CN103718038A - 高速的基于拉曼分析的多药物高速筛选装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及高速的基于拉曼分析的多药物高速筛选装置。通过使用将拉曼信号增强1012倍的核-间隙-壳纳米粒子，根据本发明的筛选装置能够容易地检测拉曼信号；由于其所使用的物质互不干扰且拉曼光谱具有尖峰，可以多重检测拉曼信号的拉曼光谱，所述筛选装置具有高度可再现性。此外，由于可使用CCD相机而非扫描仪作为检测器，所述筛选装置可对药物进行高速多重筛选，而不需要样品内分子间的移动。此外，由于可包被多种颜色(5种颜色以上)，所述筛选装置可效用于筛选多种药物。

Description

高速的基于拉曼分析的多药物高速筛选装置
技术领域
本发明涉及用于高速筛选多种药物的基于拉曼分析的装置。
背景技术
药物开发是需要大量时间和资金投入的国家级高层战略进程，所投入的时间超过10年，所投入的资金则超过8亿美元。发达的社会基础设施对于药物开发也是必需的。
宽泛而言，药物开发过程可分为：通过基础研究发现药物靶标、通过化合物筛选选择有效的前导物质、确定候选药物、通过前临床工作／I期临床阶段的临床研究、以及通过II期临床阶段和III期临床阶段的商业化。
迄今为止，伴随着自人类基因组计划以来研究对象的稳步扩增，发现的作为药物靶标的总共35，000个基因中，约有500个正被用于药物开发的研究。一旦选定药物靶标，即需考虑开发最合适有效的筛选方法。筛选方法可分为体外(in vitro)分析和基于细胞的分析。主要的制药公司拥有从数万到数亿典型库容量的化合物作为筛选靶标，所使用的如此大量的化合物来源于早期筛选阶段。
这种筛选过程的巨大花费引起致力于设计有效的筛选方法，并开发高速且最为精简的设备和试剂，以实现在尽可能短的时间内筛选尽可能多的化合物。
用于多种化合物的筛选过程必须工艺简单并具有高度可再现性。当药物靶标是酶时，由于已建立大量筛选方法和试剂，可使用相对简单的方法。然而，由于大部分发生在细胞内的生物过程与蛋白的相互作用有关，基于蛋白相互作用的筛选方法在用于开发前导化合物的分析方法中最为有效。这样的筛选方法被看好的理由如下：蛋白的功能与其在体内与另一蛋白相互作用时一致；基因和蛋白表达的改变、细胞内定位的改变、和／或通过翻译后修饰引起的结构改变引起蛋白间相互作用的改变，继而引起细胞内代谢活动和信号通路的活性和调控的改变；基因突变导致的蛋白相互作用异常直接引发疾病。检测蛋白间相互作用的技术包括FRET(荧光共振能量转移)、BRET(生物发光共振能量转移)和FP(荧光偏振)，在可使用此类技术的装置方面也取得了技术进步。近年来，引入了使用自动化高分辨率显微镜的HCS(高内涵筛选，high-contentscreening)，由此，将细胞与化学物质在多孔板(如96孔板、384孔板等)中孵育后，可快速地以定量的方式观测与细胞内蛋白的定量变化和转运相关的现象。相比于使用传统的酶检测方法或报告系统获得的简单信息(例如对于酶活、启动子强度、蛋白水平等方面的信息)，由于HCS能够对难以使用传统方法大规模筛选的生物参数(如蛋白相互作用、Ca++流等)进行定量分析，HCS现已上升为世界顶级的制药公司或研究机构最感兴趣的生物学研究方法。
典型地，药物筛选的程序包括：制备化合物份(aliquots)、稀释、与筛选组分混合、孵育并检测、分析筛选数据并报告结果。将高通量筛选(以下称为HTS)系统用于快速进行这样的一系列步骤。已知先进的制药公司拥有由数以亿计的不同化合物组成的化合物库，一旦发现新的药物靶标，公司即利用HTS系统在化合物库中针对药物靶标进行筛选。由此，目前为止，主要的制药公司积累了数以亿计的化合物在生物活性方面的庞大数据。为针对数以千计的药物靶标更快更有效地对化合物库进行筛选，需要能够执行各种功能的曲线拟合工具，所述功能包括QC功能、重叠数据的纠错、相对活性(％活性)的计算、以及生化指标(如IC50、Ki以及Km)的提取。在这方面，需要能够通过一次筛选过程生成大量数据的HTS。这项旨在克服传统技术中的问题的新技术，其设计本质上为通过自动化大规模随机评估制备的化合物，并能够与自动化制备新材料(CCL)、分子设计和系统化信息管理相关联，尽可能地缩短确定候选药物的时间。
能够每天筛选超过10,000种不同化合物的HTS的先决条件总结如下：
(1)快速：考虑到具有更高的筛选速度，HTS能够筛选更大数量的化合物，由此能够在更短的时间内、以更低的费用完成执行。
(2)费用：筛选过程中使用的试剂构成了总筛选费用的大部分。有必要采取资金节省的措施。
(3)小型化：小型化不仅是削减试剂费用的最好措施之一，也可减少执行筛选过程的时间。此外，还能够节约用于设备的实验室空间。
(4)自动化：自动化增加了结果的可再现性以及筛选速度。特别是能够在降低试验误差方面发挥重要作用。
(5)筛选灵敏度：检测方法的灵敏度直接关系到样品的用量。由于在较低灵敏度的情况下筛选样品需要更长的时间，高灵敏度是必须的。
(6)非放射性方法：迄今为止开发的高达50％的HTS方法使用放射性物质。然而，放射性物质产生需对其特别小心的废料，由此在空间、时间和费用方面不利。
(7)简单化：由于以过滤、分离、洗涤、区别(distinction)和固态提取进行操作的方法需要附加费用和程序，筛选过程应尽可能地简化为在液体状态。
制药公司在开发化合物的化学方法和HTS技术中做出了巨大投入。结果是，候选药物数量激增。其后，经过初筛过程(靶标的发现及评价，以及候选物的发掘)发掘的候选物经受第二轮筛选过程(候选物的优化)，这一过程的产率远低于初筛过程。初筛过程和第二轮筛选过程中产率的差别引发新药开发中明显的瓶颈现象。因此，将第二轮筛选的效率提高至与初筛过程相一致的水平、而不损害第二轮筛选生成的数据的质量，是对新药开发全程的重要挑战。
高内涵筛选(HCS)可定义为“基于高时空分辨荧光图像的用于功能性地复合筛选活细胞内多种靶标的技术”。HCS的基本技术包括：基于细胞的分析、具有高时空分辨率的活细胞实时荧光成像以及高速高内涵的自动分析。HCS分析仪的代表是图1中示出的Perkin-Elmer的Opera系统。
由Opera系统获得的典型细胞分析数据如图2所示。在这方面，首先，在视野中获得数十个聚集细胞的图像，细胞核和细胞壁在图像中得以区分；在这一过程中，在程序中移除某些细胞的图像而保留有意义的细胞图像。最后，获得如图2所示的双色图像。
迄今为止，高内涵筛选技术基于荧光分析。然而荧光分析中使用的荧光标记荧光强度减弱(光漂白)；并且，由于激发光具有很窄的波长范围而荧光具有很宽的波长范围，不同荧光标记间出现干扰。此外，可用的荧光物质数量极其有限。
因此，需要新的高速高效的药物筛选方法，所述方法具有尖锐的谱峰且不引起荧光物质相互干扰，由此允许多种药物的检测。
近几年，拉曼光谱法(Raman spectroscopy)引起广泛关注。
其中，表面增强拉曼散射(SERS)是一种利用如下现象的光谱法：在金属纳米结构(如金或银纳米粒子)的粗糙化表面吸附分子时，相比于普通拉曼信号，拉曼散射的强度显著增加至106-108倍的水平。当光穿过透明介质，介质的分子或原子散射光。在这方面，一小部分光子发生非弹性散射，被称为拉曼散射。例如，一部分入射光子与分子以这样的方式反应获得能量或将电子激发至更高的能级，使得散射光子具有与入射光子不同的频率。由于拉曼散射光谱频率依赖于样品中光吸收分子的化学组成和结构特性，将拉曼光谱法与目前快速发展的纳米技术结合，可进一步开发对单分子的高灵敏度检测。此外，强烈期望SERS传感器可着重用作医学传感器。SERS效应与等离子共振相关联。在本文中，由于金属中传导电子的集体耦合(collective coupling)，金属纳米粒子响应入射电磁辐射而表现出明显的光学共振。因此，金、银、铜和其它特定金属的纳米粒子本质上可作为增强电磁辐射定位的纳米天线。位于这些粒子附近处的分子对拉曼光谱法呈现大大增强的灵敏度。
据此，与使用SERS传感器检测包括基因和蛋白等生物标记来对各种疾病进行早期诊断相关的很多研究正在积极地进行。与其他方法(例如：红外光谱法)相比，拉曼光谱法具有多种优势。红外光谱法可以检测到来自于具有偶极矩的分子的强信号，而拉曼光谱法甚至能够检测到来自于非极性分子(调制其诱导极化)的强信号。因此，几乎全部有机分子都有自己的拉曼位移(Gm-1)。此外，由于不受水分子的干扰，拉曼光谱法适用于包括蛋白、基因等生物分子的检测。虽然研究已进行了很长时间，然而，由于信号强度低，拉曼光谱法的发展阶段尚未达到可应用于实践的水平。
本发明人对与拉曼光谱法相关的多药物高速筛选进行了大量深入的研究，并发现了：当暴露于含有一种以上的分析物的样品时，使用其上标记有生物分子(其功能在于识别分析物)的纳米粒子(包含核(core)和壳(shell)，并在所述核和所述壳之间形成纳米间隙(nanogap))，经激发激光束照射生成拉曼信号；特定的拉曼波长可由通过由多个拉曼滤光器滤过的拉曼信号获得，使用检测器以高SERS增强因子进行检测，并用颜色编码以生成颜色编码的拉曼图像，由此可高度可再现并高度可靠定量地对多种药物进行高速筛选，从而完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供多药物高速筛选装置，所述装置使用以多种颜色编码拉曼信号的拉曼光谱法。
本发明的另一目的在于提供使用所述装置的多药物高速筛选方法。
技术方案
为完成本发明的一个目的，本发明提供了利用表面增强拉曼散射的多药物高速筛选装置，所述装置包含：
用于将光源的光引入显微镜的激发模块，所述激发模块由透镜(1ens)、反射镜(mirror)和针孔组成；
用于获取样品图像的显微镜模块，所述显微镜模块包含：用于控制样品位置的运动控制器、由一个以上的拉曼滤光器组成的滤过单元(所述滤过单元用于对样品被光源的激发光照射时由所述样品所散射的光进行拉曼波长滤过)、以及用于顺序接收通过所述滤过单元的光束的检测器；以及
图像处理模块，所述图像处理模块用于将从含有样品的位点处获得的一组图像进行颜色编码以生成细胞或组织的图像，并用于显示所述细胞或组织的图像，其中，所述位点由所述运动控制器定位。在一个实施方式中，所述高速筛选装置还可包含用于存储核-间隙-壳纳米粒子的存储腔。
可通过提供利用表面增强拉曼散射的多药物高速筛选方法完成本发明的另一目的，所述方法包括：
步骤1：将核-间隙-壳纳米粒子添加至待分析样品；
步骤2：用激光束照射所述样品，以产生拉曼散射光；用滤过单元(由一个以上的拉曼滤光器组成)滤过所述拉曼散射光，以提取感兴趣的拉曼波长；并用检测器检测拉曼光谱，从而由所述样品获得一幅以上的拉曼图像；以及
步骤3：对所述样品的拉曼图像进行颜色编码，以生成细胞或组织的图像，并显示所述细胞或组织的图像。
有益效果
如上所述，本发明的筛选装置和方法并非针对检测自发荧光而设计，而在于检测由核-间隙-壳纳米粒子产生的拉曼信号，从而使得其不在荧光标记间发生干扰。该核-间隙-壳纳米粒子显示了很强的表面增强拉曼散射(SERS)信号，其SERS增强因子高达约1012，且经证实高度可再现。此外，由于以非扫描方式运行的CCD相机能够即时拍摄多孔板的每个孔，并能与运动控制器协同运行拍摄其它孔，使用CCD相机作为检测器使得本发明的装置和方法能够高速筛选多种药物。此外，本发明的装置和方法能够对拉曼图像进行多色编码，可有效应用于多种药物的筛选。
附图说明
图1是传统的基于荧光的高内涵筛选分析装置的照片。
图2是由传统的基于荧光的高内涵筛选分析装置获得的细胞的2色图像。
图3是根据本发明的基于拉曼的多药物高速筛选装置的示意图。
图4显示了在基于拉曼光谱法的多药物高速筛选方法中有用的核-间隙-壳纳米粒子。
图5显示了使用制备例1-3中制备的纳米粒子，由本发明的装置测得的表面增强拉曼散射光谱。
图6显示了用于选择性滤过源自制备例1-3的纳米粒子的拉曼散射光的窄带通滤光器(narrow band pass filters)。
图7示出了在通过相应的窄带通滤光器对源自制备例1-3制备的纳米粒子所散射的拉曼信号进行选择性滤过后检测到的拉曼图像。
图8示出了通过针对制备例1-3的纳米粒子优化的相应的窄带通滤光器选择性滤过的拉曼图像及其叠加图像。
图9为制备例4，5和6制备的PEG包被的纳米粒子的示意图。
图10示出了通过使用两个窄带通滤光器(“滤光器1”和“滤光器2”)由本发明的装置测量的(a)不与制备例5制备的PEG包被的纳米粒子孵育(对照组)和(b)与制备例5制备的PEG包被的纳米粒子孵育(实验组)的细胞的图像。
图11示出了通过使用两个窄带通滤光器(“滤光器1”和“滤光器2”)由本发明的装置测量的与制备例4的PEG包被的纳米粒子孵育的实验组细胞的图像的三个视野。
图12示出了通过使用两个窄带通滤光器(“滤光器1”和“滤光器2”)由本发明的装置测量的与制备例5的PEG包被的纳米粒子孵育的实验组细胞的图像的三个视野。
具体实施方式
以下给出对本发明的详细说明。
按照本发明的一个方面，本发明提出了利用表面增强拉曼散射的多药物高速筛选装置，所述装置包含：
用于将光源的光引入显微镜的激发模块，所述激发模块由透镜、反射镜和针孔组成；
用于获取样品图像的显微镜模块，所述显微镜模块包含：用于控制样品位置的运动控制器、一个以上的拉曼滤光器(用于对样品被光源的激发光照射时由所述样品所散射的光进行拉曼波长滤过)、以及用于顺序接收通过所述拉曼滤光器的光束的检测器；以及
图像处理模块，所述图像处理模块用于将从含有样品的位点处获得的一幅以上的图像进行颜色编码以生成细胞或组织的图像，并用于显示所述细胞或组织的图像。
以下结合图3描述本发明的优选实施方式。
全部附图中，相同的附图标记用于指示相同或相似的组件。此外，在本发明的描述中，省略了确定会混淆本发明主旨的相关技术的具体说明。
图3是根据本发明的基于拉曼的多药物高速筛选装置的示意图。
根据本发明的基于拉曼的多药物高速筛选装置可分为激发模块、显微镜模块和图像处理模块。对本领域技术人员来说显而易见的是，对功能模块的区分旨在对其进行具体说明，而非在于将其分为相互排斥且孤立的部分；对本领域技术人员来说还显而易见的是，功能模块可在某些区域重叠、或两个以上的功能模块可共享同一区域。
激发模块
在本发明的装置中，激发模块的功能在于将光源(LS)10产生的激光束引入显微镜。
LS10可产生近红外(NIR)激光或可见激光。可见激光是波长范围在400nm至700nm的光。在一个实施方式中，可见激光具有514.5nm的波长。由于使用可见光作为光源引起自发荧光，导致拉曼信号的强度降低，在生物技术领域主要使用NIR激光获得拉曼图像。然而，由于拉曼信号强度与波长的4次幂成反比，与NIR激光相比，可见激光更能增加拉曼信号的强度。此外，利用可见光的光学装置比利用NIR光的光学装置更先进。因此，如果能降低自发荧光，在优化光学系统时，使用可见激光比使用NIR激光更具优势。
在由LS10产生后，激光束通过空间滤光器20，从而光束直径增大。通过多个透镜、反射镜和针孔，将光束校准至具有约10mm的直径，随后将其引入显微镜模块。
显微镜模块
在本发明的装置中，显微镜模块包含：用于控制样品位置的运动控制器50、由一个以上的拉曼滤光器组成的拉曼滤过单元40(所述滤过单元40用于对样品被激光束的激发光照射时由所述样品所散射的光进行拉曼波长光滤过)、以及用于顺序接收通过所述拉曼滤过单元40的光束的检测器111。
进入显微镜后，所述激光束被光分离单元21反射，并导向显微镜物镜(MO)镜头30。作为光分离单元21，可使用分束器、二向分色镜(dichroicmirror)或可拆卸镜。
用于滤过拉曼波长光的拉曼滤光器的数量为1至20的量级，优选为5至20的量级。
拉曼滤过单元可为带通滤光器，优选包括但不限于窄带通滤光器。
本发明中可应用任何以扫描方式或非扫描方式运行的检测器。例如可应用均以扫描方式运行的PMT(光电倍增管)检测器或APD(雪崩光电二极管)检测器；而CCD(电荷耦合器件)相机代表以非扫描方式运行的可用的检测器。
样品可以是含有分析物的细胞。感兴趣的分析物的实例包括氨基酸、肽、多肽、蛋白、糖蛋白、脂蛋白、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖类、碳水化合物、寡糖、多糖、脂肪酸、脂类、激素、代谢物、细胞因子、趋化因子、受体、神经递质、抗原、过敏原、抗体、底物、代谢物、辅因子、抑制剂、药物(drugs)、药品(pharmaceuticals)、营养物、朊病毒、毒素、毒药、炸药、杀虫剂、化学战剂、生物有害物质、放射性同位素、维生素、杂环芳香族化合物、致癌物质、诱变剂、麻醉剂、安非他明、巴比妥类(barbiturates)、致幻剂(hallucinogens)、废物和污染物。此外，当分析物是核酸时，所述分析物例如可以是基因、病毒RNA和DNA、细菌DNA、真菌DNA、哺乳动物DNA、cDNA、mRNA和DNA片段、寡核苷酸、合成寡核苷酸、修饰的寡核苷酸、单链和双链核酸、天然和合成的核酸。此外，样品可与图4所示的核-间隙-壳纳米粒子结合以放大拉曼信号。这种结合可通过将装置的腔(未示出)中存储的核-间隙-壳纳米粒子暴露于所述样品而实现。
所述核-间隙-壳被设计为：在壳表面具有功能化的生物分子，所述生物分子可识别感兴趣的分析物。当核-间隙-壳纳米粒子暴露于样品时，它们选择性地与感兴趣的分析物结合，并由此能够用于成像。
纳米粒子上功能化的生物分子可以是抗体、抗体片段、基因修饰的抗体、单链抗体、受体蛋白、配体蛋白、酶、抑制蛋白、凝集素、细胞粘附蛋白、寡核苷酸、多核苷酸、核酸和适配子(aptamers)。功能化(functionalization)可通过但不限于通过如下方法实现：利用静电力将生物分子附着至纳米粒子、或通过直接将生物分子结合至纳米粒子或经由接头将生物分子结合至纳米粒子。
本发明中，所述核-间隙-壳纳米粒子包含核、包围所述核的壳以及在所述核和所述壳之间形成的纳米间隙。在所述纳米粒子中，所述核通过纳米桥(nanobridge)与所述壳连接、或所述核不与所述壳连接；所述纳米间隙中含有光学活性分子。
只要光学活性分子由选自C、H、O、N、S及其组合中的原子构成，本发明中可使用任何光学活性分子。此外，可使用金属离子、金属离子的螯合剂、或金属纳米粒子。具体而言，本发明所使用的信号物质为涵盖荧光有机分子、非荧光有机分子、无机纳米粒子和拉曼活性分子的广义概念，并不局限于显色标记物质。优选拉曼活性分子。本文所用的术语“拉曼活性分子”是指在本发明的纳米粒子结合至至少一种分析物后，便于通过拉曼检测装置对分析物进行检测和测定的分子。适用于拉曼光谱法的拉曼活性分子可以是有机原子或分子、或无机原子或分子。本发明中可用的拉曼活性分子的实例包括但不限于：FAM、Dabcyl、TAMRA、TRITC(四甲基罗丹明-5-异硫氰酸酯)、MGITC(孔雀石绿异硫氰酸酯)、XRITC(X-罗丹明-5-异硫氰酸酯)、DTDC(3，3-二乙基硫二碳碘化氰)、TRIT(四甲基罗丹明异硫氰酸)、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、对氨基苯甲酸、赤藓红(erythrosine)、生物素、地高辛、5-羧基_4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、甲亚胺(azomethine)、菁类(cyanines)(Cy3、Cy3.5、CY5)、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、氨基吖啶、量子点、碳同位素、氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷和硫。为用于本发明的纳米结构，所述拉曼活性分子必须显示清晰的拉曼光谱，且必须与不同类型的分析物相结合或相关。优选与拉曼分析中所用的激发激光的波长共振而示出更高拉曼信号强度的分子。
可将光学活性分子限制在纳米间隙中。在这方面，借助共价键或静电引力，用纳米粒子上功能化的生物分子修饰所述光学活性分子，使得所述光学活性分子位于间隙的内部(interior gap)。或者，与生物分子无关，可通过共价键和静电引力将光学活性分子附着至核粒子的表面。以生物分子进行修饰具有控制光学活性分子位置的优势。具体而言，如果在邻近生物分子附着在核的一端的位置对所述光学活性分子进行修饰，可将光学活性分子定位在近核处。以这样的方式，所述光学活性分子可定位于纳米间隙中。拉曼信号可随光学活性分子的位置而变化。例如，当光学活性分子定位在间隙的内部，可检测到具有高均一性和可再现性的最强的拉曼信号。
本文中，限制在核-间隙-壳的纳米间隙内的光学活性分子的类型决定了特定拉曼峰的生成。通过检测器(如CCD)经由相应拉曼滤光器对拉曼峰进行检测，以获得样品(细胞)的图像。通过计算机程序对这些图像进行颜色编码并随后将其显示出。
本文所用的术语“核”是指球形或类球形粒子，所述粒子具有1-900nm的直径，由呈现表面等离子体共振的金属构成。所述呈现表面等离子体共振的金属可为金、银或铜。
本文所用的术语“壳”是指核周围的包被层，所述包被层由呈现表面等离子体共振的金属构成。所述壳的厚度范围是0.1nm至900nm、优选1nm至100nm。所述核与所述壳之间形成的空间称为纳米间隙。金、银或铜可用作所述呈现表面等离子体共振的金属。
本文所用的术语“纳米间隙”是指所述核与所述壳之间形成的空间。纳米间隙的厚度优选为0.01nm至100nm的量级。可借助纳米间隙将核与壳区分开。可通过纳米间隙的形成而使得核和壳不互相接触，但核和壳也可通过纳米桥彼此接触。也就是说，“纳米间隙”并不意味着完全隔开核和壳的空间。
本文所用的术语“纳米桥”是指直径为0.5nm至20nm的连接核与壳的桥。纳米粒子可包含“具有纳米桥的纳米间隙”或“不具纳米桥的纳米间隙”。
本文所用的术语“光学活性分子”是指响应激发光而产生拉曼散射光的分子。光学活性分子定位于核和壳(所述核和壳均呈现表面等离子体共振)之间，发挥最大的表面增强拉曼散射效应。
根据本发明优选的实施方式，核-间隙-壳纳米粒子可选自于由以下纳米粒子所组成的组：i)由金核和银壳构成、并在所述金核和所述银壳之间形成纳米间隙的纳米粒子；ii)由银核和金壳构成、并在所述银核和所述金壳之间形成纳米间隙的纳米粒子；iii)由金核和金壳构成、并在所述金核和所述金壳之间形成纳米间隙的纳米粒子；iv)由银核和银壳构成、并在所述银核和所述银壳之间形成纳米间隙的纳米粒子。最优选由金核和金壳构成、并在其间形成纳米间隙的纳米粒子。对核的形态没有特别限制。
在纳米粒子中，核可通过纳米桥与壳相连。即，壳以这样的方式建立在核上方：在一些部分形成纳米桥而使得壳可与核表面接触，这示于图4中，具有纳米桥的纳米间隙延核表面形成。纳米桥的数量没有特别限制，仅需保障纳米间隙的形成。优选纳米桥具有0.5nm至20nm的直径。纳米桥的作用在于维持核-壳结构的稳定，并增强SERS信号。
定位于核和壳之间的纳米间隙中的光学活性分子，借助于在所述核和所述壳之间的纳米间隙处的等离子体耦合作用(plasmonic coupling)而发挥最大表面增强拉曼散射(SERS)效应，由此放大拉曼信号。特别是，可以高可再现地制备该纳米间隙结构。此外，所述纳米间隙结构显著地改善了信号的量化、数据的可再现性、制备的简易及便捷性、费用、以及探针的稳定性。
样品出射(emitted)的光穿过光分离单元21，经由拉曼滤过单元40后，由检测器111进行检测。
拉曼滤过单元40可包含一个以上的拉曼滤光器(优选1至20个拉曼滤光器、更优选5至20个拉曼滤光器)，只有特定的拉曼波长可以通过所述拉曼滤光器。样品所出射的具有不同拉曼波长的光经过一系列针对各自的拉曼波长的拉曼滤光器，从而检测器检测到特定拉曼波长，以获得1至20幅的多幅图像。
如前所述，拉曼滤过单元可使用带通滤光器、优选窄带通滤光器。
为调整放大倍数，可为检测器111(例如以非扫描方式运行的CCD相机)配备变焦镜头。配备变焦镜头后，可改进所述检测器的光学显微功能，并能够观察更详细的光学图像。
对于运动控制器50，其功能在于，通过在X轴或Y轴方向移动载物台(stage)，将样品定位于匹配入射光焦点的精确位置，所述载物台上加载有含有样品的多孔板。按照拉曼滤光器的数量，从含有样品的一个位点(孔)获得多幅图像后，通过运动控制器50将另一位点移至焦点，并用于拉曼成像。在与运动控制器协同工作的情况下，以非扫描方式运行的检测器(例如CCD(电荷耦合器件))可高速拍摄每个孔的拉曼图像，由此实现了高速筛选。
此外，为维持放置样品的外部腔室的大气，可为显微镜模块配备大气维持装置(atmosphere maintainer，未显示)。所述大气维持装置可控制腔室条件，如温度、湿度、pH等。
图像处理模块
图像处理模块的功能在于为从所述位点获取的单幅或多幅拉曼图像进行颜色编码、将颜色编码后的拉曼图像转换为细胞或组织图像、并显示该细胞或组织图像。
图像处理模块优选是计算机。对CCD相机获得的数据进行处理，并可将其存储于主存储单元。也可将标准分析物的出射谱(emissionprofiles)数据存储于主存储器或ROM。处理器可对拉曼活性基底上分析物的出射光谱进行比较，以区分分析物的种类。此外，处理器分析来自检测器的数据，来确定各种分析物的特征(identities)和／或浓度。在图像处理模块中，不同的计算机可用于各自的特定任务。因此，本发明的不同实施方式中可采用不同的系统结构。收集数据后，对数据进行分析。为便于数据分析，可使用高性能数字计算机。可对计算机适当编程，以在接收和存储数据外，进一步对收集到的数据进行分析和报告。
使用软件对通过一个以上的拉曼滤光器检测到的一个以上的拉曼峰编码各自的不同颜色。将由此获得的颜色编码的拉曼图像转换为细胞或生物组织图像并在监视器上显示该细胞或生物组织图像。
如上所述，在一个以上的核-间隙-壳纳米粒子选择性地与分析物结合后，本发明的装置可由存在于样品(如细胞)中的一种以上的分析物产生高分辨率的表面增强拉曼散射(SERS)光谱。当使用以非扫描方式运行的检测器(例如CCD(电荷耦合器件)相机)时，由于CCD相机可与运动控制器协同工作而在短时间内拍摄多个孔，本发明的装置能够高速筛选多种药物。
对本领域技术人员而言显而易见地，虽然参照附图阐明了多个特定要素(如具体元件)以说明本发明的装置，本领域技术人员能够理解的是，可在不背离本发明范围和精神的情况下进行各种修改、添加和替换。
根据本发明的另一方面，本发明提出了利用表面增强拉曼散射的多药物高速筛选方法，所述方法包括：
步骤1：将核-间隙-壳纳米粒子添加至待分析样品；
步骤2：用激光束照射所述样品，以产生拉曼散射光；用一个以上的拉曼滤光器滤过所述拉曼散射光，以提取感兴趣的拉曼波长；并用检测器检测拉曼光谱，从而由所述样品获得一幅以上的拉曼图像；以及
步骤3：对所述样品的拉曼图像进行颜色编码，以生成细胞或组织的图像，并显示所述细胞或组织的图像。
在步骤1中，在含有细胞的样品中加入含有核-间隙-壳纳米粒子的试剂。
在步骤1中使用的核-间隙-壳纳米粒子被设计为具有生物分子，所述生物分子能够识别感兴趣的分析物，并在壳表面上被功能化。当核-间隙-壳纳米粒子暴露于样品，所述生物分子与感兴趣的分析物结合，由此可用于拉曼成像。
如上所述，核-间隙-壳纳米粒子可选自于由以下纳米粒子所组成的组：i)由金核和银壳构成、并在所述金核和所述银壳之间形成纳米间隙的纳米粒子；ii)由银核和金壳构成、并在所述银核和所述金壳之间形成纳米间隙的纳米粒子；iii)由金核和金壳构成、并在所述金核和所述金壳之间形成纳米间隙的纳米粒子；iv)由银核和银壳构成、并在所述银核和所述银壳之间形成纳米间隙的纳米粒子。最优选由金核和金壳构成、并在其间形成纳米间隙的纳米粒子。
在步骤1中，将所述核-间隙-壳纳米粒子暴露于分析物可在本发明筛选装置的内部或外部进行。
步骤2被设计为生成并拍摄感兴趣的分析物的一幅以上的拉曼图像。在这方面，用激光束照射样品以产生拉曼散射光，随后将该拉曼散射光导向一个以上的拉曼滤光器。通过所述拉曼滤光器后，由检测器(例如CCD相机)检测特定的拉曼波长。
本发明的筛选装置中，拉曼滤过单元可包含一个以上的拉曼滤光器(优选1至20个拉曼滤光器、更优选5至20个拉曼滤光器)，只有特定的拉曼波长可通过所述拉曼滤光器。样品所出射的具有不同拉曼波长的光经过一系列针对各自的拉曼波长的拉曼滤光器，从而检测器检测到特定拉曼波长，以获得1至20幅的多幅图像。
如前所述，拉曼滤过单元可使用带通滤光器、优选窄带通滤光器。
为调整放大倍数，可为检测器(例如CCD相机)配备变焦镜头。配备变焦镜头后，允许检测器观察到具有更多细节的光学图像。
随后，在步骤3中，对在步骤2中获得的拉曼图像进行颜色编码；将颜色编码的拉曼图像转换为细胞或组织图像，并随后将其显示在显示器上。
在步骤3中，根据拉曼峰，将在步骤2中获得的拉曼图像编码1至20种颜色，生成复用度(multiplexity)范围为1至20种颜色的颜色编码的拉曼图像。
本发明的筛选装置和方法并非针对检测自发荧光而设计，而在于检测由核-间隙-壳纳米粒子产生的拉曼信号，从而使得其不在荧光标记间发生干扰。该核-间隙-壳纳米粒子显示了很强的表面增强拉曼散射(SERS)信号，其SERS增强因子高达约1012，且经证实高度可再现。此外，由于以非扫描方式运行的CCD相机能够即时拍摄多孔板的每个孔，并能与运动控制器协同运行拍摄其它孔，使用CCD相机作为检测器使得本发明的装置和方法能够高速筛选多种药物。此外，本发明的装置和方法能够对拉曼图像进行多色编码，可有效应用于多种药物的筛选。
可通过如下实施例更好地理解本发明，所述实施例用于阐明本发明，而不应视为限制本发明。
实施例
<制备例1-3>制备核-间隙-壳纳米粒子
使用DNA链作为具有高精确位置控制能力的拉曼染料修饰平台，按如下制备具有纳米桥支撑的内部间隙的NNP(具有纳米桥的纳米间隙粒子)：
根据文献记载的方法(S.J.Hurst，A.K.R.Lytton-Jean，C.A.Mirkin，Anal.Chem.78，8313(2006))制备DNA修饰的金纳米粒子(直径20nm；用于制备例1的DNA序列：[3′-HS-(CH2)3-(Dabcyl)-A10-PEG18-AAACTCTTTGCGCAC-5′]；用于制备例2的DNA序列：[3′-HS-(CH2)3-(Cy3)-A10-PEG18-AAACTCTTTGCGCAC-5′]；以及用于制备例3的DNA序列：[3′-HS-(CH2)3-(TAMRA)-A10-PEG18-AAACTCTTTGCGCAC-5′])。为在这些DNA修饰的金纳米粒子核周围形成金壳，在磷酸盐缓冲液(0.3M NaCl，10mM PB，pH7.4)中使DNA修饰的金纳米粒子与金前体(HAuCl4)、还原剂(NH2OH-HCl)和1％的聚-N-乙烯基-2-吡咯烷酮(PVP；MW40,000)反应，随后在室温下温和地漩涡振荡30分钟。金前体(HAuCl4)和还原剂(NH2OH-HCl)的量根据种子(seeds)(DNA修饰的金纳米粒子，1nM)的量控制，以在金壳形成的过程中监测纳米粒子的形态变化。
在这方面，将DNA修饰的金纳米粒子溶液(100μL；1nM，在0.3MPBS中)与50μL1％PVP溶液混合。生成的溶液再分别与1.5μL、5.2μL、10.3μL或30.4μL盐酸羟胺溶液(10mM)以及1.5μL、5.2μL、10.3μL或30.4μL氯金酸溶液(5mM)混合。根据试剂的用量，形成各种纳米结构。
<制备例4-6>制备PEG包被的核-间隙-壳纳米粒子
在制备例1-3中制备的各纳米粒子的壳表面应用PEG，以使得粒子在细胞培养基中分散良好，由此更适用于细胞实验(“Dabcyl”(制备例4)；“Cy3”(制备例5)；“TAMRA”(制备例6)；参见图9)。
参照“W.Peter Wuelfing，Stephen M.Gross，Deon T.Miles和RoyceW.Murray，J.Am.Chem.Soc.120，12696(1998)”，在纳米粒子的壳表面应用mPEG-SH(MW约5kDa)，以制备PEG包被的核-间隙-壳纳米粒子(制备例4-6)。
<实验例1>表面增强拉曼散射光谱的评价
使用制备例1-3制备的纳米粒子，通过本发明的装置测定SERS光谱。即，使用配置有倒置光学显微镜(Axiovert200，Zeiss)的自制(in-house)纳米-拉曼分光仪记录SERS光谱。
首先，分别将20μL含有制备例1-3中各纳米粒子的溶液通过旋转涂布施加于盖玻片上，以制备用于光谱测量的样品。将波长为660nm、能量为50nW-1mW的激发激光束导向油浸显微镜物镜(100×，数值孔径1.3；50×，数值孔径0.5；Zeizz)中，该物镜将光束聚焦于样品以产生拉曼信号。由液氮冷却(-125℃)的CCD(电荷耦合器件)采集背景拉曼信号。对全部数据进行基线校正以提供SERS光谱。结果如图5所示。
图5显示了使用制备例1-3中制备的纳米粒子，由本发明的装置记录的表面增强拉曼散射光谱。
从图5的SERS光谱可以看出，制备例1-3制备的纳米粒子产生其各自固有的拉曼峰。
此外，为了寻找经由该窄带通滤光器选择性通过来自含有制备例1-3的纳米粒子的溶液的拉曼散射光的窄带通滤光器，将用660nm的激发激光获得的光谱在X轴上以nm为单位分割，以确定所述窄带通滤光器的详细规格，用于滤过选自制备例1-3的纳米粒子的拉曼光谱中的峰和信号。结果如下：
“滤光器1”，针对制备例1的纳米粒子优化：中心=707nm，FWHM=1.5nm；
“滤光器2”，针对制备例2的纳米粒子优化：中心=715nm，FWHM=1.5nm；
“滤光器3”，针对制备例3的纳米粒子优化：中心=740nm，FWHM=1.5nm。
图6显示了用于选择性滤过源自制备例1-3的纳米粒子的拉曼散射光的窄带通滤光器的波长范围。
由图6的数据可知，制备例1-3制备的纳米粒子各自具有其固有的拉曼波长范围，由此能够制定针对纳米粒子优化的窄带通滤光器。
此外，为检验制备例1-3制备的纳米粒子是否仅由特定的窄带通滤光器选择性成像，用660nm的激发激光照射制备例1-3制备的纳米粒子的溶液，将拉曼光顺次导向窄带通滤光器(“滤光器1”、“滤光器2”和“滤光器3”)。结果如图7所示。此外，将通过针对各纳米粒子优化的窄带通滤光器由制备例1-3的纳米粒子获得的相应图像叠加，结果在图8中给出。
图7示出了在通过相应的窄带通滤光器对源自制备例1-3制备的纳米粒子的拉曼散射光进行选择性滤过后检测到的拉曼图像。
图8示出了通过针对制备例1-3制备的纳米粒子优化的相应的窄带通滤光器选择性滤过的拉曼图像及其叠加图像。
从图7、图8的数据可明显看出，仅当使用针对制备例1-3制备的纳米粒子优化的窄带通滤光器时，制备例1-3制备的纳米粒子才被选择性成像。此外，将获得自制备例1-3的纳米粒子的拉曼散射光束叠加后获得拉曼图像。
<实验例2>多色编码细胞图像的评价
使用制备例4-5制备的纳米粒子，由本发明的装置获得多色编码细胞图像。
在这方面，以20,000细胞／孔的密度将HeLa细胞(宫颈腺癌细胞系)接种在96孔板中，并在培养箱内保持20-24hrs。随后，将细胞用PBS清洗，并与含有制备例4-5制备的纳米粒子的细胞培养基在培养箱内孵育6hrs。再次用PBS清洗细胞，并用冷却的固定缓冲液(BD CytofixTM)固定15min。去除固定缓冲液后，将细胞用PBS清洗两次，并在冰箱中储存于PBS中备用。用660nm激发激光照射样品，以产生拉曼散射光束，使该拉曼散射光束通过窄带通滤光器(“滤光器1”和“滤光器2”)。所得图像如图10-图12所示。
图10示出了通过使用两个窄带通滤光器(“滤光器1”和“滤光器2”)由本发明的装置测量的(a)不与制备例5制备的PEG包被的纳米粒子孵育(对照组)和(b)与制备例5制备的PEG包被的纳米粒子孵育(实验组)的细胞的图像。
图11示出了通过使用两个窄带通滤光器(“滤光器1”和“滤光器2”)由本发明的装置测量的与制备例4的PEG包被的纳米粒子孵育的实验组细胞的图像的三个视野。
图12示出了通过使用两个窄带通滤光器(“滤光器1”和“滤光器2”)由本发明的装置测量的与制备例5的PEG包被的纳米粒子孵育的实验组细胞的图像的三个视野。
从图10-图12可以看出，由于“滤光器2”选择性输出制备例5制备的PEG包被的纳米粒子的信号，细胞的拉曼图像仅能通过“滤光器2”获得。应理解的是，这些图像不是来源于细胞的自发荧光，而是来源于与细胞结合的PEG包被的纳米粒子所散射的拉曼信号。
<附图标记说明>
10：光源     20：空间滤光器
21：分束器    30：物镜
40：拉曼滤光器   50：运动控制器
60：反射镜    110：计算机
111：检测器(CCD相机)

Claims (18)

1.一种利用表面增强拉曼散射的多药物高速筛选装置，所述装置包含：
用于将光源的光引入显微镜的激发模块，所述激发模块由透镜、反射镜和针孔组成；
用于获取样品图像的显微镜模块，所述显微镜模块包含：用于控制样品位置的运动控制器、由一个以上的拉曼滤光器组成的滤过单元、以及用于顺序接收通过所述滤过单元的光束的检测器，其中，所述滤过单元用于对样品被光源的激发光照射时由所述样品所散射的光进行拉曼波长滤过；以及
图像处理模块，所述图像处理模块用于将从含有样品的位点处获得的一组图像进行颜色编码以生成细胞或组织的图像，并用于显示所述细胞或组织的图像，其中，所述位点由所述运动控制器定位。
2.如权利要求1所述的高速筛选装置，所述高速筛选装置还包含用于存储核-间隙-壳纳米粒子的存储腔。
3.如权利要求1所述的高速筛选装置，其中，所述光源发出的光的波长为400nm至700nm。
4.如权利要求1所述的高速筛选装置，其中，所述滤过单元由1至20个拉曼滤光器组成。
5.如权利要求1所述的高速筛选装置，其中，所述检测器以扫描方式运行或以非扫描方式运行，以检测所述滤过单元输出的光。
6.如权利要求5所述的高速筛选装置，其中，所述以扫描方式运行的检测器是PMT(光电倍增管)或APD(雪崩光电二极管)；所述以非扫描方式运行的检测器是CCD(电荷耦合器件)相机。
7.如权利要求1所述的高速筛选装置，其中，所述一组图像由1至20幅图像组成。
8.如权利要求1所述的高速筛选装置，其中，所述样品是细胞。
9.如权利要求8所述的高速筛选装置，其中，所述细胞选择性地与核-间隙-壳纳米粒子结合，以用于拉曼成像。
10.如权利要求9所述的高速筛选装置，其中，所述核-间隙-壳纳米粒子包含核、包围所述核的壳、以及所述核和所述壳之间形成的纳米间隙，其中，所述核通过纳米桥与所述壳连接、或所述核不通过纳米桥与所述壳连接；所述纳米间隙中含有光学活性分子。
11.如权利要求10所述的高速筛选装置，其中，所述光学活性分子是由选自于下列原子所组成的组中的原子构成的分子：C、H、O、N、S，以及它们的组合。
12.如权利要求1所述的高速筛选装置，其中，当所述检测器是以非扫描方式运行的CCD(电荷耦合器件)时，通过所述运动控制器将孔顺序移至拍摄位置，所述检测器高速拍摄各孔中的样品的一幅以上的拉曼图像。
13.一种利用表面增强拉曼散射的多药物高速筛选方法，所述方法包括：
步骤1：将权利要求10所述的核-间隙-壳纳米粒子添加至待分析样品；
步骤2：用激光束照射所述样品，以产生拉曼散射光；用由一个以上的拉曼滤光器组成的滤过单元滤过所述拉曼散射光，以提取感兴趣的拉曼波长；并用检测器检测拉曼光谱，从而获得一幅以上的拉曼图像；以及
步骤3：对所述样品的拉曼图像进行颜色编码，以生成细胞或组织的图像，并显示所述细胞或组织的图像。
14.如权利要求13所述的高速筛选方法，其中，所述滤过单元由1至20个拉曼滤光器组成。
15.如权利要求13所述的高速筛选方法，其中，所述检测器以扫描方式运行或以非扫描方式运行，以检测所述滤过单元输出的光。
16.如权利要求15所述的高速筛选方法，其中，所述以扫描模式运行的检测器是PMT(光电倍增管)或APD(雪崩光电二极管)；所述以非扫描方式运行的检测器是CCD(电荷耦合器件)相机。
17.如权利要求13所述的高速筛选方法，其中，当所述检测器是以非扫描方式运行的CCD(电荷耦合器件)时，通过所述运动控制器将孔顺序移至拍摄位置，所述检测器高速拍摄各孔中的样品的一幅以上的拉曼图像。
18.如权利要求13所述的高速筛选方法，其中，所述步骤3通过如下方式进行：使用计算机程序对在所述步骤2中获得的所述样品的拉曼图像编码1至20种颜色，以获得颜色编码的拉曼图像；并以范围为1至20的复用度显示所述颜色编码的拉曼图像。
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