CN103429738A - 裂殖酵母属酵母的转化体、该转化体的制造方法、β-葡糖苷酶的制造方法及纤维素的降解方法 - Google Patents

裂殖酵母属酵母的转化体、该转化体的制造方法、β-葡糖苷酶的制造方法及纤维素的降解方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103429738A
CN103429738A CN2012800138538A CN201280013853A CN103429738A CN 103429738 A CN103429738 A CN 103429738A CN 2012800138538 A CN2012800138538 A CN 2012800138538A CN 201280013853 A CN201280013853 A CN 201280013853A CN 103429738 A CN103429738 A CN 103429738A
Authority
CN
China
Prior art keywords
variation
beta
glucosidase enzyme
transformant
glucosidase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2012800138538A
Other languages
English (en)
Inventor
冈田和士
东田英毅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AGC Inc
Original Assignee
Asahi Glass Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Asahi Glass Co Ltd filed Critical Asahi Glass Co Ltd
Publication of CN103429738A publication Critical patent/CN103429738A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明的目的在于提供可产生葡糖苷酶活性经改良的修饰型β-葡糖苷酶的裂殖酵母属酵母的转化体、该转化体的制造方法、该修饰型β-葡糖苷酶的制造方法及采用该修饰型β-葡糖苷酶的纤维素的降解方法。裂殖酵母属酵母的转化体，其特征在于，在染色体中或作为染色体外基因具有包括编码向来源于丝状菌的β-葡糖苷酶中导入了特定变异组中的至少一种变异的修饰型β-葡糖苷酶的区域的结构基因序列以及用于使该结构基因表达的启动子序列和终止子序列，所述修饰型β-葡糖苷酶的热稳定性或耐葡萄糖抑制性比不具有所述特定变异的β-葡糖苷酶高。

Description

裂殖酵母属酵母的转化体、该转化体的制造方法、β-葡糖苷酶的制造方法及纤维素的降解方法
技术领域
本发明涉及裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属酵母的转化体、该转化体的制造方法、使用该转化体的β-葡糖苷酶的制造方法及采用该β-葡糖苷酶的纤维素的降解方法。具体来说，涉及可生产热稳定性或耐葡萄糖抑制性比野生型的β-葡糖苷酶高的修饰型的β-葡糖苷酶的裂殖酵母属酵母的转化体及其制造方法。
背景技术
为了由木材或稻草、稻壳、杂草等纤维素类生物质生产作为发酵原料的糖并进而生产生物乙醇等生物质燃料，必须降解作为植物细胞壁的主要构成成分的纤维素。纤维素的降解有浓硫酸糖化法或稀硫酸糖化法等酸糖化法、利用酶的酶糖化法等方法，在近年来生物技术迅猛发展的背景下，进行了大量酶糖化法的研究开发。纤维素的酶糖化利用被总称为纤维素酶的一类酶。首先，具有随机切断纤维素链的活性的内切葡聚糖酶(EG)将纤维素的非晶体区域降解，使葡萄糖末端露出。露出的葡萄糖末端被纤维二糖水解酶(CBH)降解，纤维二糖游离。接着，β-葡糖苷酶(BGL)将游离的纤维二糖降解，从而葡萄糖游离。
纤维素的酶糖化中广泛采用曲霉属和木霉属等的丝状菌。这是因为可生产用于将结晶纤维素降解而糖化的各种纤维素酶和半纤维素酶，并可将这些酶大量分泌至细胞外。
此外，也进行了通过异种株表达这些丝状菌的纤维素酶的尝试。此外，非专利文献1中揭示了通过编码作为丝状菌之一的棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)的β-葡糖苷酶Ⅰ(BGL Ⅰ)的基因对作为出芽酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)进行转化，使所得的转化体表达了这些酶。
另一方面，与曲霉属和木霉属相比，裂殖酵母属酵母的基因分析更深入，具有确立了各种有用的变异株和基因导入用载体、适合于蛋白质的工业化大量生产的优点。然而，裂殖酵母属酵母不具有固有的β-葡糖苷酶基因，无法对纤维二糖进行同化。
另外，还期待β-葡糖苷酶本身的高功能化。例如，酶糖化法的情况下，存在下述问题：如果葡萄糖随着基于酶的纤维素的水解反应进行而在反应体系内积聚，积聚的葡萄糖会抑制β-葡糖苷酶，纤维二糖积聚，进而积聚的纤维二糖抑制内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶，结果纤维素无法完全降解。因此，希望开发出耐葡萄糖抑制性(葡萄糖抑制的耐受性)更高的β-葡糖苷酶。
此外，酶反应一般存在反应温度越高则反应效率越高的倾向，因此通过提高纤维素降解反应时的温度，可期待更高效地降解纤维素。另外，热稳定性越高，酶反应的持续时间可越长。因为，希望开发出热稳定性更高的β-葡糖苷酶。
对酶的随机变异导入法在改良该酶的功能的方面是重要的方法之一。易错PCR(聚合酶链式反应)法(非专利文献2)等中，向目标基因导入随机的单碱基置换变异。通过饱和变异导入法(非专利文献2)随机改变特定部位的密码子。通过体外重组法(非专利文献2)，将多个变异体的基因杂交而组合变异点。通过这些随机变异导入法向编码目标酶的基因导入随机变异，从而可制成变异酶文库。通过使用可从其中选择符合目标功能的筛选法进行选择，可获得有用的改良酶。另外，通过反复进行随机变异和筛选，可积累有用的变异点，使酶的功能进一步提高。
然而，基于随机变异导入的酶的改良大部分是大肠杆菌(专利文献1)和无细胞蛋白质合成系(专利文献2)中的事例，不适合于来源于真核生物的糖蛋白的变异导入。此外，专利文献3中对出芽酵母进行随机变异导入，但有变异基因向载体的插入和大肠杆菌中的变异基因插入载体的扩增和纯化的工序，不够简便。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利特许第4402446号公报
专利文献2:日本专利特开2005-245336号公报
专利文献3:日本专利特许第4448772号公报
非专利文献
非专利文献1:G.Tanaka等,Biosci.Biotechnol.Biochem.,(1998)62(8),1615-1618页.
非专利文献2:F.Arnold等,《定向进化文库的构建方法及实验方案(Directed Evolution Library Creation Methods and Protocols)》,《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》,(2003)231卷.
发明的概要
发明所要解决的技术问题
于是，本发明的目的在于提供可产生葡糖苷酶活性经改良的修饰型β-葡糖苷酶的裂殖酵母属酵母的转化体、该转化体的制造方法、该修饰型β-葡糖苷酶的制造方法及采用该修饰型β-葡糖苷酶的纤维素的降解方法。
解决技术问题所采用的技术方案
本发明人为了解决上述课题而认真研究后，发现通过将向来源于丝状菌的编码β-葡糖苷酶的结构基因序列导入特定变异而合成的编码修饰型β-葡糖苷酶的结构基因导入裂殖酵母属酵母进行转化，可解决上述课题，从而完成了本发明。
即，本发明提供以下的[1]～[15]。
[1]裂殖酵母(schizosaccharomyces)属酵母的转化体，其中，在染色体中或作为染色体外基因具有包括编码下述修饰型β-葡糖苷酶的区域的结构基因序列以及用于使该结构基因表达的启动子序列和终止子序列；
修饰型β-葡糖苷酶:作为存在选自下述变异1～变异6的至少一种变异的来源于丝状菌的β-葡糖苷酶，热稳定性或耐葡萄糖抑制性比不具有所述变异的来源于丝状菌的β-葡糖苷酶高的β-葡糖苷酶；
变异1:与位于AaBGL1(棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的BGL1)的第244个的异亮氨酸对应的氨基酸被置换为苯丙氨酸的变异；
变异2:与位于AaBGL1的第282个的甘氨酸对应的氨基酸被置换为苯丙氨酸的变异；
变异3:与位于AaBGL1的第442个的天门冬酰胺对应的氨基酸被置换为丝氨酸的变异；
变异4:与位于AaBGL1的第452个的甘氨酸对应的氨基酸被置换为丝氨酸的变异；
变异5:与位于AaBGL1的第503个的缬氨酸对应的氨基酸被置换为丙氨酸的变异；
变异6:与位于AaBGL1的第613个的精氨酸对应的氨基酸被置换为亮氨酸的变异。
[2]如上述[1]所述的转化体，其中，所述来源于丝状菌的β-葡糖苷酶为BGL1。
[3]如上述[1]或[2]所述的转化体，其中，所述丝状菌为曲霉(Aspergillus)属的微生物。
[4]如上述[1]～[3]中的任一项所述的转化体，其中，所述来源于丝状菌的β-葡糖苷酶是与以序列编号1表示的氨基酸序列的同源率在70％以上且具有催化β-D-吡喃葡萄糖苷键的水解反应的活性的蛋白质。
[5]如上述[1]～[4]中的任一项所述的转化体，其中，所述结构基因序列在编码所述修饰型β-葡糖苷酶的区域的5’末端侧和3’末端侧的至少任一方具有编码信号的区域或编码标签的区域。
[6]如上述[1]～[4]中的任一项所述的转化体，其中，所述结构基因序列在编码所述修饰型β-葡糖苷酶的区域的5’末端侧具有编码分泌信号的区域。
[7]转化体的制造方法，其特征在于，通过包括编码下述修饰型β-葡糖苷酶的区域的结构基因序列以及用于使该结构基因表达的启动子序列和终止子序列的载体对裂殖酵母属酵母进行转化；
修饰型β-葡糖苷酶:作为存在选自下述变异1～变异6的至少一种变异的来源于丝状菌的β-葡糖苷酶，热稳定性或耐葡萄糖抑制性比不具有所述变异的来源于丝状菌的β-葡糖苷酶高的β-葡糖苷酶；
变异1:与位于AaBGL1(棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的BGL1)的第244个的异亮氨酸对应的氨基酸被置换为苯丙氨酸的变异；
变异2:与位于AaBGL1的第282个的甘氨酸对应的氨基酸被置换为苯丙氨酸的变异；
变异3:与位于AaBGL1的第442个的天门冬酰胺对应的氨基酸被置换为丝氨酸的变异；
变异4:与位于AaBGL1的第452个的甘氨酸对应的氨基酸被置换为丝氨酸的变异；
变异5:与位于AaBGL1的第503个的缬氨酸对应的氨基酸被置换为丙氨酸的变异；
变异6:与位于AaBGL1的第613个的精氨酸对应的氨基酸被置换为亮氨酸的变异。
[8]如上述[7]所述的转化体的制造方法，其中，所述结构基因序列在编码所述修饰型β-葡糖苷酶的区域的5’末端侧和3’末端侧的至少任一方具有编码信号的区域或编码标签的区域。
[9]如上述[7]所述的转化体的制造方法，其中，所述结构基因序列在编码所述修饰型β-葡糖苷酶的区域的5’末端侧具有编码分泌信号的区域。
[10]如上述[7]～[9]中的任一项所述的转化体的制造方法，其中，将所述载体整合至裂殖酵母属酵母的染色体的1处以上。
[11]如上述[10]所述的转化体的制造方法，其中，将所述载体整合至染色体中的转座子基因Tf2位点。
[12]β-葡糖苷酶的制造方法，其特征在于，从对上述[1]～[5]中的任一项所述的转化体进行培养而得的菌体获得修饰型β-葡糖苷酶。
[13]β-葡糖苷酶的制造方法，其特征在于，从对上述[6]所述的转化体进行培养而得的培养液上清获得修饰型β-葡糖苷酶。
[14]纤维素的降解方法，其特征在于，使用通过上述[12]或[13]所述的β-葡糖苷酶的制造方法得到的修饰型β-葡糖苷酶。
[15]纤维素的降解方法，其特征在于，在纤维素的存在下对上述[6]所述的转化体进行培养。
发明的效果
通过本发明的裂殖酵母属酵母的转化体的制造方法，可制造能生产热稳定性和耐葡萄糖抑制性的至少任一方得到改良的修饰型β-葡糖苷酶的裂殖酵母属酵母的转化体。此外，通过本发明的β-葡糖苷酶的制造方法从该转化体获得的修饰型β-葡糖苷酶可良好地用于纤维素的降解。
附图的简单说明
图1是将来源于丝状菌的β-葡糖苷酶的系统树和与通过棘孢曲霉的bgl1基因编码的BGL1(AaBGL1)的同源率一起表示的图。
图2A是表示AaBGL1的氨基酸序列和来源于其它丝状菌的β-葡糖苷酶的氨基酸序列的比对的图。
图2B是表示AaBGL1的氨基酸序列和来源于其它丝状菌的β-葡糖苷酶的氨基酸序列的比对的图。
图2C是表示AaBGL1的氨基酸序列和来源于其它丝状菌的β-葡糖苷酶的氨基酸序列的比对的图。
图3是表达载体pSL6AaBGL1的构成图。
图4是表达载体pSL6P3AaBGL1的构成图。
图5是表示实施例8中各变异株的培养上清的葡萄糖抑制测定和保温温度50℃～75℃的热稳定性测定的结果的图。
实施发明的方式
β-葡糖苷酶(EC.3.2.1.21)被用作特异性催化β-D-吡喃葡萄糖苷键的水解反应的酶的总称。特别是因将纤维二糖分解为葡萄糖而又被称为纤维二糖酶，广泛分布于细菌、丝状菌、植物和动物。在各种生物种内大多存在多种编码β-葡糖苷酶的基因。例如，作为丝状菌的1种的米曲霉(Aspergillus oryzae)中报道了存在bgl1～bgl7(《大豆蛋白质研究(Soyprotein Research)》，日本12，78-83页，2009，以及日本专利特开2008-086310号公报)。
本发明和本申请说明书中，“来源于丝状菌的β-葡糖苷酶”是指丝状菌原来具有的野生型β-葡糖苷酶。丝状菌是指菌类中由被称为菌丝的管状细胞构成的真核细胞微生物。作为丝状菌，可例举例如曲霉(Aspergillus)属、木霉属(Trichoderma)属、镰刀菌属(Fusarium)属、青霉(Penicillium)属和支顶孢属(Acremonium)属等。作为曲霉属的丝状菌，可例举例如构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米曲霉、棘孢曲霉、黑曲霉(Aspergillusniger)、粉状曲霉(Aspergillus pulverulentus)、土曲霉(Aspergillusterreus)等。
图1中将来源于丝状菌的β-葡糖苷酶的系统树和与通过棘孢曲霉的bgl1基因编码的BGL1(AaBGL1)的同源率(％:各β-葡糖苷酶的末尾的数值)一起示出。此外，图1中，各β-葡糖苷酶的最初的6个字符是UniProtKB/Swiss-Prot数据库中登记的登录号。
本申请说明书和本发明中，耐葡萄糖抑制性高是指葡萄糖存在下的葡糖苷酶活性相对于不存在葡萄糖的条件下催化β-D-吡喃葡萄糖苷键的水解反应的活性(以下称为葡糖苷酶活性)的比值(将不存在葡萄糖的条件下的葡糖苷酶活性设为100％时的葡萄糖存在下的葡糖苷酶活性的相对活性值)高。此外，热稳定性高是指进行加热处理的情况下的葡糖苷酶活性相对于酶反应前不进行加热处理的情况下的葡糖苷酶活性的比值高。
[转化体]
本发明的转化体的特征在于，在染色体中或作为染色体外基因具有包括编码下述修饰型β-葡糖苷酶的区域的结构基因序列以及用于使该结构基因表达的启动子序列和终止子序列。该修饰型β-葡糖苷酶是存在选自后述的(变异1)～(变异6)的至少一种变异的来源于丝状菌的β-葡糖苷酶，热稳定性或耐葡萄糖抑制性比不具有该变异的β-葡糖苷酶高。该修饰型β-葡糖苷酶可通过向来源于丝状菌的β-葡糖苷酶中导入特定的氨基酸置换变异而获得。
(修饰型β-葡糖苷酶)
修饰型β-葡糖苷酶是与来源于丝状菌的β-葡糖苷酶相比，具有选自下述(变异1)～(变异6)的一种以上的变异，且具有葡糖苷酶活性的酶。具有变异2或变异4的变异的修饰型β-葡糖苷酶的耐葡萄糖抑制性与不具有该变异的β-葡糖苷酶相比提高。此外，具有变异3、变异5或变异6的变异的修饰型β-葡糖苷酶的热稳定性与不具有该变异的β-葡糖苷酶相比得到改善。具有变异1的变异的修饰型β-葡糖苷酶的耐葡萄糖抑制性和热稳定性与不具有该变异的β-葡糖苷酶相比都提高。
变异1:与位于AaBGL1(棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的BGL1)的第244个的异亮氨酸对应的氨基酸被置换为苯丙氨酸的变异。
变异2:与位于AaBGL1的第282个的甘氨酸对应的氨基酸被置换为苯丙氨酸的变异。
变异3:与位于AaBGL1的第442个的天门冬酰胺对应的氨基酸被置换为丝氨酸的变异。
变异4:与位于AaBGL1的第452个的甘氨酸对应的氨基酸被置换为丝氨酸的变异。
变异5:与位于AaBGL1的第503个的缬氨酸对应的氨基酸被置换为丙氨酸的变异。
变异6:与位于AaBGL1的第613个的精氨酸对应的氨基酸被置换为亮氨酸的变异。
β-葡糖苷酶的热稳定性或耐葡萄糖抑制性因上述(变异1)～(变异6)的存在而提高是本发明人首先获得的发现。该发现通过采用以裂殖酵母属酵母为宿主的随机变异导入法和功能筛选法的修饰蛋白质的获得方法得到。具体来说，如下获得：通过随机变异法向AaBGL1中导入各种变异，将其导入裂殖酵母属酵母中而制成变异型β-葡糖苷酶文库后，从该文库中筛选β-葡糖苷酶的热稳定性或耐葡萄糖抑制性得到改善的转化体，分析该转化体中编码AaBGL1的结构基因的碱基序列。
对于修饰型β-葡糖苷酶所具有的6种变异，可以是仅这些变异中的1种，也可以2种以上的变异组合。例如，具有变异2和变异4的修饰型β-葡糖苷酶的耐葡萄糖抑制性分别比具有单独的变异的修饰型β-葡糖苷酶高。此外，例如与单独具有变异5的修饰型β-葡糖苷酶相比，具有变异5和变异6的修饰型β-葡糖苷酶具有更高的热稳定性。此外，与具有变异5和变异6的修饰型β-葡糖苷酶相比，具有变异3、变异5和变异6的修饰型β-葡糖苷酶具有更高的热稳定性。此外，具有变异1、变异2、变异5和变异6的修饰型β-葡糖苷酶具有比仅具有变异1和变异2的修饰型β-葡糖苷酶高的热稳定性。
本申请说明书和本发明中，某一β-葡糖苷酶中的“与AaBGL1的第X个的氨基酸对应的氨基酸”是指将AaBGL1的氨基酸序列(序列编号1)与该β-葡糖苷酶的氨基酸序列以同源率最高的条件进行比对时位于与AaBGL1的第X个的氨基酸对应的位置的氨基酸。图2中示出AaBGL1的氨基酸序列和来源于其它丝状菌的β-葡糖苷酶的氨基酸序列的比对结果。
具体来说，如图2所示，对于与AaBGL1的第244个的异亮氨酸对应的氨基酸，米曲霉和土曲霉中为第245个的缬氨酸，黑曲霉中为第244个的缬氨酸，构巢裸胞壳(Emericella nidulans)中为第247个的异亮氨酸。
此外，对于与AaBGL1的第282个的甘氨酸对应的氨基酸，米曲霉中为第283个的苏氨酸，土曲霉中为第283个的丝氨酸，黑曲霉中为第282个的丙氨酸，构巢裸胞壳中为第285个的丝氨酸。
此外，对于与AaBGL1的第442个的天门冬酰胺对应的氨基酸，米曲霉中为第443个的天门冬酰胺，土曲霉中为第443个的赖氨酸，黑曲霉中为第442个的天门冬酰胺，构巢裸胞壳中为第445个的谷氨酰胺。
此外，对于与AaBGL1的第452个的甘氨酸对应的氨基酸，米曲霉和土曲霉中为第453个的甘氨酸，黑曲霉中为第452个的甘氨酸，构巢裸胞壳中为第455个的甘氨酸。
此外，对于与AaBGL1的第503个的缬氨酸对应的氨基酸，米曲霉和土曲霉中为第504个的缬氨酸，黑曲霉中为第503个的缬氨酸，构巢裸胞壳中为第506个的缬氨酸。
此外，对于与AaBGL1的第613个的精氨酸对应的氨基酸，米曲霉中为第614个的赖氨酸，土曲霉中为第614个的苏氨酸，黑曲霉中为第613个的苏氨酸，构巢裸胞壳中为第616个的苏氨酸。
不具有本发明中的变异的野生型β-葡糖苷酶是来源于丝状菌的蛋白质，只要具有葡糖苷酶活性即可，但从酶活性的高低等来看，较好是BGL1。
此外，该野生型β-葡糖苷酶只要来源于丝状菌即可，可以是来源于任一种丝状菌的酶，但较好是来源于曲霉属的丝状菌的β-葡糖苷酶，更好是来源于米曲霉或棘孢曲霉的β-葡糖苷酶。其中，由于结晶纤维素降解能力高，单糖生成能力好，较好是来源于棘孢曲霉的β-葡糖苷酶，更好是AaBGL1。根据坂本礼一郎博士的论文(《关于棘孢曲霉编号F-50的纤维素酶系的研究(Aspergillus aculeatus No.F-50のセルラーゼ系に関する研究)》，大阪府立大学，1984年)，由棘孢曲霉纯化的野生型的AaBGL1的分子量为约133KDa，最适pH为4.0，稳定pH范围为3～7(25℃，24小时)。
作为本发明中的修饰型β-葡糖苷酶，具体来说，与来源于丝状菌的野生型β-葡糖苷酶相比，可以是存在上述(变异1)～(变异6)中的1种以上的变异的酶，除了上述(变异1)～(变异6)之外，只要不破坏该变异产生的效果且不破坏葡糖苷酶活性，还可以存在该变异以外的其它变异或修饰。作为该存在其它变异的修饰型β-葡糖苷酶，可例举例如存在野生型β-葡糖苷酶的1个以上的氨基酸、较好是1～数十个、更好是1～十数个、进一步更好是1～9个、进一步更好是1～数个氨基酸的缺失、置换或插入且具有葡糖苷酶活性的蛋白质中存在选自上述(变异1)～(变异6)中的1种以上的变异的β-葡糖苷酶。例如，可将位于野生型β-葡糖苷酶的N末端侧或C末端侧的不影响葡糖苷酶活性的由1～数十个氨基酸构成的区域缺失且存在选自上述(变异1)～(变异6)中的1种以上的变异的β-葡糖苷酶作为修饰型β-葡糖苷酶。
作为本发明中的修饰型β-葡糖苷酶，可以是与以序列编号1表示的氨基酸序列的同源率在60％以上、较好是在65％以上、更好是在70％以上、进一步更好是在75％以上、进一步更好是在80％以上且具有催化β-D-吡喃葡萄糖苷键的水解反应的活性的蛋白质中存在选自上述(变异1)～(变异6)中的1种以上的变异的β-葡糖苷酶。
(宿主)
本发明的转化体的宿主是裂殖酵母属酵母。本发明中使用的裂殖酵母属酵母可以是野生型，也可以是根据用途使特定的基因缺失或失活的突变型。作为使特定的基因缺失或失活的方法，可使用公知的方法。具体来说，可通过使用Latour法(记载于Nucreic Acids Res,2006年,第34卷第e11号以及国际公开第2007/063919号等)来使基因缺失。此外，可通过以采用诱变剂的突变分离法(《酵母分子遗传学实验法》，1996年，学会出版中心)或利用PCR的随机突变法(PCR Methods Appl.，1992年，第2卷，28-33页)等向基因的一部分导入突变而使该基因失活。作为使特定基因缺失或失活的裂殖酵母属酵母宿主，记载于例如国际公开第2002/101038号、国际公开第2007/015470号等。
另外，作为宿主的裂殖酵母属酵母较好是使用具有用于筛选转化体的标记物的酵母。例如，较好是使用因某一基因缺失而在生长发育中需要特定营养成分的宿主。通过包含目标基因序列的载体进行转化来制造转化体的情况下，通过向载体中整合该缺失的基因(营养缺陷性互补标记物)，转化体中宿主的营养缺陷性消失。可通过该宿主与转化体的营养缺陷性的差异对两者进行区分而获得转化体。
例如，可将乳清酸核苷5’-磷酸脱羧酶基因(ura4基因)缺失或失活而呈尿嘧啶缺陷性的裂殖酵母属酵母作为宿主，通过具有ura4基因(营养缺陷性互补标记物)的载体进行转化后，筛选尿嘧啶缺陷性消失的酵母，从而获得整合了载体的转化体。宿主中因缺失而呈营养缺陷性的基因只要是可用于转化体的筛选即可，并不仅限于ura4基因，可以是异丙基苹果酸脱氢酶基因(leu1基因)等。
作为裂殖酵母属酵母，可例举粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)、八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)等。上述裂殖酵母属酵母中，因为可利用各种有用的突变株，较好是粟酒裂殖酵母。
(表达盒)
表达盒是指表达蛋白质所需的DNA的组合，包括编码该蛋白质的结构基因以及在裂殖酵母属酵母内起作用的启动子和终止子。
本发明的转化体通过将具有包括编码所述修饰型β-葡糖苷酶的区域的结构基因序列(修饰型β-葡糖苷酶包含结构基因序列)以及用于使该结构基因表达的启动子序列和终止子序列的表达盒导入裂殖酵母属酵母中而制成。
上述表达盒中可进一步包含1个以上的5’-非翻译区域、3’-非翻译区域。优选的表达盒是修饰型β-葡糖苷酶包含结构基因序列、启动子、终止子、5’-非翻译区域、3’-非翻译区域均包含在内的表达盒。还可具有营养缺陷性互补标记物等基因。
修饰型β-葡糖苷酶包含结构基因序列中的编码修饰型β-葡糖苷酶的区域的碱基序列可通过用基因工程方法对野生型β-葡糖苷酶的结构基因实施反映(变异1)～(变异6)中的至少一种以上的氨基酸置换的碱基置换和根据需要进行的其它修饰来获得。此外，修饰部分以外可直接使用编码来源于丝状菌的β-葡糖苷酶的基因，但为了增大裂殖酵母属酵母内的表达量，较好是将上述基因序列转变为裂殖酵母属酵母的高表达基因中使用频率高的密码子。
该修饰型β-葡糖苷酶包含结构基因序列除了编码修饰型β-葡糖苷酶的区域之外还可具有编码其它肽或蛋白质的区域。该情况下，本发明的转化体中，生产修饰型β-葡糖苷酶的N末端或C末端结合有其它肽等的蛋白质。作为结合于修饰型β-葡糖苷酶的肽，可例举分泌信号和向特定的细胞器的定位信号等信号、His标签和FLAG标签等标签等。各种信号必须是在裂殖酵母属酵母内发挥作用的信号。
分泌信号是具有通过存在于N末端而使表达的蛋白质分泌至宿主细胞外的功能的肽。作为在裂殖酵母属酵母内起作用的分泌信号，特别好是国际公开第1996/23890号中记载的P3信号。
作为该修饰型β-葡糖苷酶包含结构基因序列，较好是编码修饰型β-葡糖苷酶的区域的5’末端侧结合了编码分泌信号的区域的序列。通过在N末端具备分泌信号，由转化体产生的修饰型β-葡糖苷酶分泌至裂殖酵母属酵母的细胞外。被分泌至细胞外的修饰型β-葡糖苷酶可简便地从培养液的上清回收，纯化。
启动子和终止子只要是可在作为宿主的裂殖酵母属酵母内起作用并表达修饰型β-葡糖苷酶的启动子和终止子即可。作为在裂殖酵母属酵母内起作用的启动子，可使用裂殖酵母属酵母本来具有的启动子(较好是转录开始活性高的启动子)或裂殖酵母属酵母本来不具有的启动子(来源于病毒的启动子等)。启动子在载体内可存在2种以上。
作为裂殖酵母属酵母本来具有的启动子，可例举例如乙醇脱氢酶基因启动子、参与硫胺素代谢的nmt1基因启动子、参与葡萄糖代谢的果糖-1,6-二磷酸酶基因启动子、参与分解代谢物抑制的转化酶基因的启动子(参照国际公开第99/23223号)、热休克蛋白基因启动子(参照国际公开第2007/26617号)等。
作为裂殖酵母属酵母本来不具有的启动子，可例举例如日本专利特开平5-15380号公报、日本专利特开平7-163373号公报、日本专利特开平10-234375号公报中记载的来源于动物细胞病毒的启动子，较好是hCMV启动子、SV40启动子。
作为在裂殖酵母属酵母内起作用的终止子，可使用裂殖酵母属酵母本来具有的终止子或裂殖酵母属酵母本来不具有的终止子。终止子在载体内可存在2种以上。
作为终止子，可例举例如日本专利特开平5-15380号公报、日本专利特开平7-163373号公报、日本专利特开平10-234375号公报中记载的来源于人的终止子，较好是人脂皮质蛋白Ⅰ的终止子。
[转化体的制造方法]
本发明的裂殖酵母属酵母的转化体的制造方法(以下称为本发明的转化体的制造方法)的特征在于，通过具有所述表达盒的载体对裂殖酵母属酵母进行转化。
作为宿主的裂殖酵母属酵母、修饰型β-葡糖苷酶、丝状菌、包括修饰型β-葡糖苷酶包含结构基因序列的表达盒如上所述。
(载体)
本发明的转化体的制造中使用的载体包含上述的表达盒。此外，较好是包含选择标记物。例如，较好是使用根据宿主的营养缺陷性整合有所述营养缺陷性互补标记物的载体。
另外，本发明中的载体较好是具有在裂殖酵母属酵母内起作用的分泌信号基因。分泌信号基因的位置为β-葡糖苷酶结构基因的5’末端侧。由5’末端侧结合有分泌信号基因的异种蛋白质结构基因表达出N末端添加有分泌信号的异种蛋白质。该异种蛋白质在分泌信号通过宿主内的内质网和高尔基体等被切断后，除去了分泌信号的异种蛋白质被分泌至细胞外。分泌信号基因(和分泌信号)必须在裂殖酵母属酵母内起作用。作为在裂殖酵母属酵母内起作用的分泌信号基因，可使用例如国际公开第1996/23890号中记载的基因。
本发明的转化体的制造中使用的载体是具有环状DNA结构或线状DNA结构的载体。制造上述表达盒在裂殖酵母属酵母的细胞内作为染色体外基因保持的转化体的情况下，载体较好是包含用于在裂殖酵母属酵母内被复制的序列、即、自主复制序列(Autonomously Replicating Sequence:ARS)的质粒。
另一方面，制造上述表达盒整合到裂殖酵母属酵母的染色体中的转化体的情况下，较好是将载体以线状DNA结构导入宿主。
从继代培养的角度来看，较好是表达盒整合到裂殖酵母属酵母的染色体中的转化体。所整合的表达盒不易脱落，继代中的维持稳定性极高。即，染色体中整合了表达盒的转化体能够以更稳定的生产性制造异种蛋白质。
以下，对用于制造整合到裂殖酵母属酵母的染色体中的转化体的载体进行说明。
对于表达盒向染色体中的整合，从可整合到染色体中的任意位置的角度来看，较好是采用同源重组。
将载体以线状DNA结构导入宿主的情况下，如果是具有通常所用的质粒DNA那样的环状DNA结构的载体，较好是用限制酶将载体切开成线状后导入裂殖酵母属酵母的细胞。该情况下，切开具有环状DNA结构的载体的位置在重组部位内。由此，切开的载体两端分别部分存在重组部位，载体整体通过同源重组被整合至染色体的靶部位。
只要可形成两端分别存在重组部位的一部分的线状DNA结构即可，载体可通过将具有环状DNA结构的载体切开的方法以外的方法、例如采用PCR的酶扩增法或化学合成法来构建。
为了构建本发明中的载体，可优选使用来源于例如pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等大肠杆菌的质粒。使用来源于大肠杆菌的质粒构建的载体通常具有大肠杆菌内的复制所需的被称为“ori”的复制起始点。此外，即使是不采用如上所述的来源于大肠杆菌的质粒的情况下，也可在为了构建本发明中的载体进行扩增而采用大肠杆菌时利用上述“ori”，获得具有“ori”的载体。
用于同源重组时的载体较好是除去了大肠杆菌内的复制所需的被称为“ori”的复制起始点。由此，将上述的载体整合至染色体中时，可使其整合效率提高(参照日本专利特开2000-262284号公报)。
除去了复制起始点的载体的构建方法无特别限定，较好是使用日本专利特开2000-262284号公报中所记载的方法。即，较好是是预先构建在重组部位内的剪切位点插入有复制起始点的前体载体，如上所述在形成线状DNA结构的同时切出复制起始点的方法。由此，可简便地获得除去了复制起始点的载体。
此外，还可以是采用日本专利特开平5-15380号公报、日本专利特开平7-163373号公报、国际公开第96/23890号、日本专利特开平10-234375号公报等中所记载的表达载体及其构建方法，构建具有表达盒和重组部位的前体载体，再通过常规的基因工程方法从该前体载体除去复制起始点而获得用于同源重组的载体的方法。
载体中的表达盒的数量可以是仅1个，也可以是2个以上。本发明的转化体制造中所用的载体较好是具有1～8个表达盒，特别好是1～4个。
如果载体所具有的表达盒的数量为2个以上，则容易增加整合至裂殖酵母属酵母的染色体的表达盒的数量，进一步加大异种蛋白质的表达量。例如，如果载体中的表达盒的数量为2个以上，则裂殖酵母属酵母的染色体的同一位点连续整合有多个表达盒。此外，如果载体所具有的表达盒的数量为8个以下，则容易抑制载体过大而导致基于同源重组的载体的重组效率的下降。如果表达盒的数量为4个以下，则可进一步提高重组效率。
染色体中的后述靶部位的数量多的情况下，即使载体中的表达盒的数量为1个，也可增加所整合的表达盒的数量。此外，有时会在裂殖酵母属酵母的染色体的同一位置整合2个以上的表达盒。
此外，通过使载体中的表达盒的数量为1个且染色体中的后述靶部位的数量为1个，可在各种转化体中使平均每一转化体的修饰型β-葡糖苷酶的表达量一致。例如，评价各种变异的导入对葡糖苷酶活性的影响时，通过使各种转化体的平均每一个的修饰型β-葡糖苷酶的表达量一致，可藉由比较培养的转化体(分泌至细胞外时为培养液上清)的单位干燥重量的葡萄糖活性，对由各转化体生产的修饰型β-葡糖苷酶的葡萄糖活性进行比较评价。
载体的重组部位为具有可对裂殖酵母属酵母的染色体中的同源重组靶部位进行同源重组的碱基序列的部位。此外，靶部位为成为裂殖酵母属酵母的染色体内整合表达盒的目标的部位。靶部位可通过使载体的重组部位为对该靶部位进行同源重组的碱基序列来自由地进行设定。
为了进行同源重组，需要使所述重组部位的碱基序列与靶部位的碱基序列的同源性在70％以上。此外，从容易进行同源重组的角度来看，重组部位的碱基序列与靶部位的碱基序列的同源性较好是在90％以上，更好是在95％以上。通过使用具有这样的重组部位的载体，表达盒通过同源重组被整合到靶部位。
重组部位的长度较好是20～2000bp。如果重组部位的长度在20bp以上，则容易进行同源重组。此外，如果重组部位的长度在2000bp以下，则容易防止载体过长而导致难以进行同源重组。重组部位的长度更好是在100bp以上，进一步更好是在200bp以上。此外，重组部位的长度更好是在800bp以下，进一步更好是在400bp以下。
(宿主的靶部位)
宿主的染色体中仅整合1个所述表达盒的情况下，整合表达盒的靶部位较好是裂殖酵母属酵母所具有的染色体中存在于必需基因不会缺失或失活的染色体的1个位置的靶部位。如果靶部位为1处，则整合于染色体的表达盒的数量恒定，变异株间的比较容易，因此修饰型蛋白质的选择性进一步提高。
上述的必需基因是指该基因缺失或失活时无法生长的基因，是本发明的转化体的生长不可缺少的基因。
宿主的染色体中整合多个所述表达盒的情况下，整合表达盒的靶部位在裂殖酵母属酵母所具有的染色体中较好是(1)存在于各染色体的2处以上的靶部位、或(2)以其间夹有1个以上的必需基因的方式存在于同一染色体的多处的2处以上的靶部位、或同时满足(1)和(2)的多个靶部位。这2处以上的靶部位为具有实质上相同的碱基序列的部位。其中，实质上相同的碱基序列是指各自的靶部位的碱基序列的同源性在90％以上。靶部位之间的同源性较好是在95％以上，更好是在99％以上。
夹着该必需基因导入的表达盒如果脱落，则必需基因也脱落，转化体无法生长。由此，转化体的培养中，表达盒脱落的转化体与表达盒未脱落的转化体一起生长的可能性减小，异种蛋白质的生产效率下降的可能性降低。通常表达盒脱落的转化体的增殖速度快，因此较好是向满足上述(2)的靶部位导入表达盒。
由于像这样靶部位在裂殖酵母属酵母的染色体中分散存在，表达盒分散整合至染色体中，因此所整合的表达盒不易脱落，继代中的维持稳定性极高。因此，可稳定地以高生产性制造异种蛋白质。
此外，通过像这样使碱基序列为实质上相同的靶部位，即使在不同的位置存在多个靶部位，也可通过1种载体向这些靶部位简便地整合载体。
本发明的转化方法中，整合多个表达盒的情况下，较好是整合载体的靶部位在5处以上。如果靶部位在5处以上，则容易使整合至染色体的表达盒的数量增加，因此异种蛋白质的生产性进一步提高。
此外，靶部位更好是10～60处。如果靶部位在10处以上，则容易使整合至染色体的表达盒的数量进一步增加，异种蛋白质的生产性进一步提高。如果靶部位在60处以下，则容易抑制整合至染色体的表达盒过多而使异种蛋白质的表达量减少。
从将表达盒一次性以1种载体整合至分散存在于裂殖酵母属酵母的多个染色体中的靶部位的角度来看，靶部位较好是转座子基因Tf2中的碱基序列。Tf2是在粟酒裂殖酵母中于3条染色体存在合计13处的长度(碱基数)为约4900bp的转座子基因，碱基序列之间的同源性为99.7％(参照Nathan J.Bowen等,Genome Res.200313:1984-1997页)。
但是，靶部位不限于上述的部位。例如，除了转座子基因Tf2以外，可将具有所述重组部位的长度以上的长度且染色体中具有多个实质上相同的碱基序列的部位(基因等)作为靶部位。此外，例如可在染色体中新导入多个具有所述重组部位的长度以上的长度且具有实质上相同的碱基序列的基因(靶部位)而形成靶部位后，向这多个靶部位导入载体。
(转化方法)
使用上述载体，对作为宿主的裂殖酵母属酵母进行转化。转化方法可使用任何公知的裂殖酵母属酵母的转化方法。作为这样的转化方法，可例举例如乙酸锂法、电穿孔法、球状质体法、玻璃珠法等目前公知的方法和日本专利特开2005-198612号公报记载的方法等。此外，还可使用市售的酵母转化用试剂盒。
进行转化后，通常对所得的转化体进行筛选。作为筛选方法，可例举例如以下所示的方法。通过能以所述营养缺陷性标记物选择转化体的培养基进行筛选，从所得的群落选择多个。接着，将它们分别进行液体培养后，考察各种转化体(分泌至细胞外时为培养液上清)中的异种蛋白质的表达量，筛选异种蛋白质的表达量更多的转化体。此外，通过对这些筛选的转化体进行采用脉冲场凝胶电泳法的基因组分析，可考察整合至染色体的载体的数量和表达盒的数量。
(培养方法)
本发明的转化体可与天然的裂殖酵母属酵母同样地进行培养。
用于本发明的转化体的培养的培养液可使用公知的酵母培养培养基，只要包含裂殖酵母属酵母可同化的碳源、氮源、无机盐类等而可高效地进行裂殖酵母属酵母的培养即可。作为培养液，可使用天然培养基，也可使用合成培养基。
作为碳源，可例举例如葡萄糖、果糖、蔗糖等糖。
作为氮源，可例举例如氨、氯化铵和乙酸铵等无机酸或无机酸的铵盐、蛋白胨、酪蛋白氨基酸。
作为无机盐类，可例举例如磷酸镁、硫酸镁、氯化钠。
培养可使用公知的酵母培养方法，可通过例如振荡培养、搅拌培养等进行。
此外，培养温度较好是23～37℃。此外，培养时间可适当确定。
此外，培养可以是分批培养，也可以是连续培养。
本发明的转化体是可生产热稳定性或耐葡萄糖抑制性比野生型β-葡糖苷酶高的修饰型β-葡糖苷酶的裂殖酵母属酵母。该转化体可生产修饰型β-葡糖苷酶，因此可对纤维二糖进行同化。
[β-葡糖苷酶的制造方法]
从对本发明的转化体进行培养而得的菌体中，可以获得修饰型β-葡糖苷酶。培养转化体而从培养液或菌体分离修饰型β-葡糖苷酶的情况下，可使用公知的蛋白质分离方法。例如，可在培养后将菌体从培养液分离，破坏菌体而获得含修饰型β-葡糖苷酶的细胞破碎液，从该细胞破碎液用例如盐析、柱纯化、色谱法、免疫沉淀等公知的蛋白质分离方法获得修饰型β-葡糖苷酶。
导入了包含在编码修饰型β-葡糖苷酶的区域的5’末端附加有编码分泌信号的区域的结构基因序列的表达盒的转化体的情况下，由转化体生产的修饰型β-葡糖苷酶被分泌至细胞外。于是，可使用公知的蛋白质分离方法从培养液上清获得修饰型β-葡糖苷酶。此外，也可以重复进行从培养了一定时间的培养液通过离心等回收含修饰型β-葡糖苷酶的培养上清并向剩下的菌体加入培养液进行培养的操作，连续地培养转化体而使其产生β-葡糖苷酶。
[纤维素的降解方法]
本发明的纤维素的降解方法使用从培养上述本发明的裂殖酵母属酵母的转化体而得的菌体或培养物获得的修饰型β-葡糖苷酶。
对作为降解对象的纤维素的形态无特别限定，可以是纯化纤维素，也可以是木材或稻草、稻壳、杂草等生物质中所含的纤维素。
作为具体的纤维素的降解方法，可例举例如下述方法：培养转化体，从培养液上清或菌体分离或纯化修饰型β-葡糖苷酶，与含纤维素的生物质和内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶一起进行孵育。使用将转化体产生的产物分离、纯化而得的修饰型β-葡糖苷酶降解纤维素的情况下，反应条件可使用公知的β-葡糖苷酶的反应条件。采用修饰型β-葡糖苷酶的降解反应液中的优选pH为3.0～8.0，优选的反应温度为20～65℃。
还可以不从含修饰型β-葡糖苷酶的培养液上清或细胞破碎液分离修饰型β-葡糖苷酶，使该培养液上清或细胞破碎液直接与作为降解对象的纤维素接触。例如使用导入了在编码修饰型β-葡糖苷酶的区域的5’末端具有编码分泌信号的区域的表达盒的转化体的情况下，也可以在存在纤维素的培养液中培养转化体，通过分泌至培养液的修饰型β-葡糖苷酶降解培养液中的纤维素。作为具体的纤维素的降解方法，可例举例如在上述生物质的存在下培养上述转化体的方法和混合与上述生物质培养的上述转化体进行孵育的方法等。该情况下，培养条件可采用裂殖酵母属酵母的一般的培养条件。培养液的优选pH为3.0～8.0，优选的培养温度为23～37℃。
实施例
以下，示出实施例和比较例对本发明进行详细说明。但是，本发明并不受到下述记载的限定。
[实施例1]
<产生AaBGL1的粟酒裂殖酵母的转化体的制备>
由以序列编号1表示的AaBGL1肽序列设计以粟酒裂殖酵母的高表达型密码子置换的基因序列(参照序列编号2，以下称为AaBGL1基因)。在起始密码子前添加KpnⅠ、BspHⅠ识别序列。在终止密码子后添加XbaⅠ、SacⅠ识别序列。将含该序列的质粒(由德国雷根斯堡的基因工艺公司(ジーンアート社)合成)用限制酶BspHⅠ、XbaⅠ消化。
另一方面，在其同时另外将pSL6lacZ用限制酶AarⅠ、XbaⅠ消化，进行碱性磷酸酶处理。该处理后，在琼脂糖凝胶上进行电泳，从琼脂糖凝胶切出载体pSL6片段和上述的AaBGL1基因片段，进行连接后导入大肠杆菌DH5α(宝生物技术株式会社(タカラバイオ社)制)进行转化。通过所得的转化体制备载体，获得作为目标的表达载体pSL6AaBGL1(参照图3、序列编号3)。根据限制酶图谱的绘制确认为目标载体。
此外，为了制备对删除了所述AaBGL1的N末端的19氨基酸的缺失体在N末端附加作为分泌信号的P3信号而得的P3AaBGL1(参照序列编号4)，将pSL6AaBGL1作为模板用In-fusion引物通过PCR法扩增AaBGL1基因片段。另一方面，用限制酶AflⅡ、XbaⅠ消化pSL6P3lacZ。将该片段和通过PCR得到的上述AaBGL1基因片段用In-fusion法环化后，导入大肠杆菌DH5α进行转化。通过所得的转化体制备载体，获得作为目标的表达载体pSL6P3AaBGL1(参照图4、序列编号5)。根据限制酶图谱的绘制和部分碱基序列的确认而确认为目标载体。
使作为宿主的粟酒裂殖酵母的亮氨酸缺陷株(基因型:h-、leu1-32，东京大学研究生院理学系研究科附属基因实验设施的饭野雄一教授提供)(ATCC38399)用YES(0.5％酵母提取物、3％葡萄糖、0.1mg/ml SP补充剂)培养基生长至0.6×107细胞数/ml。集菌并清洗后，按照1.0×108细胞数/ml的条件悬浮于0.1M乙酸锂(pH5.0)。然后，向100μl悬浮液中加入1μg将上述中得到的载体pSL6P3AaBGL1用限制酶NotⅠ消化而得的产物，再加入290μl50％(w/v)聚乙二醇(PEG4000)水溶液充分搅拌后，按照30℃下60分钟、42℃下5分钟、室温下10分钟的顺序孵育。通过离心除去PEG4000，清洗后悬浮于150μl的灭菌水，涂布于极限琼脂培养基。
3天后，将所得的转化体(AaBGL1表达株)作为ASP3326株。
<易错PCR片段的制备>
将pSL6P3AaBGL1作为模板，使用以序列编号6表示的引物和以序列编号7表示的引物通过易错PCR法扩增P3AaBGL1基因片段。易错PCR使用多种PCR随机突变试剂盒(Diversify PCR Random Mutagenesis Kit)(克隆泰克公司(Clontech社)制)。另一方面，另外将pSL6P3AaBGL1作为模板，使用以序列编号8表示的引物和以序列编号9表示的引物通过PCR法扩增leu1+启动子片段。此外，另外将pSL6P3AaBGL1作为模板，使用以序列编号10表示的引物和以序列编号11表示的引物通过PCR法扩增终止子top2片段。PCR法使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶(PrimeSTAR Max DNA polymerase)(宝生物技术株式会社制)。
向这3种片段的反应溶液中加入限制酶DpnⅠ，消化模板后，为了置换引物，使用SUPREC-PCR(宝生物技术株式会社制)进行纯化。使用50ng纯化后的3种片段和以序列编号12表示的引物及以序列编号13表示的引物通过PCR法扩增使leu1+启动子-变异型P3AaBGL1-终止子top2融合而得的变异基因整合片段。然后，通过SUPREC-PCR进行柱纯化。
<转化体的制备>
使作为宿主的粟酒裂殖酵母的亮氨酸缺陷株(基因型:h-、leu1-32，东京大学研究生院理学系研究科附属基因实验设施的饭野雄一教授提供)(ATCC38399)用YES(0.5％酵母提取物、3％葡萄糖、0.1mg/ml SP补充剂)培养基生长至0.6×107细胞数/ml。集菌并清洗后，按照2×108细胞数/ml的条件悬浮于0.1M乙酸锂(pH5.0)。然后，向100μl悬浮液中加入1μg将上述中得到的leu1+启动子-变异型P3AaBGL1-终止子top2片段，再加入290μl50％(w/v)聚乙二醇(PEG4000)水溶液充分搅拌后，按照30℃下60分钟、加入43μl DMSO后42℃下5分钟、室温下10分钟的顺序孵育。通过离心除去PEG4000，清洗后悬浮于150μl的灭菌水，涂布于极限琼脂培养基。极限琼脂培养基的组成示于表1～6。
通过使极限琼脂培养基的碳源为0.1％葡萄糖和2％纤维二糖，由于仅活性型的P3AaBGL1变异株可将纤维二糖作为碳源，菌落的形成大，可仅筛选保持活性的P3AaBGL1变异株。
5天后，可获得转化体(P3AaBGL1变异株)。将其作为P3AaBGL1变异株文库。
[表1]
10×MA组成
邻苯二甲酸氢钾 3g
Na2HPO4 2.2g
NH4Cl 5g
水 至1000ml
[表2]
盐储备溶液组成
MgCl26H2O 53.3g
CaCl22H2O 0.735g
KCl 50g
Na2SO4 2g
水 至1000ml
[表3]
矿物质储备溶液组成
H3BO3 500mg
MnSO45H2O 530mg
ZnSO47H2O 400mg
FeCl36H2O 200mg
Na2MoO42H2O 200mg
KI 100rug
CuSO45H2O 40mg
柠檬酸二氢钾 1000mg
水 至1000ml
[表4]
维生素储备溶液组成
泛酸钙 0.01g
烟酸 0.10g
肌醇 0.10g
水 至10ml
[表5]
生物素储备溶液组成
生物素 0.001g
水 至10ml
[表6]
极限琼脂培养基组成
10×MA 100ml
盐储备溶液 20ml
矿物质储备溶液 1ml
维生素储备溶液 1ml
生物素储备溶液 1ml
葡萄糖* 20g
琼脂 30g
水 880ml
<极限琼脂培养基的碳源研究>
通过使极限琼脂培养基的碳源(表6中的*标记)为0.1％葡萄糖和2％纤维二糖，仅活性型的P3AaBGL1变异株(产生具有葡萄糖活性的AaBGL1变异体的转化体)可将纤维二糖作为碳源。因此，如下所述，通过用极限琼脂培养基培养转化体，菌落的形成大，可仅筛选保持活性的P3AaBGL1变异株。
与2％葡萄糖的情况进行P3AaBGL1变异株的菌落形成和BGL活性的有无。按照下述的活性测定法对用碳源为葡萄糖的极限琼脂培养基形成的P3AaBGL1变异株测定活性，结果全部菌落中具有BGL活性的变异株为26.5％。与之相对，用碳源为0.1％葡萄糖和2％纤维二糖的极限琼脂培养基形成的P3AaBGL1变异株中70.5％的P3AaBGL1变异株的菌落形成小。按照下述的活性测定法对菌落形成较大的余下的P3AaBGL1变异株测定活性，结果其中83.9％的AaBGL1变异株可检出BGL活性。即，通过用碳源为0.1％葡萄糖和2％纤维二糖的极限琼脂培养基选择性获得菌落形成大的P3AaBGL1变异株，可除去失活的P3AaBGL1变异株。此外，碳源仅2％纤维二糖的情况下，转化体的获得效率极低，难以获得大量的变异株。这被认为是由于没有用于保持活性的变异型P3AaBGL1的表达的碳源，因而无法同化纤维二糖。
<自P3AaBGL1变异株文库的筛选>
自P3AaBGL1变异株文库，将菌落形成大的变异株和作为原株的P3ASP3326株用150μl/孔的YES培养基(96孔板)在30℃培养2天。将50μl该培养上清用150μl50mM乙酸缓冲液(pH5.0)稀释而制成酶稀释样品，按照下述方法进行活性测定。
(活性测定法)
向10μl20mM对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(以下略作pNPG)中加入10μl1M乙酸钠缓冲液(pH5.0)和130μl水，添加50μl酶稀释样品，在37℃使其反应10分钟。向100μl2％碳酸钠溶液中加入100μl反应液使反应停止，以450nm的波长对游离的对硝基苯酚量进行比色定量。
将每1分钟生成相当于1μmol的对硝基苯酚的酶量设为1U。
(葡萄糖抑制测定)
向10μl20mM pNPG中加入10μl1M乙酸钠缓冲液(pH5.0)和4μl～10μl(最终浓度20mM～50mM)1M葡萄糖，用水定容至150μl后，添加50μl酶稀释样品，在37℃使其反应10分钟。作为对照，使用未添加葡萄糖的反应液，同样地在37℃使其反应10分钟。向100μl各反应液中加入100μl2％碳酸钠溶液使反应停止，以450nm的波长对游离的对硝基苯酚量进行比色定量。
将以对照样品(未添加葡萄糖的样品)的比色定量值为100％时的各反应液的比色定量值的比例(％)作为葡萄糖抑制时的残存活性。将各变异体的该残存活性与ASP3326株的结果比较，选择耐葡萄糖抑制性变化了的变异株。
(热稳定性测定)
向10μl20mM pNPG中加入10μl1M乙酸钠缓冲液(pH5.0)和130μl水，添加在65℃～70℃进行了10分钟热处理的50μl酶稀释样品，在37℃使其反应10分钟。作为对照，使用未进行热处理的酶稀释样品，同样地在37℃使其反应10分钟。向100μl各反应液中分别加入100μl2％碳酸钠溶液使反应停止，以450nm的波长对游离的对硝基苯酚量进行比色定量。
将以对照样品(未处理样品)的比色定量值为100％时的各反应液的比色定量值的比例(％)作为热处理后的残存活性。将各变异体的该残存活性与ASP3326株的结果比较，选择热稳定性提高了的变异株。
<获得变异株的培养>
将上述中得到的P3AaBGL1变异株用YES培养基在30℃培养1天。将100μl该培养液移种至5ml的YPD培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)，在30℃培养2天。将该培养液离心分离而获得培养上清。
<获得变异株的评价>
使用上述中得到的P3AaBGL1变异株的培养上清，制备酶稀释样品，按照上述的活性测定法测定活性。此外，进行最终浓度0.1mM～200mM的葡萄糖抑制测定和保温温度50℃～75℃的热稳定性测定进行评价。
<修饰型P3AaBGL1基因的获得>
上述中得到的P3AaBGL1变异株中，选择葡糖苷酶活性的耐葡萄糖抑制性和热稳定性与ASP3326株相比变化了的P3AaBGL1变异株。将100μl所选择的P3AaBGL1变异株的培养液离心分离，回收菌体。以酵母裂解酶处理后的菌体为模板，用以序列编号14表示的引物和以序列编号15表示的引物、PrimeSTAR Max DNA聚合酶通过PCR法扩增重组基因片段。然后，以该片段为模板用In-fusion引物(以序列编号16表示的引物和以序列编号17表示的引物)通过PCR法扩增P3AaBGL1变异基因片段。另一方面，用限制酶AflⅡ、XbaⅠ消化pSL6P3lacZ。将该片段和通过PCR得到的上述P3AaBGL1变异基因片段用In-fusion法环化后，导入大肠杆菌DH5α进行转化。通过所得的转化体制备载体，获得表达载体pSL6P3AaBGL1mutXX(XX为变异株名)。
确认pSL6P3AaBGL1mutXX载体和P3AaBGL1变异基因片段的P3AaBGL1基因内的碱基序列，特定变异导入点。
独立重复以上的操作4次，结果获得7个对所得的修饰型P3AaBGL1基因的葡糖苷酶活性的耐葡萄糖抑制性和热稳定性造成影响的变异被导入至P3AaBGL1的P3AaBGL1变异株。对于该P3AaBGL1变异株产生的变异型P3AaBGL1和P3AaBGL1，导入至P3AaBGL1的变异、葡糖苷酶活性、培养液中的葡萄糖浓度为20mM和50mM时的葡糖苷酶活性的残存活性(相对于培养液中的葡萄糖浓度为0mM时的葡糖苷酶活性的相对值)、将培养液在65℃和67℃保温10分钟后的葡糖苷酶活性的残存活性(相对于酶反应前的培养液的未进行热处理时的葡糖苷酶活性的相对值)示于表7。表中，“活性”表示葡糖苷酶活性，右栏的“缄默”表示各变异缄默的数量。此外，表中的“w.t.”表示ASP3326株的结果。其结果是，推测P3AaBGL1的Q142(与第142个的谷氨酰胺、AaBGL1的第126个的谷氨酰胺对应)、Q156(与第156个的谷氨酰胺、AaBGL1的第140个的谷氨酰胺对应)、I260(与第260个的异亮氨酸、AaBGL1的第244个的异亮氨酸对应)、G298(与第298个的甘氨酸、AaBGL1的第282个的甘氨酸对应)、N458(与第458个的天门冬酰胺、AaBGL1的第442个的天门冬酰胺对应)、G468(与第468个的甘氨酸、AaBGL1的第452个的甘氨酸对应)、V519(与第519个的缬氨酸、AaBGL1的第503个的缬氨酸对应)和R629(与第629个的精氨酸、AaBGL1的第613个的精氨酸对应)与耐葡萄糖抑制性或热稳定性相关。
[表7]
Figure BDA0000383392930000261
[实施例2]
<G298X定点饱和突变片段的制备>
进行使用简并引物的G298的特异性氨基酸置换。将pSL6P3AaBGL1作为模板，使用以序列编号8表示的引物和以序列编号18表示的引物通过PCR法扩增leu1+-G298X片段。另一方面，使用以序列编号19表示的引物和以序列编号11表示的引物通过PCR法扩增G298X-top2片段。
向这2种片段的反应溶液中加入限制酶Dpn Ⅰ，消化模板后，为了置换引物，使用SUPREC-PCR进行纯化。使用50ng纯化后的2种片段以及以序列编号12表示的引物和以序列编号13表示的引物通过PCR法扩增leu1+-G298X-top2片段。然后，通过SUPREC-PCR进行柱纯化。
<定点饱和突变株的获得>
除了使用上述leu1+-G298X-top2片段作为变异基因整合片段以外，与实施例1同样地制备变异株，进行所得的变异株的培养上清的葡萄糖抑制测定和保温温度50℃～75℃的热稳定性测定，筛选任一活性与ASP3326株相比变化了的变异株，确认所筛选的变异株的染色体中整合的P3AaBGL1基因内的碱基序列，特定第298个的氨基酸。其结果是，耐葡萄糖抑制性或热稳定性与ASP3326株相比变化了的P3AaBGL1变异株中，第298个的氨基酸为丝氨酸、苯丙氨酸或脯氨酸。
[实施例3]
<V519X定点包含突变片段的制备>
进行使用简并引物的V519的特异性氨基酸置换。将pSL6P3AaBGL1作为模板，使用以序列编号8表示的引物和以序列编号20表示的引物通过PCR法扩增leu1+-V519X片段。另一方面，使用以序列编号21表示的引物和以序列编号11表示的引物通过PCR法扩增V519X-top2片段。
向这2种片段的反应溶液中加入限制酶Dpn Ⅰ，消化模板后，为了置换引物，使用SUPREC-PCR进行纯化。使用50ng纯化后的2种片段以及以序列编号12表示的引物和以序列编号13表示的引物通过PCR法扩增leu1+-V519X-top2片段。然后，通过SUPREC-PCR进行柱纯化。
<定点饱和突变株的获得>
除了使用上述leu1+-V519X-top2片段作为变异基因整合片段以外，与实施例1同样地制备变异株，进行所得的变异株的培养上清的葡萄糖抑制测定和保温温度50℃～75℃的热稳定性测定，筛选任一活性与ASP3326株相比变化了的变异株，确认所筛选的变异株的染色体中整合的P3AaBGL1基因内的碱基序列，特定第519个的氨基酸。其结果是，耐葡萄糖抑制性或热稳定性与ASP3326株相比变化了的P3AaBGL1变异株中，第519个的氨基酸为丙氨酸、甘氨酸或半胱氨酸。
[实施例4]
<Q142X定点包含突变片段的制备>
进行使用简并引物的Q142的特异性氨基酸置换。将pSL6P3AaBGL1作为模板，使用以序列编号8表示的引物和以序列编号22表示的引物通过PCR法扩增leu1+-Q142X片段。另一方面，使用以序列编号23表示的引物和以序列编号11表示的引物通过PCR法扩增Q142X-top2片段。
向这2种片段的反应溶液中加入限制酶Dpn Ⅰ，消化模板后，为了置换引物，使用SUPREC-PCR进行纯化。使用50ng纯化后的2种片段以及以序列编号12表示的引物和以序列编号13表示的引物通过PCR法扩增leu1+-Q142X-top2片段。然后，通过SUPREC-PCR进行柱纯化。
<定点饱和突变株的获得>
除了使用上述leu1+-Q142X-top2片段作为变异基因整合片段以外，与实施例1同样地制备变异株，进行所得的变异株的培养上清的葡萄糖抑制测定和保温温度50℃～75℃的热稳定性测定，筛选任一活性与ASP3326株相比变化了的变异株，确认所筛选的变异株的染色体中整合的P3AaBGL1基因内的碱基序列，特定第142个的氨基酸。其结果是，耐葡萄糖抑制性或热稳定性与ASP3326株相比变化了的P3AaBGL1变异株中，第142个的氨基酸为天门冬酰胺或精氨酸。
[实施例5]
<G468X定点包含突变片段的制备>
进行使用简并引物的G468的特异性氨基酸置换。将pSL6P3AaBGL1作为模板，使用以序列编号8表示的引物和以序列编号24表示的引物通过PCR法扩增leu1+-G468X片段。另一方面，使用以序列编号25表示的引物和以序列编号11表示的引物通过PCR法扩增G468X-top2片段。
向这2种片段的反应溶液中加入限制酶Dpn Ⅰ，消化模板后，为了置换引物，使用SUPREC-PCR进行纯化。使用50ng纯化后的2种片段以及以序列编号12表示的引物和以序列编号13表示的引物通过PCR法扩增leu1+-G468X-top2片段。然后，通过SUPREC-PCR进行柱纯化。
<定点饱和突变株的获得>
除了使用上述leu1+-G468X-top2片段作为变异基因整合片段以外，与实施例1同样地制备变异株，进行所得的变异株的培养上清的葡萄糖抑制测定和保温温度50℃～75℃的热稳定性测定，筛选任一活性与ASP3326株相比变化了的变异株，确认所筛选的变异株的染色体中整合的P3AaBGL1基因内的碱基序列，特定第468个的氨基酸。其结果是，耐葡萄糖抑制性或热稳定性与ASP3326株相比变化了的P3AaBGL1变异株中，第468个的氨基酸为丝氨酸。
实施例2～5中得到的各变异株的导入至P3AaBGL1的变异、葡糖苷酶活性、培养液中的葡萄糖浓度为20mM和50mM时的葡糖苷酶活性的残存活性(相对值)以及将培养液在65℃和67℃保温10分钟后的葡糖苷酶活性的残存活性(相对值)示于表8。
[表8]
Figure BDA0000383392930000291
其结果是，可知通过G298F(将第298个的甘氨酸置换为苯丙氨酸)，P3AaBGL1的耐葡萄糖抑制性提高，热稳定性下降。此外，可知通过V519A(将第519个的缬氨酸置换为丙氨酸)，P3AaBGL1的耐葡萄糖抑制性不受影响，热稳定性显著改善。此外，可知通过G468S(将第468个的甘氨酸置换为丝氨酸)，耐葡萄糖抑制性提高，热稳定性下降。另外，提示通过Q142N(将第142个的谷氨酰胺置换为天门冬酰胺)，P3AaBGL1的热稳定性得到改善。
[实施例6]
<采用StEP法的变异基因的合并>
以2种或数种pSL6P3AaBGL1mutXX载体(共计1ng)为模板，使用以序列编号6表示的引物和以序列编号7表示的引物以及PrimeSTAR HS DNA聚合酶(宝生物技术株式会社)，以Zhao等的StEP法(Huimin Zhao，《酶学方法(METHODSIN ENZYMOLOGY)》，388卷，42-49页，2004)为基础，PCR条件为98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下20秒(2.6kb)进行30个循环后，98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下3分钟(2.6kb)进行5个循环来扩增P3AaBGL1基因片段。另一方面，另外将pSL6P3AaBGL1作为模板，使用以序列编号8表示的引物和以序列编号9表示的引物通过PCR法扩增leu1+启动子片段。此外，另外将pSL6P3AaBGL1作为模板，使用以序列编号10表示的引物和以序列编号11表示的引物通过PCR法扩增终止子top2片段。PCR法使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶(宝生物技术株式会社制)。
向这3种片段的反应溶液中加入限制酶Dpn Ⅰ，消化模板后，为了置换引物，使用SUPREC-PCR(宝生物技术株式会社制)进行纯化。使用50ng纯化后的3种片段以及以序列编号12表示的引物和以序列编号13表示的引物通过PCR法扩增leu1+启动子-P3AaBGL1-终止子top2片段。然后，通过SUPREC-PCR进行柱纯化。
<StEP变异合并株的获得>
除了使用上述中得到的片段作为变异基因整合片段以外，与实施例1同样地制备变异株，进行所得的变异株的培养上清的葡萄糖抑制测定和保温温度50℃～75℃的热稳定性测定，筛选任一活性与ASP3326株相比变化了的变异株，确认所筛选的变异株的染色体中整合的P3AaBGL1基因内的碱基序列。
所得的各变异株的导入至P3AaBGL1的变异、葡糖苷酶活性、培养液中的葡萄糖浓度为20mM和50mM时的葡糖苷酶活性的残存活性以及将培养液在65℃和67℃保温10分钟后的葡糖苷酶活性的残存活性示于表9。
[表9]
Figure BDA0000383392930000311
[实施例7]
<定点饱和突变片段的制备>
以pSL6P3AaBGL1mut27A10载体为模板，使用简并引物，进行向Q142N和G468S的特异性氨基酸置换。
进行Q142N的特异性氨基酸置换的情况下，具体来说，使用以序列编号8表示的引物和以序列编号22表示的引物通过PCR法扩增leu1+-Q142X片段。另一方面，使用以序列编号23表示的引物和以序列编号11表示的引物通过PCR法扩增Q142N-top2片段。
向这2种片段的反应溶液中加入限制酶Dpn Ⅰ，消化模板后，为了置换引物，使用SUPREC-PCR进行纯化。使用50ng纯化后的2种片段以及以序列编号12表示的引物和以序列编号13表示的引物通过PCR法扩增leu1+-Q142N-top2片段。然后，通过SUPREC-PCR进行柱纯化。
此外，进行向G468S的特异性氨基酸置换的情况下，使用以序列编号7表示的引物和以序列编号24表示的引物通过PCR法扩增leu1+-Q142X片段。另一方面，使用以序列编号25表示的引物和以序列编号11表示的引物通过PCR法扩增G468S-top2片段。
向这2种片段的反应溶液中加入限制酶Dpn Ⅰ，消化模板后，为了置换引物，使用SUPREC-PCR进行纯化。使用50ng纯化后的2种片段以及以序列编号12表示的引物和以序列编号13表示的引物通过PCR法扩增leu1+-G468S-top2片段。然后，通过SUPREC-PCR进行柱纯化。
<定点饱和突变株的获得>
除了使用上述各片段作为变异基因整合片段以外，与实施例1同样地制备变异株，确认所得的变异株的P3AaBGL1基因内的碱基序列，进行培养上清的葡萄糖抑制测定和保温温度50℃～75℃的热稳定性测定。
所得的各变异株的导入至P3AaBGL1的变异、葡糖苷酶活性、培养液中的葡萄糖浓度为20mM和50mM时的葡糖苷酶活性的残存活性以及将培养液在65℃和67℃保温10分钟后的葡糖苷酶活性的残存活性示于表10。
[表10]
[实施例8]
对产生野生型P3AaBGL1的变异株、变异株11F10、变异株22A12、变异株29F09、变异株28C02株分别进行培养，进行培养上清的葡萄糖抑制测定和保温温度50℃～75℃的热稳定性测定。测定结果示于图5。图5(A)将葡萄糖浓度为0mM时的葡萄糖苷酶活性设为100％，示出各葡萄糖浓度下的各培养上清的葡糖苷酶活性的残存活性。图5(B)将酶反应前的未加热处理时的葡萄糖苷酶活性设为100％，示出各温度下的各培养上清的葡糖苷酶活性的残存活性。
[实施例9]
根据实施例1～7的结果，提示Q142N(将第142个的谷氨酰胺置换为天门冬氨酸)、Q156L(将第156个的谷氨酰胺置换为亮氨酸)、I120F(将第120个的异亮氨酸置换为苯丙氨酸)、G298F(将第298个的甘氨酸置换为苯丙氨酸)、N458S(将第458个的天门冬酰胺置换为丝氨酸)、G468S(将第468个的甘氨酸置换为丝氨酸)、V519A(将第519个的缬氨酸置换为丙氨酸)、R629L(将第629个的精氨酸置换为亮氨酸)与AaBGL1的耐葡萄糖抑制性或热稳定性相关。于是，对于P3AaBGL1中仅导入了各变异的变异株，更具体地对耐葡萄糖抑制性和热稳定性进行了考察。
<部位特异性变异片段的制备>
首先，制成仅导入了Q156L、I120F、N458S或R629L的变异株。
进行使用引物的Q156L的特异性氨基酸置换。将pSL6P3AaBGL1作为模板，使用以序列编号8表示的引物和以序列编号26表示的引物通过PCR法扩增leu1+-Q156L片段。另一方面，使用以序列编号27表示的引物和以序列编号11表示的引物通过PCR法扩增Q156L-top2片段。
向这2种片段的反应溶液中加入限制酶Dpn Ⅰ，消化模板后，为了置换引物，使用SUPREC-PCR进行纯化。使用50ng纯化后的2种片段以及以序列编号12表示的引物和以序列编号13表示的引物通过PCR法扩增leu1+-Q156L-top2片段。然后，通过SUPREC-PCR进行柱纯化。
进行使用引物的I120F的特异性氨基酸置换。将pSL6P3AaBGL1作为模板，使用以序列编号8表示的引物和以序列编号28表示的引物通过PCR法扩增leu1+-I120F片段。另一方面，使用以序列编号29表示的引物和以序列编号11表示的引物通过PCR法扩增I120F-top2片段。
向这2种片段的反应溶液中加入限制酶Dpn Ⅰ，消化模板后，为了置换引物，使用SUPREC-PCR进行纯化。使用50ng纯化后的2种片段以及以序列编号12表示的引物和以序列编号13表示的引物通过PCR法扩增leu1+-I120F-top2片段。然后，通过SUPREC-PCR进行柱纯化。
进行使用引物的N458S的特异性氨基酸置换。将pSL6P3AaBGL1作为模板，使用以序列编号8表示的引物和以序列编号30表示的引物通过PCR法扩增leu1+-N458S片段。另一方面，使用以序列编号31表示的引物和以序列编号11表示的引物通过PCR法扩增N458S-top2片段。
向这2种片段的反应溶液中加入限制酶Dpn Ⅰ，消化模板后，为了置换引物，使用SUPREC-PCR进行纯化。使用50ng纯化后的2种片段以及以序列编号12表示的引物和以序列编号13表示的引物通过PCR法扩增leu1+-N458S-top2片段。然后，通过SUPREC-PCR进行柱纯化。
进行使用引物的R629L的特异性氨基酸置换。将pSL6P3AaBGL1作为模板，使用以序列编号8表示的引物和以序列编号32表示的引物通过PCR法扩增leu1+-R629L片段。另一方面，使用以序列编号33表示的引物和以序列编号11表示的引物通过PCR法扩增R629L-top2片段。
向这2种片段的反应溶液中加入限制酶Dpn Ⅰ，消化模板后，为了置换引物，使用SUPREC-PCR进行纯化。使用50ng纯化后的2种片段以及以序列编号12表示的引物和以序列编号13表示的引物通过PCR法扩增leu1+-R629L-top2片段。然后，通过SUPREC-PCR进行柱纯化。
<定点饱和突变株的获得>
除了使用上述各片段作为变异基因整合片段以外，与实施例1同样地制备变异株，确认所得的变异株的P3AaBGL1基因内的碱基序列。
<葡糖苷酶活性、耐葡萄糖抑制性和热稳定性的评价>
与实施例1同样地进行各变异株的培养上清的葡萄糖抑制测定和保温温度50℃～75℃的热稳定性测定。结果示于表11。
[表11]
Figure BDA0000383392930000361
其结果是，可知通过I260F，P3AaBGL1的耐葡萄糖抑制性和热稳定性均提高。此外，可知通过G298F和G468S，P3AaBGL1的耐葡萄糖抑制性提高，热稳定性下降。另外，可知通过N458S、V519A和R629L，未使P3AaBGL1的耐葡萄糖抑制性下降，热稳定性得到改善。此外，可知通过Q156L，P3AaBGL1的耐葡萄糖抑制性和热稳定性均下降。
P3AaBGL1的这些变异部位中，第468个的甘氨酸和第519个的缬氨酸在β-葡糖苷酶间具有非常高的保守性。此外，与第260个的异亮氨酸、第298个的甘氨酸、第458个的天门冬酰胺或第629个的精氨酸对应的氨基酸在各β-葡糖苷酶间侧链的大小和极性类似，且该氨基酸的前后为保守性非常高的区域。因此，这些氨基酸被认为均很有可能是对β-葡糖苷酶的活性重要的氨基酸，通过将这些氨基酸与P3AaBGL1同样地进行置换，与本实施例的P3AaBGL1同样，各β-葡糖苷酶的活性也受到影响。
[实施例10]
<变异型P3AaBGL1的纯化>
变异株中，将11F10株、22A12株、28C02株、29F09株和mutBGL1株以及作为亲株的ASP3326株用YPD培养基100ml/坂口烧瓶在30℃培养2天。向该培养上清中按照80％饱和硫酸铵的条件添加硫酸铵，在4℃进行2小时的硫铵沉淀。用离心分离回收颗粒，使其溶解于10ml10mM柠檬酸-磷酸缓冲液(pH7.0)，用100000MWCO超滤膜脱盐、浓缩，获得1ml的粗纯化液。将粗纯化液用Hitrap QXL柱纯化，回收pNPG活性的峰部分，作为纯化样品。通过10mM柠檬酸-磷酸缓冲液(pH7.0)、NaCl盐浓度梯度(0-1M)溶出。
<纯化变异型P3AaBGL1的性状分析>
与实施例1同样地对葡萄糖浓度0.1mM～200mM的葡萄糖抑制产生的残存活性进行测定。此外，对在50℃～75℃进行10分钟的热处理后的残存活性进行测定。其结果是，作为耐葡萄糖抑制性改善型P3AaBGL1的11F10株在50mM葡萄糖的存在下具有53％的活性。作为热稳定性改善型P3AaBGL1的22A12株在65℃具有80％左右的残存活性。此外，作为耐葡萄糖抑制性改善及热稳定性改善型P3AaBGL1的mutBGL1株在50mM葡萄糖的存在下具有60％的活性，在65℃具有45％左右的残存活性。
产业上利用的可能性
由本发明的转化体获得的β-葡糖苷酶可用于纤维素的酶糖化。此外，本发明的转化体可表达具有分泌信号的β-葡糖苷酶的情况下，β-葡糖苷酶被分泌至培养液中，因而通过在存在纤维素的培养液中培养该转化体，可对该培养液中的纤维素进行酶糖化。
另外，在这里引用2011年3月24日提出申请的日本专利申请2011-066539号的说明书、权利要求书、摘要和附图的所有内容，作为本发明说明书的揭示采用。
Figure IDA0000383392990000011
Figure IDA0000383392990000021
Figure IDA0000383392990000051
Figure IDA0000383392990000071
Figure IDA0000383392990000091
Figure IDA0000383392990000111
Figure IDA0000383392990000121
Figure IDA0000383392990000151
Figure IDA0000383392990000161
Figure IDA0000383392990000171
Figure IDA0000383392990000181
Figure IDA0000383392990000191
Figure IDA0000383392990000201

Claims (15)

1.裂殖酵母(schizosaccharomyces)属酵母的转化体，其特征在于，在染色体中或作为染色体外基因具有包括编码下述修饰型β-葡糖苷酶的区域的结构基因序列以及用于使该结构基因表达的启动子序列和终止子序列；
修饰型β-葡糖苷酶:作为存在选自下述变异1～变异6的至少一种变异的来源于丝状菌的β-葡糖苷酶，热稳定性或耐葡萄糖抑制性比不具有所述变异的来源于丝状菌的β-葡糖苷酶高的β-葡糖苷酶；
变异1:与位于AaBGL1(棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的BGL1)的第244个的异亮氨酸对应的氨基酸被置换为苯丙氨酸的变异；
变异2:与位于AaBGL1的第282个的甘氨酸对应的氨基酸被置换为苯丙氨酸的变异；
变异3:与位于AaBGL1的第442个的天门冬酰胺对应的氨基酸被置换为丝氨酸的变异；
变异4:与位于AaBGL1的第452个的甘氨酸对应的氨基酸被置换为丝氨酸的变异；
变异5:与位于AaBGL1的第503个的缬氨酸对应的氨基酸被置换为丙氨酸的变异；
变异6:与位于AaBGL1的第613个的精氨酸对应的氨基酸被置换为亮氨酸的变异。
2.如权利要求1所述的转化体，其特征在于，所述来源于丝状菌的β-葡糖苷酶为BGL1。
3.如权利要求1或2所述的转化体，其特征在于，所述丝状菌为曲霉(Aspergillus)属的微生物。
4.如权利要求1～3中的任一项所述的转化体，其特征在于，所述来源于丝状菌的β-葡糖苷酶是与以序列编号1表示的氨基酸序列的同源率在70％以上且具有催化β-D-吡喃葡萄糖苷键的水解反应的活性的蛋白质。
5.如权利要求1～4中的任一项所述的转化体，其特征在于，所述结构基因序列在编码所述修饰型β-葡糖苷酶的区域的5’末端侧和3’末端侧的至少任一方具有编码信号的区域或编码标签的区域。
6.如权利要求1～4中的任一项所述的转化体，其特征在于，所述结构基因序列在编码所述修饰型β-葡糖苷酶的区域的5’末端侧具有编码分泌信号的区域。
7.转化体的制造方法，其特征在于，通过包括编码下述修饰型β-葡糖苷酶的区域的结构基因序列以及用于使该结构基因表达的启动子序列和终止子序列的载体对裂殖酵母属酵母进行转化；
修饰型β-葡糖苷酶:作为存在选自下述变异1～变异6的至少一种变异的来源于丝状菌的β-葡糖苷酶，热稳定性或耐葡萄糖抑制性比不具有所述变异的来源于丝状菌的β-葡糖苷酶高的β-葡糖苷酶；
变异1:与位于AaBGL1(棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的BGL1)的第244个的异亮氨酸对应的氨基酸被置换为苯丙氨酸的变异；
变异2:与位于AaBGL1的第282个的甘氨酸对应的氨基酸被置换为苯丙氨酸的变异；
变异3:与位于AaBGL1的第442个的天门冬酰胺对应的氨基酸被置换为丝氨酸的变异；
变异4:与位于AaBGL1的第452个的甘氨酸对应的氨基酸被置换为丝氨酸的变异；
变异5:与位于AaBGL1的第503个的缬氨酸对应的氨基酸被置换为丙氨酸的变异；
变异6:与位于AaBGL1的第613个的精氨酸对应的氨基酸被置换为亮氨酸的变异。
8.如权利要求7所述的转化体的制造方法，其特征在于，所述结构基因序列在编码所述修饰型β-葡糖苷酶的区域的5’末端侧和3’末端侧的至少任一方具有编码信号的区域或编码标签的区域。
9.如权利要求7所述的转化体的制造方法，其特征在于，所述结构基因序列在编码所述修饰型β-葡糖苷酶的区域的5’末端侧具有编码分泌信号的区域。
10.如权利要求7～9中的任一项所述的转化体的制造方法，其特征在于，将所述载体整合至裂殖酵母属酵母的染色体的1处以上。
11.如权利要求10所述的转化体的制造方法，其特征在于，将所述载体整合至染色体中的转座子基因Tf2位点。
12.β-葡糖苷酶的制造方法，其特征在于，从对权利要求1～5中的任一项所述的转化体进行培养而得的菌体获得修饰型β-葡糖苷酶。
13.β-葡糖苷酶的制造方法，其特征在于，从对权利要求6所述的转化体进行培养而得的培养液上清获得修饰型β-葡糖苷酶。
14.纤维素的降解方法，其特征在于，使用通过权利要求12或13所述的β-葡糖苷酶的制造方法得到的修饰型β-葡糖苷酶。
15.纤维素的降解方法，其特征在于，在纤维素的存在下对权利要求6所述的转化体进行培养。
CN2012800138538A 2011-03-24 2012-03-19 裂殖酵母属酵母的转化体、该转化体的制造方法、β-葡糖苷酶的制造方法及纤维素的降解方法 Pending CN103429738A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011-066539 2011-03-24
JP2011066539 2011-03-24
PCT/JP2012/057055 WO2012128260A1 (ja) 2011-03-24 2012-03-19 シゾサッカロミセス属酵母の形質転換体、該形質転換体の製造方法、β－グルコシダーゼの製造方法、およびセルロースの分解方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103429738A true CN103429738A (zh) 2013-12-04

Family

ID=46879405

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2012800138538A Pending CN103429738A (zh) 2011-03-24 2012-03-19 裂殖酵母属酵母的转化体、该转化体的制造方法、β-葡糖苷酶的制造方法及纤维素的降解方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20140186897A1 (zh)
EP (1) EP2703484A4 (zh)
JP (1) JPWO2012128260A1 (zh)
CN (1) CN103429738A (zh)
WO (1) WO2012128260A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103180442A (zh) * 2010-11-05 2013-06-26 旭硝子株式会社 裂殖酵母属酵母的转化体及其制造方法
CN104583387B (zh) 2012-08-20 2017-05-03 旭硝子株式会社 粟酒裂殖酵母突变体的转化体、以及克隆载体
CN104936466A (zh) * 2012-11-20 2015-09-23 普罗努塔利亚公司 工程化的分泌蛋白质和方法
JP6449573B2 (ja) * 2014-07-04 2019-01-09 花王株式会社 β−グルコシダーゼ
JP7051491B2 (ja) * 2018-02-26 2022-04-11 花王株式会社 変異β－グルコシダーゼ
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1816631A (zh) * 2003-05-02 2006-08-09 诺维信股份有限公司 β－葡糖苷酶的变体
WO2010148148A2 (en) * 2009-06-16 2010-12-23 Codexis, Inc. β-GLUCOSIDASE VARIANTS
WO2010148128A1 (en) * 2009-06-16 2010-12-23 Codexis, Inc. Beta-glucosidase variant enzymes and related polynucleotides

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2776085B2 (ja) 1990-09-14 1998-07-16 旭硝子株式会社 ベクター
JP3689920B2 (ja) 1993-10-05 2005-08-31 旭硝子株式会社 マルチクローニングベクター、発現ベクター、および異種蛋白質の生産
WO1996023890A1 (fr) 1995-02-03 1996-08-08 Asahi Glass Company Ltd. Gene de signal de secretion et vecteur d'expression comprenant ce signal
US5747320A (en) * 1996-08-02 1998-05-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Glucose and cellobiose tolerant β-glucosidase from Candida peltata
JPH10234375A (ja) 1997-02-28 1998-09-08 Asahi Glass Co Ltd マルチクローニングベクター
EP1223219A3 (en) 1997-10-31 2002-10-23 Asahi Glass Company Ltd. Inducible promoter and secretion signal for use in schizosaccharomyces pombe, expression vector containing them and their use
JP4305998B2 (ja) 1999-03-18 2009-07-29 旭硝子株式会社 シゾサッカロミセス・ポンベの形質転換方法
WO2002101038A1 (fr) 2001-05-29 2002-12-19 Asahi Glass Company, Limited Procede de construction d'un hote et procede de production d'une proteine etrangere
EP1361284A1 (en) 2002-05-10 2003-11-12 Direvo Biotech AG Process for generating sequence-specific proteases by directed evolution and use thereof
JP4402446B2 (ja) 2002-12-24 2010-01-20 ダイセル化学工業株式会社 Ｄ−アミノアシラーゼの変異体
EP1622921B1 (en) * 2003-05-02 2010-06-16 Novozymes Inc. Variants of beta-glucosidases
JP5248735B2 (ja) 2004-01-19 2013-07-31 旭硝子株式会社 酵母の形質転換方法
JP2005245336A (ja) 2004-03-04 2005-09-15 Japan Science & Technology Agency 変異タンパク質の機能変化のスクリーニング方法およびその利用
DE602006018634D1 (de) 2005-08-03 2011-01-13 Asahi Glass Co Ltd Transformierte Hefezellen UND VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON FREMDPROTEIN
EP1930423A4 (en) 2005-08-29 2009-12-09 Asahi Glass Co Ltd EXPRESSION VECTOR, TRANSFORMANT IN WHICH THE EXPRESSION VECTOR IS INTRODUCED AND PROCESS FOR THE PRODUCTION OF A HETEROLOGOUS PROTEIN
JP5200542B2 (ja) 2005-11-29 2013-06-05 旭硝子株式会社 染色体改変方法
JP2008086310A (ja) 2006-09-04 2008-04-17 Gekkeikan Sake Co Ltd セルロース分解酵素を表層提示する酵母及びその利用
US20090312196A1 (en) * 2008-06-13 2009-12-17 Codexis, Inc. Method of synthesizing polynucleotide variants
JP2011066539A (ja) 2009-09-15 2011-03-31 Toshiba Corp 番組情報の表示制御装置及び番組情報の表示制御方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1816631A (zh) * 2003-05-02 2006-08-09 诺维信股份有限公司 β－葡糖苷酶的变体
WO2010148148A2 (en) * 2009-06-16 2010-12-23 Codexis, Inc. β-GLUCOSIDASE VARIANTS
WO2010148128A1 (en) * 2009-06-16 2010-12-23 Codexis, Inc. Beta-glucosidase variant enzymes and related polynucleotides

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIROFUMI OKADA ET AL.: "Molecular Characterization and Heterologous Expression of the Gene Encoding a Low-Molecular-Mass Endoglucanase from Trichoderma reesei QW9414", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》, vol. 64, no. 2, 28 February 1998 (1998-02-28), pages 555 - 563 *
TAKASHI KAWAGUCHI ET AL.: "Cloning and sequencing of the cDNA encoding β-glucosidase 1 from Aspergillus aculeatus", 《GENE》, vol. 173, 31 December 1996 (1996-12-31), pages 287 - 288 *
杜鹃等: "棘孢曲霉SM-L22 β-葡萄糖苷酶的纯化与性质", 《菌物系统》, vol. 21, no. 2, 31 December 2002 (2002-12-31), pages 239 - 245 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2012128260A1 (ja) 2014-07-24
WO2012128260A1 (ja) 2012-09-27
EP2703484A1 (en) 2014-03-05
EP2703484A4 (en) 2014-12-31
US20140186897A1 (en) 2014-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102939382B (zh) 丝状真菌宿主菌株和dna构建体以及它们的使用方法
CN103502266B (zh) 具有粘度改变表型的丝状真菌
US9175296B2 (en) Fungal production system
CN102227502B (zh) 在镶片镰孢的酶缺陷突变体中产生多肽的方法
CN108291213A (zh) 在高温下表达和分泌异源蛋白的酵母菌株
CN103429738A (zh) 裂殖酵母属酵母的转化体、该转化体的制造方法、β-葡糖苷酶的制造方法及纤维素的降解方法
CN108291189A (zh) 在具有降低的clr2活性的丝状真菌中生产蛋白质的方法
CN109790510A (zh) 在不存在诱导底物下丝状真菌细胞中的蛋白产生
WO2019128454A1 (zh) 一种新型木霉及其应用
EP4055177B1 (en) Fungal strains comprising enhanced protein productivity phenotypes and methods thereof
CN105368866A (zh) 改良ATMT在构建深绿木霉T23△Crel中的应用
CN103097536A (zh) 具有粘度改变表型的丝状真菌
CN108291191A (zh) 在具有降低的clr1活性的丝状真菌中生产蛋白质的方法
CN109661402A (zh) 真菌的高水平蛋白质生产系统
CN104583387B (zh) 粟酒裂殖酵母突变体的转化体、以及克隆载体
RU2701308C1 (ru) Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент ксиланазы
CN102120966A (zh) Ura3缺陷型毕赤酵母x-33菌株的构建及应用
EP3030661B1 (en) Increasing the expression of a transgene in eukaryotic cells by reducing rna interference
CN103180442A (zh) 裂殖酵母属酵母的转化体及其制造方法
JP6465470B2 (ja) 糖化酵素の生産方法、及び草木類バイオマスの糖化処理方法
JP6368968B2 (ja) 形質転換体の製造方法、糖化酵素の生産方法、及び草木類バイオマスの糖化処理方法
RU2741078C1 (ru) ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM CANESCENS mtCBHI ПРОДУЦЕНТ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ЦЕЛЛОБИОГИДРОЛАЗЫ I И ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ БИОКОНВЕРСИИ ВОЗОБНОВЛЯЕМОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ В САХАРА
CN115820746B (zh) 激酶基因在调控丝状真菌菌丝形态中的应用
RU2796447C1 (ru) Штамм Komagataella phaffii T07/pPZL-4x-OA-xyl-AsOr, обладающий способностью продуцировать ксиланазу из грибов вида Aspergillus oryzae
CN103060341B (zh) 源于里氏木霉的转录调控因子及编码基因和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20131204