CN115746091A - 一种高稳定性的胶原蛋白靶向sers多肽探针及其在肝纤维化诊断中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高稳定性的胶原蛋白靶向SERS多肽探针及其在肝纤维化诊断中的应用。本发明所述的SERS多肽探针包括多肽(X‑靶向多肽‑Cys)、纳米粒子以及拉曼信号分子，所述多肽中的X为至少一个带负电荷的氨基酸，所述多肽通过Cys与纳米粒子结合；所述拉曼信号分子通过巯基修饰到纳米粒子表面。本发明提供的SERS多肽探针，具有良好的分散性和稳定性，可以特异性结合组织中的胶原蛋白，并成功用于不同分期的肝纤维化小鼠的SERS成像，在肝纤维化等胶原蛋白相关疾病的诊断中具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于SERS探针技术领域，具体涉及一种高稳定性的胶原蛋白靶向SERS多肽探针及其在肝纤维化诊断中的应用。
背景技术
肝纤维化是肝硬化和肝细胞癌的早期病理形式。肝损伤和慢性炎症持续存在会引发肝纤维化，中后期的肝纤维化会最终发展为致死率极高的肝硬化和肝癌。因此，肝纤维化的早期诊断和精准分期，对预防肝硬化和肝癌具有重要意义。肝活检是临床上评估肝纤维化分期的常用方法，目前肝纤维化的活检方法主要包括苏木精-伊红和Masson三色染色法，但是这些方法步骤繁琐，而且缺乏特异性，导致肝纤维化的精准分期仍然是巨大挑战。
胶原蛋白是肝纤维化的重要生物标志物。肝细胞长期损伤导致胶原蛋白沉积，多种胶原蛋白在肝纤维化发生发展过程中扮演重要角色。研究发现，间质基质中成纤维细胞被激活导致I型胶原蛋白含量显著增加，窦状毛细血管化导致Disse空间中IV型胶原蛋白含量异常增加，同时，肝纤维化组织中的胶原蛋白三螺旋结构被破坏导致大量的变性胶原蛋白。因此，开发可以同时检测不同类型胶原蛋白的多肽探针对肝纤维化的精准诊断具有重要意义。
目前，已经开发了多种可以靶向检测胶原蛋白的荧光多肽探针。中国专利CN107266562A提供了一种特异性识别胶原蛋白的多肽荧光探针，可以被用于变性胶原蛋白的组织成像。这些荧光多肽探针仅被用于单组分胶原蛋白的检测，并且存在荧光易漂白、组织穿透能力差等缺陷。同时，荧光探针较宽的发射峰，严重限制了它们在多组分胶原蛋白同时检测中的应用。
针对上述问题，本发明提供了一种高稳定性的胶原蛋白靶向SERS(Surface-Enhanced Raman Scattering)多肽探针及其在肝纤维化诊断中的应用。本发明所述的SERS多肽探针包括多肽(X-靶向多肽-Cys)、纳米粒子以及拉曼信号分子；本发明提供的SERS多肽探针，具有良好的分散性和稳定性；所述SERS多肽探针具有良好的靶向性，可以分别特异性结合组织中的I型、IV型和变性胶原蛋白；所述SERS多肽探针可用于肝纤维化组织中不同类型胶原蛋白的SERS共成像，在肝纤维化的精准诊断中具有广泛的应用前景。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种高稳定性的胶原蛋白靶向SERS多肽探针及其在肝纤维化诊断中的应用。所述SERS多肽探针保持良好分散性和稳定性，具有良好的胶原蛋白靶向能力，可以避免SERS成像过程中非特异性吸附导致的假阳性信号，可用于肝纤维化组织中不同类型胶原蛋白的SERS共成像，制备简单，检测方便。具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种高稳定性的胶原蛋白靶向SERS多肽探针，所述SERS多肽探针包括多肽(X-靶向多肽-Cys)、纳米粒子以及拉曼信号分子，所述X为至少一个带负电荷的氨基酸，所述靶向多肽的末端通过Cys与纳米粒子结合；所述拉曼信号分子通过巯基与修饰到纳米粒子表面。
优选地，所述拉曼信号分子选自4-MBA、4-MBN、4-EBT、S-(4-乙炔基苯基)乙硫代酸酯、S-(4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)乙硫代酸酯和S-(4-氰基苯基)乙硫代酸酯中任一种。
优选地，所述拉曼信号分子为S-(4-乙炔基苯基)乙硫代酸酯(R1)、S-(4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)乙硫代酸酯(R2)和S-(4-氰基苯基)乙硫代酸酯(R3)。
优选地，所述纳米粒子为Ag纳米粒子。
优选地，所述靶向多肽包括KLWVLPK、LRELHLNNN、(GPO)n，n为大于6的整数。
优选地，所述X为1-3个带负电荷的氨基酸。
优选地，所述带负电荷的氨基酸为天冬氨酸D。
优选地，所述X-靶向多肽-Cys包括D-KLWVLPK-Ahx-Cys、DD-KLWVLPK-Ahx-Cys、DDD-KLWVLPK-Ahx-Cys、D-LRELHLNNN-Ahx-Cys、DD-LRELHLNNN-Ahx-Cys、D-(GPO)8-Ahx-Cys。
优选地，所述靶向多肽与Cys之间连接有Linker，所述Linker为Ahx。
优选地，所述X-靶向多肽-Cys包括D-KLWVLPK-Ahx-Cys、DD-KLWVLPK-Ahx-Cys、DDD-KLWVLPK-Ahx-Cys、D-LRELHLNNN-Ahx-Cys、DD-LRELHLNNN-Ahx-Cys、D-(GPO)8-Ahx-Cys。
优选地，所述SERS多肽探针的结构为：D-KLWVLPKs-Ahx-Cys-Ag纳米粒子-R2、DD-KLWVLPKs-Ahx-Cys-Ag纳米粒子-R2、DDD-KLWVLPKs-Ahx-Cys-Ag纳米粒子-R2、D-LRELHLNNNs-Ahx-Cys-Ag纳米粒子-R3、DD-LRELHLNNNs-Ahx-Cys-Ag纳米粒子-R3、D-(GPO)8-Ahx-Cys-Ag纳米粒子-R1；所述R1为S-(4-乙炔基苯基)乙硫代酸酯；R2为S-(4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)乙硫代酸酯；R3为S-(4-氰基苯基)乙硫代酸酯。
第二方面，本发明提供了上述第一方面所述SERS多肽探针的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)固相合成X-靶向多肽-Cys；
(2)将拉曼信号分子修饰到具有拉曼增强能力的Ag纳米粒子；
(3)将X-靶向多肽-Cys结合到已被信号分子修饰的Ag纳米粒子上。
优选地，所述步骤(1)为：设计X-靶向多肽-Cys的多肽序列，根据固相合成法合成X-靶向多肽-Cys的多肽序列；固相合成的具体方法为：
①将100mg Rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5mL二氯甲烷溶胀树脂；
②由20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；
③将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3hrs。
④反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次。显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min。树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
⑤重复步骤③和④，直到合成目标序列的胶原多肽。向反应器中加入25％乙酸酐，显色反应检测反应完全，树脂分别由5mLDMF和DCM洗3次；
⑥树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤3次；将树脂抽干，加入切割液(TFA:TIS:水＝95:2.5:2.5)，反应3hrs；
⑦反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀。离心收集沉淀，用少量TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2次后风干，得到粗肽；粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽。
优选地，所述步骤(2)为：将拉曼信号分子溶于DMSO配成1mM的溶液，取1mL的Ag纳米粒子与10μL信号分子溶液混合搅拌1-4hrs，使巯基配位到纳米粒子表面，得到信号分子修饰的Ag纳米粒子。
优选地，将步骤(1)中合成的X-靶向多肽-Cys溶于水中配成0.5mM的溶液，取X-靶向多肽-Cys溶液200μL与步骤(2)制备的信号分子修饰的Ag纳米粒子溶液混合搅拌1-4hrs，然后5000rpm离心洗去多余多肽，得到SERS多肽探针。
第三方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的SERS多肽探针在制备肝纤维化SERS成像试剂中的应用。
第四方面，本发明提供了应用上述第一方面所述的SERS多肽探针的肝纤维化体外成像方法：使用0.2mL山羊血清溶液室温下封闭处理组织5分钟。将100μL的混匀的探针溶液分别滴加到肝纤维化组织上染色，并用石蜡膜覆盖组织玻片于4℃下孵育4h。除去封口膜，用吸水纸吸去载玻片上的溶液。将组织载玻片用PB缓冲洗涤3次，每次3分钟；选择纤维区域和汇管区域由激光共聚焦拉曼光谱仪采集SERS图像。
第五方面，本发明提供了应用上述第一方面所述的SERS多肽探针的肝纤维化体内成像方法：将SERS多肽探针溶于已灭菌的含半胱氨酸的1×PBS中，注射入活体内，放入成像装置中进行成像试验。
本发明的有益效果是：(1)本发明首先提供了一种高稳定性的胶原蛋白靶向SERS多肽探针，所述SERS多肽探针具有良好的分散性和稳定性；(2)所述SERS多肽探针具有良好的胶原蛋白靶向性，可以避免SERS成像过程中非特异性吸附导致的假阳性信号；(3)所述SERS多肽探针具有多种胶原蛋白同时成像的能力，可用于不同分期的肝纤维化小鼠的SERS成像；(4)所述SERS多肽探针制备简单，检测方便，生物相容性好。
附图说明
图1 IV型胶原蛋白靶向多肽纳米探针的稳定性表征；
图2 I型胶原蛋白靶向多肽纳米探针的稳定性表征；
图3 变性胶原蛋白靶向多肽纳米探针的稳定性表征；
图4 I型、IV型和变性胶原蛋白靶向的SERS多肽探针的表征；
图5 I型、IV型和变性胶原蛋白靶向的SERS多肽探针的靶向性表征；
图6 I型、IV型和变性胶原蛋白靶向的SERS多肽探针对不同肝纤维化分期组织中汇管区的SERS成像；
图7 I型、IV型和变性胶原蛋白靶向的SERS多肽探针对不同肝纤维化分期组织中纤维间隔区的SERS成像。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
实施例1 IV型胶原蛋白靶向多肽纳米探针的制备
1.IV型胶原蛋白靶向多肽纳米探针的设计
本实施例设计的靶向多肽序列如下所示：D-KLWVLPK-Ahx-Cys、DD-KLWVLPK-Ahx-Cys、DDD-KLWVLPK-Ahx-Cys、R-KLWVLPK-Ahx-Cys；以KLWVLPK-Ahx-Cys为对照。
2.固相合成法制备靶向多肽
(1)将100mg Rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5mL二氯甲烷溶胀树脂；
(2)由20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；
(3)将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3hrs；
(4)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次；显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min；树脂分别由5mLDMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
(5)重复步骤(3)和(4)，直到合成目标序列的胶原多肽；向反应器中加入25％乙酸酐，显色反应检测反应完全，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次；
(6)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤3次。将树脂抽干，加入切割液(TFA:TIS:水＝95:2.5:2.5)，反应3hrs；
(7)反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀。离心收集沉淀，用少量TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2次后风干，得到粗肽；粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽。
(8)将25mg纯肽由DMF溶解，称取羧基荧光素FAM(4eq)、HOBt(4eq)和HBTU(4eq)，由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，混合液加入到多肽溶液中，避光反应24hrs，将反应液加入冰乙醚中，得到黄色沉淀，黄色沉淀由水溶解并透析除去未反应物质，然后将溶液冻干得到探针FAM-DDD-KLWVLPK-Ahx-Cys(F-IVCTP-DDD)。
3.多肽纳米探针的制备
将上述合成的D-KLWVLPK-Ahx-Cys、DD-KLWVLPK-Ahx-Cys、DDD-KLWVLPK-Ahx-Cys、R-KLWVLPK-Ahx-Cys以及对照多肽KLWVLPK-Ahx-Cys分别溶于水中配成0.5mM的溶液，取200μL上述靶向多肽溶液与1mL Ag纳米粒子溶液，混合搅拌1-4hrs，然后5000rpm离心洗去多余多肽，得到多肽纳米探针D-KLWVLPK-Ahx-Cys-Ag纳米粒子、DD-KLWVLPK-Ahx-Cys-Ag纳米粒子、DDD-KLWVLPK-Ahx-Cys-Ag纳米粒子、R-KLWVLPK-Ahx-Cys-Ag纳米粒子、KLWVLPK-Ahx-Cys-Ag纳米粒子；分别命名为Ag@IVCTP-D、Ag@IVCTP-DD、Ag@IVCTP-DDD、Ag@IVCTP-R、Ag@IVCTP。
4.多肽纳米探针的分散性和稳定性验证
上述多肽纳米探针Ag@IVCTP-R、Ag@IVCTP、Ag@IVCTP-D、Ag@IVCTP-DD、Ag@IVCTP-DDD分别进行裸眼比色、紫外可见吸收光谱、TEM表征对比。探针Ag@IVCTP-R、Ag@IVCTP、Ag@IVCTP-D、Ag@IVCTP-DD、Ag@IVCTP-DDD溶液室温下放置24h后用数码相机(Canon EOS M6(18-45mm))采集溶液的比色图；紫外可见吸收光谱由UV-1750分光光度计(ShimadzuCorporation，Kyoto，Japan)记录；稀释溶液至412nm紫外吸收强度为1.3，采集200-800nm光谱，取特征吸收412nm和700nm做柱状图。
结果如图1所示：其中a为上述不同多肽修饰的纳米探针的裸眼比色结果，从左至右分别为：Ag@IVCTP-R、Ag@IVCTP、Ag@IVCTP-D、Ag@IVCTP-DD、Ag@IVCTP-DDD；纳米探针Ag@IVCTP-R和Ag@IVCTP溶液浑浊，表明该纳米探针分散性欠佳；纳米探针Ag@IVCTP-D依然较浑浊，纳米探针Ag@IVCTP-DD浑浊度变小，而Ag@IVCTP-DDD探针保持澄清溶液状态，表明该纳米探针具有良好分散性和稳定性；b为多肽纳米探针Ag@IVCTP-DDD的TEM图，进一步表明，该纳米探针分散性好，完全没有发生聚集；c为700nm紫外可见吸收光谱表征的溶液浊度结果，从左至右分别为：Ag@IVCTP-R、Ag@IVCTP、Ag@IVCTP-D、Ag@IVCTP-DD、Ag@IVCTP-DDD，结果表明纳米探针Ag@IVCTP-R和Ag@IVCTP溶液浊度高，表明该纳米探针分散性欠佳；纳米探针Ag@IVCTP-D浊度依然较高，Ag@IVCTP-DD溶液浊度变小，纳米探针Ag@IVCTP-DDD浊度最低，表明该纳米探针具有良好分散性和稳定性；d为412nm紫外可见吸收光谱表征的溶液纳米粒子粒径结果，从左至右分别为：Ag@IVCTP-R、Ag@IVCTP、Ag@IVCTP-D、Ag@IVCTP-DD、Ag@IVCTP-DDD，结果表明，纳米探针Ag@IVCTP-R和Ag@IVCTP溶液紫外吸收低，表明该纳米探针分散性欠佳，纳米探针Ag@IVCTP-D溶液紫外吸收依然较低，纳米探针Ag@IVCTP-DD溶液紫外吸收变高，而纳米探针Ag@IVCTP-DDD溶液紫外吸收最高，表明该纳米探针具有良好分散性和稳定性。上述结果表明，本实施例制备的IV型胶原蛋白靶向的多肽纳米探针Ag@IVCTP-DDD具有良好的分散性和稳定性。
实施例2 I型胶原蛋白靶向多肽纳米探针的制备
1.I型胶原蛋白靶向多肽探针的设计
本实施例设计的靶向多肽序列如下所示：D-LRELHLNNN-Ahx-Cys、DD-LRELHLNNN-Ahx-Cys、R-LRELHLNNN-Ahx-Cys；以LRELHLNNN-Ahx-Cys为对照。
2.固相合成法制备靶向多肽
具体方法同实施例1中2所述。荧光标记多肽为FAM-DD-LRELHLNNN-Ahx-Cys(F-ICTP-DD)
3.多肽纳米探针的制备
将上述中合成的D-LRELHLNNN-Ahx-Cys、DD-LRELHLNNN-Ahx-Cys、R-LRELHLNNN-Ahx-Cys以及对照多肽LRELHLNNN-Ahx-Cys分别溶于水中配成0.5mM的溶液，取200μL上述靶向多肽溶液与1mLAg纳米粒子溶液，混合搅拌1-4hrs，然后5000rpm离心洗去多余多肽，得到多肽纳米探针D-LRELHLNNN-Ahx-Cys-Ag纳米粒子、DD-LRELHLNNN-Ahx-Cys-Ag纳米粒子、R-LRELHLNNN-Ahx-Cys-Ag纳米粒子、LRELHLNNN-Ahx-Cys-Ag纳米粒子；分别命名为Ag@ICTP-D、Ag@ICTP-DD、Ag@ICTP-R、Ag@ICTP。
4.多肽纳米探针的分散性和稳定性验证
上述多肽纳米探针Ag@ICTP-D、Ag@ICTP-DD、Ag@ICTP-R、Ag@ICTP进行裸眼比色、紫外可见吸收光谱、TEM表征对比。探针Ag@ICTP-R、Ag@ICTP-D、Ag@ICTP-DD、Ag@ICTP溶液室温下放置24h后用数码相机(Canon EOS M6(18-45mm))采集溶液的比色图；紫外可见吸收光谱由UV-1750分光光度计(Shimadzu Corporation,Kyoto，Japan)记录。稀释溶液至412nm紫外吸收强度为1.3，采集200-800nm光谱，取特征吸收412nm和700nm做柱状图。
结果如图2所示：其中a为上述不同多肽修饰的纳米探针的裸眼比色结果，从左至右分别为：多肽纳米探针Ag@ICTP-R、Ag@ICTP、Ag@ICTP-D、Ag@ICTP-DD，结果表明，纳米探针Ag@ICTP-R和Ag@ICTP溶液浑浊，表明该纳米探针分散性欠佳；纳米探针Ag@ICTP-D依然较浑浊，纳米探针Ag@ICTP-DD保持澄清溶液状态，表明该纳米探针具有良好分散性和稳定性；b为多肽纳米探针Ag@ICTP-DD的TEM图，进一步表明，该纳米探针分散性好，完全没有发生聚集；c为700nm紫外可见吸收光谱表征的溶液浊度结果，从左至右分别为：Ag@ICTP-R、Ag@ICTP、Ag@ICTP-D、Ag@ICTP-DD；结果表明，纳米探针Ag@ICTP-R和Ag@ICTP溶液浊度高，纳米探针分散性欠佳，纳米探针Ag@ICTP-D浊度依然较高，而纳米探针Ag@ICTP-DD浊度最低，表明该纳米探针具有良好分散性和稳定性；d为412nm紫外可见吸收光谱表征的溶液纳米粒子粒径结果，从左至右分别为：Ag@ICTP-R、Ag@ICTP、Ag@ICTP-D、Ag@ICTP-DD，结果表明，纳米探针Ag@ICTP-R和Ag@ICTP溶液紫外吸收低，表明该纳米探针分散性欠佳，纳米探针Ag@ICTP-D溶液紫外吸收依然较低，纳米探针Ag@ICTP-DD溶液紫外吸收最高，表明该纳米探针具有良好分散性和稳定性。上述结果表明，本实施例制备的I型胶原蛋白靶向的多肽纳米探针Ag@ICTP-DD具有良好的分散性和稳定性稳定性。
实施例3变性胶原蛋白靶向多肽纳米探针的制备
1.变性胶原蛋白靶向多肽纳米探针的设计
本实施例设计的靶向多肽序列如下所示：D-(GPO)8-Ahx-Cys、R-(GPO)8-Ahx-Cys；以(GPO)8-Ahx-Cys为对照。
2.固相合成法制备靶向多肽
具体方法同实施例1中2所述,荧光标记多肽序列为FAM-D-(GPO)8-Ahx-Cys(F-DCTP-D)
3.多肽纳米探针的制备
(1)将上述合成的D-(GPO)8-Ahx-Cys、R-(GPO)8-Ahx-Cys以及对照(GPO)8-Ahx-Cys分别溶于水中配成0.5mM的溶液，取200μL上述靶向多肽溶液与1mL Ag纳米粒子溶液，混合搅拌1-4hrs，然后5000rpm离心洗去多余多肽，得到多肽纳米探针D-(GPO)8-Ahx-Cys-Ag纳米粒子、R-(GPO)8-Ahx-Cys-Ag纳米粒子、(GPO)8-Ahx-Cys-Ag纳米粒子；分别命名为Ag@DCTP-D、Ag@DCTP-R、Ag@DCTP。
4.多肽纳米探针的分散性和稳定性验证
上述制备的不同的探针Ag@DCTP-R、Ag@DCTP、Ag@DCTP-D进行裸眼比色、紫外可见吸收光谱、TEM表征对比。探针Ag@DCTP-R、Ag@DCTP、Ag@DCTP-D溶液室温下放置24h后用数码相机(Canon EOS M6(18-45mm))采集溶液的比色图。紫外可见吸收光谱由UV-1750分光光度计(Shimadzu Corporation，Kyoto，Japan)记录。稀释溶液至412nm紫外吸收强度为1.3，采集200-800nm光谱，取特征吸收412nm和700nm做柱状图。
结果如图3所示：其中a为上述不同多肽修饰的纳米探针的裸眼比色结果，从左至右分别为：多肽纳米探针Ag@DCTP-R、Ag@DCTP、Ag@DCTP-D，结果表明，纳米探针Ag@DCTP-R溶液浑浊，纳米探针分散性欠佳，纳米探针Ag@DCTP较浑浊，纳米探针Ag@DCTP-D保持澄清溶液状态，表明该纳米探针具有良好分散性和稳定性；b为多肽纳米探针Ag@DCTP-D的TEM图，进一步表明，该纳米探针分散性好，完全没有发生聚集；c为700nm紫外可见吸收光谱表征的溶液浊度结果，从左至右分别为：Ag@DCTP-R、Ag@DCTP、Ag@DCTP-D，结果表明，纳米探针Ag@DCTP-R溶液浊度高，分散性欠佳，纳米探针Ag@DCTP浊度依然较高，纳米探针Ag@DCTP-D浊度最低，表明该纳米探针具有良好分散性和稳定性；d为412nm紫外可见吸收光谱表征的溶液纳米粒子粒径结果，从左至右分别为：Ag@DCTP-R、Ag@DCTP、Ag@DCTP-D，结果表明，纳米探针Ag@DCTP-R溶液紫外吸收低，分散性欠佳，纳米探针Ag@DCTP溶液紫外吸收依然较低，纳米探针Ag@DCTP-D溶液紫外吸收最高，表明该纳米探针具有良好分散性和稳定性。上述结果表明，本实施例制备的变性胶原蛋白靶向的多肽纳米探针Ag@DCTP-D具有良好的分散性和稳定性。
实施例4 SERS多肽探针的合成与表征
1.SERS多肽探针的合成
羧基荧光素FAM分别标记多肽ICTP-DD(DD-LRELHLNNN-Ahx-Cys)、IVCTP-DDD(DDD-KLWVLPK-Ahx-Cys)、DCTP-D(D-(GPO)8-Ahx-Cys)，得到荧光多肽探针F-ICTP-DD、F-IVCTP-DDD、F-DCTP-D。
(1)将S-(4-氰基苯基)乙硫代酸酯(R3)溶于DMSO配成1mM的溶液，取1mL的Ag@F-ICTP-DD与10μL R3溶液混合搅拌1-4hrs，使巯基配位到纳米粒子表面，然后5000rmp离心洗去多余信号分子，得到I型胶原靶向的SERS多肽探针R3@Ag@F-ICTP-DD(SF-I)。
(2)将S-(4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)乙硫代酸酯(R2)溶于DMSO配成1mM的溶液，取1mL的Ag@F-IVCTP-DDD与10μL R2溶液混合搅拌1-4hrs，使巯基配位到纳米粒子表面，然后5000rmp离心洗去多余信号分子，得到IV型胶原靶向的SERS多肽探针R2@Ag@IVCTP-DDD(SF-IV)。
(3)将S-(4-乙炔基苯基)乙硫代酸酯(R1)溶于DMSO配成1mM的溶液，取1mL的Ag@F-DCTP-D与10μL R1溶液混合搅拌1-4hrs，使巯基配位到纳米粒子表面，然后5000rmp离心洗去多余信号分子，得到I型胶原靶向的SERS多肽探针R1@Ag@F-DCTP-D(SF-D)。
2.SERS多肽探针的表征
将得到的SERS多肽探针SF-IV、SF-I和SF-D及其等比例混合溶液由激光共聚焦拉曼光谱仪(Lab RAM HR Evolution，HORIBA，Japan)采集SERS信号。记录三种SERS多肽探针S-IV、S-I和S-D在1day，1week，2week，1month的不同时间间隔的SERS光谱。
结果如图4所示：其中a分别为SERS多肽探针SF-D(红色)、SF-IV(橙色)、SF-I(蓝色)和Merge(桃红色)的SERS光谱，特征峰分别为2102cm-1、2154cm-1、2227cm-1和三种信号的叠加峰，说明三种信号互不重叠，不会产生干扰；b分别为SERS多肽探针SF-I在放置1day，1week，2week，1month的不同时间间隔的SERS光谱，特征峰为2227cm-1；c分别为SERS多肽探针SF-IV放置1day，1week，2week，1month的不同时间间隔的SERS光谱，特征峰为2154cm-1；d分别为SERS多肽探针SF-D放置1day，1week，2week，1month的不同时间间隔的SERS光谱，特征峰为2102cm-1。这些结果表明，SERS多肽探针SF-I、SF-IV、SF-D具有良好的稳定性。
实施例5 SERS多肽探针的靶向性表征
1.SERS多肽探针的溶液和组织染色实验
(1)PB溶液中配备I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、明胶溶液(20μg/mL)以及牛血清白蛋白、胰蛋白酶、胃蛋白酶、溶菌酶溶液(200μg/mL)。100μL蛋白溶液分别加到96孔板中，4℃孵育5h完成蛋白结合。倾去蛋白溶液，将100μL三种SERS多肽探针SF-I、SF-IV和SF-D分别加入孔中，4℃结合4h。用PB溶液清洗3次，每次3min。在Infinite M200多功能酶标仪(TECAN，瑞士)上测量其荧光强度(ex:485nm，em:535nm)。每次测量重复三次。
(2)肾脏、肝脏和胸骨组织取自KM小鼠(25-40g)。取1cm2组织用冷冻组织包埋剂(Leica)包埋冷藏，用冰冻切片机(Leica CM1680)将组织切成4μm的厚度固定于载玻片，室温下风干备用。冰冻组织切片先用0.2mL即用型山羊血清溶液室温下封闭组织10min，除去封闭液并保持切片湿润。在PB溶液中制备SF-I、SF-IV和SF-D探针溶液。分别将100μL的探针溶液用于不同组织切片染色，于4℃环境中孵育4h。用吸水纸吸去载玻片上的剩余溶液。PB溶液洗涤组织载玻片3次，每次3min。组织避光保存，使用Leica DM4000B正置荧光显微镜采集图像。
2.SERS多肽探针的靶向性表征
SERS多肽探针的溶液和组织靶向性表征结果如图5所示：其中a为SERS多肽探针SF-F96孔板结合不同蛋白的结果，从左到右依次为：BSA、溶菌酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和I型胶原蛋白，结果表明：BSA信号很弱，表明探针SF-I与BSA结合能力很差；溶菌酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶信号也很弱，表明探针SF-F基本不与溶菌酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶结合；I型胶原蛋白蛋白信号显著强于BSA、溶菌酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶，表明探针SF-I能特异性识别I型胶原蛋白；b为SERS多肽探针SF-IV 96孔板结合不同蛋白的结果，从左到右依次为：BSA、溶菌酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和IV型胶原蛋白，结果表明：BSA信号很弱，表明探针SF-IV与BSA结合能力很差；溶菌酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶信号也很弱，表明探针SF-IV基本不与溶菌酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶结合；IV型胶原蛋白蛋白信号显著强于BSA、溶菌酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶，表明探针SF-IV能特异性识别IV型胶原蛋白。c为SERS多肽探针SF-D 96孔板结合不同蛋白的结果，从左到右依次为：BSA、溶菌酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和变性胶原蛋白；结果表明：BSA信号很弱，表明探针SF-D与BSA结合能力很差；溶菌酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶信号也很弱，表明探针SF-D基本不与溶菌酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶结合；变性胶原蛋白蛋白信号显著强于BSA、溶菌酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶，表明探针SF-D能特异性识别变性胶原蛋白。d，g分别为探针F-ICTP-DD、SF-I染色小鼠肝纤维化组织成像图，对比可知SF-I与F-ICTP-DD具有相似的染色I型胶原蛋白的能力。e，h分别为探针F-IVCTP-DDD、SF-IV染色小鼠肾脏组织成像图，对比可知SF-IV与F-IVCTP-DDD具有相似的染色IV型胶原蛋白的能力。f，i分别为探针F-DCTP-D、SF-D染色小鼠热变性胸骨组织成像图，对比可知SF-D与F-DCTP-D具有相似的染色变性胶原蛋白的能力。上述结果表明，SERS多肽探针SF-I、SF-IV、SF-D分别具有靶向结合I型胶原、IV型胶原、变性胶原的能力，即SERS多肽探针S-I、S-IV、S-D分别具有靶向结合I型胶原、IV型胶原、变性胶原的能力。
实施例6不同分期肝纤维化小鼠SERS共成像
1.肝纤维化小鼠模型构建
肝纤维化模型由7-8周龄的KM小鼠(22-25g)构建；具体为：50只小鼠随机分为5组，其中4组为模型组，1组为对照组。模型组小鼠腹腔注射四氯化碳溶液(CCl4：橄榄油＝1：2剧烈搅拌混匀)，剂量为70μL/100g，持续2-8周，每周两次。对照组小鼠每周两次腹腔注射相同剂量的橄榄油。在不同时间段(2、4、6、8周)分别处死小鼠取肝组织样本进行HE和Masson染色确定肝纤维化分期。
2.I型胶原、IV型胶原、变性胶原SERS同时成像
不同分期的肝纤维化组织切片；使用0.2mL山羊血清溶液室温下封闭处理组织5分钟；将100μL的混匀的探针溶液S-I、S-IV、S-D分别滴加到不同分期的肝纤维化组织上染色，并用石蜡膜覆盖组织玻片于4℃下孵育4h。除去封口膜，用吸水纸吸去载玻片上的溶液。将组织载玻片用PB缓冲洗涤3次，每次3分钟。
3.选择汇管区域和纤维间隔区域由激光共聚焦拉曼光谱仪采集SERS图像。
汇管区SERS共成像结果如图6所示：从左到右依次为I型胶原成像图、IV型胶原成像图、变性胶原成像图和三种胶原成像叠加图；从上到下依次为肝纤维化S0、S1、S2、S3、S4期小鼠组织；结果表明，肝纤维化S0期时，有一部分IV型和I型胶原蛋白成像信号，但没有变性胶原蛋白信号；S1期时，开始出现变性胶原蛋白信号，三种信号同时存在，但I型胶原、IV型胶原、变性胶原蛋白含量很少；S2-S4期时，汇管区周围纤维量增加，三种信号同时存在，分布范围也在增加。成像结果表明，SERS共成像更能反映肝纤维化发展过程中三种类型胶原蛋白的变化。
纤维间隔区SERS共成像结果如图7所示：从左到右依次为I型胶原成像图、IV型胶原成像图、变性胶原成像图和三种胶原成像叠加图；从上到下依次为肝纤维化S0、S1、S2、S3、S4期小鼠组织。结果表明，S0期中，均无三种胶原信号；S1期中，也没有三种胶原信号，说明纤维间隔未形成，对应I型胶原、IV型胶原和变性胶原含量很少；从S2期开始，SERS图像三种胶原信号开始出现，分布范围也在增加；S3期时，纤维间隔大量产生，SERS成像纤维部位数量大量增加，变性胶原通道信号较强，反映胶原的降解速度加快；S4期时，纤维间隔变粗，三种胶原信号强烈。成像结果表明，肝纤维化S2期时开始出现纤维间隔，S3-S4期时明显形成纤维间隔，并且I型胶原、IV型胶原和变性胶原同时存在。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (9)
1.一种高稳定性的胶原蛋白靶向SERS多肽探针，其特征在于，所述SERS多肽探针包括多肽(X-靶向多肽-Cys)、纳米粒子以及拉曼信号分子，所述多肽中的X为至少一个带负电荷的氨基酸，所述多肽通过Cys与纳米粒子结合；所述拉曼信号分子通过巯基与修饰到纳米粒子表面；所述拉曼信号分子选自4-MBA、4-MBN、4-EBT、S-(4-乙炔基苯基)乙硫代酸酯、S-(4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)乙硫代酸酯和S-(4-氰基苯基)乙硫代酸酯中任一种。
2.如权利要求1所述的SERS多肽探针，其特征在于，所述纳米粒子为Ag纳米粒子。
3.如权利要求2所述的SERS多肽探针，其特征在于，所述靶向多肽包括KLWVLPK、LRELHLNNN、(GPO)n，n为大于6的整数。
4.如权利要求3所述的SERS多肽探针，其特征在于，所述X为1-3个带负电荷的氨基酸。
5.如权利要求4所述的SERS多肽探针，其特征在于，所述带负电荷的氨基酸为天冬氨酸D。
6.如权利要求5所述的SERS多肽探针，其特征在于，所述多肽包括D-KLWVLPK-Ahx-Cys、DD-KLWVLPK-Ahx-Cys、DDD-KLWVLPK-Ahx-Cys、D-LRELHLNNN-Ahx-Cys、DD-LRELHLNNN-Ahx-Cys、D-(GPO)8-Ahx-Cys。
7.如权利要求6所述的SERS多肽探针，其特征在于，所述靶向多肽通过Linker与Cys连接，所述Linker为Ahx。
8.如权利要求1-7任一所述的SERS多肽探针的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)固相合成X-靶向多肽-Cys；
(2)将拉曼信号分子修饰到具有拉曼增强能力的Ag纳米粒子；
(3)将X-靶向多肽-Cys结合到已被信号分子修饰的Ag纳米粒子上。
9.如权利要求1-7任一所述的SERS多肽探针在制备肝纤维化SERS成像试剂中的应用。
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