JPH09504438A

JPH09504438A - 改変したアシル基転移活性を有する特製プロテアーゼ

Info

Publication number: JPH09504438A
Application number: JP7517672A
Authority: JP
Inventors: ブレダム，クラウス; キャラン−ブラント，モーテン・セー; モーテンセン，ウッフェ・ハスボー; オレセン，キェル・オーヴェ; ステンニッケ，ヘニング・ラルフ; ワーグナー，フレッド・ダブリュー
Original assignee: カールスベアウ・アクチェ・セルスカブ
Priority date: 1993-10-28
Filing date: 1994-10-28
Publication date: 1997-05-06
Also published as: AU679861B2; US6187579B1; AU2651395A; NZ283995A; WO1995020039A2; EP0723585A1; US5945329A; CA2174525A1; WO1995020039A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、特製プロテアーゼ（すなわち、変異体酵素）、例えば、カルボキシペプチダーゼＹ、特製プロテアーゼを製造する方法、および、特製プロテアーゼを使用する方法を提供する。本発明の特製プロテアーゼは、公知プロテアーゼから誘導される。変化したアシル基転移反応は、公知プロテアーゼによって実質的に触媒されないアシル基転移反応を行う能力もしくはアシル基転移反応を行う能力またはその両方を包含する。本発明の方法は、公知プロテアーゼの活性部位アミノ酸の部位特異的または無秩序な変異誘発による特製プロテアーゼを提供する。本発明は、また、予め選択されたアシル基転移生成物を調製するために特製プロテアーゼを使用する方法をも提供する。予め選択されたアシル基転移反応製造生成物は、Ｌアミノ酸、Ｄアミノ酸、アミノ酸アミドおよび放射活性アミノ酸などの求核試薬によるＮ末端またはＣ末端での置換によって修飾することができる。

Description

【発明の詳細な説明】改変したアシル基転移活性を有する特製プロテアーゼ発明の背景将来、製薬目的に使用するペプチドは、さらに頻繁に遺伝子工学を利用して製造されるようになる。しかしながら、遺伝子工学はその可能性に限度がある。例えば、非天然のＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、放射性アミノ酸および他の検知可能な標識を有する組換ペプチドの発現は、これらの修飾をコードする遺伝的コードがないので、組換技術を介することは可能ではない。また、イン・ビボにおいて日常的に行われるＣ−末端アミド基の置換のような天然のアミノ酸の修飾は、イン・ビトロで行うことが困難である。これらの翻訳後の修飾は、しばしば、ペプチドの最も強力な持続性のある形態をもたらし、製薬用途にしばしば必要とされるペプチドの天然型を構成するので重要である。組換ペプチドの修飾用のいくつかの技術がある。そのような技術の１つは、ヘンリクセンら［Henriksen et al.，J．Am.，Chem．Soc.，114:1876-1877(1992) ］およびオースエら［Ohsuye et al.，Biochem．Biophys．Res．Commun.，150:1 275-1281(1988)］に記載されるα−アミド化酵素を利用するボンジャースら［Bo ngers et al.，Int．J．Peptide Protein Res.，40:268(1992)］に記載されるＣ −末端α−カルボキシル基のアミド化である。しかし、これらの技術は、所望の修飾を行える天然の酵素または化学反応が存在する修飾に限定される。ペプチドのアミド化は、求核試薬としてアミノ酸アミドまたはペプチドアミドを使用するプロテアーゼ触媒置換反応（ペプチド転移反応）を介して行われる。サヒナら［Sahina et al.，Chem．Pharm．Bull.，36:4345-4354(1988)］；サヒナら［Sahina et al.，Chem．Pharm．Bull.，37:811-812(1989)］；ブレッダムら［Breddam et al.，J．Peptide Protein Res.，37:153-160(1991)］。これらの技術を用いる収率は典型的には非常に低い。しかし、適当な反応条件下、セリンまたはチオール−プロテアーゼによって触媒されるペプチド転移反応は高い収率で行われている。上記ブレッダムら(1991)。いくつかの状況では、プロテアーゼ触媒ペプチド転移反応は非常に効率がよいが、天然のプロテアーゼが存在し、Ｃ−末端に近いペプチド結合に対して特異性を示す基質に限られる。そこで、種々の基質、特に、天然のプロテアーゼ酵素と反応性でない基質を用い、これまで未知のＮ−またはＣ−末端修飾ならびにペプチド鎖延長を行うことのできる変異プロテアーゼ酵素を提供する必要性がある。発明の概要これら、および他の目的は、本発明の方法により達成される。本発明は、特製（customized）プロテアーゼ（すなわち、変異プロテアーゼ）、特製プロテアーゼの製法および特製プロテアーゼの使用法を提供するものである。特製プロテアーゼは、エンドプロテアーゼ類、エクソプロテアーゼ類、セリンプロテアーゼ類およびシステインプロテアーゼ類のような公知のプロテアーゼ類から誘導される。特製プロテアーゼは、公知のプロテアーゼにより実質的に触媒されないアシル基転移反応において予め選択された求核試薬で予め選択された基質のアシル基転移を行うことのできるプロテアーゼを提供するように設計された当該公知のプロテアーゼの修飾形である。変異または特製プロテアーゼはまた、改善された、または増強されたアシル基転移の収率を示すことができる。好ましい予め選択された基質は、末端から２番目の位置に酸性または塩基性アミノ酸を持つペプチド類である。好ましい予め選択された求核試薬は、アミノ酸類およびアミノ酸エステル類やアミノ酸アミド類のようなアミノ酸誘導体である。本発明はまた、特製プロテアーゼの製法も提供する。これらの方法は、部位特異的突然変異誘発またはランダム突然変異誘発を包含することができる。部位特異的突然変異誘発は、活性部位における選択アミノ酸の、１つの選択したアミノ酸での置換または該選択した活性部位アミノ酸の２０個のアミノ酸のいずれか１つによるランダムな置換を包含できる。ランダム突然変異誘発は、活性部位のいずれかのアミノ酸の他の１９個のアミノ酸のいずれかによる置換を包含することができる。本発明の１つの方法は、公知のプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列を用意し、活性部位における少なくとも１つのアミノ酸に対する少なくとも１つのコドンを修飾して変異ＤＮＡ配列を形成し、該変異ＤＮＡ配列で適当な宿主細胞を形質転換し、特製プロテアーゼの発現に供することを包含する。好ましい形態においては、活性部位におけるアミノ酸に対するコドンを、制限酵素を用いて欠失させ、欠失コドンを別のアミノ酸残基をコードするオリゴヌクレオチドで置換する。本発明のもう１つの方法は、標的部位に停止コドンおよび／または制限酵素認識部位を挿入して公知のプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列を修飾して不活性プロテアーゼをコードする修飾ＤＮＡ配列を形成することを包含する。標的部位は、好ましくは、停止コドンで置換される活性部位のアミノ酸に対するコドンを含む。修飾ＤＮＡ鎖を合成酵素、オリゴヌクレオチド類および第１の変性（dege nerate）オリゴヌクレオチドの存在下にインキュベートして、変異ＤＮＡ鎖を合成、増幅する。第１の変性オリゴヌクレオチドは、標的部位において、公知のプロテアーゼにおける活性部位のアミノ酸の代わりに異なるアミノ酸に対するコドンを含む。ついで、特製プロテアーゼを検出することにより変異ＤＮＡ鎖を選択およびスクリーニングする。本発明はまた、予め選択した基質をアシル基転移により修飾するための特製プロテアーゼの使用法も包含する。該特製プロテアーゼで触媒されるアシル基転移反応は、好ましくは、公知の酵素によって実質的にアシル基転移しないものである。特製プロテアーゼを、予め選択した基質および予め選択した求核試薬と共にインキュベートし、混合物を形成させる。該混合物を十分にインキュベートして、予め選択したアシル基転移生成物を、好ましくは高収率で生成させる。本発明の特製プロテアーゼは、組換ペプチドの翻訳後修飾に利用できる。生成されたアシル基転移生成物は、そのＣ−末端またはＮ−末端が種々の求核試薬（含：Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸アミド、アミノ酸誘導体、アミノ酸エステルおよび放射性アミノ酸または、その末端アミノ酸が天然アミノ酸またはアミノ酸誘導体である２個以上のアミノ酸を含むペプチド誘導体）での置換により修飾されている。組換技術以外の方法によって製造されるペプチドは、本発明の方法によりアシル基転移できると理解される。発明の詳細な記載本発明は特製プロテアーゼ（すなわち、変異酵素）、特製プロテアーゼの製法、ならびに特製プロテアーゼの使用法を提供する。本発明の特製プロテアーゼは公知のプロテアーゼから誘導され、公知のプロテアーゼと異なるアシル基転移能を有する。改変されたアシル基転移能には、公知のプロテアーゼによって実質的に触媒されない（すなわち、収率１０％未満）アシル基転移反応を行う能力または改善もしくは増強された収率（すなわち、８０〜１００％）でアシル基転移反応を行う能力または両方が含まれる。変異特製プロテアーゼは、プロテアーゼが、公知のプロテアーゼとは異なる予め選択された基質および／または異なる予め選択された求核試薬によるアシル基転移反応を行うことができる。変異酵素はまた、特定の予め選択した基質および／または求核試薬によるアシル基転移反応を行うように特別に設計、選択することもできる。公知のプロテアーゼ、好ましくはエクソペプチダーゼ類は、特製酵素が、異なる予め選択した基質および／または求核試薬をアシル基転移できるように、活性部位のアミノ酸を置換して作成する。特製プロテアーゼはまた、増強または改善したアシル基転移収率を示すことができる。予め選択した基質は、好ましくは、末端から２番目に酸性または塩基性のアミノ酸を有する。予め選択した求核試薬は、好ましくは、酸性または塩基性アミドである。本開示においては、以下の用語を使用する。この用語はカルボキシおよびアミノペプチダーゼ類の両方ならびにエンドペプチダーゼ類を包含するプロテアーゼ類に適用できる。シェヒターら［Schechter et al.，(1967)］予め選択された基質のアミノ酸は文字「Ｐ」によって命名する。プロテアーゼ酵素で開裂されるペプチド結合のＮ−末端側の基質アミノ酸をＰ_n・・・Ｐ₃、Ｐ₂、Ｐ₁で命名し、Ｐ_nがプロテアーゼの触媒機構（apparatus）から最も遠いアミノ酸である。プロテアーゼで開裂されるべき結合のカルボキシ側の予め選択された基質のアミノ酸はＰ₁'、Ｐ₂'、Ｐ₃'・・・Ｐ_n'で命名し、Ｐ_n'がプロテアーゼの触媒機構から最も遠いアミノ酸である。プロテアーゼで開裂されるべき結合はＰ₁ −Ｐ₁'結合である。したがって、予め選択した基質のアミノ酸についての一般式は、つぎのとおりである。カルボキシペプチダーゼＰ_n---Ｐ₃-Ｐ₂-Ｐ₁-Ｐ₁' アミノペプチダーゼＰ₁-Ｐ₁'−Ｐ₂'-Ｐ₃'---Ｐ_n' エンドペプチダーゼＰ_n---Ｐ₃-Ｐ₂-Ｐ₁-Ｐ₁'-Ｐ₂'-Ｐ₃'---Ｐ_n' プロテアーゼの「活性部位」は多くの基質結合部位および１つの触媒機構に分割される。例えば、カルボキシペプチダーゼＹのようなセリンプロテアーゼの触媒機構は、セリン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸を含むアミノ酸の保存触媒３回対称軸（conserved catalytic triad）を有する。酵素の結合部位は、Ｓ₁結合部位を含むことができ、そのＳ₁'結合部位はＣ−結合部位を含む。カルボキシペプチダーゼについて、Ｓ₁結合部位は、予め選択した基質（Ｐ₁）の末端から２番目のアミノ酸の側鎖と結合し、そのＳ₁'結合部位はカルボキシ末端アミノ酸（Ｐ₁'）の側鎖に結合し、Ｃ−結合部位は末端α−カルボキシレート基質と結合する。活性部位の修飾は、好ましくは、１以上の結合部位におけるアミノ酸の変化を含む。プロテアーゼの基質結合部位についての用語は、プロテアーゼの基質結合部位が文字「Ｓ」で命名される点を除いて、予め選択した基質のアミノ酸を記載するための用語に類似している。開裂した結合のＮ−末端側のアミノ酸に対する基質結合部位はＳ_n・・・Ｓ₃、Ｓ₂、Ｓ₁と標記される。開裂した結合のカルボキシ側のアミノ酸についての基質結合部位は「Ｓ'」で命名される。これらはＳ₁'、Ｓ₂'・・・Ｓ_n'と標記される。また、基質のアミノ酸の用語と同様、プロテアーゼの触媒機構は、Ｓ₁およびＳ₁'基質結合部位の間に存在すると理解される。すなわち、プロテアーゼの基質結合部位を記載するための一般式はつぎのとおりである。Ｓ_n---Ｓ₂-Ｓ₁-Ｓ₁'-Ｓ₂'---Ｓ_n 本発明の特製プロテアーゼは、基質のアシル基を転移できる。ここで用いるアシル基転移とは、酵素が、脱離基が求核試薬と交換する反応を触媒できることである。アシル基転移反応には、ペプチド転移反応ならびにペプチド延長反応を包含する。ここで用いるペプチド転移反応は、単一または複数のアミノ酸またはアミノ酸誘導体が脱離基として作用し、求核試薬が単一のアミノ酸もしくはペプチドまたはアミノ酸誘導体であるときに起こる。ここで使用するペプチド延長は、単一のアミノ酸のペプチドによる置換を包含する。また、アシル基転移反応には、脱離基がアルコールで求核試薬が単一または複数のアミノ酸単位である場合も包含する。本発明による特製プロテアーゼは、組換ペプチドの翻訳後の修飾に利用できる。生成したアシル基転移生成物はそのＣ−末端およびＮ−末端で種々の求核試薬（含：Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸アミド、アミノ酸誘導体、アミノ酸エステルおよび放射性アミノ酸または、その末端アミノ酸が天然アミノ酸またはアミノ酸誘導体である２個以上のアミノ酸を含むペプチド誘導体）での置換により修飾されている。組換技術以外の方法によって製造されるペプチドは、本発明の方法によりアシル基転移できると理解される。本発明の方法は、部位特異的および／またはランダム部位突然変異誘発法を介する特製プロテアーゼ製造に供される。本発明は、さらに、予め選択したアシル基転移反応を触媒することのできる適当に修飾された特製プロテアーゼを選択およびスクリーニングするために供される。別に、本発明の方法は伝統的な突然変異誘発法を介する特製プロテアーゼを製造する手段を提供する。本発明はまた、予め選択した基質をアシル基転移反応して修飾ペプチド生成物を生成するために該特製プロテアーゼを利用する方法も提供する。Ａ．特製プロテアーゼ本発明は特製プロテアーゼを提供する。特製プロテアーゼは公知のプロテアーゼから誘導され、公知のプロテアーゼと異なる改変されたアシル基転移能を有する。ここで用いる特製プロテアーゼは、公知のプロテアーゼでは実質的に触媒されない（すなわち、１０％未満）アシル基転移反応において、予め選択した基質を、予め選択した求核試薬でアシル基転移できるプロテアーゼを提供するように設計された当該公知のプロテアーゼの修飾形態である。該変異または特製プロテアーゼは改善または増強されたアシル基転移収率も示すことができる。改善または増強された収率は、公知の酵素の収率を好ましくは、約４０〜８０％、さらに好ましくは約８０〜１００％上回った収率である。公知のプロテアーゼは、好ましくは、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼおよび他のエンドおよびエクソペプチダーゼを包含する。特に好ましいプロテアーゼは、セリンカルボキシペプチダーゼである。プロテアーゼ酵素は、予め選択した基質を加水分解でき、かつ切断される結合がエステルおよび／またはペプチド結合である基質をアシル基転移できる。アシル基転移反応の一般的反応を以下に示す。アシル基転移反応は予め選択した基質のＮまたはＣ−末端で起こることができる。本発明を限定する意味ではないが、アシル基転移反応を触媒する酵素は好ましくは求核試薬と結合できるか、さもなければ収容できると考えられる。反応の所望の生成物をアシル基転移生成物と称する。加水分解の一般的反応をは以下のとおりである。所望のアシル基転移反応生成物の収率は（１）基質の脱離基、（２）求核試薬および（３）個々の基質および求核試薬についての競合副反応の速度に依存しうる。競合副反応には、（１）基質の加水分解、（２）所望のアシル基転移生成物の加水分解、（３）アシル基転移反応を介する種々の望ましくない副生成物の生成、例えば、基質の加水分解から生じたペプチドへの求核試薬の付加、所望のアシル基転移反応生成物への求核試薬の付加、アシル基転移反応生成物の重合が包含されうる。望ましくない副生成物には、基質の加水分解生成物、所望のアシル基転移反応生成物の加水分解生成物および基質と１以上の加水分解生成物とのアシル基転移反応生成物が包含されうる。本発明の好ましい特製プロテアーゼは、所望のアシル基転移反応の高収率（すなわち、好ましくは約４０〜１００％、より好ましくは８０〜１００％）で触媒でき、実質的な量の望ましくない副生成物を生成せず、求核触媒に対し高い親和性を有する。好ましい特製プロテアーゼはまた、望ましくないアシル基転移副生成物、特に、基質の加水分解生成物と基質との反応のアシル基転移生成物を実質的に生成物しない。ここで用いる「実質的に」は、望ましくない副生成物が、好ましくは収率約０〜４０％、より好ましくは収率０〜２０％および、最も好ましくは、収率０〜５％を意味する。望ましくない副生成物の幾つかは抗原性キャッピング剤で副生成物を修飾し、キャップ形成生成物をアフィニティーカラムで除去することにより反応混合物から除去できる。副生成物は、自動ペプチド合成における望ましくない副生成物の修飾法を記載している１９９１年９月１７日に発行された米国特許５０４９６５６号に記載されたと同様な方法により抗原性キャッピング剤で修飾できる。予め選択された基質は、好ましくは、公知のプロテアーゼにより実質的にアシル基転移されない。ここで用いる実質的なる用語は、公知のプロテアーゼによるアシル基転移反応の収率が、好ましくは約０〜４０％、より好ましくは約０〜１０％であることを意味する。予め選択された基質は、天然のペプチド、組換ペプチド、合成ペプチドまたはＣ−末端α−カルボキシル基がエステル化、その他、修飾されているペプチドとすることができる。予め選択した基質は、その末端に脱離基の結合したコアペプチドを有する。脱離基が除去され、求核試薬が付加する予め選択された基質の部分がコアである。適当な脱離基は、アミノ酸、小ペプチドまたはアルコールである。好ましい脱離基は、小さい無極性の、親水性のアミノ酸ならびにエステル結合でペプチドに結合する基である。予め選択した基質の適合性は、プロテアーゼの基質特異性、脱離基の性質および所望の最終生成物に依存している。本発明を限定するものではないが、脱離基の適合性は、（１）予め選択した基質の所望の修飾、（２）特製プロテアーゼの基質特異性および（３）脱離基の特製プロテアーゼへの結合様式に依存すると考えられる。本発明による特製プロテアーゼを用いるアシル基転移のための適当な予め選択した基質は一般式：Ｐ−Ａ（式中、Ｐは予め選択した基質のＮ−末端またはＣ−末端コアを表し、Ａは脱離基である）のものである。脱離基（Ａ）は、アミノ酸、アミノ酸アミド、ペプチド、ペプチドアミドまたはアルコールとすることができる。Ａがアミノ酸、アミノ酸アミド、ペプチドまたはペプチドアミドの場合、コア（Ｐ）からのＡの開裂はペプチド結合の所である。Ａがアルコールの場合、コアからのＡの開裂はエステル結合の所である。好ましくは、予め選択された基質は、公知のプロテアーゼによって高い効率でアシル基転移されない基質である（すなわち、約０〜４０％の収率）。より好ましくは、予め選択された基質は酸性または塩基性の第２位（ penultimate）アミノ酸を有する。適当な予め選択された基質は、成長ホルモン関連因子（ＧＲＦ）およびその誘導体、カルシトニンおよびその誘導体およびグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）（配列番号ＳＥＱＩＤＮＯ：１）を包含する。好ましい予め選択した基質はＧＲＦ（１−４３）−Ａla（配列番号ＳＥＱＩＤＮＯ：２）、ＧＲＦ（１−２４）（配列番号ＳＥＱＩＤＮＯ：３）およびＧＬＰ−１（配列番号ＳＥＱＩＤＮＯ：１）である。ここで用いる求核試薬は、電子対を原子核に与えて共有結合を形成することのできるものである。適当な求核試薬はアミノ酸誘導体、ペプチド誘導体、アンモニアまたは、脱離基を求核試薬と置換する能力を有する特製プロテアーゼにより、予め選択した基質のコアに付加できる標識化合物とすることができる。適当な求核試薬はまた、アシル基転移生成物の所望の修飾を行えるように変えることのできる試薬を包含できる。例えば、バッカート（Buckardt）によって記載されているような光求核試薬は特製プロテアーゼを用いるアシル基転移によって基質に付加でき、ついで、得られたアシル基転移生成物は光を適用することによりアミドに変えることができる。適当な求核試薬は、（１）最終生成物の所望の修飾および（２）予め選択した基質の脱離基を置換する求核試薬の能力に基づいて予め選択できる。好ましい求核試薬には、アミノ酸および、アミノ酸エステルおよびアミノ酸アミドのようなアミノ酸誘導体が包含される。特製プロテアーゼは、「活性部位」における公知のプロテアーゼの修飾を通じて選択したアシル基転移反応に適合させることができる。変異または特製酵素の修飾は、公知のプロテアーゼとは異なる予め選択した基質および／または求核試薬に作用できるようにプロテアーゼの「活性部位」を変えるために設計された部位特異的突然変異とすることができる。修飾には、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入を包含できる。また、修飾はランダム突然変異誘発によっても生じさせることができる。プロテアーゼの活性部位の幾つかのアミノ酸は当業者に公知である。プロテアーゼの活性部位のアミノ酸が公知でない場合、標準的方法を用いて、プロテアーゼの公知の結合部位のアミノ酸と同等のアミノ酸を同定できる。これらの方法には、そのプロテアーゼ群の酵素の一次および／または三次構造を参照して同等なアミノ酸を同定することが含まれる。例えば、カルボキシペプチダーゼに対する参照酵素は小麦カルボキシペプチダーゼ（ＣＰＤ−ＷＩＩ）である。ＣＰＤ−ＷＩＩの一次アミノ酸構造および結晶構造は公知であり［Liao および Remington 、J．Biol．Chem．265:6528(1990)］、他のカルボキシペプチダーゼにおける同等なアミノ酸の同定のための参照点として供することができる。ＣＰＤ−Ｙのアミノ酸配列および結晶構造も公知であり［Endrizzi et al.，B iochemistry，33:11106(1994)］、同様に、他のカルボキシペプチダーゼにおける同等なアミノ酸の同定のための参照点として使用できる。未知の三次構造を有するプロテアーゼの活性部位における残基の同定に適用できる１つの方法は、目的のプロテアーゼのアミノ酸配列と、公知の三次構造を有する相同プロテアーゼのアミノ酸配列との対比である。すなわち、この方法は、相同プロテアーゼの活性部位のアミノ酸と同等の、目的とするプロテアーゼにおけるアミノ酸の同定に使用できる。例えば、オルセンら［Olesenet al.，Protei n Engineering，6:409(1993)］参照。別法として、活性部位のアミノ酸は、Ｘ線結晶学またはＮＭＲ技術を用いる三次構造の決定により同定できる。好ましい形態では、カルボキシペプチダーゼＹは活性部位のアミノ酸の置換により修飾される。これらのアミノ酸は、好ましくは、Ｓ₁またはＳ₁'結合部位に見いだされる。Ｓ₁結合部位の好ましいアミノ酸には、Ｔyr１４７、Ｌeu１７８、Ｔyr１８５、Ｔyr１８８、Ａsn２４１、Ｌeu２４５、Ｔrp３１２、Ｉle３４０およびＣys３４１が包含される。Ｓ₁'結合部位の好ましいアミノ酸には、Ｔrp４９、Ａsn５１、Ｇly５２、Ｃys５６、Ｔhr６０、Ｐhe６４、Ｇlu６５、Ｇ1u１４５、Ｔyr２５６、Ｔyr２６９、Ｌeu２７２、Ｓer２９７、Ｃys２９８およびＭet ３９８が包含される。カルボキシペプチダーゼＹの結合部位のこれらの残基と同等のアミノ酸が好ましい。Ｓ₁結合部位におけるアミノ酸の置換は、好ましくは、塩基性または酸性第２位アミノ酸（Ｐ₁）で予め選択された基質をアシル基転移できる変異プロテアーゼをもたらすことができる。Ｓ₁'結合部位におけるアミノ酸の置換は、好ましくは、大きな無極アミノ酸、プロリンおよびプロリンアミドのような大きな無極アミノ酸脱離基および／または求核試薬で予め選択した基質のアシル基転移反応を行う能力を有する変異プロテアーゼをもたらすことができる。特に好ましい酵素は、カルボキシペプチダーゼＹのアミノ酸残基１７８または３９８に等価な位置に異なるアミノ酸残基を有する特製カルボキシペプチダーゼである。好ましい置換アミノ酸は１７８位におけるセリンである。好ましい特製プロテアーゼは、成長ホルモン関連因子のような酸性または塩基性アミノ酸を有する予め選択した基質を、Ｃ−末端アラニン（ＧＲＦ（１−４３）−Ａla（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）および第２位アミノ酸としてのアルキニンてアシル基転移できる能力のあるカルボキシペプチダーゼである。特に好ましい変異カルボキシペプチダーゼは、ロイシンアミドによる成長ホルモン関連因子の形成を触媒する。選択にはまた、活性部位に置換される異なるアミノ酸の選択も含む。本発明を限定するものではないが、活性部位に挿入すべきアミノ酸を選択することのできる１つの方法は、予め選択した基質と特製プロテアーゼとの結合相互反応への影響の予測による。これらの置換は保存性（conservative）アミノ酸置換でありうる。一般に、プロテアーゼの基質結合部位と、予め選択した基質および／または求核試薬との結合相互反応は直接、アシル基転移反応過程に影響する。本発明を限定するものではないが、結合部位のアミノ酸と、基質のアミノ酸との相互反応が、アシル基転移の第１工程である酵素基質複合体（ＥＳ）の形成を行うと考えられる。セリンまたはチオールプロテアーゼについて、酵素基質相互反応は四面体遷移状態の形成、それに続く、基質コアと脱離基間のペプチド（エステル）結合の開裂を導く。ついで、形成されたアシル−またはチオ−種は求核攻撃（アミノリシス）を受け、アシル基転移生成物を形成する。ＥＳ複合体形成に含まれる結合相互反応には３つの主なタイプ：静電気的相互反応、水素結合およびファンデルワールス力が包含される。基質結合部位におけるアミノ酸置換は、基質に対する酵素の結合親和力（すなわち、ＥＳ複合体形成）における変化、遷移状態を伴う酵素の相互反応の修飾ならびに競合アミノリシスおよび加水分解の速度に影響する相互反応を介してプロテアーゼのアシル基転移能の変をもたらす。これらの段階の各々に影響するアミノ酸置換は、脱離基を有する予め選択した基質および予め選択した求核試薬に基づいて予測できる。好ましい置換には、カルボキシペプチダーゼＹにおけるＡsn５１のグルタミンによる置換およびＬeu１７８のセリンによる置換が包含される。変異または特製プロテアーゼはまた、増強されたアシル基転移能を示すものも包含される。増強されたアシル基転移能は、アシル基転移生成物の収率増加を測定することにより決定できる。好ましくは、公知のプロテアーゼによる触媒の収率よりも約４０〜１００％、さらに好ましくは約８０〜１００％の収率増加である。予め選択した基質は、公知のプロテアーゼでアシル基転移できるが、低収率（すなわち、約１０〜４０％）な基質か、公知のプロテアーゼによって実質的に開裂されない（すなわち、１０％未満）基質のいずれかである。Ｂ．特製プロテアーゼの製法本発明は、公知のプロテアーゼから誘導される、修飾活性部位を有し、当該公知のアシル基転移能を改変するために機能する特製プロテアーゼの製法を提供する。ここで使用するように、特製酵素は、公知のプロテアーゼの１つ以上の基質結合部位における１つ以上のアミノ酸を変異することにより、新しい基質をアシル基転移するように修飾できる。１つの基質結合部位における１つのごとき少ないアミノ酸の変異でも、公知のプロテアーゼに適合できない基質のアシル基転移を提供できる。また、活性部位は増強したアシル基転移能、すなわち、アシル基転移の高収率を提供するために修飾できる。基質結合部位のアミノ酸の変異は、（１）基質のコアペプチド部分に対する特製プロテアーゼの親和力、（２）脱離基または求核試薬に対する特製プロテアーゼの親和力および（３）競合加水分解反応を越えるアミノシス触媒の優先性のような特製プロテアーゼによる予め選択した基質のアシル基転移を影響する１つ以上の機能を改変できる。ａ．変異すべき公知プロテアーゼのＤＮＡ配列の提供本発明の方法によれば、特製プロテアーゼ製造のための公知プロテアーゼの変異は、部位特異性突然変異誘発、ランダム部位突然変異誘発および伝統的突然変異誘発によって行うことができる。最初の２つの方法は、公知プロテアーゼのＤＮＡ配列および基質結合部位アミノ酸をコードするコドンの所在についての知識を必要とする。プロテアーゼの活性部位のアミノ酸は、当業者に公知であるか、ここに記載のように公知のプロテアーゼと同様にして同定できる。公知のプロテアーゼをコードする対応するＤＮＡ配列および活性部位におけるアミノ酸に対するコドンの所在は当業者に公知であるか、アミノ酸配列から誘導できる。例えば、カルボキシペプチダーゼＹ（ＣＰＤ−Ｙ）をコードするＰＲＣ１遺伝子のＤＮＡ配列および制限地図および該ＤＮＡ配列の源はバルズら［Valls et al.，Cell ，48:887-889(1987)］に記載されている。公知のプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列は、SwissProt、GeneBankおよびＥＭＢＬのような電子データバンクから得ることができる。一旦、これらの配列を同定したら、当業者は当該ＤＮＡ配列を含むベクターを同定する刊行物を見いだし、使用して特製プロテアーゼを調製できる。公知の酵素のＤＮＡ配列および基質結合部位が利用できない場合、公知のプロテアーゼのアミノ酸配列から推定ＤＮＡ配列を誘導できる。公知のアミノ酸配列は、合成オリゴヌクレオチドプローブの調製に使用できる。該プローブを使用して、マニアティスら［Maniatis et al，A Guide to Mo1ecular C1oning(1989)］によって記載されているような、標準的方法により適当な生物で公知のプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列を同定する。一旦、公知のプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列が単離されたら、活性部位におけるアミノ酸に対応するコドンはここに記載のようにして同定できる。活性部位アミノ酸は、一次または三次構造を他のプロテアーゼの他の公知の活性部位と比較するか、ここに記載のＸ線結晶学によって同定できる。ｂ．活性部位のアミノ酸の修飾活性部位におけるアミノ酸は、公知のプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列における該アミノ酸をコードするコドンを修飾することにより修飾できる。活性部位におけるアミノ酸およびそれらのアミノ酸をコードするコドンの所在は当業者に公知であるか、標準的方法を用いて決定できる。活性部位のアミノ酸は、好ましくは、Ｓ₁、Ｓ₁'またはＣ結合部位に見られるものが包含される。該プロテアーゼの活性部位のアミノ酸をコードするコドンまたはコドン類をＤＮＡ配列の標的部位に含ませる。標的部位は、変異しようとするＤＮＡ配列を含む。標的部位において１つ以上のコドンが変化されうる。所望により、標的部位はまた、活性部位のアミノ酸のコドンまたはコドン類を取り囲むＤＮＡ配列を含むこともできる。コドンを取り囲む標的部位のＤＮＡ配列は、好ましくは、活性部位にアミノ酸のコドンまたはコドン類のいずれかの側に約３〜９個のヌクレオチドを含む。コドン類の修飾には、コドンの置換、挿入または欠失が含まれる。活性部位のアミノ酸をコードするコドン類は、好ましくは、公知のプロテアーゼとは異なるアミノ酸をコートするように修飾される。部位特異的修飾では、活性部位における選択したアミノ酸は、ランダムに、または特定のアミノ酸に対するコドンとの置換により変えることができる。ランダム部位修飾では、任意の数のコドンが任意のアミノ酸による置換によって修飾できる。コドンの修飾は改変したアシル基転移能を有する特製プロテアーゼをもたらす。好ましい修飾用のコドンは、カルボキシペプチダーゼのＳ₁またはＳ₁'結合部位におけるアミノ酸をコードするものである。本発明を限定するものではないが、Ｓ₁部位におけるアミノ酸の修飾は、予め選択した基質を塩基性または酸性第２位アミノ酸（Ｐ₁）でアシル基転移できる変異プロテアーゼをもたらすことができると考えられる。同様に、Ｓ₁'結合部位におけるアミノ酸の修飾は、予め選択した基質を酸性または塩基性脱離基および／または求核試薬としてのアミノ酸アミドでアシル基転移できる変異プロテアーゼをもたらすと考えられる。ランダムまたは特異的部位における特定のアミノ酸置換の選択は、結合部位アミノ酸と基質の相互反応の公知または推定した機序に基づくことができる。このために、そのアミノ酸置換が適宜の相互反応を提供し、予め選択した基質のアシル基転移を行わせるアミノ酸の特性についての知識を用い、合理的な推論ができる。特定のアミノ酸置換を選択する場合に考慮されうる公知のアミノ酸の特性には電子的および立体的因子が包含される。例えば、特定のアミノ酸置換選択は、（α−カルボキシルおよび側鎖水素の）pＫa値、アミノ酸側鎖長および種々のp Ｈにおけるアミノ酸側鎖極性に基づくことができる。本発明を限定するものではないが、アミノ酸置換の効果は、ここでカルボキシペプチダーゼについて記載するように、結合および触媒に包含される相互反応に基づいて予測できる。あるいは、特定アミノ酸置換の合理的推測に利用できるデータがない場合は、変化させるべき活性部位のアミノ酸および作るべきアミノ酸置換の両方に関してアミノ酸置換のランダム選択ができる。本発明の方法によれば、部位特異的およびランダム部位特突然変異誘発を公知のプロテアーゼの変異に使用し、変異した、または修飾したコドンを含むオリゴヌクレオチドの、選択または標的コドン位置での取り込みにより行うことができる。ランダムおよび部位特異的突然変異誘発の他の方法は、上記マニアティスによる記載に従って採用できる。公知のプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列へオリゴヌクレオチドを取り込み、修飾ＤＮＡ配列を製造する好ましい方法には複製連鎖反応（ＰＣＲ）および標準的クローニング技術が包含される。変異または修飾コドンを含むオリゴヌクレオチドは標準的方法で得ることができる。これらの標準的方法は自動化方法による合成を包含する。自動ＤＮＡ合成用の方法は当業者に公知である。合成オリゴヌクレオチドは可変および定常部からなり、好ましくは、約２０〜６０のヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドの長さは、（１）オリゴヌクレオチドがコードする可変部の数および（２）定常部の長さの２つの主なファクターに依存する。オリゴヌクレオチドの可変部は、基質結合部位の変異アミノ酸をコードする核酸コドンを含む。アミノ酸のコドンは当業者に公知である。オリゴヌクレオチドの可変部は、特定アミノ酸または任意の数のランダムアミノ酸のコドンを含むように設計できる。したがって、可変部のコドンの最少数は３であり、これは単一のアミノ酸を表す。可変部のコドンは、公知のプロテアーゼにおける変異すべきコドンの位置に対応する。可変部は、オリゴヌクレオチドの定常部により隣接（ flank）される。オリゴヌクレオチドが２つ以上の可変部を含む場合、可変部の間に定常部がある。定常部は特製プロテアーゼ遺伝子に該オリゴヌクレオチドを取り込むのに必要であり、その部位で公知プロテアーゼのコドンに対応するコドンを含む（すなわち、変異されない）。定常部の長さは、特製遺伝子にオリゴヌクレオチドを取り込ませる手段および可変部に含まれるアミノ酸修飾の数に依存できる。好ましくは、定常部は、可変部のいずれかの側に約３〜５０のヌクレオチド、より好ましくは可変部のいずれかの側に約３〜３０のヌクレオチドを含む。一旦、形成されたら、該合成オリゴヌクレオチドを、フレーム中の、標的部位において公知のプロテアーゼに対するＤＮＡ配列に取り込ませる。この挿入を起こすことのできる１つの方法は、少なくとも１つの適当な制限エンドヌクレアーゼによる開裂により、標的部位を欠失し、ついでその欠失部位に該合成オリゴヌクレオチドを結合させることによる。適当な制限エンドヌクレアーゼは、標的部位周辺のヌクレオチド配列を調べ、その部位に挿入すべき合成オリゴヌクレオチドのサイズにより決定できる。制限酵素の認識配列は当業者に公知であり、酵素の適当な組み合わせは、当業者が容易に選択できる。好ましい形態において、カルボキシペプチダーゼＹのＡsn５１に対するコドンを修飾してグルタミン５１をコードするようにする。ＰＣＲ１遺伝子はカルボキシペプチダーゼＹをコードし、メリーランド州、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９９３年１０月２６日に寄託され、寄託番号７５５８０を与えられたプラスミドpＴＳＹ３から得ることができる。ＧＧＡＴＣＣＧＧＴＣＡＴＣＣＴＴＴＧＧＴＴＧＣＡＡＧＧＧＧＧＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）（オリゴＮ５１Ｑ）（下線部は標識部位におけるコドンに対する変化を示す）のような、Asn５１に対するコドンに対応する部位においてグルタミンに対するコドンを含むオリゴヌクレオチドは自動ＤＮＡ合成により合成される。ＰＣＲ１のＢamＨＩフラグメントはアミノ酸５１のコドンを含む。Ａsn５１に対するコドンを取り囲むカルボキシペプチダーゼＹのＤＮＡ配列は、ＢstＸＩおよびＳmaＩのような制限エンドヌクレアーゼによるＰＣＲ１のＢamＨＩフラグメントから欠失できる。該合成オリゴヌクレオチドを、ついで、該ＢamＨＩフラグメントのＳ maＩ−ＢstＸＩ部位に欠失配列の代わりに導入できる。この修飾ＢamＨＩフラグメントを、ついで、公知の方法を用いてカルボキシペプチダーゼＹに対する全ＤＮＡコード配列に挿入し戻す。修飾ＤＮＡ配列の配列はジデオキシ・シーケンシング方法を用いて確認できる。一旦、修飾ＤＮＡ配列が得られたら、それを適当な宿主細胞に導入し、選択し、発現させて、修飾活性部位を有し、公知のプロテアーゼのアシル基転移活性を改変するように機能する特製プロテアーゼを得ることができる。修飾ＤＮＡ配列は、好ましくは、ベクターに組み込み、選択および発現させる。適当なベクターには、酵母細菌シャトルベクターＹＥp２４、pＲＡ２１ΔＢＡＭ、pＹＳＰ１、pＴＳＹ３、pＲＡ２１およびpＹＳ３２が包含される。修飾または変異ＤＮＡ配列は、上記マニアティスら、およびニールセンら［Nielsen et a l.，Appl．Microbiol．Biotechnol.，33:307(1990)］に記載されるような標準的方法によってベクターに組み込むことができる。一旦、ベクターに組み込んだら、ベクターを選択および発現に適した宿主細胞に導入する。適当な宿主細胞には、イー・コリ(E．coli)のような細菌およびエス・セレビシアエ（S．cerevisiae）のような酵母が包含される。好ましい宿主細菌は、イソジェニック（isogenic）vp１変異、デルタ−prc１変異およびura３変異を有するエス・セレビシアエが包含される。特に好ましい宿主は、上記ニールセンらに記載される、活性ＣＰＤ−Ｙの分泌をもたらすvp１変異を有するエス・セレビシアエである。好ましいベクターは、ＰＣＲ１プロモーターの制御の下、ＰＣＲ１遺伝子を含む３.２kbのＤＮＡインサートを有する酵母細菌シャトルベクターＹＥp２４であるプラスミドpＴＳＹ３である。このプラスミドは、メリーランド州、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、寄託番号７５５８０を与えられている。適当な宿主細胞を、リン酸カルシウム、塩化カルシウムまたは酢酸リチウム・コンピテント細胞の形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等を含む標準的な方法で形質転換する。形質転換細胞は、イー・コリの場合、ベクター上の抗生物質耐性遺伝子の存在に基づき、また、酵母の場合はＵＲＡ３の存在に基づき、選択できる。形質転換酵母細胞は変異プロテアーゼ活性の生産についてスクーニングできる。変異プロテアーゼ生産形質転換酵母細胞は、上記ニールセンらにより記載される標準的方法を用いて、形質転換細胞のペプチド基質を加水分解する能力を検出することによりスクーニングできる。予め選択した基質および／または求核試薬によるアシル基転移反応を行うことのできる変異プロテアーゼは、さらに、実施例２および３に記載の方法を含む標準的方法によりアシル基転移活性を分析することにより選択できる。一旦、形質転移細胞を選択し、増幅したら、実施例１に記載のごとく、高速液体クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィーのような標準的方法を用いて変異プロテアーゼを精製できる。別の態様において、本発明の新規方法は、公知のプロテアーゼを突然変異誘発して改変したアシル基転移能を有する特製プロテアーゼを形成することを含む。この方法の基本的な技術は、突然変異誘発変性（degenerate）合成オリゴヌクレオチドにより感作（prime）された合成イン・ビトロＤＮＡ合成を含む。この方法は、変異形質転換体の大集団の効率よいスクーニングを提供し、それに続く機能的スクーニングにおける非突然変異誘発プラスミドによる野生型バックグラウンドを除去する。上記方法の工程には、公知プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列を用意することが含まれる。公知プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列は、公的に入手可能であるか、または、ここに記載のように標準的な方法によって得ることができる。公知プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列が得られれば、１個またはそれ以上の標的部位が選択される。ＤＮＡの標的部位には、好ましくは、ここに記載のように修飾すべき活性部位のアミノ酸に対する少なくとも１個のコドンが含まれる。標的部位が同定されれば、変異させるべき位置に停止コドンおよび所望により制限エンドヌクレアーゼ部位を挿入することによって、各標的部位でＤＮＡ配列が修飾される。停止コドンに対するコドンは、アンバー、オーカーおよびオパールと呼ばれ、停止コドンの配列は当業者に公知である。制限エンドヌクレアーゼによって認識されるＤＮＡ配列は当業者に公知である。制限エンドヌクレアーゼ部位を含むＤＮＡ配列は、停止コドンに隣接することができ、また、停止コドンと重複することもできる。標的部位に挿入されたオリゴヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ分析を含む標準的な方法によって調製することができる。挿入されたオリゴヌクレオチド配列は、好ましくは、長さが約３〜６０ヌクレオチドであり、マニアチス（Maniatis）ら（前出）に記載のようにインビトロＤＮＡ合成法などの標準的な方法を用いて、１個またはそれ以上の標的部位に挿入することができる。停止コドンおよび所望により制限エンドヌクレアーゼ部位を有するオリゴヌクレオチドが、公知プロテアーゼをコードするＤＮＡの標的部位に挿入されれば、不活性な公知プロテアーゼをコードする修飾されたＤＮＡ配列が形成される。停止コドンが存在することから、活性を欠く切断形（truncated form）の公知プロテアーゼが発現される。不活性な公知プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列は、ベクター、好ましくは、ファージミッドベクター（phagemid vector）に挿入される。ベクターは、増幅に適したイー・コリ（E．coli）などの宿主細胞に形質転換される。増幅されれば、ベクターが単離され、一本鎖ＤＮＡを調製することができる。所望により、ＤＮＡ配列は、フレームシフト変異を有するアンピシリン抵抗性をコードする遺伝子などの不活性な抗生物質抵抗性遺伝子を有するベクターに導入することができる。好ましいファージミッドベクターはｐＹＳＰ１である。特製プロテアーゼをコードする変異体ＤＮＡ鎖は、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼの存在下で、一本鎖ＤＮＡを１個またはそれ以上の第１縮重オリゴヌクレオチドと共にインキュベートすることによって、合成することができる。第１縮重オリゴヌクレオチドは、前記したように、可変領域および不変領域を有する。縮重オリゴヌクレオチドの可変領域には、公知プロテアーゼの活性部位にあるアミノ酸に対する少なくとも１個の（標的とされている）変異したコドンが含まれる。変異したコドンは、周囲のＤＮＡに関して、公知プロテアーゼのアミノ酸に対するコドンと同じ位置に見い出される。オリゴヌクレオチドは、変異したコドンが２０種類のアミノ酸のいずれかをコードするように無秩序に変化していれば、縮重（degenerate）している。変異したコドンにおける縮重オリゴヌクレオチドは、ＮＮＮという配列を有する。ここで、Ｎは４種類のヌクレオチドのいずれかに対応する。縮重オリゴヌクレオチドには、好ましくは、変異したコドンの両側に約１０〜５０個のオリゴヌクレオチドが含まれる。不変領域のコドンは、公知プロテアーゼの標的位置における公知プロテアーゼのコドンに対応する。縮重オリゴヌクレオチドは、２０種類のアミノ酸のいずれかに対するものとすることができ、公知の方法を用いて、また、オウリセン（Olesen）ら（前出）に記載のように、無秩序に生成される。公知プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列が停止コドンおよび／または制限エンドヌクレアーゼ部位によって修飾されている１個より多くの標的部位を含む場合、標的部位の１個または数個においてのみ修飾される変異体ＤＮＡ鎖を合成することが望ましい。変異が停止コドンを有する標的部位の数個においてのみ必要とされる場合、変異体酵素における他の標的部位は、これら他の標的部位における公知酵素の配列を有するべきである。オウリセン（Olesen）ら（前出）に記載のように、変異体ＤＮＡ鎖において変異すべきではない他の標的部位が確実に公知酵素の配列を有するように機能する１個またはそれ以上の第２オリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ合成混合物に含ませることができる。第２オリゴヌクレオチドには、標的部位における停止コドンおよび所望により制限エンドヌクレアーゼ部位によって置換されている公知プロテアーゼにおけるコドンに対応するコドンが含まれる。各第２オリゴヌクレオチドは、特定の標的部位において公知プロテアーゼと同じ配列を有する。第２オリゴヌクレオチドは、好ましくは、約２０〜６０ヌクレオチドを有する。合成混合物は、また、所望により、抗生物質抵抗性遺伝子の修復を行うオリゴヌクレオチドを含むこともできる。公知プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列がベクターに挿入される場合、そのベクターには、好ましくは、変異したアンピシリン抵抗性などの抗生物質抵抗性遺伝子が含まれる。ＤＮＡ合成混合物に抗生物質抵抗性遺伝子の変異を修復することができる１個またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含めることから、機能的な抗生物質抵抗性遺伝子を有する変異体ＤＮＡ鎖が得られる。抗生物質抵抗性遺伝子を修復することができるオリゴヌクレオチドには、抵抗性遺伝子中の関連した変異における正しいＤＮＡ配列を与えるコドンが含まれる。これらのオリゴヌクレオチドは、当業者に公知であり、また、ここに記載のように標準的な方法によって調製することができる。変異体ＤＮＡの合成が完了すれば、このＤＮＡによってコードされる望ましい変異体酵素を、予め選択された基質に作用してアシル基転移能（transacylation capability）を変更する能力について選択し、スクリーニングすることができる。変異体ＤＮＡは、選択し、まず、イー・コリ（E．coli）などの適当な宿主細胞中で増幅した後、プロテアーゼを分泌することができるエス・セレビシアエ（S．cerevisiae ）などの適当な宿主細胞中に導入することができる。形質転換した細胞の選択方法には、ベクター上における抗生物質抵抗性遺伝子の存在に基づいて、抗生物質抵抗性について選択することが含まれる。選択可能なマーカー遺伝子を用いた酵母中での選択方法は、当業者に公知である。形質転換した細胞は、スクリーニングし、所望の機能活性を持つ特製プロテアーゼを有する細胞を同定することができる。所望の特製プロテアーゼとしては、酸性または塩基性の最後から２番目のアミノ酸を有する予め選択された基質を加水分解することができるプロテアーゼ、予め選択された基質が予め選択された求核試薬によって修飾されるアシル基転移反応を触媒することができるプロテアーゼ、および、増強されたアシル基転移能を持つプロテアーゼを挙げることができる。好ましい特製プロテアーゼは、塩基性の最後から２番目のアミノ酸を有する予め選択された基質を末端ロイシンアミドで修飾することができるカルボキシペプチダーゼである。１つまたはそれ以上のスクリーニングおよび選択方法を採用することができる。例えば、予め選択された基質を加水分解することが可能な変異体酵素が、まず、加水分解活性について選択され、スクリーニングされ、次いで、それらの選択された変異体がアシル基転移活性についてスクリーニングされる。基質の加水分解は、変異体が予め選択された基質に作用できることを確実にするための第１レベル選択として用いられる。予め選択された基質を加水分解することが可能な変異体酵素は、次いで、さらにアシル基転移能についてスクリーニングされる。予め選択された基質の加水分解活性を発現する形質転換体の選択は、プレート活性法またはカラーオーバーレイ法を用いて実施することができる。低レベルの特製プロテアーゼを検出するには、カラーオーバーレイ法が好ましい。本発明によれば、プレート活性法を用いて、特製プロテアーゼを発現する形質転換した細胞を、予め選択された基質に対する加水分解活性について選択することができる。本発明のこの方法は、増殖にアミノ酸を必要とするバクテリアまたは酵母の宿主細胞を利用する。増殖に必要とされるアミノ酸は、ペプチトのＣ末端アミノ酸として形質転換した宿主細胞に与えられる。脱離基アミノ酸を欠く培地上で形質転換体を培養することによって、ペプチド基質から脱離基を放出することが可能な形質転換体のみが増殖することができる。この方法は、オウリセン（Olesen）ら、プロテイン・エンジニアリング（Protein Eng.）（前出）に記載されている。例えば、増殖にＬｅｕを必要とするエス・セレビシアエ（S．cerev isiae ）のｖｐｓ株は、Ｎ-保護化-Ｘ-Ｌｅｕ-ＯＨジペプチド（Ｘ＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＨｉＳ、Ｐｒｏ、ＴｒｐまたはＬｙｓ）などの予め選択された基質から末端Ｌｅｕを切断することが可能な変異体ＣＰＤ-Ｙ遺伝子を発現する形質転換体を選択するのに用いられる。これらの基質から末端Ｌｅｕを放出することができるプロテアーゼを発現する細胞のみが、これらのプレート上で増殖することができる。予め選択された基質を加水分解することが可能な特製プロテアーゼを発現する形質転換体の好ましい選択方法は、カラーオーバーレイ法である。この方法によれば、形質転換体コロニーには、特製プロテアーゼ活性を表す発色性基質を含む寒天が重ねられる。発色性基質は、特製プロテアーゼの触媒作用によって形成される生成物と反応すると、変色する。好ましい場合には、形質転換した細胞は、予め選択されたペプチドまたはアミノ酸基質と共にインキュベートされる。Ｎ- アセチル-Ｌ-アラニンβ-ナフチルエステルなどの予め選択されたペプチドまたは基質は、特製プロテアーゼを発現する形質転換した細胞によって作用を受け、反応生成物は、反応生成物に曝露されることによって変色するガーネットレッドなどの発色剤を形質転換した細胞に一緒に重ねることによって検出される。変異を受け、予め選択された基質に作用する能力についてスクリーニングされた特製プロテアーゼは、さらにアシル基転移能についてスクリーニングすることができる。アシル基転移能についてスクリーニングするのに採用することができる１つの方法は、実施例２および３に記載の方法である。特製プロテアーゼは、当該分野で公知の方法によって、また、実施例２および３に記載のように、形質転換した細胞から精製される。精製された特製プロテアーゼは、ｐＨ約７〜９．５などのアシル基転移に好ましい条件下で、かつ、適当な求核試薬の存在下で、予め選択された基質と混合される。予め選択された基質のアシル基転移を触媒することが可能な特製プロテアーゼを生成する形質転換体は、標準的な方法により、所望の反応生成物の出現および／または量に従って同定することができる。好ましい場合には、カルボキシペプチダーゼＹをコードするＰＲＣ１遺伝子は、以下のような標的部位におけるＤＮＡ配列の挿入によって修飾される。ＴＡＡＧＣＴＴＣＣ（配列番号５）、ＨｉｎｄIII Ｔｙｒ１４７において、オーカー停止コドンＴＧＡＡＴＴＣＣＴ（配列番号６）ＥｃｏＲＩＬｅｕ１７８において、オパール停止コドンＴＡＧＣＣＣＧＧＧＴＧＴ（配列番号７）、ＳｍａＩＧｌｕ２１４、Ａｒｇ２１６において、アンバー停止コドンＴＡＡＡＴＣＧＡＴＡＣＣ（配列番号８）、ＣｌａＩＩｌｅ３４０、Ｃｙｓ３４１において、オーカー停止コドンカルボキシペプチダーゼにおける標的部位は、カルボキシペプチダーゼ-ＷII に対するホモロジーに基づいて、選択された。修飾されたＤＮＡ配列は、不活性なカルボキシペプチダーゼＹをコードする。修飾されたＤＮＡ配列は、イー・コリ（E．coli）中におけるファージミッドベクターｐＹＳＰ３２として増幅される。好ましいベクターは、また、不活性なフレームシフトしたアンピシリン抵抗性遺伝子をも含む。ｐＹＳＰ３２の一本鎖ＤＮＡは、標準的な方法によって生成することができる。一本鎖ＤＮＡは、各々の長さが２０〜６０個のヌクレオチドで中央に縮重コドンを含む４つまでの第１縮重オリゴヌクレオチドと共にインキュベートすることかできる。１７８位に対する好ましい第１縮重オリコヌクレオチドとしては、以下の配列が挙げられる。ＧＧＣＮＮＮＡＣＴここで、ＮＮＮは、オリゴヌクレオチドの中央に位置し、１７８位のアミノ酸に対するコドンの位置に対応する。ＮＮＮは、２０種類のアミノ酸のいずれかに対するコドンである。縮重オリゴヌクレオチドは、自動化合成法によって合成することができる。好ましい合成混合物は、１個またはそれ以上の第２オリゴヌクレオチドを含むことができ、この場合、それらは、各々、第１オリゴヌクレオチドの１つと入れ替わる。第２オリゴヌクレオチドには、以下のように、１４７位、１７８位、２１５位および２１６位のアミノ酸に対するコドン、ならびに、カルボキシラーゼＹの３４０位および３４１位が含まれる。ＴＣＣＴＡＣＧＣＣ（配列番号９）Ｔｙｒ１４７ＴＴＧＧＡＡＣＧＴＴＧＴ（配列番号１０）Ｇｌｕ２１５、Ａｒｇ２１６ＴＴＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣ（配列番号１１）Ｉｌｅ３４０、Ｃｙｓ３４１ＧＧＣＣＴＣＡＣＴ（配列番号１２）Ｌｅｕ１７８これら第２ヌクレオチドの存在は、他の標的部位において停止コドンを用いずに変異体ＤＮＡ鎖を合成することを確実にする。ある好ましい変異誘発混合物は、１７８位に対する第１縮重オリゴヌクレオチドと、Ｔｙｒ１４７、Ｇｌｕ２１５、Ａｒｇ２１６、Ｉｌｅ３４０およびＣｙｓ３４１の各位置に対する第２オリゴヌクレオチドとを含有する。所望により、好ましいＤＮＡ合成混合物は、また、１個またはそれ以上の第３オリゴヌクレオチド、すなわちアンピシリン修復オリゴヌクレオチドをも含有する。修復オリゴヌクレオチドは、変異体または特製プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列に作動可能なように連結した機能的なアンピシリン抵抗性遺伝子を有する変異体ＤＮＡ配列の合成を与える。一本鎖ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドの混合物は、前駆体ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼの存在下でインキュベートされる。特製プロテアーゼをコードする変異体ＤＮＡ配列が形成され、所望により、機能的なアンピシリン抵抗性遺伝子に連結することができる。変異体ＤＮＡは、増幅および選択に適したミスマッチ修復欠損バクテリアに導入された後、引き続いて、スクリーニング用酵母に導入される。好ましい適当な酵母細胞は、ｖｐｓ変異を有し、および／または、増殖に少なくとも１種のアミノ酸を必要とするエス・セレビシアエ（S．cerevisiae）株である。特に好ましいエス・セレビシアエ（S．ce revisiae ）株としては、Ｗ２５７９、Ｋ２５７９ＬＬＲおよびＪＨＲＹ２０-２Ｃ△３が挙げられる。形質転換したイー・コリ（E．coli）細胞は、まず、アンピシリンの存在下で増殖する能力について選択することができる。引き続いて、これら形質転換体は、さらに、増殖に必要なアミノ酸を欠く培地上で、かつ、Ｃ末端に増殖用アミノ酸を有するペプチド基質の存在下で増殖する能力について選択される。例えば、ロイシンなしでは通常は増殖できない宿主細胞は、変異体ＤＮＡで形質転換され、以下の式を有する予め選択されたペプチドを補足したロイシン欠損培地上にプレートされる。Ｐ_nＰ₁-Ａここで、Ａはロイシンであり、Ｐ₁は公知プロテアーゼによって充分には作用を受けないアミノ酸、例えば、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＴｒｐまたはＬｙｓのいずれか１種である。Ｐ_n-Ｌｙｓ-Ｌｅｕなどの予め選択したポリペプチドを補足したロイシン欠損培地上で増殖することができる形質転換体は、予め選択されたポリペプチドに作用してロイシンを放出することができ、それにより、増殖用ロイシンの起源を与える。これらの発現されたプロテアーゼは、次いで、Ｐ_n-Ａｒｇ-Ａｌａ［ここで、Ｐ_nは増殖ホルモン放出因子およびロイシンアミドである］などの予め選択されたポリペプチドをアシル基転移させる能力についてスクリーニングされる。加水分解よりアミノリシスに好都合な特製プロテアーゼは、伝統的な変異誘発法を用いて製造することができる。本発明のこの方法によれば、公知プロテアーゼのアミノ酸組成の変異は、ＤＮＡ、または公知プロテアーゼのＤＮＡ配列をコードするベクターを含む細胞を、紫外光、ニトロソグアニジン、エチルメチルスルホネート、重亜硫酸塩、硫酸ジメチル、ギ酸、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、メトキシルアミン、亜硝酸、硫酸カリウムなどの変異誘発剤に曝露することよって達成される。伝統的な変異誘発法は、当該分野で公知であり、例えば、以下に記載されている。インビトロ変異誘発法の薬品については、マイヤース（My ers）ら、サイエンス(Science)，229巻：242-247頁（1985年）；ハヤツ(Hayatsu )，メソッヅ・イン・エンザイモロジー(Methods Enzymol.)，45巻：568-587（19 76年）；ショートル（Shortle）ら、メソッヅ・イン・エンザイモロジー(Method sEnzymol. )，100巻：457-568（1983年）；カドンガ（Kadonga）ら、ニュクリアー・アシッズ・リサーチ(Nucl．Acids．Res.)，13巻：1733-1745頁（1985年）；バスビィ（Busby）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J．Mol ．Biol. )，154巻：197-209頁（1982年）；およびレブ(Loeb)、セル(Cell)，40巻：483-484（1985年）；ヌクレオチドの誤導入については、コルンベルグ(Kornbe rg)、ディー・エヌ・エイ・レプリケーション(DNA Replication),フリーマン(Fr eeman)，サンフランシスコ（1980年)，724頁；およびクンケル（Kunkel）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J．Biol．Chem.)，254巻：571 8-5725頁（1979年）；ヌクレオチド類似体の導入については、フラベル（F1avel ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J．Biol．Chem.)，89 巻：255-272頁（1974年）；ダイエルクス（Dierks）ら、セル(Cell)，22巻：659 -706頁（1983年）；ドッドソン（Dodson）ら、ピー・エヌ・エイ・エス(PNAS)，79 巻：7440-7444頁（1982年）；イーディー(Eadie)ら、ネイチャー(Nature)，30 8 巻：201-203頁（1984年）；グロスバーガー（Gross-berger）ら、ピー・エヌ・エイ・エス(PNAS)，78巻：5689-587頁（1981年）；およびモット（Mott）ら、ニュクリアー・アシッズ・リサーチ(Nucl．Acids.Res.)，12巻：4139-4152頁(1984 年)。変異したベクターは、次いで、適当な発現系に導入され、発現された特製酵素は選択され、スクリーニングされる。伝統的な変異誘発法で製造された特製プロテアーゼを選択しスクリーニングする方法は、部位特異的および無秩序部位の変異誘発法によって製造された形質転換体について、上記のように実施することができる。プレート活性およびカラーオーバーレイ選択法は、予め選択された基質に作用することが可能な特製プロテアーゼを発現する形質転換体を選択するのに利用することができる。予め選択された基質に作用することが可能な特製プロテアーゼは、精製され、アシル基転移に好ましい条件下で、予め選択された基質および求核試薬と混合され、予め選択された基質のアシル基転移を触媒することが可能な酵素についてスクリーニングする。ｃ．特製プロテアーゼを用いて基質をアシル基転移させる方法本発明は、また、予め選択された基質を予め選択された求核試薬でアシル基転移させるために特製酵素を用いる方法をも提供する。この方法は、Ｄ-アミノ酸、修飾されたアミノ酸および放射標識されたアミノ酸などの求核試薬を、組換え法によって製造されたペプチドの末端に添加してアシル基転移生成物を形成するのに有用である。この方法は、また、天然に存在するペプチドまたは合成ペプチドに適用して有用な類似体または誘導体を形成することができる。本発明の特製プロテアーゼは、アシル基転移能（すなわち、収率）を増強するか、または、公知プロテアーゼによる受け入れが乏しい予め選択された基質および／または求核試薬に作用するように設計される。特製プロテアーゼは、ここに記載の方法によって調製し、選択することができる。予め選択された基質は、所望のアシル基転移生成物に応じて選択される。予め選択された基質は、好ましくは、公知プロテアーゼによって実質的にはアシル基転移されない。この文脈における「実質的」とは、予め選択された基質を用いた場合および特定の求核試薬を用いた場合のアシル基転移の収率が、好ましくは、標準的な条件下で約０〜１０％であることを意味する。予め選択された基質は、好ましくは、最後から２番目のアミノ酸として塩基性または酸性のアミノ酸を有する。予め選択された基質の好ましい量は、基質に対する酵素の基質特異性ならびに選択された溶媒中への基質の溶解度に依存し、約０.２〜１０ｍＭである。予め選択された基質は、天然に存在するペプチド、合成ペプチドまたは組換え法によって製造されたペプチドとすることができる。予め選択された求核試薬は、好ましくは、公知プロテアーゼを用いた場合に有効な求核試薬ではない。求核試薬は、好ましくは、アミノ酸、放射標識されたアミノ酸およびアミノ酸アミドである。求核試薬は、ブレッダム（Breddam）ら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン・リサーチ(Int．J．Peptide Res.)，37巻：153-160頁（1991年）に記載のような当業者に公知の標準的な合成法によって調製することができる。求核試薬の好ましい量は、また、酵素の親和性および選択された溶媒中への求核試薬の溶解度に依存し、約１０ｍＭ〜２Ｍである。所望生成物の高収率をもたらす反応条件は、与えられた酵素基質系によって異なる。反応条件は、生成物の分解および重合を最少限に抑えるように変更することができる。このような副反応は、セリンカルボキシペプチダーゼと共にエステル基質を用いる場合には、水性溶媒を採用していれば、ｐＨを約８.０より高く上昇させることによって回避しうる。あるいは、副反応は、有機溶媒中で反応を行うことによって回避することができる。水性緩衝溶液中でアシル基転移を実施することができる。好ましい緩衝溶液には、５０ｍＭＨＥＰＥＳおよび５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７.５または５０ｍＭＣＨＥＳおよび５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ９.５が含まれる。選択された緩衝液がアシル基転移反応における求核試薬として作用できないことが重要である。アルコール脱離基を用いたアシル基転移に好ましいｐＨは、好ましくは約ｐＨ６.５〜９. ５、より好ましくはｐＨ７.５〜８.５である。アミノ酸またはペプチト誘導体脱離基を用いたアシル基転移に好ましいｐＨは、好ましくは、約ｐＨ５.５〜８.５、より好ましくは約ｐＨ６.５〜７.５である。アシル基転移生成物の生成は、ＨＰＬＣまたは他の適当な分析技術によってモニターされる。酸性溶液を添加して反応混合物のｐＨを約ｐＨ１〜３に低下させることによって反応を停止することができる。あるいは、フェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、またはジイソプロピルホスホリルフルオリデート（ＤＦＰ）などの酵素阻害剤を添加して反応を停止することができる。アシル基転移生成物は、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣによって反応混合物から分離することができる。あるいは、アシル基転移反応は、有機溶媒中で機能することが可能な酵素基質系に対する有機溶媒中で実施することができる。アシル基転移反応に適した有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、Ｎ,Ｎ'-ジメチルアセトアミドおよび他の類似溶媒が挙げられる。有機溶媒中におけるアシル基転移の方法論は、ボンガース（Bongers）ら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン・リサーチ(Int．J．Peptide Protein Res.)，40巻:2 68頁（1992年）に記載されている。水溶液中でアミノ酸脱離基を用いたペプチド転移の好ましい例においては、予め選択されたペプチド基質、すなわちＧＲＦ（１-４３）-Ａｌａ（配列番号２）が、酢酸の５％溶液に溶解される。求核試薬であるロイシンアミドは、最終濃度が５００ｍＭになるように、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、５ｍＭＥＤＴＡに溶解される。求核試薬溶液の約９５０μｌあたり、ＧＲＦ（１-４３）-Ａｌａ（配列番号２）の４０ｍＭ溶液の２５μｌが添加され、ｐＨは２０℃で７.５に調節される。溶液１ｍｌあたり２０μｌの水中において、特製プロテアーゼが混合物に添加され、酵素濃度は約０.００２〜０.０７ｍｇ/ｍｌとなる。反応は、ＨＰＬＣによって追跡し、１容量の２.５％トリフルオロ酢酸の添加によって付加的な生成物が形成されなければ、停止される。実施例１カルボキシペプチダーゼＹ活性部位の部位特異的突然変異誘発カルボキシペプチダーゼＹの三次元構造が示唆するところによると、Trp49、A sn51、Gly52、Cys56、Thr60、Phe64、Glu65、Glu145、Try256、Try269、Leu272 、Ser297、Cys298およびMet398の側鎖は該酵素の活性部位において重要である。１個、２個または３個の突然変異を有する酵素を形成させるために、これらのアミノ酸残基を部位特異的突然変異誘発により突然変異させた。標準的な方法を用いて、カルボキシペプチダーゼＹの以下の突然変異を構築した。 Asn51が、アラニン(N51A) システイン(N51C) グリシン(N51G) バリン(N51V) アスパラギン酸(N51D) グルタミン酸(N51E) グルタミン(N51Q) セリン(N51S) スレオニン(N51T) で置換されている。 Glu65が、アラニン(E65A) グルタミン(E65Q) で置換されている。 Glu145が、アラニン(E145A) グルタミン(E145Q) セリン(E145S) アスパラギン(E145N) アスパラギン酸(E145D) で置換されている。 Trp49が、フェニルアラニン(W49F) で置換されている。また、少なくとも以下に示す突然変異を有する酵素を構築した。 N51A + E145A E65A + E145A N51A + E65A + E145A E65Q + E145Q 該突然変異酵素を構築するために用いた一般的方法は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる部位特異的突然変異誘発による。例えば、該活性部位の形成に関与しているすべてのアミノ酸残基についてのコーティング領域を含有するpYTS3からのPRC1遺伝子の１１１２bpのBamHI断片を、 pUC19のポリリンカー中の唯一のBamHI部位に挿入することにより、プラスミドpU C-α30を構築した。ヤニシュ−ペロン（Yanisch-Perron）ら（ジーン（Gene）,3 3:103(1985)；スティーブンス（Stevens）ら、イースト・セル・バイオロジー(Y east Cell Biology)、ジェイ・ヒックス（J．Hicks）編、ニューヨーク、Alan R .Liss、第５１９〜５３６頁(19 )）。該断片の配向は、LacZ遺伝子の逆であった。pUC-α30は、クローニングおよび突然変異誘発法に使用できる唯一のBstXI 、EcoRI、NoelおよびSmaI制限部位を含有する。突然変異W49FおよびN51Aは、GTTTCTGTCCTTGTGAGACAAAATTTCAGA（配列番号１３）(オリゴwtl1)および、GGATCCGGTCATCCTTTTCTTGAACGGG（配列番号１４）(オリゴW49F)またはGCAAAGGATCCGGTCATCCTTTGGTTGGCAGGGGGCCA（配列番号１５）(オリゴN51A)のいずれかにより、pUC−α30上、ジーン・アンプ（Gene Amp）キット（パーキン・エルマー・シータス）を用いるパーキン・エルマー・シータスDNAサーマル・サイクラー(Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler)中でのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(インズ(Innes)ら、1990)により作成した。下線部のヌクレオチドが、野生型と異なっていた。BstXIによる開裂により、該PCR断片をpUC-α30 のSmaI-BstXIベクター断片中に挿入することができた。突然変異E145Aは、GCAAGGCGATTAAGTTGGGT(配列番号１６)(オリゴpUC19 spl) およびGGCGTAGGAAGCCCCAGCGAT（配列番号１７）(オリゴE145A)を用いてpUC-α30 上でPCRにより作成した。該PCR断片をEcoRIで開裂することにより、pUC-α30のN aeI-EcoRIベクター断片へ導入することができた。 pUC-α30またはpUC-α30-N51Aのいずれかを鋳型として用いて２個の重複PCR断片を融合させることより、突然変異E65AおよびN51A+E65Aを得た。断片１はCTGTT CTTTGCATTAGGACCC（配列番号１８）(オリゴE65A)および（オリゴwtl）を用いて、断片２は（オリゴpUC19sql）および（オリゴE145A）を用いて得た。該融合断片上でオリゴpUC19sqlおよびオリゴwtlを用いてさらにPCR反応を行った。得られた断片をEcoRIおよびBstXIで切断し、これにより１４５位の不要な突然変異を除去し、同じ制限酵素で切断したpUC-α30ベクター断片中に連結した。該ポリリンカー中のEcoRI部位を利用し、またBstXIが６５位と１４５位との間を開裂することを利用して、上記突然変異を適当に組み合わせることによりN51A +E145A、E65A+E145AおよびN51A+E65A+E145Aを作成した。突然変異した１１１２bpのBamHI断片をベクターpRA21△Bamに移すことにより、該PRCl遺伝子中に該突然変異配列を導入した。pRA21△Bamに挿入された断片は、タック・ダイ−ジデオキシ（Taq Dye-Dideoxy）(登録商標)ターミネーター・サイクル・シークエンシング・キットおよびアプライド・バイオシステムズ（Ap plied Biosystems）(米国)からのモデル３７３ＡＤＮＡ−シークエンシングシステムを用いて配列決定することにより、いずれかの非サイレント２次突然変異の不存在に関して制御した。本明細書中に記載のポリメラーゼ連鎖反応および制限エンドヌクレアーゼ開裂により５１位および１４５位で部位指定突然変異誘発を行った。該突然変異誘発反応においては、以下のオリゴヌクレオチドを使用した。 GCAAAGGATCCGGTCATCCTTTGGTTGGACGGGGGCCA(配列番号１９)(オリゴN51D)、 GGATCCGGTCATCCTTTGGTTGGAAGGGGGCCA(配列番号２０)(オリゴN51E)、 GGATCCGGTCATCCTTTGGTTGCAGGGGGT(配列番号２１)(オリゴN51Q)、 GGATCCGGTCATCCTTTGGTTGAGTGGGGGT(配列番号２２)(オリゴN51S)、 GGATCCGGTCATCCTTTGGTTGACTGGGGGT(配列番号２３)(オリゴN51T)、 GGCGTAGGAATCCCCAGCGAT(配列番号２４)(オリゴE145D)、 GGCGTAGGAATTCCCAGCGAT(配列番号２５)(オリゴE145D)、 GGCGTAGGATTGCCCAGCGAT(配列番号２６)(オリゴE145Q)、 GGCGTAGGATGACCCAGCGAT(配列番号２７)(オリゴE145S)。下線部のヌクレオチドが野生型と異なる。例えばEcoRI(E145)またはBstXI(Asn51 )のような適当な制限酵素による開裂後、該PCR反応により得られたすべての断片をpUC-α30中に連結した。タック・ダイージデオキシ(Taq Dye-Dideoxy)(登録商標)ターミネーター・サイクル・シークエンシング・キットおよびアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)(米国)からのモデル373A DNA-シークエンシングシステムを用いて配列決定することにより、いずれかの非サイレント２次突然変異の不存在を確認した。同様にして、システイン（N51C）、バリン（N51V）またはグリシン（N51G）、グルタミン（E65Q）およびアスパラギン（E145N）を含有する突然変異酵素を調製した。該ＰＣＲ酵素をコードするＤＮＡ配列を本明細書に記載のとおりに突然変異させたら、それをベクターpRA21△Bam中に移した。ついで、イトウ（Ito）ら、J． Bacteriol.，153: 163-168(1983)に記載の方法により、酢酸リチウムを用いてこのベクターをエス・セレビシエ（S．cerevisiae）株（W2579(prc△LEU2 ura 3-5 1,pep4-3)）に導入した。ＹＰＤ培地（１％酵母エキス[ディフコ(Difco)]、２％ペプトン[ディフコ(Difco)]および２％グルコース）上で培養試料を平板培養し、ついで約１００個のコロニーをウラシルを欠くＳＣ培地にレプリカプレーティングすることにより、定常期の酵母細胞におけるプラスミドの安定性を決定した。酵母培養は、MU／pro培地および５０mMリン酸カリウム中で増殖させた。既に記載されている条件下で増殖させた１リットルの培養から突然変異酵素を精製した（ニールセン（Nielsen）ら、1990）。分泌突然変異酵素を含有する増殖培地を、濃酢酸でpＨ４.４に調整し、ついでジョハンセン（Johansen）ら(197 6)の方法に従い、GYBS-セファロースアフィニティーカラムに直接適用した。N51 A(これはGYBS-セファロースに効果的に結合しなかった)を、ペリコン(Pellicon) システム（ミリポア（Millipore））を用いて１０mM NaH₂PO₄，pH7.0に対するダイアフィルトレーションに付し、ついでDEAE フラクトゲル(Fractogel)650カラム（２.６×６cm）上、イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。Ａ₂₈₀が０.０１未満になるまで該カラムを洗浄し、１０mM NaH₂PO₄，pH7.0中の０〜０．５M NaClの直線塩勾配により溶出を行った。アミコン(Amicon)細胞を用いて該溶出液を濃縮し、５０mM NaH₂PO₄，pH7.0で平衡化したセファクリル（Sephacryl） -S300カラム（１cm×１００cm）に適用した。一定の比活性を有する画分をプールし、濃縮し、水に対して透析した。すべての酵素調製物は、−１８℃で水中で凍結保存した。該突然変異酵素の純度を、ファルマシア（Pharmacia）からのファストシステム（PhastSystem）を用いて１２.５％均一ゲル上、SDS-PAGEにより確認した。CP D-Y突然変異体の濃度を、Ａ₂₈₀（１mg／ml＝１.４８）を用いる分光光度法により測定した（前掲ジョハンセン（Johansen）ら、(1976)）。調製したら、ペプチド転移反応における変化に関して該突然変異または特製（ customized）酵素を評価することができる。実施例２アミノ酸を求核体として用いる、アシル基転移反応における改良された性質を有するカルボキシペプチダーゼＹ突然変異体ペプチド基質の負に荷電したＣ末端カルボキシラート基に対するカルボキシペプチダーゼＹ（CPD-Y）中の結合部位は、本明細書中に記載のとおり、部位指定突然変異誘発を用いて確認されている。本発明を限定するものではないが、該ペプチド基質のカルボキシラート基は、S₁'結合ポケット中のAsn51およびGlu145の側鎖に結合すると考えられている。両側鎖は水素結合供与体として働くことができる。Asn51およびGlu145の側鎖は、Glu65およびTrp49との水素結合により配向しているようであり、したがって該Glu65およびTrp49はペプチド基質のカルボキシラート基の結合において間接的機能を有する。また、セリンカルボキシペプチダーゼもペプチドエステルの加水分解を触媒し、この活性はpＨと共に増加し、pＨ７〜９.５の範囲で一定に保たれる。したがって、塩基性pＨにおいては、該エステラーゼ活性は高く、該ペプチダーゼ活性は低い。これらの独特の性質は、求核体としてのアミノ酸またはアミノ酸誘導体によるアシル基転移反応を触媒する能力と共に、セリンカルボキシペプチダーゼがペプチド合成において有用であり得ることを示唆する。しかしながら、多数の基質および求核体は、公知の酵素によっては触媒され得ない。アミノ酸メチルエステルを求核体として用いて中程度の収率（４０〜８０％）が得られるが、該生成物のさらに伸長する（オリゴマー化）危険性のため、この方法は複雑化している。求核体としてはアミノ酸アミドよりもアミノ酸を使用する方が価値があるであろう。突然変異カルボキシペプチダーゼ酵素は、求核体としてアミノ酸を用いるペプチド伸長に結合し、高収率でこれを触媒し得ることが証明されている。求核体としてアミノ酸を用いることにより６０％を超える収率が得られる場合は少ないが、１０〜４０％の収率がより一層一般的であり、H-Pro-OH、 H-Glu-OHおよびH-A sp-OHは求核体と考えられていない。したがって、アミノ酸を求核体として用いて得られる収率が満足できることはめったにない。該反応は、ペプチダーゼ活性が非常に低い（上記を参照されたし）塩基性pＨで行われ、したがって反応混合物中のペプチド生成物の蓄積が保証されるため、求核体としてアミノ酸を用いる場合の低収率は生成物の分解によるものではない。求核体としてアミノ酸を用いてある種の基質をアシル基転移する能力に関して、カルボキシペプチダーゼＹの突然変異体を調べた。また、突然変異カルボキシペプチダーゼＹ酵素の活性部位中のいくつかのアミノ酸置換を行った（それらはアシル基転移反応の収率を改良せず、むしろある型の求核体による結合および触媒の作用機構を解明しそうであることが知られている）。カールバイオテック(Carlbiotech)(デンマーク国コペンハーゲン)からCPD-Yを得た。アミノ酸および緩衝液は、ベイケム(Bachem)(スイス)またはシグマ(Sigma )(米国)から得た。突然変異体E65AN、E65Q、E145AN、E145Q、E61A+E145A、E65Q+ E145Q、N51S、N51Q、N51AおよびN51A+N145Aを実施例１に記載されているとおりに調製した。該酵素の純度をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認した。アミノリシス反応を以下のとおりに行った。求核体を５０mMヘペス、５mM EDT Aに溶解し、pHを７.５に調整した。１９０μlの求核体溶液に５μlの基質（メタノール中の８mＭ FA-Ala-OBzl）を加え、ついで５μlの酵素を加え、０.２mMの基質濃度を得た。pＨ９.５で行う反応ではヘペスをチェスと取り替えた。該反応の間、２０μlのアリコートを該反応混合物から除き、５０μlの１％トリフルオロ酢酸を加えて反応をクエンチした。反応物の組成は、Ｃ−１８ウォーターズ・ノバパック（Waters Novapac）４μ逆相カラムのついたウォーターズ（Waters）ＨＰＬＣおよび０.１％トリフルオロ酢酸中アセトニトリルの種々の勾配を用いるＨＰＬＣにより決定した。積分ピーク面積から生成物の直接定量が可能な３０２nmで分離を監視した。該反応の間に少なくとも２回、該反応混合物の組成を決定した。１回目は、２０〜５０％（好ましくは３５％）のエステル基質が反応で消費された時点で行い、２回目は５０〜９０％（好ましくは８０％）の基質が消費された時点で行った。生成物を集め、ファルマシア・アルファ・プラス・アナライザー（Pharmacia Alpha Plus analyzer）を用いて、酸加水分解した後にアミノ酸分析することにより同定した。さらに、基準化合物の同時クロマトグラフィーにより同定を行った。アミノリシスの画分（fa）を、形成されたアミノリシス生成物と形成されているすべての生成物の合計との間の割合として表した。すなわち、未消費の基質は計算において無視した。求核体の７個の濃度の最小時に得たfaの値を飽和にあてはめることにより、faが最大値の半分である求核体濃度を表すK_N(app)（求核体の解離定数についての量）およびfa_max（求核体による酵素の飽和時に得た最高可能fa）を求めた。最高可能求核体濃度で得たfa値をfa_satと称する。水と競合して求核体として作用するアミノ酸またはアミノ酸誘導体を用いた場合のアシル基転移反応を触媒するCPD-Yの能力を研究することができる。アミノリシスを起こすアミノ酸の生成結合に対する、Ｓ₁'結合部位内の構造変化の有益な効果の研究は、好ましくは、エステル基質を用いて行う。エステラーゼ活性を最大にしペプチダーゼ活性を最小にするために、アシル基転移反応は、好ましくは、やや塩基性pＨで行うべきである。アミノ酸を求核体として使用した場合、生成ペプチドは該酵素により非常にゆっくりと分解し、その結果、反応混合物中に蓄積する。 CPD-Yおよび低濃度の酵素（０.５μg／ml）の使用を可能にする調製された突然変異酵素により、Fa-Ala-OBzlは非常に高いk_cat／K_Mで加水分解される。該ペプチド生成物がはるかに低いk_cat／K_Mで加水分解されるという事実は、アミノリシス生成物の分解を妨げる。pＨ７.５では、添加求核体としてH-Val-OHを用いることにより、２個の生成物：FA-Ala-OH（加水分解）およびFA-Ala-Val-OH（アミノリシス）が形成される。求核体の各濃度において、アミノリシス反応を受ける画分は、時間に対して一定であり、反応混合物に残存する基質の濃度から独立していた。これは、用いた反応条件下で生成物FA-Ala-Val-OHが酵素によって加水分解されないことを示し、したがって、この２個の生成物の割合は、その２個の競合反応の相対速度を反映する。H-Val-OHの濃度を上昇させるにつれてfaは上昇するが、０.３２を超えなかった。アミノリシス画分とH-Val-OH濃度との相関は、反応媒体中の０.５M NaClの存在によっては影響されなかった。したがって、該加水分解およびアミノリシスの速度比は、反応媒体のイオン強度から独立している。 CPD-YがH-Val-OHで飽和されるという観察は、脱アシル化反応の前に求核体がセリンカルボキシペプチダーゼのアシル−酵素中間体に結合するという以前の証明と一致する。faと求核体濃度との相関は、それぞれ１３mMおよび０.３２であるK_N(app)およびfa_max値と一致する。また、該反応はpＨ９.５で行い、K_N(app) およびfa_maxについての値はそれぞれ１９mＭおよび０.３１であったが、これは、この２形態の求核体（アミノ／アンモニウム）の割合が該合成パラメーターにほとんど影響を及ぼさないことを示唆する。アミノ酸求核体の側鎖がfa_maxおよびK_N(app)に及ぼす影響を調べた。K_N(app) は、以下の順序で減少した： H-Gly-OH > H-Ser-OH > H-Lys-OH > H-Gln-OH > H-His-OH > H-Ala-OH > H-Val-OH > H-Leu-OH > H-Phe-OH （表Ｉを参照されたし）。H-Pro-PHおよびH-Glu-OHを用いた場合、アミノリシス生成物は全く得られなかった。したがって、親水性アミノ酸は、疎水性アミノ酸ほど効率よくは結合しない。最も結合効率の低いアミノ酸により、最高Fa_max値が得られた。すなわち、H-Gly-OH、H-Ala-OH、H-Ser-OHおよびH-Arg-OHではfa_ma _x 値は０.８を超えるが、疎水性および効率よく結合するH-Val-OH、H-Leu-OHおよびH-Phe-OHでは０.４未満の値が得られた。求核体としてアミノ酸アミドを用いた場合、fa_maxは一貫して０.８５を超え、実質的には該側鎖の疎水性から独立している。本発明を限定するものではないが、いくつかのアミノ酸で観察された低値は、酵素に対するその側鎖の堅い結合と組み合わせた場合、酵素と該アミノ酸のα− カルボキシラート基との相互作用により説明され得る。明らかに、酵素といくつかのアミノ酸求核体のα−カルボキシラートとの間の相互作用はfa_maxに対して反作用を及ぼしたが、これはこの相互作用の変化が有益な影響を及ぼし得ることを示唆するものである。アミノ酸求核体は、ペプチド基質のＰ₁'アミノ酸残基と同様の位置を占め得る。これが事実なら、ペプチド基質のＣ末端カルボキシラート基の結合に関与するCPD-Y中のアミノ酸もまた、アミノ酸求核体のα−カルボキシラート基の結合に重要であろう。ペプチド基質のＣ末端カルボキシラート基の結合は、Asn51およびGlu145（後者はそのプロトン化形態においてカルボン酸基を有する）の側鎖からの水素結合に依存しており、これら２個の側鎖の最適位置は、Glu65およびTrp49からの水素結合により確保される。しかしながら、これは、該酵素が効率よくペプチド基質に結合する低pＨ時の場合である。該アミノリシス反応を行うpＨ７.５では、Glu145は、α−カルボキシラート基の結合に関与し得ないその脱プロトン化された負に荷電した形態である。実際、この負の荷電は、該アミノ酸求核体の結合様式に実質的に影響を及ぼし得る。したがって、該アシル基転移反応は、Asn51およびGlu145の突然変異置換により、またおそらく間接的影響によりGlu65の置換により影響されるかもしれない。求核体としてH-Val-OHおよびH-Leu-OHを用いた場合のアシル基置換反応を触媒する能力に関して、５１位、６５位および１４５位の置換によるCPD-Y突然変異体を調べた（表II）。５１位および１４５位におけるAlaの取り込みによる（すなわちN51A+E145A）両位置の側鎖の能力を付与する水素結合の完全な除去は、求核体としてアミノ酸を受容する該酵素の能力を損なった。単一突然変異体N51Aでも同じ結果が得られたが、これは、Asn51が、アシル−酵素中間体上の攻撃前のアミノ酸求核体の結合に重要であることを示唆するものである。しかしながら、もう一方の単一突然変異体であるE145Aを用いた場合には顕著なアミノリシスが得られ、これは、Glu14 5がpＨ７.５でアミノ酸求核体の結合に小さな役割しか果たしていないという考えと一致した。それにもかかわらず、求核体としてH-Val-OHおよびH-Leu-OHを用いた場合には、野生型酵素と比較してE145Aを用いることによりＫ_N(app)は４〜５倍高かった。 H-Val-OHおよびH-Leu-OHによるK_N(app)が５〜１０倍増加したことは、６５位および１４５位突然変異体のすべて（すなわちE65A、E65Q、E145A、E145QN、E65 A+E145AおよびE65Q+E145Q）に一般に見られるものである。同時に、E145A以外を用いた場合にfa_maxの増加が観察された。E65AおよびE65Qを用いた場合には、fa_m _ax 値は０.９０を超えた。その結果、求核体として疎水性アミノ酸を用いる場合には、これらの酵素により一層高い収率を得ることが可能である。本発明を限定するものではないが、Glu65およびGlu145は、該反応を行うpＨにおけるアミノ酸求核体のα−カルボキシラート基の結合に直接関与していないようである。しかし、fa_maxの上昇で示されるとおり、それらは間接的な影響を及ぼしてそれらの置換が結合様式に影響を及ぼすようである。アミノ酸アミドを求核体として使用する場合、fa_max値は一貫して高いため、負に荷電したGlu145の存在は負の影響を及ぼさないようである。 Asn51を他のアミノ酸残基で置換し、これらの酵素を試験した。Asn51をSerまたはGlnで置換することは、fa_maxにさまざまな方向で影響を及ぼした。求核体としてN51SおよびH-Val-OHおよびH-Leu-OHを用いる場合、fa_maxはそれぞれ０.０５および０.０３であった（表II）。N51Qでは、それらはそれぞれ０.９７および０ .９６であり、野生型酵素では両求核体においてfa_maxは０.３５であった。基質としてFA-Phe-OMe、求核体としてH-Val-OHを用いる場合、fa_maxに及ぼす５１位基の同じ影響が観察された（データは示していない）。これらの突然変異体によるFA-Phe-Val-OHの加水分解についての速度論的パラメーターは、k_cat＝６５００min^-1、K_M＝０.０４７mM、k_cat/K_M＝１４００００min^-1mM^-1（野性型）と比較して、k_cat＝１５００min^-1、K_M＝０.０８５mM、k_cat/K_M＝１８０００min^-1 mM^-1（N51Q）；k_cat＝８１００min^-1、K_M＝０.１７mM、k_cat/K_M＝４８０００m in^-1mM^-1（N51S）である。通常、セリンプロテアーゼ触媒ペプチド結合加水分解においては、該アシル化工程が律速段階である。しかしながら、k_cat値はXの構造に対する依存をほとんど示さないため、これは、FA-Phe-X-OH基質(X＝アミノ酸残基)のCPD-Y触媒加水分解の場合にはあてはまらない。したがって、脱アシル化工程の速度は、K_catに影響を及ぼす。FA-Phe-Val-OHの加水分解についてのk_cat 値は、N51Q〈野性型〈N51Sの順に増加し、これは、求核体がH-Val-OHの場合のfa_max値(これはN51Q〉野性型〉N51Sの順序で減少する)と逆相関した。表IIの結果は、試験した突然変異体のうちN51Qにより最高fa_max値が得られたことを示し、その結果、この酵素は、この特有の型のペプチド合成における触媒としての野性型酵素に対する最も適切な補充と考えられた。いくつかの異なるアミノ酸求核体についてのK_N(app)およびfa_max値を51Qを用いて決定することにより、これをさらに研究した（表III）。その結果は野性型酵素により得たものと比較し得る。H-His-OHおよび該疎水性アミノ酸については、fa_max値はN51Qでは野性型酵素の場合と比較して有意に高かった。しかしながら、いくつかのアミノ酸では、Asn51→Glnはfa_maxに対して全く影響を及ぼさないか又はほんの僅かの影響を及ぼすにすぎなかった。すなわち、野性型酵素を用いた場合のfa_maxはゼロかまたは０.９を超える程度であった。すべての求核体の場合、K_N(app)はN51Q を用いた場合に野性型の酵素を用いた場合と比較して有意に高く、その結果、該求核体の溶解度が制限されるため、いくつかのアミノ酸を用いた場合のfa_maxに到達できないであろう。求核体の最高可能濃度で得られたfaの値(すなわちfa_sat )は表IIIに挙げられており、この値は、pＨ７.５の水溶液中で得ることのできる最高可能収率を表す。野性型酵素で得られたfa_sat値の比較により、N51Qは求核体が疎水性アミノ酸の場合の野性型酵素より優れているという結論に達した。実施例３突然変異カルボキシペプチダーゼＹ触媒ペプチド転移反応に対する脱離基優先性の変化エステル基質を用いた場合、セリンカルボキシペプチダーゼは遊離基の性質に対する依存性を全く示さなかった。しかしながら、アミノ酸が遊離基として作用するペプチド基質を用いた場合には、これは必ずしも当てはまらない。最も一般的に使用されるセリンカルボキシペプチダーゼであるカルボキシペプチダーゼＹでは、脱離基が親水性アミノ酸である場合にペプチド転移反応の高い収率が得られたにすぎない。しかしながら、加水分解反応におけるカルボキシペプチダーゼＹは疎水性アミノ酸脱離基（P₁'アミノ酸）に対する優先性を示すため、かかる脱離基がペプチド転移反応でも許容されるなら、該反応のより高い速度と特異性のため、カルボキシペプチダーゼＹは有益であろう。また、これは、疎水性Ｃ末端アミノ酸残基により現在は除外されている、天然源から単離されたようなペプチドおよびタンパク質の修飾を可能にするであろう。記載されている脱離基依存性による低収率のために、アミノ酸配列決定を促進するための標識アミノ酸残基のペプチドまたはタンパク質への取り込み法のさらなる発展が妨げられている。親水性でない脱離基を有する基質によりアシル基転移の収率を上げる能力について、カルボキシペプチダーゼＹの突然変異体を調べた。突然変異カルボキシペプチダーゼＹ酵素の活性部位中のいくつかのアミノ酸置換を行った（それらは、アシル基転移反応の収率を改良しそうにないが、むしろ脱離基依存性の作用機構を調べるのに役立ちそうであることが知られている）。カールバイオテック(Carlbiotech)（デンマーク国コペンハーゲン）からカルボキシペプチダーゼＹを得た。すべてのアミノ酸／アミノ酸誘導体は、ベイケム (Bachem)（スイス）から得た。実施例１と同様にして、カルボキシペプチダーゼＹの構造遺伝子中の突然変異を起こした。突然変異体N51S、N51Q、E65AおよびE1 45Aを実施例１に記載されているとおりに単離し、ファルマシア・ファスト・システム（Pharmacia Phast-system）上で行うＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動でその純度を確認した。基質FA-Ala-Gln-OH、FA-Ala-Arg-OH、FA-Ala-Lys-O H、ヒプリル-L-Phe-OHおよびヒプリル-L-β-フェニル乳酸をベイケム(Bachem)( スイス)から購入した。以下の基質の調製は、既に記載されているとおりに行った：FA-Ala-OBzl、FA-Ala-Ala-OH、FA-Ala-Val-OH、FA-Ala-Leu-OHおよびFA-Ala -Phe-OH。ブレッダム（Breddam）ら、Carlsberg Res．Comm.，49：535(1984)。アミノリシス反応を以下のとおり行った。求核体を５０mＭヘペス、５mＭＥＤＴＡに溶解し、pHを７.５に調整し、１９０μlの求核体溶液に５μlの基質（メタノール中の８mＭ FA-Ala-OBzlまたはFA-Ala-Xaa-OH）を加え、ついで緩衝液中に希釈された５μlの酵素を適当な濃度まで加えて、０.２mＭの基質濃度を得た。該反応の間、２０μlのアリコートを該反応混合物から除き、５０μlの１％トリフルオロ酢酸を加えて反応をクエンチした。反応物の組成は、Ｃ−１８ウォーターズ・ノバパック（Waters Novapac）４μ逆相カラムのついたウォーターズ（Waters）ＨＰＬＣおよび０.１％トリフルオロ酢酸中アセトニトリルの種々の勾配を用いるＨＰＬＣにより決定した。積分ピーク面積から生成物の直接定量が可能な３０２nmで分離を監視した。生成物を集め、ファルマシア・アルファ・プラス・アナライザー（Pharmacia Alpha Plus analyzer）を用いて、酸加水分解した後にアミノ酸分析し、基準化合物の同時クロマトグラフィーによりすることにより同定した。アミノリシスの画分（fa）を、形成アミノリシス生成物と形成されているすべての生成物の合計との割合として表した。すなわち、未消費の基質は計算において無視した。得られたfaの値を式fa＝fa_max／(1+K_N,app／N)にあてはめることにより、K_N(app)（求核体の解離定数についての量）およびfa_max（求核体による酵素の飽和時に得た最高可能fa）を決定した。 FA-Ala-OBzlおよび該ペプチド基質の酵素的加水分解をパーキン・エルマー（P erkin Elmer）λ9分光光度計上で追跡した。０.５〜８mMの濃度で該基質をメタノールに溶解した。全量２５μlの基質溶液を９５５μlの５０mMヘペス、５mM E DTA，pH７.５に加えて、１.２５〜２００μMのキュベット中の初期基質濃度S_o' を得た。３３７nmでの吸光度の減少を監視することにより、基質の開裂を時間の経過と共に追跡し、これから加水分解の初期濃度V_o'を求めた。FA-Ala-OBzlについては、以下の形式のミカエリス−メンテン式：V_o＝e_o(k_cat/K_M)/(1/KM+1/S_o) にあてはめることによりk_cat／K_M値を決定した。該ペプチド基質については、S_o 《K_Mの場合に妥当である式V_o=(k_cat/K_M)e_oｓ_o'にあてはめることによりk_catK_M値を決定した。パラメーターk_cat/K_M、fa_maxおよびK_N.appのすべてのあてはめは、グラフィット（Grafit）プログラム（リーザーバロウ，アール・ジェイ(Leather barrow，R．J.)、Grafit version 3.0，Erithacus Software Ltd.，Staines，U. K.，1990）を用いて行った。本発明を限定するものではないが、CPD-Y触媒加水分解反応においては、基質は必須のセリン残基をアシル化し、これはついで水により脱アシル化される。こうして、加水分解反応を完了する。アミンが求核体、例えばアミノ酸またはアミノ酸アミドを反応混合物に加える場合、該アシル−酵素は水と加えたアミノ成分との間に分配され、後者の場合には新しいペプチド結合を形成するであろう（ペプチド転移反応）。飽和曲線は、式（１）により描かれ得る。 N》K_N,appの場合に、fa_maxと称されるfaの上限に達する。fa_maxは、最大値１に達し得る。しかしながら、これは実際はめったに得られない。K_N,appと称されるfa_max/2に達する濃度は、該酵素に対する求核体の親和性および該アミノリシス生成物の解離を表す。ペプチドエステルは、基質として機能し得、この場合、該アミン成分による反応はペプチドの伸長を起こす。アミノリシス反応に対する加水分解の割合は、アルコール脱離基の性質によって影響されないが、fa_maxに対する求核体の著しい作用がある。したがって、求核体H-Gly-NH₂による１.００からH-Phe-OHによる０ .１５までの範囲のfa_max値が認められる。ペプチドが基質として機能する場合（この場合、Ｃ末端アミノ酸残基が添加アミノ酸成分と交換されている）、アミノ酸脱離基の疎水性は加水分解／アミノリシス割合に著しい影響を及ぼす。基質がH-Val-NH₂またはH-Gly-NH₂およびFA-Ala -XAA-OH（XAA=H-Arg-OH，H-Lys-OH，H-Gln-OH，H-Ala-OH，H-Val-OH，H-Leu-OH およびH-Phe-OH)の場合、観察されたfa_max値はそれそれ１.００、０.９９、０. ９３、０.９４、０.２２、０.１６および０.０５６に達する（表IV参照）。fa_ma _x の相違は、アミノ酸脱離基の解離速度が、該脱離基が結合したアシル−酵素の加水分解のものに匹敵することを示唆する。さらに、それらは、該エステル基質および求核体としてのH-Arg-OH、H-Lys-OH、H-Gln-OH、H-Ala-OH、H-Val-OH、H- Leu-OHおよびH-Phe-OHから得たfa_max値がそれぞれ０.８７、０.８１、０.９０、０.９１、０.３２、０.３５および０.１５であり、したがってこれらのアミノ酸が脱離基として作用する場合に得たfa_max値と近似するという観察と一致する（表IV参照）。既に示唆されているところによれば、アミノリシス反応の低収率は生成物の分解によるものであり、これはアミノリシス反応のいずれかの生成物がCPD-Yの基質になるという事実に基づく説である。しかしながら、基質としてFA-Ala-OBzl を用いてここで研究された反応では、該アミノリシス反応で用いた条件下での該生成物の加水分解についてのk_cat/K_Mは、基質のものより５０〜１００倍低い（データは示していない）。その結果、FA-Ala-OBzlを基質としFA-Ala-Xaa-OH(Xaa = Ala-OH，Val-OH，Leu-OH，Val-NH₂)を生成物とする場合には、該アミノリシス生成物の分解は全く検出されない。脱離基／求核体として作用する特定のアミノ酸を用いて得られる収率を変化させ得るためには、低fa_max値に寄与するものを知ることが役立つ。本発明を限定するものではないが、アミノ酸を脱離基とした場合の広範な結果は、fa_maxについての表現に入る速度定数の大きさが、アミノ酸側鎖の性質に関連していることを示す。脱離基が疎水性になればなるほどfa_maxは小さくなるようである。Ｐ₁' アミノ酸残基の側鎖についての結合ポケット内の構造変化により、fa_maxの有意な減少が得られる。あるいは、脱離基または求核基のα−カルボキシラート基とＣ末端カルボキシラート基（Asn51、Glu65およびGlu145）の結合部位との間の相互作用の修飾はfa_maxに影響を与えるであろう。この領域内の変化の結果、基質としてのFA-Ala-OBzlおよび種々のアミノ酸求核体を用いるアシル基転移反応におけるfa_max値の変化したCPD-Y誘導体が得られる。基質ヒプリル−L-Phe-OH（ペプチド結合、脱離基のＮ−末端はH₂N-基である）およびヒプリル-L-β-フェニル乳酸（エステル結合、脱離基のＮ−末端はHO-基である）を用い、求核体としてH-Gly-NH₂を用いてアミノリシス反応を行った。これらの２個の反応により、Phe側鎖カルボキル末端またはアミノ基の性質が、P heで観察された低f_max値を決定するかどうかを評価する可能性が得られた。それぞれ脱離基としてフェニルアラニンまたはL-β-フェニル乳酸、求核体としてH-G ly-NH₂を用いた場合のアミノリシスのパラメーターを求めた：fa_maxはそれぞれ０.３３±０.０１および０.９６±０.０１、およびK_N,appは０.６３±０.０６および０.４７±０.０５であることが判明した。したがって、これらの反応は、該 α−アミノ基の性質および配置がいくつかのアミノ酸で得た低収率の一因となることを示唆する。本発明を限定するものではないが、アミノ酸がS₁'部位内に結合する配座は、脱離基／求核体のアミノ基の配置により、必須のセリン残基（Ser146）に共有結合したアシル成分に対する水の接近を促進し得る。したがって、S₁'結合部位内の特定のアミノ酸の結合様式が変化してアシル−酵素に対する水の求核攻撃を妨げるなら、増大したfa_max値を得ることが可能であろう。これらの突然変異体を用いて、反応FA-Ala-Xaa-OH + H-Val-NH₂→FA-Ala-Val- NH₂ + H-Xaa-OHについて研究した。突然変異体N51Qでは、fa_max値はXaa = Ala,V al，Leuでそれぞれ０.９８、０.９１および０.８０であった。反応FA-Ala-OBzl + H-Xaa-OH（Xaa = Ala，Val，LeuおよびPhe）→FA-Ala-Xaa-OH + HOBzl（表Ｖ参照）でも同様の結果が得られ、Xaa = ValおよびLeuの場合のfa_max値は野性型酵素で得られたものより４〜５倍高かった。ペプチド転移反応においてN51Qがfa_max 値の増大を示したという観察は、おそらくS₁'内のアミノ酸の結合の変化によるものであろう。該突然変異により、水に比べてアミンで反応が増大する。この結果は、アシル酵素と求核体／脱離基のα−アミノ基との間のより短い距離と一致するであろう。これに対して、５１位のセリンの導入により、野性型の値の約５０％に減少したfa_max値を得た（表ＶおよびVI）。これは、基質としてFA-Ala-OBzlおよび求核体としてバリン、ロイシンまたはフェニルアラニンを用いた場合には生成物が全く観察されず、またアラニンでは fa_maxは０.９１から０.５６に減少したという事実と一致する（表Ｖ）。したがって、N51Sでは、FA-Ala-OBzlで観察された減少したfa_max値も、基質としてFA-A la-Xaa-OHを用いた場合に見いだされ、したがって、N51Qで見いだされたパターンを繰り返す。すなわち、同様のFa_maxの変化がいずれかの脱離基で見いだされる。本発明を限定するものではないが、これは、アスパラギンより短い突然変異体中のセリン、およびより迅速な加水分解を起こす活性部位のその後の立体変化によるものであろう。該アミノリシス反応からの結果は、定常状態速度論から得られたものとよく一致するが、これはN51がペプチドのＣ末端α−カルボキシラート基と相互作用することを示唆する。突然変異体E61Aの特徴は、N51Qのものと全く同一である。したがって、それは反応：FA-Ala-OBzl + H-Xaa-OH（Xaa = Val，LeuおよびPhe）→FA-Ala-Xaa-OH + HOBzl、ならびにこれらのアミノ酸が脱離基として作用する反応において約０. ９（表Ｖ参照）へのfa_maxの増加を示す。後者の反応では、fa_maxは-Val-OH、-Le u-OHおよび-Phe-OHでそれぞれ０.６７、０.７１および０.６６に達する。ここでもまた、脱離基／求核体として同じアミノ酸を用いた場合にfa_maxの同様の変化、N51位の突然変異体で既に見いだされているのと同じパターンが観察される。 E145Aにより、fa_maxはバリンを脱離基として用いた場合に０.２２から０.８９０へ、ロイシンを用いた場合に０.１６〜０.６５に増加した。しかし、求核体としてバリンを用いた場合には、fa_maxは０.３５から０.４８に増加したに過ぎず、ロイシンを用いた場合は０.３５から０.３０に減少した。したがって、E145A は求核体として同じアミノ酸を用いた場合の同様のfa_maxの増加を示さない。このようにして、E145Aの特徴はN51S、51QおよびE65Aのものから逸脱するのである。E145Aでは、FA-Ala-OBzlおよびFA-Ala-Xaa-OHでの反応におけるfa_max値が逸脱するという事実は、アミノ酸求核体のカルボキシル基の結合に関与していないE1 45と一致する。これらの突然変異体から、CPD-Yの脱離基優先性を変化させ、種々のペプチド転移反応におけるその潜在的使用を増大させることが可能なことが示された。実施例４突然変異カルボキシペプチダーゼによる求核体特異性の変化一連の突然変異的に変化させたこのカルボキシペプチダーゼＹ（CPD-Y）の誘導体の特徴づけは、該基質のＣ末端カルボキラート基と該酵素との間の相互作用の性質を示す。本発明を限定するものではないが、Asn51およびGlu145の側鎖からの水素結合はペプチド基質のＣ末端カルボキシラート基の結合の一因となり得ると考えられている。CPD-Yのペプチダーゼ活性は、酸性pＨで最大となる。また、CPD-Yはペプチドアミドからのアミノ酸アミドの遊離を触媒するが、この活性は塩基性pＨで最大となる。塩基性pＨ領域でAsn51はＣ末端カルボキシアミド基のカルボニル酸素と相互作用し、脱プロトン化（カルボキシラート）形態のGlu1 45は基質の-NH₂基と相互作用するようである。Glu65はAsn51およびGlu145に水素結合し、これによりＣ末端認識に関与する２個の側鎖を配向させる。これらのアミノ酸残基が、部位指定突然変異誘発により、水素結合供与体としての機能を有さないアミノ酸と交換された場合、ペプチドおよびペプチドアミドのＣ末端からのアミノ酸およびアミノ酸アミドの遊離についてのk_cat／K_Mは劇的に減少する。しかしながら、かかる能力を有する他のアミノ酸残基がこれらの位置に取り込まれた場合、より多くの活性が保持される。ブロックされたα−カルボキシラート基を含有する求核体、特にアミノ酸アミドによるより高い収率が非常に望ましい場合が多いであろう。この問題に対してはタンパク質工学によりアプローチすることができる。特に、（ａ）野性型酵素が不完全に受容する求核体の使用を許容することにより、（ｂ）求核体のよりよい結合を保証することにより、（ｃ）高い収率を得ることにより、および（ｄ）生成物の分解速度を減少させることにより、かかる変化が該酵素の合成能を改良し得ることを想像することができるであろう。本発明者らは、求核体としてのアミノ酸誘導体によるアシル基転移反応に対するかかる突然変異の効果をここに報告する。突然変異プロテアーゼにおいて行われた幾つかのアミノ酸置換を行った（これらは、アシル基転移反応の収率を増大させるようではないが、むしろ、ブロックされたα−カルボキシラート基を含有する求核体による結合および触媒の作用機構を明らかにするようであることが知られている）。カルボキシペプチダーゼＹは、カールバイオテック(Carlbiotech)（デンマーク、コペンハーゲン)から得た。H-Val-OPr、H-Val-OBu、H-Val-NHCH₃およびH-Va l-NHC₂H₅はペプテック(Peptech)（オーストラリア、シドニー）から得た。すべての他のアミノ酸およびアミノ酸誘導体は、バイケム(Bachem)（スイス）から得た。CPD-Yの構造遺伝子中の突然変異Asn51→Gly、CysおよびValおよび突然変異体N51GおよびN51Cのその後の発現および精製は、実施例１と同様にして行った。該酵素の純度は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。突然変異体N51A、N51D、N51T、N51Q、N51S、E145AおよびE145Dの調製は既に記載されている。突然変異Asn51→Cys、Asn51→GlyおよびAsn51→Valを構築した。しかしながら、N51Vは発現されず、N51CおよびN51Gのみが単離された。FA-Ala-OBzl、F A-Phe-Ala-OHおよびFA-Phe-Leu-OHは標準的方法により合成した。 FA-基質も対するすべての酵素活性は、２５℃の恒温に保ったパーキン・エルマー・ラムダ（perkin E1mer lambda）７またはラムダ９分光光度計を用いて、分光光度法により３２９〜３３７nmで測定した。該加水分解は、ペプチド基質の場合は０.０５M Mes、１mM EDTA、pH６.５中で、エステル基質の場合は０.０５M ヘペス、１mM EDTA、２.５％（v/v）、pH７.５中で行い、エンズフィッター（En zfitter）プログラムを用いてK_catおよびKm値を求めた。５１位、６５位および／または１４５位で突然変異的に改変された、既に記載されているCPD-Y誘導体のうち、ペプチド合成における適用性について調べるためにある個数を選んだ。アミノリシス反応の研究には、優れたCPD-Y基質であるF A-Ala-OBzlを選択し、まず、すべてのCPD-Y誘導体のこの基質を加水分解する能力を調べた（データは示していない）。ほとんどの突然変異体では、FA-Ala-OBz lの加水分解はAsn51の置換によりわずかな影響を受けたにすぎなかった。実際、いくつかの突然変異体によるK_cat／K_M値の上昇が観察された。E61A、N51Gおよび特にE145Qでは、おそらく小さな配座変化によるk_cat／K_Mの減少が観察された。しかしながら、この結果は別として、酵素と-OBzl脱離基との間の相互作用は、その嵩高さにもかかわらず、５１位、６５位および１４５位の突然変異置換により逆影響を受けた。したがって、これらの酵素が求核体を生産形態に拘束し得るのであれば、それらはアミノリシス反応を触媒することができる。バリンアミドのよる反応を調べた。H-Val-NH₂を用いる場合、アミノリシス反応を受ける画分は、１.００に達するまで、求核体の濃度の上昇と共に上昇した。求核体が脱アシル反応の前にアシル−酵素中間体に結合すると仮定するモデルにより、結果を分析した。faと求核体の濃度との相関は、それぞれ１６mMおよび１.００であるK_N(app)およびfa_max値と一致した。したがって、該加水分解反応は、高濃度の求核体により完全に排除されている。対応する遊離アミノ酸H-Val- OHを用いて、同じ条件下で決定されたK_N(app)およびfa_maxについての値はそれぞれ１３mMおよび０.３２であった。したがって、H-Val-NH₂と比較すると、該遊離アミノ酸の結合ははるかに弱く、それが結合している場合、結合様式はアミノリシス反応には明らかにはるかに不利である。カルボキシラート基をブロックする有利な効果は、おそらく、電荷反発の反作用の除去によるものであろう。 Asn51およびGlu145のアミノ酸アミド求核体の生産的結合に対する寄与は、５１位および１４５位で突然変異的に改変されたCPD-Y誘導体を用いてH-Val-NH₂によりK_N(app)およびfa_maxを求めることにより調べた（表VII参照）。Ｎ５１ＡおよびＮ５１Ｇについては、Ｋ_N(app)値は８〜２０倍増加し、ｆａ_max 値は高いままであった。本発明の限界であることを意味しないが、これらの結果は、該基の水素結合供与能力が、アシル−酵素中間体への求核分子攻撃前にアミノ酸アミドを正しく配向させることを必要としないことを示すと思われるが、求核分子の結合について明らかに重要である。これらの結果は、Ａｓｎ５１がアクセプターとしての求核分子のカルボキシアミド基のカルボニル酸素を有する水素結合供与体として機能することと一致する。この野生型酵素を損なうことなく、Ａｓｎ５１を他の水素結合供与体と置換することができる。しかしながら、Ａｓｎ５１→Ｃｙｓ突然変異は、Ｋ_N(app)の有意な低下を生じ、これは、Ｃｙｓを含む水素結合が弱いことと一致する。Ｎ５１Ｄについては、Ｋ_N(app)の値も有意に上昇するが、Ａｓｐ５１が求核分子の−ＮＨ₂基と相互に作用することは可能であるので、この結果は、解釈するのが困難である。Ｅ１４５ＡおよびＥ６５Ａについては、Ｋ_N(app)の値は、２倍になるだけであり、ｆａ_max値は、変わらなかった。かくして、Ａｓｎ５１と比較して、Ｇｌｕ１４５およびＧｌｕ６５は、アミノ酸アミド求核分子との相互作用のためにはあまり重要ではないと思われる。しかしながら、pＨ７.５で負に荷電される残存するグルタミン酸がアミノ酸アミドの結合において機能できる可能性があった。これを調べるために、二重突然変異体Ｅ６５Ａ−Ｅ１４５Ａを試験し、これにより、Ｋ_N(app)が激増し、一方、ｆａ_maxが多少減少することが判明した。かくして、両方のグルタミン酸の不在によりアミノ酸アミドの結合は、損なわれるが、それらのうちの一方の存在は、堅固な結合をもたらすのに充分である。野生型酵素において、Ｇｌｕ１４５は、負に荷電され、一方、Ｇｌｕ６５は、荷電されず、したがって、Ｇｌｕ１４５は、アミノ酸アミドと相互に作用するものである。Ｅ１４５Ｑを用いて得られた非常に低いｆａ_maxおよび有意に高いＫ_N(app)は、アミノ酸アミドとの相互作用におけるＧｌｕ１４５の重要性を確立する。おそらく、ペプチドアミドのＣ末端は、水素結合受容体として作用する負に荷電されたＧｌｕ１４５と同様の方法で酵素と相互に作用するであろう。単一突然変異体におけるＧｌｕ６５およびＧｌｕ１４５は、共に、この能力において機能するので、明らかに、水素結合の長さに関係して若干の許容範囲がある。これは、１４５位のカルボキシラート基を一炭素原子移動させること、すなわち、Ｅ１４５Ｄは、両方のパラメーターに対して非常に小さな影響を有するという事実によって示される。二重突然変異体Ｎ５１Ａ＋Ｅ１４５Ａおよび求核分子としてのＨ−Ｖａｌ −ＮＨ₂を用いて得られた高いＫ_N(app)は、Ａｓｎ５１→ＡｌａおよびＧｌｕ１４５→Ａｌａ突然変異の影響がほぼ相加的であることを示すが、ｆａ_maxは、高いままであった。バリンＮメチルアミド（Ｈ−Ｖａｌ−ＮＨ−ＣＨ₃）がＣＰＤ−Ｙに結合するのは、非ブロックＨ−Ｖａｌ−ＮＨ₂と比較して非常に効率的ではない。しかしながら、ｆａ_maxは、ほとんど同様に高い（０.８０）。Ａｓｎ５１のＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｎへの置換およびＧｌｕ１４５のＡｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｎへの置換は、ｆａ_maxおよびＫ_N(app)についての値に適度に影響を及ぼすだけであり、これは、Ａｓｎ５１およびＧｌｕ１４５がいずれもＨ−Ｖａｌ−ＮＨ−ＣＨ₃との相互作用に関係しないことを示す。したがって、この求核分子の結合モードは、不明確なままである。実施例５突然変異誘発の新規ストラテジーによるカルボキシペプチダーゼＹの基質優位性の変更ＰＲＣ１の選択された標的をランダムに突然変異誘発させ、次いで、乏しいＰ₁ 基質に対して高活性を有する突然変異体発現カルボキシペプチダーゼＹ（ＣＰＤ−Ｙ）についてスクリーニングした。ＣＰＤ−Ｙおよび小麦カルボキシペプチダーゼ（ＣＰＤ−Ｗ）［ブレッダム（Breddam）ら、カールスベアウ・リサーチ・コミュニケーション(Carlsberg Res.Commun.)、５２：５５−６３；６５−７１および２９７−３１１（１９８７）］の一次構造の配列ならびにＣＰＤ−Ｗの結晶構造［リアウ（Liao）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ．Ｂiol.Chem.)、２６５：６５２８−６５３１(１９９０)］から、アミノ酸残基は、ＣＰＤ−ＹＳ₁結合ポケットの表面を構成すると予想される。ＰＲＣ１の対応するコドンは、飽和突然変異誘発のための標的として選ばれた。突然変異誘発の基本的な技術は、鋳型として一本鎖ファージミド(phagemid)ＤＮＡを用いる突然変異誘発（改変）合成オリゴヌクレオチド、次いで、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）のトランスフェクションによって活性化されたイン・ビトロ合成であった。多数の突然変異体形質転換体の効率的なスクリーニングを促進するために、次の機能的スクリーンにおける非突然変異誘発プラスミドによる野生型バックグラウンドを削除する、新しい一般的に適用可能な突然変異誘発ストラテジーが研究された。いくつかの実在する方法は、突然変異誘発の頻度に関して非常に効果的であるが、産生されたプラスミドの残存部分は、突然変異されないであろう。突然変異頻度が例えば９０％である場合、および１０⁵ 個の形質転換体が産生される場合、１０⁴個は、野生型であろう。酵母の形質転換後、野生型形質転換体により、次のスクリーンにおいて所望の突然変異体を選択することが非常に困難になることがある。この問題点を克服するために、終止コドンと制限部位との組合せを、改変オリゴヌクレオチドによって標的とされるべきであったＰＲＣ１遺伝子における各位置で導入した。終止コドンは、例えば１０％非突然変異プラスミドが不活性ＣＰＤ−Ｙを確実にコードするが、一方、導入した制限部位により、突然変異頻度をモニターできる。突然変異誘発自体は、フレームシフト変異アンピシリン耐性遺伝子およびナンセンス変異ｐｒｃ１遺伝子を有する一本鎖ファージミドＤＮＡ上で、ルイスら（Lewis）ら［ニュークリイック・アシッズ・リサーチ(Ｎucleic Ａcids Ｒes.)、１８：３４３９（１９９０)］のプロトコールに従って行われる。突然変異鎖合成は、多数の改変オリゴヌクレオチドとの単一反応において活性化されて、ＰＲＣ１遺伝子、およびアンピシリン耐性遺伝子を修復するオリゴヌクレオチドにおいて突然変異を生じる。得られたＤＮＡを用いて、ミスマッチ修復欠失イー・コリ（Ｅ.coli）菌株をアンピシリン耐性に形質転換する。アンピシリン含有培地における増殖は、突然変異鎖の後代について選択する。酵母の２つのｐｒｃ１欠失菌株をプラスミド個体群と形質転換させた。１つの菌株において、ＣＰＤ−Ｙは、液胞に入るが、他方の菌株においては、ＣＰＤ− Ｙは、ニールセン（Ｎielsen）ら［アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー(Ａppl.Ｍicrobiol.Ｂiotech.)、３３：３０７(１９９０) ］によって開示されたようなｖｐｓ突然変異により、ミス選別され、分泌され、細胞外で活性化される。増殖のためにロイシンを必要とするｖｐｓ菌株を用いて、一方向スクリーンにおいて所望の突然変異体について調べた。形質転換細胞を、ロイシンを欠いているが種々のＮ−ブロック−Ｘ−Ｌｅｕ−ＯＨジペプチドのうちの１つを含有する合成培地上で平板培養した。ターミナルロイシンを放出することができるプロテアーゼを発現する細胞は、これらのプレート上で増殖することができる。Ｖｐｓ⁺菌株を用いて、二工程において所望の突然変異体をスクリーニングした。最初に、形質転換体コロニーを、ＣＰＤ−Ｙ活性を示す色素産生基質を含有する寒天で覆った。次の工程で、正のコロニーからのＣＰＤ−Ｙ活性を、色素産生マイクロタイターディッシュアッセイにおける種々の基質に対して評価した。この方法によって、合計＞１０⁵個の独立突然変異体が産生され、それらのいくつかは、１５０までのファクターによって、ある種の基質に対して高い活性（ｋ_cat／Ｋ_m）を示す。多くのこれらの突然変異体プラスミドを配列決定し、コード化酵素を精製し、動力学的に特徴付けた。試薬：ＣＢＺ−Ｘ−Ｌｅｕ−ＯＨペプチドおよびＮ−アセチル−Ｌ−アラニンβ−ナフチルエステル（ＡＡＮＥ）は、バッケム（Ｂachem）から入手した；ホースラディッシュペルオキシダーゼＩ型、クロタラス・アトロクス（Ｃrotalus atrox ）Ｌ−アミノ酸オキシダーゼVI型、ｏ−ジアニシジンおよびファースト・ガーネット・レッド（Ｆast Ｇarnet Ｒed）ＧＢＣ塩は、シグマ（Ｓigma）から入手した。オリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステムズ（Ａpplied Ｂiosys tems）３９４ＤＮＡ−ＲＮＡシンセサイザーで合成した。ＬＢ、２ｘＹＴおよびＳＯＣ培地は、サムブルック（Ｓambrook）らのモレキュラー・クローニング．ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍolecular Ｃloning．ＡＬaboratory Ｍan ual ）［コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク(１９８９)］に従って調製した。ＳＣおよびＹＰＤ培地は、シャーマン（Ｓherman）のＭethods Ｅnzymol. 、１９４:３−２１（１９９１）に従って、僅かな変更を加えて［タリン（Ｔull in）ら、イースト(Ｙeast)、７：９３３−９４１(１９９１)］調製した。菌株：イー・コリ（Ｅ.coli）ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ（ｔｈｉｓｕｐＥΔ(ｌａｃ−ｐｒoＡＢ)[ｍｕｔＳ::Ｔｎ１０］Ｆ'[ｐｒｏＡＢ⁺ｌａｑＩ^qｌａｃＺΔＭ１５]）［クレイマー（Kramer）ら、セル（Ｃell)、３８:８７９（１９８４）；ゼル（Ｚell）ら、ＥＭＢＯＪ.、６：１８０９（１９８７）］；イー・コリ（Ｅ.coli）ＪＭ１０９（ｒｅｃＡ１ｓｕｐＥ４４ｅｎｄＡ１ｈｓｄＲ１７ｇｒｙＡ９６ｒｅｌＡ１ｔｈｉΔ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）Ｆ’[tｒａＤ３６ｐｒｏＡＢ⁺ｌａｑＩ^qｌａｃＺΔＭ１５]）［ヤニッシュ−ペーロン（Ｙanisch− Ｐerron）ら、ジーン(Ｇene)、３３：１０３（１９８５）］；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ.cerevisiae）ＪＨＲＹ２０−２ＣΔ３（ＭＡＴａ Δｐｒｃ１ｌｅｕ２−３ｌｅｕ２−１１２ｕｒａ３−５２ｈｉｓ３−Δ２００ｐｒｃ１ −Δ３::ＨＩＳ３）［ブラチリィーダイソン（Ｂlachly−Ｄyson）ら、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー(Ｊ.Ｃell Ｂiol.)、１０４：１１８３（１９８７）］；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ.cerevisiae）Ｗ２５７９（ＭＡＴａ Δｐｒｃ１ｌｅｕ２−３ｌｅｕ２−１１２ｕｒａ３−５２ｖｐｌ１−１）[ ニールセン（Ｎielsen）ら（１９９０）前記文献]。ｖｐｌ１遺伝子は、ｖｐｓ１と改名された［ロビンソン（Robinson）ら、モレキュラー・アンド・セリューラー・バイオロジー（Ｍol.Ｃell.Ｂiol.)、８：４９３６（１９８８）］。Ｋ２５７９ＬＬＲは、増殖のためにあまりロイシンを必要としないＷ２５７９の自然突然変異体として本研究において単離された。プラスミド：ＹＥｐ２４［ボトシュタイン（Ｂotstein）ら、ジーン(Ｇene)、８：１７−２４(１９７９)］由来の２.２kb ＥｃｏＲＩ２μフラグメントを平滑末端化し、ｌａｃＺの近くにＨＩＮＤＩＩＩ部位を置く配向でｐＳＥＬＥＣＴ［ルイス（Le wis）ら、１９９０、前記文献］の平滑末端ＣｌａＩ部位中に挿入した。ＹＥｐ２４由来の１.１kbＨｉｎｄＩＩＩＵＲＡ３フラグメントを平滑末端化し、得られたプラスミドの平滑末端ＳｔｙＩ部位中に右回りに挿入して、ｐＹＳＥＬを生成した。自身のプロモーターの制御下にあるＰＲＣ１遺伝子を有するｐＷＩ３［ウインザー（Ｗinther）ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Ｅur.Ｊ.Ｂiochem.)、１７９：６８１(１９９１)］のＳａｌＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントを平滑末端化し、ｐＹＳＥＬの平滑末端ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメント中に右回りに挿入して、ファージミドシャトルベクターｐＹＳＰ１を生成した。合した停止コドン／制限部位を、ＰＲＣ１遺伝子の突然変異誘発のために４個の選択された標的の各々でｐＹＳＰ１中に導入した（第VIII表）。得られたプラスミドｐＹＳＰ３２は、ｏｒｉ、ｔｅｔ⁺、ｂｌａ^-、ｆｌｓｓＤＮＡ複製起源、２μの機能性フラグメント、ＵＲＡ３およびｐｒｃ１を有する。このファージミドから生成した一本鎖ＤＮＡは、第VIII表に示す配列と相補的である。形質転換：イー・コリ（Ｅ.coli）の形質転換は、ダウアー（Ｄower）らのニュークリイック・アシッド・リサーチ(Ｎucleic.Ａcid Ｒes.)、１６：６１２７（１９８８）に従って、２mmのキュベット中、２５μＦ、２００Ωおよび２.５kＶでバイオ −ラッド・ジーン・パルサー（Ｂio−Ｒad Ｇene Ｐulser）装置を用いて行った。酵母の形質転換は、シーストゥル（Ｓchiestl）およびギエッツ(Ｇietz)のＣu rr.Ｇenet. 、１６：３３９（１９９２）に従って行った。一本鎖ファージミドＤＮＡの調製：ｐＹＳＰ３２で形質転換したイー・コリ（Ｅ.coli）ＪＭ１０９を、２ｘＹＴ＋５０mg／lのテトラサイクリン中、ＯＤ₆₀₀＝０.５まで増殖させた。この培養物１mlを、５００mlのエーレンマイヤーボトル中、＞１０⁹ｐ.ｆ.ｕ.／mlのＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージストック２０μlで重複感染させた。３７℃で１時間のインキュベーション後、２ｘＹＴ＋５０mg／lのテトラサイクリン＋５０mg／l のカナマイシンを２００ml添加した。３７℃で一晩撹拌しつつインキュベートした後、ｓｓＤＮＡを標準的な方法［サムブルック（Ｓambrook）ら、ア・ガイド・トゥ・モレキュラー・クローニング（ＡＧuide to Ｍolecular Ｃloning）( １９８９)］によって精製した。カナマイシンは、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７に重複感染した細胞について選択する。突然変異誘発：突然変異誘発は、ルイス（Ｌewis）ら（１９９０）（前記文献）のプロトコールを僅かに変更して行った。一本鎖ｐＹＳＰ３２（０.２pmol）を、２ｘアニーリング緩衝液（２０mＭのトリス−ＨＣｌ(pＨ７.５)、１０mＭのＭgＣl₂、５０m ＭのＮaＣl）８０μl中、０.５pmolのアンピシリン修復オリゴヌクレオチド［プロメガ(Ｐromega)、アルタード・サイティス・キット(Ａltered Ｓites Ｋit)］および各２pmolの突然変異誘発改変オリゴヌクレオチドと混合し、７０℃に５分間加熱し、ゆっくりと（〜１時間）室温まで冷却した。アニーリング反応後、１０ｘ合成緩衝液（１００mＭのトリス−ＨＣｌ(pＨ７.５)、各々５mＭの４つのｄＮＴＰ、１０mＭのＡＴＰ、２０mＭのＤＴＴ）、１０ヴァイス(Ｗeiss) ユニットのＴ４リガーゼ［ニュー・イングランド・バイオラブズ(Ｎew Ｅngland Ｂiolabs)］、２０ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ［プロメガ(Ｐromega)］およびＨ₂Ｏを１００μlまで添加した。ポリメラーゼ／連結反応物を３７℃で２時間インキュベートした。次いで、反応混合物を、フェノール抽出、エタノール沈殿および再懸濁させ、これを用いて、エレクトロコンピテント・イー・コリ（Ｅ.coli ）ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ細胞を形質転換した。ＳＯＣ中、３７℃で４５分間、形質転換した細胞をインキュベートした後、アリコットを、６０mg／ lのアンピシリンを有するＬＢプレート上に置いて、形質転換体の数を測定し、一方、残りの細胞を、６０mg／lのアンピシリンを有するＬＢ５０ml中で一晩増殖させた。この一次培養物からのプラスミド調製物は、非突然変異親菌株由来のアンピシリン感受性プラスミドを約５０％まで含有するであろう。突然変異体を富化するため、ＪＭ１０９の二次形質転換のために、この培養物からのミニプレプ（miniprep）ＤＮＡ１μgを用いた。ＪＭ１０９形質転換体培養物からのミニプレプＤＮＡ１μgを用いて、酵母菌株Ｋ２５７９ＬＬＲおよびＪＨＲＹ２０ −２ＣΔ３を形質転換した。配列決定：ＤＮＡ配列決定は、アプライド・バイオシステムズ・モデル（Ａpplied Ｂios ystems Ｍodel）３７３ＡＤＮＡシーケンシングシステム用のアプライド・バイオシステムズ（Ａpplied Ｂiosystems）ｄｓＤＮＡＴaq ＤyeＤeoxy^TMターミネーター法によって行った。プレート活性スクリーニング：酵母菌株Ｋ２５７９ＬＬＲをｐＹＳＰ３２の突然変異個体群で形質転換し、酵素依存性ロイシン供給源として乏しいＣＢＺ−Ｘ−Ｌｅｕ−ＯＨペプチド基質１ .５mＭを補足したＳＣ−ｕｒａ−ｌｅｕ上で平板培養した。基質のＰ₁は、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＴｒｐまたはＬｙｓのいずれかであった。該細胞は、それらがＣ末端ロイシンを放出する能力を有するプロテアーゼを発現する場合にのみ、この培地上で増殖することができる。しかしながら、ＣＰＤ −Ｙは、この切断を触媒することができる細胞によって分泌される唯一のプロテアーゼではない。かくして、最小レベルのＣＰＤ−Ｙ活性は、増殖のために充分なロイシンを放出するためだけでなく、ＣＰＤ−Ｙ依存性増殖をバックグラウンド増殖と区別するためにも必要である。特徴付けられたＣＰＤ−Ｙ突然変異体による実験に基づいて、ｋ_cat／Ｋ_mは、基質に依存して、−１０,０００−２５,０００分^-1mＭ^-1以上でなければならないと判断される。カラーオーバーレイスクリーン：酵母菌株ＪＨＲＹ２０−２ＣΔ３をｐＹＳＰ３２の突然変異個体群で形質転換し、ＳＣ−ｕｒａプレート上で平板培養し、これを、コロニーが直径２−３mmに達するまで、３０℃でインキュベートした。次いで、各プレートを、５０℃の水中０.６％寒天３mlおよび室温の０.２５％ＡＡＮＥを含有するジメチルホルムアミド２mlの新しい混合物で覆った。室温で５分間のインキュベーション後、１０mＭのリン酸ナトリウム緩衝液（pＨ７.０）中の０.４％ファースト・ガーネット・レッド（Ｆast Ｇarnet Ｒed）ＧＢＣ塩５mlを上部に注いだ；５分間のインキュベーション後、該プレートを水道水で洗浄した。活性ＣＰＤ−Ｙを発現しているコロニーは、赤色を呈し、一方、液胞ＣＰＤ−Ｙ活性を欠いているコロニーは、白色を呈する[ジョーンズ（１９７７）から変更した]。ＳＣ−ｕｒａプレート上で画線培養することにより、活性ＣＰＤ−Ｙを発現しているコロニーを単離した。カップルドアッセイスクリーン：活性突然変異体ＣＰＤ−Ｙを発現するＪＨＲＹ２０−２ＣΔ３形質転換体を、ＳＣ−ｕｒａプレート上で３−４日間インキュベートした後、細胞〜１mm³を爪楊枝でピッアップし、水２００μl中に懸濁させた。８個のマイクロタイターウエルの各々に細胞懸濁液２０μlずつを取った後、基質混合物（５０mＭのＭＥＳ (pＨ６.５)、１mＭのＭnＣl₂、５０μg／mlのペルオキシターゼ、１００μg／ml のＬ−アミノ酸オキシダーゼ、１００μg／mlのｏ−ジアニシジンおよび１mＭＣＢＺ−Ｘ−Ｌｅｕ−ＯＨ）１００μlを添加した。基質（Ｘ）のＰ₁は、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＴｒｐまたはＬｙｓのいずれかであった。該プレートを室温でインキュベートし、パーキン・エルマー・ラムダ・マイクロプレート・リーダー（Ｐerkin Ｅlmer Ｌambda Ｍicroplate Ｒe ader）で０、１および１６時間目にＯＤ₅₆₀を測定した[ルイス（Ｌewis）およびハリス（Ｈarris）（１９６７、上記文献）から変更した]。各突然変異体の活性を、以下のとおり野生型のものに標準化した。まず、バックグラウンド（細胞を含まないウエルにおける同時点での吸光度）を引いて、全ての吸光度値を修正した。次いで、２つの時点間の補正吸光度の差異（加水分解の量に対応する）を、細胞のＯＤ（０時での細胞を含むウエルのＯＤ − ０時での細胞を含まないウエルのＯＤ）で割って、細胞数の変化の原因について説明するために標準化した。最後に、得られた活性概算値を野生型についての対応する概算値で割る。０および１時間目を用いて、ＣＢＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯＨに対する比活性を算出し、一方、０および１６時間目を用いて、全ての他の基質に対する比活性を算出した。ＣＰＤ−Ｙの突然変異体形の単離および動力学的特徴付け：選択された突然変異体酵素の過剰発現は、ニールセン（Ｎielsen）ら（１９９０、上記文献）に従って行った。ｐＹＳＰ３２の突然変異体ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩＰＲＣ１フラグメントをＧＡＬ発現ベクターｐＲＡ２１中に挿入し、酵母菌株Ｋ２５７９ＬＬＲ中に導入した。該プラスミドｐＲＡ２１は、９１８bp ＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩフラグメントをｐＷＩ３の６３８bp ＢｇｌＩＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントで置き換え、これにより、ＰＲＣ１遺伝子の下流のＢａｍＨＩ部位を欠失させることによって、ｐ７２ＵＧ［ニールセン（Ｎielsen）ら(１９９０)、上記文献］から誘導される。実施例１に記載のアフィニティクロマトグラフィーによって、ＣＰＤ−Ｙの突然変異体形を培養上清から精製した。１０mＭのリン酸ナトリウム緩衝液（pＨ６.５）中、２２４nmで分光測定的に、ＣＢＺ− Ｘ−Ｌｅｕ−ＯＨ基質の２５℃での加水分解速度を測定することによって、動力学的パラメーターを測定した。基質の濃度は、０.０１〜０.５mＭの範囲であった。０.５mＭを超える基質濃度の場合、基質の高い吸光度により、正確な測定は不可能であった。小麦カルボキシペプチダーゼＣＰＤ−Ｗ［リアウ（Ｌiao）ら、(１９９０)、上記文献］の結晶構造を研究することによって、アミノ酸位置Ｐｒｏ６０、Ｔｙｒ１５６、Ｌｅｕ１８７、Ｐｈｅ２２４、Ｉｌｅ２２５、Ｖａｌ３３４およびＶａ１３３５は、カルボキシペプチダーゼＷのＳ₁結合ポケットの下部、末端および側部を構成することが判明した。ＣＰＤ−Ｗのこれらの位置は、２つの酵素の一次構造の配列に従ってＣＰＤ−Ｙのアミノ酸位置Ｐｒｏ５４、Ｔｙｒ１４７、Ｌｅｕ１７８、Ｇｌｕ２１５、Ａｒｇ２１６、Ｉｌｅ３４０およびＣｙｓ３４１に相当する[ブレッダム（Ｂreddam）ら(１９８７)、上記文献；ソーレンセン（Ｓorensen）ら、Ｃarlsberg Ｒes.Ｃommun.、５２：２８５（１９８７）]。本発明者らは、これらのアミノ酸残基がＣＰＤ−ＹのＳ₁結合ポケットを構成するという仮説を立てた。Ｐｒｏ６０は、ＣＰＤ−ＷのＳ₁の表面にあまり寄与しないので、ＣＰＤ−ＹのＰｒｏ５４は、いずれの突然変異誘発実験においても含まれず、Ｔｙｒ１５６は、ＣＰＤ−Ｗの活性Ｓｅｒ１５５の次であり、Ｓ₁の表面に対するその寄与も小さく、ＣＰＤ−ＹのＴｙｒ１４７は、１つの突然変異誘発実験において含まれるだけであった。酵母カルボキシペプチダーゼＹ［エンドリッジ（Ｅndrizzi）ら、バイオケミストリー(Ｂiochemistry)、３３：１１１０６（１９９４）］の結晶構造は、このモデルがその特徴の多くにおいて正しいことを確立する。該モデルは、Ｓ₁結合部位における９個の残基のうち４個を正しく予想する。カルボキシペプチダーゼＹのＰｒｏ５４は、せいぜい、Ｓ₁結合部位の末端部分であることが予想されるだけである；実際は、Ｓ₁部位から欠けている。小麦カルボキシペプチダーゼ −Ｗの結晶構造を用いたモデルは、カルボキシペプチダーゼＹの突然変異体の構造についての正確なガイダンスを生じた。ｐＹＳＰ３２の突然変異誘発の８種類のシリーズを同時に行い、１〜６の種々の数のコドンをランダムに突然変異させた(第VIII表)：シリーズ１、全てのコドンが野生型に戻った；シリーズ２、位置１４７、１７８、２１５、２１６、３４０および３４１が改変した；シリーズ３、位置１７８、２１５および２１６が改変した；シリーズ４、位置１７８、３４０および３４１が改変した；シリーズ５、位置２１５、２１６、３４０および３４１が改変した；シリーズ６、位置１７８が改変した；シリーズ８、位置３４０および３４１が改変した。全てのシリーズでは、本発明者らがランダム突然変異誘発に付さないｐＹＳＰ３２中に存在する全ての突然変異コドンを野生型に戻した(第VIII表)。全ての改変突然変異誘発オリゴヌクレオチドは、誘導された停止コドンおよび制限部位と相補的なオリゴヌクレオチドの偏ったアニーリングを最小にするように比較的長く（３３塩基）設計された。感受性二工程スクリーニングストラテジーを用いた。まず、活性ＣＰＤ−Ｙを発現する形質転換体を区別するために、本発明者らは、ＣＰＤ−Ｙ含有酵母コロニーを染色するためにジョーンズ（Ｊones）（１９７７）のオーバーレイ法の変形法を用いた。本発明者らは、不活性ＣＰＤ−Ｙ形質転換体のバックグラウンド染色がＡＡＮＥを用いると非常に低く、かくして、低いＣＰＤ−Ｙ活性を有する形質転換体を同定することができることを見いだしたので、本発明者らは、ＣＰＤ−Ｙ基質としてＡＰＮＥ（Ｎ−アセチル−ＤＬ−フェニルアラニンβ−ナフチルエステル）を用いる代わりにＡＡＮＥを用いた。さらにまた、最も活性なＣＰＤ−ＹＳ₁突然変異体は、ＡＰＮＥの大きな側鎖よりも良好にＡＡＮＥの小さなＰ₁側鎖を提供すると予想された。全ての突然変異誘発シリーズからのＤＮＡで形質転換された酵母菌株ＪＨＲＹ２０−２ＣΔ３のコロニーをこのアッセイによってスクリーニングした。野生型対照突然変異誘発、シリーズ１において、形質転換体コロニーの半分は、活性ＣＰＤ−Ｙを発現する(第VIII表)。各オリゴヌクレオチド標的での突然変異誘発事象が他の３つの標的のものに依存する場合、この数は、各標的で突然変異頻度８４％に相当する。突然変異誘発シリーズ２からの試験された形質転換体１０⁵個のうち、検出可能なＣＰＤ−Ｙ活性を有するものは全くなかった。このシリーズにおいて、６個のコドンを同時に突然変異させた。シリーズ３−６および８においては、より少ないコドンが突然変異され、オーバーレイアッセイにおける色強度によって示される広範囲のＣＰＤ−Ｙ活性を発現する正の形質転換体０.４〜１０％を生じた。突然変異誘発シリーズ７は、活性ＣＰＤ−Ｙを発現する形質転換体５０％を生じ、全ての形質転換体の活性のレベルは、野生型形質転換体のものと区別がつかなかった。これは、位置２１５および２１６がＡＡＮＥに対する活性にあまり影響を及ぼさずに変化させることができることを示す。第２の工程では、本発明者らは、カルボキシペプチダーゼＳ活性をモニターするために従前に用いられた［ルイス（Ｌewis）およびハリス(Ｈarris)、１９６７；ウルフ（Ｗolf）およびウェイザー(Ｗeiser)、１９７７］Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびｏ−ジアニシジンを含む色素産生性マイクロタイターディッシュアッセイの変形法によって、８個のＮ−ブロック−ジペプチド（第IX表に挙げられている）に対する正の突然変異体のＣＰＤ−Ｙ活性を評価した。突然変異誘発シリーズ３−８からの活性ＣＰＤ−Ｙを発現する酵母ＪＨＲＹ２０ −２ＣΔ３の形質転換体を、１mＭの初期濃度の基質を用いるこのアッセイにおいて試験した。野生型と比較して、突然変異誘発シリーズ７からの形質転換体は、全て、８個の試験したＣＢＺ−Ｘ−Ｌｅｕ−ＯＨ基質の全てに対して約１００％の活性レベルを示した。非常に低い活性レベルおよび非常に高い活性レベルのいずれも観察されなかった。これは、位置２１５および２１６がＰ₁優位性に対する影響をあまり有しないことを示した。突然変異誘発シリーズ４、５および８からの形質転換体は、一般的に、低く変化した活性レベルを示した。これらのほとんどは、１０〜１００％のＣＰＤ−Ｙ活性を示し、＞２００％の活性を示すものは全くなかった。本発明者らは、Ｉｌｅ３４０および／またはＣｙｓ３４１が酵素のＫｍ、ｋ_catまたは産生について重要であると考える。突然変異誘発シリーズ３および６からの形質転換体は、平均約１００％を有する活性の幅広い範囲を示した。基質のうちの１つ、ＣＢＺ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＨに対して、いくつかの突然変異体は、低い活性レベルを有することが判明し、いくつかの突然変異体は、非常に高い活性レベルを有することが判明した。ある場合には、該活性は、野生型の活性の９倍であった。アミノ酸が最も関心ある多くの突然変異体中で置換されたことを判定するために、プラスミドＤＮＡを見いだし、配列決定した (第IX表)。ＣＢＺ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＨに対する活性の最大増加を示す突然変異体は、Ｌｅｕ１７８がＳｅｒで置換されたことが判明した。活性の最大増加を示す突然変異体の動力学的パラメーターを測定するために、アフィニティクロマトグラフィーによって、突然変異体１７８Ｓｅｒおよび１７８Ｓｅｒ／２１５Ａｌａ／２１６ＰｒｏからＣＰＤ−Ｙを精製し、動力学的に分析した(第Ｘ表)。ＣＢＺ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＨに対するこれらの酵素のｋ_cat／Ｋm値は、各々、３７００および２２００分^-1mＭ^-1であり、２４分^-1mＭ^-1の野生型値に対して１５５倍および９１倍増加に相当した。これらの結果は、１７８Ｓｅｒ突然変異の重要さならびに位置２１５および２１６での側鎖における変化の小さな影響を確認した。ランダム突然変異誘発のための全ての標的で停止コドンを導入することによって、非突然変異誘発プラスミドのために通常存在する野生型バックグラウンドは、排除され、野生型ＰＲＣ１遺伝子は、稀な復帰突然変異によってのみ生じることができる。かかる復帰突然変異細胞の頻度は、突然変異誘発効率、多くのコドンが同時に突然変異誘発を生じる方法、および突然変異誘発コドンと同義のコドンの数に依存する。５０％の全体的な突然変異誘発効率の場合、６ｘ１０^-9、１ｘ１０^-4、７ｘ１０^-5、２ｘ１０^-6、５ｘ１０^-2、１ｘ１０^-3および７ｘ１０^-1 ⁰ の理論的な復帰突然変異頻度は、各々、突然変異誘発シリーズ１−８について予想される。野生型のこれらの低い頻度は、増加した活性を有する稀な突然変異体についての選択を可能にした。野生型バックグラウンドの排除なしで、０.５％活性突然変異体および５０％非突然変異誘発野生型形質転換体のプールから所望の突然変異体を選択することが困難である。このストラテジーによって、機能的なスクリーンを有する酵素の結合部位は、アミノ酸ごとに切断されて、産生的な突然変異誘発標的である位置を決定することができる。さらにまた、突然変異誘発前のオリゴヌクレオチド標的での稀な制限部位の導入は、突然変異を確認する仕事を簡素化し、シーケンシングを最小限に減少させる。結果は、Ｌｅｕ１７８、Ｉｌｅ３４０およびＣｙｓ３４１が、考えられるところではＳ₁結合ポケットの表面の部分を形成することによって、Ｐ₁特異性に寄与することを示す。Ｐ₁でＬｙｓに対して高い活性を有するＣＰＤ−Ｙ突然変異体は、全て、１７８位で突然変異を有することが判明した。驚くべきことに、Ｌｅｕ１７８をＳｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＡｓｎまたはＨｉｓに置換することは、全て、同一の一般的な効果−Ｐ₁におけるＬｙｓを有する基質に対する活性を与える(第Ｘ表)。ＣＰＤ−Ｙ−１７８のＰ₁におけるＬｙｓに対する高い活性についての説明は、ＣＰＤ−Ｗの２２４および２２５に対応する、ＣＰＤ−ＹにおけるＳ₁の末端を構成するいずれの残基の配座変化をも生じることである。ＣＰＤ−Ｙは、プロリンインスリン（ＩＮＳ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＯＨ）のペプチド転移反応を触媒して、ヒトインスリンアミド(ＯＮＳ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−ＮＨ₂)を産生することができ、Ｐ₁におけるＬｙｓに対する１５倍高い活性を有するＣｙｓ３４１Ｈg²⁺修飾酵素がペプチド転移反応［ブレダム（Ｂreddam）ら、１９８４］における２６％ヒトインスリンアミド産生物を産生し、一方、野生型酵素は、４.２％だけ産生した。かくして、Ｐ₁におけるＬｙｓに対する活性の１５５倍増加を有する１７８Ｓｅｒ突然変異体は、ペプチド転移反応において高い収率を与える。本明細書に記載の乏しいＣＢＺ−Ｘ−Ｌｅｕ−ＯＨペプチド基質を加水分解する能力について選択される突然変異体を、実施例２および３に記載の予備選択されたポリペプチド基質および求核分子をアシル転移反応させる能力についてスクリーニングすることもできる。本明細書中の全ての刊行物および特許出願は、本発明に属する当業者のレベルを示す。本明細書では、全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が引用によって詳細に個別的に示されたと同程度に引用によって取り込まれる。本発明において、請求の範囲の精神または範囲から逸脱せずに、多くの変化および変更をなすことができることは、当業者に明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者モーテンセン，ウッフェ・ハスボーデンマーク国デーコー―2300・コペンハーゲン・エス、ニアンベアウスギャーゼ６番、トレジェ・チル・ヴェンストレ (72)発明者オレセン，キェル・オーヴェデンマーク国デーコー―2000・フレデリクスベアウ、ニーチヴェーウ９番、トレジェ・チル・ヘイア (72)発明者ステンニッケ，ヘニング・ラルフデンマーク国デーコー―2000・フレデリクスベアウ、シンシュヴィーレヴァイ３アー番、フィアーゼ・チル・ヴェンストレ (72)発明者ワーグナー，フレッド・ダブリューアメリカ合衆国ネブラスカ州68461、ウォルトン、ボックス77ビー、ルート１番

Claims

【特許請求の範囲】１．修飾された活性部位を有し、かつ、予め選択された基質が予め選択された求核試薬で修飾されるアシル基転移反応であって公知プロテアーゼでは実質的に触媒されないアシル基転移反応を触媒することが可能な、公知プロテアーゼから誘導される特製プロテアーゼ。２．予め選択された基質のＣ末端でアシル基転移させることが可能な請求項１記載の特製プロテアーゼ。３．予め選択された基質のＮ末端でアシル基転移させることが可能な請求項１記載の特製プロテアーゼ。４．予め選択された求核試薬が単一または多数のアミノ酸単位である請求項１記載の特製プロテアーゼ。５．公知エキソペプチダーゼから誘導される請求項１記載の特製プロテアーゼ。６．公知のセリンまたはシステインプロテアーゼら誘導される請求項１記載の特製プロテアーゼ。７．公知カルボキシペプチダーゼから誘導される請求項１記載の特製プロテアーゼ。８．公知エンドプロテアーゼから誘導される請求項１記載の特製プロテアーゼ。９．予め選択された基質が塩基性または酸性の最後から２番目のアミノ酸を有する請求項１記載の特製プロテアーゼ。１０．予め選択された求核試薬が、酸性アミノ酸アミド、塩基性アミノ酸アミド、ペプチドアミド、アミノ酸およびアミノ酸エステルからなる群から選択される請求項１記載の特製プロテアーゼ。１１．予め選択された基質がＧＲＦ（１-４３）-Ａｌａに該当し、予め選択された求核試薬がロイシンアミドである請求項１記載の特製プロテアーゼ。１２．修飾された活性部位を有し、かつ、最後から２番目の位置に酸性または塩基性のアミノ酸を有する予め選択された基質が予め選択された求核試薬のアミノ酸アミドで修飾されるアシル基転移反応を触媒することが可能な、公知カルボキシペプチダーゼから誘導される特製カルボキシペプチダーゼ。１３．予め選択された基質が最後から２番目の位置にアルギニンを有する請求項１２記載の特製カルボキシペプチダーゼ。１４．予め選択された基質がＧＲＦ（１-４３）-Ａｌａであり、予め選択された求核試薬がロイシンアミドである請求項１３記載の特製カルボキシペプチダーゼ。１５．修飾された活性部位がＳ₁結合部位において公知カルボキシペプチダーゼとは異なるアミノ酸を有する請求項１２記載の特製プロテアーゼ。１６．修飾された活性部位がＳ₁'部位において公知カルボキシペプチダーゼとは異なるアミノ酸を有する請求項１２記載の特製プロテアーゼ。１７．カルボキシペプチダーゼＹの１７８位または３９８位に対応する公知カルボキシペプチダーゼの位置に異なるアミノ酸残基を有する、公知カルボキシペプチダーゼから誘導される特製カルボキシペプチダーゼ。１８．アシル基転移活性が増強されるように活性部位が修飾されている公知プロテアーゼから誘導される、増強されたアシル基転移能を示す特製プロテアーゼ。１９．公知プロテアーゼがカルボキシペプチダーゼであり、活性部位がカルボキペプチダーゼＹの１７８位に対応する位置のアミノ酸残基をセリンに置換することによって修飾されている請求項１８記載の特製プロテアーゼ。２０．公知プロテアーゼから誘導され、修飾された活性部位を有し、かつ、公知プロテアーゼのアシル基転移能を変化させるように機能する特製プロテアーゼを製造する方法であって、（ａ）公知プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列を用意し、（ｂ）活性部位における少なくとも１個のアミノ酸残基をコードする少なくとも１個のコドンを修飾し、修飾されたコドンが変化したアシル基転移能を特製プロテアーゼに与える異なるアミノ酸残基をコードするようにし、変異体ＤＮＡ配列を形成し、（ｃ）変異体ＤＮＡ配列の発現に適した宿主細胞を変異体ＤＮＡ配列で形質転換し、特製プロテアーゼを得る、ことからなる方法。２１．ＤＮＡ配列がカルボキシペプチダーゼＹのＤＮＡ配列に該当する請求項２０記載の方法。２２．ＤＮＡ配列がエンドプロテアーゼをコードする請求項２０記載の方法。２３．アミノ酸がカルボキシペプチダーゼＹの活性部位のＳ₁結合部位におけるアミノ酸である請求項２０記載の方法。２４．アミノ酸が、Ｔｙｒ１４７、Ｌｅｕ１７８、Ｔｙｒ１８５、Ｔｙｒ１８８、Ａｓｎ２４１、Ｌｅｕ２４５、Ｔｒｐ３１２、Ｉｌｅ３４０、Ｃｙｓ３４１およびそれらの混合物からなる群から選択される請求項２３記載の方法。２５．アミノ酸がカルボキシペプチダーゼＹの活性部位のＳ₁'結合部位におけるアミノ酸である請求項２０記載の方法。２６．アミノ酸が、Ｔｒｐ４９、Ａｓｎ５１、Ｇｌｙ５２、Ｃｙｓ５６、Ｔｈｒ６０、Ｐｈｅ６４、Ｇｌｕ６５、Ｇｌｕ１４５、Ｔｙｒ２５６、Ｔｙｒ２６９、Ｌｅｕ２７２、Ｓｅｒ２９７、Ｃｙｓ２９８、Ｍｅｔ３９８およびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸である請求項２５記載の方法。２７．アミノ酸がメチオニン３９８である請求項２６記載の方法。２８．修飾する工程が、さらに、（ａ）活性部位における少なくとも１個のアミノ酸残基のコドンを欠失させ、（ｂ）異なるアミノ酸残基をコードするオリゴヌクレオチドで欠失コドンを置換する、ことを含む請求項２０記載の方法。２９．適当な宿主細胞を形質転換する工程が、さらに、（ａ）プロテアーゼを分泌することが可能なエス・セレビシアエ(S．cerevisia e)株を形質転換し、（ｂ）形質転換した細胞を変異体プロテアーゼの発現について選択し、（ｃ）発現された変異体プロテアーゼを、予め選択された基質および／または予め選択された求核試薬とのアシル基転移反応を触媒する能力についてスクリーニングする、ことを含む請求項２０記載の方法。３０．公知プロテアーゼを変異誘発し、変化したアシル基転移能を有する特製プロテアーゼを形成する方法であって、（ａ）公知プロテアーゼのＤＮＡ配列を用意し、（ｂ）変異させるべき公知プロテアーゼの活性部位におけるアミノ酸のコドンを含む少なくとも１個の標的位置のＤＮＡ配列を、活性部位におけるアミノ酸のコドンによって適所に挿入される停止コドンを有するＤＮＡ配列、および／または、制限酵素によって認識されるＤＮＡ配列を該標的位置に挿入することによって修飾し、不活性型の公知プロテアーゼをコードする修飾されたＤＮＡ配列を形成し、（ｃ）一本鎖の修飾されたＤＮＡを生成させ、（ｄ）一本鎖の修飾されたＤＮＡを、公知プロテアーゼの活性部位および標的部位に存在するアミノ酸とは異なるアミノ酸のコドンを含む１個またはそれ以上の第１縮重オリゴヌクレオチドと共にインキュベートすることによって、特製プロテアーゼをコードする変異体ＤＮＡ配列を合成し、増幅させ、（ｅ）特製プロテアーゼをコードする変異体ＤＮＡ配列について選択し、スクリーニングする、ことからなる方法。３１．合成し、増幅する工程が、標的部位における公知プロテアーゼのコドンを含み、かつ、１個またはそれ以上の第１縮重オリゴヌクレオチドと入れ替わる１個またはそれ以上の第２オリゴヌクレオチドを含む請求項３０記載の方法。３２．公知プロテアーゼのＤＮＡ配列がカルボキシペプチダーゼＹのＤＮＡ配列に実質的に該当する請求項３０記載の方法。３３．標的部位が、Ｔｙｒ１４７、Ｌｅｕ１７８、Ｔｙｒ１８５、Ｔｙｒ１８８、Ｇｌｕ２１５、Ａｒｇ２１６、Ａｓｎ２４１、Ｌｅｕ２４５、Ｔｒｐ３１２、Ｉｌｅ３４０、Ｃｙｓ３４１およびそれらの混合物からなる群から選択されるアミノ酸をコードする請求項３２記載の方法。３４．標的部位が１７８位のアミノ酸をコードする請求項３３記載の方法。３５．修飾されたＤＮＡ配列が、アンバー、オーカーおよびオパールからなる群から選択される停止コドンを有する請求項３０記載の方法。３６．修飾されたＤＮＡ配列が標的部位にオパール停止コドンとＥｃｏＲＩに対する制限エンドヌクレアーゼ認識部位とを有する請求項３５記載の方法。３７．有効量の一本鎖の修飾されたＤＮＡを生成させる工程が、（ａ）変異したアンピシリン抵抗性遺伝子を有するファージミッドシャトルベクターに修飾されたＤＮＡ配列を挿入し、（ｂ）適当な宿主細胞中でシャトルベクターを増幅し、（ｃ）一本鎖の修飾されたＤＮＡを生成させる、ことを含む請求項３０記載の方法。３８．合成し、増幅する工程が、さらに、アンピシリン抵抗性遺伝子を修復する１個またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含む請求項３７記載の方法。３９．選択する工程が、（ａ）増殖するのに少なくとも１種のアミノ酸を必要とする適当な宿主細胞を形質転換し、（ｂ）増殖に必要なアミノ酸を欠くが、必要なアミノ酸をＣ末端に有する予め選択されたペプチドを補足した培地上で増殖することができる形質転換した細胞を選択し、（ｃ）公知プロテアーゼによって実質的に作用を受けない予め選択された基質をアシル基転移させることが可能な変異体プロテアーゼについてスクリーニングすることによって、特製プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列を有する細胞を同定する、ことを含む請求項３８記載の方法。４０．公知プロテアーゼから誘導される特製プロテアーゼを用いたアシル基転移によって、予め選択された基質を修飾する方法であって、（ａ）修飾された活性部位を有する特製プロテアーゼを、公知プロテアーゼによるアシル基転移をいずれも実質的に受けない予め選択された基質および予め選択された求核試薬とインキュベートして混合物を形成し、（ｂ）混合物を充分にインキュベートして予め選択されたアシル基転移生成物を形成する、ことからなる方法。４１．予め選択された基質が、Ｃ末端にアラニンを有する増殖ホルモン放出因子である請求項４０記載の方法。４２．予め選択された求核試薬がロイシンアミドである請求項４０記載の方法。４３．特製プロテアーゼが、１７８位のアミノ酸がセリンである修飾された活性部位を有するカルボキシペプチダーゼＹである請求項４０記載の方法。４４．予め選択されたアシル基転移生成物が、Ｃ末端にロイシンアミドを有する増殖ホルモン放出因子である請求項４０記載の方法。