CN111303249B - 一种特异性检测病变胶原蛋白的探针、制备方法及应用 - Google Patents
一种特异性检测病变胶原蛋白的探针、制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于胶原蛋白检测技术领域，具体涉及一种特异性检测组织中病变胶原蛋白的多肽探针、制备方法及应用。本发明公开的多肽荧光探针包含多肽序列(Gly‑Hyp‑Pro)n和修饰在所述多肽序列(Gly‑Hyp‑Pro)n N端的信号分子。所述多肽探针的制备方法简便，具有良好的单链稳定性和荧光发光性能；且该探针能够特异性的结合病变胶原蛋白，可用于检测组织中病变胶原蛋白的含量；也可作为组织成像试剂，用于胶原蛋白相关疾病的早期诊断。
Description
技术领域
本发明属于胶原蛋白检测技术领域，具体涉及一种特异性检测组织中病变胶原蛋白的多肽探针、制备方法及应用。
背景技术
胶原蛋白作为哺乳动物体内含量最多的蛋白质，是细胞外基质的主要组成成分，在组织形成和维持体内平衡中发挥关键作用。研究表明，当胶原蛋白的产生和降解平衡遭到破坏时，会引发骨质疏松、肌肉骨骼组织损伤等诸多疾病。研究还发现，人体的正常发育和组织修复中存在胶原重塑的过程，即天然胶原的三螺旋结构在蛋白水解酶或其他外力的作用下会发生形变或降解。若在胶原重塑过程中，胶原产生过多，则过量的胶原会在器官中累积，容易产生组织纤维化，最终导致肿瘤等严重疾病；若胶原发生不可控的降解，则会导致胶原蛋白退化性疾病，如关节炎等。因此，如何快速准确的检测机体组织中的病变胶原蛋白的含量，对于预防和早期治疗与胶原蛋白病变相关疾病具有重要意义。
目前，对于机体组织中的病变胶原蛋白含量的检测主要通过抗体抗原免疫法或传统染料为核心的试剂盒来检测，但是抗体抗原免疫试剂盒的检测过程复杂，特异性和稳定性较差；传统染料的检测能力又十分有限。同时，以上方法都不能有效的检测组织中的病变胶原蛋白。随着探针技术的研究不断进展，已发现一些可作为识别胶原蛋白的短肽探针，并用于体外胶原蛋白的识别及成像，包括天然氨基酸多肽序列和非天然氨基酸多肽，但是，这些多肽存在稳定性差、组织成像时的特异性弱，且难以区分病变胶原蛋白等缺点。同时，非天然氨基酸多肽的合成成本较高，并且应用于体内检测会存在安全隐患。因而，具有(Gly-X-Y)n重复氨基酸序列的天然氨基酸多肽是目前用于制备病变胶原检测探针的常用元件，主要包括GOO(Gly-Hyp-Hyp)、GPO(Gly-Pro-Hyp)和GPP(Gly-Pro-Pro)。但是，以天然氨基酸多肽序列为元件制备的检测探针自身容易形成三重螺旋结构，丧失对病变胶原蛋白的结合能力；而且这些探针单链稳定性差，在使用前一般需要高温等物理条件处理，使其保持单链状态。而高温等前处理过程容易导致待检测组织出现不必要的损伤，影响检测结果的准确性。
因此，为了使天然氨基酸多肽序列能够保持更好的单链状态，现有技术中一般采用其他氨基酸对天然氨基酸多肽序列的两端进一步修饰的方法，但是这种修饰过程比较复杂。例如，中国专利CN110129029A公开了一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针，通过在GPO、GPP或GOO元件的序列一端连有带电荷的氨基酸，另一端修饰发光物质获得。其中多肽序列GPO、GPP或GOO本身合成难度较大，向序列中引入数个带电荷的氨基酸会进一步导致合成过程的复杂化，增加探针的合成成本。再例如，中国专利CN107530454A公开了一种肽缀合物，所述缀合物是将两条胶原杂肽通过接头连接形成的二聚胶原杂肽，但是所述的肽缀合物结构复杂，制备过程中容易错配导致获得的肽缀合物结构差异较大，影响检测结果。
针对现有技术存在的问题，发明人经过多次试验研究，发现，含有多个GOP(Gly-Hyp-Pro)重复序列的多肽在不经过引入其他组分的前提下，即具有显著的单链稳定性，在该多肽序列的N端连有信号分子后，可作为多肽探针用于胶原蛋白的检测；该多肽探针制备简易，与现有的多肽(GPO、GPP或GOO)探针相比，具有良好的单链稳定性，使用前不需要经过加热等预处理步骤，完全避免了探针预处理可能对待测样品造成的损伤，最大程度地保证了该探针的检测效果。并且该多肽探针能够特异性的结合病变胶原蛋白，可用于体外检测病变胶原蛋白的含量，在关节炎，纤维化等胶原蛋白相关疾病的早期检测与疗效评估等领域具有广阔的应用前景。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种检测病变胶原蛋白的多肽探针，所述多肽探针包括多肽序列(Gly-Hyp-Pro)n和修饰在所述多肽序列(Gly-Hyp-Pro)n N端的信号分子X，其中n为大于6的整数。
优选地，所述信号分子X为荧光素类染料、香豆素类染料、罗丹明类染料、菁类染料、BODIPY类染料、四苯基乙烯类染料，六苯基甲硅烷类染料、二苯乙烯蒽类染料、半导体量子点、碳量子点、钙钛矿量子点、稀土离子配合物、金属框架材料、上转化稀土纳米材料和长余辉纳米材料中的一种或几种。
优选地，所述信号分子X为羧基荧光素FAM。
优选地，所述信号分子X和所述多肽序列(Gly-Hyp-Pro)n之间通过接头Ahx连接，所述多肽探针的序列为FAM-Ahx-(Gly-Hyp-Pro)n。
优选地，所述n为8到12之间的任何整数。
本发明的另一目的在于提供一种多肽探针的制备方法，所述方法包括：
(1)固相合成多肽树脂(Gly-Hyp-Pro)n；
(2)将4eq的信号分子、HOBt和HBTU溶解于DMF中，低温活化10-30min后，向溶液中滴加4-10eq的DIEA，得混合液；
(3)将步骤(2)制备的混合液加入到步骤(1)所述的树脂中，避光反应12-48h；
(4)将步骤(3)反应后的树脂用切割液处理2-4h后，加入冰乙醚，所得沉淀即为多肽探针，其中所述切割液由体积比为95：2.5：2.5的三氟乙酸、自由基捕获剂和水组成。
本发明的另一目的在于提供一种多肽探针在制备检测病变胶原蛋白含量的检测试剂，和/或试剂盒，和/或成像试剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种包含上述多肽探针的检测试剂。
本发明的另一目的在于提供一种包含上述多肽探针的检测试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种包含上述多肽探针的组织成像试剂。
本发明的有益效果是：①本发明提供的多肽探针制备简易；②本发明提供的多肽探针具有良好的单链稳定性；③本发明提供的多肽探针可特异性的结合病变胶原蛋白，结合能力强，可用于体外检测病变胶原蛋白的含量；④本发明提供的多肽探针具有良好的荧光发光性能，可作为组织成像试剂，广泛用于胶原蛋白相关疾病的早期诊断，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1多肽探针的荧光染色性能检测图；
图2多肽探针溶液比色对比图；
图3多肽探针溶液的荧光强度对比图；
图4多肽探针的热稳定性曲线对比图；
图5多肽探针对小鼠肠组织染色荧光显微镜图；
图6多肽探针对小鼠耳组织染色荧光显微镜图；
图7多肽探针对人骨关节炎纤维软骨病理切片染色荧光显微镜图；
图8多肽探针对人骨关节炎透明软骨病理切片染色荧光显微镜图。
具体实施方式
以下具体结合实施例进一步描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
以下实施例中制备的多肽探针GOP-8、GOP-10和GOP-12可特异性的结合病变胶原蛋白，并具体以GOP-10为例进行了组织荧光染色，但是本发明所述的多肽探针并不局限于GOP-10，其他探针也具有良好的荧光染色能力，且能够特异性结合病变胶原蛋白。
实施例1多肽探针GOP-4的制备
1.多肽探针的设计
本实施例设计的多肽探针序列为：FAM-Ahx-(GOP)4-NH2，其中FAM为羧基荧光素。
2.固相合成多肽序列Ahx-(GOP)4
(1)将100mg Rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5mL二氯甲烷溶胀树脂；
(2)由20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；
(3)将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3h。
(4)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次。显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min。树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
(5)重复步骤(3)和(4)，直到合成目标序列的多肽Ahx-(GOP)4。3.信号分子修饰多肽序列
(1)称取羧基荧光素(4eq)、HOBt(4eq)和HBTU(4eq)，由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，混合液加入到合成的多肽Ahx-(GOP)4树脂中，避光反应24h；
(2)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤3次，将树脂抽干，加入切割液(TFA:TIS:水＝95:2.5:2.5)，反应3h；
(3)反应液加入冰乙醚，将多肽沉淀。离心收集沉淀，用少量TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2次后风干，得到多肽粗产品FAM-Ahx-(GOP)4-NH2。粗产品由反相液相色谱纯化得多肽探针GOP-4。
实施例2多肽探针GOP-6的制备
1.多肽探针的设计
本次设计的多肽探针序列为：FAM-Ahx-(GOP)6-NH2，其中FAM为羧基荧光素。
2.固相合成多肽序列Ahx-(GOP)6
(1)将100mg Rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5mL二氯甲烷溶胀树脂；
(2)由20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；
(3)将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3h。
(4)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次。显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min。树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
(5)重复步骤(3)和(4)，直到合成目标序列的多肽Ahx-(GOP)6。3.信号分子修饰多肽序列
(1)称取羧基荧光素(4eq)、HOBt(4eq)和HBTU(4eq)，由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，混合液加入到合成的多肽Ahx-(GOP)6树脂中，避光反应24h；
(2)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤3次。将树脂抽干，加入切割液(TFA:TIS:水＝95:2.5:2.5)，反应3h；
(3)反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀。离心收集沉淀，用少量TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2次后风干，得到多肽粗产品FAM-Ahx-(GOP)6-NH2。粗产品由反相液相色谱纯化得多肽探针GOP-6。
实施例3多肽探针GOP-8的制备
1.多肽探针的设计
本次设计的多肽探针序列为：FAM-Ahx-(GOP)8-NH2，其中FAM为羧基荧光素。
2.固相合成多肽序列Ahx-(GOP)8
(1)将100mg Rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5mL二氯甲烷溶胀树脂；
(2)由20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；
(3)将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3h。
(4)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次。显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min。树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
(5)重复步骤(3)和(4)，直到合成目标序列的多肽Ahx-(GOP)8。
3.信号分子修饰多肽序列
(1)称取羧基荧光素(4eq)、HOBt(4eq)和HBTU(4eq)，由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，混合液加入到合成的多肽Ahx-(GOP)8树脂中，避光反应24h；
(2)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤3次,将树脂抽干，加入切割液(TFA:TIS:水＝95:2.5:2.5)，反应3h；
(3)反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀。离心收集沉淀，用少量TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2次后风干，得到多肽粗产品FAM-Ahx-(GOP)8--NH2。粗产品由反相液相色谱纯化得多肽探针GOP-8。
实施例4多肽探针GOP-10的制备
1.多肽探针的设计
本次设计的多肽探针序列为：FAM-Ahx-(GOP)10-NH2，其中FAM为羧基荧光素。
2.固相合成多肽序列Ahx-(GOP)10
(1)将100mg Rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5mL二氯甲烷溶胀树脂；
(2)由20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；
(3)将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3h。
(4)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次。显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min。树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
(5)重复步骤(3)和(4)，直到合成目标序列的多肽Ahx-(GOP)10。
3.信号分子修饰多肽序列
(1)称取羧基荧光素(4eq)、HOBt(4eq)和HBTU(4eq)，由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，混合液加入到合成的多肽Ahx-(GOP)10树脂中，避光反应24h；
(2)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤3次。将树脂抽干，加入切割液(TFA:TIS:水＝95:2.5:2.5)，反应3h；
(3)反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀。离心收集沉淀，用少量TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2次后风干，得到多肽粗产品FAM-Ahx-(GOP)10-NH2。粗产品由反相液相色谱纯化得多肽探针GOP-10。
实施例5多肽探针GOP-12的制备
1.多肽探针的设计
本次设计的多肽探针序列为：FAM-Ahx-(GOP)12-NH2，其中FAM为羧基荧光素。
2.固相合成多肽序列Ahx-(GOP)12
(1)将100mg Rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5mL二氯甲烷溶胀树脂；
(2)由20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；
(3)将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3h。
(4)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次。显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min。树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
(5)重复步骤(3)和(4)，直到合成目标序列的多肽Ahx-(GOP)12。
3.信号分子修饰多肽序列
(1)称取羧基荧光素(4eq)、HOBt(4eq)和HBTU(4eq)，由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，混合液加入到合成的多肽Ahx-(GOP)12树脂中，避光反应24h；
(2)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤3次。将树脂抽干，加入切割液(TFA:TIS:水＝95:2.5:2.5)，反应3h；
(3)反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀。离心收集沉淀，用少量TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2次后风干，得到多肽粗产品FAM-Ahx-(GOP)12-NH2。粗产品由反相液相色谱纯化得多肽探针GOP-12。
对比例1多肽探针GPP-10的制备
1.多肽探针的设计
本次设计的多肽探针序列为：FAM-Ahx-(GPP)10-NH2，其中FAM为羧基荧光素。
2.固相合成多肽序列Ahx-(GPP)10
(1)将100mg Rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5mL二氯甲烷溶胀树脂；
(2)由20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；
(3)将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3h。
(4)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次。显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min。树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
(5)重复步骤(3)和(4)，直到合成目标序列的多肽Ahx-(GPP)10。3.信号分子修饰多肽序列
(1)称取羧基荧光素(4eq)、HOBt(4eq)和HBTU(4eq)，由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，混合液加入到合成的Ahx-(GPP)10树脂中，避光反应24h；
(2)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤3次。将树脂抽干，加入切割液(TFA:TIS:水＝95:2.5:2.5)，反应3h；
(3)反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀。离心收集沉淀，用少量TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2次后风干，得到多肽粗产品FAM-Ahx-(GPP)10-NH2。粗产品由反相液相色谱纯化得多肽探针GPP-10。
对比例2多肽探针GPO-10的制备
1.多肽探针的设计
本次设计的多肽探针序列为：FAM-Ahx-(GPO)10-NH2，其中FAM为羧基荧光素。
2.固相合成多肽序列Ahx-(GPO)10
(1)将100mg Rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5mL二氯甲烷溶胀树脂；
(2)由20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；
(3)将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3h。
(4)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次。显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min。树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
(5)重复步骤(3)和(4)，直到合成目标序列的多肽Ahx-(GPO)10。3.信号分子修饰多肽序列
(1)称取羧基荧光素(4eq)、HOBt(4eq)和HBTU(4eq)，由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，混合液加入到合成的Ahx-(GPO)10树脂中，避光反应24h；
(2)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤3次。将树脂抽干，加入切割液(TFA:TIS:水＝95:2.5:2.5)，反应3h；
(3)反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀。离心收集沉淀，用少量TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2次后风干，得到多肽粗产品FAM-Ahx-(GPO)10-NH2。粗产品由反相液相色谱纯化得多肽探针GPO-10。
对比例3多肽探针GOO-10的制备
1.多肽探针的设计
本次设计的多肽探针序列为：FAM-Ahx-(GOO)10-NH2，其中FAM为羧基荧光素。
2.固相合成多肽序列Ahx-(GOO)10
(1)将100mg Rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5mL二氯甲烷溶胀树脂；
(2)由20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；
(3)将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3h。
(4)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次。显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min。树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
(5)重复步骤(3)和(4)，直到合成目标序列的多肽Ahx-(GOO)10。3.信号分子修饰多肽序列
(1)称取羧基荧光素(4eq)、HOBt(4eq)和HBTU(4eq)，由DMF溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，混合液加入到合成的Ahx-(GOO)10树脂中，避光反应24h；
(2)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤3次。将树脂抽干，加入切割液(TFA:TIS:水＝95:2.5:2.5)，反应3h；
(3)反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀。离心收集沉淀，用少量TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2次后风干，得到多肽粗产品FAM-Ahx-(GOO)10-NH2。粗产品由反相液相色谱纯化得多肽探针GOO-10。
实施例6多肽探针性能测定
1.染色能力检测
取实施例1-5制备的多肽探针进行染色实验。
石蜡胸骨组织染色：石蜡包埋小鼠胸骨组织切片75℃烤片2h；冷却后使用二甲苯处理组织2次，每次10min；之后使用梯度浓度乙醇处理切片；最后使用超纯水洗切片2次。在组织切片上加封闭液，放置30min后吸走液体，分别用100μL，15μM的上述多肽探针溶液进行染色，0℃孵育2h；吸去染色液后，使用1x PBS洗涤3次，洗液清洗去未结合的探针；滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照。
冰冻尾组织染色：冰冻切片PBS洗2次，在组织切片上加封闭液，放置30min后吸走液体，分别用100μL，15μM的上述多肽探针溶液进行染色，0℃孵育2h；吸去染色液后，使用1xPBS洗涤3次，洗液清洗去未结合的探针；滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照。
结果：本发明实施例1-5制备的多肽探GOP-4、GOP-6、GOP-8、GOP-10、GOP-12的石蜡胸骨组织染色结果分别见图1a；冰冻尾组织染色结果分别见图1b；结果表明，GOP重复序列少于6时的多肽探针无荧光，而当GOP重复序列大于等于8时，可检测到明显的荧光，说明本发明提供的多肽探针可以用于检测胶原蛋白。
2.比色实验
取多肽探针GOP-10以及多肽探针GPP-10、GPO-10和GOO-10，并分别配置成300μM的探针溶液；将上述各探针溶液于85℃水浴恒温20min，并由数码相机采集图片数据，观察溶液颜色；将加热后的探针溶液置于0℃冰水混合物中恒温24h，再次由数码相机采集图片数据，观察溶液颜色。结果如图2所示：多肽探针GPP-10、GPO-10和GOO-10不稳定，在0℃时变为三螺旋(橙色)失去对病变胶原结合能力；而本发明制备的多肽探针GOP-10在0℃时仍保持稳定的单链状态(绿色)。
3.荧光光谱图
取多肽探针GOP-10以及GPP-10、GPO-10和GOO-10，并分别配置成300μM的探针溶液；将上述各探针溶液于85℃水浴恒温20min，立刻由荧光分光光度计测定荧光光谱图；将上述加热后的探针溶液置于0℃冰水混合物中恒温24h，再次由荧光分光光度计测定荧光光谱图；其中激发波长为515nm，发射光谱扫描范围为500-700nm。结果如图3所示：多肽探针GPP-10、GPO-10和GOO-10经85℃水浴处理后，再置于0℃冰浴时，荧光强度发生显著变化；而本发明制备的多肽探GOP-10经85℃水浴处理后，再置于冰浴时，荧光强度未发生变化。
4.热稳定性实验
取多肽探针GOP-10以及GPP-10、GPO-10和GOO-10，并分别配置成300μM的探针溶液；各探针溶液分别由10mM的磷酸缓冲液稀释至15μM，于0℃中保存备用；分别取探针溶液，并从0℃梯度升温至90℃，升温过程中检测溶液在525nm处的荧光强度，得荧光强度-时间曲线；曲线进行一阶求导，导数曲线最大值对应探针的热变温度。结果如图4所示：本发明制备的多肽探针GOP-10在0-90℃范围内一致保持较稳定的荧光强度，说明本发明制备的多肽探针GOP-10在0-90℃范围内能够保持稳定的单链状态。
实施例7多肽探针荧光染色实验
1.多肽探针对小鼠肠组织中胶原蛋白的染色
取多肽探GOP-10以及GPP-10、GPO-10和GOO-10，并分别配置成300μM的探针溶液；取小鼠肠组织样品进行石蜡包埋，切片至4μm；切片清洗脱蜡至水后，在组织切片上加封闭液，放置30min后吸走液体，分别用不同预处理的100μL，15μM的上述多肽探针溶液进行染色，0℃孵育2h；吸去染色液后；使用1x PBS洗涤3次，洗液清洗去未结合的探针；滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照；
实验结果如图5所示，其中染色前0℃孵育的上述多肽探针的染色结果如图5a-d所示；染色前85℃孵育处理的上述多肽探针的染色结果如图5e-h所示；多肽探针GPP-10、GPO-10、GOO-10只有经85℃孵育预处理才能进行荧光染色，而在0℃无荧光染色能力；本发明制备的多肽探针GOP-10在85℃和0℃孵育后均具有良好的荧光染色能力，说明本发明制备的多肽探针GOP-10保持单链能力较强，在低温下仍未单链状态，不用经过加热处理，仍能用于胶原蛋白的荧光成像。
2.多肽探针对正常小鼠以及病变小鼠耳组织中胶原蛋白的染色
取多肽探针GOP-10，配置成300μM的探针溶液；
取正常及损伤的小鼠耳组织样品进行石蜡包埋，切片至4μm；切片清洗脱蜡至水后，在组织切片上加封闭液，放置30min后吸走液体，分别用100μL，15μM的上述多肽探针溶液进行染色，4℃孵育2h；吸去染色液后，使用100μL的DAPI稀释液染色1min；使用1x PBS洗涤3次，洗液清洗去未结合的探针和过量的DAPI稀释液；滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照；
实验结果如图6所示，其中损伤小鼠耳组织荧光检测结果如图6a所示，正常小鼠耳组织荧光检测结果如图6b所示，其中图6a中，病变胶原蛋白染色为绿色，而在6b中无绿色分布，仅有被DAPI染色的细胞核，说明本发明制备的多肽探针GOP-10探针仅对病变胶原蛋白具有靶向性，不受正常胶原蛋白影响，可以用于病变胶原蛋白的特异性检测。
3.人体关节炎病理切片染色
取人骨关节炎组织进行石蜡包埋，切片至4μm，切片清洗脱蜡至水，切片上加0.5mL封闭液，放置30min后吸走液体。使用100μL，15μM的多肽探针溶液染色，4℃孵育2h。吸去染色液后，使用100μL的DAPI稀释液染色1min。使用1x PBS洗涤3次，洗液清洗未结合探针和过量的DAPI。滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照。
人骨关节炎纤维软骨病理切片染色结果如图7所示，人骨关节炎透明软骨病理切片染色结果如图8所示，探针GOP-10可以特异结合骨关节炎组织中的病变胶原蛋白，并染色为绿色，细胞核被DAPI染色为蓝色。说明，本发明制备的多肽探针GOP-10可用于人骨关节炎纤维软骨和骨关节炎透明软骨中的病变胶原蛋白的检测。
Claims (10)
1.一种检测病变胶原蛋白的多肽探针，其特征在于，所述多肽探针由多肽序列(Gly-Hyp-Pro)n和修饰在所述多肽序列(Gly-Hyp-Pro)nN端的信号分子X组成，其中n为大于6的整数。
2.如权利要求1所述多肽探针，其特征在于，所述信号分子X为荧光素类染料、香豆素类染料、罗丹明类染料、菁类染料、BODIPY类染料、四苯基乙烯类染料，六苯基甲硅烷类染料、二苯乙烯蒽类染料、半导体量子点、碳量子点、钙钛矿量子点、稀土离子配合物、金属框架材料、上转化稀土纳米材料和长余辉纳米材料中的一种或几种。
3.如权利要求2所述的多肽探针，其特征在于，所述信号分子X为羧基荧光素FAM。
4.一种检测病变胶原蛋白的多肽探针，其特征在于，所述多肽探针由多肽序列(Gly-Hyp-Pro)n、修饰在所述多肽序列(Gly-Hyp-Pro)nN端的信号分子X和接头Ahx组成，其中n为大于6的整数，所述信号分子X和所述多肽序列(Gly-Hyp-Pro)n之间通过接头Ahx连接，所述多肽探针的序列为FAM-Ahx-(Gly-Hyp-Pro)n。
5.如权利要求4所述的多肽探针，其特征在于，所述n为8到12之间的任何整数。
6.一种如权利要求1-5任一所述多肽探针的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)固相合成多肽树脂(Gly-Hyp-Pro)n；
(2)将4eq的信号分子、HOBt和HBTU溶解于DMF中，低温活化10-30min后，向溶液中滴加4-10eq的DIEA，得混合液；
(3)将步骤(2)制备的混合液加入到步骤(1)所述的多肽树脂中，避光反应12-48h；
(4)将步骤(3)反应后的多肽树脂用切割液处理2-4h后，加入冰乙醚，所得沉淀即为多肽探针，其中，所述切割液由体积比为95：2.5：2.5的三氟乙酸、自由基捕获剂和水组成。
7.如权利要求1-5任一所述的多肽探针在制备检测病变胶原蛋白的检测试剂，和/或试剂盒，和/或成像试剂中的应用。
8.一种含有权利要求1-5任一所述多肽探针的检测试剂。
9.一种含有权利要求1-5任一所述多肽探针的检测试剂盒。
10.一种含有权利要求1-5任一所述多肽探针的组织成像试剂。
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