CN114105979B - 一种检测细胞色素氧化酶cyp3a的广谱型荧光探针的应用 - Google Patents

一种检测细胞色素氧化酶cyp3a的广谱型荧光探针的应用 Download PDF

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Abstract

一种检测细胞色素氧化酶CYP3A的广谱型荧光探针的应用,其属于生物医药技术领域。该特异性探针底物可用于测定生物体系中CYP3A的酶活性。CYP3A酶活性测定的流程如下:选择BN类化合物4‑位羟化反应为探针反应,通过定量检测单位时间内其羟化代谢产物的生成量来测定各类生物样品中CYP3A酶的活性。BN系列探针可同时检测CYP3A4和CYP3A5的活性,是检测CYP3A活性的广谱型探针,由此可以实现CYP3A相关的基于机理抑制剂的高效发现和深入研究。该探针还可用于体外快速筛选CYP3A的可逆及不可逆抑制剂、激活剂及诱导剂,并用以检测CYP3A在活体层面药‑药相互作用。

Description

一种检测细胞色素氧化酶CYP3A的广谱型荧光探针的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种检测细胞色素氧化酶CYP3A的双光子荧光探针及其应用。
背景技术
细胞色素P450为一类亚铁血红素—硫醇盐蛋白的超家族,在多种内源物及外源物如药物、致癌物、环境污染物等物质的代谢过程中发挥着重要作用。CYP3A是细胞色素P450的重要亚家族,CYP3A4和CYP3A5是人体CYP3A亚家族的核心成员,二者的表达量约占肝脏中总P450含量的30%以上,参与约50%以上临床用药的Ⅰ相代谢,是介导人体内药物代谢的关键代谢靶点之一。
CYP3A4和CYP3A5具有较大的底物空腔,对具有各种结构骨架的底物包容度好、底物谱广泛,这也是CYP3A极易介导药物相互作用的根源。不仅如此,CYP3A可介导药物的代谢激活,催化生成的高活性代谢产物一方面可能与CYP3A酶空腔内的氨基酸共价结合而导致CYP3A酶活不可逆丧失,另一方面,高活性代谢产物还可能与细胞内的关键靶点共价结合而诱发难以预料的肝毒性、和肝癌等毒性效应。
基于机理的酶失活过程(MBI)可将非活性底物转化为高活性的亲电代谢产物,通过对酶催化腔内关键氨基酸基团的共价修饰,导致对目标酶的不可逆抑制。不幸的是,由MBI诱导的代谢酶的“不可逆”和“自杀”抑制通常与严重的不良反应有关,有时会危及生命健康(Chem.Rev.2018,118,4037-4070)。与可逆抑制相比,代谢酶的MBI经常引起不利的药物相互作用。此外,形成的活性代谢物会诱发药物的不良途径,因为它们会引发生物大分子的不可逆共价修饰,最终导致毒性。这种间接影响通常更难以预测,并且与毒性事件密切相关。因此,关键代谢酶的基于机理的抑制剂的发现和评估对于药物的开发和安全使用以及公共卫生具有重要意义。
目前研究表明,CYP3A在介导药物发生基于机理的抑制过程中起到了举足轻重的作用。因此,开发可灵敏监测CYP3A活性的广谱型荧光探针是助力发现和评估MBI相关的生物学效应的重要工具。
光谱探针在检测基于机理的抑制剂时具有更突出的优势,主要原因如下:1)CYP3A4和CYP3A5的底物谱,虽然非常相似,但并不完全重叠(Curr Drug Metab.2008,9:20);2)CYP3A4和CYP3A5的表达水平以及它们相对于总CYP3A的比例在个体和不同生物样本中是存在显著波动的(Trends Pharmacol.Sci.2003,24:161;Drug Metab.Dispos.2019,47:1257)。因此,单独检测CYP3A4或CYP3A5,但不能同时检测CYP3A4和CYP3A5的荧光探针,不能有效评估CYP3A的基于机理的抑制行为。换句话说,对CYP3A4或CYP3A5活性的单独测量可能无法准确揭示生理环境中的真实的基于机理的抑制效应。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题,开发CYP3A广谱探针以便实现CYP3A相关的基于机理抑制剂的高效发现和深入研究,开发高选择性的CYP3A的双光子荧光探针反应及其配套的高通量检测方法具有重要的实用价值。本发明的目的在于提供一种检测细胞色素氧化酶CYP3A的双光子型荧光探针及其应用,该双光子型荧光探针底物没有荧光,羟化产物具有荧光,且具有双光子性质,能够减少背景荧光干扰。利用该探针反应可对多种生物体系中CYP3A的分布和功能进行定量评价。
本发明提供了一种检测细胞色素氧化酶CYP3A的双光子型荧光探针,该探针可被CYP3A特异性催化生成相应的羟化产物,其结构通式如式(1)所示,BN类衍生物,其结构通式如下:
Figure BDA0003378752180000031
其中,R1、R2、R3、R4为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、氟、溴、氯等;当R1、R2、R3、R4为氢时,化合物命名为BN-1。
本发明中BN类化合物具有代谢酶高选择性(主要由CYP3A代谢)、代谢产物易于检测,且灵敏度高等特点。
本发明还提供了所述检测细胞色素氧化酶CYP3A的双光子型荧光探针,采用上述式(1)化合物作为CYP3A亚家族酶的特异性底物,进行羟化反应,通过定量检测单位时间内的底物消除率或其羟化产物的生成率,来定量测定不同生物体系(包括重组表达CYP3A酶、人或动物组织制备液、各类组织细胞等生物体系)中CYP3A活性;具体测定方法为:
体系中以BN类化合物作为双光子型探针底物;底物浓度选择1/10~10Km;单点测定时底物浓度优选Km
在PBS缓冲液中,反应温度为20℃至60℃之间,优选37℃为最优反应时间;孵育体系pH介于5.5~10.5之间,优选pH 7.4为最优反应pH值;
反应时间为5~120分钟,确保以上底物相应的羟化产物达到定量限,且底物转化率不超过20%时终止反应;
测定单位时间内底物减少量或羟化产物生成量作为CYP3A活性的评价指标。
本发明提供的细胞色素氧化酶CYP3A的双光子型近红外荧光探针及其应用,该探针底物没有荧光,其羟化产物具有双光子荧光属性,可采用荧光检测器同时实现底物及产物的快速、灵敏检测;羟基化产物荧光检测条件分别为:激发波长470nm(或800nm),最大发射波长为526nm。
该特异性探针底物为双光子型荧光探针,其在CYP3A活性检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰,可用于各种重组CYP3A、人及动物组织制备液及各类组织细胞中CYP3A酶活力的定量测定;同时也可作为在体及动物整体CYP3A的探针底物,评估代谢酶CYP3A的个体及种属差异。该探针底物及羟化代谢产物的荧光检测方法,还可用于CYP3A可逆抑制剂、不可逆抑制剂、激活剂、诱导剂的快速筛选及活性调节能力、诱导表达能力的定量评价。
采用重组细胞色素氧化酶CYP3A酶,肝微粒体孵育体系进行考察,通过相关性分析,重组单酶代谢反应,特异性抑制实验,以及酶反应动力学几方面的证据,证明BN类化合物可特异性的经细胞色素氧化酶CYP3A代谢,生成羟化产物。进一步采用各种哺乳动物的新鲜提取的肝细胞﹑原代培养肝细胞、肝切片﹑肝灌流等代谢评价体系进行考察,发现该代谢反应具有非常良好的特异性。
作为高特异性的细胞色素氧化酶CYP3A酶的双光子荧光探针底物,该化合物可以用来检测CYP3A的活性,尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生产的CYP3A酶活测定,以及多种哺乳动物组织器官来源的微粒体、S9等制备物中CYP3A的活性标定。
选用本发明所述细胞色素氧化酶CYP3A酶的双光子型荧光探针反应检细胞色素氧化酶CYP3A酶体外活性具有以下突出优势:
(1)对CYP3A4或CYP3A5活性的单独测量无法准确揭示生理环境中的真实的基于机理的抑制效应。由此,开发的可检测CYP3A广谱探针BN系列可以实现CYP3A相关的基于机理抑制剂的高效发现和深入研究。
(2)高特异性:BN类化合物可被细胞色素氧化酶CYP3A酶高特异性地代谢成一个代谢产物,即羟化产物。
(3)廉价易得:BN类化合物可经化学合成获得,合成工艺简单易行,荧光方法检测成本低。
(4)高灵敏度:具有BN类化合物羟基化产物具有良好的双光子荧光发射光谱特性,能更好的减少背景荧光干扰。
附图说明
图1是BN类化合物的结构通式。
图2是BN-1的1H-NMR谱图。
图3是BN-1的13C-NMR谱图。
图4是BN-1的高分辨质谱图。
图5是BN-1的人CYP重组单酶筛选试验结果
图6是CYP3A蛋白浓度标准曲线测定图。
图7是HepaRG细胞双光子激光共聚焦成像图。
图8是肝组织中双光子激光共聚焦成像图。
图9是CYP3A可逆及不可逆抑制的可视化高通量筛选及评价。
图10是CYP3A介导BN-1的代谢通路。
图11是BN-1的合成路线。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明,但并不因此而限制本发明。
实施例1.化合物BN-1的合成
将1,8-萘二甲酸酐(990.85mg,5.0mmol)溶于20mL冰乙酸中,加入邻苯二胺(648.84mg,6.0mmol),反应液搅拌回流4h。TLC跟踪反应结束,反应液静置冷却至室温,有大量固体析出,过滤,滤饼经乙醇淋洗得粗产品,进一步通过硅胶柱分离(展开剂为二氯甲烷)得化合物BN-1(1272.07mg,产率94.2%)为黄绿色固体。
BN-1:1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.76–8.71(m,1H),8.68(dd,J=7.3,0.9Hz,1H),8.54–8.45(m,1H),8.17(d,J=8.1Hz,1H),8.04(d,J=8.1Hz,1H),7.87–7.81(m,1H),7.72(dd,J=15.9,8.3Hz,2H),7.49–7.41(m,2H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ160.58,149.22,143.74,135.19,132.15,131.82,131.75,131.56,127.27,127.06,126.80,125.73,125.36,123.07,120.54,119.92,115.86.HRMS(ESI positive):[M+H]+理论值271.0866,实测值271.0856。
注:化合物BN-1的1H-NMR谱图、13C-NMR谱图以及高分辨质谱谱图如图2、3、4所示。
实施例3.体外测定人重组CYP单酶的选择性
预先准备180μL CYP代谢反应体系,包括pH 7.4的Buffer缓冲液(100mM)、6-磷酸葡萄糖(10mM),葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(1unit/mL),MgCl2(4mM),重组人CYP单酶,BN-1终浓度为10μM,于37℃条件下震荡预孵3分钟;向反应体系中加入20μL浓度为10mM的NADP+起始反应;60分钟后,加入100μL冰乙腈,剧烈震荡后,终止反应;用高速冷冻离心机在4℃,20,000×g的条件下,高速离心20分钟后,取上清,进行荧光检测(Ex=470nm,Em=526nm)。
从图5中可以看出,该探针对重组人CYP3A4和CYP3A5酶的选择性良好,对CYP3A4和CYP3A5的荧光响应接近,而CYP家族的其他酶几乎不催化这一探针反应。因此,该探针反应能同时检测CYP3A4和CYP3A5,进而可以有效评估CYP3A的基于机理的抑制行为。
实施例4.CYP3A蛋白浓度标准曲线测定
实验在酶标仪上使用96孔板进行测定,10μM BN-1,6-磷酸葡萄糖(10mM),葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(1unit/mL),MgCl2(4mM)NADP+(1mM),CYP3A4和CYP3A5单酶(0-15nM),pH 7.4的Buffer缓冲液100mM,总体积为200μL,37℃下孵育30min,产物的荧光强度比底物的荧光强度的比值与蛋白浓度做标准曲线。
图6中a)为不同浓度CYP3A4催化下荧光强度曲线,b)为CYP3A4蛋白浓度与荧光强度的线性关系;c)为不同浓度CYP3A5催化下荧光强度曲线,d)为CYP3A5蛋白浓度与荧光强度的线性关系。该结果表明该探针底物线性范围宽广,可准确定量CYP3A的含量。
实施例5.HepaRG细胞中CYP3A活性评估
三组细胞分别为正常组,HepaRG细胞分化组以及加酮康唑组。分化组细胞按如下操作促进分化:接种后将HepRG细胞在培养皿中培养2周。培养2周后,将液体更换为含有2%DMSO的RPMI 1640培养基,再培养2周。正常HepaRG细胞和分化的细胞以每培养皿1×105个细胞(Φ=20mm)的密度接种,并在含有5%CO2的加湿培养箱中在37℃下孵育过夜。随后,三组细胞分别加入25μM BN-1孵育1小时,磷酸缓冲溶液清洗残余探针后,并拍照;酮康唑组细胞在加入25μM BN-1前0.5小时加入酮康唑50μM孵育1小时,磷酸缓冲溶液清洗残余探针后,并拍照(Ex=800nm,Em=520-560nm)。
图7中可以看出,探针组显现出很强的荧光活性,而空白组与探针+抑制剂组,几乎无荧光反应。表明探针具有较高的选择性和检测灵敏度。
实施例6.肝组织中CYP3A活性评估
取大鼠新鲜肝组织制成约200微米厚肝切片。肝切片滴加25μM BN-1的PBS溶液于37度条件下孵育1小时。孵育结束后利用磷酸缓冲溶液清洗残余探针,并拍照;同时设立酮康唑处理组,既在滴加25μM BN-1的PBS溶液的同时加入酮康唑50μM于37度条件下孵育1小时。孵育结束后利用磷酸缓冲溶液清洗残余探针,并拍照(Ex=800nm,Em=520-560nm)。
图8为肝组织中双光子激光共聚焦成像图,探针组变现出很强的荧光活性,而空白组与探针+抑制剂组,几乎无荧光反应。表明探针具有较高的选择性、组织穿透能力和检测灵敏度。
实施例7.CYP3A活性可逆及不可逆抑制剂的可视化筛选
分别设置待测物的NADPH孵育组和对照组,以及不加待测物的NADPH孵育组和对照组。简述之,预先准备100μL CYP代谢反应体系,包括pH 7.4的Buffer缓冲液(100mM)、待测物、6-磷酸葡萄糖(10mM)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(1unit/mL)、MgCl2(4mM)、人肝微粒体,于37℃条件下震荡预孵3分钟;向NADPH孵育组样品反应体系中加入10μL浓度为10mM的NADP+起始反应,对照组平行加入10μL的pH 7.4Buffer缓冲液;60分钟后,加入100μL CYP代谢反应体系以测定剩余酶活,包括pH 7.4的Buffer缓冲液(100mM)、6-磷酸葡萄糖(10mM)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(1unit/mL)、MgCl2(4mM)、NADP+(1mM)、BN-1(50μM);反应30分钟后,向反应体系中加入100μL冰乙腈,剧烈震荡后,终止反应;用高速冷冻离心机在4℃,20,000×g的条件下,高速离心20分钟后,取上清,进行荧光图像分析(λex:488nm,λem:570±15nm;GEAmersham Typhoon)。
通过计算待测物NADPH孵育组和对照组的百分剩余活性,当差值大于15%时,提示可能存在基于时间的抑制现象,即对CYP3A的不可逆抑制行为。
图9中a)是基于机理抑制剂筛选成像结果,b)是根据定量数据计算的各样品的百分剩余活性。根据同一测待测物对照组及NADPH孵育组间的百分剩余活性差值,可推测出待测物是否具有基于机理的抑制行为。其中图9a)框出的待测物百分剩余活性均大于15,被指示为潜在的CYP3A的基于机理的抑制剂。相关表明该探针可高效筛选CYP3A相关的基于机理的抑制剂。

Claims (5)

1.一种检测细胞色素氧化酶CYP3A的广谱型荧光探针非疾病诊断及治疗目的的应用,其特征在于:探针底物为BN类化合物衍生物,其结构通式如下:
Figure FDA0003899963240000011
其中,R1、R2、R3、R4为氢;
探针的应用为:该探针底物被CYP3A特异性催化生成相应的羟化产物,探针底物与含CYP3A的生物样品混合后进行酶促反应,通过定量检测单位时间内的底物消除率或其羟化产物的生成率来定量测定不同生物体系中CYP3A的活性;具体测定方法及条件如下:
A.体系中以BN类化合物衍生物作为探针底物;底物浓度选择1/10~10Km
B.在PBS缓冲液中,反应温度为20℃至60℃之间;孵育体系pH介于5.5~10.5之间;
C.反应时间为5~120分钟,确保以上底物相应的羟化产物达到定量限,且底物转化率不超过20%时终止反应;
D.测定单位时间内底物减少量或羟化产物生成量,作为CYP3A活性的评价指标;
该探针底物及其羟化产物的荧光信号需采用激发波长470nm,最大发射波长为526nm。
2.根据权利要求1所述的一种检测细胞色素氧化酶CYP3A的广谱型荧光探针非疾病诊断及治疗目的的应用,其特征在于:所述生物体系为重组表达CYP3A酶、人或动物组织制备样本及其制备物中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种检测细胞色素氧化酶CYP3A的广谱型荧光探针非疾病诊断及治疗目的的应用,其特征在于:该探针底物用于CYP3A可逆、不可逆抑制剂及CYP3A可逆、不可逆激活剂的快速筛选及调控能力的定量评价。
4.根据权利要求1所述的一种检测细胞色素氧化酶CYP3A的广谱型荧光探针非疾病诊断及治疗目的的应用,其特征在于:该探针底物用于CYP3A表达诱导剂的快速筛选及诱导表达能力的评价,评估代谢酶CYP3A4的个体及种属差异。
5.根据权利要求1所述的一种检测细胞色素氧化酶CYP3A的广谱型荧光探针非疾病诊断及治疗目的的应用,其特征在于:该探针底物作为实验动物在体及整体CYP3A的探针底物,评估代谢酶CYP3A的个体及种属差异。
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KR101171801B1 (ko) * 2010-12-06 2012-08-13 고려대학교 산학협력단 수은 이온 검출용 화합물, 이의 제조방법 및 이를 이용한 형광 화학 검출 시스템
CN104975066B (zh) * 2014-04-04 2018-12-04 中国人民解放军总医院 细胞色素p450_3a4酶的特异性探针底物及其应用
WO2015179999A1 (zh) * 2014-05-30 2015-12-03 中国科学院大连化学物理研究所 细胞色素氧化酶cyp1a的比率型荧光探针底物及其应用
WO2016069780A1 (en) * 2014-10-28 2016-05-06 Oregon State University Compounds and methods to suppress autoimmune response
CN107022349B (zh) * 2016-01-29 2019-10-11 中国科学院大连化学物理研究所 细胞色素氧化酶cyp1a1特异性荧光探针及其制备方法与应用
CN109928927B (zh) * 2019-03-04 2022-05-13 大连医科大学 一种检测细胞色素氧化酶cyp3a4的双光子型荧光探针的应用

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