KR101824639B1

KR101824639B1 - UnaG 단백질을 이용한 세포 소기관 내 빌리루빈 검출 방법

Info

Publication number: KR101824639B1
Application number: KR1020160022151A
Authority: KR
Inventors: 이현우; 박종석
Original assignee: 울산과학기술원
Priority date: 2016-02-24
Filing date: 2016-02-24
Publication date: 2018-02-01
Also published as: KR20170099722A

Abstract

본 발명은 살아있는 세포 내 소기관에 존재하는 빌리루빈을 검출하는 방법에 관한 것으로, 세포 내 소기관 타겟팅 폴리뉴클레오타이드 및 UnaG 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이를 포함하는 재조합 벡터로 세포를 형질전환하는 단계, 형질전환된 세포에서의 UnaG 단백질의 형광세기를 측정하는 단계, 형질전환된 세포에서의 UnaG 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계, 및 형광세기와 발현 정도를 비교하여 결정계수 및 추세를 확인하는 단계를 포함하는 세포 내 빌리루빈 정량 방법에 관한 것이다.

Description

UnaG 단백질을 이용한 세포 소기관 내 빌리루빈 검출 방법 {method for detecting subcellular bilirubin by UnaG protein}

본 발명은 살아있는 세포 내 소기관에 존재하는 빌리루빈을 검출하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 세포 내 소기관 타겟팅 폴리뉴클레오타이드 및 UnaG 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이를 포함하는 재조합 벡터로 세포를 형질전환하는 단계, 형질전환된 세포에서의 UnaG 단백질의 형광세기를 측정하는 단계, 형질전환된 세포에서의 UnaG 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계, 및 형광 세기와 발현 정도를 비교하여 결정계수 및 추세를 확인하는 단계를 포함하는 세포 내 빌리루빈 정량 방법에 관한 것이다.

보통 작은 생체분자들이 분산 작용을 통해 세포 내 소기관에서 대칭적으로 분포할 것이라는 게 일반적인 견해였으나, 최근 살아있는 세포 내에서의 많은 작은 생체분자들이 세포 내 소기관에서 비대칭적으로 분포함이 발견되어 학계의 놀라움을 주고 있다. 예를 들어 생체분자의 하나인 지질이 세포 내 소기관 내에서 비대칭적을 존재하고 또 한 세포 내 소기관에서도 다른 종류의 지질들이 막을 구성하고 있다는 계 밝혀져 이러한 연구는 학계의 새로운 시각을 제공해주었다고 평가되고 있다.

하지만, 이러한 세포 내 소기관에서 생체분자를 정성 및 정량 분석하는 방법은 다소 어려운 측면이 있는데, 기존의 세포분획방법과 화학반응, 안티바디(anti-body)를 통한 검출 방법은 위정(false-positive)의 위험이 있고 이러한 방법은 살아있는 세포상태가 아닌 인위적인 용액에서 실행해야 한다는 한계가 있다. 이러한 한계는 생물학적, 의학적인 분석을 어렵게 하기에 보다 상세하고 살아있는 상태에서 할 수 있는 방법을 필요로 하게 되었다.

현재까지 형광단백질을 이용한 이미징 기술은 생체분자를 정성 및 정량하는 가장 실용적인 방법으로 평가되고 있으며, 또 살아있는 세포 내 특정 소기관에서 독성이 거의 없어 장기적인 측정도 가능하다는 장점이 있다. 이제까지 이러한 형광이미징 기술을 이용한 센서로 ATP, GTP, cAMP, 금속이온, 포도당 등을 검출하는데 사용되었고, 이는 곧 세포 내에서 그 생체분자의 생리학적 기능을 밝히는데 큰 도움을 주었다.

빌리루빈은 척추동물의 지질성 대사물질 중 하나로 끊임없이 재생산되며 그 양이 하루에만 사람기준 250 내지 400mg에 달한다. 빌리루빈은 주로 헴 분해과정에서 생기며 헴 산소첨가효소(소포체에 위치)와 빌리버딘 환원효소(세포질에 위치)에 의해 생성된다. 빌리루빈은 항산화제의 성격을 가지며 활성산소 중의 하나인 과산화수소를 10,000배나 분해할 수 있다는 것이 밝혀져 있다. 그러나 이러한 빌리루빈도 많은 양이 체내에 축적되면 치명적인 질병을 일으키는 데 만성 황달, 뇌병증, Crigler-Najjar syndrome, Dublin-Johnson syndrome이 그 예이다. 현재까지 빌리루빈의 기본적인 정보가 안 밝혀져 있어 그 생물학적, 병리학적 중요함에도 불구하고 빌리루빈의 역할을 가늠하기에 많은 어려움이 있었다.

빌리루빈의 측정을 위해 여러 실험관 분석기기들이 이용되어 왔으나 살아있는 세포에서 측정하기에는 무리가 있었고 아주 근래에 이르러 이광자 레이저 현미경을 통해 종양세포에서의 빌리루빈 2량체를 분석을 한 연구가 있었으나 빌리루빈 1량체를 분석하기에 또 세포 내 소기관에서의 분포를 측정하기에는 적합하지 않았다. 또한, 이러한 이광자 레이저 현미경이라고 하는 고가의 기기를 사용해야 할 뿐만 아니라 현미경 작동에 관한 복잡한 과정을 수행할 수 있는 노련한 기술자가 필요하기에 모든 과학자들이 쉽게 적용할 수 있는 기술이라고 볼 수 없어, 보다 용이하게 세포 내 소기관에서 빌리루빈을 분석할 수 있는 기술이 필요한 실정이다.

본 발명자들은 빌리루빈과 결합하여 형광을 내는 UnaG 단백질을 이용해, 형광이미징 기술을 통해 빌리루빈이 살아있는 세포 내 소기관에 분포하는지 여부를 확인하는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 세포 내 소기관 타겟팅 폴리뉴클레오타이드 및 UnaG 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이를 포함하는 재조합 벡터로 세포를 형질전환하는 단계, 형질전환된 세포에서의 UnaG 단백질의 형광세기를 측정하는 단계, 형질전환된 세포에서의 UnaG 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계, 및 형광세기와 발현 정도를 비교하여 결정계수 및 추세를 확인하는 단계를 포함하는 세포 내 빌리루빈 정량 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 살아있는 세포 내 소기관에 존재하는 빌리루빈을 형광을 통해 검출하는 신규한 방법에 관한 것으로, 기존의 세포 분획법, 화학반응을 통한 방법보다 선택적인 효과를 가진다.

일 예에서, 본 발명은 형질전환된 세포에서의 UnaG 단백질의 형광세기를 측정하는 단계, 형질전환된 세포에서의 UnaG 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계, 및 형광세기와 발현 정도를 비교하여 결정계수 및 추세를 확인하는 단계를 통해 빌리루빈의 동적 이동과 이와 관련된 메커니즘을 규명하는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 일 예는, 세포 내 소기관에 따른 빌리루빈의 정량 방법을 제공한다.

다른 예는 세포 내 소기관에 따른 빌리루빈 가시화 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다

일 예에서, 상기 빌리루빈의 정량 방법은 하기의 단계를 포함하는 것일 수 있다:

(1) 세포 내 소기관 타겟팅 폴리뉴클레오타이드 및 UnaG 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이를 포함하는 재조합 벡터로 세포를 형질전환하는 단계;

(2) 형질전환된 세포에서의 UnaG 단백질의 형광세기를 측정하는 단계;

(3) 형질전환된 세포에서의 UnaG 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및

(4) 형광세기와 발현 정도를 비교하여 결정계수 및 추세를 확인하는 단계.

또한, 상기 빌리루빈 가시화 방법은 하기의 단계를 포함하는 것일 수 있다:

(a) 세포 내 소기관 타겟팅 폴리뉴클레오타이드 및 UnaG 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이를 포함하는 재조합 벡터로 세포를 형질전환하는 단계; 및

(b) 형질전환된 세포에서의 UnaG 단백질의 형광 여부를 확인하는 단계.

상기 빌리루빈 가시화 방법에서, 형질전환된 세포에서의 UnaG 단백질의 형광이 확인되면, 상기 폴리뉴클레오타이드에 의하여 타겟팅되는 세포 내 소기관에 빌리루빈이 존재함을 확인할 수 있다.

상기 세포는 동물 세포, 식물 세포, 미생물 등을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 동물 세포(mammalian cell)일 수 있으며, 외래 유전자의 형질 감염(transfection)이 가능한 모든 살아있는 세포들 중에서 특별한 제한 없이 선택될 수 있다.

구체적인 예로, 신장 세포, 암 세포, 피부 세포, 난소 세포, 활막 세포, 말초혈액 단핵구 세포, 섬유아세포, 섬유 세포, 신경세포, 상피세포, 각질세포, 조혈 세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 대식세포, 근육 세포, 혈액 세포, 골수 세포, 림프구 세포, 단핵세포, 폐 세포, 췌장 세포, 간 세포, 위 세포, 장 세포, 심장 세포, 방광 세포, 요도 세포, 배아 생식세포 또는 난구세포 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

더욱 구체적으로, 상기 동물 세포는 신장 세포(hek293T 세포, hek293 세포 등), 암 세포(hela 세포 등), 원숭이 콩팥 세포(Cos-7 세포 등), 골육종 세포(U2OS 세포 등), 피부 세포(NIH3T3 세포 등), 난소 세포(CHO 세포 등) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 "세포 내 소기관(organelle)"이란, 세포의 내부에 존재하며 세포의 여러 가지 기능을 분업으로 하고 있는 구조단위를 의미한다. 바람직하게, 본 발명에 있어서 세포 소기관은 세포 내막에 싸인 구조체로, 다른 공간과는 구획한 세포 내 구획을 형성하고 있으며 고유의 미세환경을 갖는 소기관을 의미한다. 이러한 세포 소기관은 고유의 기능을 가지며, 예를 들어, 핵, 미토콘드라아 이중막 사이 공간, 미토콘드리아 외막, IMS, 소포체 내강, 미토콘드리아 기질, 세포질, 소포체 내강방향 조면소포체막, 세포질방향 조면 소포체 막, 원형질막, 활면소포체 등 일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 식물세포의 경우 엽록체, 액포 등을 포함할 수 있다.

상기 세포 내 소기관 타겟팅 폴리뉴클레오타이드는 특정 세포 내 소기관을 타겟팅하여 UnaG 단백질을 특정 타겟팅된 세포 내 소기관에서 발현하도록 하는 역할을 한다. 각 세포 내 소기관 별로 이를 타겟팅 하는 폴리펩타이드 및 이를 암호화하는 염기서열은 잘 알려져 있다.

일 예에서, 상기 세포 내 소기관 타겟팅 폴리뉴클라오타이드는 서열번호 1 내지 11의 염기서열 중에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 서열번호 1 내지 11의 염기서열은 하기 표 1에 나타내었다.

상기 UnaG 단백질은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 UnaG 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 25의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함할 수 있으며, 예컨대, 서열번호 23의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 예에서, 세포 내 소기관 타겟팅 폴리뉴클레오타이드 및 UnaG 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터에서, 상기 세포 내 소기관 타겟팅 폴리뉴클레오타이드는 상기 UnaG 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단 모두 (세포 내 소기관 타겟팅 폴리뉴클레오타이드가 2개 사용되는 경우)에 연결되어 있을 수 있다. 상기 재조합 벡터 내에서의 세포 내 소기관 타겟팅 폴리뉴클레오타이드의 위치는 타겟팅되는 소기관 및/또는 사용되는 세포 내 소기관 타겟팅 폴리뉴클레오타이드 위치에 따라서 정해질 수 있다.

상기 재조합 벡터는 통상적인 표지 부위 (예컨대, FLAG tag 등)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 FLAG tag는 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 FLAG tag을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 25의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 재조합 벡터 내 세포 내 소기관 타겟팅 폴리뉴클레오타이드 및 UnaG 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 통상적인 표지 부위, 통상의 제한 부위, 펩타이드 링커 암호화 폴리뉴클레오타이드 등을 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다.

일 예에서, 상기 재조합 벡터에 포함 가능한 세포 내 소기관 타겟팅 폴리뉴클레오타이드의 염기서열 및 UnaG 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 기준으로 한 재조합 벡터 내 위치를 표 1 및 2에 정리하고, 상기 폴리뉴클레오타이드로부터 암호화되는 아미노산 서열을 표 3에 정리하였다. 그 외 재조합 벡터에 포함되는 UnaG 단백질과 표지 부위 (FLAG tag)의 암호화 염기서열 및 아미노산 서열을 표 4에 정리하였다.

서열번호	타켓팅 영역	서열목록 (5' -> 3')	벡터 내 위치 (UnaG 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 기준)
1	핵	AGCAGGGCCGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTG	3' 말단 쪽
2	미토콘드리아 이중막 사이 공간	ATGTACCGGCTCCTGTCAAGCGTGACAGCTCGGGCTGCGGCCACCGCAGGCCCAGCCTGGGACGGAGGGCGGCGCGGGGCGCACAGGCGACCGGGCCTGCCTGTGCTGGGCCTTGGTTGGGCCGGCGGCCTGGGGCTCGGGCTGGGGCTGGCTCTCGGCGCGAAGCTGGTGGTCGGGCTGCGGGGCGCCGTCCCCATTCAGTCC	5' 말단 쪽
3	미토콘드리아 외막	ATGGTGGGTCGGAACAGCGCCATCGCCGCCGGTGTATGCGGGGCCCTTTTCATTGGGTACTGCATCTACTTCGACCGCAAAAGACGAAGTGACCCCAACTTCAAGAACAGGCTTCGAGAACGAAGAAAGAAACAGAAGCTTGCCAAGGAGAGAGCTGGGCTTTCCAAGTTACCTGACCTTAAAGATGCTGAAGCTGTTCAGAAGTTCTTCCTTGAAGAAATACAGCTTGGTGAAGAGTTACTAGCTCAAGGTGAATATGAGAAGGGCGTAGACCATCTGACAAATGCAATTGCTGTGTGTGGACAGCCACAGCAGTTACTGCAGGTCTTACAGCAAACTCTTCCACCACCAGTGTTCCAGATGCTTCTGACTAAGCTCCCAACAATTAGTCAGAGAATTGTAAGTGCTCAGAGCTTGGCTGAAGATGATGTGGAA	5' 말단 쪽
4	IMS (Mito-intermembrane spece)	ATGGCGATGCTGGTCCTAGTACCCGGACGAGTTATGCGGCCTCTGGGTGGCCAACTTTGGCGCTTCTTGCCTCGCGGACTCGAGTTTTGGGGCCCAGCCGAGGGGACTGCGAGAGTCTTGCTGAGGCAGTTCTGCGCGCGGCAAGCGGAGGCGTGGCGTGCCTCGGGGCGCCCTGGCTATTGCCTGGGAACCCGGCCCCTCAGCACTGCGAGGCCGCCACCCCCGTGGTCGCAGAAGGGCCCCGGAGACTCCACGCGCCCCTCGAAGCCCGGGCCTGTTTCCTGGAAGTCTTTAGCAATCACATTTGCTATTGGAGGAGCTTTACTGGCTGGAATGAAGCACGTCAAGAAAGAAAAGGCAGAGAAGTTAGAGAAGGAACGGCAGCGACACATCGGCAAGCCTTTACTTGGGGGACCGTTTTCCCTCACAACTCATACTGGGGAGCGTAAAACTGACAAGGACTACTTGGGTCAGTGGTTATTGATTTATTTTGGCTTCACTCATTGCCCTGATGTCTGTCCAGAAGAACTAGAAAAGATGATTCAAGTCGTGGATGAAATAGATAGCATTACAACTCTGCCAGATCTAACTCCACTTTTCATCAGCATTGACCCAGAGAGGGACACAAAAGAAGCCATCGCAAATTATGTGAAAGAATTTTCTCCCAAACTGGTTGGCTTGACTGGCACGAGAGAAGAGGTCGATCAAGTGGCCAGAGCATACAGAGTGTATTACAGCCCTGGCCCCAAGGACGAAGATGAAGACTACATAGTGGATCACACAATAATAATGTACTTGATTGGACCAGATGGTGAGTTTCTAGATTATTTTGGCCAGAACAAGAGGAAGGGAGAAATAGCTGCTTCAATTGCCACACACATGAGGCCATACAGAAAAAAGAGC	5' 말단 쪽

서열번호	타켓팅 영역	서열목록 (5' -> 3')	벡터 내 위치 (UnaG 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 기준)
5	소포체 내강	AAGGACGAGCTG	5' 말단 및 3' 말단 쪽
6	미토콘드리아 기질	ATGCTGGCCACCCGCGTGTTCAGCCTGGTGGGCAAGCGCGCCATCAGCACCAGCGTGTGCGTGCGCGCCCAC	5' 말단 쪽
7	세포질	CTGCAGCTGCCCCCCCTGGAGCGCCTGACCCTGGAC	3' 말단 쪽
8	소포체 내강방향 조면소포체 막	ATGCCTGGTCCGACCCCCAGTGGCACTAACGTGGGATCCTCAGGGCGCTCTCCCAGCAAAGCAGTGGCCGCCCGGGCGGCGGGATCCACTGTCCGGCAGAGGAAAAATGCCAGCTGTGGGACAAGGAGTGCAGGCCGCACAACCTCGGCAGGCACCGGGGGGATGTGGCGATTCTACACAGAAGATTCACCTGGGCTCAAAGTTGGCCCTGTTCCAGTATTGGTTATGAGTCTTCTGTTCATCGCTTCTGTATTTATGTTGCACATTTGGGGCAAGTACACTCGTTCG	5' 말단 쪽
9	세포질방향 조면 소포체 막	ATGCCTGGTCCGACCCCCAGTGGCACTAACGTGGGATCCTCAGGGCGCTCTCCCAGCAAAGCAGTGGCCGCCCGGGCGGCGGGATCCACTGTCCGGCAGAGGAAAAATGCCAGCTGTGGGACAAGGAGTGCAGGCCGCACAACCTCGGCAGGCACCGGGGGGATGTGGCGATTCTACACAGAAGATTCACCTGGGCTCAAAGTTGGCCCTGTTCCAGTATTGGTTATGAGTCTTCTGTTCATCGCTTCTGTATTTATGTTGCACATTTGGGGCAAGTACACTCGTTCG	3' 말단 쪽
10	원형질막	CGCAGCAAGCTGAACCCCCCCGACGAGAGCGGCCCCGGCTGCATGAGCTGCAAGTGCGTGCTGAGC	3' 말단 쪽
11	활면소포체	ATGGATCCTGTGGTGGTGCTGGGGCTCTGTCTCTCCTGTTTGCTTCTCCTTTCACTCTGGAAACAGAGCTATGGGGGAGGG	5' 말단 쪽

서열번호	타켓팅 영역	서열목록 (5' -> 3')
12	핵	SRADPKKKRKVDPKKKRKVDPKKKRKV
13	미토콘드리아 이중막 사이 공간	MYRLLSSVTARAAATAGPAWDGGRRGAHRRPGLPVLGLGWAGGLGLGLGLALGAKLVVGLRGAVPIQS
14	미토콘드리아 외막	MVGRNSAIAAGVCGALFIGYCIYFDRKRRSDPNFKNRLRERRKKQKLAKERAGLSKLPDLKDAEAVQKFFLEEIQLGEELLAQGEYEKGVDHLTNAIAVCGQPQQLLQVLQQTLPPPVFQMLLTKLPTISQRIVSAQSLAEDDVE
15	IMS	MAMLVLVPGRVMRPLGGQLWRFLPRGLEFWGPAEGTARVLLRQFCARQAEAWRASGRPGYCLGTRPLSTARPPPPWSQKGPGDSTRPSKPGPVSWKSLAITFAIGGALLAGMKHVKKEKAEKLEKERQRHIGKPLLGGPFSLTTHTGERKTDKDYLGQWLLIYFGFTHCPDVCPEELEKMIQVVDEIDSITTLPDLTPLFISIDPERDTKEAIANYVKEFSPKLVGLTGTREEVDQVARAYRVYYSPGPKDEDEDYIVDHTIIMYLIGPDGEFLDYFGQNKRKGEIAASIATHMRPYRKKS
16	소포체 내강	KDEL
17	미토콘드리아 기질	MLATRVFSLVGKRAISTSVCVRAH
18	세포질	LQLPPLERLTLD
19	소포체 내강방향 조면소포체 막	PGPTPSGTNVGSSGRSPSKAVAARAAGSTVRQRKNASCGTRSAGRTTSAGTGGMWRFYTEDSPGLKVGPVPVLVMSLLFIASVFMLHIWGKYTRS
20	세포질방향 조면 소포체 막	MPGPTPSGTNVGSSGRSPSKAVAARAAGSTVRQRKNASCGTRSAGRTTSAGTGGMWRFYTEDSPGLKVGPVPVLVMSLLFIASVFMLHIWGKYTRS
21	원형질막	RSKLNPPDESGPGCMSCKCVLS
22	활면소포체	MDPVVVLGLCLSCLLLLSLWKQSYGGG

서열번호	명명	서열목록 (5' -> 3')
23	UnaG	ATGGTTGAAAAATTTGTTGGTACGTGGAAAATAGCGGATTCTCATAATTTTGGCGAATATCTGAAGGCTATCGGGGCGCCTAAAGAGCTGAGTGATGGAGGCGATGCCACGACTCCAACTCTGTATATTTCACAGAAGGACGGTGATAAAATGACCGTTAAGATCGAGAATGGCCCGCCCACCTTCCTGGATACACAGGTAAAGTTTAAACTTGGTGAAGAATTTGATGAGTTCCCGAGCGACAGACGCAAAGGTGTTAAATCCGTAGTCAACTTGGTCGGAGAAAAACTCGTATATGTCCAAAAATGGGATGGCAAAGAGACAACCTACGTGCGTGAAATTAAAGACGGGAAACTGGTTGTGACGCTGACAATGGGCGACGTGGTGGCAGTGCGCTCGTACCGGCGTGCAACCGAA
24	FLAG tag	GACTACAAGGATGACGACGATAAG
25	UnaG	MVEKFVGTWKIADSHNFGEYLKAIGAPKELSDGGDATTPTLYISQKDGDKMTVKIENGPPTFLDTQVKFKLGEEFDEFPSDRRKGVKSVVNLVGEKLVYVQKWDGKETTYVREIKDGKLVVTLTMGDVVAVRSYRRATE
26	FLAG tag	DYKDDDDK

상기 재조합 벡터는 세포 내 특정 소기관에서 UnaG 단백질이 발현될 수 있도록 할 수 있다. 예를 들어, UnaG 단백질을 핵, 미토콘드라아 이중막 사이 공간, 미토콘드리아 외막, IMS, 소포체 내강, 미토콘드리아 기질, 세포질, 소포체 내강방향 조면소포체막, 세포질방향 조면 소포체 막, 원형질막, 활면소포체에서 발현할 수 있다.

또한, 상기 재조합 벡터는 서열번호 27 내지 38의 염기서열 중에서 선택된 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 서열번호 27 내지 38의 염기서열은 하기의 표 5 내지 표 7에 나타내었다.

명명	타켓팅 영역	서열목록(5'->3')	서열 번호
UnaG-Flag-NLS	핵	ATGGTTGAAAAATTTGTTGGTACGTGGAAAATAGCGGATTCTCATAATTTTGGCGAATATCTGAAGGCTATCGGGGCGCCTAAAGAGCTGAGTGATGGAGGCGATGCCACGACTCCAACTCTGTATATTTCACAGAAGGACGGTGATAAAATGACCGTTAAGATCGAGAATGGCCCGCCCACCTTCCTGGATACACAGGTAAAGTTTAAACTTGGTGAAGAATTTGATGAGTTCCCGAGCGACAGACGCAAAGGTGTTAAATCCGTAGTCAACTTGGTCGGAGAAAAACTCGTATATGTCCAAAAATGGGATGGCAAAGAGACAACCTACGTGCGTGAAATTAAAGACGGGAAACTGGTTGTGACGCTGACAATGGGCGACGTGGTGGCAGTGCGCTCGTACCGGCGTGCAACCGAAGACTACAAGGATGACGACGATAAGGAATTCAGCAGGGCCGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGTGA	27
LACTB-UnaG-Flag	미토콘드리아 이중막 사이 공간	ATGTACCGGCTCCTGTCAAGCGTGACAGCTCGGGCTGCGGCCACCGCAGGCCCAGCCTGGGACGGAGGGCGGCGCGGGGCGCACAGGCGACCGGGCCTGCCTGTGCTGGGCCTTGGTTGGGCCGGCGGCCTGGGGCTCGGGCTGGGGCTGGCTCTCGGCGCGAAGCTGGTGGTCGGGCTGCGGGGCGCCGTCCCCATTCAGTCCATGGTTGAAAAATTTGTTGGTACGTGGAAAATAGCGGATTCTCATAATTTTGGCGAATATCTGAAGGCTATCGGGGCGCCTAAAGAGCTGAGTGATGGAGGCGATGCCACGACTCCAACTCTGTATATTTCACAGAAGGACGGTGATAAAATGACCGTTAAGATCGAGAATGGCCCGCCCACCTTCCTGGATACACAGGTAAAGTTTAAACTTGGTGAAGAATTTGATGAGTTCCCGAGCGACAGACGCAAAGGTGTTAAATCCGTAGTCAACTTGGTCGGAGAAAAACTCGTATATGTCCAAAAATGGGATGGCAAAGAGACAACCTACGTGCGTGAAATTAAAGACGGGAAACTGGTTGTGACGCTGACAATGGGCGACGTGGTGGCAGTGCGCTCGTACCGGCGTGCAACCGAAGACTACAAGGATGACGACGATAAGTAA	28
Tom20-flag-UnaG	미토콘드리아 외막	ATGGTGGGTCGGAACAGCGCCATCGCCGCCGGTGTATGCGGGGCCCTTTTCATTGGGTACTGCATCTACTTCGACCGCAAAAGACGAAGTGACCCCAACTTCAAGAACAGGCTTCGAGAACGAAGAAAGAAACAGAAGCTTGCCAAGGAGAGAGCTGGGCTTTCCAAGTTACCTGACCTTAAAGATGCTGAAGCTGTTCAGAAGTTCTTCCTTGAAGAAATACAGCTTGGTGAAGAGTTACTAGCTCAAGGTGAATATGAGAAGGGCGTAGACCATCTGACAAATGCAATTGCTGTGTGTGGACAGCCACAGCAGTTACTGCAGGTCTTACAGCAAACTCTTCCACCACCAGTGTTCCAGATGCTTCTGACTAAGCTCCCAACAATTAGTCAGAGAATTGTAAGTGCTCAGAGCTTGGCTGAAGATGATGTGGAAGGATCCTCTGGTGGATCTGGTGGATCTAGAGACTACAAGGATGACGACGATAAGAAGCTAGCAATGGTTGAAAAATTTGTTGGTACGTGGAAAATAGCGGATTCTCATAATTTTGGCGAATATCTGAAGGCTATCGGGGCGCCTAAAGAGCTGAGTGATGGAGGCGATGCCACGACTCCAACTCTGTATATTTCACAGAAGGACGGTGATAAAATGACCGTTAAGATCGAGAATGGCCCGCCCACCTTCCTGGATACACAGGTAAAGTTTAAACTTGGTGAAGAATTTGATGAGTTCCCGAGCGACAGACGCAAAGGTGTTAAATCCGTAGTCAACTTGGTCGGAGAAAAACTCGTATATGTCCAAAAATGGGATGGCAAAGAGACAACCTACGTGCGTGAAATTAAAGACGGGAAACTGGTTGTGACGCTGACAATGGGCGACGTGGTGGCAGTGCGCTCGTACCGGCGTGCAACCGAATAA	29

명명	타켓팅 영역	서열목록(5'->3')	서열 번호
ScoI-UnaG-flag	IMS	TCCAACTCTGTATATTTCACAGAAGGACGGTGATAAAATGACCGTTAAGATCGAGAATGGCCCGCCCACCTTCCTGGATACACAGGTAAAGTTTAAACTTGGTGAAGAATTTGATGAGTTCCCGAGCGACAGACGCAAAGGTGTTAAATCCGTAGTCAACTTGGTCGGAGAAAAACTCGTATATGTCCAAAAATGGGATGGCAAAGAGACAACCTACGTGCGTGAAATTAAAGACGGGAAACTGGTTGTGACGCTGACAATGGGCGACGTGGTGGCAGTGCGCTCGTACCGGCGTGCAACCGAAGACTACAAGGATGACGACGATAAGTAA	30
ss-UnaG-KDEL-Flag	소포체 내강	ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGGGGCCCAGCCGGCCAGATCTATGGTTGAAAAATTTGTTGGTACGTGGAAAATAGCGGATTCTCATAATTTTGGCGAATATCTGAAGGCTATCGGGGCGCCTAAAGAGCTGAGTGATGGAGGCGATGCCACGACTCCAACTCTGTATATTTCACAGAAGGACGGTGATAAAATGACCGTTAAGATCGAGAATGGCCCGCCCACCTTCCTGGATACACAGGTAAAGTTTAAACTTGGTGAAGAATTTGATGAGTTCCCGAGCGACAGACGCAAAGGTGTTAAATCCGTAGTCAACTTGGTCGGAGAAAAACTCGTATATGTCCAAAAATGGGATGGCAAAGAGACAACCTACGTGCGTGAAATTAAAGACGGGAAACTGGTTGTGACGCTGACAATGGGCGACGTGGTGGCAGTGCGCTCGTACCGGCGTGCAACCGAAGACTACAAGGATGACGACGATAAGAAGGACGAGCTGTGA	31
mito-UnaG-flag	미토콘드리아 기질	ATGCTGGCCACCCGCGTGTTCAGCCTGGTGGGCAAGCGCGCCATCAGCACCAGCGTGTGCGTGCGCGCCCACAAGGATCCAATGGTTGAAAAATTTGTTGGTACGTGGAAAATAGCGGATTCTCATAATTTTGGCGAATATCTGAAGGCTATCGGGGCGCCTAAAGAGCTGAGTGATGGAGGCGATGCCACGACTCCAACTCTGTATATTTCACAGAAGGACGGTGATAAAATGACCGTTAAGATCGAGAATGGCCCGCCCACCTTCCTGGATACACAGGTAAAGTTTAAACTTGGTGAAGAATTTGATGAGTTCCCGAGCGACAGACGCAAAGGTGTTAAATCCGTAGTCAACTTGGTCGGAGAAAAACTCGTATATGTCCAAAAATGGGATGGCAAAGAGACAACCTACGTGCGTGAAATTAAAGACGGGAAACTGGTTGTGACGCTGACAATGGGCGACGTGGTGGCAGTGCGCTCGTACCGGCGTGCAACCGAAGACTACAAGGATGACGACGATAAGTAA	32
Flag-UnaG-NES	세포질	ATGGACTACAAGGATGACGACGATAAGATGGTTGAAAAATTTGTTGGTACGTGGAAAATAGCGGATTCTCATAATTTTGGCGAATATCTGAAGGCTATCGGGGCGCCTAAAGAGCTGAGTGATGGAGGCGATGCCACGACTCCAACTCTGTATATTTCACAGAAGGACGGTGATAAAATGACCGTTAAGATCGAGAATGGCCCGCCCACCTTCCTGGATACACAGGTAAAGTTTAAACTTGGTGAAGAATTTGATGAGTTCCCGAGCGACAGACGCAAAGGTGTTAAATCCGTAGTCAACTTGGTCGGAGAAAAACTCGTATATGTCCAAAAATGGGATGGCAAAGAGACAACCTACGTGCGTGAAATTAAAGACGGGAAACTGGTTGTGACGCTGACAATGGGCGACGTGGTGGCAGTGCGCTCGTACCGGCGTGCAACCGAACTGCAGCTGCCCCCCCTGGAGCGCCTGACCCTGGACTAA	33

명명	타켓팅 영역	서열목록(5'->3')	서열 번호
Sec61B-UnaG-Flag	소포체 내강방향 조면소포체 막	ATGCCTGGTCCGACCCCCAGTGGCACTAACGTGGGATCCTCAGGGCGCTCTCCCAGCAAAGCAGTGGCCGCCCGGGCGGCGGGATCCACTGTCCGGCAGAGGAAAAATGCCAGCTGTGGGACAAGGAGTGCAGGCCGCACAACCTCGGCAGGCACCGGGGGGATGTGGCGATTCTACACAGAAGATTCACCTGGGCTCAAAGTTGGCCCTGTTCCAGTATTGGTTATGAGTCTTCTGTTCATCGCTTCTGTATTTATGTTGCACATTTGGGGCAAGTACACTCGTTCGAAGCTAGCAATGGTTGAAAAATTTGTTGGTACGTGGAAAATAGCGGATTCTCATAATTTTGGCGAATATCTGAAGGCTATCGGGGCGCCTAAAGAGCTGAGTGATGGAGGCGATGCCACGACTCCAACTCTGTATATTTCACAGAAGGACGGTGATAAAATGACCGTTAAGATCGAGAATGGCCCGCCCACCTTCCTGGATACACAGGTAAAGTTTAAACTTGGTGAAGAATTTGATGAGTTCCCGAGCGACAGACGCAAAGGTGTTAAATCCGTAGTCAACTTGGTCGGAGAAAAACTCGTATATGTCCAAAAATGGGATGGCAAAGAGACAACCTACGTGCGTGAAATTAAAGACGGGAAACTGGTTGTGACGCTGACAATGGGCGACGTGGTGGCAGTGCGCTCGTACCGGCGTGCAACCGAAGACTACAAGGATGACGACGATAAGTAA	34
UnaG-Flag-Sec61	세포질방향 조면 소포체 막	ATGGTTGAAAAATTTGTTGGTACGTGGAAAATAGCGGATTCTCATAATTTTGGCGAATATCTGAAGGCTATCGGGGCGCCTAAAGAGCTGAGTGATGGAGGCGATGCCACGACTCCAACTCTGTATATTTCACAGAAGGACGGTGATAAAATGACCGTTAAGATCGAGAATGGCCCGCCCACCTTCCTGGATACACAGGTAAAGTTTAAACTTGGTGAAGAATTTGATGAGTTCCCGAGCGACAGACGCAAAGGTGTTAAATCCGTAGTCAACTTGGTCGGAGAAAAACTCGTATATGTCCAAAAATGGGATGGCAAAGAGACAACCTACGTGCGTGAAATTAAAGACGGGAAACTGGTTGTGACGCTGACAATGGGCGACGTGGTGGCAGTGCGCTCGTACCGGCGTGCAACCGAAGACTACAAGGATGACGACGATAAGGAATTCATGCCTGGTCCGACCCCCAGTGGCACTAACGTGGGATCCTCAGGGCGCTCTCCCAGCAAAGCAGTGGCCGCCCGGGCGGCGGGATCCACTGTCCGGCAGAGGAAAAATGCCAGCTGTGGGACAAGGAGTGCAGGCCGCACAACCTCGGCAGGCACCGGGGGGATGTGGCGATTCTACACAGAAGATTCACCTGGGCTCAAAGTTGGCCCTGTTCCAGTATTGGTTATGAGTCTTCTGTTCATCGCTTCTGTATTTATGTTGCACATTTGGGGCAAGTACACTCGTTCGTGA	35
UnaG-Flag-PM	원형질막	ATGGTTGAAAAATTTGTTGGTACGTGGAAAATAGCGGATTCTCATAATTTTGGCGAATATCTGAAGGCTATCGGGGCGCCTAAAGAGCTGAGTGATGGAGGCGATGCCACGACTCCAACTCTGTATATTTCACAGAAGGACGGTGATAAAATGACCGTTAAGATCGAGAATGGCCCGCCCACCTTCCTGGATACACAGGTAAAGTTTAAACTTGGTGAAGAATTTGATGAGTTCCCGAGCGACAGACGCAAAGGTGTTAAATCCGTAGTCAACTTGGTCGGAGAAAAACTCGTATATGTCCAAAAATGGGATGGCAAAGAGACAACCTACGTGCGTGAAATTAAAGACGGGAAACTGGTTGTGACGCTGACAATGGGCGACGTGGTGGCAGTGCGCTCGTACCGGCGTGCAACCGAAGACTACAAGGATGACGACGATAAGGAATTCCGCAGCAAGCTGAACCCCCCCGACGAGAGCGGCCCCGGCTGCATGAGCTGCAAGTGCGTGCTGAGCTGA	36
C1(1-29)-Flag-UnaG	활면소포체	ATGGATCCTGTGGTGGTGCTGGGGCTCTGTCTCTCCTGTTTGCTTCTCCTTTCACTCTGGAAACAGAGCTATGGGGGAGGGTCTGGTGGATCTGGTGGATCTAGAGACTACAAGGATGACGACGATAAGAAGCTAGCAATGGTTGAAAAATTTGTTGGTACGTGGAAAATAGCGGATTCTCATAATTTTGGCGAATATCTGAAGGCTATCGGGGCGCCTAAAGAGCTGAGTGATGGAGGCGATGCCACGACTCCAACTCTGTATATTTCACAGAAGGACGGTGATAAAATGACCGTTAAGATCGAGAATGGCCCGCCCACCTTCCTGGATACACAGGTAAAGTTTAAACTTGGTGAAGAATTTGATGAGTTCCCGAGCGACAGACGCAAAGGTGTTAAATCCGTAGTCAACTTGGTCGGAGAAAAACTCGTATATGTCCAAAAATGGGATGGCAAAGAGACAACCTACGTGCGTGAAATTAAAGACGGGAAACTGGTTGTGACGCTGACAATGGGCGACGTGGTGGCAGTGCGCTCGTACCGGCGTGCAACCGAATAA	37

상기 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다.

상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상기 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다.

상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pcDNA3, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔ1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 (2) 단계는 공초점 형광 현미경 또는 형광 분광 광도계를 이용하여 형광세기를 측정하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 (3) 단계는 면역형광법, 중합효소 연쇄반응, 노던 블랏 또는 유전자미세배열을 이용하여 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 (4) 단계의 결정계수 및 추세를 확인은, UnaG 단백질의 형광세기와 발현 정도를 배경과의 대비하여 이를 수치화 하고, 수치화된 형광세기와 발현 정도를 좌표평면상에 표시하여 (X축: 발현 정도, Y축: 형광세기) 가장 표준편차가 적도록 추세선을 그리고, 상기 추세선의 기울기를 결정계수, 추세선과 각각의 데이터의 차이를 표준편차로 나타낸 것을 분석하여 수행하는 것일 수 있다.

상기 수치화는 선형회귀분석(linear regression model)을 이용하였으며, 하기의 계산식을 이용하였다 (imagej 분석프로그램을 이용).

[계산식 1]

[계산식 2]

상기

는 하나의 픽셀에 해당하는 발현 정도,

는 형광 세기,

는 평균 발현 정도,

는 평균 형광 세기,

는 추세선의 Y절편,

은 추세선의 기울기로서 즉

이 결정계수를 의미한다.

상기 결정계수는 상대적인 발현대비 형광세기 정도를 의미하며, 결정계수가 클수록 빌리루빈이 특정 소기관에 많이 분포함을 의미한다.

상기 표준편차는 각각의 픽셀간의 분포를 의미하며, 표준편차가 작을수록 높은 연관성을 의미한다.

상기 (3) 단계는 세포를 고정 및 투과 처리를 거친 뒤 수행하는 것일 수 있다.

상기 고정은 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 상온에서 반응시키는 것일 수 있으며, 10 내지 20분, 11 내지 19분, 12 내지 18분, 13 내지 17분, 14 내지 16분, 예를 들어, 15분간 반응을 수행하는 것일 수 있다. 상기 상온은 20 내지 30℃, 22 내지 28℃, 24 내지 36℃, 예를 들어 25℃인 것일 수 있다.

상기 투과 처리는 0.4% 트리톤-X100으로 상온에서 반응시키는 것일 수 있으며, 30 내지 90분, 40 내지 80분, 50 내지 70분, 예를 들어, 60분 동안 반응을 수행하는 것일 수 있다. 상기 상온은 20 내지 30℃, 22 내지 28℃, 24 내지 36℃, 예를 들어 25℃인 것일 수 있다.

본 발명은 살아있는 세포 내 소기관에 존재하는 빌리루빈을 검출하는 방법에 관한 것으로, 세포 내 소기관 타겟팅 폴리뉴클레오타이드 및 UnaG 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이를 포함하는 재조합 벡터로 세포를 형질전환하는 단계, 형질전환된 세포에서의 UnaG 단백질의 형광세기를 측정하는 단계, 형질전환된 세포에서의 UnaG 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계, 및 형광세기와 발현 정도를 비교하여 결정계수 및 추세를 확인하는 단계를 포함하는 세포 내 빌리루빈 정량 방법에 관한 것으로, 본 발명은 빌리루빈의 동적 이동과 이와 관련한 매커니즘 규명할 수 있는 가능성을 제시한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 UnaG 단백질이 빌리루빈(bilirubin; BR)과 결합하여 형광을 타나내는 메커니즘을 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 UnaG 단백질이 세포의 목적 소기관에서 발현된 모습을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 UnaG 단백질을 세포 내 목적 소기관에서 발현하기 위한 유전자 구조 지도(Genetic construct map)를 타나낸 그림이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 세포 내의 소기관에 존재하는 빌리루빈의 양을 분석하여 빌리루빈의 동적 이동과 이와 관련된 매커니즘을 나타낸 그림이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 세포 내의 소기관에 존재하는 빌리루빈의 양을 분석하여 빌리루빈의 동적 이동과 이와 관련된 매커니즘을 나타낸 그림이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 내의 소기관(핵, 세포질, 원형질막, 미토콘드리아 기질 및 막 사이 공간, 활면소포체, 조면소포체의 내강 및 외막의 세포질방향, 내강방향)을 타겟팅 할 수 있는 UnaG 단백질을 살아있는 HEK-293T 세포 내에서 발현시켜 공초점 형광 현미경을 통해 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 내의 소기관(핵, 세포질, 원형질막, 미토콘드리아 기질 및 막 사이 공간, 활면소포체, 조면소포체의 내강 및 외막의 세포질방향, 내강방향)을 타겟팅 할 수 있는 UnaG 단백질을 살아있는 N2a 세포 내에서 발현시켜 공초점 형광 현미경을 통해 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 내의 소기관(핵, 세포질, 원형질막, 미토콘드리아 기질 및 막 사이 공간, 활면소포체, 조면소포체의 내강 및 외막의 세포질방향, 내강방향)을 타겟팅 할 수 있는 UnaG 단백질을 살아있는 U2OS 세포 내에서 발현시켜 공초점 형광 현미경을 통해 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 내의 소기관(핵, 세포질, 원형질막, 미토콘드리아 기질 및 막 사이 공간, 활면소포체, 조면소포체의 내강 및 외막의 세포질방향, 내강방향)을 타겟팅 할 수 있는 UnaG 단백질을 살아있는 세포 내에서 발현시켜 공초점 형광 현미경을 통해 분석한 결과를 보여주는 사진이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 HEK-293T 세포에서의 Scatter plot 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 N2a 세포에서의 Scatter plot 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 U2OS 세포에서의 Scatter plot 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 N2a 및 N2a-APP 세포주에서의 UnaG 형광 및 면역형광 결과를 보여주는 사진이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 N2a 및 N2a-APP 세포주에서의 UnaG 형광 및 면역형광 결과를 바탕으로 결정계수를 도식화한 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 재조합 벡터 제작

HEK293T 세포의 각기 다른 세포 소기관(예. 미토콘드리아 기질 공간(mitochondria matrix), 미토콘드리아 이중막 사이 공간(Intermembrane Space of Mitochondrial, IMS), 미토콘드리아의 외막 공간(outer mitochondrial membrane, OMM), 소포체, 핵, 세포질, 골지체 등)에 UnaG 단백질을 도입하기 위하여, 각 세포 소기관으로 타겟팅하는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자와 UnaG 단백질을 코딩하는 유전자 서열(서열번호 23)이 연결된 폴리뉴클레오타이드를 pcDNA3벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였다. 재조합 과정은 본 분야에 잘 알려진 통상의 방법에 따라 수행하였으며, 상기 벡터의 구성 및 특징을 하기 표 8에 정리하였다.

플라스미드	특징	발현위치	Promoter/ Vector	세부사항
UnaG-Flag-NLS	NotI-UnaG-Flag-EcoRI-NLS-Stop-XhoI	핵	CMV/ pCDNA3	NLS: PKKKRKVDPKKKRKVDPKKKRKV Flag: DYKDDDDK
LACTB-UnaG-Flag	NotI-LACTB-BamHI-UnaG-Flag-Stop-XhoI	미토콘드리아 이중막 사이 공간	CMV/ pCDNA3	LACTB(1-68): MYRLLSSVTARAAATAGPAWDGGRRGAHRRPGLPVLGLGWAGGLGLGLGLALGAKLVVGLRGAVPIQS
Tom20-Flag-UnaG	KpnI-Tom20-10aalinker-BamHI-Flag-NheI-UnaG-Stop-XhoI	미토콘드리아 외막	CMV/ pCDNA5	10aa linker : GSSGGSGGSR Tom20 (NM_014765.2)
ScoI-UnaG-Flag	NotI-ScoI-BamHI-UnaG-Flag-Stop-XhoI	미토콘드리아 이중막 사이 공간	CMV/ pCDNA3	Sco1 (NM_004589)
ss-UnaG-Flag-KDEL	EcoRI-IgK ss-ApaI-BglII-UnaG-Flag-KDEL-Stop-NotI	소포체 내강	CMV/ pDisplay	ss: METDTLLLWVLLLWVPGSTGD KDEL: ER retention motif
Mito-UnaG-Flag	NotI-Mito-BamHI-UnaG-Flag-Stop-XhoI	미토콘드리아 기질	CMV/ pCDNA3	Mito matrix targeting sequence: MLATRVFSLVGKRAISTSVCVRAH
Flag-UnaG-NES	NotI-Flag-UnaG-NES-Stop-XhoI	세포질	CMV/ pCDNA3	NES: LQLPPLERLTLD
Sec61B-UnaG-Flag	NotI-Sec61B-NheI-UnaG-Flag-Stop-XhoI	소포체 내강 방향 조면 소포체 막	CMV/ pCDNA3	Sec61B (NM_006808)
UnaG-Flag-Sec61B	NotI-UnaG-Flag-EcoRI-Sec61B-Stop-XhoI	세포질 방향 조면 소포체 막	CMV/ pCDNA3	Sec61B (NM_006808)
UnaG-Flag-PM	NotI-UnaG-Flag-EcoRI-PM-Stop-XhoI	원형질막	CMV/ pCDNA3
ss C1(1-29) P450-linker-Flag-UnaG	NotI-ss C1(1-29) P450-linker-Flag-NheI-UnaG-Stop-XhoI	활면 소포체 막	CMV/ pCDNA3	C1(1-29): MDPVVVLGLCLSCLLLLSLW KQSYGGGKL (endoplasmic reticulum membrane anchor

실시예 2. 형질전환 및 단백질 발현

실시예 1에서 제조한 벡터를 세포에 도입시키기 위해, ATCC에서 구입한 HEK293T 세포, N2a 세포 및 U2OS 세포에 상기 벡터를 리포펙타민(Lipofectamin) transfection reagent를 사용하여 도입하여 형질전환 시켰다.

그 다음, 소태아혈청(Fetal Bovine Serum)이 함유된 MEM(Minimum Essential Medium) 배지에 36℃로 16 내지 24시간동안 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 그 다음, DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)로 3번 씻어주어 단백질이 발현된 세포를 수득하였다.

실시예 3. 단백질 발현 확인

3-1. 공초점 형광 현미경을 통한 살아있는 세포 내의 형광확인

실시예 2의 단백질이 발현된 세포(HEK293T 세포, N2a 세포 및 U2OS 세포)를 4℃ DPBS용액에서 여자파장(excitation wavelength)을 488mm에서, 방사파장 (emission wavelength)을 510mm에서 공초점 형광 현미경을 통해 형광세기를 측정하였다. 그 다음, 최종농도가 10uM이 되도록 빌리루빈을 첨가하여 UnaG 단백질이 포화가 되지는 않았는지 확인한다. 그 결과를 도 6 내지 8에 나타내었다.

도 6 내지 8에서 확인할 수 있듯이, HEK293T 세포, N2a 세포 및 U2OS 세포 모두에서 세포 내 형광이 확인되어, 모든 세포 내 소기관에서 UnaG 단백질이 모두 잘 발현이 잘 되고 빌리루빈을 잘 검출되고 있음을 알 수 있었다. 또한, 기존의 견해와 달리 빌리루빈이 분포하는 정도가 고르지 않아 빌리루빈의 동적 이동과 의학적, 생물학적 메커니즘을 연구할 수 있음을 확인하였다.

3-2. 공초점 형광 현미경을 통한 단백질 발현 확인

실시예 2의 단백질이 발현된 세포(HEK293T 세포, N2a 세포 및 U2OS 세포)를 4% PFA용액(Para-Formaldehyde)으로 상온에서 15분 고정을 시킨 다음, 0.4% Triton X100 용액으로 상온에서 1시간 투과를 진행하였다. 그 다음, 2% BSA가 들어간 DPBS용액으로 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 2%의 투석된 BSA 용액에 1차 항체 (예를 들어, anti-FLAG-mouse antibody) 를 3000:1로 희석하여 1시간동안 상온에서 교반하였다. 그 다음, 1회당 5분씩 총 4회 DPBS로 세포를 씻어주었다. 2%의 투석된 BSA 용액에 2차 항체 (예를 들어, anti-647-mouse antibody) 를 3000:1로 희석하여 1시간동안 상온에서 교반하였다. 그 다음, 1회당 5분씩 총 4회 DPBS로 세포를 씻어주었다.

4℃ DPBS용액에서 UnaG의 형광측정은 각각 여자파장(excitation wavelength)을 488mm에서, 방사파장(emission wavelength)을 510mm에서 공초점 형광 현미경을 통해 형광세기를 측정하였다. UnaG의 발현 정도 측정은 각각 여자파장(excitation wavelength)을 651mm에서, 방사파장(emission wavelength)을 667mm에서 공초점 형광 현미경을 통해 형광세기를 측정하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에서 확인할 수 있듯이, UnaG단백질의 발현 정도를 면역형광법으로 확인하였고 이를 형광세기와 비교하여 정량분석을 가능함을 알 수 있었다.

실시예 3. 세포 내 소기관의 빌리루빈 정량 분석

세포 내 소기관은 조금씩 그 환경이 달라 이에 UnaG의 발현 정도가 달라질 수 있을 가능성이 있기에 각각의 소기관에서 발현되는 정도를 면역형광법을 이용하여 측정하고 그에 해당하는 부분의 형광세기를 비교하여, 발현 정도 대비 형광세기를 측정을 통해 각각의 소기관에 존재하는 빌리루빈의 양을 정량 분석하였다.

구체적으로, 공초점 현광현미경을 통해 얻은 이미지에서 각각의 픽셀이 가지는 형광세기와 발현 정도를 gray scale index(0~255)로 변환하여 즉, 이미지상에서 배경과 대비하여 얼마나 차이를 보이는지를 수치화하였다.

그 다음, 수치화된 형광세기와 발현 정도를 좌표평면상에 표시하여 (X축: 발현 정도, Y축: 형광세기) 가장 표준편차가 적도록 추세선을 그린 후, 이 추세선의 기울기를 결정계수로 표현하고, 추세선과 각각의 데이터의 차이를 표준편차로 나타낸 것을 분석하였다. 그 결과를 도 10 내지 14, 및 표 9에 나타내었다.

세포내 소기관	셀 라인 구분	결정계수
UnaG-Sec61B	N2a	2.11
UnaG-Sec61B	N2a-APP	0.64
KDEL	N2a	0.62
KDEL	N2a-APP	0.20
NLS	N2a	1.66
NLS	N2a-APP	0.93
Mito	N2a	0.61
Mito	N2a-APP	0.16
PM	N2a	1.39
PM	N2a-APP	0.29

도 13 내지 14 및 표 9에서 확인할 수 있듯이, APP 단백질의 유무로 인해 세포 내 여러 소기관에서 빌리루빈 양을 줄여주는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 APP 단백질에 의한 빌리루빈의 의학적, 생물학적 매커니즘을 연구할 수 있는 좋은 수단으로 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

<110> UNIST(ULSAN NATIONAL INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY) <120> method for detecting subcellular bilirubin by UnaG protein <130> DPP20154502KR <160> 48 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS <400> 1 agcagggccg accccaagaa gaagaggaag gtggacccca agaagaagag gaaggtggac 60 cccaagaaga agaggaaggt g 81 <210> 2 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LACTB <400> 2 atgtaccggc tcctgtcaag cgtgacagct cgggctgcgg ccaccgcagg cccagcctgg 60 gacggagggc ggcgcggggc gcacaggcga ccgggcctgc ctgtgctggg ccttggttgg 120 gccggcggcc tggggctcgg gctggggctg gctctcggcg cgaagctggt ggtcgggctg 180 cggggcgccg tccccattca gtcc 204 <210> 3 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tom20 <400> 3 atggtgggtc ggaacagcgc catcgccgcc ggtgtatgcg gggccctttt cattgggtac 60 tgcatctact tcgaccgcaa aagacgaagt gaccccaact tcaagaacag gcttcgagaa 120 cgaagaaaga aacagaagct tgccaaggag agagctgggc tttccaagtt acctgacctt 180 aaagatgctg aagctgttca gaagttcttc cttgaagaaa tacagcttgg tgaagagtta 240 ctagctcaag gtgaatatga gaagggcgta gaccatctga caaatgcaat tgctgtgtgt 300 ggacagccac agcagttact gcaggtctta cagcaaactc ttccaccacc agtgttccag 360 atgcttctga ctaagctccc aacaattagt cagagaattg taagtgctca gagcttggct 420 gaagatgatg tggaa 435 <210> 4 <211> 903 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ScoI <400> 4 atggcgatgc tggtcctagt acccggacga gttatgcggc ctctgggtgg ccaactttgg 60 cgcttcttgc ctcgcggact cgagttttgg ggcccagccg aggggactgc gagagtcttg 120 ctgaggcagt tctgcgcgcg gcaagcggag gcgtggcgtg cctcggggcg ccctggctat 180 tgcctgggaa cccggcccct cagcactgcg aggccgccac ccccgtggtc gcagaagggc 240 cccggagact ccacgcgccc ctcgaagccc gggcctgttt cctggaagtc tttagcaatc 300 acatttgcta ttggaggagc tttactggct ggaatgaagc acgtcaagaa agaaaaggca 360 gagaagttag agaaggaacg gcagcgacac atcggcaagc ctttacttgg gggaccgttt 420 tccctcacaa ctcatactgg ggagcgtaaa actgacaagg actacttggg tcagtggtta 480 ttgatttatt ttggcttcac tcattgccct gatgtctgtc cagaagaact agaaaagatg 540 attcaagtcg tggatgaaat agatagcatt acaactctgc cagatctaac tccacttttc 600 atcagcattg acccagagag ggacacaaaa gaagccatcg caaattatgt gaaagaattt 660 tctcccaaac tggttggctt gactggcacg agagaagagg tcgatcaagt ggccagagca 720 tacagagtgt attacagccc tggccccaag gacgaagatg aagactacat agtggatcac 780 acaataataa tgtacttgat tggaccagat ggtgagtttc tagattattt tggccagaac 840 aagaggaagg gagaaatagc tgcttcaatt gccacacaca tgaggccata cagaaaaaag 900 agc 903 <210> 5 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KDEL <400> 5 aaggacgagc tg 12 <210> 6 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mito <400> 6 atgctggcca cccgcgtgtt cagcctggtg ggcaagcgcg ccatcagcac cagcgtgtgc 60 gtgcgcgccc ac 72 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NES <400> 7 ctgcagctgc cccccctgga gcgcctgacc ctggac 36 <210> 8 <211> 288 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sec61B <400> 8 atgcctggtc cgacccccag tggcactaac gtgggatcct cagggcgctc tcccagcaaa 60 gcagtggccg cccgggcggc gggatccact gtccggcaga ggaaaaatgc cagctgtggg 120 acaaggagtg caggccgcac aacctcggca ggcaccgggg ggatgtggcg attctacaca 180 gaagattcac ctgggctcaa agttggccct gttccagtat tggttatgag tcttctgttc 240 atcgcttctg tatttatgtt gcacatttgg ggcaagtaca ctcgttcg 288 <210> 9 <211> 288 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sec61 <400> 9 atgcctggtc cgacccccag tggcactaac gtgggatcct cagggcgctc tcccagcaaa 60 gcagtggccg cccgggcggc gggatccact gtccggcaga ggaaaaatgc cagctgtggg 120 acaaggagtg caggccgcac aacctcggca ggcaccgggg ggatgtggcg attctacaca 180 gaagattcac ctgggctcaa agttggccct gttccagtat tggttatgag tcttctgttc 240 atcgcttctg tatttatgtt gcacatttgg ggcaagtaca ctcgttcg 288 <210> 10 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PM <400> 10 cgcagcaagc tgaacccccc cgacgagagc ggccccggct gcatgagctg caagtgcgtg 60 ctgagc 66 <210> 11 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C1(1-29) <400> 11 atggatcctg tggtggtgct ggggctctgt ctctcctgtt tgcttctcct ttcactctgg 60 aaacagagct atgggggagg g 81 <210> 12 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS <400> 12 Ser Arg Ala Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Pro Lys Lys Lys 1 5 10 15 Arg Lys Val Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 13 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LACTB <400> 13 Met Tyr Arg Leu Leu Ser Ser Val Thr Ala Arg Ala Ala Ala Thr Ala 1 5 10 15 Gly Pro Ala Trp Asp Gly Gly Arg Arg Gly Ala His Arg Arg Pro Gly 20 25 30 Leu Pro Val Leu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Gly Leu Gly Leu Gly Leu 35 40 45 Gly Leu Ala Leu Gly Ala Lys Leu Val Val Gly Leu Arg Gly Ala Val 50 55 60 Pro Ile Gln Ser 65 <210> 14 <211> 145 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tom20 <400> 14 Met Val Gly Arg Asn Ser Ala Ile Ala Ala Gly Val Cys Gly Ala Leu 1 5 10 15 Phe Ile Gly Tyr Cys Ile Tyr Phe Asp Arg Lys Arg Arg Ser Asp Pro 20 25 30 Asn Phe Lys Asn Arg Leu Arg Glu Arg Arg Lys Lys Gln Lys Leu Ala 35 40 45 Lys Glu Arg Ala Gly Leu Ser Lys Leu Pro Asp Leu Lys Asp Ala Glu 50 55 60 Ala Val Gln Lys Phe Phe Leu Glu Glu Ile Gln Leu Gly Glu Glu Leu 65 70 75 80 Leu Ala Gln Gly Glu Tyr Glu Lys Gly Val Asp His Leu Thr Asn Ala 85 90 95 Ile Ala Val Cys Gly Gln Pro Gln Gln Leu Leu Gln Val Leu Gln Gln 100 105 110 Thr Leu Pro Pro Pro Val Phe Gln Met Leu Leu Thr Lys Leu Pro Thr 115 120 125 Ile Ser Gln Arg Ile Val Ser Ala Gln Ser Leu Ala Glu Asp Asp Val 130 135 140 Glu 145 <210> 15 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ScoI <400> 15 Met Ala Met Leu Val Leu Val Pro Gly Arg Val Met Arg Pro Leu Gly 1 5 10 15 Gly Gln Leu Trp Arg Phe Leu Pro Arg Gly Leu Glu Phe Trp Gly Pro 20 25 30 Ala Glu Gly Thr Ala Arg Val Leu Leu Arg Gln Phe Cys Ala Arg Gln 35 40 45 Ala Glu Ala Trp Arg Ala Ser Gly Arg Pro Gly Tyr Cys Leu Gly Thr 50 55 60 Arg Pro Leu Ser Thr Ala Arg Pro Pro Pro Pro Trp Ser Gln Lys Gly 65 70 75 80 Pro Gly Asp Ser Thr Arg Pro Ser Lys Pro Gly Pro Val Ser Trp Lys 85 90 95 Ser Leu Ala Ile Thr Phe Ala Ile Gly Gly Ala Leu Leu Ala Gly Met 100 105 110 Lys His Val Lys Lys Glu Lys Ala Glu Lys Leu Glu Lys Glu Arg Gln 115 120 125 Arg His Ile Gly Lys Pro Leu Leu Gly Gly Pro Phe Ser Leu Thr Thr 130 135 140 His Thr Gly Glu Arg Lys Thr Asp Lys Asp Tyr Leu Gly Gln Trp Leu 145 150 155 160 Leu Ile Tyr Phe Gly Phe Thr His Cys Pro Asp Val Cys Pro Glu Glu 165 170 175 Leu Glu Lys Met Ile Gln Val Val Asp Glu Ile Asp Ser Ile Thr Thr 180 185 190 Leu Pro Asp Leu Thr Pro Leu Phe Ile Ser Ile Asp Pro Glu Arg Asp 195 200 205 Thr Lys Glu Ala Ile Ala Asn Tyr Val Lys Glu Phe Ser Pro Lys Leu 210 215 220 Val Gly Leu Thr Gly Thr Arg Glu Glu Val Asp Gln Val Ala Arg Ala 225 230 235 240 Tyr Arg Val Tyr Tyr Ser Pro Gly Pro Lys Asp Glu Asp Glu Asp Tyr 245 250 255 Ile Val Asp His Thr Ile Ile Met Tyr Leu Ile Gly Pro Asp Gly Glu 260 265 270 Phe Leu Asp Tyr Phe Gly Gln Asn Lys Arg Lys Gly Glu Ile Ala Ala 275 280 285 Ser Ile Ala Thr His Met Arg Pro Tyr Arg Lys Lys Ser 290 295 300 <210> 16 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KDEL <400> 16 Lys Asp Glu Leu 1 <210> 17 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mito <400> 17 Met Leu Ala Thr Arg Val Phe Ser Leu Val Gly Lys Arg Ala Ile Ser 1 5 10 15 Thr Ser Val Cys Val Arg Ala His 20 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NES <400> 18 Leu Gln Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu Asp 1 5 10 <210> 19 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sec61B <400> 19 Pro Gly Pro Thr Pro Ser Gly Thr Asn Val Gly Ser Ser Gly Arg Ser 1 5 10 15 Pro Ser Lys Ala Val Ala Ala Arg Ala Ala Gly Ser Thr Val Arg Gln 20 25 30 Arg Lys Asn Ala Ser Cys Gly Thr Arg Ser Ala Gly Arg Thr Thr Ser 35 40 45 Ala Gly Thr Gly Gly Met Trp Arg Phe Tyr Thr Glu Asp Ser Pro Gly 50 55 60 Leu Lys Val Gly Pro Val Pro Val Leu Val Met Ser Leu Leu Phe Ile 65 70 75 80 Ala Ser Val Phe Met Leu His Ile Trp Gly Lys Tyr Thr Arg Ser 85 90 95 <210> 20 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sec61 <400> 20 Met Pro Gly Pro Thr Pro Ser Gly Thr Asn Val Gly Ser Ser Gly Arg 1 5 10 15 Ser Pro Ser Lys Ala Val Ala Ala Arg Ala Ala Gly Ser Thr Val Arg 20 25 30 Gln Arg Lys Asn Ala Ser Cys Gly Thr Arg Ser Ala Gly Arg Thr Thr 35 40 45 Ser Ala Gly Thr Gly Gly Met Trp Arg Phe Tyr Thr Glu Asp Ser Pro 50 55 60 Gly Leu Lys Val Gly Pro Val Pro Val Leu Val Met Ser Leu Leu Phe 65 70 75 80 Ile Ala Ser Val Phe Met Leu His Ile Trp Gly Lys Tyr Thr Arg Ser 85 90 95 <210> 21 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PM <400> 21 Arg Ser Lys Leu Asn Pro Pro Asp Glu Ser Gly Pro Gly Cys Met Ser 1 5 10 15 Cys Lys Cys Val Leu Ser 20 <210> 22 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C1(1-29) <400> 22 Met Asp Pro Val Val Val Leu Gly Leu Cys Leu Ser Cys Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Trp Lys Gln Ser Tyr Gly Gly Gly 20 25 <210> 23 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UnaG <400> 23 atggttgaaa aatttgttgg tacgtggaaa atagcggatt ctcataattt tggcgaatat 60 ctgaaggcta tcggggcgcc taaagagctg agtgatggag gcgatgccac gactccaact 120 ctgtatattt cacagaagga cggtgataaa atgaccgtta agatcgagaa tggcccgccc 180 accttcctgg atacacaggt aaagtttaaa cttggtgaag aatttgatga gttcccgagc 240 gacagacgca aaggtgttaa atccgtagtc aacttggtcg gagaaaaact cgtatatgtc 300 caaaaatggg atggcaaaga gacaacctac gtgcgtgaaa ttaaagacgg gaaactggtt 360 gtgacgctga caatgggcga cgtggtggca gtgcgctcgt accggcgtgc aaccgaa 417 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG tag <400> 24 gactacaagg atgacgacga taag 24 <210> 25 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UnaG <400> 25 Met Val Glu Lys Phe Val Gly Thr Trp Lys Ile Ala Asp Ser His Asn 1 5 10 15 Phe Gly Glu Tyr Leu Lys Ala Ile Gly Ala Pro Lys Glu Leu Ser Asp 20 25 30 Gly Gly Asp Ala Thr Thr Pro Thr Leu Tyr Ile Ser Gln Lys Asp Gly 35 40 45 Asp Lys Met Thr Val Lys Ile Glu Asn Gly Pro Pro Thr Phe Leu Asp 50 55 60 Thr Gln Val Lys Phe Lys Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Phe Pro Ser 65 70 75 80 Asp Arg Arg Lys Gly Val Lys Ser Val Val Asn Leu Val Gly Glu Lys 85 90 95 Leu Val Tyr Val Gln Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Thr Tyr Val Arg 100 105 110 Glu Ile Lys Asp Gly Lys Leu Val Val Thr Leu 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<400> 28 atgtaccggc tcctgtcaag cgtgacagct cgggctgcgg ccaccgcagg cccagcctgg 60 gacggagggc ggcgcggggc gcacaggcga ccgggcctgc ctgtgctggg ccttggttgg 120 gccggcggcc tggggctcgg gctggggctg gctctcggcg cgaagctggt ggtcgggctg 180 cggggcgccg tccccattca gtccatggtt gaaaaatttg ttggtacgtg gaaaatagcg 240 gattctcata attttggcga atatctgaag gctatcgggg cgcctaaaga gctgagtgat 300 ggaggcgatg ccacgactcc aactctgtat atttcacaga aggacggtga taaaatgacc 360 gttaagatcg agaatggccc gcccaccttc ctggatacac aggtaaagtt taaacttggt 420 gaagaatttg atgagttccc gagcgacaga cgcaaaggtg ttaaatccgt agtcaacttg 480 gtcggagaaa aactcgtata tgtccaaaaa tgggatggca aagagacaac ctacgtgcgt 540 gaaattaaag acgggaaact ggttgtgacg ctgacaatgg gcgacgtggt ggcagtgcgc 600 tcgtaccggc gtgcaaccga agactacaag gatgacgacg ataagtaa 648 <210> 29 <211> 918 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tom20-flag-UnaG <400> 29 atggtgggtc ggaacagcgc catcgccgcc ggtgtatgcg gggccctttt cattgggtac 60 tgcatctact tcgaccgcaa aagacgaagt gaccccaact tcaagaacag gcttcgagaa 120 cgaagaaaga aacagaagct tgccaaggag agagctgggc tttccaagtt acctgacctt 180 aaagatgctg aagctgttca gaagttcttc cttgaagaaa tacagcttgg tgaagagtta 240 ctagctcaag gtgaatatga gaagggcgta gaccatctga caaatgcaat tgctgtgtgt 300 ggacagccac agcagttact gcaggtctta cagcaaactc ttccaccacc agtgttccag 360 atgcttctga ctaagctccc aacaattagt cagagaattg taagtgctca gagcttggct 420 gaagatgatg tggaaggatc ctctggtgga tctggtggat ctagagacta caaggatgac 480 gacgataaga agctagcaat ggttgaaaaa tttgttggta cgtggaaaat agcggattct 540 cataattttg gcgaatatct gaaggctatc ggggcgccta aagagctgag tgatggaggc 600 gatgccacga ctccaactct gtatatttca cagaaggacg gtgataaaat gaccgttaag 660 atcgagaatg gcccgcccac cttcctggat acacaggtaa agtttaaact tggtgaagaa 720 tttgatgagt tcccgagcga cagacgcaaa ggtgttaaat ccgtagtcaa cttggtcgga 780 gaaaaactcg tatatgtcca aaaatgggat ggcaaagaga caacctacgt gcgtgaaatt 840 aaagacggga aactggttgt gacgctgaca atgggcgacg tggtggcagt gcgctcgtac 900 cggcgtgcaa ccgaataa 918 <210> 30 <211> 1356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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gttaagatcg agaatggccc gcccaccttc ctggatacac aggtaaagtt taaacttggt 300 gaagaatttg atgagttccc gagcgacaga cgcaaaggtg ttaaatccgt agtcaacttg 360 gtcggagaaa aactcgtata tgtccaaaaa tgggatggca aagagacaac ctacgtgcgt 420 gaaattaaag acgggaaact ggttgtgacg ctgacaatgg gcgacgtggt ggcagtgcgc 480 tcgtaccggc gtgcaaccga agactacaag gatgacgacg ataagaagga cgagctgtga 540 540 <210> 32 <211> 525 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mito-UnaG-flag <400> 32 atgctggcca cccgcgtgtt cagcctggtg ggcaagcgcg ccatcagcac cagcgtgtgc 60 gtgcgcgccc acaaggatcc aatggttgaa aaatttgttg gtacgtggaa aatagcggat 120 tctcataatt ttggcgaata tctgaaggct atcggggcgc ctaaagagct gagtgatgga 180 ggcgatgcca cgactccaac tctgtatatt tcacagaagg acggtgataa aatgaccgtt 240 aagatcgaga atggcccgcc caccttcctg gatacacagg taaagtttaa acttggtgaa 300 gaatttgatg agttcccgag cgacagacgc aaaggtgtta aatccgtagt caacttggtc 360 ggagaaaaac tcgtatatgt ccaaaaatgg gatggcaaag agacaaccta cgtgcgtgaa 420 attaaagacg ggaaactggt tgtgacgctg acaatgggcg acgtggtggc agtgcgctcg 480 taccggcgtg caaccgaaga ctacaaggat gacgacgata agtaa 525 <210> 33 <211> 483 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Flag-UnaG-NES <400> 33 atggactaca aggatgacga cgataagatg gttgaaaaat ttgttggtac gtggaaaata 60 gcggattctc ataattttgg cgaatatctg aaggctatcg gggcgcctaa agagctgagt 120 gatggaggcg atgccacgac tccaactctg tatatttcac agaaggacgg tgataaaatg 180 accgttaaga tcgagaatgg cccgcccacc ttcctggata cacaggtaaa gtttaaactt 240 ggtgaagaat ttgatgagtt cccgagcgac agacgcaaag gtgttaaatc cgtagtcaac 300 ttggtcggag aaaaactcgt atatgtccaa aaatgggatg gcaaagagac aacctacgtg 360 cgtgaaatta aagacgggaa actggttgtg acgctgacaa tgggcgacgt ggtggcagtg 420 cgctcgtacc ggcgtgcaac cgaactgcag ctgccccccc tggagcgcct gaccctggac 480 taa 483 <210> 34 <211> 741 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sec61B-UnaG-Flag <400> 34 atgcctggtc cgacccccag tggcactaac gtgggatcct cagggcgctc tcccagcaaa 60 gcagtggccg cccgggcggc gggatccact gtccggcaga ggaaaaatgc cagctgtggg 120 acaaggagtg caggccgcac aacctcggca ggcaccgggg ggatgtggcg attctacaca 180 gaagattcac ctgggctcaa agttggccct gttccagtat tggttatgag tcttctgttc 240 atcgcttctg tatttatgtt gcacatttgg ggcaagtaca ctcgttcgaa gctagcaatg 300 gttgaaaaat ttgttggtac gtggaaaata gcggattctc ataattttgg cgaatatctg 360 aaggctatcg gggcgcctaa agagctgagt gatggaggcg atgccacgac tccaactctg 420 tatatttcac agaaggacgg tgataaaatg accgttaaga tcgagaatgg cccgcccacc 480 ttcctggata cacaggtaaa gtttaaactt ggtgaagaat ttgatgagtt cccgagcgac 540 agacgcaaag gtgttaaatc cgtagtcaac ttggtcggag aaaaactcgt atatgtccaa 600 aaatgggatg gcaaagagac aacctacgtg cgtgaaatta aagacgggaa actggttgtg 660 acgctgacaa tgggcgacgt ggtggcagtg cgctcgtacc ggcgtgcaac cgaagactac 720 aaggatgacg acgataagta a 741 <210> 35 <211> 738 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UnaG-Flag-Sec61 <400> 35 atggttgaaa aatttgttgg tacgtggaaa atagcggatt ctcataattt tggcgaatat 60 ctgaaggcta tcggggcgcc taaagagctg agtgatggag gcgatgccac gactccaact 120 ctgtatattt cacagaagga cggtgataaa atgaccgtta agatcgagaa tggcccgccc 180 accttcctgg atacacaggt aaagtttaaa cttggtgaag aatttgatga gttcccgagc 240 gacagacgca aaggtgttaa atccgtagtc aacttggtcg gagaaaaact cgtatatgtc 300 caaaaatggg atggcaaaga gacaacctac gtgcgtgaaa ttaaagacgg gaaactggtt 360 gtgacgctga caatgggcga cgtggtggca gtgcgctcgt accggcgtgc aaccgaagac 420 tacaaggatg acgacgataa ggaattcatg cctggtccga cccccagtgg cactaacgtg 480 ggatcctcag ggcgctctcc cagcaaagca gtggccgccc gggcggcggg atccactgtc 540 cggcagagga aaaatgccag ctgtgggaca aggagtgcag gccgcacaac ctcggcaggc 600 accgggggga tgtggcgatt ctacacagaa gattcacctg ggctcaaagt tggccctgtt 660 ccagtattgg ttatgagtct tctgttcatc gcttctgtat ttatgttgca catttggggc 720 aagtacactc gttcgtga 738 <210> 36 <211> 516 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UnaG-Flag-PM <400> 36 atggttgaaa aatttgttgg tacgtggaaa atagcggatt ctcataattt tggcgaatat 60 ctgaaggcta tcggggcgcc taaagagctg agtgatggag gcgatgccac gactccaact 120 ctgtatattt cacagaagga cggtgataaa atgaccgtta agatcgagaa tggcccgccc 180 accttcctgg atacacaggt aaagtttaaa cttggtgaag aatttgatga gttcccgagc 240 gacagacgca aaggtgttaa atccgtagtc aacttggtcg gagaaaaact cgtatatgtc 300 caaaaatggg atggcaaaga gacaacctac gtgcgtgaaa ttaaagacgg gaaactggtt 360 gtgacgctga caatgggcga cgtggtggca gtgcgctcgt accggcgtgc aaccgaagac 420 tacaaggatg acgacgataa ggaattccgc agcaagctga acccccccga cgagagcggc 480 cccggctgca tgagctgcaa gtgcgtgctg agctga 516 <210> 37 <211> 558 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C1(1-29)-Flag-UnaG <400> 37 atggatcctg tggtggtgct ggggctctgt ctctcctgtt tgcttctcct ttcactctgg 60 aaacagagct atgggggagg gtctggtgga tctggtggat ctagagacta caaggatgac 120 gacgataaga agctagcaat ggttgaaaaa tttgttggta cgtggaaaat agcggattct 180 cataattttg gcgaatatct gaaggctatc ggggcgccta aagagctgag tgatggaggc 240 gatgccacga ctccaactct gtatatttca cagaaggacg gtgataaaat gaccgttaag 300 atcgagaatg gcccgcccac cttcctggat acacaggtaa agtttaaact tggtgaagaa 360 tttgatgagt tcccgagcga cagacgcaaa ggtgttaaat ccgtagtcaa cttggtcgga 420 gaaaaactcg tatatgtcca aaaatgggat ggcaaagaga caacctacgt gcgtgaaatt 480 aaagacggga aactggttgt gacgctgaca atgggcgacg tggtggcagt gcgctcgtac 540 cggcgtgcaa ccgaataa 558 <210> 38 <211> 176 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UnaG-Flag-NLS <400> 38 Met Val Glu Lys Phe Val Gly Thr Trp Lys Ile Ala Asp Ser His Asn 1 5 10 15 Phe Gly Glu Tyr Leu Lys Ala Ile Gly Ala Pro Lys Glu Leu Ser Asp 20 25 30 Gly Gly Asp Ala Thr Thr Pro Thr Leu Tyr Ile Ser Gln Lys Asp Gly 35 40 45 Asp Lys Met Thr Val Lys Ile Glu Asn Gly Pro Pro Thr Phe Leu Asp 50 55 60 Thr Gln Val Lys Phe Lys Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Phe Pro Ser 65 70 75 80 Asp Arg Arg Lys Gly Val Lys Ser Val Val Asn Leu Val Gly Glu Lys 85 90 95 Leu Val Tyr Val Gln Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Thr Tyr Val Arg 100 105 110 Glu Ile Lys Asp Gly Lys Leu Val Val Thr Leu Thr Met Gly Asp Val 115 120 125 Val Ala Val Arg Ser Tyr Arg Arg Ala Thr Glu Asp Tyr Lys Asp Asp 130 135 140 Asp Asp Lys Glu Phe Ser Arg Ala Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 145 150 155 160 Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 165 170 175 <210> 39 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LACTB-UnaG-Flag <400> 39 Met Tyr Arg Leu Leu Ser Ser Val Thr Ala Arg Ala Ala Ala Thr Ala 1 5 10 15 Gly Pro Ala Trp Asp Gly Gly Arg Arg Gly Ala His Arg Arg Pro Gly 20 25 30 Leu Pro Val Leu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Gly Leu Gly Leu Gly Leu 35 40 45 Gly Leu Ala Leu Gly Ala Lys Leu Val Val Gly Leu Arg Gly Ala Val 50 55 60 Pro Ile Gln Ser Arg Asp Pro Met Val Glu Lys Phe Val Gly Thr Trp 65 70 75 80 Lys Ile Ala Asp Ser His Asn Phe Gly Glu Tyr Leu Lys Ala Ile Gly 85 90 95 Ala Pro Lys Glu Leu Ser Asp Gly Gly Asp Ala Thr Thr Pro Thr Leu 100 105 110 Tyr Ile Ser Gln Lys Asp Gly Asp Lys Met Thr Val Lys Ile Glu Asn 115 120 125 Gly Pro Pro Thr Phe Leu Asp Thr Gln Val Lys Phe Lys Leu Gly Glu 130 135 140 Glu Phe Asp Glu Phe Pro Ser Asp Arg Arg Lys Gly Val Lys Ser Val 145 150 155 160 Val Asn Leu Val Gly Glu Lys Leu Val Tyr Val Gln Lys Trp Asp Gly 165 170 175 Lys Glu Thr Thr Tyr Val Arg Glu Ile Lys Asp Gly Lys Leu Val Val 180 185 190 Thr Leu Thr Met Gly Asp Val Val Ala Val Arg Ser Tyr Arg Arg Ala 195 200 205 Thr Glu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 210 215 <210> 40 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tom20-flag-UnaG <400> 40 Met Val Gly Arg Asn Ser Ala Ile Ala Ala Gly Val Cys Gly Ala Leu 1 5 10 15 Phe Ile Gly Tyr Cys Ile Tyr Phe Asp Arg Lys Arg Arg Ser Asp Pro 20 25 30 Asn Phe Lys Asn Arg Leu Arg Glu Arg Arg Lys Lys Gln Lys Leu Ala 35 40 45 Lys Glu Arg Ala Gly Leu Ser Lys Leu Pro Asp Leu Lys Asp Ala Glu 50 55 60 Ala Val Gln Lys Phe Phe Leu Glu Glu Ile Gln Leu Gly Glu Glu Leu 65 70 75 80 Leu Ala Gln Gly Glu Tyr Glu Lys Gly Val Asp His Leu Thr Asn Ala 85 90 95 Ile Ala Val Cys Gly Gln Pro Gln Gln Leu Leu Gln Val Leu Gln Gln 100 105 110 Thr Leu Pro Pro Pro Val Phe Gln Met Leu Leu Thr Lys Leu Pro Thr 115 120 125 Ile Ser Gln Arg Ile Val Ser Ala Gln Ser Leu Ala Glu Asp Asp Val 130 135 140 Glu Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Arg Asp Tyr Lys Asp Asp 145 150 155 160 Asp Asp Lys Lys Leu Ala Met Val Glu Lys Phe Val Gly Thr Trp Lys 165 170 175 Ile Ala Asp Ser His Asn Phe Gly Glu Tyr Leu Lys Ala Ile Gly Ala 180 185 190 Pro Lys Glu Leu Ser Asp Gly Gly Asp Ala Thr Thr Pro Thr Leu Tyr 195 200 205 Ile Ser Gln Lys Asp Gly Asp Lys Met Thr Val Lys Ile Glu Asn Gly 210 215 220 Pro Pro Thr Phe Leu Asp Thr Gln Val Lys Phe Lys Leu Gly Glu Glu 225 230 235 240 Phe Asp Glu Phe Pro Ser Asp Arg Arg Lys Gly Val Lys Ser Val Val 245 250 255 Asn Leu Val Gly Glu Lys Leu Val Tyr Val Gln Lys Trp Asp Gly Lys 260 265 270 Glu Thr Thr Tyr Val Arg Glu Ile Lys Asp Gly Lys Leu Val Val Thr 275 280 285 Leu Thr Met Gly Asp Val Val Ala Val Arg Ser Tyr Arg Arg Ala Thr 290 295 300 Glu 305 <210> 41 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ScoI-UnaG-flag <400> 41 Met Ala Met Leu Val Leu Val Pro Gly Arg Val Met Arg Pro Leu Gly 1 5 10 15 Gly Gln Leu Trp Arg Phe Leu Pro Arg Gly Leu Glu Phe Trp Gly Pro 20 25 30 Ala Glu Gly Thr Ala Arg Val Leu Leu Arg Gln Phe Cys Ala Arg Gln 35 40 45 Ala Glu Ala Trp Arg Ala Ser Gly Arg Pro Gly Tyr Cys Leu Gly Thr 50 55 60 Arg Pro Leu Ser Thr Ala Arg Pro Pro Pro Pro Trp Ser Gln Lys Gly 65 70 75 80 Pro Gly Asp Ser Thr Arg Pro Ser Lys Pro Gly Pro Val Ser Trp Lys 85 90 95 Ser Leu Ala Ile Thr Phe Ala Ile Gly Gly Ala Leu Leu Ala Gly Met 100 105 110 Lys His Val Lys Lys Glu Lys Ala Glu Lys Leu Glu Lys Glu Arg Gln 115 120 125 Arg His Ile Gly Lys Pro Leu Leu Gly Gly Pro Phe Ser Leu Thr Thr 130 135 140 His Thr Gly Glu Arg Lys Thr Asp Lys Asp Tyr Leu Gly Gln Trp Leu 145 150 155 160 Leu Ile Tyr Phe Gly Phe Thr His Cys Pro Asp Val Cys Pro Glu Glu 165 170 175 Leu Glu Lys Met Ile Gln Val Val Asp Glu Ile Asp Ser Ile Thr Thr 180 185 190 Leu Pro Asp Leu Thr Pro Leu Phe Ile Ser Ile Asp Pro Glu Arg Asp 195 200 205 Thr Lys Glu Ala Ile Ala Asn Tyr Val Lys Glu Phe Ser Pro Lys Leu 210 215 220 Val Gly Leu Thr Gly Thr Arg Glu Glu Val Asp Gln Val Ala Arg Ala 225 230 235 240 Tyr Arg Val Tyr Tyr Ser Pro Gly Pro Lys Asp Glu Asp Glu Asp Tyr 245 250 255 Ile Val Asp His Thr Ile Ile Met Tyr Leu Ile Gly Pro Asp Gly Glu 260 265 270 Phe Leu Asp Tyr Phe Gly Gln Asn Lys Arg Lys Gly Glu Ile Ala Ala 275 280 285 Ser Ile Ala Thr His Met Arg Pro Tyr Arg Lys Lys Ser Lys Asp Pro 290 295 300 Met Val Glu Lys Phe Val Gly Thr Trp Lys Ile Ala Asp Ser His Asn 305 310 315 320 Phe Gly Glu Tyr Leu Lys Ala Ile Gly Ala Pro Lys Glu Leu Ser Asp 325 330 335 Gly Gly Asp Ala Thr Thr Pro Thr Leu Tyr Ile Ser Gln Lys Asp Gly 340 345 350 Asp Lys Met Thr Val Lys Ile Glu Asn Gly Pro Pro Thr Phe Leu Asp 355 360 365 Thr Gln Val Lys Phe Lys Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Phe Pro Ser 370 375 380 Asp Arg Arg Lys Gly Val Lys Ser Val Val Asn Leu Val Gly Glu Lys 385 390 395 400 Leu Val Tyr Val Gln Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Thr Tyr Val Arg 405 410 415 Glu Ile Lys Asp Gly Lys Leu Val Val Thr Leu Thr Met Gly Asp Val 420 425 430 Val Ala Val Arg Ser Tyr Arg Arg Ala Thr Glu Asp Tyr Lys Asp Asp 435 440 445 Asp Asp Lys 450 <210> 42 <211> 179 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ss-UnaG-KDEL-Flag <400> 42 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Gly Ala Gln Pro Ala Arg Ser Met Val Glu Lys 20 25 30 Phe Val Gly Thr Trp Lys Ile Ala Asp Ser His Asn Phe Gly Glu Tyr 35 40 45 Leu Lys Ala Ile Gly Ala Pro Lys Glu Leu Ser Asp Gly Gly Asp Ala 50 55 60 Thr Thr Pro Thr Leu Tyr Ile Ser Gln Lys Asp Gly Asp Lys Met Thr 65 70 75 80 Val Lys Ile Glu Asn Gly Pro Pro Thr Phe Leu Asp Thr Gln Val Lys 85 90 95 Phe Lys Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Phe Pro Ser Asp Arg Arg Lys 100 105 110 Gly Val Lys Ser Val Val Asn Leu Val Gly Glu Lys Leu Val Tyr Val 115 120 125 Gln Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Thr Tyr Val Arg Glu Ile Lys Asp 130 135 140 Gly Lys Leu Val Val Thr Leu Thr Met Gly Asp Val Val Ala Val Arg 145 150 155 160 Ser Tyr Arg Arg Ala Thr Glu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Lys 165 170 175 Asp Glu Leu <210> 43 <211> 174 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mito-UnaG-flag <400> 43 Met Leu Ala Thr Arg Val Phe Ser Leu Val Gly Lys Arg Ala Ile Ser 1 5 10 15 Thr Ser Val Cys Val Arg Ala His Lys Asp Pro Met Val Glu Lys Phe 20 25 30 Val Gly Thr Trp Lys Ile Ala Asp Ser His Asn Phe Gly Glu Tyr Leu 35 40 45 Lys Ala Ile Gly Ala Pro Lys Glu Leu Ser Asp Gly Gly Asp Ala Thr 50 55 60 Thr Pro Thr Leu Tyr Ile Ser Gln Lys Asp Gly Asp Lys Met Thr Val 65 70 75 80 Lys Ile Glu Asn Gly Pro Pro Thr Phe Leu Asp Thr Gln Val Lys Phe 85 90 95 Lys Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Phe Pro Ser Asp Arg Arg Lys Gly 100 105 110 Val Lys Ser Val Val Asn Leu Val Gly Glu Lys Leu Val Tyr Val Gln 115 120 125 Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Thr Tyr Val Arg Glu Ile Lys Asp Gly 130 135 140 Lys Leu Val Val Thr Leu Thr Met Gly Asp Val Val Ala Val Arg Ser 145 150 155 160 Tyr Arg Arg Ala Thr Glu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 165 170 <210> 44 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flag-UnaG-NES <400> 44 Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Val Glu Lys Phe Val Gly 1 5 10 15 Thr Trp Lys Ile Ala Asp Ser His Asn Phe Gly Glu Tyr Leu Lys Ala 20 25 30 Ile Gly Ala Pro Lys Glu Leu Ser Asp Gly Gly Asp Ala Thr Thr Pro 35 40 45 Thr Leu Tyr Ile Ser Gln Lys Asp Gly Asp Lys Met Thr Val Lys Ile 50 55 60 Glu Asn Gly Pro Pro Thr Phe Leu Asp Thr Gln Val Lys Phe Lys Leu 65 70 75 80 Gly Glu Glu Phe Asp Glu Phe Pro Ser Asp Arg Arg Lys Gly Val Lys 85 90 95 Ser Val Val Asn Leu Val Gly Glu Lys Leu Val Tyr Val Gln Lys Trp 100 105 110 Asp Gly Lys Glu Thr Thr Tyr Val Arg Glu Ile Lys Asp Gly Lys Leu 115 120 125 Val Val Thr Leu Thr Met Gly Asp Val Val Ala Val Arg Ser Tyr Arg 130 135 140 Arg Ala Thr Glu Leu Gln Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu Asp 145 150 155 160 <210> 45 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sec61B-UnaG-Flag <400> 45 Pro Gly Pro Thr Pro Ser Gly Thr Asn Val Gly Ser Ser Gly Arg Ser 1 5 10 15 Pro Ser Lys Ala Val Ala Ala Arg Ala Ala Gly Ser Thr Val Arg Gln 20 25 30 Arg Lys Asn Ala Ser Cys Gly Thr Arg Ser Ala Gly Arg Thr Thr Ser 35 40 45 Ala Gly Thr Gly Gly Met Trp Arg Phe Tyr Thr Glu Asp Ser Pro Gly 50 55 60 Leu Lys Val Gly Pro Val Pro Val Leu Val Met Ser Leu Leu Phe Ile 65 70 75 80 Ala Ser Val Phe Met Leu His Ile Trp Gly Lys Tyr Thr Arg Ser Lys 85 90 95 Leu Ala Met Val Glu Lys Phe Val Gly Thr Trp Lys Ile Ala Asp Ser 100 105 110 His Asn Phe Gly Glu Tyr Leu Lys Ala Ile Gly Ala Pro Lys Glu Leu 115 120 125 Ser Asp Gly Gly Asp Ala Thr Thr Pro Thr Leu Tyr Ile Ser Gln Lys 130 135 140 Asp Gly Asp Lys Met Thr Val Lys Ile Glu Asn Gly Pro Pro Thr Phe 145 150 155 160 Leu Asp Thr Gln Val Lys Phe Lys Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Phe 165 170 175 Pro Ser Asp Arg Arg Lys Gly Val Lys Ser Val Val Asn Leu Val Gly 180 185 190 Glu Lys Leu Val Tyr Val Gln Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Thr Tyr 195 200 205 Val Arg Glu Ile Lys Asp Gly Lys Leu Val Val Thr Leu Thr Met Gly 210 215 220 Asp Val Val Ala Val Arg Ser Tyr Arg Arg Ala Thr Glu Asp Tyr Lys 225 230 235 240 Asp Asp Asp Asp Lys 245 <210> 46 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UnaG-Flag-Sec61 <400> 46 Met Val Glu Lys Phe Val Gly Thr Trp Lys Ile Ala Asp Ser His Asn 1 5 10 15 Phe Gly Glu Tyr Leu Lys Ala Ile Gly Ala Pro Lys Glu Leu Ser Asp 20 25 30 Gly Gly Asp Ala Thr Thr Pro Thr Leu Tyr Ile Ser Gln Lys Asp Gly 35 40 45 Asp Lys Met Thr Val Lys Ile Glu Asn Gly Pro Pro Thr Phe Leu Asp 50 55 60 Thr Gln Val Lys Phe Lys Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Phe Pro Ser 65 70 75 80 Asp Arg Arg Lys Gly Val Lys Ser Val Val Asn Leu Val Gly Glu Lys 85 90 95 Leu Val Tyr Val Gln Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Thr Tyr Val Arg 100 105 110 Glu Ile Lys Asp Gly Lys Leu Val Val Thr Leu Thr Met Gly Asp Val 115 120 125 Val Ala Val Arg Ser Tyr Arg Arg Ala Thr Glu Asp Tyr Lys Asp Asp 130 135 140 Asp Asp Lys Glu Phe Met Pro Gly Pro Thr Pro Ser Gly Thr Asn Val 145 150 155 160 Gly Ser Ser Gly Arg Ser Pro Ser Lys Ala Val Ala Ala Arg Ala Ala 165 170 175 Gly Ser Thr Val Arg Gln Arg Lys Asn Ala Ser Cys Gly Thr Arg Ser 180 185 190 Ala Gly Arg Thr Thr Ser Ala Gly Thr Gly Gly Met Trp Arg Phe Tyr 195 200 205 Thr Glu Asp Ser Pro Gly Leu Lys Val Gly Pro Val Pro Val Leu Val 210 215 220 Met Ser Leu Leu Phe Ile Ala Ser Val Phe Met Leu His Ile Trp Gly 225 230 235 240 Lys Tyr Thr Arg Ser 245 <210> 47 <211> 171 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UnaG-Flag-PM <400> 47 Met Val Glu Lys Phe Val Gly Thr Trp Lys Ile Ala Asp Ser His Asn 1 5 10 15 Phe Gly Glu Tyr Leu Lys Ala Ile Gly Ala Pro Lys Glu Leu Ser Asp 20 25 30 Gly Gly Asp Ala Thr Thr Pro Thr Leu Tyr Ile Ser Gln Lys Asp Gly 35 40 45 Asp Lys Met Thr Val Lys Ile Glu Asn Gly Pro Pro Thr Phe Leu Asp 50 55 60 Thr Gln Val Lys Phe Lys Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Phe Pro Ser 65 70 75 80 Asp Arg Arg Lys Gly Val Lys Ser Val Val Asn Leu Val Gly Glu Lys 85 90 95 Leu Val Tyr Val Gln Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Thr Tyr Val Arg 100 105 110 Glu Ile Lys Asp Gly Lys Leu Val Val Thr Leu Thr Met Gly Asp Val 115 120 125 Val Ala Val Arg Ser Tyr Arg Arg Ala Thr Glu Asp Tyr Lys Asp Asp 130 135 140 Asp Asp Lys Glu Phe Arg Ser Lys Leu Asn Pro Pro Asp Glu Ser Gly 145 150 155 160 Pro Gly Cys Met Ser Cys Lys Cys Val Leu Ser 165 170 <210> 48 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Claims

(1) 세포 내 소기관 타겟팅 폴리뉴클레오타이드 및 UnaG 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 세포를 형질전환하는 단계;
(2) 형질전환된 세포에서의 UnaG 단백질의 형광세기를 측정하는 단계;
(3) 형질전환된 세포에서의 UnaG 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
(4) 형광세기와 발현 정도를 비교하여 결정계수 및 추세를 확인하는 단계;
를 포함하는 세포 내 소기관 빌리루빈 정량 방법에 관한 것으로서,
상기 세포 내 소기관은 핵, 미토콘드라아 이중막 사이 공간, 미토콘드리아 외막, IMS, 소포체 내강, 미토콘드리아 기질, 세포질, 소포체 내강방향 조면소포체막, 세포질방향 조면 소포체 막, 원형질막 및 활면소포체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 방법.
제1항에 있어서, 세포 내 소기관 타겟팅 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 내지 11의 염기서열 중에서 선택된 1종 이상인 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 UnaG 단백질은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 UnaG 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 23의 염기서열을 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 FLAG tag을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제5항에 있어서, 상기 FLAG tag는 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 FLAG tag을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 25의 염기서열을 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포 내 소기관 타겟팅 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 12 내지 22의 아미노산 서열 중에서 선택된 1종 이상을 암호화하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 27 내지 38의 염기서열 중에서 선택된 염기서열을 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 (2) 단계는 공초점 형광 현미경 또는 형광 분광 광도계를 이용하여 형광세기를 측정하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 (3) 단계는 면역형광법, 중합효소 연쇄반응, 노던 블랏 또는 유전자미세배열을 이용하여 수행하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 (3) 단계는 세포를 고정 및 투과 처리를 거친 뒤 수행하는 것인, 방법.
제12항에 있어서, 고정은 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 20 내지 30℃에서 10 내지 20분간 반응을 수행하는 것인, 방법.
제12항에 있어서, 투과 처리는 0.4% 트리톤-X100으로 20 내지 30℃에서 30 내지 90분간 반응을 수행하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 (4) 단계의 결정계수 및 추세를 확인은, UnaG 단백질의 형광세기와 발현 정도를 배경과의 대비하여 이를 수치화 하고, 수치화된 형광세기(Y축)와 발현 정도(X축)를 좌표평면상에 표시하여, 가장 표준편차가 적도록 추세선을 그리고, 상기 추세선의 기울기를 결정계수, 추세선과 각각의 데이터의 차이를 표준편차로 나타낸 것을 분석하여 수행하는 것인, 방법.
제15항에 있어서, 상기 수치화는 하기의 계산식 1 및 2를 통해 수행하는 것인, 방법:
[계산식 1]

[계산식 2]

상기
는 하나의 픽셀에 해당하는 발현 정도,

는 형광 세기,

는 평균 발현 정도,

는 평균 형광 세기,

는 추세선의 Y절편, 및

은 추세선의 기울기 및 결정계수를 의미한다.
제1항에 있어서, 상기 세포는 신장 세포, 암 세포, 피부 세포, 난소 세포, 활막세포, 말초혈액 단핵구 세포, 섬유아세포, 섬유 세포, 신경세포, 상피세포, 각질세포, 조혈 세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 대식세포, 근육 세포, 혈액 세포, 골수 세포, 림프구 세포, 단핵 세포, 폐 세포, 췌장 세포, 간 세포, 위 세포, 장 세포, 심장 세포, 방광 세포, 요도 세포, 배아 생식세포 또는 난구세포인 것인, 방법.