CN103842563B

CN103842563B - 蛋白质展示方法

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Publication number: CN103842563B
Application number: CN201280041236.9A
Authority: CN
Inventors: 马修·贝亚斯利; 本·基费尔
Original assignee: Affinity Biosciences Pty Ltd
Current assignee: Affinity Biosciences Pty Ltd
Priority date: 2011-06-29
Filing date: 2012-06-28
Publication date: 2017-03-15
Anticipated expiration: 2032-06-28
Also published as: EP2726652A1; CN103842563A; WO2013000023A8; CA2840650C; EP2726652A4; DK2726652T3; AU2012276282A1; EP2726652B1; US9644203B2; JP2014520507A; SG195215A1; ES2609313T3; JP6013470B2; WO2013000023A1; US20140121131A1; AU2012276282B2; CA2840650A1

Abstract

本发明涉及用于针对抗靶分子之期望活性筛选多肽的方法。特别地，本发明涉及通过在革兰氏阴性细菌细胞中表达多肽并使所述细胞透化来针对抗靶分子之期望活性筛选多肽的方法。本发明还涉及在细菌细胞中包装基因文库的方法。

Description

蛋白质展示方法

发明领域

本发明涉及用于针对抗靶分子之期望活性筛选多肽的方法。特别地，本发明涉及通过在革兰氏阴性细菌细胞中表达多肽并使所述细菌细胞透化来针对抗靶分子之期望活性筛选多肽的方法。本发明还涉及在细菌细胞中包装基因文库的方法。

发明背景

最早的蛋白质展示(protein display)方法是噬菌体展示(Smith，1985)，在该方法中，目的蛋白质与噬菌体的外壳蛋白(outer-coat protein)之一融合，在此处其可以与蛋白质的野生型拷贝一起存在。例如，基于M13丝状噬菌体的展示平台使用与giII蛋白的融合。

其他展示方法包括“体外”展示方法，在该方法中，使用细胞翻译提取物表达蛋白质，并通过物理连接(例如核糖体展示、mRNA展示)或通过连接在共用骨架上或包封在膜内实现蛋白质与编码核酸之间的偶联，例如，在体外区室化(in vitrocompartmentalization，IVC)中，mRNA在胶束悬液中翻译，所述胶束悬液还可包含mRNA和蛋白质二者的微珠(磁性或琼脂糖(sepharose))捕获系统。

蛋白质展示的另一个方法是微生物表面展示，其涉及所表达蛋白在微生物细胞外部的靶向定位，所述微生物细胞为革兰氏阴性或革兰氏阳性真细菌或酵母。使蛋白质与将蛋白质连接到细胞表面的锚结构域融合。所述锚结构域可具有指导酯化或共价连接至细胞壁的基序，或者锚结构域可以是与暴露的环区内与整合膜蛋白的融合。由于生产的可扩展性，微生物表面展示不仅可用于从多样化文库中筛选改进的蛋白质变体，还可用于呈递用于疫苗接种的抗原，或作为酶的细胞骨架以用于工业生物技术。

蛋白质展示方法常应用于亲和蛋白质(如抗体)的进化(evolution)。单分子展示方法在历史上是最受欢迎的，但是其缺点在于高背景以及亲和尺度(affinity scale)之间的低分辨率。通过体外展示或通过噬菌体系统鉴定的抗体通常被重新编排以用于在大肠杆菌周质中表达，虽然周质的产率相比于胞质中的表达通常极差。但是，当抗体在胞质中以高产率表达时，在几乎所有情况下，其形成不溶的包涵体，必须费力地再折叠包涵体并测试其活性。

因此，依然需要蛋白质展示方法，特别是用于筛选亲和蛋白质展示文库和酶文库的蛋白质展示方法。

发明概述

本发明人开发了一种蛋白质展示方法，在该方法中，在革兰氏阴性细菌细胞的胞质中产生被针对期望活性进行筛选的多肽，以及将编码所述多肽的多核苷酸包装在也保留在细菌细胞中的裂解缺陷型噬菌体中。使一个或更多个细菌细胞膜透化，从而使细菌细胞可以与靶分子接触以针对期望活性进行筛选。

因此，本发明提供了针对抗靶分子之期望活性筛选多肽的方法，所述方法包括：

a)对包含编码多肽之外源多核苷酸的革兰氏阴性细菌细胞进行培养，从而在细胞中产生所述多肽，

b)使得裂解缺陷型噬菌体包装所述编码多肽的多核苷酸，其中所述裂解缺陷型噬菌体保留在细菌细胞中，

c)透化：

i)细菌细胞的外膜，或

ii)细菌细胞的内膜和外膜，

d)使所述细菌细胞与靶分子接触，以及

e)针对期望活性筛选多肽，

其中，多肽被细菌细胞壁或内膜保留在细菌细胞内和/或多肽连接至细菌细胞壁或内膜。

在一个实施方案中，多肽可以被表达并被细菌细胞壁保留在细菌细胞的胞质内。因此，在一个实施方案中，所述方法包括使细菌细胞的内膜和外膜透化。

所述多肽可具有足够的尺寸从而使所述多肽被完整的细胞壁保留在包含经透化内膜和外膜的细菌细胞内。或者，如果所述多肽的尺寸足够小，其可穿过完整细胞壁扩散。在一个实施方案中，为了阻止所述多肽穿过细胞壁扩散，使所述多肽与至少第二多肽缔合以形成蛋白质复合物，所述蛋白质复合物保留在经透化细菌细胞内和/或连接至细菌细胞壁。在一个实施方案中，所述多肽与第二多肽或其亚基融合。

在一个具体实施方案中，所述第二多肽选自：

i)具有的分子大小使蛋白质复合物保留在经透化细菌细胞壁内的多肽；

ii)DNA结合蛋白；

iii)细菌细胞壁结合蛋白；和/或

iv)裂解缺陷型噬菌体的噬菌体外壳蛋白(coat protein)。

尽管可使用任何合适的方法使细菌内膜和细菌外膜透化，但是在一个实施方案中，通过一种或更多种去污剂或有机溶剂使细菌内膜和细菌外膜透化。

在一个实施方案中，所述一种或更多种去污剂是非离子去污剂。

在另一个实施方案中，所述非离子去污剂选自：癸酰基-N-甲基葡糖酰胺(Decanoyl-N-methylglucamide，Mega10)、二甲基辛基氧化膦(demithyloctylphosphineoxide，Apo8)、正辛基-β-D-硫代吡喃葡糖苷(n-octyl-β-D-thioglucopyranoside，8TGP)，以及癸酰基-N-甲基葡糖酰胺(Mega10)和二甲基辛基氧化膦(Apo8)的混合物。

或者，可利用有机溶剂如氯仿使细菌细胞的内膜和外膜透化。例如，在一个实施方案中，通过将细菌细胞在用氯仿饱和的水溶液中孵育来使细菌细胞的内膜和外膜透化。

在一个具体实施方案中，将细菌细胞在用氯仿饱和的水溶液中在约25℃下孵育约10分钟。

在本发明的另一个实施方案中，多肽在细菌细胞中产生并连接至细菌细胞的内膜。因此，使细菌细胞的外膜透化并使细胞壁至少部分地水解，而使内膜保持完整。

因此，在本发明方法的一个实施方案中：

i)使细菌外膜透化；

ii)使细菌细胞壁至少部分地水解；以及

iii)使所述多肽连接至内膜。

在一个具体实施方案中，利用溶菌酶使细菌细胞壁至少部分地水解。

在另一个实施方案中，多肽与连接在内膜上的蛋白质融合。在一个具体实施方案中，多肽连接至内膜的外面。

在另一个实施方案中，多肽与细菌噬菌体外壳蛋白缔合。在一个具体实施方案中，多肽与λ细菌噬菌体衣壳蛋白(capsid protein)gpD的任一端融合。在另一个实施方案中，多肽与P2细菌噬菌体衣壳蛋白gpL的N端融合。

编码所述多肽的DNA可以是基因组DNA和/或附加体DNA(episomal DNA)。在一个实施方案中，编码所述多肽的多核苷酸是质粒、粘粒、噬菌粒或噬菌体DNA。

在一个实施方案中，所述裂解缺陷型噬菌体是温和噬菌体，其选自λ噬菌体、186、P2、186和P2的杂交体、和/或P4。

裂解缺陷型噬菌体可以作为噬菌体存在于革兰氏阴性细菌细胞中或作为原噬菌体整合到宿主细胞基因组中。因此，在一个实施方案中，所述裂解缺陷型噬菌体是原噬菌体。

在一个具体实施方案中，细菌细胞包含裂解缺陷型的λ、186、P2、186和P2的杂交体、和/或P4原噬菌体。

在另一个实施方案中，细菌细胞包含P2和P4原噬菌体。

在一个具体实施方案中，细菌细胞包含λ原噬菌体。

在另一个实施方案中，细菌细胞包含186和P2原噬菌体的杂交体。

在一个实施方案中，使裂解缺陷型噬菌体包装编码所述多肽的多核苷酸包括，诱导细菌细胞中的原噬菌体活化以产生噬菌体，其中所述噬菌体包装多核苷酸。

在一个实施方案中，诱导原噬菌体活化包括在细菌细胞中产生一种或更多种噬菌体活化蛋白。

在一个具体实施方案中，细菌细胞包含P2和P4原噬菌体，所述方法包括在细菌细胞中产生P2和/或P4活化蛋白。

在一个实施方案中，所述P2和/或P4活化蛋白选自P2cox、P2ogr、P4δ和/或P4ε中的一种或更多种。

在另一个实施方案中，诱导原噬菌体活化包括使细菌细胞中的一种或更多种噬菌体阻遏蛋白失活。

在一个实施方案中，细菌细胞包含P2和/或P4原噬菌体，诱导P2原噬菌体活化包括使细菌细胞中P2蛋白质C的温度敏感性阻遏等位基因失活。

在一个实施方案中，细菌细胞包含λ原噬菌体，诱导λ原噬菌体活化包括使细菌细胞中λ噬菌体阻遏蛋白cI的温度敏感性阻遏等位基因失活。

在另一个实施方案中，细菌细胞包含186原噬菌体，诱导186原噬菌体活化包括使细菌细胞中186蛋白质cI的温度敏感性阻遏等位基因失活。

在另一个实施方案中，细菌细胞包含186和P2原噬菌体的杂交体，诱导原噬菌体活化包括使细菌细胞中杂交噬菌体的温度敏感性阻遏等位基因失活。

在另一个实施方案中，原噬菌体是裂解缺陷型的，这是由于溶菌酶基因或穴蛋白(holin)基因两者之一缺失或突变成无活性形式，或者穴蛋白基因和溶菌酶基因两者都缺失或突变成无活性形式。在一个具体实施方案中，P2原噬菌体溶菌酶基因包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：17，P2穴蛋白基因包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：18。在另一个实施方案中，λ原噬菌体穴蛋白基因包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：23，λ溶菌酶基因包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：24。

在另一个实施方案中，诱导原噬菌体活化包括升高细菌细胞的孵育温度。在一个具体实施方案中，将细菌细胞的孵育温度由约30℃升高至约42℃以诱导原噬菌体活化。在一个实施方案中，原噬菌体是λ噬菌体。在另一个实施方案中，原噬菌体是186或186和P2原噬菌体的杂交体。

本领域技术人员将理解，本发明方法可以与其他已知的噬菌体展示系统一起使用。与本发明相比，已知的噬菌体展示系统不将编码多肽的多核苷酸包装进裂解缺陷型噬菌体和/或不使多肽保留在细菌细胞中或连接在细菌细胞壁或细胞膜上。

因此，在一个实施方案中，所述方法还包括在革兰氏阴性细菌细胞中针对抗靶分子之期望活性额外筛选多肽的方法，其中，

i)编码多肽的多核苷酸不被包装进裂解缺陷型噬菌体内，和/或

ii)多肽不被细菌细胞壁保留在细菌细胞内和/或不连接在细菌细胞壁上。

尽管可以在本发明方法之前和/或之后进行使用已知的噬菌体展示系统的额外筛选，但是在一个实施方案中，在本发明方法之前进行额外筛选。

在一个实施方案中，额外筛选中的噬菌体使用裂解性噬菌体或温和噬菌体进行以包装编码多肽的多核苷酸。

在另一个实施方案中，裂解额外筛选中的细菌细胞以释放噬菌体。

在另一个实施方案中，额外筛选中的噬菌体是裂解性噬菌体，其裂解细菌细胞。

当在额外筛选过程中裂解细菌细胞时，理想地将多肽连接到噬菌体颗粒上。

因此，在一个实施方案中，

i)裂解性噬菌体包含在噬菌体外壳上的第一结合伴侣(binding partner)，并且

ii)针对期望活性进行筛选的多肽是包含第二结合伴侣的融合蛋白，

其中，使包含第二结合伴侣的融合蛋白与λ噬菌体外壳上的第一结合伴侣结合。

在一个实施方案中，裂解性噬菌体是λ噬菌体。

在另一个实施方案中，裂解性噬菌体是186、P2、186和P2原噬菌体的杂交体，和/或P4。

在一个实施方案中，第一结合伴侣是钙调蛋白，第二结合伴侣是钙调蛋白结合肽。

在另一个实施方案中，额外筛选中的一种或更多种原噬菌体是裂解缺陷型噬菌体，并且化学和/或酶促裂解细胞。在一个具体实施方案中，酶促裂解细胞包括用溶菌酶裂解细菌细胞。裂解缺陷型噬菌体可以是例如裂解缺陷型的λ、186、P2、186和P2原噬菌体的杂交体，和/或P4。

尽管可以使用本发明方法包装任何基因文库，但是在一个实施方案中，多核苷酸文库编码待针对抗靶分子之期望活性筛选多肽的方法。

本发明还提供了革兰氏阴性细菌，其包含具有温度敏感性阻遏蛋白的裂解缺陷型噬菌体。

本发明还提供了革兰氏阴性细菌，其包含裂解缺陷型噬菌体和编码一种或更多种噬菌体活化蛋白的多核苷酸。

在一个实施方案中，裂解缺陷型噬菌体选自λ、186、P2、186和P2的杂交体和/或P4。

在一个实施方案中，噬菌体活化蛋白选自P2cox、P2ogr、P4δ和/或P4ε。

本发明还提供了包含本发明革兰氏阴性细菌的试剂盒。

在一个实施方案中，所述试剂盒还包含能够使革兰氏阴性细菌细胞透化的试剂。在一个具体实施方案中，能够使革兰氏阴性细菌细胞透化的试剂选自一种或更多种去污剂或有机溶剂。

在一个实施方案中，所述去污剂是非离子去污剂，其选自癸酰基-N-甲基葡糖酰胺(Mega10)、二甲基辛基氧化膦(Apo8)、正辛基-β-D-硫代吡喃葡糖苷(8TGP)，聚山梨醇酯20(Tween20)以及癸酰基-N-甲基葡糖酰胺(Mega10)和二甲基辛基氧化膦(Apo8)的混合物。

在另一个实施方案中，所述有机溶剂是氯仿。

本发明还提供了针对抗靶分子之期望活性筛选多肽的方法，所述方法包括：

a)对包含编码多肽之多核苷酸的革兰氏阴性细菌细胞进行培养，从而产生多肽，

b)用氯仿使所述细菌细胞的内膜和外膜透化，其中多肽和编码多肽的多核苷酸保留在经透化细菌细胞内，

c)使经透化细菌细胞与靶分子接触，从而使其扩散进入经透化细菌细胞，以及

d)针对期望活性筛选多肽。

a)对包含编码多肽之多核苷酸的革兰氏阴性细菌细胞进行培养，从而产生多肽并使多肽连接至细菌细胞壁，

b)用氯仿使所述细菌细胞的内膜和外膜透化，其中编码多肽的多核苷酸保留在经透化细菌细胞内，

c)使经透化细菌细胞与靶分子接触，以及

d)针对期望活性筛选多肽。

在一个实施方案中，步骤d)包括：

i)确定多肽是否与靶分子结合和/或结合的程度；和/或

ii)确定多肽是否酶促修饰靶分子和/或酶促修饰的速率。

在一个实施方案中，多肽与至少第二多肽缔合形成蛋白质复合物，所述蛋白质复合物保留在经透化细菌细胞内和/或连接在细菌细胞壁上。

在一个实施方案中，多肽与第二多肽或其亚基融合。

在本发明方法中，所述第二多肽可选自：

ii)DNA结合蛋白；

iii)细菌细胞壁结合蛋白，和/或

iv)噬菌体外壳蛋白。

本发明还提供了用于鉴定具有期望活性的多肽的方法，所述方法包括：

a)使用本发明方法筛选多肽文库；和

b)选择一种或更多种具有期望活性的多肽。

本发明还提供了通过用氯仿透化细菌细胞内膜和外膜所获得的革兰氏阴性细菌细胞，其中所述细菌细胞包含外源多肽，所述外源多肽与第二多肽缔合，以形成保留在经透化细菌细胞内的蛋白质复合物。

本发明还提供了通过用氯仿透化细菌细胞的内膜和外膜所获得的革兰氏阴性细菌细胞，其中所述细菌细胞包含包含外源多肽，所述外源多肽连接在细菌细胞壁上。

本发明还提供了试剂盒，其包含：

a)载体，所述载体包含

i)用于向所述载体中插入编码第一多肽的多核苷酸的位点；和

ii)编码第二多肽的开放阅读框，所述第二多肽与所述第一多肽缔合以形成保留在经透化革兰氏阴性细菌细胞内的蛋白质复合物，和

b)用于透化细菌细胞的氯仿。

本发明还提供了试剂盒，其包含：

a)载体，所述载体包含

ii)编码第二多肽的开放阅读框，所述第二多肽与所述第一多肽缔合以形成连接至革兰氏阴性细菌细胞壁的蛋白质复合物，和

b)用于透化细菌细胞的氯仿。

如显而易见的，本发明一个方面的优选特征和特性适用于本发明的许多其他方面。

在整个说明书中，词语“包括”或类似用语如“包含”或“含”应理解为意指，包含指出的要素、整数或步骤，或者要素、整数或步骤的组，但是不排除任何其他要素、整数或步骤，或者要素、整数或步骤的组。

接下来将通过下文的非限制性实施例并参照附图描述本发明。

附图简述

图1.大肠杆菌细胞的去污剂透化。用去污剂处理表达GFP的大肠杆菌细胞以确定膜透化的效力。通过亮视野(第一列)或荧光显微镜(第二列和第三列)观察细胞。如果GFP(第二列)从细胞中释放同时摄取了膜不渗透的DNA结合染料Gel Red(第三列)，那么透化是有效的。发现去污剂8TGP(0.5％)和0.5％Mega10/0.5％Apo8(“试剂86”)在大肠杆菌细胞透化中最有效。

图2.去污剂上清液的SDS-PAGE。将图1中所示去污剂透化的大肠杆菌细胞的上清液装载到9％SDS-PAGE上，以定量判断去污剂导致的蛋白质释放(第一泳道)。为了证实经去污剂透化细胞中细胞壁囊(cell wall capsule)对一部分细胞蛋白质的保留，用溶菌酶(2mg/mL)处理经去污剂透化细胞的样品以水解细胞壁(第二泳道)。

图3.四聚体融合蛋白表达。(A)使用探测总细胞蛋白质的αHis抗体通过Western印迹检查大肠杆菌中His6：：SNAP：：四聚体融合蛋白的表达。除了预期分子量的带外，在RhnA四聚体融合物中观察到了＞250kD的高分子量带(泳道4)，推测其是作为四聚体迁移的抗SDS形式的复合物。(B)将BetB四聚体融合蛋白提取物分成去污剂可溶的和去污剂不溶的(细胞囊沉淀)提取物，并通过SDS-PAGE检查。

图4.四聚体融合蛋白的SNAP标记。在大肠杆菌中表达His6：：SNAP：：四聚体融合蛋白，并且如实施例1所述用8TGP使细胞透化。如实施例3中所述，通过标记有膜不渗透性SNAP配体BG-547的经透化细胞的荧光显微镜检查检测融合蛋白的表达(第二列)。用膜渗透染料Sytox绿(Sytox Green)标记细胞DNA(第一列)。SNAP和Sytox绿信号的叠加表示在第三列中。

图5.经透化细胞中His6：：SNAP：：BetB四聚体的αHis抗体标记。如实施例3中所述对用αHis抗体探测的表达His6：：SNAP：：BetB四聚体的经透化细胞进行荧光显微镜检查(第一幅图)。用SNAP配体BG-547标记细胞(第二幅图)。αHis和SNAP的共定位(第三幅图)表明αHis抗体穿过了经透化细胞的细胞壁。

图6.BetB、RhnA和YdcW四聚体与HALO和SNAP表达报告子的融合。使BetB、RhnA和YdcW四聚体分别与表达报告子HALO和SNAP融合。使表达融合蛋白的细胞透化并用Gel Red标记宿主DNA，使用HALO的荧光配体(G1001)和SNAP的荧光配体(BG-488)检测融合蛋白。

图7.GFP5：：DNA结合蛋白(DBP)融合物的表达。使来自淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)的非特异性高亲和DNA结合蛋白ComE与GFP5的C端融合，并在大肠杆菌中表达。使细胞透化并通过荧光显微镜观察GFP(第一幅图)和Gel Red(第二幅图)。荧光的共定位(第三幅图)表明融合蛋白和宿主DNA二者都保留在经透化细胞囊中。

图8.经透化细胞中DNA的保留。将表达GFP5：：DBP融合物或His6：：eGFP融合物的大肠杆菌细胞留下不处理(第1行和第4行)或如实施例1所述透化(第2、3、5和6行)。将经透化细胞在4℃下储存过夜或重悬在TBS中并在37℃下摇动过夜，之后通过荧光显微镜观察GFP(第一列)或Gel Red(第二列)。GFP和Gel Red的共定位表示在第三列中。

图9.由经透化细胞提取DNA。如实施例1所述使表达(A)GFP5：：DBP或(B)His6：：eGFP融合蛋白的大肠杆菌细胞透化。将经透化细胞在4℃下储存过夜或重悬在TBS中并在37℃下摇动过夜，之后提取质粒DNA并在用溴化乙锭染色的具有TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶上进行电泳。泳道1是未处理细胞中的总质粒DNA。泳道2和4分别是来自在4℃下储藏过夜和37℃下摇动储藏过夜的细胞囊的透化步骤的上清液，泳道3和5分别是来自在4℃下储藏过夜和37℃下摇动储藏过夜的细胞囊的质粒制备物。

图10.OmpF：：SNAP：：LPP融合蛋白的SNAP标记。如实施例1所述使表达OmpF：：SNAP：：LPP融合蛋白的大肠杆菌细胞透化。如实施例3所述通过SNAP配体BG-488的标记检测融合蛋白定位。通过亮视野显微镜(第一幅图)和荧光显微镜(第二幅图)观察标记的细胞。第三幅图是亮视野视图和荧光视图二者的叠加。

图11.αGFP：：HALO：：RhnA融合蛋白的eGFP结合。如实施例1所述使表达αGFP：：HALO：：RhnA融合蛋白的大肠杆菌细胞透化。如实施例8所述使纯化的eGFP蛋白与细胞囊结合，并且通过荧光显微镜观察eGFP。第一幅图，亮视野视图；第二幅图，eGFP荧光；第三幅图，亮视野和荧光的叠加。

图12.αGFP：：KzPG：：SNAP：：DBP融合蛋白的eGFP结合。如实施例1所述使表达αGFP：：KzPG：：SNAP：：DBP融合蛋白的大肠杆菌细胞透化。如实施例8所述使纯化的eGFP蛋白与细胞囊结合，并且如实施例3所述通过湿封片和干封片两种方法利用荧光显微镜观察eGFP。(A)eGFP与湿封片的细胞囊结合。插入图(i)和(ii)示出了αGFP：：KzPG：：SNAP：：DBP融合蛋白的eGFP结合的细胞壁定位。(B)和插入图(Aiii)示出了为在DABCO/甘油中干封片显微镜检查制备的相同细胞。

图13.OmpF：：αGFP：：SNAP：：LPP融合蛋白的eGFP结合。如实施例1所述使表达OmpF：：SNAP：：LPP或OmpF：：αGFP：：SNAP：：LPP融合蛋白的大肠杆菌细胞透化。如实施例8所述使纯化的eGFP蛋白与细胞囊结合，并且如实施例3所述通过干封片经荧光显微镜观察eGFP。(A)与表达OmpF：：αGFP：：SNAP：：LPP融合蛋白的细胞(底行第二幅图)不同，表达OmpF：：SNAP：：LPP融合蛋白的细胞缺少eGFP荧光(顶行第二幅图)。

图14.证实了LPP融合蛋白的细胞壁共价结合。如实施例1所述使表达OmpF：：αGFP：：SNAP：：LPP融合蛋白的大肠杆菌细胞透化。如实施例3所述通过用SNAP配体BG-488标记检测融合蛋白定位，并且用Gel Red使DNA染色。将样品在22℃(A)或95℃(B)下加热5分钟，之后制作干封片并通过荧光显微镜观察。

图15.使用去污剂/Ca²⁺缓冲液使外膜透化。如实施例10所述使表达OmpF：：αGFP：：SNAP：：LPP融合蛋白(外部αGFP或αGFP：：HALO：：FLAG：：RhnA融合蛋白(内部αGFP)的大肠杆菌细胞透化。通过eGFP与连接在细胞壁上的αGFP结构域的结合评估大配体的外膜透化。使用大配体(eGFP)和小配体(Gel Red)评估内膜的透化。证明Ca²⁺缓冲液中的去污剂Apo8(A)和Tween20(B)二者使外膜对大配体选择性透化。

图16.使用去污剂/EDTA缓冲液使外膜透化。如实施例10所述使表达OmpF：：αGFP：：SNAP：：LPP融合蛋白(外部αGFP)或αGFP：：HALO：：FLAG：：RhnA融合蛋白(内部αGFP)的大肠杆菌细胞透化。通过eGFP与连接在细胞壁上的αGFP结构域的结合评估大配体的外膜透化。使用大配体(eGFP)和小配体(Gel Red)评估内膜的透化。证明EDTA缓冲液中的去污剂Apo8(A)和Tween20(B)二者使外膜对大配体选择性透化。

图17.eGFP和SNAP标记细胞的混合类群的FACS分析。通过FACS分选三个大肠杆菌细胞群，所述三个细胞群表达：eGFP(#1箭头)；标记有SNAP配体BG-488的αGFP：：KzPG：：SNAP：：DBP融合蛋白(#2箭头)；和标记有SNAP配体BG-547的His6：：SNAP：：BetB(#3箭头)。在第一次分选60分钟后再次分析所分选类群的纯度和细胞完整性。

图18.αGFP和KzPG结构域之间的肽接头能够使表达αGFP：：KzPG：：SNAP：：DBP融合蛋白的大肠杆菌细胞与琼脂糖支持物结合。通过His6：：eGFP中间物将表达具有αGFP和KzPG结构域之间之12-mer接头区RL6的αGFP：：KzPG：：SNAP：：DBP融合蛋白的细胞与Co²⁺琼脂糖支持物结合。GFP结合在左图中示出(绿色)；融合蛋白的SNAP配体(红色)结合在中间图中示出；每一种的叠加在右边示出。

图19.表达αGFP：：RL6：：KzPG：：SNAP：：DBP融合蛋白的大肠杆菌细胞与链霉亲和素标记磁珠的结合。(A)生物素标记的eGFP(中间图和右边图)与表达αGFP：：RL6：：KzPG：：SNAP：：DBP融合蛋白的细胞结合，而后将其与链霉亲和素标记的磁性颗粒结合。(B)表达αGFP：：RL6：：KzPG：：SNAP：：DBP融合蛋白的细胞与链霉亲和素标记的磁性颗粒(首先标记有生物素化eGFP)逆向结合。在该实例中，珠标记有绿色(GFP图)，细胞标记有BG-547SNAP配体(红色，SNAP红色图)。(C)结构域接头(人肌联蛋白(titin)的第27个Ig结构域)也有效作为结合间隔物。表达αGFP：：I27：：RL6：：KzPG：：SNAP：：DBP融合蛋白的大肠杆菌细胞首先与生物素化eGFP(绿色，GFP图)结合，并且用BG-547SNAP配体(红色，SNAP红色图)标记，之后与链霉亲和素标记的磁性颗粒结合。

图20.大肠杆菌胞质中作为scFv：：I27：：RL6：：KzPG：：SNAP：：DBP融合蛋白的小鼠scFv基因的表达。根据本发明方法在大肠杆菌胞质中构建并展示小鼠scFv文库。通过SNAP配体结合检测具有可检测表达的克隆，并且分成错误折叠(左图)、弱表达但是可溶(中图)或高表达并且可溶(右图)。

图21.在大肠杆菌胞质中可溶性和不溶性scFv表达的检测。将在由小鼠scFv表达文库的有限筛选中发现的高表达并且可溶的选定克隆作为scFv：：I27：：RL6：：FLAG和scFv：：RL6：：FLAG融合蛋白亚克隆至表达构建体。将蛋白级分作为可溶的或不可溶的上样在SDS-PAGE凝胶上，转移到硝酸纤维素膜上并使用αFLAG抗体检测。将样品配对成可溶(S)或不可溶(P)级分，并且每一克隆表达有I27：：RL6(I)或RL6(R)接头。还在底部的图中示出了由文库筛选分离的I27：：RL6：：KzPG：：SNAP：：DBP展示构建体中原始scFv克隆的荧光显微图像。

图22.使用有机溶剂使大肠杆菌膜透化。将表达αGFP：：RL6：：KzPG：：SNAP：：DBP融合蛋白的大肠杆菌细胞悬浮在有机溶剂的水性混合物中。通过(A)小分子量DNA结合荧光配体Gel Red和30kD蛋白质eGFP的结合指示膜的透化。在测试的有机溶剂中，仅氯仿使内膜和外膜二者都透化，使得高分子量的eGFP能够进入细胞(B)。

图23.大肠杆菌中αGFP：I27：gpL融合蛋白的表达。如实施例20所述，通过阿拉伯糖诱导来诱导αGFP：I27：gpL融合蛋白的表达。通过用0.5％8TGP进行透化使可溶性蛋白质从大肠杆菌细胞中释放，并且认为剩余样品是不可溶的。将样品在SDS上样缓冲液中煮并在15％SDS-PAGE上电泳。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并用αFLAG单克隆抗体探测以检测αGFP：I27：gpL融合蛋白。(1)样品1：未诱导的αGFP：I27：gpL融合物克隆1；(2)经诱导的αGFP：I27：gpL融合物克隆1；(3)经诱导的αGFP：I27：gpL融合物克隆2。S＝可溶性级分；In＝不可溶级分。

图24.展示gpD：：α-mAG1融合蛋白的mAG1标记的经包封λ噬菌体的荧光成像。使诱导了λ原噬菌体并表达gpD：：α-mAG1融合蛋白的大肠杆菌细胞透化并用mAG1蛋白和DNA结合染料Gel Red染色。通过荧光显微镜观察mAG1在经透化细胞内以点状模式结合(左图)。

图25.展示gpD：：α-mAG1融合蛋白的经包封λ噬菌体的流入FACS(Influx FACS)分析的截图。示出的是具有约1％α-mAG1阳性细胞输入的流入FACS(BD Biosciences)上100K事件的荧光曲线。细胞群已经用DNA结合染料Gel Red(红色，561nm)和荧光mAG1蛋白(绿色，488nm)共染色。P2门控群为α-mAG1阳性，P3门控群为α-mAG1阴性。

序列表解释

SEQ ID NO：1——pAra3：：His6：：SNAP阿拉伯糖载体的核苷酸序列

SEQ ID NO：2——pAra3：：His6：：KzPG：：SNAP：：DBP载体的核苷酸序列

SEQ ID NO：3——pAra3：：OmpF：：SNAP：：LPP载体的核苷酸序列

SEQ ID NO：4——pAra3：：αGFP(R35)：：HALO：：FLAG：：RhnA载体的核苷酸序列

SEQ ID NO：5——随机化肽间隔物结构域

SEQ ID NO：6至12——肽接头间隔物

SEQ ID NO：13——I27：：RL6：：KzPG：：SNAP：：DBP

SEQ ID NO：14——I27：：RL6：：KzPG：：SNAP：：DBP编码序列

SEQ ID NO：15——文库支架载体

SEQ ID NO：16——I27间隔物

SEQ ID NO：17——肠细菌噬菌体P2内溶素基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：18——肠细菌噬菌体P2穴蛋白基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：19——温度诱导型P4δ载体的核苷酸序列

SEQ ID NO：20——αGFP：：I27：：gpL融合蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO：21——gpL：：αGFP：：I27融合蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO：22——αGFP：：I27：：gpL融合蛋白表达载体的核苷酸序列

SEQ ID NO：23——λ噬菌体穴蛋白基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：24——λ噬菌体溶菌酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：25——λ裂解簇缺失残余(remnant)的氨基酸序列

SEQ ID NO：26——λcos区的核苷酸序列

SEQ ID NO：27——λSR缺失(ΔSR)载体的核苷酸序列

发明详述

一般技术和定义

除非另外明确定义，否则本文使用的所有技术和科学术语应采用与本领域(例如，蛋白质化学、生物化学、细胞培养、分子遗传学、微生物学和免疫学)一般技术人员通常理解的相同的含义。

除非另外指明，否则本发明中使用的重组蛋白质、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员周知的标准方法。这些技术描述和解释在例如以下来源的文献的全文中：J，Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons(1984)；J.Sambrook and Russell.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，ColdSpring Harbour Laboratory Press(2001)；R.Scopes，Protein Purification-Principals and Practice,第3版，Springer(1994)；T.A.Brown(编辑)，EssentialMolecular Biology：A Practical Approach，第1和2卷，IRL Press(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(编辑)，DNA Cloning：A Practical Approach，Volumes1-4，IRL Press(1995和1996)，和F.M.Ausubel等(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology,GreenePub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括迄今为止的所有更新)；Ed Harlow和David Lane(编辑)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratory,(1988)；以及J.E.Coligan等(编辑)Current Protocols in Immunology,JohnWiley&Sons(包括迄今为止的所有更新)。

术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”在本文中一般可互换地使用。本文使用的术语“外源多肽”是指由外源多核苷酸编码的多肽。本文使用的术语“外源多核苷酸”是指对于已引入它的细胞来说为外源的多核苷酸，或者其序列与引入它的细胞中的序列同源，但是所处位置为宿主细胞核酸中通常不会发现所述多核苷酸的位置。

本发明中使用的术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、二抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、多抗体(multibodies)、异缀合抗体(heteroconjugateantibody)、嵌合抗体，包括完整分子及其片度，例如Fab、F(ab′)2、Fv和scFv以及其他抗体样分子。

本文使用的术语“约”是指给定值的+/-5％的范围。

裂解缺陷型噬菌体(Lysis-defective phage)

在本发明一个实施方案中，在革兰氏阴性细菌细胞中针对期望活性筛选多肽，其中，在细胞中产生多肽并将编码多肽的多核苷酸包装进裂解缺陷型噬菌体中。“裂解缺陷型噬菌体”是指这样的裂解性噬菌体或温和噬菌体，在其生命周期中正常地应具有裂解期，但是其已经被改造成尽管其可进行裂解周期的所有其他功能，但是其不能裂解革兰氏阴性细菌细胞以释放包装的噬菌体。因此，裂解缺陷型噬菌体包括能够具有溶源周期的温和噬菌体，其中病毒基因组被整合进宿主细胞DNA中作为原噬菌体或其作为质粒(噬菌粒)复制。原噬菌体在细菌细胞中保持休眠，直到宿主细胞条件允许原噬菌体成为活化的并开始繁殖周期。而原噬菌体的繁殖周期的起始通常会导致细菌宿主细胞的裂解，本发明方法中的裂解缺陷型噬菌体已经被进行了改造，从而使得细菌宿主细胞不裂解，而噬菌体保留在细菌细胞中。

本文使用的术语“裂解缺陷型噬菌体”不包括对在其生命周期中通常不具有裂解阶段的噬菌体的涉及，因此，本领域技术人员将理解，术语“裂解缺陷型噬菌体”不包括对通过外排(extrusion)从细菌细胞中释放的噬菌体(例如丝状噬菌体，如M13、f1或f2)的涉及，或对通过出芽从细菌细胞中释放的噬菌体的涉及。

可以被改造以从其生命周期中移除裂解阶段从而产生裂解缺陷型噬菌体的裂解性噬菌体的实例包括：phiX174、T1、T2、T3、T4、T5、T6和T7细菌噬菌体。可以被改造以从其生命周期中移除裂解阶段的溶源噬菌体的实例包括：λ噬菌体、N15噬菌体、P22噬菌体、Mu噬菌体、P2噬菌体、噬菌体186、和P2卫星噬菌体P4(Lindqvist等，1993；Ziermann等，1994；Liu等，1997；和Briani等，2001)。

本领域技术人员将理解，一些能够在细菌细胞中包装多核苷酸的温和噬菌体需要另一噬菌体如辅助噬菌体的存在，以便进行多核苷酸包装和/或用于进行细菌细胞裂解。这种关系的实例是P2噬菌体及其卫星噬菌体P4。为进行多核苷酸包装和/或细菌细胞裂解对辅助噬菌体存在的需要被称为辅助-噬菌体系统(helper-phage system)。在辅助-噬菌体系统中，辅助噬菌体或噬菌体多肽(即，“活化蛋白质”)的活性诱导另一噬菌体进行多核苷酸包装和/或造成细菌细胞裂解。因此，本领域技术人员将理解，尽管多核苷酸可以被包装到一种噬菌体(即，辅助-噬菌体系统中的一种噬菌体)中，但是可需要另一种噬菌体(即，辅助-噬菌体)的活性以裂解其中存在这两种噬菌体的细菌细胞。为了在本发明方法的一些实施方案中使用，改造会正常地提供裂解活性的噬菌体以使其不再能够裂解细菌细胞。因此，本文使用的“裂解缺陷型噬菌体”还指其中包装了多核苷酸的噬菌体，其中所述噬菌体在正常情况下会依赖于第二噬菌体以提供裂解活性，但是其中第二噬菌体已经被改造从而不再能够裂解革兰氏阴性细菌细胞。

本领域技术人员将理解，还可以物理地将多核苷酸与裂解缺陷型噬菌体的基因组分离。例如，多核苷酸可以与这样的序列可操作性连接，所述序列足以通过噬菌体结构和复制蛋白质包装所述多核苷酸以形成与裂解缺陷型噬菌体的亲本株形态相似或相同的感染单元。

作为一个非限制性实例，适当大小的质粒载体可包含将DNA包装进λ细菌噬菌体所必需的cos区周围序列。这些质粒载体可以通过辅助噬菌体体内包装，或还可以通过包含噬菌体结构和重复蛋白质的经纯化提取物来体外包装。提供了一个足够进行λ包装的序列SEQID NO：26。这些载体被称为粘粒(cosmid，cos+plasimid)，并且由于其克隆外源多核苷酸并作为细菌噬菌体颗粒增殖多核苷酸的能力而为本领域技术人员所周知。用于在粘粒中克隆多核苷酸的商业化试剂盒以及用于体外包装的试剂盒是本领域中已知的。

示例性辅助-噬菌体系统：P2-P4系统

辅助-噬菌体系统的一个非限制性实例是P2-P4噬菌体系统。尽管每一种噬菌体都携带有确保其自身DNA复制并整合进宿主基因组必需的基因，但是大肠杆菌P4缺少尾和裂解功能所需的遗传信息，以及用于形成衣壳的主要结构蛋白(Kahn等，1991；Liu等，1997)。因此，P4依赖于噬菌体P2或P2相关噬菌体(例如，噬菌体186)，以便产生P4噬菌体结构组件，以包装其DNA和裂解宿主细胞。当P4感染P2溶源性宿主细胞(例如，在其基因组中包含P2原噬菌体的大肠杆菌)时，P2原噬菌体被P4ε基因去抑制。去抑制导致P2早期和晚期基因表达，并且足以完成P4裂解周期。

P4还可以被P2样噬菌体(噬菌体186)包装。该噬菌体具有P2的直系同源结构蛋白(约75％同一性)，并且已经构建了杂交体P2/186噬菌体，其包含受噬菌体186转录因子调控的P2结构基因(Younghusband等，1975)。关键地，噬菌体186和P2/186杂交体(Hy2和Hy5)的早期区不与P2相关，因此不被P4ε蛋白质抑制。但是，如果使用噬菌体186免疫阻遏物的温度敏感性突变体诱导噬菌体186的功能以符合P4感染(Sauer等，1982)或活化时，可以使用噬菌体186作为P4辅助噬菌体。

本领域技术人员将理解，P2/P4细菌噬菌体系统将适合于在本发明方法中使用。P2/P4细菌噬菌体系统的有利特征包括：

i)与偏向于包装连锁(concatamerised)、线性多核苷酸模板的其他细菌噬菌体末端酶不同，P2末端酶偏向于质粒模板。因此，该系统更适合于体内包装编码被针对期望活性进行筛选的多肽的质粒，和

ii)可有效包装进P4尺寸衣壳(约10-12kb)的粘粒(即，包含指导细菌噬菌体包装的细菌噬菌体cos序列的质粒)相比于较大的细菌噬菌体基因组如λ(48.5kb)更易于进行常规克隆方法和反复诱变。

产生裂解缺陷型噬菌体的基因修饰

裂解性细菌噬菌体的生命周期包括基因组复制和包装为噬菌体颗粒二者，但是还包括裂解细胞以释放颗粒以再感染。革兰氏阴性细菌的细胞裂解是两阶段过程，首先使内膜穿孔，允许细胞壁降解酶(溶菌酶)接近周质间隙并作用在肽聚糖细胞壁上。通过胞质和周围溶液之间渗透压的差异使细胞裂解，从而将噬菌体颗粒释放进介质。

在大部分裂解性噬菌体和溶源噬菌体中，膜穿孔(穴蛋白)和溶菌酶的活性通常由两种基因的编码。由于大部分噬菌体基因组的简约性，这些基因通常在同一操纵子中相邻。为了保持细胞壁的完整性以及防止噬菌体颗粒和通过本发明方法进行功能筛选的蛋白质的释放，编码噬菌体溶菌酶或溶菌酶和穴蛋白二者的基因必须从噬菌体基因组中缺失。由于频繁使用重叠阅读框和终止/起始密码子导致许多噬菌体基因中的翻译偶联，所以在设计这些缺失时，必须仔细考虑对下游基因的影响。如果裂解簇在翻译上与下游结构基因偶联，那么优选缺失将留下截短ORF，作为在具有一个基因的起始区和另一个基因的终止区的基因座处的残留“伤口”。

在一个实施方案中，本发明的蛋白质筛选方法使用革兰氏阴性细菌内膜和外膜二者的透化，同时保持肽聚糖细胞壁的结构完整性。因此，在该实施方案中，可以使细菌噬菌体基因组中的穴蛋白基因保持功能并且可有助于内膜透化，而使溶菌酶基因缺失以保持细胞壁结构完整性。当在与周质靶向的蛋白质偶联(例如，WO2002/034886和WO2005/095988中所述)或与细胞壁结合融合蛋白偶联的筛选系统中使用裂解缺陷型噬菌体的情况下，必须使穴蛋白或穴蛋白/溶菌酶功能从噬菌体基因组中缺失以保持细胞或原生质球的内膜的完整性。

本领域技术人员将理解，通过使编码溶素(lysin)和/或溶菌酶分子的基因从噬菌体基因组中缺失，或通过使溶素和/或溶菌酶基因突变从而使其缺陷并不能编码功能性溶素和/或溶菌酶蛋白，可以使溶素和/或溶菌酶基因功能缺失。

在本发明使用P2和P4卫星系统的一些实施方案中，P2基因组包含由P4使用的穴蛋白(Y)和溶菌酶基因(K)二者。因此，可通过使K、Y或YK基因缺失来改造P2原噬菌体。在实施例16中描述了裂解缺陷型P2噬菌体的构建，其中YK基因从大肠杆菌K12菌株的P2原噬菌体基因组中缺失。可用P4细菌噬菌体感染携带P4大小之粘粒的P2ΔYK原噬菌体，从而诱导粘粒的包装。还可以诱导粘粒以表达待进行功能性筛选的基因。在粘粒包装和基因表达的诱导完结时，可通过本发明方法使细胞膜透化并筛选细胞衣壳。实施例18中描述了通过用P4噬菌体感染携带P2ΔYK原噬菌体的菌株，在大肠杆菌菌株中用裂解缺陷型P2噬菌体包装粘粒。

在本发明使用λ噬菌体系统的一些实施方案中，λS和R基因分别编码穴蛋白和内溶素(endolysin)(溶菌酶)。R或SR基因缺失或突变失活会产生裂解缺陷型λ原噬菌体。

实施例20中描述了裂解缺陷型λ噬菌体的构建，其中使SR基因从大肠杆菌K12菌株的λ原噬菌体基因组中缺失。实施例21中描述了大肠杆菌菌株中裂解缺陷型λ噬菌体对粘粒的包装，其通过使不耐热的cI阻遏子失活来诱导。

在本发明使用裂解性噬菌体的一些实施方案中，以T7噬菌体为例，可通过使编码T7溶菌酶的基因3.5突变失活来产生裂解缺陷型噬菌体。由于T7溶菌酶通过与T7RNAP的抑制性相互作用对T7转录具有调控活性，所以溶菌酶的缺失将是不可取的。因此，需要使细胞壁酰胺酶酶活性特异性失活的突变以产生保持T7复制的裂解缺陷型突变体。

可以通过与已知的噬菌体基因组比较或通过遗传分析来鉴定其他裂解性噬菌体或溶源性噬菌体的溶素/穴蛋白系统，并且可产生用于在本发明方法中的包装文库中使用的相应裂解缺陷型突变体。

裂解缺陷型噬菌体的多核苷酸包装

在本发明利用裂解缺陷型噬菌体的筛选方法中，所述方法包括对包含编码被筛选多肽之外源多核苷酸的革兰氏阴性细胞进行培养，从而在细胞内产生多肽，并使得裂解缺陷型噬菌体包装编码所述多肽的多核苷酸。用语“使得裂解缺陷型噬菌体包装多核苷酸”意思是指在革兰氏阴性细菌细胞中提供条件以使得裂解缺陷型噬菌体能够包装多核苷酸。

技术人员将理解，在一些情况下，培养革兰氏阴性细菌细胞以产生多肽和使得裂解缺陷型噬菌体包装多核苷酸可同时进行。以非限制性实例的方式来说，可以用能够包装粘粒的裂解缺陷型噬菌体感染包含辅助原噬菌体和编码目的多肽之粘粒的革兰氏阴性细菌细胞，然后进行培养以产生多肽。

或者，通过例如使不稳定阻遏蛋白加热失活或通过共诱导活化蛋白来处理包含辅助原噬菌体和编码目的多肽之粘粒的革兰氏阴性细菌细胞，以诱导原噬菌体的包装功能，然后进行培养以产生多肽。

这样，在革兰氏阴性细菌细胞中产生多肽，同时将粘粒包装进裂解缺陷型噬菌体中。

在一个实施方案中，裂解缺陷型噬菌体保留(即，包封)在经透化革兰氏阴性细菌细胞中，并根据本发明方法针对期望活性筛选多肽。特别地，将编码待筛选多肽的基因文库克隆进裂解缺陷型噬菌体中或粘粒中，并引入到革兰氏阴性细菌细胞中。可以共诱导(即，同时诱导)噬菌体包装和待筛选多肽二者，并在适当时间点使用去污剂或有机溶剂使革兰氏阴性细菌细胞群透化，而多肽和噬菌体保留在细胞衣壳内。然后针对期望的多肽活性筛选经透化革兰氏阴性细菌细胞群。

培养革兰氏阴性细菌细胞以产生多肽和使得裂解缺陷型噬菌体包装编码多肽的多核苷酸的步骤还可以相继进行而不是同时进行。因此，可首先培养革兰氏阴性细菌以产生多肽，随后允许裂解缺陷型噬菌体包装编码多肽的多核苷酸。可以例如在多肽由细菌细胞中的粘粒编码并用辅助噬菌体感染细菌细胞以允许裂解缺陷型噬菌体包装编码多肽的多核苷酸的情况下，相继地进行在细菌细胞中产生多肽然后包装多核苷酸。在本发明方法的一个实例中，细菌细胞包含P2和/或P4原噬菌体，诱导P2原噬菌体活化包括使细菌细胞中P2蛋白C的温度敏感性阻遏等位基因(allele)失活和/或在细菌细胞中表达P4活化蛋白。

或者，可以在适于产生多肽的条件下培养革兰氏阴性细菌并且使得裂解缺陷型噬菌体包装编码多肽的多核苷酸可包括：诱导细菌细胞中的原噬菌体活化以产生噬菌体，其中所述噬菌体包装所述多核苷酸。如本领域技术人员将理解的，诱导细胞中原噬菌体活化的步骤可以与培养革兰氏阴性细菌以在细胞中产生多肽的步骤同时或相继进行。

根据本说明书，技术人员将理解的是，诱导裂解缺陷型噬菌体活化以包装多核苷酸可以通过多种方式来实现。例如，诱导裂解缺陷型噬菌体活化可包括将卫星或辅助噬菌体引入到革兰氏阴性细菌细胞中，所述革兰氏阴性细菌细胞包含作为原噬菌体存在于细菌细胞基因组的裂解缺陷型噬菌体。

或者，诱导活化可包括在细菌细胞中产生一种或更多种原噬菌体的活化蛋白。例如，革兰氏阴性细菌细胞可包含P2和/或P4原噬菌体，P2和/或P4活化蛋白可以例如选自P2cox、P2ogr、P4δ和/或中的一种或更多种。由于活化，细菌细胞中的原噬菌体产生包装多核苷酸的噬菌体。或者，诱导裂解缺陷型噬菌体活化以包装多核苷酸可包括使细菌细胞中的一种或更多种噬菌体阻遏蛋白失活。在本发明一个具体实施方案中，诱导活化包括使细菌细胞中λ原噬菌体的温度敏感性阻遏等位基因失活。在另一个实施方案中，诱导裂解缺陷型噬菌体活化包括升高细菌细胞的孵育温度。

透化(Permeabilisation)

在本发明的某些实施方案中，使革兰氏阴性细菌细胞的单独外细胞膜或内细胞膜和外细胞膜二者透化，从而允许至少一些可溶性细胞组分穿过细胞壁扩散。待针对期望活性进行筛选的多肽保留在细菌细胞壁内或连接至细菌细胞壁。本文使用的术语“透化”或“经透化”或“经透化细菌细胞”是指使用透化试剂或机械处理或二者的组合在革兰氏阴性细菌的外膜中或内膜和外膜二者中产生孔，或者溶解革兰氏阴性细菌的外膜或内膜和外膜二者，而不水解肽聚糖之间的连接，从而保持细胞壁完整。能够使细菌细胞透化的试剂的非限制性实例包括去污剂和有机溶剂。能够使细菌细胞透化的机械处理的非限制性实例是电穿孔。

透化有利地允许小至中等大小的蛋白质(例如，大至120KDa)或者等价或更小尺寸的其他分子进入保持完整的细胞囊(cellular capsule)。另外，通过保持细菌细胞壁的完整性，经透化细菌细胞比例如通过用Tris-EDTA溶菌酶处理细菌细胞(其中细菌细胞壁至少部分地水解)所产生的原生质体更不脆弱。在本发明方法的某些实施方案中产生的经透化细菌细胞非常适合于技术如荧光活化细胞分选(FACS)，而原生质体被高剪切流式细胞术环境破坏并需要经控制的渗透条件，因此限制了其潜在应用。

优选地，透化处理保持了细胞蛋白质的天然状态和相互作用。与离子型去污剂相比，非离子去污剂通常较少破坏蛋白质折叠和蛋白质复合物。因此，在一个优选实施方案中，使用非离子去污剂使细菌细胞壁透化。非离子去污剂的非限制性实例包括Triton X-100、Triton X-114、Brii35、Brij58、Tween20、Tween80、Nonidet P-40替代物(Nonidet P-40Substitute)、辛基β葡糖苷、Mega8、Mega9、Mega10、BigCHAP、脱氧BigCHAP、Apo8和8TGP(正辛基-β-D-硫代吡喃葡糖苷)。

可使用去污剂的混合物使细菌细胞透化。例如，去污剂可以是两种或更多种非离子去污剂的混合物。在一个实施方案中，去污剂是Mega10和Apo8的混合物。

当待针对期望活性进行筛选的多肽连接到细胞壁上或者整合或连接到内细胞膜上时，技术人员将理解的是，使细菌细胞的内膜透化可以是不必要的。因此，在一个实施方案中，使细菌细胞选择性透化。“选择性透化”意思是指使经透化细菌细胞的外膜的透化程度比内膜大，从而使得当与例如通过使用包含0.5％Mega10和0.5％Apo8的溶液使内膜和外膜二者都透化的经透化细胞相比时，50％或更少，或更优选40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或更少或没有膜不渗透的物质(例如，膜不渗透的DNA结合配体Gel Red)渗透经选择性透化细胞的内膜。

尽管技术人员能够确定使根据本发明方法选择性透化细菌细胞的合适条件，但是在一个实施方案中，利用非离子去污剂使细菌细胞选择性透化。例如，非离子去污剂可以选自Apo8和Tween20。在一个实施方案中，用于使细菌细胞选择性透化的溶液包含约0.2％至约0.4％、或约0.2％至约0.3％、或约0.2％浓度的去污剂。优选地，用于使细菌细胞选择性透化的溶液包含在含Ca²⁺或EDTA的缓冲液中的去污剂。适合于使细菌细胞选择性透化的示例性缓冲剂包括在25mM Tris、1mM EDTA(pH8.0)或25mM Tris、2mM Ca²⁺(pH8.0)中的0.2-0.4％Apo8或Tween20。在一个实施方案中，可以通过例如将细胞在合适的缓冲液中于约25℃孵育约10分钟来实现对细菌细胞的选择性透化。

在另一个实施方案中，能够使革兰氏阴性细菌细胞透化的试剂是有机溶剂如氯仿。例如，可以通过将革兰氏阴性细菌细胞悬浮在在用亲脂性溶剂氯仿饱和的水溶液中来使细菌内细胞膜和外细胞膜透化。为了产生氯仿的饱和溶液，需要通过搅动水和有机溶剂的两种不混溶的相(通常通过摇动或机械涡旋)直到氯仿相作为细小液滴悬浮来将两相混合。使两个相静置，并使用脉冲离心来帮助分离所述相。5％(v/v)氯仿的混合物足以产生饱和溶液。在25℃下10分钟的孵育时间足以使两个细胞膜透化。实施例19和附图22描述和证明了使用有机溶剂氯仿使大肠杆菌内膜和外膜透化。

多肽表达

可以将待针对期望活性进行筛选的多肽克隆进用于在细菌细胞中表达的合适载体中。本文使用的术语“载体”是指本领域已知的适于转化细菌细胞的任何载体。优选地，载体还能够在细菌细胞中独立于宿主基因组复制。载体包括质粒、病毒和粘粒以及线性DNA元件，例如大肠杆菌的线性噬菌体N15和/或不依赖于细菌细胞基因组复制的染色体外DNA。优选地，载体是表达载体。如技术人员将理解的，在将编码多肽的多核苷酸包装进噬菌体的一些实施方案中，载体将为合适的形式，并包含用于将多核苷酸包装进噬菌体的必要序列(例如，粘粒中的cos序列)。

本文使用的“表达载体”是指能够在细菌细胞中实现特定多核苷酸分子的表达的载体。优选地，表达载体还能够在细菌细胞中复制。合适的表达载体通常包含调控序列，例如转录控制序列、翻译控制序列、复制起点以及与重组细菌细胞相容并控制编码多肽的多核苷酸分子表达的其他调控序列。转录控制序列是控制转录起始、延伸和终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制转录起始的那些，例如启动子、增强子、操作子和阻遏序列。合适的转录控制序列包括可以在细菌细胞中行使功能的任何转录控制序列。多种这样的转录控制序列是本领域中已知的。

可以通过任何合适的方法完成表达载体向细菌细胞中的转化，通过这样可以将多核苷酸分子插入到细胞中。转化技术包括但不限于：电穿孔和化学转化。转化的多核苷酸分子可以保持在染色体外或可以以保持其表达能力的方式整合到经转化(即重组)细胞的染色体内的一个或更多个位点中。

可使用重组DNA技术来改善转化的多核苷酸分子的表达，这通过例如控制宿主细胞中多核苷酸分子的拷贝数、这些多核苷酸转录的效率、所得转录物翻译的效率和翻译后修饰的效率来进行。可用于提高多核苷酸分子表达的重组技术包括但不限于：将多核苷酸分子与高拷贝数的质粒可操作性连接、向质粒添加载体稳定序列、替换或修饰转录控制信号(例如，启动子、操作子、增强子)、替换或修饰翻译控制信号(例如，核糖体结合位点、夏因-达尔加诺序列(Shine-Dalgarno sequences))、修饰多核苷酸分子以与宿主细胞的密码子使用相应，和将使转录物不稳定的序列缺失。

本领域技术人员能够容易地确定适合于在本发明方法中表达多肽的细菌菌株。本领域技术人员将理解，适合于在本发明方法中使用的革兰氏阴性细菌包括沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(E.coli)、志贺氏菌(Shigella)、弯曲菌(Campylobacter)、梭菌(Fusobacterium)、博德特氏菌(Bordetella)、巴斯德菌(Pasteurella)、放线杆菌(Actinobacillus)、嗜血杆菌(Haemophilus)和嗜组织菌(Histophilus)。在一个优选实施方案中，所述革兰氏阴性细菌是大肠杆菌。

蛋白质复合物

待针对期望活性进行筛选的多肽可与至少第二多肽缔合以形成蛋白复合物，所述蛋白复合物具有使蛋白质复合物保留在经透化细菌细胞内的分子大小。所述多肽可以通过例如共价键如二硫桥或非共价键缔合与第二多肽缔合。“非共价缔合”是指不涉及原子间键的分子相互作用。例如，非共价相互作用涉及离子键、氢键、疏水相互作用和范德华力。非共价力可用于使蛋白质或蛋白质复合物中独立的多肽链保持在一起。因此，所述多肽和第二多肽可以由相同载体或不同载体表达为独立的多肽，或者所述多肽中的一者或两者可以由整合进细菌细胞基因组的编码所述多肽的DNA表达。

或者，在蛋白质复合物中缔合的所述多肽和第二多肽可以是融合蛋白。本文使用的“融合蛋白”是指由两种或更多种多肽或其片段组成的杂合蛋白，其由编码两种多肽中每一种多肽的至少一部分的多核苷酸的表达产生，并且通过肽键连接。

通过分子大小使蛋白质复合物保留在经透化细菌细胞中

第二多肽可以是具有足够分子大小(即，足够的分子量或分子半径)的任何多肽，从而使得与针对期望活性进行筛选之多肽形成的至少一些复合物不能从经透化细菌细胞扩散。因此，在细胞透化之后，蛋白质复合物保留在细菌细胞内。本领域技术人员将理解，第二多肽的性质(包括其分子量以及其是否为球状蛋白质或棒状(丝状)蛋白质)将决定其防止或抑制蛋白质穿过细菌细胞壁扩散的能力。在一个实施方案中，第二多肽的分子量至少为约30kDa，或至少约40、50、60、70、80、90、100、120、130、140、150或更大kDa。在一个实施方案中，第二多肽至少为约120kDa。

在一个实施方案中，第二多肽形成分子大小比经透化细菌细胞的孔排出尺寸大的多聚体。本文使用的术语“多聚体”和其语法变形是指两个或更多个不同分子之间的多聚体复合物的形成。多聚体可以包含例如相同蛋白质的两个或更多个分子(即，同源多聚体)或两个或更多个不同或非一致(non-identical)蛋白质的混合物(即，异源多聚体)。形成适合于在本发明方法中使用的多聚体的蛋白质包括形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体和包含七个或更多个亚基的更高级别多聚体的那些蛋白质。

多聚体蛋白质包括：同源二聚体，例如PDGF受体α和β亚型、促红细胞生成素受体、MPL和G-CSF受体；异源二聚体，其各亚基具有配体结合结构域和效应结构域，例如PDGF受体αβ亚型；和多聚体，其具有具备不同功能的组分亚基，例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7和GM-CSF受体。可用在本发明方法中的其他多聚体蛋白质的非限制性实例包括参与DNA合成或复制的因子，例如参与mRNA产生的DNA聚合酶蛋白质，例如TFIID和TFIIH；细胞、核和其他膜相关蛋白质，例如激素和其他信号转导受体、主动转运蛋白和离子通道、血液中的多聚体蛋白质，包括血红蛋白、纤维蛋白原和von Willabrand因子；形成细胞内结构的蛋白质，例如肌动蛋白、肌球蛋白和微管蛋白，以及其他细胞骨架蛋白；形成细胞外环境中的结构的蛋白质，例如胶原蛋白、弹性蛋白和纤连蛋白；参与细胞内和细胞外转运的蛋白质，例如驱动蛋白(kinesin)和动力蛋白(dynein)，SNARE蛋白质家族(可溶性NSF附着蛋白受体)和网格蛋白；帮助调节染色质结构的蛋白质，例如，组蛋白和精蛋白、Swi3p、Rsc8p和moira；多聚体转录因子，例如Fos、Jun和CBTF(CCAAT盒转录因子)；多聚体酶，例如乙酰胆碱酯酶和醇脱氢酶；伴侣蛋白质，例如GroE、Gro EL(陪伴蛋白60)和Gro ES(陪伴蛋白10)；抗毒素，例如，蛇毒、肉毒毒素、链球菌超级抗原(Streptococcus super antigen)；溶素(来自细菌噬菌体和病毒的酶)；以及大部分变构蛋白。在一个实施方案中，多聚体蛋白质是大肠杆菌蛋白质。形成多聚体的大肠杆菌蛋白质的非限制性实例包括L-鼠李糖异构酶(RhnA，例如NCBI登录号CAA43002)、β-半乳糖苷酶(β-gal，例如NCBI登录号YP001461520)、甜菜醛脱氢酶(BetB，例如NCBI登录号AAA23506)、谷氨酸-5-激酶(G5K，例如NCBI登录号AAB08662)、谷胱甘肽合酶(GshB，例如NCBI登录号AP_003504)和中链醛脱氢酶(YdcW，例如NCBI登录号AP_002067)。

在一个实施方案中，针对期望活性进行筛选的多肽具有足以使多肽保留在细菌细胞壁内的分子大小。因此，本领域技术人员将理解的是，这样的多肽未必需要与第二多肽缔合以将所述多肽保留在经透化细菌细胞内。

在裂解性噬菌体和溶源性噬菌体上的衣壳展示

在另一个实施方案中，多肽可以连接在大的大分子复合物上，例如噬菌体和/或噬菌体外壳蛋白上。可以通过将多肽的基因与噬菌体外壳蛋白的基因直接融合，或可以通过两种分别表达的多肽之间的强相互作用来实现多肽与噬菌体的连接。将蛋白质文库连接在裂解性和溶源性细菌噬菌体的头部表面上被称为“衣壳展示”。可适合地适于与多肽融合的噬菌体外壳蛋白的实例是11kDλD蛋白的基因(Sternberg和Hoess，1995；Mikawa等，1996)，其缀于λ细菌噬菌体头部；或25kDλV蛋白(Maruyama等，1994)，其是尾鞘蛋白。其它裂解性噬菌体还使用多肽与T4样噬菌体的9kD SOC蛋白的融合(Rao等，2007)以及与42kD T7衣壳蛋白10B的C端的融合(Dai等，2008)。在P2/P4细菌噬菌体系统的情况下，肽在21kD P4Psu蛋白的N端展示(Lindqvist和Naderi，1995)。

衣壳展示的示例性方法是使肽或多肽与λ细菌噬菌体的衣壳蛋白gpD的融合。该方法已经在文献(Sternberg和Hoess，1995；Mikawa等，1996；Gupta等，2003；Vaccaro等，2006；Levy等，2007)以及第7,732,150号美国专利和第6,884,612号美国专利中进行了详尽描述。

已经表明λgpD蛋白以每个噬菌体多至约400的价(valency)耐受多肽与N端或C端的融合(Mikawa等，1996)，尽管每个头部超过约50％融合蛋白的负载降低噬菌体的活力。λ衣壳展示和丝状体噬菌体展示的直接比较表明了在优秀的融合蛋白表达和靶标汰选过程中的捕获效率(Santini等，1998；Gupta等，2003)。尽管λ衣壳展示在筛选抗体文库中会有高应用价值，但是其仅被引用为被三个小组使用。Gupta等(2003)证明单链抗体(scFv)生产性折叠并且通过ELISA测定的反应性是丝状噬菌体展示抗体的约100倍。类似地，Vaccaro等(2006)发现λ是展示scFv的极好平台。但是，如Vaccaro等(2006)表明的，这是由于所选scFv显著和稀有的稳定性，其能够在胞质中折叠。这些作者表明，对于其他scFv序列，很可能难以获得生产性(productive)展示。Levy等(2007)承认并利用了该事实来尝试使用λ展示作为遗传筛选来选择会提高胞质中scFv的生产性折叠的大肠杆菌胞质蛋白。他们的结果是仅非常适中地提高了scFv的生产性折叠。本发明方法可在裂解缺陷型噬菌体中的衣壳展示系统中使用稳定的scFv支架，例如由Gupta等(2003)和Vaccaro等(2006)证明的。

使用裂解缺陷型噬菌体包装多核苷酸和在衣壳表面上展示所编码多肽二者具有很多优点。首先，噬菌体衣壳作为多核苷酸稳定的、保护免受核酸内切酶作用的包封体，其形式为，一旦释放，能够产生高产率的回收(可以回收接近100％的包装噬菌体)。其次，噬菌体衣壳充当了经透化细胞内所编码多肽的稳定的和众多的结合位点。图25表明，该性质可用于直接显现scFv与其荧光靶标的结合，其中scFv与λgpD蛋白融合。因此，包装进裂解缺陷型噬菌体并进一步被经透化细胞包封的多核苷酸文库可用在本发明蛋白质展示方法中。使用该实施方案的展示的实例是筛选荧光标记靶标与衣壳展示抗体或亲和支架的结合，其中所述结合使用荧光显微镜或使用FACS检测。图25表明了使用FACS阳性识别了与展示衣壳结合抗体的包封噬菌体结合的荧光靶标。

使用裂解缺陷型噬菌体的进行文库展示和包装的第三个优点是，不能从诱导的宿主细胞中释放噬菌体使得通过对宿主细胞进行离心接着使用去污剂或氯仿透化并使用纯化的溶菌酶诱导裂解能够将噬菌体浓缩至高滴度。本发明人可报道，当使用噬菌体的裂解缺陷型突变体包装时，与裂解性噬菌体的液体培养滴度相比，λ形噬菌体的滴度可提高100倍。当使用裂解缺陷型突变体包装噬菌体时，常规地，每mL经Readylyse(Epicentre)裂解的细胞获得＞10¹¹噬菌体的滴度。为了获得该水平的滴度，需要费力地沉淀和超速离心噬菌体溶解产物，这有在长程序过程中损失表面结合的融合蛋白质的风险。

通过本发明方法实现的衣壳展示的另一提高是，可通过细胞透化容易地除去未与包封的噬菌体颗粒结合的过量的可溶衣壳融合蛋白。该特征对于靶标与包封细菌噬菌体颗粒的结合是重要的，因为不如此的话，可在溶液中发生与未结合衣壳的融合蛋白的结合，而未结合衣壳的融合蛋白通常是过量的。不区分衣壳结合的融合蛋白和可溶性融合蛋白，会降低展示亲和蛋白的细菌噬菌体的结合和/或捕获。

实施例20和23分别描述了亲和蛋白与Hy5噬菌体(具有P2结构基因的P2/186杂交体)和λ噬菌体衣壳蛋白(gpL和gpD)二者的融合，以及它们被证明在通过基质结合靶标的富集中的用途。

待筛选多肽不一定与噬菌体衣壳蛋白直接融合，替代地，其可以表达为在体内通过蛋白质结构域的稳定缔合连接在噬菌体外部的独立多肽。这样的缔合的实例可以是蛋白质结构域和肽配体之间的高亲和力，例如在钙调蛋白与钙调蛋白结合肽(CBP)之间观察到的。或者，缔合可以通过两个多肽之间的共价相互作用建立。其的一个实例是分别作为伴侣融合至展示蛋白和噬菌体外壳蛋白的SNAP和CLIP蛋白(New England Biolabs)，以及被这两种蛋白质共价结合的配体。

DNA结合蛋白

本发明人发现，在透化之后，DNA保留在细菌细胞中。因此，在一个实施方案中，多肽与DNA结合蛋白缔合以形成蛋白质复合物，所述蛋白质复合物与DNA结合并保留在细菌细胞内。本文使用的“DNA结合蛋白”是指包含DNA结合结构域的任意蛋白质，所述DNA结合结构域包含至少一个识别双链或单链DNA的基序。如本领域技术人员已知的，DNA结合结构域包括螺旋-转角-螺旋、锌指、亮氨酸拉链、有翼螺旋、有翼螺旋转角螺旋、螺旋-环-螺旋、识别DNA的免疫球蛋白折叠或B3结构域。多肽与DNA结合蛋白的缔合有利地提供改进的DNA回收，如编码本发明筛选方法中的多肽的质粒。

DNA结合蛋白的实例包括细菌感受态蛋白，例如但不限于：大肠杆菌DNA结合蛋白，淋病奈瑟菌(Neisseria gonorhoeae)DNA结合蛋白，例如ComE，腺病毒E2蛋白，AraC转录因子，碱性螺旋-环-螺旋转录因子，碱性亮氨酸拉链转录因子，丁酸盐响应因子(butyrateresponse factor)、着丝点蛋白B、COUP转录因子、早期生长响应转录因子、G盒(G-box)结合因子、GATA转录因子、HMGA蛋白、同源结构域蛋白、I-κB蛋白、整合宿主因子、干扰素调节因子、干扰素刺激基因因子3、Kruppel样转录因子、亮氨酸响应调节蛋白(leucineresponsive regulatory protein)、基质附着区结合蛋白、甲基-CpG结合蛋白、MutS同系物2蛋白、骨髓-淋巴白血病蛋白、NF-κB、NF1转录因子、核呼吸因子(nuclear respiratoryfactor)、癌基因蛋白p55、起始识别复合物、成对盒转录因子、POU结构域因子、原癌基因因子、Rad51重组酶、Rad52DNA修复和重组蛋白、复制蛋白A、复制蛋白C、成视网膜细胞瘤蛋白、Smad蛋白、SOX转录因子、T盒结构域蛋白、TCF转录因子、端粒结合蛋白、Toll样受体9、反式活化蛋白和有翼螺旋转录因子。在一个实施方案中，DNA结合蛋白是大肠杆菌DNA结合蛋白。在另一个实施方案中，DNA结合蛋白是淋病奈瑟菌蛋白(例如ComE)或其结构域。

细胞壁结合蛋白

用于针对期望活性进行筛选的多肽可与细菌细胞壁结合蛋白缔合。技术人员将理解，细胞壁结合蛋白的选择将取决于宿主细胞物种，因为不同细菌具有不同细胞壁组成。尽管细菌具有由肽聚糖(PG)构成的细胞壁，但是物种之间的化学修饰可影响跨物种结合。技术人员将能够容易地确定适合于在特定细菌物种中使用的细胞壁结合蛋白。

细菌细胞壁结合蛋白包括这样的蛋白，已知其具有结构域结构，从而使得天然结构中多肽链的一部分能够识别并结合细菌细胞壁上的特定分子或分子构象。因此，术语“细菌细胞壁结合蛋白”包括蛋白质结构域，其为与细菌细胞壁特异性结合的蛋白质的一部分。细菌细胞壁结合蛋白的实例包括由细菌噬菌体编码的细胞壁水解酶、细菌的细胞壁水解酶和不同的自溶素。还涵盖由细菌噬菌体和其他病毒的DNA编码的受体分子。当细菌细胞壁结合蛋白来自细菌噬菌体来源的水解酶时，其能够与细菌特异性结合，细胞壁结合蛋白保持其结合能力，但是优选地不具有显著的水解活性。

在一个实施方案中，细胞壁结合蛋白与大肠杆菌的细胞壁非共价结合。例如，对于大肠杆菌宿主细胞，其具有内源PG结合蛋白，所述PG结合蛋白具有发生在PAL、OmpA、YiaD、YfiB和MotB中的保守的约100个氨基酸的PG结合结构域(Parsons等，2006)。但是，已经表明来自其他生物的蛋白质在大肠杆菌中很好地表达并且以高亲和力与细胞壁结合，例如，来自假单胞菌(Pseudomonas)噬菌体的约70个氨基酸的PG结合结构域(KzPG)(Briers等，2009)。因此，可以将来自与PG结合之蛋白质的PG结合结构域用作本发明方法中的细菌细胞壁结合蛋白。

在一个实例性实施方案中，PG结合结构域可以与针对期望活性进行筛选的多肽融合，并且在细菌细胞的胞质溶胶中表达。在膜透化之后，PG结合结构域接近细胞壁并与细胞壁结合，导致目的多肽保留在经透化细胞内。为了潜在地进一步增强目的多肽在细胞内的保留，本领域技术人员将理解，除细菌细胞壁结合蛋白之外，多肽可以与DNA结合蛋白缔合。

或者，目的多肽可以与能够共价连接至细菌细胞壁的蛋白质缔合。优选地，所述蛋白质包含周质靶向信号。因此，多肽在细菌细胞的胞质溶胶中表达，但是靶向周质，其中在膜透化之前其与细胞壁连接。

通过非限制性实例，共价连接到细胞壁的细菌细胞壁结合蛋白可以是能够与细胞壁结合的脂蛋白，并且其缺少外膜附着所必需的功能性N端信号序列。例如，脂蛋白可以是大肠杆菌LPP。LPP是一种含量丰富的大肠杆菌蛋白质，其形成三聚卷曲螺旋。在其天然形式中，一端通过脂化与外膜相连，另一端通过C端赖氨酸与细胞壁共价结合。脂蛋白还可包含使脂蛋白靶向周质的序列，例如，OmpF周质靶向序列。在一个实施方案中，脂蛋白是缺少外膜附着所必需的功能性N端信号序列的大肠杆菌脂蛋白。

根据本说明书的教导，本领域技术人员能够鉴定或设计能够与细菌细胞壁共价连接并适合在本发明方法中使用的蛋白质。

在本发明的一个实施方案中，针对期望活性进行筛选的多肽是包含KzPG结构域和一个或更多个其他结构域的融合多肽，所述其他结构域选自间隔物、SNAP和/或DBP。在一个具体实施方案中，融合多肽包含一个或更多个间隔物以及KzPG、SNAP和DBP结构域。

间隔物

在一个实施方案中，针对期望活性进行筛选的多肽可表达为包含一个或更多个间隔物的融合多肽。本文使用的“间隔物”是指这样的肽或多肽，其可以包含在融合多肽中以提高多肽在细菌细胞中的表达或降低空间位阻，从而使针对期望活性进行筛选的多肽可呈现其期望的三级结构和/或与其靶分子之间适当地相互作用。因此，融合蛋白质可包含位于融合多肽中一个或更多个多肽结构域之前、之后或之间的一个或更多个间隔物。对于间隔物和鉴定期望间隔物的方法见例如George,等(2003)。

在一个实施方案中，间隔物包含1至50个氨基酸残基长、或约1至25个残基长、或约5至15个残基长的一个或更多个氨基酸序列。例如，间隔物可选自I27、RL1、RL2、RL3、RL4、RL5和/或RL6中的一个或更多个。本领域技术人员将理解，可以向间隔物中引入有限数量的氨基酸替换(例如1、2、3、4或5个氨基酸替换)而不影响其作为间隔物行使功能的能力。在一个具体实施方案中，一个或更多个间隔物选自SEQ ID NO：6至12或16中的任一个。因此，在一个实施方案中，针对期望活性进行筛选的多肽是包含I27、RL6、KzPG、SNAP和DBP的融合多肽。

在另一个实施方案中，间隔物区域可包含作为蛋白质结构域的高亲和力结合位点的肽序列。例如，钙调蛋白对来自蛋白质配体的许多肽序列(已经作图到短肽区域)具有Ca²⁺依赖性亲和力。这些CBP(钙调蛋白结合肽)已经被突变成以甚至更高的亲和力与钙调蛋白结合(Kd为约1nM至1pM)(Montigiani等，1996)，使得可进行Ca²⁺开关切换，在一个具有CBP间隔物且另一个与钙调蛋白融合的两种蛋白质之间的高亲和相互作用。

筛选方法和蛋白质进化(protein evolution)

本发明提供了用于针对抗靶分子之期望活性筛选多肽的方法。本文使用的术语“期望活性”是指多肽的任何潜在有用活性，包括但不限于：结合性、酶促修饰、折叠稳定性和/或热稳定性。

术语“靶分子”是指与多肽结合和/或被所述多肽修饰的分子，并且可以是例如：抗体、受体、抗原、酶等。因此，“靶分子”可用于指底物(例如酶底物)或被评估结合性的分子(例如，配体、表位、抗原、多聚化伴侣，例如同源或异源二聚物伴侣等，或其任意组合)。

应理解的是，可以在表达单一多肽的单一细胞类型的背景下，或在每一种细胞表达不同多肽或多肽变体的细胞文库的背景下筛选或选择多肽活性。因此，本发明方法可用于体外蛋白质进化。体外蛋白质进化使得能够研究大量的蛋白质功能和特征，并且通常包括两个主要步骤：多样化和选择。多样化依赖于产生编码多肽之核酸的多样文库的能力。选择可通过从文库中针对期望活性进行筛选并将活性与基因型联系起来来实现，例如，通过鉴定包含引起所观察活性的基因型的文库成员。

DNA文库是包含编码多肽的DNA插入物(DNA片段)的重组载体的集合。DNA插入物的来源可以是基因组、eDNA、合成或半合成的。多肽可具有任何期望活性，例如，目的多肽可以是结合蛋白，如抗体，或酶，如聚合酶、连接酶、限制酶、拓扑异构酶、激酶、磷酸酶、代谢酶、催化酶或者生长因子激素、抗微生物肽、抗原、受体、报告蛋白、免疫调节蛋白、神经递质、结构蛋白、转录因子或转运蛋白。在一个实施方案中，多肽是抗体或酶。因此，本发明方法可用于针对期望活性筛选多肽的变体。

可以使用本领域中已知的方法进行例如结合蛋白或酶的DNA文库的克隆和构建。例如，Lutz和Patrick(2004)综述了产生文库多样性的方法和用于在蛋白质工程中使用的基因重组策略。为了筛选展示的多肽变体，可以采用用于表面展示文库的策略并将其适用于本发明方法(Becker等，2004；Daugherty等，2000；enrick等，2007；Miller等，2006)。

可以将核酸文库引入到多种细菌细胞中，导致各细菌细胞表达文库的成员。除了被表达外，多肽保留在经透化细菌细胞内或连接在细胞壁上，以便评估其功能或特征。可以通过多种方法来产生多肽(例如，结合蛋白如抗体)或酶的核酸文库，包括通过引入突变如点突变、缺失和插入，或通过重组事件。产生变体文库的方法是本领域中已知的，包括易错PCR(error-prone PCR)、在DNA修复受损的细菌中合成DNA和DNA的化学修饰。通过重组产生文库的方法是本领域中已知的，并且包括基因改组(gene shuffling)、在产生高度重组的细菌中组装DNA、合成的核酸文库组装等或其任意组合。这样，可以将编码多肽多核苷酸文库引入到多个细菌细胞中，导致在各细菌细胞中表达文库的一个或成员。

在一些实施方案中，文库包含两种或更多种多肽的变体，其中每一种变体包含在氨基酸序列中具有微小变化的独特多肽。在另一些实施方案中，文库包含两种或更多种不相关序列。例如，为了鉴定可抑制酶的候选多肽，可查询随机序列或预定序列的文库。文库可具有至少2、至少5、至少10、至少50、至少100、至少1000、至少10,000、至少100,000、至少1,000,000、至少10⁷个或更多个成员。

结合蛋白展示

在一个实施方案中，本发明方法被应用于结合蛋白如抗体的进化。因此，在一个实施方案中，针对期望活性进行筛选的蛋白质是结合蛋白，靶分子可以是可与结合蛋白结合的任意分子，并且期望活性是与靶分子的结合和/或结合的程度。本发明方法可包括，例如：培养包含编码结合蛋白的多核苷酸的细菌细胞，从而在细胞中产生所述蛋白质。随后使所述细胞透化并使经透化细胞与靶分子接触。可以使用本领域中的任何合适方法来确定多肽是否与靶分子结合和/或结合的程度。

本发明方法特别适合于筛选结合蛋白展示文库。与其他体内表面展示方法不同(其必然需要使蛋白质靶向细胞外空间，因为细胞膜阻止与呈递至所展示蛋白的经标记靶标的相互作用)，本发明方法可以在宿主细胞的胞质中表达和折叠亲和蛋白。因此，筛选参数可包括细菌胞质中亲和变体蛋白的高产率和生产性折叠。

另外，因为胞质蛋白在还原环境中表达和折叠，本发明方法可应用于选择可以在还原环境下生产性折叠的抗体或在天然形式下具有二硫键的其他蛋白质的变体。预期所选择的变体将更稳定，因为其折叠稳定性会不依赖于结构域内或结构域间二硫键。该方法在开发可用于靶标的细胞内结合(以中和或标记)的抗体中有应用。

因此，本发明方法可用作展示和选择多种结合蛋白的平台，包括本领域已知的那些支架，例如单链抗体(scFv)、结构域抗体、Fab，以及非抗体支架，例如脂质运载蛋白(lipocalin)、FN3、泛素、γ-B-晶体蛋白(γ-B-crystallin)。

多肽筛选与噬菌体展示相组合

将被筛选的多肽连接在丝状噬菌体表面(一般为一个或几个拷贝)的常规噬菌体展示能够平行地筛选大量克隆对靶分子的亲和力。但是，低亲和力和中等亲和力克隆的背景高并且在不进行亚克隆和测序的情况下不能区分独特克隆，各独特克隆的特性(例如，表达水平、溶解度和亲和力)的确定通常需要改变表达形式。因此，在现有技术方法中，在初始噬菌体展示筛选的下游有极大量的工作。

相比之下，本发明方法允许使用FACS来表征革兰氏阴性细菌细胞内或连接在革兰氏阴性细菌细胞上的多肽。FACS能够确定结合参数，导致具有期望特性的克隆被高度富集。但是，单个克隆的筛选是连续的，即使用每秒10⁴个克隆的分选速率，可以在一次筛选中处理的个体数目也具有比较低的上限。例如，筛选10⁸个克隆会占用超过2小时。

因此，在一些情况下，可期望将常规噬菌体展示系统的平行筛选与本发明提供的通过FACS分析的细胞展示的克隆表征进行组合。因此，可以通过常规噬菌体展示进行早期筛选，随后通过本发明的展示系统分析输出克隆，在本发明的展示系统中，多肽被细胞壁保留在细菌细胞内和/或连接在细胞壁上或连接在包封的裂解缺陷型噬菌体上。

因此，可以表达基因文库并如本文所述通过与噬菌体蛋白的融合或通过两种多肽的稳定缔合在裂解性噬菌体或丝状噬菌体的表面上展示。这些噬菌体可以使用细菌噬菌体展示的标准技术针对多肽的活性进行筛选(“汰选(spanning)”)。可以产生展示粘附于靶分子如亲和底物上的融合蛋白的噬菌体并且例如通过感染到包含原噬菌体溶源菌的辅助菌株中作为粘粒回收。可以重复该循环直到文库中主要为经富集的克隆。此时，可以将文库亚克隆到根据本发明方法进行包封展示的载体系统中。

因此，在本发明一个实施方案中，在本发明筛选方法之前和/或之后进行额外筛选步骤。如上文所述的，额外筛选涉及常规噬菌体展示系统，即这样的噬菌体展示系统：其中i)：编码针对期望活性进行筛选的多肽的多核苷酸未包装在裂解缺陷型噬菌体中，和/或ii)：多肽未被细菌细胞壁保留在细菌细胞内和/或连接在细菌细胞壁上。这些额外筛选可包括已知的噬菌体展示方法，例如，使用裂解性λ噬菌体或丝状M13噬菌体。

在本发明方法的另一个实施方案中，可以将常规噬菌体展示方法与使用裂解缺陷型噬菌体和包封的细胞展示相组合，以使得能够在蛋白质展示的两种形式之间灵活切换，而不进一步亚克隆富集文库的DNA。

在该实施方案中，待展示蛋白质可以作为噬菌体衣壳蛋白的融合物由克隆入裂解缺陷型细菌噬菌体或噬菌粒或克隆入可由原噬菌体包装的粘粒中的多核苷酸编码。构建用于衣壳展示的细菌噬菌体载体如λ载体的方法描述在Mikawa等(1996)、Sternberg和Hoess(1995)、以及Vaccaro等(2006)中。构建噬菌粒和粘粒载体的方法也是本领域中周知的。例如，基于pUC和pBR322来源的噬菌粒载体分别由Yankovsky等(1989)和King等(1982)描述。对于λ粘粒的Sambrook和Russell(2001)以及对于P2/P4/186粘粒的Kahn等(1991)均提供了载体的良好一般描述和详细描述。将粘粒转化到包含裂解缺陷型原噬菌体的细菌细胞系中，并且诱导衣壳融合蛋白的表达和粘粒载体的包装二者。

或者，将裂解缺陷型细菌噬菌体载体转化/感染到宿主细胞中并类似地诱导衣壳融合蛋白和细菌噬菌体载体基因组的表达。

在包装细菌噬菌体/粘粒载体之后，可以通过使用去污剂或有机溶剂如氯仿的透化步骤和酶促溶菌酶活性(如作为ReadyLyse(Epicentre)市售)的组合处理来裂解细胞以释放包装的噬菌体。现在可以通过噬菌体展示选择的常用方法针对与靶标的结合“汰选”展示文库。在汰选之后，通过再感染到包含裂解缺陷型原噬菌体的细菌细胞中可以回收文库。可以重复汰选和再感染的循环直到文库群中结合噬菌体的比例大幅富集，此时，在产生噬菌体的下一循环中，使细胞透化，但是省略酶促裂解步骤，因此产生包封噬菌体的亚文库。可使荧光标记靶标与这些包封噬菌体结合，然后将其通过FACS分选(如实施例23中所述和图25中所观察到的)。

本领域技术人员将理解，本实施方案提供了在两种不同展示模式之间移动的展示文库：1)针对固定化靶标汰选游离噬菌体，这是低克隆选择性的高度平行筛选；和2)包封单个克隆的FACS表征和纯化，这是高选择性但是低通量的筛选。因此，本发明方法的该实施方案具有以下能力，利用每一种系统的最有力要素，而使用者不对形式变换进行干预(这在不如此的情况下是需要的)。因此，这样的实施方案高度适于自动化(robotic)、高通量的工作流程。

在本发明方法的另一实施方案中，可鉴定可溶性抗体并用作基因文库中的支架，所述基因文库可在噬菌体展示和通过本发明方法的革兰氏阴性细菌细胞展示之间转换。

酶展示

本发明方法可用于酶展示和酶文库以及用于酶特性的进化。因此，在一个实施方案中，针对期望活性进行筛选的多肽是酶，靶分子是酶的底物，期望活性是与靶分子的结合和/或对靶分子的酶促修饰。本领域技术人员将理解，使用其他表面展示技术来开发酶活性测定的方法可用样地用作本发明方法的测定。

本发明方法也良好地适于在宿主细胞中表达的酶文库的使用中，所述宿主细胞经透化，然后作为水包油包水乳剂(w/o/w)悬浮。Aharoni等(2005)证明了使用在w/o/w乳剂中的细胞表面展示酶文库通过FACS改进对氧磷酶的应用。包封在不渗透油膜中的优点是可以将可扩散底物和产物保持为接近于酶活性和编码核酸序列。但是，Aharoni等(2005)描述的筛选需要将酶展示在宿主细胞的外部。使用本发明方法，可以使用细胞内表达和折叠的酶文库来改进酶功能。

在本发明方法中，培养包含编码酶的多核苷酸的细菌细胞以产生酶。在使宿主细胞透化之后，使细胞与酶的底物接触，并且可以使用已知方法来确定底物是否被酶修饰和/或酶修饰的速率。

在一些情况下，期望靶分子(例如，酶底物)连接到细菌细胞上。本领域技术人员将理解，靶分子可以与经透化细菌细胞的任何组分直接或间接连接。作为非限制性实例，可以通过靶分子与细菌细胞壁的连接来实现直接连接。靶分子的间接连接可以通过例如使靶分子与第二多肽连接来实现，所述第二多肽与针对期望活性进行筛选的多肽缔合以形成蛋白复合物。例如，如本发明方法中使用的，靶分子可以与具有足以使蛋白质复合物保留在经透化细菌细胞内的分子大小的多肽连接，或其可以与DNA结合蛋白连接，或与细菌细胞壁结合蛋白连接。靶分子与细菌细胞的连接有利地使得能够使用技术如FACS或通过磁珠选择来分离呈递活性酶的细菌细胞。

本领域技术人员将能够容易地确定适于使靶分子与细菌细胞连接的偶联化学。合适的偶联化学包括利用硫醇偶联剂的半胱氨酸标记例如acrydite和马来酰亚胺，胺标记和羧基标记，其可由供应商市售，包括Pierce Protein Research Products和Invitrogen。

流式细胞分析

本发明的细胞展示技术可一次呈现几千个目的多肽分子，并且与分子展示技术如核糖体/mRNA展示或噬菌体展示不同，可使用流式细胞技术筛选，例如使用荧光活化细胞分选(FACS)设备。不仅可捕获文库中的阳性事件，而且对于每个阳性成员可同时确定参数如蛋白质表达、酶活性或靶标亲和力，从而提高筛选的输出。用于进行流式细胞术的仪器是本领域中已知的，并且包括FACS Star Plus、FACScan和FACSort(Becton Dickinson)、EpicsC以及MoFlo。流式细胞技术通常包括分离液体样品中的细胞。通常，FACS的目的是分析细胞的一个或更多个特征，例如，靶分子的存在。用于进行流式细胞分析的方法是本领域中公知的。例如，Farinas(2006)中描述了使用FACS测定酶活性的方法的综述。

对于本发明，流式细胞术可用于可相继进行的多轮筛选。可以从初始的一轮分选中分离细胞，并立即再次引入到流式细胞仪中并再此筛选以改进筛选的严密性。由于流式细胞术基本上是颗粒分选技术，所以培养细胞的能力不是必需的。用于从非活性细胞中回收核酸的技术是本领域中周知的，并且可包括例如模板依赖性扩增技术，包括PCR。

在鉴定出产生具有期望活性之多肽的革兰氏阴性细菌细胞之后，可以使用任何合适的已知技术从细菌细胞中分离编码多肽的DNA。因此，可以使用常规方法对编码多肽的DNA进行分离和测序。如期望，可以对多核苷酸进行另一轮多样化以产生另一变体文库，用于针对期望活性进行筛选。这样，可使用反复过程来优化多肽的期望活性。

在用裂解缺陷型噬菌体包装多核苷酸的一些实施方案中，通过用溶菌酶如ReadyLyse(Epicentre)处理经透化细菌细胞以降解细胞壁并释放用于随后感染的噬菌体来回收包装的噬菌体文库或粘粒文库，可容易和迅速地从FACS后筛选回收编码具有期望活性之文库多肽成员的多核苷酸，以用于进一步反复富集或用于克隆分析。

因此，本发明的该实施方案允许利用FACS筛选同时表征表达和结合参数，以及容易地回收和操作包装噬菌体的基因文库。使用裂解缺陷型噬菌体文库的反复FACS筛选轮因此被简化并且不依赖于阳性克隆的PCR扩增(其具有伴随的突变错误并且需要操作)。

使用裂解缺陷型噬菌体包装基因文库

本发明人发现使用可诱导的裂解缺陷型原噬菌体使得能够高效率地在革兰氏阴性细菌中克隆和包装基因文库。可诱导的原噬菌体是存在于革兰氏阴性细菌细胞的基因组中的原噬菌体，其中，在诱导原噬菌体活化之后，原噬菌体被活化为细菌细胞中的噬菌体。然后细胞中的噬菌体能够包装多核苷酸。

可以将编码待通过本发明展示方法筛选之蛋白质的多核苷酸包装进具有裂解阶段的噬菌体中，或可替代地包装进裂解缺陷型噬菌体中。裂解性噬菌体和溶源性噬菌体二者的基因组一般具有对任一者的生命周期非必要的区域，并且可用克隆基因和缔合的调节区替换。非必要区域可包括含有用于DNA重组的基因的区域(例如，λ细菌噬菌体bet和exo基因以及Nin5区)或提供对溶源体的宿主细胞生存功能的区域(例如，λ噬菌体Ea47、Ea31、Ea59、Lom和bor基因，P2噬菌体Old和Fun基因)。或者，可以对包装比正常稍大的基因组有耐受性(例如，λ细菌噬菌体包装长至48.5kb的野生型长度的105％的长度)，这使得能够直接将短区域克隆进基因组中而不替换非必要区域(例如在T7选择噬菌体(T7Select Phage)展示系统(Novagen)中)。当将基因文库克隆进裂解缺陷型细菌噬菌体载体中时，裂解基因也代表非必要区域。

当可行时，应将编码针对期望活性进行筛选之多肽的多核苷酸克隆进噬菌体基因组的区域中以使得其不破坏细菌噬菌体基本操纵子的转录和翻译。因此，技术人员将理解，可以使用其自身的转录调节区如其自身的启动子和/或终止子来表达多肽。

还可以使用指导辅助噬菌体将质粒包装成感染性噬菌体颗粒的元件来构建针对期望活性进行筛选的多肽的基因文库。例如，细菌噬菌体λ、P2、P4和其他λ型噬菌体的cos区域是＜500bp的元件，所述元件具有末端酶的结合和切割位点，其将包含这些区域的质粒切割和包装为噬菌体衣壳头部内的线性元件。可以将这些cos区克隆进质粒中，则其在本领域中被称为粘粒。一般来说，粘粒的大小必须接近于野生型基因组的大小，通常在野生型噬菌体基因组的80％至105％内，以便有效地包装。或者，其可以是野生型基因组的单位分数(1/2、1/3、1/4)，其中粘粒的多聚体包装在单个噬菌体头部中。多聚体可以通过recA⁺细胞中粘粒之间的重组在细胞内形成，或者可以在细菌噬菌体的复制周期(例如，通过λ细菌噬菌体的滚环复制(rolling circle replication))中形成。

P2噬菌体或相关的186噬菌体或者186和P2的杂交体及其卫星P4有利地为基于质粒的克隆技术提供了大小易操作的粘粒(约11kb)，并且P2末端酶蛋白优先包装包含单个cos区的质粒底物，而不是具有相邻cos区的线性多聚体(如λ末端酶优选的)。因此，可以容易地构建粘粒文库并高效地体内包装。使用P2噬菌体包装基因文库的方法描述在Kahn等(1991)中。

可以在感染宿主细胞之后在体内包装使用裂解性细菌噬菌体(例如，T7Select)制备的噬菌体文库。当噬菌体为裂解缺陷型时，细胞将保持完整性，直到通过本发明方法透化和筛选。然后通过用溶菌酶处理以降解肽聚糖并释放噬菌体颗粒，可以从所选细胞中回收感染性噬菌体。

通过诱导整合的原噬菌体的活化或通过辅助噬菌体的感染以产生噬菌体并进入裂解途径来在体内包装使用溶源性细菌噬菌体或其粘粒制备的噬菌体文库。通常使用噬菌体免疫阻遏蛋白的温度敏感性突变体实现原噬菌体的诱导。可以在低温下在宿主细胞中建立文库，然后通过上升的温度变化诱导细菌噬菌体包装。例如，λ噬菌体的阻遏基因的cI857等位基因在30℃下支持溶源性的建立和保持，但是在高于37℃的温度下失活，迫使原噬菌体切除并进入裂解性途径。但是，已知为非诱导性噬菌体的P2噬菌体不可通过标准方法如UV或温度敏感性阻遏物诱导。而是，通过使用P4卫星(尤其是阻止建立P2/P4共溶源体而活化P2的P4的vir突变体)的感染可以诱导P2作为辅助噬菌体的功能用于粘粒包装。但是，P2相关噬菌体186不具有可以在失活之后诱导噬菌体复制和包装的温度敏感性阻遏子cIts(Woods和Egan(1974))。此外，通过共感染获得P2和186的杂合噬菌体，其包含噬菌体186的温度可诱导复制控制和P2的结构基因。已知一种这样的噬菌体是Hy5(Younghusband等，1975)。

还可以克隆和诱导调节P2裂解途径的P2和P4元件以引起裂解。实施例17详细描述了使用转录因子P4δ、P2cox和P2ogr基因诱导大肠杆菌C菌株P2/P4共溶源体(co-lysogen)的裂解和粘粒包装。使用λ噬菌体cI857阻遏物及其内源启动子和cro基因的操作子区以调节P2和P4转录因子的表达。δ基因是裂解的最迅速活化子，在其之后按顺序是ogr和cox基因。细胞裂解伴随着感染性P4噬菌体和粘粒颗粒的释放。

可诱导P2活化的其他P2控制基因包括完整的P4sid-δ-psu操纵子和P4ε抗阻遏物，或它们的组合。

转化进包含P2辅助噬菌体和共溶源P4辅助噬菌体和/或上述P4控制区的细胞中的粘粒文库可以在诱导P2活化之后体内包装。当噬菌体是裂解缺陷型时，细胞将保持完整，直到通过本发明方法透化和筛选。然后通过用溶菌酶处理以降解肽聚糖并释放噬菌体颗粒来从所选细胞中回收感染性粘粒噬菌体颗粒。

试剂盒

可以以试剂盒的形式便利地提供进行本发明方法必需的组分。如本领域技术人员将理解的，试剂盒中的多种组分可以在单独容器中或以小份提供，或者溶液组分可以以不同组合和不同浓度进行组合以实现对本发明方法的最佳性能。试剂盒的哪种组分可以组合从而使组分在使用之前保持为稳定形式在技术人员的知识范围内。

在一个实施方案中，本发明的试剂盒通常最少包含载体，所述载体包含用于向所述载体中插入编码第一多肽的多核苷酸的位点，和编码第二多肽的开放阅读框，所述第二多肽与第一多肽缔合以形成保留在经透化细菌细胞内或连接在其细胞壁上的蛋白复合物。优选地，试剂盒还包含用于使细菌细胞透化的试剂。在一个实施方案中，试剂盒还包含细菌细胞，优选革兰氏阴性细菌细胞。若需要，试剂盒中可包含其他另外的组分，或由最终使用者提供的其他组分。

本发明还提供了适合在利用裂解缺陷型噬菌体针对期望活性筛选蛋白质的方法中使用的试剂盒。这样的试剂盒通常最少包含革兰氏阴性细菌，所述革兰氏阴性细菌包含裂解缺陷型噬菌体和温度敏感性噬菌体阻遏蛋白和/或编码一种或更多种噬菌体活化蛋白的多核苷酸。在一个实施方案中，试剂盒包含选自P2、186、Hy5和/或P4的裂解缺陷型噬菌体。在另一个实施方案中，试剂盒包含裂解缺陷型λ噬菌体。试剂盒可任选地包含用于使革兰氏阴性细菌细胞透化的试剂。

实施例

实施例1筛选透化大肠杆菌的去污剂

为了鉴定可使大肠杆菌细胞透化的去污剂，我们针对摄取膜不渗透染料Gel Red(Biotium，目录号41002)和释放GFP二者筛选了许多离子型(正十二烷基-β-亚氨基二丙酸、癸基三甲基氯化铵、十二烷基肌氨酸钠、anzergent3-10)和非离子型(二甲基辛基氧化膦[Apo8]、二甲基癸基氧化膦、正辛基-β-D-硫代吡喃葡糖苷[8TGP]、蔗糖单十二烷酸酯、Mega10、Tween80、Triton X100、Triton X114)去污剂。测试透化的去污剂购自Anatrace。

所有经报道实验中使用的大肠杆菌宿主菌株都是K12衍生的Argentum(AlchemyBiosciences)细胞系(ΔmcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)ΔendA lacZΔM15)。但是，还利用B菌株衍生的BL21(F-dcm ompThsdS(rB-mB-)gal)和K12克隆菌株DH5α(F^-endAl glnV44thi-lrecAl relAl gyrA96deoR nupGΦ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169,hsdR17(r_K ^-m_K ⁺),λ-)测试了本发明方法并获得可比较的结果。

将GFP克隆进阿拉伯糖诱导型高拷贝数载体(pAra1：：GFP5)中。表达来自由具有新鲜划线培养菌落的平板高度接种的培养物。将培养物在37℃下培养至约0.3OD600，这时通过添加阿拉伯糖至0.2％终浓度进行诱导。将经诱导培养物在25℃下摇动2小时，之后收获。

通过离心使细胞从1mL经诱导培养物中沉淀，通过在300μL LB中的0.5％去污剂中悬浮进行透化，并且在25℃下孵育10分钟。使经透化细胞沉淀并重悬在水中的1×Gel Red中2分钟，之后沉淀并在300μL TBS中洗涤一次。将其悬在300μL TBS中并且通过添加DABCO/甘油(将0.0325g DABCO溶解在900μL甘油+100μLPBS中)进行荧光显微法处理。

在具有Slider照相机的Olympus Provis AX70光学显微镜(SPOTRT2.3.0Software v4.6)或Leica TCS SP2共聚焦扫描激光显微镜/Leica DM IRE2倒置显微镜(Leica Confocal Software v2.0)上观察样品。

图1示出了表达GFP的大肠杆菌的去污剂透化结果。尽管未处理的细胞为绿色(GFP)，但是已经透化的细胞失去了其内部GFP并摄取DNA结合Gel Red染料，被染成红色。尽管nonidet-40表现了一些透化，但是Apo8和Mega10表现为使经透化细胞的比例更高。这两种去污剂各自0.5％的混合物被称为试剂86(Agent86)，被证明几乎完全透化，另一种去污剂正辛基-β-D硫代吡喃葡糖苷(8TGP)也是这样。Mega10、Apo8和8TGP全部都是非离子去污剂，其具有比离子去污剂更小的对蛋白质折叠和功能的破坏性。

因为在透化之后细胞壁保持完整，通过SDS-PAGE分析来自上述去污剂透化的上清液的可溶性蛋白质提取物。还向进行透化的细胞的样品中添加2mg/mL终浓度的母鸡卵白溶菌酶(Boehringer Mannheim；837059)以除去细胞壁并释放全部细胞蛋白质。然后向样品中添加具有β巯基乙醇的SDS-PAGE上样染料，将所述样品在95℃下变性2分钟。将20μL样品上样到9％SDS-PAGE上并用考马斯亮蓝/甲醇/乙酸染色/固定。

图2示出了用显微镜观察的与GFP释放和Gel Red摄取直接相关的可溶性蛋白质的释放。明显地，与使用溶菌酶除去了细胞壁的相比，具有完整细胞壁的细胞的蛋白质释放有差异，细胞壁包封的细胞释放最大约120kD大小的可溶性蛋白质。推测这是截留尺寸，在该尺寸之上，球蛋白不能通过构成革兰氏阴性真细菌细胞壁的肽聚糖网格的孔离开细胞。

实施例2保留宿主DNA的透化溶液的筛选

如果使用本发明方法筛选具有改进性能的蛋白质变体的基因文库，必须保持表达的蛋白质与其编码核酸之间的连接。由于膜透化步骤除去了阻止DNA通过细胞壁损失的障碍，所以检查可降低或防止宿主DNA损失的透化条件。

在不同介质中进行使用0.5％8TGP的细胞透化，并使用DNA结合染料Gel Red通过荧光显微镜检查DNA的损失。

测试的透化介质的组成(所有介质都具0.5％8TGP)：

LB培养基(每Lt10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl)

LB[-盐]培养基(每Lt10g胰蛋白胨、5g酵母提取物)

50mM Tris,pH7.5

50mM Hepes,pH7.0

170mM NaCl

250mM NaCl

25mM Tris,pH7.5+1.5％PEG6000(w/v)

50mM Tris,pH7.5+3％PEG6000(w/v)

50mM Tris,pH7.5+170mM NaCl

50mM Tris,pH7.5+250mM NaCl

用于透化的最佳介质被鉴定是LB细菌培养基。因此，以下的透化使用LB中0.5％8TGP或LB中的试剂86(LB中0.5％Mega10和0.5％Apo8)进行。

实施例3.蛋白质融合至四聚体支架

如通过实施例1中报道的实验观察的，尺寸大于约120kD的蛋白质被细胞壁保留在透化大肠杆菌细胞内。因此，有理由认为，如果通过与蛋白质伴侣融合而使总大小超过120kD，那么小于120kD的目的蛋白可保留在细胞壁囊内。

因此，我们克隆了来自大肠杆菌的6种不同的四聚体蛋白质来用作融合伴侣。这些蛋白质为β-gal、BetB、G5K、GshB、RhnA和YdcW，其单体大小分别为116kD、52kD、39kD、35kD、47kD和50kD。

构建阿拉伯糖诱导型的高拷贝载体来用于四聚体表达。将SNAP标签(NEB/Covalys)(与荧光底物共价结合的20kD结构域)克隆在四聚体基因的上游并用作表达报告子。融合蛋白的N端还包含6×His表位以便于纯化或检测。

阿拉伯糖载体pAra3：：His6：：SNAP的序列由SEQ ID NO.1提供。

通过添加0.2％阿拉伯糖来诱导融合蛋白的表达，并且将培养物在25℃下孵育2小时。

为了透化用于通过本发明方法进行蛋白质展示的细胞，方案如下：

1.通过离心沉淀1mi细胞。

2.使细胞重悬在300μL0.5％8TGP/LB中。

3.在25℃下孵育10分钟。

4.通过离心使细胞沉淀。

5.使细胞重悬在200μLTBS或LB中。

为了用膜不渗透的SNAP染料(Covalys New England Biolabs)标记SNAP表达报告结构域，方案如下：

1.将20nmolBG-488(绿色染料)或BG-547(红色染料)溶解在300μL DMSO中作为200×储液。

2.向悬浮在TBS或LB中的200μL经透化细胞中添加1μL200×储液。

3.在25℃下孵育15分钟。

4.通过离心沉淀洗涤细胞两次，并重悬在300μLTBS中。

为了通过荧光显微镜观察四聚体融合蛋白是否保留在经透化细胞囊中，方案如下：

1.将20μL细胞悬液滴在玻璃显微镜载片上，用盖片覆盖并用指甲油封边(湿封片)；或者，允许细胞微滴几乎干燥，在上面滴加20μLDABCO/甘油，用盖片覆盖并用指甲油封边(干封片)。

2.使用Olympus或Leica荧光显微镜观察样品。

通过在SDS-PAGE凝胶上跑胶并使用α-His6抗体探测的蛋白质提取物进行Western印迹确认全长融合蛋白的表达。所有四聚体构建物以可检测水平在大肠杆菌中表达(图3A)。

在大肠杆菌中表达的四聚体融合蛋白的荧光显微镜观察发现，β-gal和G5K具有显著的包涵体和低荧光，推测是由于难以使融合蛋白折叠。但是，如图4所示，对于GshB，通过SNAP荧光判断的融合蛋白的表达很好，对于RhnA、BetB和YdcW是极佳的。注意到，透化宿主细胞中融合蛋白的分布不均匀，通过亮视野显微镜和荧光显微镜二者都具有明显焦点。但是，因为荧光SNAP底物不与错误折叠的结构域结合，并且因为信号非常强烈，认为这些物体很可能是折叠蛋白质的聚集，并且不是未折叠蛋白质的包涵体，其在大肠杆菌中过表达蛋白质时经常被观察到。

SNAP：：四聚体融合物还具有His6N端表位。为了测试大分子(如抗体)是否能够穿过大肠杆菌细胞壁的网格结构，用αHis抗体探测经透化细胞以检测SNAP：：四聚体融合物。

1.如上文描述进行His6：：SNAP：：BetB支架融合物的表达和透化。

2.如上文描述用BG-547SNAP配体进行标记。

3.将200μL透化的SNAP标记细胞在LB中洗涤三次，并允许沉降在聚乙烯胺亚胺(PEI)覆盖的盖片上。通过送气除去过量的细胞介质并使载片风干。

4.将细胞在封闭缓冲液(PBS-Tween20中1％BSA、1％冷水鱼明胶(Sigma，G7765)、0.02％叠氮化物)中封闭1小时。

5.将细胞在以1∶10在封闭缓冲液中稀释的αHis一抗(Abeam，AB9136-100)中于25℃孵育过夜。

6.将细胞在PBS-Tween20中洗3次(每次10分钟)

7.将细胞在以1∶2000在封闭缓冲液中稀释的二抗(Molecular Probes，A11015)中于室温孵育1小时。

8.将细胞在PBS-Tween20中洗3次。

9.安置在DABCO/甘油中并在共聚焦/Olympus显微镜下观察。

图5表明αHis抗体在细胞壁囊内与SNAP荧光配体共定位，表明细胞壁的孔足够宽以允许相对大的蛋白质扩散进入内部囊体积。因此，即使相当大的蛋白质配体也可用作根据本发明方法在胞质内表达的亲和蛋白的亲和底物。

将SNAP融合伴侣和表达报告子与HALO蛋白(Promega)进行了比较以尝试观察亚细胞体的形成是否改变。与SNAP类似，HALO蛋白与膜不渗透的荧光底物(Alexa fluor488；G1001，Promega)共价结合。将HALO报告基因直接框内克隆至四聚体表达构建体中的SNAP基因的位置中。将HALO：：四聚体支架蛋白的表达与SNAP变体进行比较。基本如对SNAP的描述并根据制造商说明书进行经透化HALO细胞的标记。

图6表明，发现HALO：：四聚体和SNAP：：四聚体的表达模式类似，不同之处在于HALO：：RhnA融合蛋白比SNAP：：RhnA融合物稍更可溶，较少细胞包含荧光焦点。

因此，将蛋白质表达成四聚体支架的融合物(在本实施例中，SNAP或HALO)，然后使用合适的去污剂使大肠杆菌宿主细胞透化能够使目的蛋白保留在细胞壁内。

实施例4.作为细胞支架的DNA结合蛋白

为了将表现型与基因型结合起来，宿主细胞在透化后和整个功能筛选之中必须保留至少一些附加体DNA。由于已鉴定保留宿主基因组DNA和质粒DNA的透化条件，我们有理由认为DNA可用作目的表达蛋白质的保留支架。

因此，我们由淋病奈瑟菌ComE基因克隆了小的(80个aa)高亲和力螺旋-发夹-螺旋DNA结合蛋白(DBP)(Chen和Gotschlich，2001)，并且将其融合到阿拉伯糖可诱导构建体(pAra3：：GFP：：DBP；seq2)中的GFP的C端。

如实施例1的描述进行通过阿拉伯糖诱导的表达。如实施例1和3的描述使细胞透化并制备用于荧光显微观察。

图7表明，GFP：：DBP融合物(绿色)保留在经透化细胞中，并且与DNA结合染料GelRed(红色)共定位。

因此，将蛋白质表达成与高亲和力非特异性DNA结合蛋白融合的蛋白，然后用合适的去污剂使大肠杆菌宿主细胞透化能够使目的蛋白质保留在细胞囊中。

实施例5.经透化细胞中的DNA保留

为了证明透化之后基因组和附加体质粒二者的DNA保留在细胞囊内，我们制备了表达GFP5：：DBP和His6：：eGFP的细胞用于荧光显微法和质粒DNA提取。

在诱导之后，使细胞透化，然后冷冻或留在37℃的TBS中摇动过夜。所有样品在次日进行处理：或进行荧光显微法以通过DNA结合染料GelRed观察GFP和囊DNA含量，或进行质粒DNA的制备。

如实施例3的描述进行荧光显微法。图8表明，宿主细胞DNA(红色)和GFP5：：DBP(绿色)二者在透化后立即保留在细胞囊中而没有任何明显损失，在37℃孵育过夜的也是如此。透化后His6：：GFP蛋白从细胞中丢失，但是宿主细胞DNA(红色)在透化后以及也在过夜后依旧保留，同样没有明显损失。

为了确认不仅仅是宿主基因组，还有质粒DNA保留在经透化细胞中，在同样制备的样品上进行质粒小量制备。

从1mL的去污剂处理或未处理细胞通过质粒小量制备碱裂解方案制备质粒DNA。根据制造商的方案，使用Perfectprep Gel Cleanup(Eppendorf；955152051)柱和溶液提取由去污剂提取物释放进上清液的质粒DNA。

将来自每一个样品的全部量上样到1％琼脂糖凝胶上并使用图像阅读器LAS-3000软件和Multi Gauge v3.0软件在FujiFilm LAS-3000Intelligent Darkbox上成像。

图9示出了来自两种细胞系的质粒DNA样品的具有TEA缓冲液的溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶。

图9的泳道1是未处理细胞中的总质粒DNA。泳道2是来自透化步骤的上清液，泳道3是在透化之后保留在细胞囊中的质粒。尽管在图8中观察到可溶性His6：：GFP蛋白完全损失，但是观察到通过透化，非常少的质粒释放进入上清液。因此，质粒DNA几乎完全被细胞壁保留并可用在本发明方法中以在改进的蛋白质变体的筛选中连接基因型和表型。

确认显微镜数据的是，在将悬浮在TBS中的经透化细胞在37℃下孵育过夜之后，过夜孵育未表现出质粒DNA的任何损失(泳道5)。

实施例6：肽聚糖结合支架

在膜透化之后保留的另一细胞结构是细胞壁，其由肽聚糖(PG)的网格状聚合物构成。

为了非共价地结合PG，我们由假单胞菌噬菌体(KzPG)克隆了70aa的PG结合结构域，之前已表明所述噬菌体在大肠杆菌中良好表达，并且与细胞壁高亲和力(K＝3×10⁷M-1)结合(Briers等，2009)。因为对亲和蛋白的筛选可有希望鉴定出对其靶标的亲和力甚至比KzPG结合结构域对PG的亲和力更高的变体，所以需要提高支架结合蛋白的亲和力。为了提高支架结合部分的亲和力，我们在相同的融合蛋白中连接ComE DNA结合结构域(DBD)和PG结合结构域二者。因此，来自两种支架(PG或DNA)的融合蛋白的最终解离常数应接近于各速率常数的倍数。

因此，我们构建了表达载体pAra3：：His6：：KzPG：：SNAP：：DBP(SEQ ID NO：2)。如实施例1中所述诱导表达，如实施例3中所述为荧光显微镜法准备细胞。如实施例3中所述通过SNAP标记监测融合蛋白的表达和分布。

在细胞外周、细胞壁区域观察到了荧光，以及在囊的细胞壁界定体积内的扩散区域观察到了较低水平的荧光。

本发明的另一实施方案为在透化之前共价地将目的蛋白质连接在细胞支架上。为了实现这一点，我们使用蛋白质融合LPP，LPP为在周质中形成三聚体卷曲螺旋的含量丰富的大肠杆菌蛋白。在其天然形式中，一端通过脂化连在外膜上，另一端通过C端赖氨酸与细胞壁共价结合。

我们构建了表达构建体，其使OmpF周质靶向信号序列与SNAP表达报告子融合，之后是57个aa的大肠杆菌LPP序列(缺少外膜连接所需的半胱氨酸和N端信号序列)。如实施例1所述利用阿拉伯糖诱导表达载体pAra3：：OmpF：：SNAP：：LPP(SEQID NO：3)，并且如实施例3所述为荧光显微镜法准备细胞。如实施例3中所述通过SNAP标记监测融合蛋白的表达和分布。

图10表明LPP融合蛋白的分布在细胞壁的表面不均匀，具有强荧光的区域和无任何荧光的区域。但是，在几乎所有情况下，细胞的极(poles)是被标记的。

实施例7.使用四聚体蛋白质支架展示αGFP亲和蛋白

为了证明本发明方法适用于亲和蛋白，将对大羊驼针对αGFP进行免疫接种产生的单结构域抗体克隆进细胞支架载体中。应注意的是，在αGFP抗体的专利申请(WO2007/068313)中所列的两个序列中，发现仅R35变体是功能性的(αGFP-R35；蛋白质数据库ID3K1K)。因此，在所有实验测试中使用该序列。

将αGFP-R35基因作为N端融合物克隆至pAra3：：HALO：：FLAG：：RhnA四聚体支架以产生pAra3：：αGFP(R35)：：HALO：：FLAG：：RhnA载体(SEQ ID NO：4)。

还构建了pAra3：：His6：：eGFP载体以产生His6：：eGFP融合蛋白作为抗体的靶底物。如实施例1中所述诱导His6：：eGFP蛋白。使用0.5％8TGP从细胞中释放可溶性蛋白质，并通过使用Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen；30230)的IMAC纯化。从NTTW缓冲液+咪唑(500mMNaCl，50mM Tris-HCl，pH7.5，0.1％Tween20+200mM咪唑)中的Ni-NTA树脂洗脱His6：：eGFP。

如实施例1和实施例3所述进行抗体：：四聚体融合蛋白的表达和宿主细胞的透化。

为了在经透化细胞囊中使αGFP和eGFP结合，将囊沉淀悬浮在300μL eGFP中并允许在25℃下平衡20分钟，这时通过离心使囊沉淀，在300μL TBS中洗涤一次，然后重悬在TBS中。如实施例3中所述进行αGFP/eGFP囊的荧光显微镜观察。

图11表明表达αGFP：：HALO：：RhnA融合蛋白的经透化囊与eGFP的结合遍及细胞，尽管显示出更强染色的焦点，其可与图5中观察的利用HALO配体标记的焦点的相关。

因此，大羊驼αGFP抗体在胞质中功能性表达，此外，在去污剂透化之后保留在囊内。

实施例3中描述和图5中观察的αHis抗体标记已经表明，约150kD的大蛋白质能够穿过经透化细胞壁扩散进入囊的内部。但是，天然抗体是不规则形状的蛋白质，其中三个大致相等大小的结构域被柔性铰链区隔开。因此，这些蛋白质可以呈现的有效半径可以是小得多的球蛋白。但是，具有β筒形结构和约27kD的分子大小的GFP是对称蛋白质，其半径与其大小成比例，其能够穿过经透化囊的细胞壁被内部αGFP抗体结合。

因此，本发明方法可用于在大肠杆菌胞质中表达亲和蛋白，用于在亲和文库的展示中用于结合至少30kD的对称靶标。

实施例8使用PG和DNA结合蛋白支架展示αGFP亲和蛋白

使用与PG和DNA结合结构域融合的αGFP骆驼科抗体进一步证明了本发明方法。

如实施例6所述进行抗体：：KzPG：：SNAP：：DBP融合蛋白的表达、宿主细胞的透化和利用His6：：eGFP的标记。

使用湿封片和干封片二者使αGFP融合蛋白与eGFP的结合成像。图12表明两种不同的成像方法之间，GFP荧光具有显著差异。干封片(DABCO/甘油)细胞主要具有内部的荧光，亮视野和eGFP标记的合并表明细胞壁周围的区域不比内部体积强(图12B)。但是，直接在TBS中封片的细胞具有不同的模式：显示为细胞壁结合eGFP外边界强荧光以及较弱的内部信号(图12A)。不受理论的约束，我们推断DABCO/甘油溶剂环境是粘性的和非水性的，其阻止KzPG结构域与肽聚糖细胞壁之间的相互作用，但是不阻止αGFP与eGFP的结合或者DBP与DNA的结合。

但是，因为亲和蛋白或酶的筛选程序几乎总是在水性环境中进行，所以亲和融合蛋白的分布将接近图12A所观察的细胞壁结合湿封片。

实施例9.通过共价连接在细胞壁上展示αGFP亲和蛋白

还通过将αGFP抗体共价连接至细胞壁来进一步证明本发明方法。

将αGFP抗体作为阿拉伯糖可诱导融合物克隆在OmpF信号序列的下游以及SNAP和LPP序列的上游。

在通过阿拉伯糖诱导表达之后，OmpF信号序列将指导新生蛋白穿过内细胞膜进入周质，并在在其通过膜开孔时被切掉。

在周质中，预期LPP结构域将与两个其他的伴侣(野生型LPP或其他αGFP融合蛋白)形成三聚体卷曲螺旋。LPP结构域的C端残基是赖氨酸，其通过ε氨基与大肠杆菌细胞壁共价连接，最有可能是通过YbiSL,D-转肽酶进行(Magnet等，2007)。

如实施例8所述进行OmpF：：αGFP：：SNAP：：LPP融合蛋白的表达、细胞的透化和eGFP标记。

图13表明eGFP不均匀但是强烈地结合在细胞壁周围(图13)。eGFP不被表达OmpF：：SNAP：：LPP融合物(无αGFP结构域)的细胞结合(图13A)。

通过首先用SNAP配体标记表达融合蛋白的经透化细胞，之后将经标记细胞囊的样品加热至95℃5分钟，来证明OmpF：：SNAP：：LPP融合物与细胞壁的共价结合。图14表明，在加热处理的样品与未加热的对照之间，SNAP配体标记的细胞壁的荧光没有没有改变。Gel Red染色也证明，即使是在加热处理的样品中，基因组DNA依然保留在细胞中。

实施例10.外膜透化实验

在本发明的另一个实施方案中，可以使外膜对于配体靶标如酶底物或多肽选择性透化，而被筛选的多肽保留在细胞内或连接在细胞壁上。

为了确定使外膜选择性透化的条件，筛选多个去污剂和缓冲剂。使用大的(eGFP)和小的(Gel Red)配体二者来确定外/内膜透化是否产生了大的或小的膜孔。

如实施例1所述培养和诱导表达阿拉伯糖可诱导OmpF：：aGFP：：SNAP：：LPP(细胞壁结合)或aGFP：：HALO：：FLAG：：RhnA(胞质)的大肠杆菌菌株。

将1mL的经诱导培养物在50mM Tris(pH8)中洗涤一次，之后悬浮在包含25mM Tris+1mM EDTA(pH8)或25mM Tris+2mM Ca²⁺(pH8)中的0.2-0.4％去污剂的透化缓冲剂变体中，并在25℃下孵育10分钟。

将经透化细胞在适当的缓冲液中洗涤一次，然后用Gel Red(水中1×)中染色并用TBS洗涤。然后将其与纯化的His6：：eGFP一起在25℃下孵育1小时，之后通过离心沉淀并重悬在TBS中，作为湿封片用荧光显微镜观察。

图15和图16表明，Tris/Ca²⁺或Tris/EDTA缓冲液中的0.2％Apo8(A)或Tween20(B)使外膜选择性透化，允许大配体(eGFP)渗透穿过外膜，但是不能穿过内膜。较小的膜不渗透的DNA结合配体Gel Red在大部分样品中部分地渗透进胞质，表明在一些细胞中发生了内膜一定程度的孔隙化。但是，与用去污剂0.5％8TGP或试剂86处理的外膜和内膜对于eGFP完全渗透的样品相比，Gel Red结合的程度大大降低。

实施例11.经包封展示的荧光分选和分析

作为细胞展示平台，本发明方法理想地适于荧光活化细胞分选(FACS)以鉴定配体结合克隆。为了测试透化大肠杆菌细胞对于通过FACS分选的稳定性，诱导了三个群以表达：i)eGFP；ii)αGFP：：KzPG：：SNAP：：DBP；和iii)His6：：SNAP：：BetB。

eGFP表达细胞未透化，并且是完整大肠杆菌细胞中荧光的阳性对照。根据本发明方法使αGFP：：KzPG：：SNAP：：DBP表达细胞透化，并用SNAPBG-488配体(绿色)标记。根据本发明方法使His6：：SNAP：：BetB表达细胞透化，并用SNAP BG-547配体(红色)标记。

将细胞悬浮在PBS中并且以近似相等的数量混合以分选混合的群或单独分选用于信号校准。在Becton Dickson Influx FACS上进行细胞分选。在FlowJo软件上进行数据分析。由操作者确定大肠杆菌分选的参数。

图17表明，通过荧光可鉴定三个群。所分选群的重新分析表明，分选提供了相对纯的各个群。存在于曲线的低荧光区中的信号随后表明是信号中的固有噪声，并随后由操作者通过仪器校正除去。

实施例12.用于固体支持物结合的间隔物区域选择

使用8TGP介质使表达αGFP：：KzPG：：SNAP：：DBP融合蛋白的细胞透化，并且通过中间物His6标记的eGFP使细胞与HisPur Co²⁺琼脂糖珠(Thermo Scientific)结合。将细胞或珠首先用过量His6-eGFP孵育，之后在TBS中洗涤，然后一起在25℃下孵育30分钟。然后从珠上洗掉未结合细胞，之后通过荧光显微镜分析珠结合的程度。

初始未检测到αGFP：：KzPG：：SNAP：：DBP融合蛋白与琼脂糖珠的结合。推断αGFP结合结构域可过于接近细胞壁而不能到达琼脂糖树脂上的钴复合的eGFP。因此，将具有随机密码子的12残基的肽间隔物结构域克隆在αGFP结合结构域与kzPG肽聚糖结合结构域之间(GGT ACC gcy gcy gkk wtb gck wtb gkk gkk gck gkk gcy gcy GGT CTG(SEQ ID NO：5))。

表达间隔物变体的小文库(约2,000个成员)，然后如上所述与Co2+琼脂糖结合。观察与珠结合的文库的比例。然后将这些克隆进行PCR扩增、再克隆，并单独测试12个克隆的结合并进行测序。如图18所示，发现多种肽间隔物抗蛋白水解切割(保持αGFP在融合蛋白中的高水平)并且能够使去污剂处理的细胞与琼脂糖珠结合。发现对于支持物结合具备功能性的间隔物序列列举在表1中。

表1.用于固体支持物结合的随机接头(RL)间隔物

接头	氨基酸序列
		RL1	GSNSNNQSKPSS(SEQ ID NO：6)
RL2	GGPRNPQRHTGS(SEQ ID NO：7)
		RL6	SGTRHHNSHNSS(SEQ ID NO：8)

RL9	SSNRTHKSNNSS(SEQ ID NO：9)
		RL10	SGHRTTERKHSS(SEQ ID NO：10)
RL13	GGHRHTQRHNGG(SEQ ID NO：11)
		RL14	GGPRTPQSQPSG(SEQ ID NO：12)

选择一种间隔物序列R16进行进一步的结合研究。检查有助于与固体支持物基体强结合的其他因素。发现细胞和基体的孵育时长以及结合溶液的盐(NaCl)浓度二者都对结合具有正向作用。发现30分钟的孵育时长和约200mM至500mM的NaCl浓度范围是有效的，而300mM被认为是最佳的。结合在多种缓冲液中有效，包括具有300mM盐的MOPS缓冲溶液、Tris磷酸盐。

还确定了表达αGFP：：RL6：：KzPG：：SNAP：：DBP融合蛋白的细胞通过生物素化eGFP与链霉亲和素磁性纳米颗粒(MagneSphere；Roche diagnostics)结合的条件在对琼脂糖珠结合鉴定的范围内并且如图19所示。

除了12残基间隔物外，还考虑将蛋白结构域用作间隔物结构域。将来自人肌联蛋白基因的小、稳定且高表达的第27个免疫球蛋白结构域(I27)克隆在RL6间隔物的上游。也发现该结构域能够高且稳定地表达N端αGFP结构域并且有极好的固体基体结合(图19)。

实施例13.用于包封展示的小鼠scFv文库的构建

单链抗体(scFv)文库的细胞内展示的最终结构域结构为：scFv：：I27：：RL6：：KzPG：：SNAP：：DBP。SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14提供了不具有scFv结构域的融合蛋白的蛋白质序列和DNA序列。该蛋白质融合物在N端具有scFv，之后是两个间隔物结构域I27和RL6，然后是肽聚糖结合结构域KzPG，SNAP报告子结构域，最后是DNA结合结构域(DBP)。

使用Superscript III(Invitrogen)酶由小鼠脾脏总RNA产生随机引物化的cDNA。如Schaefer等(2010)的描述，使用Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)和小鼠抗体家族序列的简并寡核苷酸引物由该cDNA扩增scFv轻链可变结构域(V_L)和重链可变结构域(V_H)。用于文库克隆的寡核苷酸引物与Schaefer等描述的引物的区别在于其具有适合于通过Bsm BI克隆进我们文库支架载体中的末端(SEQ ID NO：15)。使用重叠延伸PCR连接VL结构域和VH结构域。对最终的scFv带进行总计60个PCR扩增循环(30个第一轮，30个第二轮)。

对于文库克隆，使用BsmBI切割900ng的展示构建体，根据制造商说明书使用Sureclean(Bioline)沉淀，并使用T4DNA连接酶与400ng的类似处理的scFv产物连接。通过在65℃孵育10分钟使连接酶失活，并且将连接物电穿孔到大肠杆菌Argentum菌株(AlchemyBiosciences)中。使电穿孔细胞在SOC介质中恢复并且在合并之前于37℃孵育1小时，然后涂布在具有75ug/mL氨苄青霉素的20×150mm LB琼脂平板上。将板在30℃下孵育过夜。估计文库大小为4×10⁵个独立克隆。发现20个集落中的20个含有预期大小的插入物。

实施例14.经包封展示小鼠scFv文库的筛选

由噬菌体展示文库分离的单链抗体通常难以在大肠杆菌中表达，其在周质中低水平表达，或者由于缺少Ig折叠的β片层之间二硫键形成而在胞质中完全不可溶。为了确定经包封展示是否可用于选择在大肠杆菌胞质中可溶的小鼠scFv支架，需要确定scFv溶解度与融合蛋白的行为是否相关。

推测可用的可溶性scFv会具有低聚集水平和至少适度水平的表达。这可以在视觉上判断为允许经透化细胞中KzPG结构域与细胞壁结合(因此不定位在细胞内的包涵体)以及表现出至少适度表达SNAP报告结构域的克隆。

为了筛选这些参数，挑选单个集落并且如之前实施例1所述使用阿拉伯糖诱导融合蛋白表达。在透化之后，将其用SNAP配体标记并使用荧光显微镜观察。我们基于其表达和SNAP报告物的细胞分布将文库克隆表征为4类，其实例可参见图20。

1)未表达SNAP

2)适度/高表达SNAP，在包涵体中聚集(图20，左图)

3)弱表达SNAP，细胞壁定位(图20，中图)

4)高表达SNAP，细胞壁定位(图20，右图)

仅进一步分析具有高表达和溶解性的克隆。但是，由于SNAP报告物的弱表达可以是由于未针对大肠杆菌表达优化的蛋白质的低效表达，所以预期如果其密码子使用被优化，则这些克隆中的一部分会被证明对于可溶性胞质文库展示是极佳的。

对SNAP报告物高表达且围绕经透化细胞的细胞壁均匀分布的克隆进行测序以确定scFv插入物的存在，其与融合蛋白的其余部分在正确的翻译框中。在所有分析的21个克隆中，发现scFv插入物是全长的，具有正确长度的甘氨酸/丝氨酸接头区，并且对于完整融合蛋白的翻译在正确的阅读框内。这表明本发明筛选方法正确地鉴定了在大肠杆菌细胞胞质中以可溶形式表达的小鼠scFv基因。为了证实从文库分离的scFv蛋白在大肠杆菌胞质中可溶，使其从文库构建体穿梭(shuttle)到阿拉伯糖可诱导表达载体中，其具有C端FLAG表位以及中间间隔物区域I27-RL6或RL6。

在通过阿拉伯糖诱导蛋白质表达之后，用0.5％8TGP提取可溶性scFv：：I27：：RL6：：FLAG或scFv：：RL6：：FLAG融合蛋白。沉淀不溶的细胞物质并通过对样品进行超声将其重悬浮在具有β-巯基乙醇的SDS-PAGE上样缓冲液中，加热至95℃5分钟。将等体积的各级分上样到10％SDS-PAGE凝胶上并进行电泳。将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，然后用5％脱脂乳粉封闭。使用1∶1000稀释的羊αFLAG抗体(Sigma)接着用抗小鼠HRP缀合的第二抗体探测重组蛋白的表达。使用化学发光进行检测。

图21表明本发明方法能够鉴定在细菌胞质中主要以可溶形式表达的scFv基因。各样品中表达谱的Western印迹与对scFv：：I27：：RL6：：FLAG构建物通过SNAP配体检测的荧光显微镜观察匹配。

实施例15.大肠杆菌Argentum菌株中P2溶源体的产生

通过Argentum细胞的菌苔上单一P2噬菌斑的生长物(outgrowth)产生Argentum的P2溶源体(K12；ΔmcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)ΔendA lacZΔM15)。如Kahn等(1991)所述进行噬菌体感染。

实施例16.P2ΔYK敲除

a.通过同源重组产生

与对许多裂解性和溶源性细菌噬菌体表征的裂解系统类似，P2细菌噬菌体具有推定的穴蛋白和溶素系统的基因。穴蛋白为溶素酶降解胞壁质细胞壁提供了穿过内膜到达周质空间的可及性。

P2K基因(SEQ ID NO：17)和Y基因(SEQ ID NO：18)分别编码推定的溶菌酶和穴蛋白。使用与Hamilton等(1989)所述类似的同源重组使这些基因缺失。从P2基因组(Genbanksequence NC_001895.1)中选择侧翼同源区并且克隆在侧翼为FRT的卡那霉素选择盒之间。P2基因组的替换区为6,721至7,487bp。

在替换靶YK基因之后，如Cherepanov和Wackernagel(1995)的描述，通过由pCP20质粒表达的FLP重组酶除去卡那霉素盒。所得菌株缺失YK基因，留下短的20-mer肽作为唯一的ORF。

通过用P4细菌噬菌体感染功能性测试了K12P2ΔYK株。用10³pfu的P4细菌噬菌体感染Argentum(P2)和Argentum(P2ΔYK)培养物，并且倒入琼脂平板顶层。观察到在Argentum(P2)(而非Argentum(P2ΔYK))菌苔上形成了噬菌斑。

b.使用P4vir1和Ready-Lyse测试

为了测试YK缺失的P2细菌噬菌体(P2ΔYK)复制和包装感染的P4细菌噬菌体的功能，用P4突变体P4vir1(具有提高P4控制区的转录的突变并具有清晰噬菌斑表型)感染P2ΔYK株。

使P2ΔYK细胞生长至早期对数期并补充1mMCaCl₂。将含10⁹pfu/mL P4vir1细菌噬菌体的1μL溶解产物上清液添加到1mL P2ΔYK培养物中并在37℃下孵育80分钟。将悬液离心以使细胞沉淀，弃去上清液并将沉淀在含0.08mM EGTA和2.5mM MgCl₂的LB培养基中洗涤三次以除去未结合的P4vir1。将细胞重悬在1mL LB培养基中，然后分成三个样品。保留一个样品不进行进一步处理(样品1，未透化)。将样品2和样品3进行进一步处理：沉淀并悬浮在补充有0.5％去污剂8TGP的LB中以使内膜和外膜二者透化。然后使细胞沉淀并在未增补的LB培养基中洗涤两次。将经透化、洗涤的细胞沉淀重悬在LB培养基中。保留样品2(透化)不进行进一步处理。将样品3(透化，溶菌酶)用0.5μL重组溶菌酶Ready-Lyse(Epicentre，USA)进一步处理。浊度迅速下降表明肽聚糖细胞壁被Ready-Lyse降解，并且这样任何包装的P4vir1颗粒将释放到溶解产物中。

然后将各自10μL的样品1和样品2以及0.1μL样品3(粗溶解产物的稀释物)添加到补充有1mM CaCl₂的200μL新鲜K12(P2)细胞中。将细胞在37℃下孵育20分钟，然后添加7mL顶层琼脂(LB培养基，％琼脂)并倒在预热的LB平板上。将平板在37℃下孵育过夜，并在次日早晨确定K12菌苔中P4vir1噬菌斑的存在。

样品1(其代表未透化的P4感染细胞)在顶层琼脂平板上产生83个噬菌斑。样品2(其代表通过去污剂透化的P4感染细胞)产生了34个噬菌斑。样品3(其代表通过去污剂透化然后通过溶菌酶降解了细胞壁的P4感染细胞)产生了168个噬菌斑。

调整了样品稀释度，经透化、溶菌酶处理的P2ΔYK细胞(样品3)具有比样品1多200倍的P4vir1细菌噬菌体，比样品2多500倍的P4vir1细菌噬菌体。

经感染K12P2ΔYK细胞中存在能复制的P4virl细菌噬菌体表明，YK裂解基因的缺失不妨碍P4vir1基因组的复制或功能性细菌噬菌体颗粒的组装。然而，YK裂解基因的缺失的确阻止了组装的细菌噬菌体颗粒从感染细胞的释放。通过去污剂处理实现的内细胞膜和外细胞膜的透化不导致细菌噬菌体颗粒释放进溶液。但是，用溶菌酶处理经透化细胞使感染性细菌噬菌体释放进入溶液。

实施例17.具有可诱导活化子的P2ΔYK/P4共溶源体

a.C1a细胞中P2/P4共溶源体的产生

过去，用于利用P2细菌噬菌体及其卫星P4进行实验的菌株是大肠杆菌的C菌株(Wiman等，1970)。使用C菌株的衍生物C1a(Sasaki和Bertani，1965)，我们如上述通过来自P2噬菌斑的溶源性细胞的亚克隆建立了P2溶源体。类似地，我们建立了C1a P2菌株的P4共溶源体。

P2/P4共溶源体菌株具有在转录抑制下的两种原噬菌体。为了使用该菌株可诱导地包装粘粒文库质粒，需要活化两种噬菌体。对于其他良好表征的温和噬菌体λ，通过RecA/LexA介导的切割或使用不耐热的突变阻遏物cI857来失活阻遏蛋白cI以释放抑制。但是，已知P2是不可诱导的噬菌体，因为其不响应于通过失活其阻遏物导致的抑制，推断这是由于不能协调从基因组的去除以及复制和结构基因转录(Bertani，1968)。但是，感染性P4卫星噬菌体在进入之后具有活化被抑制的P2原噬菌体的机制。P4ε(epsilon)蛋白通过与P2阻遏蛋白结合来充当抗阻遏物。另外，P4δ(delta)蛋白是P2结构操纵子的强活化子，其为P2ogr转录活化子的融合的串联重复。然而，P4原噬菌体对其自身和P2的活化具有复杂和严格的控制。

P4原噬菌体依赖于转录和翻译偶联使用转录阻遏子Vis蛋白在其自身启动子以及下游Eta和cI基因的相互作用基于cIRNA产生抑制复合物。最后，该复合物的作用是阻碍P4ε蛋白的表达，P4ε蛋白是P2阻遏蛋白的结合拮抗剂。

P4和P2原噬菌体的去抑制需要通过P4ε蛋白抑制P2阻遏物。活化的P2继而产生反式作用以促进P4δ基因转录的Cox和Ogr转录活化子，其通过Vis启动子进一步活化P4，并且也反式作用于P2结构基因操纵子。

在这样的复杂系统中，有许多元件相互影响以加强其联合作用，包含P2和P4两种受抑制原噬菌体的细胞必须紧密控制所有活化子基因的表达，以防止发生正反馈效应。原噬菌体的潜在活化子包括P2cox、P2ogr和P4δ转录活化子，以及P4ε抗阻遏物。

在由λ噬菌体阻遏物cI857的温度敏感性等位基因提供的紧密转录控制下，克隆三种转录活化子。与pUC起点相容的低拷贝pACYC184质粒复制起点能够使可诱导的活化子保持于基于pUC文库的质粒。

用可诱导的表达构建体转化C1a P2/P4共溶源体并在30℃下培养。使培养物生长至早期对数期，之后通过将温度改变为42℃下20分钟来诱导，然后在37℃下生长至发生裂解。

全部三种活化子均能够诱导共溶源体裂解，但是证明P4δ基因是最早裂解的，接下来是ogr，然后是cox。温度可诱导P4δ的多核苷酸序列在SEQ ID NO：19提供。

通过对C1a P2溶源体滴定溶解产物来验证感染性细菌噬菌体P4颗粒的产生。确定的P4滴度为＞10⁹pfu/mL。

实施例18.具有粘粒传递(transmission)的P2ΔYK

为了将P2/P4系统应用于基因文库筛选和传递，构建包含P4cos区的载体。将由psu基因开始、跨越cos切割位点并到达gop基因的来自P4的389bp区(P4基因组的11461bp至225bp，NCBI登录号NC001609)通过PCR扩增并克隆到高拷贝pUC起点的质粒载体中。通过测序验证P4cos区的身份。如专利申请PCT/AU2010/001702所述，载体还包含araC基因和阿拉伯糖可诱导启动子，以控制文库细胞内展示筛选系统的表达。

与所有粘粒载体一样，无论是P2、P4或λ细菌噬菌体，对于衣壳头部内的包装具有最小尺寸，以产生有活力的传送单位。对于P4，已确定的最小尺寸为约9.2kb(Kim和Song，2006)。为了取得在P4衣壳头部内进行包装的最小尺寸，通过克隆入大肠杆菌基因组DNA的4.3kb“填充(stuffer)”片段将粘粒载体的总大小提高到了10.7kb，接近于11.6kb的野生型P4基因组大小。

为了证明粒载体的共包装存在于C1a P2ΔYK/P4共溶源体，用具有温度诱导P4δ基因的pACYC184骨架、抗氯霉素载体和pUC骨架、抗氨苄青霉素粘粒载体转化菌株。

将具有两种共溶源体和两种质粒的菌株在30℃下培养至早期对数期，之后通过将温度改变至42℃20分钟来诱导P4δ蛋白，之后在37℃下生长1小时。作为对照，还诱导了包含文库质粒而无P4cos区和填充片段的菌株用于P4衣壳包装。

为了释放包装的粘粒和P4细菌噬菌体，使诱导的细胞沉淀并且在室温(约25℃)下重悬在透化培养基(LB培养基+0.5％8TGP)中10分钟。在透化之后，使其沉淀，重悬在LB中并添加0.5μL Ready-Lys溶菌酶以消化细胞壁。通过浊度的下降验证裂解。还证实，对于Ready-Lyse对细胞壁的作用，氯仿也在细胞的透化中有效。分别通过C1a和C1aP2溶源体的感染滴定包装的粘粒和P4细菌噬菌体。

证实在诱导的P2ΔYK细胞中，文库粘粒以约等于保留的P4原噬菌体的水平包装，这是因为与P4噬菌斑相比，获得了来自粘粒的大约相等数量的抗生素抗性菌落。用携带缺少P4cos区和填充片段的文库质粒的菌株制备的裂解物的感染未得到菌落。

还注意到，与在来自裂解的C1a P2细胞(储存在4℃下具有Mg/EGTA的LB培养基中)的粗裂解物中P4细菌噬菌体或包装的粘粒的较差稳定性(推测是由于同样存在于裂解物中的细胞蛋白酶的作用)不同，由被首先被透化并洗涤之后在外源添加的溶菌酶(Ready-Lyse)作用下裂解的P2ΔYK细胞释放的P4细菌噬菌体和包装的粘粒在室温下稳定，并且经过两天滴度仅少量降低。推测这是由于在沉淀和更换培养基的步骤中前述从经透化细胞中释放蛋白酶而后被从由细胞壁保留的感染性颗粒中洗掉。因此，通过温度诱导、透化和更换培养基可容易地产生高滴度的粘粒颗粒，并且保持在稳定的滴度而不需要按照标准细菌噬菌体方案进行长的超速离心纯化步骤。

实施例19.使用有机溶剂透化大肠杆菌

除了使用去污剂使革兰氏阴性细菌细胞透化之外，用于破坏膜完整性的其他化学剂可以是亲脂性有机溶剂。在细胞透化和用于显微镜检查的免疫标记的固定中，在现有技术中已经大量使用了有机溶剂(Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbour Laboratory，1988)。在本发明方法中，使细胞膜透化以使与细胞内靶标结合的大免疫球蛋白复合物进入。

具体地，已经使用有机溶剂氯仿选择性杀死细菌/细菌噬菌体悬液中的细菌细胞，推断是通过细胞膜的透化实现(Sambrook等2001)。氯仿还被用在裂解性细菌噬菌体遗传学中以使得能够挽救不能透化内膜的穴蛋白突变体，以从细胞的胞质释放溶菌酶用于细菌噬菌体释放(Ziermanndeng等，1994)。类似地，氯仿被用于通过使外膜透化以便能够活化外源溶菌酶进入周质以挽救不能水解肽聚糖细胞壁的溶菌酶突变体(Ziermann等，1994)。因此，证实氯仿能够使至少小的(约15kD)溶菌酶穿过革兰氏阴性大肠杆菌细胞的内膜和外膜二者。

为了测试用于通过本发明方法描述的细胞内展示的细胞膜透化的有机溶剂，将表达αGFP：：RL6：：KzPG：：SNAP：：DBP融合蛋白(如实施例8所述诱导表达)的大肠杆菌细胞悬浮在有机溶剂的水性混合物中。膜的透化通过小分子量的DNA结合荧光配体Gel Red和30kD蛋白质eGFP的结合指示。

尽管一些有机溶剂在水中保持可混溶(例如，短链醇)，但是其他主要是不可混溶的，并且混合物分成水相和非水相(例如，氯仿和丁醇)。相分配表示水相中低溶解度有机溶剂的饱和。

将表达αGFP：：RL6：：KzPG：：SNAP：：DBP融合蛋白的细胞通过离心收集并用以下溶剂组合物之一在25℃下透化10分钟。将LB生长培养基用于混合物的水性组分。还进行Tris缓冲的对照。

10％乙醇；20％乙醇；30％乙醇

10％甲醇；20％甲醇；30％甲醇

10％异丙醇；20％异丙醇；30％异丙醇

10％DMSO；20％DMSO；30％DMSO

10％丙酮；20％丙酮；30％丙酮

丁醇(1∶5)

氯仿(1∶5)

50M Tris/LB(pH7.0)；1M Tris/LB(pH7.0)

在溶剂处理之后，通过离心使细胞沉淀，通过悬浮用LB培养基洗涤一次，通过离心沉淀然后悬浮在包含小分子量DNA结合荧光团Gel Red(在水中1∶10,000稀释)或eGFP的LB培养基中。在标记培养基中于25℃孵育20分钟之后，通过离心使细胞沉淀，通过悬浮在LB中洗涤，然后通过荧光显微镜观察。图22表明，在测试的有机溶剂中，氯仿和丁醇使大肠杆菌细胞膜透化以允许小分子量配体进入胞质(A)，但是仅氯仿允许大分子量蛋白质(约30kD)进入。

实施例20.使用P2gpL装饰蛋白(decoration protein)的衣壳展示

P2细菌噬菌体gpL蛋白通过质谱检测为成熟病毒体的结构组分(Chang等，2008)，并推断在功能上等同于λ细菌噬菌体的gpD衣壳蛋白，尽管通过配对BLAST比对(NCBI)这两种蛋白质未被证明有任何显著同源的区域。λgpD蛋白为110个残基长，而P2gpL蛋白为169个残基长。

为了测试P2gpL蛋白是否在衣壳展示中有功能，将αGFP：I27序列与P2gpL的N端和C端融合以产生SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所列融合蛋白。融合蛋白还包括在gpL和αGFP：I27结构域之间的FLAG表位标签。通过将基因序列克隆在araBAD启动子的下游(具有上游araC转录调节因子)，使融合蛋白的表达成为阿拉伯糖诱导的。αGFP：I27：gpL表达载体的DNA序列列举在SEQ ID NO：22中。

将编码αGFP：I27：gpL融合蛋白的质粒转化到包含Hy5原噬菌体的大肠杆菌K12宿主中。Hy5噬菌体是包含在186转录控制下的P2结构基因的相关噬菌体p2和186的杂交体(Bradley等，1975；Younghusband等，1975)。此外，Hy5(186)cI阻遏子是温度敏感的，允许温度诱导噬菌体生长。

通过阿拉伯糖使αGFP：I27：gpL融合蛋白表达并通过SDS-PAGE进行分析，产生约55kD的上条带，其在可溶性和不可溶级分二者中，比44kD的预期尺寸大；和下条带，其仅在可溶性级分中(图23)。

为了证明αGFP：I27：gpL融合蛋白与噬菌体衣壳结合并且对于通过噬菌体展示的结合是功能性的，将具有表达构建物的原噬菌体菌株在45℃下加热15分钟以引起Hy5复制。在热休克之后，将样品温度向下改变为32℃的生长温度。在温度下降之后30分钟通过添加阿拉伯糖至0.2％的浓度诱导融合蛋白质的表达。将培养物在32℃下孵育总时间70分钟以使噬菌体的释放尽可能大。

为了捕获展示αGFP：I27：gpL融合蛋白的Hy5噬菌体，将链霉亲和素包被的Dynal珠(M-270，产品编号653-05；Life Technologies)首先用生物素化His6-GFP标记，然后用TBS彻底洗涤。通过荧光显微镜确证eGFP对Dynal珠的标记。

表2列出了表达在通过Dynal珠捕获的Hy5噬菌体上的gpL融合蛋白表达的结果。这些数据证明αGFP抗体与P2gpL衣壳蛋白的融合导致相比于使用野生型gpL蛋白包装的噬菌体，通过Dynal珠有82倍富集。此外，甚至具有不可检测水平的融合蛋白表达的未诱导样品(图23，样品1)也在比对照有显著水平的亲和纯化，表明噬菌体捕获中产生即使非常低水平的展示。

表2.相比于Hy5对照展示gpL衣壳融合蛋白的Hy5噬菌体的富集

实施例21.λ噬菌体SR裂解基因的缺失

λ噬菌体裂解基因位于基因组的右臂的包含S'/S(穴蛋白(SEQ ID NO：23)/抗穴蛋白)、R(内溶素(SEQ ID NO：24))、Rz/Rzl(某些培养基中裂解必需的)基因的簇中。裂解簇在由pR启动子转录的更大转录单位内，pR启动子负责所有λ结构和裂解基因的转录。pR′mRNA是单链转录物，因而其覆盖约一半的λ基因组。为了使裂解基因失活，决定使用同源重组使基因缺失。为了能够容易地选择λ突变体，将裂解基因替换成卡那霉素抗性基因(KanR)。但是，为了确保启动子或转录终止序列都不插入从而导致可能对细胞生存不利的原噬菌体结构基因表达，还使附近的非必需bor基因缺失。bor基因赋予宿主大肠杆菌细胞血清抗性，与在其自身启动子下的pR′在相反方向在原噬菌体中组成型表达(Barondess和Beckwith，1995)。使用合成的gBlock片段(IDT)，我们通过KanR基因的起始密码子与bor基因的起始密码子的融合设计了截短的裂解簇。在该缺失中λ裂解簇保留的唯一序列是序列MKMPEKQLEGTQKYINEQCR(SEQ ID NO：25)的截短肽。具有合成臂和KanR盒的裂解缺失构建物的DNA序列列在SEQ ID NO：27中。

将合成的同源臂和KanR盒克隆到基于pUC的PCR克隆载体pAcquire(AlchemyBiosciences，Melbourne，Australia)中，并通过测序验证。

为了进行λ裂解簇的缺失，将构建物转化进大肠杆菌菌株ED8739(F-，metB，hsdS，supE，supF)的λcI857sam7溶源体中，并通过温度诱导(42℃，10分钟)来诱导噬菌体裂解，然后在37℃下培养1小时。通过离心使1mL包含噬菌体的上清液澄清并添加1滴氯仿。然后用稀释的噬菌体溶解产物感染具有增补的镁(10mM)和麦芽糖(0.1％)的ED8739培养物，并通过在30℃下2小时生长之后在LB+卡那霉素(15μg/mL)琼脂平板(在30℃下生长16小时)上布板来回收溶源体。因为靶质粒对于将λ：：质粒重组体包装成可生存噬菌体足够小，因此筛选抗卡那霉素原噬菌体集落的氨苄青霉素抗性基因的丢失(即，Kan^R/Amp^s)，其可指示去除裂解簇并按照期望将其替换成卡那霉素盒的靶标构建物的两个同源臂之间的同源重组事件。鉴定Kan^R/Amp^s原噬菌体并证实缺失是有效的并且无不期望的突变，通过PCR对该区进行扩增并测序。发现所有克隆都如所设计的是正确的。

实施例22.λΔSR基因组的包装

为了证明裂解簇的缺失依然使每个细胞产生相同数量的可生存包装噬菌体(即，改变的pR′转录物不影响噬菌体结构蛋白的产生)，在30℃下使λcI857sam7ΔSR原噬菌体在λcI857sam7原噬菌体一起生长至相同的细胞密度，并通过温度诱导(42℃，10分钟)来诱导噬菌体的产生，接着在37℃下生长1小时。正如预期的，λcI857sam7培养物完全裂解，而λcI857sam7ΔSR不能裂解。通过离心收集λcI857sam7ΔSR培养物，重悬在LB+0.5％8TGP中并在25℃下孵育10分钟。然后通过离心收集经透化细胞，用LB+10mM MgSO4洗涤一次并重悬在起初1ml体积的LB+10mM MgSO4中，并使用0.5uL ReadyLyse(Epicentre)裂解。向每一溶解产物中添加氯仿滴以杀死所有保留的活细胞，并使用系列稀释滴定噬菌体，将其感染到ED8739培养物中并在增补有10mM MgSO4和0.1％麦芽糖的LB顶层琼脂上布板。使平板在37℃下生长16小时，之后对噬菌斑计数。λcI857sam7和λcI857sam7ΔSR原噬菌体二者都得到了约1×10⁹pfu/mL的噬菌体滴度，表明λΔSR裂解簇的缺失，以及在相反转录方向上的卡那霉素基因相应插入物不扰乱结构基因的转录或翻译。

实施例23.λΔSR噬菌体上的衣壳展示

在文献中已经良好记录了使用λgpD基因的衣壳展示以及使用gpD展示的靶标结合的噬菌体汰选方法。但是，在本申请之前尚未提议使用衣壳展示和裂解缺陷型噬菌体的组合。此外，根据本发明方法在经透化细胞中裂解缺陷型性噬菌体和衣壳展示的组合能够使得通过FACS检测来筛选与噬菌体衣壳结合的靶标，这是克隆性表征的高通量方法。

为了证明靶标与保留在经透化细胞内的裂解缺陷型噬菌体的结合，我们将编码与GFP相关荧光蛋白mAG1(Karasawa等，2003)结合的单链抗体(scFv)的序列与λgpD基因的3′末端融合。当在细菌胞质中以约化态(reduced state)表达时，α-mAG1scFv是一类稀有的可溶且稳定的抗体。FLAG表位与gpD：：a-mAG1融合蛋白的C端融合，并且使用αFLAG单克隆抗体证明全长可溶性蛋白质在大肠杆菌细胞的胞质中表达。

构建λ粘粒，其由araBAD启动子表达gpD：：α-mAG1融合蛋白，并且在araC蛋白的抑制下且通过阿拉伯糖可诱导。所述粘粒还包含与其他市售粘粒载体共同的特征，并且独特的是具有λcos区(SEQ ID NO：26)、细菌质粒复制起点和抗生素抗性基因(AmpR和ChlR)。其还包含能够进行噬菌体的体内包装的填充片段。市售粘粒载体的一个实例是pFOS1(NewEngland BioLabs(NEB))。

将gpD：：α-mAG1粘粒转化到包含λcI857ASR原噬菌体的大肠杆菌ED8739菌株中，并生长在30℃下以进行营养生长。为了诱导噬菌体功能，将菌株以低密度培养在LB培养基中，然后在42℃下加热15分钟，之后在31℃下生长75分钟。在42℃下孵育之后，立即通过添加阿拉伯糖至0.2％w/v来诱导gpD：：α-mAG1融合蛋白。在噬菌体生长和包装结束时，通过离心并在25℃下在0.3×体积的LB+0.5％8TGP中重悬浮10分钟来通过本发明方法透化细胞。然后将细胞再离心并在1×体积的TBS+10mM MgSO₄(TBS/Mg)中洗涤，之后沉淀并在具有过量mAG1蛋白的TBS/Mg中悬浮20分钟。在mAG1结合之后，用TBS/M洗涤掉细胞上未结合的mAG1，之后悬浮以通过荧光显微镜观察或进行FACS分析。

图24表明当包封在经透化细胞中并利用荧光靶标探测时，多价λ展示产生足够强的信号以通过荧光显微镜视觉检测。证明每一个细菌细胞具有10至30个焦点的点状标记。这些焦点仅在表达gpD：：α-mAG1融合蛋白并且诱导噬菌体的细胞中观察到。当用mAG1蛋白探测时，在未表达融合蛋白或未诱导噬菌体的细胞中未观察到焦点。类似地，gpD：：α-mAG1标记的噬菌体不与相关荧光蛋白GFP结合。考虑到野生型λ噬菌体的裂解量为每细胞100至200拷贝，并且假定噬菌体仅集中在细胞的几个区域内，那么每一焦点可包含3至20个噬菌体。该估计可以是保守的，因为由于允许复制持续进行至裂解正常时间之外，所以裂解缺陷型噬菌体的裂解量可以较大。因此，如本文方法描述的包封的裂解缺陷型噬菌体的多价展示允许通过光学显微镜直接检测荧光团标记的蛋白结合。

由于FACS仪的灵敏度优于常规显微镜成像，那么预期包含标记噬菌体的细胞从未标记细胞中的检测和收集将容易进行(鉴于已经通过光学显微镜观察到的信号强度)。图25显示在具有约1％α-mAG1阳性细胞的输入的Influx FACS(BD Biosciences)上的100K事件的荧光图。将细胞群用DNA结合染料Gel Red和荧光mAG1蛋白共染色。P2门控群是α-mAG1阳性的而P3门控群是α-mAG1阴性的。

通过添加ReadyLyse酶接着感染到ED8739λcI857ΔSR细胞中来记录FACS后输出。以每个阳性事件约10个噬菌体颗粒来记录恢复。

因此，使用本发明方法使得包封的衣壳展示噬菌体的高通量FACS成为可能。

本领域技术人员将理解，可以对在特定实施方案中示出的本发明进行多种改变和/或修改而不脱离广泛描述的本发明的范围。因此，在所有方面，认为呈现的实施方案是说明性的而不是限制性的。

本文讨论和/或引用的所有出版物整体并入本文。

本说明书中包含的文件、行为、材料、设备、物品等的任何讨论仅是为了提供本发明内容。不应当将其认为是承认这些事件中的一些或全部组成了现有技术基础的一部分，或者是本发明相关领域中的普遍常识，如同其存在于本申请的每一条权利要求的优先权日期之前。

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Claims

1.针对抗靶分子之期望活性筛选多肽的方法，所述方法包括：

a)对包含编码所述多肽之外源多核苷酸的革兰氏阴性细菌细胞进行培养，从而在所述细胞中产生所述多肽，

b)使裂解缺陷型噬菌体包装编码所述多肽的所述多核苷酸，其中所述裂解缺陷型噬菌体保留在所述细菌细胞内，

c)透化：

i)所述细菌细胞的外膜，或

ii)所述细菌细胞的内膜和外膜，

d)使所述细菌细胞与所述靶分子接触，以及

e)针对期望活性筛选多肽，

其中，所述多肽被细菌细胞壁或内膜保留在所述细菌细胞内和/或所述多肽连接至细菌细胞壁或内膜。

2.根据权利要求1所述的方法，其包括使所述细菌细胞的内膜和外膜透化。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述多肽至少与第二多肽缔合以形成保留在经透化细菌细胞内和/或连接至细菌细胞壁的蛋白质复合物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述多肽与所述第二多肽或其亚基融合。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述第二多肽选自：

i)具有的分子大小使所述蛋白质复合物保留在所述经透化细菌细胞壁内的多肽；

ii)DNA结合蛋白；

iii)细菌细胞壁结合蛋白；和/或

iv)所述裂解缺陷型噬菌体的噬菌体外壳蛋白。

6.根据权利要求2所述的方法，其中利用一种或更多种去污剂或有机溶剂使细菌内膜和细菌外膜透化。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述去污剂是非离子去污剂。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述非离子去污剂选自：癸酰基-N-甲基葡糖酰胺(Mega10)、二甲基辛基氧化膦(Apo8)、正辛基-β-D-硫代吡喃葡糖苷(8TGP),以及癸酰基-N-甲基葡糖酰胺(Mega10)和二甲基辛基氧化膦(Apo8)的混合物。

9.根据权利要求6所述的方法，其中所述有机溶剂是氯仿。

10.根据权利要求9所述的方法，其中通过将所述细菌细胞在用氯仿饱和的水溶液中孵育来使所述细菌细胞的内膜和外膜透化。

11.根据权利要求10所述的方法，其中在25℃下将所述细菌细胞在用氯仿饱和的水溶液中孵育10分钟。

12.根据权利要求1所述的方法，其中：

使所述细菌外膜透化；

使所述细菌细胞壁至少部分地水解；以及

使所述多肽连接至所述内膜。

13.根据权利要求12所述的方法，其中利用溶菌酶使所述细菌细胞壁至少部分地水解。

14.根据权利要求12或权利要求13所述的方法，其中使所述多肽与连接至所述内膜的蛋白质融合。

15.根据权利要求12或13所述的方法，其中使所述多肽连接至所述内膜的外面。

16.根据权利要求1、2或者5至13中任一项所述的方法，其中所述编码多肽的多核苷酸是质粒、粘粒、噬菌粒或噬菌体DNA。

17.根据权利要求1、2或者5至13中任一项所述的方法，其中所述裂解缺陷型噬菌体是温和噬菌体，其选自λ噬菌体、186、P2、186和P2的杂交体以及P4。

18.根据权利要求1、2或者5至13中任一项所述的方法，其中所述裂解缺陷型噬菌体是原噬菌体。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述细菌细胞包含裂解缺陷型λ、186、P2、186和P2的杂交体和/或P4原噬菌体。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述细菌细胞包含P2和P4原噬菌体。

21.根据权利要求18所述的方法，其中使所述裂解缺陷型噬菌体包装所述多核苷酸包括：诱导所述细菌细胞中的原噬菌体活化以产生噬菌体，其中所述噬菌体包装所述多核苷酸。

22.根据权利要求21所述的方法，其中诱导所述原噬菌体活化包括在所述细菌细胞中产生一种或更多种噬菌体活化蛋白。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述细菌细胞包含P2和P4原噬菌体，并且所述方法包括在所述细菌细胞中产生P2和/或P4活化蛋白。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述P2和/或P4活化蛋白选自P2cox、P2ogr、P4δ和/或Ρ4ε中的一种或更多种。

25.根据权利要求21所述的方法，其中诱导所述原噬菌体活化包括使所述细菌细胞中的一种或更多种噬菌体阻遏蛋白失活。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述细菌细胞包含P2和/或P4原噬菌体，并且诱导P2原噬菌体活化包括使所述细菌细胞中P2蛋白质C的温度敏感性阻遏等位基因失活。

27.根据权利要求23所述的方法，其中所述噬菌体是裂解缺陷型的，这由溶菌酶基因缺失或突变成无活性形式引起，或者由穴蛋白基因和溶菌酶基因缺失或突变成无活性形式引起。

28.根据权利要求23所述的方法，其中所述P2原噬菌体溶菌酶基因的核苷酸序列为SEQID NO:17，所述P2穴蛋白基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:18。

29.根据权利要求25所述的方法，其中所述细菌细胞包含λ原噬菌体，并且诱导所述原噬菌体活化包括使所述细菌细胞中蛋白质cI的温度敏感性阻遏等位基因失活。

30.根据权利要求25所述的方法，其中所述细菌细胞包含λ原噬菌体，并且诱导所述λ原噬菌体活化包括使所述细菌细胞中λ噬菌体阻遏蛋白cI的温度敏感性阻遏等位基因失活。

31.根据权利要求25所述的方法，其中所述细菌细胞包含186原噬菌体，并且诱导所述186原噬菌体活化包括使所述细菌细胞中186蛋白cI的温度敏感性阻遏等位基因失活。

32.根据权利要求1、2或者5至13中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在革兰氏阴性细菌细胞中针对抗靶分子之期望活性额外筛选所述多肽，其中，

i)编码所述多肽的所述多核苷酸不包装进裂解缺陷型噬菌体，和/或

ii)所述多肽不被细菌细胞壁保留在所述细菌细胞内和/或不连接至细菌细胞壁。

33.根据权利要求32所述的方法，其中在权利要求1、2或者5至13中任一项所述的方法之前进行所述额外筛选。

34.根据权利要求32所述的方法，其中使用裂解性或温和噬菌体包装编码所述多肽的所述多核苷酸来进行所述额外筛选。

35.根据权利要求34所述的方法，其中裂解所述额外筛选中的细菌细胞以释放噬菌体。

36.根据权利要求34所述的方法，其中所述额外筛选中的噬菌体是裂解性噬菌体，其裂解所述细菌细胞。

37.根据权利要求36所述的方法，其中，

i)所述裂解性噬菌体包含在所述噬菌体外壳上的第一结合伴侣，并且

ii)针对期望活性进行筛选的所述多肽是包含第二结合伴侣的融合蛋白，

其中，使所述包含第二结合伴侣的融合蛋白与所述裂解性噬菌体外壳上的第一结合伴侣结合。

38.根据权利要求36所述的方法，其中所述裂解性噬菌体是λ噬菌体。

39.根据权利要求36所述的方法，其中所述裂解性噬菌体是186、P2、186和P2的杂交体和/或P4。

40.根据权利要求37所述的方法，其中所述第一结合伴侣是钙调蛋白，并且所述第二结合伴侣是钙调蛋白结合肽。