CN104975066A - 细胞色素p450_3a4酶的特异性探针底物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一类细胞色素P4503A4酶的特异性探针底物Tenuifoliside A及其在CYP3A4酶活测定中的应用，其中酶活测定的具体操作流程如下：Tenuifoliside A作为高特异性探针底物，并借助CYP体外孵育体系开展特异性底物的CYP催化反应，通过定量检测单位时间内产物生成量或底物消除量来测定各生物样品及细胞中CYP3A4酶的活性。本发明可用于不同个体来源生物样本中CYP3A4酶活性的定量评估，以及不同来源的动物组织细胞培养液及细胞制备物中CYP3A4单酶活性的定量测定。

Description

细胞色素P450_3A4酶的特异性探针底物及其应用

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及寡糖酯类化合物Tenuifoliside A，其可作为细胞色素P4503A4酶的特异性探针底物，用于不同来源生物样本中细胞色素P4503A4酶活性的定量测定，以期实现对重要药物代谢酶CYP3A4处置药物能力的评估。 

背景技术

细胞色素P450酶(Cytochrome P450，CYP)超家族包含了机体内最重要的药物代谢酶，参与约80％以上上市药物的代谢，其中经细胞色素P4503A亚家族代谢的药物约占50％。人体中表达了四种细胞色素P4503A亚型，分别为细胞色素P4503A4、P4503A5、P4503A7以及P4503A43。细胞色素P4503A4占总细胞色素P450酶含量的30～60％(Hukkanen，et al.，1998)，在肝、肠、肾、脾、心脏各器官中有非常广泛的分布，相比于人群中表达量低、表达频率低的细胞色素P4503A5，一直被认为是成年个体表达的最主要的细胞色素P4503A单酶。一般来讲，CYP3A亚家族中的各种亚型的酶都具有相似的底物具体性，也就是说，某一底物若被CYP3A4催化代谢，那么这一底物就极可能同时被CYP3A5及其它CYP3A家族的酶代谢。目前，已经发现的或已在体外、体内研究中广泛应用的CYP3A亚家族探针底物，如咪达唑仑(midazolam)、尼非地平(nifedipine)、睾酮(testosterone)、雌二醇(estradiol)等，都同时是CYP3A4和CYP3A5的特异性底物。相对应的，利用这些探针底物对细胞色素P450酶进行的评估结果反映的就是细胞 色素P4503A亚家族各单酶的催化能力的总和。然而，近期的研究发现，细胞色素P4503A5在某些个体中显现的催化能力甚至与细胞色素P4503A4的催化能力相当(Williams，et.al.,2002)，此时利用目前已有的探针则会混淆细胞色素P4503A4和3A5的催化能力，从而无法清晰地分析细胞色素P4503A4对某药物的代谢清除能力。 

此外，在鼠(细胞色素P4503A1、细胞色素P4503A2)、狗(细胞色素P4503A12、细胞色素P4503A26)，兔(细胞色素P4503A6)，猪(细胞色素P4503A29)，猴(细胞色素P4503A64)等哺乳动物体内，也高表达细胞色素P4503A4的同功酶，这些酶之间的底物有非常广泛的重叠性。利用细胞色素P4503A4的高特异性探针也可在体外活性测定方面实现对不同种属中细胞色素P4503A4的同功酶的评价与考察。 

目前，细胞色素P4503A4酶活性的体外评价体系主要包括重组单酶、哺乳动物的亚细胞组分、新鲜提取的肝细胞、原代培养肝细胞、肝切片、肝灌流等(Toxicology in Vitro2006，135-153)，其中已经商品化的重组细胞色素P4503A4单酶主要来自于细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌建立的克隆表达体系，而亚细胞组分主要包括微粒体、细胞胞浆及S9成分。采用这些标准化的评价体系，结合相应的辅因子(如：NADPH等)和孵育条件，可通过检测探针底物的代谢清除或产物生成速率，对上述各种体系中表达的细胞色素P4503A4酶活性进行表征。余琛等人还利用肝微量穿刺法构建了新型微量肝组织体外孵育体系，并采用咪达唑仑作为探针底物，通过测定咪达唑仑与其代谢产物1-羟基咪达唑仑含量的比值，来作为细胞色素P4503A体外活性评价指标。 

综上所述，评估细胞色素P4503A4代谢酶活性，关键在于选择高特异性的探针药物。 

发明内容

本发明涉及一个寡糖酯类化合物Tenuifoliside A，在检测细胞色素P4503A4酶活性中的用途及其检测方法，可作为细胞色素P4503A4酶的高特异性探针底物，用于定量测定不同来源生物样本中CYP3A4酶活。与目前已报道的细胞色素P4503A探针／标准底物不同，Tenuifoliside A具有高特异性表征细胞色素P4503A4酶活性的能力，其并不被CYP3A5催化。因此能够高特异性的评价机体或组织中CYP3A4酶对药物的处置能力，对体外药物代谢研究具有重要意义。 

Tenuifoliside A是一种寡糖酯类成分。该化合物具有图1所示基本结构。 

本发明提供了化合物Tenuifoliside A检测细胞色素P4503A4酶活性的用途，其特征在于：Tenuifoliside A作为特异性探针底物，通过定量定时测定相应代谢产物的生成量或底物的减少量实现细胞色素P4503A4酶活性的检测。 

采用重组细胞色素P450单酶，肝微粒体孵育体系进行考察，通过相关性分析，特异性抑制实验，重组单酶代谢反应，以及酶反应动力学几方面的证据，证明Tenuifoliside A可特异性的经细胞色素P4503A4酶代谢(如图2所示)，生成单羟基化代谢产物。HPLC-UV图谱见图3，代谢产物的结构见图4。 

作为高特异性的细胞色素P4503A4的探针底物，Tenuifoliside A可以 用来检测细胞色素P4503A4酶活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生产的细胞色素P4503A4重组酶的酶 

本发明还提供了所述细胞色素P4503A4酶的特异性探针底物的应用，即采用所述探针底物检测细胞色素P4503A4酶活性，其测定方法为： 

——体系中以Tenuifoliside A作为特异性探针底物；底物浓度选择1-800μM； 

——在具有辅因子NADPH或其生成体系的孵育体系中，反应温度为10℃至60℃之间，优选37℃为最优反应时间。 

——反应时间为10-120分钟，在确保以上底物相应的羟化代谢产物单羟基化Tenuifoliside A达到定量限且底物转化率低于20％时终止反应； 

——测定单位时间内底物减少量或单羟化产物生成量作为细胞色素P4503A4酶活性的评价指标。 

其中检测底物减少量或其对应羟化产物生成量的定量检测方法为紫外吸收光谱、质谱。所有检测器包括紫外吸收光谱检测器、质谱中的一种或两种串联。 

选用本发明所述细胞色素P4503A4酶的特异性探针底物检测细胞色素P4503A4酶体外活性具有以下突出优势： 

(1)高特异性，Tenuifoliside A可被目标细胞色素P4503A4高特异性地代谢成为单羟化产物。 

(2)底物Tenuifoliside A是中药远志含有的天然化学成分，来源简单易于分离纯化，无需化学合成。 

(3)检测灵敏，Tenuifoliside A均具有良好的紫外吸收特性(300～320nm)以及离子化效果，可以通过常规分析手段方便对其定量。在临床应用中，无需另行购买昂贵的检测设备。 

附图说明

图1.Tenuifoliside A结构式； 

图2.Tenuifoliside A的人重组单酶筛选试验结果。 

图3.TESA及其单羟基化代谢产物在人肝微粒体中的色谱图。 

图4.Tenuifoliside A的CYP3A4介导的羟化代谢通路。 

具体实施方式

下列实施例是为了进一步说明本发明，而不是要限制其范围。 

Tenuifoliside A用于检测酮康唑对人肝微粒体中CYP3A4活性的影响 

利用Tenuifoliside A检测酮康唑作为CYP3A特异性抑制剂对CYP3A4的抑制作用，具体步骤如下： 

(1)200μL体外代谢反应体系中，10mM葡萄糖-6-磷酸，1单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，以及4mM MgCl₂，人肝微粒体浓度为0.2mg／ml，Tenuifoliside A浓度为10μM，酮康唑浓度为1μM，于37℃条件下预孵5分钟； 

(2)于反应体系中加入20μl NADP⁺(终浓度1mM)起始反应； 

(3)20分钟后，加入100μl乙腈，剧烈震荡后，终止反应； 

(4)采用高速冷冻离心机，在15,000×g的条件下，高速离心上述体系15分钟后，取上清，进行HPLC-UV检测分析； 

(5)以同样操作进行不含有酮康唑的人肝微粒体的活性测定。 

通过紫外吸收光谱在310nm下对单羟基化Tenuifoliside A的生成量进行定量检测，代表性HPLC-UV谱图如图3所示。利用Tenuifoliside A作为探针底物测得酮康唑对人肝微粒体中CYP3A4的活性抑制率为100％。 

Claims (3)

1.具有式(1)结构的寡糖酯类化合物单体Tenuifoliside A作为细胞色素P4503A4酶的特异性探针底物。

2.一种权利要求1所述细胞色素P4503A4酶特异性探针底物的应用，其特征在于采用上述探针底物检测细胞色素P4503A4酶活性，其测定方法及条件如下：

A.选择Tenuifoliside A作为特异性探针底物；底物浓度为1-800μM；

B.在pH7.4的缓冲液体系下加入NADPH或其生成体系的孵育体系中，反应温度为37℃；

C.反应时间为10-120分钟，在确保以上底物相应的羟化代谢产物达到定量限且底物转化率低于20％时终止反应；

D.测定单位时间内底物减少量或单羟化产物生成量作为细胞色素P4503A4酶活性的评价指标。

3.按照权利要求1所述细胞色素P4503A4酶的特异性探针底物，其可用于重组细胞色素P450单酶、人组织制备液中P4503A4酶活性的定量测定。