CN109705197A

CN109705197A - 丙型肝炎病毒重组抗原及其应用

Info

Publication number: CN109705197A
Application number: CN201811558638.1A
Authority: CN
Inventors: 叶小琴; 夏良雨; 赵存洋; 陈艳华; 潘少丽
Original assignee: Guangdong Peng Peng Biological Co Ltd
Current assignee: Guangdong Peng Peng Biological Co Ltd
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2019-05-03

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种丙型肝炎病毒重组抗原及其应用。该重组抗原，其序列中包含core、NS3、NS4A、NS4B的蛋白区段。该重组抗原各区优势表位抗原连接，灵敏度高，稳定性好。本发明还改良了包被抗原和与标记物相偶模式，不引入其他蛋白，同时保证抗原活性和试剂盒灵敏度的情况下，优化试剂盒特异性。

Description

丙型肝炎病毒重组抗原及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种丙型肝炎病毒重组抗原及其应用。

背景技术

丙型肝炎病毒(Hepatitis Virus C，HCV)是一类球形的单股正链RNA病毒，长度约为9600个核苷酸。基因组序列具有高度变异性。根据不同区域的基因序列变异情况，丙型肝炎病毒分为6个基因型和80多种基因亚型。目前研究显示，丙型肝炎病毒的ORF可编码至少11个蛋白，包括3个结构蛋白：核心蛋白(core)、E1和E2；7个非结构蛋白：NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，以及小蛋白P7。

丙型肝炎病毒感染后，约80％的人并不会出现任何症状；急性症状包括发热、全身乏力、食欲下降、恶心、呕吐、腹痛、尿色深、大便颜色变浅、关节酸痛和黄疸；约75-85％的新感染者出现慢性肝病，慢性感染者中60-70％会出现慢性肝病，5-20％会出现肝硬化，1-5％会死于肝硬化或肝癌。

丙型肝炎病毒虽然在感染者体内滴度较低，但其几乎所有结构和非结构蛋白都能够诱发机体的免疫应答，并产生相应的抗体。抗丙型肝炎病毒抗体是人体免疫细胞对丙型肝炎病毒感染做出免疫反应而产生的抗体。抗HCV抗体检测具有简便、快捷、易于开展的特点，是目前公认的HCV感染筛查首选检测方法。

发明内容

本发明提供了一种丙型肝炎病毒重组抗原，并对其可能的应用进行了阐述。该重组抗原各区优势表位抗原连接，灵敏度高，稳定性好。

具体的，本发明涉及一种丙型肝炎病毒重组抗原，其序列中包含core、NS3、NS4A、NS4B的蛋白区段。

本发明提供了一种丙型肝炎病毒重组抗原，并对其可能的应用进行了阐述该重组抗原各区优势表位抗原连接，灵敏度高，稳定性好。

根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述的重组抗原在制备丙型肝炎检测剂中的应用。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种丙型肝炎检测试剂盒，其含有包被丙型肝炎第一抗原Ag₁的固相载体以及标记有标记物的丙型肝炎第二抗原Ag₂；其中Ag₁与Ag₂中的至少一种为如上所述的重组抗原。

具体实施方式

本发明同时提供一种改良的双抗原夹心法丙型肝炎试剂盒制备方法，该方法所用抗原为丙型肝炎病毒抗原各区优势表位抗原连接并重复串联表达而成或者化学技术自相偶联而成的嵌合抗原，灵敏度高，稳定性好；本发明还改良了包被抗原和与标记物相偶模式，不引入其他蛋白，同时保证抗原活性和试剂盒灵敏度的情况下，优化试剂盒特异性。即先将抗原采用基因工程技术同片段重复串联表达或化学交联方法使其按一定比例自身交联，形成重复表位，增加表位暴露几率；表面修饰磁珠和处理碱性磷酸酶，偶联抗原时避开与抗原巯基和氨基连接的反应模式，减少抗原表位覆盖的概率。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明涉及一种丙型肝炎病毒重组抗原，其序列中包含core、NS3、NS4A、NS4B的蛋白区段。

在一些实施方式中，所述core、NS3、NS4A、NS4B的蛋白区段中的一种或多种重复表达≥2次。

在一些实施方式中，所述重组抗原以core-NS3-NS4A-NS4B的顺序串联。

在一些实施方式中，所述重组抗原以(core-NS3-NS4A-NS4B)×2的顺序串联。

在一些实施方式中，所述core、NS3、NS4A、NS4B的蛋白区段序列依次如SEQ ID NO:1-4所示。

在一些实施方式中，所述重组抗原与固相支持物或用于显示信号强度的标记物偶联。

在一些实施方式中，所述固相支持物或标记物通过功能基团与所述重组抗原的非活性或低活性表位偶联。

当抗原与固相支持物或标记物化学交联以后，构象容易发生变化，表位不易暴露，从而活性降低；故而在本发明的另一方面中，可通过优化的标记物偶联方式避免标记物对抗原活性的影响。

非活性表位是指偶联后不引起抗原构象变化的表位；

低活性表位是指偶联后在可接受程度内引起抗原构象变化的表位。

发明人发现，HCV病毒的抗原表位区段core的主要活性区富含赖氨酸，从而导致氨基残基在core活性区段富集，包被标记一般偶联的就是抗原的氨基，这样导致core活性表位失活或者被覆盖，从而活性降低；在这个例子中，氨基富集的表位多为活性表位；因而非氨基表位(例如羟基所在表位)可以认为是非活性/低活性表位。

在一些实施方式中，所述非活性或低活性表位选自所述丙型肝炎病毒重组抗原的羟基；

和/或；

所述功能基团在与所述固相支持物/所述标记物端连接处的官能团靶点为非选择性靶点，或选自羟基、羧基、氨基、巯基、醛基、DNA、RNA中的任一种。

功能基团可完全修饰在所述固相支持物/所述标记物上，功能基团的游离端与所述重组抗原的羟基偶联；

亦可以将功能基团在所述固相支持物/所述标记物上修饰一部分，在抗原表位处修饰一部分，再将二者偶联。

在一些实施方式中，所述功能基团选自下列反应基团：

芳基叠氮化物、碳化二亚胺、重氮甲烷、酰肼、羟甲基膦、亚胺酸酯、异氰酸酯、马来酰亚胺、盐乙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯、五氟代苯酯、补骨脂素、吡啶基二硫化物、乙烯基砜。

上述反应基团所对应的官能团靶点如下表所示：

在一些实施方式中，所述固相支持物为磁珠；

在一些实施方式中，所述磁珠为γFe₂O₃或Fe₃O₄磁性纳米粒子，或它们与有机高分子材料的复合体。

在一些实施方式中，所述标记物选自荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种；

在一些实施方式中，所述荧光物质包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的任一种。

在一些实施方式中，所述放射性同位素包括¹¹⁰In、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、⁹⁴mTc、⁹⁴Tc、⁹⁹mTc、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、^154-158Gd、³²P、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、⁵²mMn、⁵⁵Co、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁸²mRb和⁸³Sr中的任一种。

在一些实施方式中，所述荧光微球为：聚苯乙烯荧光微球，内部包裹有稀土荧光离子铕。

在一些实施方式中，所述标记物选自辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括测试处理液、测试稀释液、发光底物、洗涤液、丙型肝炎病毒抗体阴性质控品以及丙型肝炎病毒抗体阳性质控品中的一种或多种。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种检测丙型肝炎病毒的方法，所述方法以形成固相支持物-丙型肝第一抗原Ag₁-丙型肝炎病毒抗体-丙型肝第二抗原Ag₂的形式完成检测，其中Ag₂偶联有用于显示信号强度的标记物；其中Ag₁与Ag₂中的至少一种为如上所述的重组抗原。

在一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：

1)将Ag₁、Ag₂与待检物在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下接触，形成免疫复合物；

其中以摩尔数计，Ag₁的含量多于Ag₂；

2)洗去未结合的丙型肝炎病毒抗体；

3)加入Ag₂并使其与所述免疫复合物中剩余的抗原结合位点结合；

4)检测所述标记物，以指示所述丙型肝炎病毒抗体的存在和/或含量。

在一些实施方式中，在步骤1)中，以摩尔比计，Ag₁:Ag₂＝6:2～6:5；也可以选择3:2或者2:1。

合适的Ag₁与Ag₂的添加比例能在保证灵敏度的前提下避免勾状效应。根据具体的抗原抗体特性不同，该比值可能有一些差别，但经过发明人验证，绝大多数抗原均满足上述比例。

在本发明中，“摩尔比”也可以为抗原的活性比，具有与待检测抗体结合的抗原表位的一个蛋白质可以认为是一个活性单位。

在一些实施方式中，以摩尔比计，步骤1)中加入的Ag₂与步骤3)中加入的Ag₂的比例为6:2～6:4。

在一些实施方式中，以摩尔比计，步骤1)中加入的Ag₂与步骤3)中加入的Ag₂的比例为2:1。

步骤3)中的Ag₂以适当比例添加能够有效减少标记物的残留，以降低背景。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例

本实施例涉及一种丙型肝炎病毒抗体的检测方法。

1.试剂盒的制备。

本发明的丙型肝炎病毒抗体化学发光免疫分析测定试剂盒：包括以下步骤：

1)丙型肝炎病毒特异性重组嵌合抗原的制备：

所述丙型肝炎病毒特异性重组嵌合抗原为core-NS3-NS4A-NS4B串联表达得到，且串联片段重复2次，即所表达的片段为(core-NS3-NS4A-NS4B)×2。上述嵌合抗原转化到大肠杆菌中使其表达，最后通过蛋白纯化技术得到丙型肝炎病毒特异性嵌合蛋白抗原。

2)磁珠体系：磁珠为γFe₂O₃或Fe₃O₄磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，并具有0.1-5μm的粒径，其表面带有氨基功能基团，将其依此使用2-IT(Traut’s Reagent(2-Iminothiolane·HCl)-Thermo交联剂，货号26101)及PMPI(thermo双功能交联剂，货号28100)进行活化从而引入异氰酸酯基团。进一步的，采用以下方法制备：

a)将HCV重组嵌合抗原1用1×PBS进行透析；

b)将透析后HCV重组嵌合抗原1，以10-70ug/mg磁珠的比例与磁珠进行混合，2～8°反应18小时；

c)将反应物用磁分离器分离，用磁珠试剂缓冲液将磁珠稀释后作为工作液使用。

3)酶标记物体系：

在其中一个实施例中，所述酶示踪物选自碱性磷酸酶，进一步可采用以下方法制备：

a)将碱性磷酸酶用10mM PBS进行透析，然后用2-IT进行活化；再将碱性磷酸酶用PMPI进行活化；

b)将HCV重组嵌合抗原2用10mM PBS进行透析，备用

c)将活化后的碱性磷酸酶与透析后的HCV重组嵌合抗原2进行混合，2～8℃反应6-24小时。

d)将反应物用层析柱纯化，用酶标试剂缓冲液将酶标抗原稀释后作为工作液使用。所述HCV重组嵌合抗原2和碱性磷酸酶的质量比为2:1-1:20；2-IT与碱性磷酸酶的摩尔比为1:1-1:100，PMPI与碱性磷酸酶的摩尔比为1:1-1:50。

4)发光底物制备

人工合成金刚烷胺类发光底物及其增强剂，均经无菌过滤，制备发光底物工作液。

5)洗涤液制备

洗涤液为含有Tween-20的PBS，其中Tween-20的工作浓度为0.01-0.1％，优选0.03-0.05％。

6)质控品

丙型肝炎病毒抗体阴性质控品：由非丙型肝炎病毒感染的健康人群血清配制而成。

丙型肝炎病毒抗体阳性质控品：由病毒性丙型肝炎患者的特异性抗体阳性血清配制而成；

7)制备丙型肝炎病毒抗体高通量检测试剂盒

包被HCV重组嵌合抗原1的磁珠、碱性磷酸酶标记HCV重组嵌合抗原2、测试处理液、测试稀释液、发光底物、洗涤液、丙型肝炎病毒抗体阴性质控品、丙型肝炎病毒抗体阳性质控品和外包装盒共同组成的丙型肝炎病毒抗体化学发光检测试剂盒。

2.丙型肝炎病毒抗体的检测方法，采用上述的试剂盒，包括以下步骤：

1)取待测样本50uL加入包被有HCV重组嵌合抗原1的磁珠工作液50μL和偶联了丙型肝炎嵌合抗原2的碱性磷酸酶的工作液50uL的混合液中，同时加入测试处理液50uL，37℃孵育15min；

2)加入磁-场进行磁分离1min，去上清；

3)洗涤4次，每次250uL洗液，重复步骤2操作；

4)加入测试稀释液100μL，偶联了丙型肝炎嵌合抗原2的碱性磷酸酶的工作液50uL，37℃孵育15min；

5)加入磁场进行磁分离1min，去上清；

6)洗涤4次，每次250uL洗液，重复步骤4操作；

7)加入底物100uL，必须于加化学发光底物液后的第5～30分钟内测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间1秒/孔。

8)均值各孔的RLU值与CUTOFF比较，样品测定值≥20×阴性质控，则判断为阳性，否则为阴性。

实验例

1).比较一步双抗原夹心法、两步双抗原夹心法和双抗原夹心综合法(实施例中内容)检测灵敏度。

为了对比三种反应模式的优劣，选取20例阴性样本和20例阳性标本同时采用两种反应模式进行检测，检测结果如下：

由下表可以看出，一步两步结合法检测灵敏度与一步法相当，较两步法更高，因此低值阳性测值更高，两步法对弱阳样本存在漏检风险；强阳样本测值一步法偏低，两步法和综合法测值较高，这是由于钩状效应导致，说明两步法和综合法可以避免钩状效应产生。因此双抗原综合法检测性能要优于一步法和双抗夹心直接两步法。

两种反应模式的比较结果

2).检出率比较

对比例的设置，将重组抗原替换为core+NS3抗原，其余同实施例。

测试200例确认为阳性的标本，验证试剂符合率，其中有2例有NS4表位抗原试剂检出，但不含NS4抗原漏检。

检测结果如下：

上表中，A为core+NS3抗原--试剂盒(对比例)，B为core+NS3+NS4A+NS4B抗原--试剂盒(实施例)。

从上表可知，丙型肝炎病毒(HCV)虽然在感染者体内滴度较低，但其几乎所有结构和非结构蛋白(NS2除外)都能够诱发机体的免疫应答，并产生相应的抗体。因而增加表位可以有效提高灵敏度，降低漏检风险。

3).活性表位比较

实验方案：

选取嵌合串联表达HCV抗原包被磁珠，应用不同交联方案，选取抗原不同残基交联，选取残基有：氨基、巯基、羟基。

AP标记抗人IgG抗体。

以单一变量实验原则，为了避免实验结果判断误差，酶免实验原理采用间接法，即磁珠包被抗原，AP标记二抗抗体。磁珠上的抗原连接血清中的抗HCV抗体，而后AP标记的抗抗体识别并捕获抗HCV抗体，形成磁珠-HCV抗原-标本中抗HCV抗体-抗抗体抗人IgG-AP复合物。清洗杂质后，复合物中的AP酶促AMPPD底物发光，发光值与标本中抗HCV抗体含量成正比。

具体酶免检测实验步骤：

1)取待测样本10uL加入包被有HCV重组嵌合抗原1的磁珠工作液50μL，同时加入测试处理液50uL，37℃孵育15min；

2)加入磁-场进行磁分离1min，去上清；

3)洗涤4次，每次250uL洗液，重复步骤2操作；

4)加入测试稀释液100μL，偶联了抗人IgG的碱性磷酸酶的工作液50uL，37℃孵育15min；

5)加入磁场进行磁分离1min，去上清；

6)洗涤4次，每次250uL洗液，重复步骤4操作；

8)均值各孔的RLU值与CUTOFF比较，样品测定值≥10×阴性质控，则判断为阳性，否则为阴性。

实验结果：

一般交联工艺选择蛋白巯基、氨基作为交联官能团，选择羧基官能团的交联工艺一般是采用EDC一步法，这套工艺同时连接了抗原的氨基和羧基，同时还有许多副反应，不好实现，一般不用。羟基官能团交联一般用在糖类等其他交联工艺上。

从上表中可以看出，羟基效果最好好。选取巯基时，NS3抗原失活风险较大，选取氨基时，core抗原失活风险较大。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东菲鹏生物有限公司

<120> 丙型肝炎病毒重组抗原及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 191

<212> PRT

<213> Hepatitis Virus C

<400> 1

Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn

1 5 10 15

Arg Arg Pro Met Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly

20 25 30

Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala

35 40 45

Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro

50 55 60

Ile Pro Lys Ala Arg Arg Thr Glu Gly Arg Ser Trp Ala Gln Pro Gly

65 70 75 80

Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp

85 90 95

Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Asn Asp Pro

100 105 110

Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys

115 120 125

Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Val

130 135 140

Gly Gly Val Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Ala Val Glu Asp

145 150 155 160

Gly Ile Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile

165 170 175

Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala

180 185 190

<210> 2

<211> 155

<212> PRT

<213> Hepatitis Virus C

<400> 2

Met Leu Gly Thr Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Thr Asn Glu

1 5 10 15

Asn Cys Gly Glu Ile Gln Val Leu Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu

20 25 30

Gly Thr Ala Ile Asn Gly Val Met Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly

35 40 45

Ser Lys Thr Ile Ser Gly Pro Lys Gly Pro Val Asn Gln Met Tyr Thr

50 55 60

Asn Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Val Lys

65 70 75 80

Ser Leu Ala Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Phe Leu Val Thr

85 90 95

Arg His Ala Asp Val Val Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Thr Arg Gly

100 105 110

Ala Leu Ile Ser Pro Arg Pro Ile Ser Thr Leu Lys Gly Ser Ser Gly

115 120 125

Gly Pro Leu Leu Cys Pro Leu Gly His Val Ala Gly Ile Phe Arg Ala

130 135 140

Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Asp Lys Ala Val

145 150 155

<210> 3

<211> 192

<212> PRT

<213> Hepatitis Virus C

<400> 3

Ala Gly Gly Thr Cys Ala Thr Gly Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys

1 5 10 15

Cys Thr Gly Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Thr Ala Gly Gly Cys

20 25 30

Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys Thr Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Thr

35 40 45

Thr Gly Gly Cys Cys Gly Cys Ala Thr Ala Cys Thr Gly Cys Cys Thr

50 55 60

Gly Ala Cys Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Ala Gly Thr Gly Thr Gly

65 70 75 80

Gly Thr Cys Ala Thr Thr Gly Thr Gly Gly Gly Cys Ala Gly Gly Ala

85 90 95

Thr Cys Ala Thr Cys Thr Thr Gly Thr Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala

100 105 110

Gly Cys Cys Ala Gly Cys Thr Gly Thr Cys Gly Thr Thr Cys Cys Cys

115 120 125

Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Gly Thr Cys Cys Thr Cys Thr

130 135 140

Ala Cys Cys Ala Gly Gly Ala Gly Thr Thr Cys Gly Ala Thr Gly Ala

145 150 155 160

Gly Ala Thr Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Thr Gly Cys Gly Cys Cys

165 170 175

Thr Cys Gly Cys Gly Thr Gly Cys Gly Gly Cys Thr Cys Thr Cys Ala

180 185 190

<210> 4

<211> 260

<212> PRT

<213> Hepatitis Virus C

<400> 4

Ala Ser His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Gln Leu Ala Glu Gln

1 5 10 15

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20 25 30

Glu Ala Ala Ala Pro Val Val Glu Ser Lys Trp Arg Ala Leu Glu Thr

35 40 45

Phe Trp Ala Lys His Met Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gln Tyr Leu

50 55 60

Ala Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met

65 70 75 80

Ala Phe Thr Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Thr Thr Gln Ser Thr Leu

85 90 95

Leu Phe Asn Ile Leu Gly Gly Trp Val Ala Ala Gln Leu Ala Pro Pro

100 105 110

Ser Ala Ala Ser Ala Phe Val Gly Ala Gly Ile Ala Gly Ala Ala Val

115 120 125

Gly Ser Ile Gly Leu Gly Lys Val Leu Val Asp Ile Leu Ala Gly Tyr

130 135 140

Gly Ala Gly Val Ala Gly Ala Leu Val Ala Phe Lys Val Met Ser Gly

145 150 155 160

Glu Ala Pro Ser Thr Glu Asp Leu Val Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu

165 170 175

Ser Pro Gly Ala Leu Val Val Gly Val Val Cys Ala Ala Ile Leu Arg

180 185 190

Arg His Val Gly Pro Gly Glu Gly Ala Val His Trp Met Asn Arg Leu

195 200 205

Ile Ala Phe Ala Ser Arg Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val

210 215 220

Pro Glu Ser Asp Ala Ala Ala Arg Val Thr Gln Ile Leu Ser Ser Leu

225 230 235 240

Thr Ile Thr Gln Leu Leu Lys Arg Leu His Gln Trp Ile Asn Glu Asp

245 250 255

Cys Ser Thr Pro

260

Claims

1.一种丙型肝炎病毒重组抗原，其序列中包含core、NS3、NS4A、NS4B的蛋白区段。

2.根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒重组抗原，其特征在于，所述core、NS3、NS4A、NS4B的蛋白区段中的一种或多种重复表达≥2次；

优选的，所述core、NS3、NS4A、NS4B的蛋白区段序列依次如SEQ ID NO:1-4所示。

3.根据权利要求1或2所述的丙型肝炎病毒重组抗原，其特征在于，所述重组抗原与固相支持物或用于显示信号强度的标记物偶联。

4.根据权利要求3所述的丙型肝炎病毒重组抗原，其特征在于，所述固相支持物或标记物通过功能基团与所述重组抗原的非活性或低活性表位偶联。

5.根据权利要求4所述的丙型肝炎病毒重组抗原，其特征在于，所述非活性或低活性表位选自所述丙型肝炎病毒重组抗原的羟基；

和/或；

6.根据权利要求5所述的丙型肝炎病毒重组抗原，其特征在于，所述功能基团选自下列反应基团：

7.根据权利要求1、2、4、5、6任一项所述的丙型肝炎病毒重组抗原，其特征在于，所述固相支持物为磁珠；

优选的，所述磁珠为γFe₂O₃或Fe₃O₄磁性纳米粒子，或它们与有机高分子材料的复合体。

8.根据权利要求1、2、4、5、6任一项所述的丙型肝炎病毒重组抗原，其特征在于，所述标记物选自荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种；

优选的，所述标记物选自辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。

9.权利要求1～8任一项所述的重组抗原在制备丙型肝炎检测剂中的应用。

10.一种丙型肝炎检测试剂盒，其特征在于，其含有包被丙型肝炎第一抗原Ag₁的固相载体以及标记有标记物的丙型肝炎第二抗原Ag₂；其中Ag₁与Ag₂中的至少一种为权利要求1～8任一项所述的重组抗原；

优选的，所述试剂盒还包括测试处理液、测试稀释液、发光底物、洗涤液、丙型肝炎病毒抗体阴性质控品以及丙型肝炎病毒抗体阳性质控品中的一种或多种。