CN114384032B - 诺如病毒检测探针和非诊断目的检测诺如病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了诺如病毒检测探针及其制备方法、诺如病毒检测试剂盒和非诊断目的检测诺如病毒的方法，属于分子检测技术领域；所述诺如病毒检测探针包括融合蛋白和与所述融合蛋白化学结合的CuO2；所述融合蛋白包括串联的诺如病毒识别肽和麦芽糖结合蛋白。在本发明中，所述融合蛋白中的诺如病毒识别肽能够与待检样品中的诺如病毒(NoV)特异性结合。CuO2的Cu2+与麦芽糖结合蛋白(MBP)上的氨基和巯基配位结合。并且CuO2具备催化漆酶底物显色的性能。本发明的诺如病毒检测探针能够特异性结合NoV并显色，能够用于检测NoV。

Description

诺如病毒检测探针和非诊断目的检测诺如病毒的方法
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，具体涉及诺如病毒检测探针及其制备方法、诺如病毒检测试剂盒和非诊断目的检测诺如病毒的方法。
背景技术
诺如病毒(norovirus，NoV)是一种线性单链正向RNA病毒，属于杯状病毒科，是非细菌性急性胃肠炎的主要病原之一，被WHO定为B类病原，主要导致食源或水源性急性腹泻。在全球范围内，约73％～95％的急性胃肠炎疫情暴发与诺如病毒有关。该病毒可以通过人-人密切传播、经水传播、食源性传播、还可以通过气溶胶传播。感染人类的诺如病毒最常见有两个基因组：GI、GII，包括多种基因型。监测数据显示，全球75％～100％的诺如病毒病例都是由GII型(主要是GII.4型)引起。诺如病毒GII型感染聚集性暴发事件已成为公共卫生领域的热点问题。
目前酶联免疫吸附测定法(ELISA)仍然是最常使用的测定诺如病毒浓度的检测方法，具有高灵敏度、低样本需求量、高通量和低成本等优点。国内外已报道的体内诺如病毒浓度的ELISA检测方法，主要是以抗原抗体反应为依据，利用二抗上偶联的辣根过氧化物酶(HRP)的底物显色作用，实现检测。但由于天然酶在非生理条件下不稳定，容易变性失活，使得传统的ELISA方法的灵敏度仅为105拷贝/mL。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供诺如病毒检测探针及其制备方法、诺如病毒检测试剂盒和非诊断目的检测诺如病毒的方法，基于本发明的诺如病毒检测探针的诺如病毒检测试剂盒和非诊断目的检测诺如病毒的方法，具有灵敏度高的优势。
本发明提供了一种诺如病毒检测探针，包括融合蛋白和与所述融合蛋白化学结合的CuO2；所述融合蛋白包括串联的诺如病毒识别肽和麦芽糖结合蛋白。
优选的，所述诺如病毒识别肽包括GⅡ.4诺如病毒识别肽。
优选的，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述融合蛋白的摩尔质量和CuO2的质量比为5×10-5～3×10-4μmol：0.25～2.5mg。
本发明还提供了上述方案所述的诺如病毒检测探针的制备方法，包括以下步骤：
将CuO2和融合蛋白混合，融合蛋白的巯基和CuO2配位，形成稳定的CuO2-肽纳米复合物，即得到诺如病毒检测探针。
本发明还提供了一种诺如病毒检测试剂盒，包括上述方案所述的诺如病毒探针或者所述制备方法制备得到的诺如病毒检测探针。
优选的，所述诺如病毒检测试剂盒还包括诺如病毒一抗、牛血清白蛋白和显色底物。
本发明还提供了一种非诊断目的检测诺如病毒的方法，包括以下步骤：
1)将诺如病毒一抗加入到酶标板的反应孔内，进行第一孵育，得到包被有诺如病毒一抗的酶标板；
2)在所述包被有诺如病毒一抗的酶标板的反应孔内加入牛血清白蛋白，进行第二孵育；
3)在所述第二孵育后的反应孔内加入待测样本，进行第三孵育；
4)在所述第三孵育后的的反应孔内加入上述方案所述的诺如病毒探针或者所述制备方法制备得到的诺如病毒检测探针，进行第四孵育；
5)在所述第四孵育后的反应孔内加入2-吗啉乙磺酸缓冲液和显色底物，进行显色反应，得到显色产物，检测所述显色产物在510nm处的吸光值；根据预定的标准曲线和所述吸光值，获得待测样品中诺如病毒的浓度；
所述标准曲线为诺如病毒浓度的对数与吸光值的线性关系曲线。
优选的，步骤4)中，所述诺如病毒检测探针的加入量为50～100μL/孔。
优选的，步骤5)中，所述显色反应的温度为50～60℃。
本发明提供了一种诺如病毒检测探针，包括融合蛋白和与所述融合蛋白化学结合的CuO2；所述融合蛋白包括串联的诺如病毒识别肽和麦芽糖结合蛋白。在本发明中，融合蛋白中的诺如病毒识别肽能够与待检样品中的诺如病毒(NoV)特异性结合。CuO2的Cu2+与麦芽糖结合蛋白(MBP)上的氨基和巯基配位结合，CuO2具备催化漆酶底物显色的性能，能催化漆酶底物2,4-二氯苯酚(2,4-DP)和4-氨基安替比林(4-AP)变红色，增加检测灵敏度。本发明提供的诺如病毒检测探针能够特异性结合NoV并显色，能够用于检测NoV。基于本发明的诺如病毒检测探针构建的ELISA检测策略的线性检测范围是10～104copies/mL，最低检出限(LOD)为10copies/mL，可见，本发明的诺如病毒检测探针用于ELISA检测诺如病毒，具有灵敏度高的优势。此外，基于本发明的诺如病毒检测探针构建的构建的诺如病毒ELISA检测策略有较好的选择性和抗干扰性，能用于成分复杂的实际样品中诺如病毒的检测。
附图说明
图1为本发明实施例的流程图；
图2为CuO2纳米粒子的TEM图；
图3为CuO2的XPS图；
图4为实验条件优化结果，其中，pH(A)，温度(B)，探针孵育时间(C)；
图5为传感器的线性检测范围，其中A为线性分析结果，B为标准曲线；
图6表示ELISA检测原理；
图7为抗干扰性能测试结果，其中抗干扰性(A)和平行性(B)。
具体实施方式
本发明提供了一种诺如病毒检测探针，包括融合蛋白和与所述融合蛋白化学结合的CuO2；所述融合蛋白包括串联的诺如病毒识别肽和麦芽糖结合蛋白。
在本发明中，所述诺如病毒识别肽优选的包括GⅡ.4诺如病毒识别肽；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：MGQHKMHKPHKNTKGSGGGKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTN(N端到C端)。
在本发明中，所述融合蛋白是一种特异性识别诺如病毒识别肽；所述融合蛋白优选的通过基因工程技术将麦芽糖结合蛋白(MBP)基因与特异性识别诺如病毒识别肽(Pep)基因进行重组获得。
在本发明中，所述麦芽糖结合蛋白(MBP)含有氨基和巯基，可提供更多肽与CuO2结合的位点。
本发明对所述麦芽糖结合蛋白和诺如病毒识别肽的连接顺序没有特殊限制。
在本发明中，CuO2(过氧化铜)是一种纳米材料，为片层结构，尺寸范围为5～20nm，CuO2具有良好的水溶性和类漆酶催化性能，且具有结合抗体、适配体、多肽等具有识别作用的生物分子等特点。本发明中，CuO2的Cu2+与麦芽糖结合蛋白(MBP)上的氨基和巯基配位结合。并且CuO2具备催化漆酶底物显色的性能，能催化漆酶底物2,4-二氯苯酚(2,4-DP)和4-氨基安替比林(4-AP)变红色，增加检测灵敏度。
本发明对CuO2的来源没有特殊限制，采用本领域常规方法制备得到即可。本发明具体实施过程中，所述CuO2参照DOI:10.1021/jacs.9b03457的制备方法制备得到。
在本发明中，所述融合蛋白的摩尔质量和CuO2的质量比优选为5×10-5～3×10-4μmol：0.25～2.5mg。
本发明还提供了上述方案所述的诺如病毒检测探针的制备方法，包括以下步骤：
将CuO2和融合蛋白混合，融合蛋白的巯基和CuO2配位，形成稳定的CuO2-肽纳米复合物，即得到诺如病毒检测探针。
在本发明中，将CuO2和融合蛋白混合优选的包括：将CuO2水悬浮液和融合蛋白悬浮液混合；所述CuO2水悬浮液中CuO2的质量浓度优选为0.1～5mg/mL，更优选为0.5～3mg/mL，最优选为1～2mg/mL；所述CuO2水悬浮液的溶剂优选为去离子水；所述融合蛋白悬浮液中融合蛋白的摩尔浓度优选为8～10μmol/L；所述CuO2水悬浮液和融合蛋白悬浮液的体积比优选为(400～500)：(5～30)。
在本发明中，所述CuO2水悬浮液优选的采用以下方法制备得到：将CuO2粉末分散在水中，超声处理1～5h。在本发明中，所述超声的温度优选为0～4℃，更优选为冰浴超声。本发明对所述超声的功率没有特殊要求。
在本发明中，所述混合的温度优选为20～30℃，更优选为25℃；所述混合的时间优选为9～16h，更优选为12h。
在本发明中，所述诺如病毒检测探针的存储温度优选为4℃。
本发明还提供了一种诺如病毒检测试剂盒，包括上述方案所述的诺如病毒探针或者所述制备方法制备得到的诺如病毒检测探针。
在本发明中，所述诺如病毒检测试剂盒优选的还包括诺如病毒一抗、牛血清白蛋白和显色底物；所述显色底物优选为2,4-DP和4-AP；所述诺如病毒检测试剂盒更优选的还包括2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液和PBST洗涤液。
本发明还提供了一种非诊断目的检测诺如病毒的方法，包括以下步骤：
1)将诺如病毒一抗加入到酶标板的反应孔内，进行第一孵育，得到包被有诺如病毒一抗的酶标板；
2)在所述包被有诺如病毒一抗的酶标板的反应孔内加入牛血清白蛋白，进行第二孵育；
3)在所述第二孵育后的反应孔内加入待测样本，进行第三孵育；
4)在所述第三孵育后的的反应孔内加入上述方案所述的诺如病毒探针或者所述制备方法制备得到的诺如病毒检测探针，进行第四孵育；
5)在所述第四孵育后的反应孔内加入2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液和显色底物，进行显色反应，得到显色产物，检测所述显色产物在510nm处的吸光值；根据预定的标准曲线和所述吸光值，获得待测样品中诺如病毒的浓度；
所述标准曲线为诺如病毒浓度的对数与吸光值的线性关系曲线。
本发明首先将诺如病毒一抗(Ab1)加入到酶标板的反应孔内，进行第一孵育，得到包被有诺如病毒一抗的酶标板。
在本发明中，所述诺如病毒一抗优选的经过PBS缓冲液稀释，稀释后Ab1的质量浓度优选为0.5～2μg/mL，更优选为1～1.5μg/mL；每个反应孔中稀释后Ab1的加入量优选为50～100μL/孔；所述第一孵育的温度优选为4℃；所述第一孵育的时间优选为9～16h，更优选为12h。在所述第一孵育后，本发明优选的还包括对所述第一孵育的产物依次进行清洗和拍干；所述清洗采用的试剂优选为PBST洗涤液；所述清洗的次数优选为3次。
得到包被有诺如病毒一抗的酶标板后，本发明在所述包被有诺如病毒一抗的酶标板的反应孔内加入牛血清白蛋白(BSA)，进行第二孵育。
在本发明中，所述BSA的质量浓度优选为1％；所述牛血清白蛋白的添加量优选为50～100μL/孔；所述第二孵育的温度优选为4℃；所述第二孵育的时间优选为40～50min，更优选为45min。在所述第二孵育后，本发明优选的还包括对所述第二孵育的产物依次进行清洗和拍干；所述清洗采用的试剂优选为PBST洗涤液；所述清洗的次数优选为3次。
本发明在所述第二孵育后的反应孔内加入待测样本，进行第三孵育。
在本发明中，所述待测样本的加入量优选为50～100μL/孔；所述第三孵育的温度优选为4℃；所述第三孵育的时间优选为1.5～2h。在所述第三孵育后，本发明优选的还包括洗板；所述洗板采用的试剂优选为PBST洗涤液；所述洗板的次数优选为3次。
本发明在所述第三孵育后的的反应孔内加入上述方案所述的诺如病毒探针或者所述制备方法制备得到的诺如病毒检测探针，进行第四孵育。
在本发明中，所述诺如病毒检测探针(CuO2@MBP-Pep)的加入量优选为50～100μL/孔；所述第四孵育的温度优选为4℃；所述第四孵育的时间优选为1～2h，更优选为1.5h。在所述第四孵育后，本发明优选的还包括洗板；所述洗板采用的试剂优选为PBST洗涤液；所述洗板的次数优选为3次。
本发明在所述第四孵育后的反应孔内加入2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液和显色底物，进行显色反应，得到显色产物，检测所述显色产物在510nm处的吸光值；根据预定的标准曲线和所述吸光值，获得待测样品中诺如病毒的浓度。
在本发明中，所述2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液和显色底物的总加入量优选为300μL/孔。在本发明中，所述显色反应的温度优选为50～60℃；所述显色反应的时间优选为10～20min，更优选为15min。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明实施例的技术流程图参见图1。
实施例1：CuO2的制备和表征
将0.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP，polyvinyl pyrrolidone)溶解在5mL0.01MCuCl2.2H2O的水溶液中。然后，将5mL 0.02M NaOH和100μLH2O2依次加入上述溶液中，搅拌30min后，通过超滤收集PVP包覆的CuO2纳米点并用水洗涤。CuO2纳米粒的TEM图示(图2)。CuO2的XPS图示(图3)。CuO2纳米材料成功制备，并通过扫描电镜图像和XPS光电子能谱证明。
实施例2：在CuO2上修饰MBP-Pep：
将合成的MBP-Pep按照说明书的稀释方法用去离子水稀释为1μmol/L，然后将30～50μL 1μmol/L的MBP-Pep加入到500μL1mg/mL的CuO2纳米材料溶液中，室温震荡12h，离心后去除上清液并用去离子水洗涤备用。
实施例3：实验条件优化，具体步骤如下：
(1)2-吗啉乙磺酸缓冲液的pH也对反应体系的成功构建有着较大的影响。分别选择了3.0，4.0，4.0，5.0，6.0，6.8，8.0和9.0共8个pH梯度来进行筛选。结果表明反应的最佳pH为6.8。(图4中的A)
(2)设置20℃，30℃，40℃，50℃和60℃五个温度梯度来评估温度对漆酶底物催化的影响，结果表明50℃为最佳反应温度。(图4中的B)
(3)对CuO2@MBP-Pep复合探针的孵育时间进行了优化，设置了10min，20min，30min，40min，50min，60min，75min和90min共8个时间梯度，实验结果表明CuO2@MBP-Pep复合探针的最适孵育时间为60min。(图4中的C)。
实施例4：诺如病毒的检测程序，具体步骤如下：
(1)用PBS缓冲液稀释诺如病毒一抗(Ab1)至0.5～2μg/mL，每孔100μL包被于酶标板，4℃孵育过夜；
(2)用PBST洗涤液清洗3遍，每孔加入100μL 1％BSA，4℃封闭45min；
(3)用PBST洗涤液清洗3遍，每孔加入50～100μL浓度为10-104copies·mL-1的不同浓度的NoV溶液，4℃孵育2h；
(4)用PBST洗涤液清洗3遍，每孔加入100μL CuO2@MBP-Pep复合探针，4℃孵育2h。
(5)用PBST洗涤液清洗3遍，每孔加入适量MES缓冲液，2,4-DP，4-AP，反应体系总体积为300μL，50℃孵育15min，紫外分光光度计检测510nm处的吸光值，建立标准曲线(图5)。检测原理图见图6。随着病毒浓度增加，紫外分光光度计检测到的吸光度增加，且在10-104copies/mL的诺如病毒浓度范围内具有良好的线性关系。
实施例5：抗干扰性和平行性测试，具体步骤如下：
(1)所构建检测方法抗干扰性能测试。分别测量了BSA、EV、RV、AA、E.coli、Glu、Arg、Mg2+、Na+和K+这些常见干扰物质的吸光度响应，并与HuNoV和这些物质的混合物的响应做比较，其结果如图7中的(A)所示，这些干扰物的吸光度响应几乎没有变化，而有HuNoV存在时，反应液的吸光光度值明显增加，HuNoV和干扰物混合物的吸光度响应也显著增加，表明传感器具有良好的选择性和抗干扰能力；
(2)所构建检测方法平行性测试。制备了五个相同的ELISA，并分别测量了它们的吸光度响应，从图7中的(B)可以看出所制备的传感器具有良好的平行性。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 云南大学
<120> 诺如病毒检测探针及其制备方法、诺如病毒检测试剂盒和非诊断目的检测诺如病毒的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 386
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gly Gln His Lys Met His Lys Pro His Lys Asn Thr Lys Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly
20 25 30
Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys
35 40 45
Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu
50 55 60
Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe
65 70 75 80
Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala
85 90 95
Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr
100 105 110
Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala
115 120 125
Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro
130 135 140
Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala
145 150 155 160
Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr
165 170 175
Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn
180 185 190
Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys
195 200 205
Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn
210 215 220
Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu
225 230 235 240
Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr
245 250 255
Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala
275 280 285
Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu
290 295 300
Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala
305 310 315 320
Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile
325 330 335
Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile
340 345 350
Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn
355 360 365
Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln
370 375 380
Thr Asn
385

Claims (10)

1.一种诺如病毒检测探针，包括融合蛋白和与所述融合蛋白化学结合的CuO2；所述融合蛋白包括串联的诺如病毒识别肽和麦芽糖结合蛋白；
所述CuO2的Cu2+与麦芽糖结合蛋白上的氨基和巯基配位结合。
2.根据权利要求1所述的诺如病毒检测探针，其特征在于，所述诺如病毒识别肽包括GⅡ.4诺如病毒识别肽。
3.根据权利要求2所述的诺如病毒检测探针，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1或2所述的诺如病毒检测探针，其特征在于，所述融合蛋白的摩尔质量和CuO2的质量比为5×10-5～3×10-4μmol：0.25～2.5mg。
5.权利要求1～4任意一项所述的诺如病毒检测探针的制备方法，包括以下步骤：
将CuO2和融合蛋白混合，融合蛋白的氨基和巯基和CuO2配位，形成稳定的CuO2-肽纳米复合物，即得到诺如病毒检测探针。
6.一种诺如病毒检测试剂盒，包括权利要求1～4任意一项所述的诺如病毒探针或者权利要求5所述制备方法制备得到的诺如病毒检测探针。
7.根据权利要求6所述的诺如病毒检测试剂盒，其特征在于，所述诺如病毒检测试剂盒还包括诺如病毒一抗、牛血清白蛋白和显色底物。
8.一种非诊断目的检测诺如病毒的方法，包括以下步骤：
1)将诺如病毒一抗加入到酶标板的反应孔内，进行第一孵育，得到包被有诺如病毒一抗的酶标板；
2)在所述包被有诺如病毒一抗的酶标板的反应孔内加入牛血清白蛋白，进行第二孵育；
3)在所述第二孵育后的反应孔内加入待测样本，进行第三孵育；
4)在所述第三孵育后的的反应孔内加入权利要求1～4任意一项所述的诺如病毒探针或者权利要求5所述制备方法制备得到的诺如病毒检测探针，进行第四孵育；
5)在所述第四孵育后的反应孔内加入2-吗啉乙磺酸缓冲液和显色底物，进行显色反应，得到显色产物，检测所述显色产物在510nm处的吸光值；根据预定的标准曲线和所述吸光值，获得待测样品中诺如病毒的浓度；
所述标准曲线为诺如病毒浓度的对数与吸光值的线性关系曲线。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述诺如病毒检测探针的加入量为50～100μL/孔。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤5)中，所述显色反应的温度为50～60℃。
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