項のいずれかに記載の方法。
[請求項9]
前記の生体外変性条件が中/高程度の変性条件であり、好ましくは3M~5Mの尿素、好ましくは3.5M~4.5Mの尿素、より好ましくは4Mの尿素または1M~2Mのグアニジン塩酸塩、好ましくは1.5Mのグアニジン塩酸塩の条件である、
前記の請求項のいずれかに記載の方法。
[請求項10]
前記のプロテアーゼバリアントは、宿主での発現において低い酵素切断活性を有し、好ましくは、前記のTEVプロテアーゼバリアントは、配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するS219Vバリアントよりも低い酵素切断活性を有し、前記のTEVプロテアーゼバリアントの切断配列はEXXYXQG/S/Hから選択され、ここで、Xが任意のアミノ酸残基であり、好ましくは、前記のTEVプロテアーゼの切断配列は、配列番号7および8から選択され;好ましくは、前記のプロテアーゼバリアントまたはTEVプロテアーゼバリアントは、中/高程度の変性条件下、好ましくは3M~5Mの尿素、好ましくは3.5M~4.5Mの尿素、より好ましくは4Mの尿素または1M~2Mのグアニジン塩酸塩、好ましくは1.5Mのグアニジン塩酸塩の生体外環境下で、最初のプロテアーゼ(例えばS219Vプロテアーゼ)の生体外酵素切断活性を保持し;好ましくは、前記の酵素切断活性は、前記のプロテアーゼバリアントおよびその切断配列(例えばプロテアーゼ-プロテアーゼ切断配列-Y1)を含む融合タンパク質、好ましくは前記のTEVプロテアーゼバリアントおよびその切断配列を含む融合タンパク質に対して測定されるものであり、好ましくは、前記のTEVプロテアーゼの切断配列がEXXYXQG/S/Hであり、ここで、Xが任意のアミノ酸残基であり、好ましくは、前記のTEVプロテアーゼの切断配列は配列番号7および8から選択される、
前記の請求項のいずれかに記載の方法によって得られるプロテアーゼバリアント。
[請求項11]
前記のTEVプロテアーゼバリアントが、
配列番号1に示される配列の第111位に対応する位置でのロイシン(L)からフェニルアラニン(F)またはヒスチジン(H)への変異、
配列番号1に示される配列の第138位に対応する位置でのイソロイシン(I)からリジン(K)への変異、
配列番号1に示される配列の第28位に対応する位置でのヒスチジン(H)からロイシン(L)への変異、
配列番号1に示される配列の第196位に対応する位置でのグルタミン酸(Q)からヒスチジン(H)への変異、
配列番号1に示される配列の第135位に対応する位置でのセリン(S)からグリシン(G)への変異、および
配列番号1に示される配列の第187位に対応する位置でのメチオニン(M)からイソロイシン(I)への変異からなる群から選択される1つまたは複数の変異を含み;
好ましくは、前記のTEVプロテアーゼバリアントが、
配列番号1に示される配列の第111位に対応する位置でのロイシン(L)からフェニルアラニン(F)への変異、および配列番号1に示される配列の第138位に対応する位置でのイソロイシン(I)からリジン(K)への変異;
配列番号1に示される配列の第28位に対応する位置でのヒスチジン(H)からロイシン(L)への変異、配列番号1に示される配列の第111位に対応する位置でのロイシン(L)からフェニルアラニン(F)への変異、および配列番号1に示される配列の第196位に対応する位置でのグルタミン酸(Q)からヒスチジン(H)への変異;ならびに
配列番号1に示される配列の第111位に対応する位置でのロイシン(L)からヒスチジン(H)への変異、配列番号1に示される配列の第135位に対応する位置でのセリン(S)からグリシン(G)への変異、および配列番号1に示される配列の第187位に対応する位置でのメチオニン(M)からイソロイシン(I)への変異からなる群から選択される変異の組合せを含み;
好ましくは、前記のTEVプロテアーゼバリアントが、配列番号1に示される配列の第219位に対応する位置でのセリン(S)からバリン(V)への変異を含み;
好ましくは、前記のTEVプロテアーゼバリアントが、宿主での発現において低い酵素切断活性を有し、好ましくは配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するS219Vバリアントよりも低い酵素切断活性を有すること、および/または前記のTEVプロテアーゼバリアントが、中/高程度の変性条件下で、好ましくは3M~5Mの尿素、好ましくは3.5M~4.5Mの尿素、より好ましくは4Mの尿素または1M~2Mのグアニジン塩酸塩、好ましくは1.5Mのグアニジン塩酸塩の生体外環境下で、高い酵素切断活性を有し、好ましくはS219Vバリアントの生体外酵素切断活性を保持することという条件下で、前記のTEVプロテアーゼバリアントが、上記の変異以外の1つまたは複数の変異をさらにを含む、
請求項10に記載のプロテアーゼバリアント。
[請求項12]
前記の相同体が、配列番号4、5または6と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;
好ましくは、前記の相同体が、配列番号4、5または6と比較して、少なくとも1個、好ましくは少なくとも2個、より好ましくは少なくとも3個、最も好ましくは少なくとも4個のアミノ酸部位の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記の相同体が、宿主での発現において低い酵素切断活性を有し、好ましくは、配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するS219Vバリアントよりも低い酵素切断活性を有し、および/または前記のTEVプロテアーゼバリアントが、中/高程度の変性条件下で、好ましくは3M~5Mの尿素、より好ましくは3.5M~4.5Mの尿素、より好ましくは4Mの尿素または1M~2Mのグアニジン塩酸塩、好ましくは1.5Mのグアニジン塩酸塩の生体外環境下で、S219Vバリアントの生体外酵素切断活性を保持する、
請求項10または11に記載のプロテアーゼバリアント。
[請求項13]
請求項10~12のいずれかに記載のプロテアーゼバリアントを含む融合タンパク質であって、
好ましくは、前記の融合タンパク質は、プロテアーゼ-プロテアーゼ切断配列-Y1、好ましくはTEVp-sTEV-Y1の構造を含み、ここで、Y1は、標的ポリペプチドであり;TEVpは、請求項10~12のいずれかに記載のTEVプロテアーゼバリアントであり;sTEVは、TEVプロテアーゼの切断配列であるEXXYXQG/Sであり、ここで、Xは任意のアミノ酸残基であり、好ましくは、前記の切断配列は配列番号7および8から選択され;好ましくは、前記の標的ポリペプチドは、ACTH、GLP-1/GLP-2、IFN-α、IFN-γ、Histatin、CCL5、SDF-1α、IGF-1、Leptin、BNP、Ex-4からなる群から選択され、好ましくはACTHであり、好ましくはヒトACTHであり、より好ましくは配列番号2に示されるアミノ酸配列のヒトACTHであり;好ましくは、プロテアーゼバリアント(例えばTEVp)はプロテアーゼバリアント切断配列(例えばsTEV)を認識して切断することができるという条件下で、プロテアーゼバリアントおよびプロテアーゼバリアント切断配列(例えばTEVpおよびsTEV)は直接接続され、または1つまたは複数のアミノ酸残基を介して接続され;好ましくは、プロテアーゼバリアント(例えばTEVp)はプロテアーゼバリアント切断配列(例えばsTEV)を認識して切断することができるという条件下で、プロテアーゼバリアント切断配列(例えばsTEV)およびY1は直接接続され、または1つまたは複数のアミノ酸残基を介して接続され、好ましくは、プロテアーゼバリアント切断配列(例えばsTEV)およびY1は直接接続され;好ましくは、前記の融合タンパク質は、タグをさらに含み、好ましくは、前記のタグは、精製タグであり;好ましくは、前記のタグは、Hisタグ、マルトース結合タンパク質(MBP)タグ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)タグ、NusAタグ、SUMOタグ、Aviタグ、T7タグ、Sタグ、Flagタグ、HAタグ、c-mycタグ、またはStrep IIタグからなる群から選択され;好ましくは、前記のタグは、融合タンパク質のN末端および/またはC末端にあり、或いはTEVpのN末端にタグはない、
融合タンパク質。
[請求項14]
請求項10~12のいずれかに記載のプロテアーゼバリアント、または請求項13に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であって、
好ましくは配列番号14~16から選択される、
ポリヌクレオチド配列。
[請求項15]
請求項14に記載のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド構築物。
[請求項16]
請求項14に記載のポリヌクレオチド配列、または請求項15に記載のポリヌクレオチド構築物を含む発現ベクターであって、
好ましくは、前記の発現ベクターが真核生物発現ベクターまたは原核生物発現ベクターであり;好ましくは、pRS314、pYES2、バキュロウイルス-S2発現系およびpcDNA3.1からなる群から選択され、或いは、好ましくは、pET系発現ベクター、pQE系発現ベクターおよびpBAD系発現ベクターからなる群から選択される、
発現ベクター。
[請求項17]
請求項14に記載のポリヌクレオチド配列、または請求項15に記載のポリヌクレオチド構築物、または請求項16に記載の発現ベクターを含む細胞であって;
好ましくは、前記の真核細胞が、サッカロマイセス・セレビシエ、昆虫細胞発現系からなる群から選択され;好ましくは、前記の原核細胞が、BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3) pLysS、Rosetta2、Rosetta2 pLysS、Tuner(DE3)、またはOrigami 2からなる群から選択される、
細胞。
[請求項18]
請求項10~12のいずれかに記載のプロテアーゼバリアント、好ましくはTEVプロテアーゼバリアントを調製する方法であって、
(1)請求項17に記載の細胞の培養に適した条件下で、培地中で前記の細胞を培養すること;
(2)培地を回収するか、または細胞を溶解して、ライセートを回収すること;
(3)精製して前記のプロテアーゼバリアント、好ましくはTEVプロテアーゼバリアントを得ることを含む、
プロテアーゼバリアント、好ましくはTEVプロテアーゼバリアントの調製方法。
[請求項19]
標的ポリペプチドの調製における、請求項10~12のいずれかに記載のプロテアーゼバリアント、好ましくはTEVプロテアーゼバリアントの使用であって、
ここで、前記のプロテアーゼバリアント、好ましくはTEVプロテアーゼバリアントおよび前記の標的ポリペプチドが、融合タンパク質として発現され、好ましくは、前記の融合タンパク質が請求項13に記載の融合タンパク質である、
プロテアーゼバリアント、好ましくはTEVプロテアーゼバリアントの使用。
[請求項20]
標的ポリペプチドを調製する方法であって、
(1)請求項13に記載の融合タンパク質を適当な条件下で培地中で培養すること;
(2)融合タンパク質の封入体を得ること;
(3)約8Mの尿素または約6Mのグアニジン塩酸塩のような高変性条件下で、封入体を溶解すること;
(4)中/高程度変性条件下で、好ましくは3M~5M尿素、好ましくは3.5M~4.5M尿素、より好ましくは4M尿素または1M~2Mグアニジン塩酸塩、好ましくは1.5Mグアニジン塩酸塩の条件下で、一定の温度、例えば20~40℃、好ましくは25℃で、例えば10~24時間、例えば12時間インキュベートすること;
(5)緩衝液、例えばTris-HCl、好ましくは50mMのTris-HClで希釈した後、プロテアーゼバリアント、好ましくはTEVプロテアーゼを沈殿させること;
(6)プロテアーゼバリアント、好ましくはTEVプロテアーゼの沈殿物を遠心分離で除去し、前記の標的ポリペプチドを得ること;
(7)前記の標的ポリペプチドを精製し、ここで、前記の精製が、塩析、限外濾過、有機溶媒沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーカラム、逆相高速液体クロマトグラフィーからなる群から選択される技術によって実施されることを含む、
標的ポリペプチドの調製方法。
Claims (37)
- (1)プロテアーゼランダム変異ライブラリーを構築する工程;および
(2)該プロテアーゼランダム変異ライブラリーについて、宿主内でプロテアーゼの酵素切断活性が最初の(initial)プロテアーゼよりも低く、且つ生体外変性条件下でプロテアーゼの酵素切断活性を有するプロテアーゼバリアントをスクリーニングする工程;を含み、
該最初のプロテアーゼは、配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するS219V TEV プロテアーゼ、または配列番号17に示されるGenBank accession No.AAB40026.1のアミノ酸配列を有するエンテロキナーゼであり、
該生体外変性条件は3M~5Mの尿素または1M~2Mのグアニジン塩酸塩であり、
該プロテアーゼバリアントは、TEVプロテアーゼバリアントまたはエンテロキナーゼバリアントである、
プロテアーゼバリアントのスクリーニング方法。 - 該プロテアーゼランダム変異ライブラリーがプロテアーゼランダム変異ウイルスライブラリーである、請求項1に記載の方法。
- 該プロテアーゼランダム変異ライブラリーがプロテアーゼランダム変異ファージライブラリーである、請求項2に記載の方法。
- 該プロテアーゼバリアントを同定する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- ランダム突然変異誘発キットで該変異ライブラリーを生成することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(1)において、配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するS219V TEVプロテアーゼをテンプレートとして、ランダム変異を行い、該ライブラリーを構築する、
請求項1~5のいずれかに記載の方法。 - 該プロテアーゼバリアントが、宿主内で該最初のプロテアーゼよりも低い酵素切断活性を有し、且つ該生体外変性条件下で該最初のプロテアーゼの酵素切断活性を保持する、請求項6に記載の方法。
- 該TEVプロテアーゼバリアントが、宿主内で配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するS219V TEV プロテアーゼよりも低い酵素切断活性を有し、且つ該生体外変性条件下で配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するS219V TEV プロテアーゼの酵素切断活性を保持する、請求項7に記載の方法。
- 該プロテアーゼバリアントが、プロテアーゼ-プロテアーゼ切断配列-Y1を含む融合タンパク質として提示され、
Y1は標的タンパク質である、
請求項1~8のいずれかに記載の方法。 - 該プロテアーゼ-プロテアーゼ切断配列-Y1がTEVp-sTEV-Y1であり、
プロテアーゼバリアントがTEVプロテアーゼバリアントであり、
ここで、
TEVpはTEVプロテアーゼであり、
sTEVはTEVプロテアーゼの切断配列であり、
Y1は標的タンパク質であり、
該TEVプロテアーゼの切断配列はEXXYXQG、EXXYXQS、またはEXXYXQHであり、
Xは任意のアミノ酸残基である、
請求項9に記載の方法。 - 該TEVプロテアーゼの切断配列が配列番号7および8から選択される、請求項10に記載の方法。
- 該プロテアーゼバリアントが、ファージの表面に提示される、請求項9~11のいずれかに記載の方法。
- 宿主内で、該プロテアーゼバリアントのN末端に、直接的、またはリンカーを介して間接的に部分Aを付加することを含み、
該部分Aは、親和性タグ、ビオチン、抗体、抗原、ハプテン、ストレプトアビジン、リガンド、受容体、核酸、酵素、基質およびアプタマーのうちの1つである、
請求項1~12のいずれかに記載の方法。 - 該プロテアーゼバリアントがTEVプロテアーゼバリアントである、請求項13に記載の方法。
- 3M~5Mの尿素または1M~2Mのグアニジン塩酸塩の条件下で、該部分Aに特異的な部分Bを固定化した固体支持体とともに、該部分Aを付加したファージライブラリーを一定期間インキュベートし、および、標的ファージを含む溶液と固体支持体とを分離することを含み、
該部分Bは該部分Aに特異的に結合するという条件で、該部分Aは親和性タグ、ビオチン、抗体、抗原、ハプテン、ストレプトアビジン、リガンド、受容体、核酸、酵素、基質およびアプタマーのうちの1つであり、かつ、該部分Bが、ビオチン、抗体、抗原、ハプテン、ストレプトアビジン、リガンド、受容体、核酸、酵素、基質およびアプタマーのうちの1つである、
請求項13または14に記載の方法。 - 該標的ファージのスクリーニングが1回以上繰り返される、請求項15に記載の方法。
- 該プロテアーゼが、Avi-プロテアーゼ-プロテアーゼ切断部位-Y1-PIII構築物を介して、ファージPIIIタンパク質の末端に提示され、
Aviタグは15個のアミノ酸残基GLNDIFEAQKIEWHEからなる短いペプチドタグである、
請求項1~16のいずれかに記載の方法。 - 該構築物がpHEN1-Avi-TEVp-sTEV-Y1であり、該TEVプロテアーゼがAvi-TEVp-sTEV-Y1-PIIIとして提示される、請求項17に記載の方法。
- 該TEVプロテアーゼの切断配列がEXXYXQG、EXXYXQS、またはEXXYXQHであり、Xは任意のアミノ酸残基である、請求項18に記載の方法。
- 該TEVプロテアーゼの切断配列が配列番号7および8から選択される、請求項19に記載の方法。
- 該酵素切断活性が、該プロテアーゼおよびその切断配列を含む融合タンパク質に対して測定されるものである、請求項1~20のいずれかに記載の方法。
- 該酵素切断活性がプロテアーゼ-プロテアーゼ切断配列-Y1を含む融合タンパク質に対して測定されるものである、請求項21に記載の方法。
- 該酵素切断活性が該TEVプロテアーゼバリアントおよびその切断配列を含む融合タンパク質に対して測定されるものである、請求項22に記載の方法。
- 該酵素切断活性がTEVp-sTEV-Y1を含む融合タンパク質に対して測定されるものである、請求項23に記載の方法。
- 該スクリーニングが、宿主内で該プロテアーゼランダム変異ファージライブラリーをビオチン化することを含む、請求項3に記載の方法。
- 該プロテアーゼランダム変異ファージライブラリーがTEVプロテアーゼランダム変異ファージライブラリーである請求項25に記載の方法。
- 該スクリーニングが、該ビオチン化されたファージライブラリーをストレプトアビジン磁気ビーズで処理し、該磁気ビーズによって捕捉されたファージを3M~5Mの尿素中で一定期間インキュベートし、標的ファージを含む溶液から該磁気ビーズを分離することを含む、請求項25または26に記載の方法。
- 該標的ファージのスクリーニングを1回以上繰り返す、請求項27に記載の方法。
- 該ライブラリーが、コロニーPCRによって検証される、請求項1~28のいずれかに記載の方法。
- 該コロニーPCRに使用されるプライマーが、
フォワードプライマー:5’-CCACCATGGCCGGTCTGAATGATATTTTTGAAGC-3’;
リバースプライマー:5’-TTGTTCTGCGGCCGCAAATTCCAGC-3’
である請求項29に記載の方法。 - ライブラリーの容量が1×109以上である、該請求項1~30のいずれかに記載の方法。
- ライブラリーの容量が最大2×109である、請求項31に記載の方法。
- 全体の変異頻度は1.5~7個/kbの中/低程度である、請求項31に記載の方法。
- Y1がヒトまたはブタのACTHまたはGLP-1である、請求項9~12、17~20および22~24のいずれかに記載の方法。
- 該宿主が大腸菌である、請求項1~34のいずれかに記載の方法。
- 該生体外変性条件が3.5M~4.5Mの尿素または1.5Mのグアニジン塩酸塩の条件である、請求項1~35のいずれかに記載の方法。
- 該生体外変性条件が4Mの尿素である、請求項1~36のいずれかに記載の方法。
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