JP5200542B2 - 染色体改変方法 - Google Patents
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Description
Wong, Q. N. et al. Efficient and seamless DNA recombineeringusing a thymidylate synthase A selection system in Escherichia coli. Nucl. AcidsRes.33, e59 (2005). Ghosh, K. & Van DuyneG. D. Cre-loxP biochemistry. Methods 28,374-383(2002). Datsenko, K. A. & Wanner,B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 usingPCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,6640-6645 (2000). Posfai, G., Kolisnychenko, V., Bereczki, Z. & Blattner, F. R. Markerless gene replacement in Escherichia colistimulated by a double-strand break in the chromosome. Nucl.Acids Res. 27, 4409-4415 (1999). Langle-Rouault, F. & Jacobs, E. Amethod for performing precise alterations in the yeast genome using are cyclable selectable marker. Nucl.Acids Res. 23, 3079-3081 (1995). Wilson, R. B., Davis, D., Enloe, B. M.& Mitchell, A. P. A recyclable Candida albicans URA3 cassette for PCR product-directed gene disruptions. Yeast 16, 65-70(2000). Grimm, C., Kohli, J., Murray, J. & Maundrell, K. Genetic engineering of Schizosaccharomyces pombe: a system for gene disruption and replacement using the ura4 gene as a selectable marker. Mol. Gen. Genet. 215, 81-86 (1988).
標的DNA領域の上流または下流に「ネガティヴセレクション可能な選択マーカー遺伝子(B)」を組み込むとともに標的DNA領域と該選択マーカー遺伝子(B)を重複配列で挟むことにより、当該重複配列の間に存在する「該選択マーカー遺伝子(B)と標的DNA領域とを含む領域(X)」を形成し、
次いで相同組換えとネガティヴセレクションにより前記領域(X)が除去された染色体を持つ細胞を得る、
ことを特徴とする標的DNA領域を除去する方法。
2.細胞中の染色体から標的DNA領域を除去する方法において;
「標的DNA領域の下流に存在する特定配列(A)と実質的に同一の配列(A')」と当該配列(A')の下流に結合した「ネガティヴセレクション可能な選択マーカー遺伝子(B)」とを有するDNA断片を標的DNA領域の上流に組み込むことにより、前記2つの実質的に同一の配列[(A)および(A')]の間に存在する「該選択マーカー遺伝子(B)と標的DNA領域とを含む領域(X)」を形成し、
次いで相同組換えとネガティヴセレクションにより前記領域(X)が除去された染色体を持つ細胞を得る、
ことを特徴とする標的DNA領域を除去する方法。
3.特定配列(A)及び(A')が、50bp〜1000bpの長さである前項2に記載の方法。
4.標的DNA領域が、500bp〜500kbpの長さである前項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
5.選択マーカー遺伝子(B)が、orotidine 5'-phosphate decarboxylase遺伝子である、前項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
6.前記標的DNA領域に細胞培養における栄養要求性を補償する遺伝子が含まれ、当該栄養要求性を補償する遺伝子の存在を必要としない条件下で相同組換えとネガティヴセレクションにおける培養を行う、前項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
7.細胞中の染色体から標的DNA領域を除去して当該標的DNA領域が所望の培養条件(Z)下での増殖に必須の遺伝子を含む領域か否かを判定する方法であって;
標的DNA領域の上流または下流に「ネガティヴセレクション可能な選択マーカー遺伝子(B)」を組み込むとともに標的DNA領域と選択マーカー遺伝子(B)を重複配列で挟むことにより、当該重複配列の間に存在する「該選択マーカー遺伝子(B)と標的DNA領域とを含む領域(X)」を形成し、
次いで相同組換えとネガティヴセレクションを行い、かつ、当該相同組換えとネガティヴセレクションを前記培養条件(Z)下で行うかまたは当該相同組換えとネガティヴセレクションにより得られた細胞を前記培養条件(Z)下で培養し、
さらにかかる培養条件(Z)下で増殖する細胞中の染色体に前記標的DNA領域が実質的に存在するか否かを確認し、
その結果、前記標的DNA領域が該染色体に実質的に存在しないことをもって前記標的DNA領域が前記培養条件(Z)下での増殖に必須の遺伝子を含まないと判定する、
ことを特徴とする判定方法。
8.細胞中の染色体から標的DNA領域を除去して当該標的DNA領域が所望の培養条件(Z)下での増殖に必須の遺伝子を含む領域か否かを判定する方法であって;
「標的DNA領域の下流に存在する特定配列(A)と実質的に同一の配列(A')」と当該配列(A')の下流に結合した「ネガティヴセレクション可能な選択マーカー遺伝子(B)」とを有するDNA断片を標的DNA領域の上流に組み込むことにより、前記2つの実質的に同一の配列[(A)および(A')]の間に存在する「該選択マーカー遺伝子(B)と標的DNA領域とを含む領域(X)」を形成し、
次いで相同組換えとネガティヴセレクションを行い、かつ、当該相同組換えとネガティヴセレクションを前記培養条件(Z)下で行うかまたは当該相同組換えとネガティヴセレクションにより得られた細胞を前記培養条件(Z)下で培養し、
さらにかかる培養条件(Z)下で増殖する細胞中の染色体に前記標的DNA領域が実質的に存在するか否かを確認し、
その結果、前記標的DNA領域が該染色体に実質的に存在しないことをもって前記標的DNA領域が前記培養条件(Z)下での増殖に必須の遺伝子を含まないと判定する、
ことを特徴とする判定方法。
9.前記標的DNA領域が2種以上の遺伝子を含む領域である前項7又は8に記載の方法。
10.選択マーカー遺伝子(B)が、orotidine 5'-phosphate decarboxylase遺伝子である、前項7〜9のいずれか1項に記載の方法。
「ネガティヴセレクション可能な選択マーカー遺伝子(B)」は上記重複配列の間に組み込まれる。この選択マーカー遺伝子(B)は標的DNA領域の上流側に組み込んでもよく、下流側に組み込んでもよい。また、選択マーカー遺伝子(B)の組み込みと重複配列の形成は同時に行ってもよく、任意の順に行ってもよい。
<leu1遺伝子がロイシン不含培地での生育に必須であることの判定>
分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)のオロチジン-5'-リン酸脱炭酸酵素(orotidine5'-phosphate decarboxylase)遺伝子(ura4)除去株を作製するためのDNA断片を、配列番号1(DNA-3620:5'-atgtgtgcaaagaaaatcgt-3')および2(DNA-3621:5'-ttacaaaattttttcaagtt-3')に記載の合成オリゴDNAをプライマー組としたPCR法によって作製した。増幅の鋳型にはS.pombe ARC032株(東京大学遺伝子実験施設飯野雄一博士より供与されたJY1株を継代保管したもの、遺伝子型:h-)から抽出精製した全DNA画分を使用した。得られた増幅断片を用いてS.pombe ARC010株(飯野雄一博士より供与されたJY743株を継代保管したもの、遺伝子型:h-leu1-32 ura4-D18)をOkazaki等(Nucleic Acids Res. 18:6485-6489 (1990).)に記載の方法によって形質転換し、ウラシルを含有する最少培地で生育可能であり、開始コドンATGのAを1とした時の137番目のGの変異AがGに復帰した、ura4除去株(MGF300株と命名、遺伝子型:h-ura4-D18)を取得した。
<染色体からの大規模領域(100kbp)の削除>
S. pombeの第一染色体の右腕テロメア近傍の100kbpの領域(塩基番号5413211から5513210)には、既知の必須遺伝子を含まない33個の遺伝子が位置する。この領域を除去するために、遺伝子SPAC186.06の100kbp上流(塩基番号5413211の位置)にura4と重複配列を組込むためのDNA断片を、配列番号13(DNA-3350:5'-agaattgagacggcgctgaa-3')および14(DNA-3351:5'-gtccttttgttaaataaaaattaggatacactaggtagat-3')に記載の合成オリゴDNAを上流配列用、配列番号15(DNA-3352:5'-tttcgtcaatatcacaagcttgttgcttttttatattaaa-3')および16(DNA-3353:5'-aaacaagactaaagattagt-3')に記載の合成オリゴDNAを下流配列用、配列番号17(DNA-3329:5'-tttttatttaacaaaaggac-3')および18(DNA-3330:5'-gtgggatttgtagctaagcttttatcgaaagaaaagaaat-3')に記載の合成オリゴDNAを重複配列用のそれぞれプライマー組として、前記Sakurai等および前記Krawchuk等に記載の二段階PCR法によって作製した。
Claims (10)
- 細胞(ヒトの生体内の細胞を除く)中の染色体から標的DNA領域を除去する方法において;
「標的DNA領域の上流に存在する特定配列(A)と実質的に同一の配列(A')」と当該配列(A')の上流に結合した「ネガティヴセレクション可能な選択マーカー遺伝子(B)」とを有する線状のDNA断片を標的DNA領域の下流に組み込むことにより、前記2つの実質的に同一の配列[(A)および(A')]の間に存在する「標的DNA領域と該選択マーカー遺伝子(B)とを含む領域(X)」を形成し、
次いで相同組換えとネガティヴセレクションにより前記領域(X)が除去された染色体を持つ細胞を得る、
ことを特徴とする標的DNA領域を除去する方法。 - 細胞(ヒトの生体内の細胞を除く)中の染色体から標的DNA領域を除去する方法において;
「標的DNA領域の下流に存在する特定配列(A)と実質的に同一の配列(A')」と当該配列(A')の下流に結合した「ネガティヴセレクション可能な選択マーカー遺伝子(B)」とを有する線状のDNA断片を標的DNA領域の上流に組み込むことにより、前記2つの実質的に同一の配列[(A)および(A')]の間に存在する「該選択マーカー遺伝子(B)と標的DNA領域とを含む領域(X)」を形成し、
次いで相同組換えとネガティヴセレクションにより前記領域(X)が除去された染色体を持つ細胞を得る、
ことを特徴とする標的DNA領域を除去する方法。 - 特定配列(A)及び(A')が、50bp〜1000bpの長さである請求項1又は2に記載の除去する方法。
- 標的DNA領域が、500bp〜500kbpの長さである請求項1〜3のいずれか1項に記載の除去する方法。
- 選択マーカー遺伝子(B)が、orotidine 5'-phosphate decarboxylase遺伝子である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の除去する方法。
- 前記標的DNA領域に細胞培養における栄養要求性を補償する遺伝子が含まれ、当該栄養要求性を補償する遺伝子の存在を必要としない条件下で相同組換えとネガティヴセレクションにおける培養を行う、請求項1〜5のいずれか1項に記載の除去する方法。
- 細胞(ヒトの生体内の細胞を除く)中の染色体から標的DNA領域を除去して当該標的DNA領域が所望の培養条件(Z)下での増殖に必須の遺伝子を含む領域か否かを判定する方法であって;
「標的DNA領域の上流に存在する特定配列(A)と実質的に同一の配列(A')」と当該配列(A')の上流に結合した「ネガティヴセレクション可能な選択マーカー遺伝子(B)」とを有する線状のDNA断片を標的DNA領域の下流に組み込むことにより、前記2つの実質的に同一の配列[(A)および(A')]の間に存在する「標的DNA領域と該選択マーカー遺伝子(B)とを含む領域(X)」を形成し、
次いで相同組換えとネガティヴセレクションを行い、かつ、当該相同組換えとネガティヴセレクションを前記培養条件(Z)下で行うかまたは当該相同組換えとネガティヴセレクションにより得られた細胞を前記培養条件(Z)下で培養し、
さらにかかる培養条件(Z)下で増殖する細胞中の染色体に前記標的DNA領域が実質的に存在するか否かを確認し、
その結果、前記標的DNA領域が該染色体に実質的に存在しないことをもって前記標的DNA領域が前記培養条件(Z)下での増殖に必須の遺伝子を含まないと判定する、
ことを特徴とする判定方法。 - 細胞(ヒトの生体内の細胞を除く)中の染色体から標的DNA領域を除去して当該標的DNA領域が所望の培養条件(Z)下での増殖に必須の遺伝子を含む領域か否かを判定する方法であって;
「標的DNA領域の下流に存在する特定配列(A)と実質的に同一の配列(A')」と当該配列(A')の下流に結合した「ネガティヴセレクション可能な選択マーカー遺伝子(B)」とを有する線状のDNA断片を標的DNA領域の上流に組み込むことにより、前記2つの実質的に同一の配列[(A)および(A')]の間に存在する「該選択マーカー遺伝子(B)と標的DNA領域とを含む領域(X)」を形成し、
次いで相同組換えとネガティヴセレクションを行い、かつ、当該相同組換えとネガティヴセレクションを前記培養条件(Z)下で行うかまたは当該相同組換えとネガティヴセレクションにより得られた細胞を前記培養条件(Z)下で培養し、
さらにかかる培養条件(Z)下で増殖する細胞中の染色体に前記標的DNA領域が実質的に存在するか否かを確認し、
その結果、前記標的DNA領域が該染色体に実質的に存在しないことをもって前記標的DNA領域が前記培養条件(Z)下での増殖に必須の遺伝子を含まないと判定する、
ことを特徴とする判定方法。 - 前記標的DNA領域が2種以上の遺伝子を含む領域である請求項7又は8に記載の判定方法。
- 選択マーカー遺伝子(B)が、orotidine 5'-phosphate decarboxylase遺伝子である、請求項7〜9のいずれか1項に記載の判定方法。
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