DE19500990A1

DE19500990A1 - Neues Peptid, seine Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE19500990A1
Application number: DE19500990A
Authority: DE
Inventors: Stefan Dr Med Dhein; Tatjana Dipl Chem Tudyka
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-01-14
Filing date: 1995-01-14
Publication date: 1996-07-18
Also published as: MX9704796A; NO973230L; EP0805818A1; CN1168142A; ZA96239B; CZ204897A3; CA2209496A1; WO1996021674A1; BR9606756A; KR19980701397A; FI972965A; AU4483696A; IL116658A0; NO973230D0; FI972965A0; JPH11511727A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Peptid, Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.

Es ist bekannt, daß Herzrhythmusstörungen eine der häufigsten To desursachen in westlichen Industrienationen darstellen. Dabei sind insbesondere Arrhythmien im Zusammenhang mit koronarer Herz erkrankung, Ischämie und höherem Lebensalter von großer Bedeu tung. Die Mechanismen, die zu den Arrhythmien führen, sind dabei sehr unterschiedlich und teilweise auch noch ungeklärt. Gesichert ist, daß z. B. überlebende Purkinjefasern in einem Infarktareal als externe Schrittmacher (foci) Arrhythmien unterhalten können. Ebenso kann im Rahmen der kardialen Ischämie durch ausströmendes Kalium eine Depolarisation der Fasern auftreten und diese können teilweise unerregbar werden, so daß sich unidirektionale Blockie rungen der Erregungsausbreitung ergeben können. Neben einer Viel zahl anderer Mechanismen kommt es im Rahmen des Infarktes auch zu lokalen Unterschieden der Aktionspotentialdauer (Dispersion) die dann Reentry-Kreise auslösen können. Aus solchen kreisenden Erre gungen kann sich dann ein Kammerflattern oder -flimmern entwic keln. Ein weiterer Mechanismus, der zu einer derartigen Disper sion der Aktionspotentialdauer führen kann, ist die zelluläre Entkopplung (Circ. Res. 65, 1426, (1989)), da dann Potentialun terschiede zwischen den Zellen nicht mehr ausgeglichen werden können. Diese Entkopplung kann einerseits mit zunehmendem Alter durch z. B. Bindegewebseinlagerung entstehen (Circ. Res. 62, 811 (1988)), andererseits im Rahmen des Infarktes durch Schließen der interzellulären Verbindungen (Gap Junction Kanäle) aufgrund z. B. des ansteigenden pCO₂ und des abfallen pH-Wertes und ATP-Gehaltes (Am. J. Physiol. 248, H753-H764 (1985), Circ. Res 45, 324 (1979)).

Bisher wurden als Antiarrhythmika Ionenkanalblocker eingesetzt, die transmembranäre Ionenkanäle (Natriumkanäle, Calciumkanäle und/oder Kaliumkanäle) blockieren, die für eine Therapie akuter bereits bestehender Herzrhythmusstörungen geeignet sind.

Probleme aber ergeben sich, wenn diese Substanzen zur Prophylaxe von Arrhythmien eingesetzt werden sollen. Zumindest bei prophy laktischer Gabe zeigen diese Ionenkanalblocker ein hohes pro arrhythmisches Risiko (Drugs 29, Suppl. 4 33-34 (1985), New Eng land J. Med. 324, 781 (1991)). Das bedeutet, daß gerade durch die Gabe von klassischen Antiarrhythmica Arrhythmien paradoxerweise provoziert werden. Daher sind diese Substanzen zur Prophylaxe nur sehr beschränkt geeignet.

Daher wird derzeit nach prophylaktisch anwendbaren Stoffen mit neuen Wirkprinzipien gesucht, die diese proarrhythmische Wirkung nicht mehr zeigen. Ein neues Prinzip ist die Verbesserung der zellulären Kopplung.

Die klinischen und experimentellen Ergebnisse mit den alten her kömmlichen Antiarrhythmika zeigten, daß eine Prophylaxe von Ar rhythmien kaum möglich ist wegen der hohen proarrhythmischen Ne benwirkungen, die auch im in-vitro Versuch nachgewiesen werden konnten (New England J. Med. 324, 781 (1991), Circulation 87, 617 (1993)).

Als neues Prinzip wurde ein antiarrhythmisches Peptid AAP10 vor geschlagen (Naunyn Schmiedeberg′s Arch. Pharmacol. 350, 174 (1994)), welches zu einer verbesserten zellulären Kopplung führt, lokale Unterschiede in der Aktionspotentialdauer vermindert und die epikardialen Erregungsmuster stabilisiert. Im in-vitro Ver such am isolierten Kaninchenherzen zeigt diese Substanz praktisch kein proarrhythmisches Risiko, sie ist aber gut wirksam gegen Ischämie-assoziierte Arrhythmien. Die Primärwirkung der Substanz liegt in einer Verminderung der Dispersion der Potentialdauer.

Gegenstand der Erfindung sind die Peptid
H₂N-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-3-Iodtyrosinamid und
H₂N-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-3-Fluortyrosinamid
sowie die Verwendung dieser Peptide zur Bekämpfung von Krankhei ten. Hyp bedeutet in der obigen Formel 4-Hydroxyprolin.

Diese Peptide können nach den in der Peptidchemie üblichen Metho den hergestellt werden. Besonders eignen sich folgende Verfahren zu dessen Herstellung:

Festphasensynthese an unlöslichen Harzen nach einem modifizierten Merrifield-Verfahren entsprechend E. Atherston & R.C. Streppard (1989; "Solid phase peptide synthesis", IRL-Press, Oxford) unter Verwendung der Fmoc-Strategie.

Die Aminosäureaktivierung kann dabei über die Bildung von Säu reanhydriden, 1-Hydroxybenzotriazolestern oder von Pentafluorphe nylestern erfolgen.

Das besondere der Wirkung des neuen Peptids besteht darin, daß unter dem Einfluß der Substanz lokale Unterschiede in der Akti onspotentialdauer und Irregularitäten der Erregungsausbreitung, wie beides im Rahmen von z. B. Herzinfarkten oder mit steigendem Alter auftritt, unterdrückt werden.

Die Erfindung erlaubt eine prophylaktische Therapie von Ischämie assoziierten und Alters-assoziierten Herzrhythmusstörungen. Dabei weist die Substanz im Gegensatz zu herkömmlichen Antiarrhythmika im in-vitro Versuch kein nennenswertes proarrhythmisches Risiko auf. Gegenüber bekannten Substanzen zeigt das neue Peptid eine höhere Potenz und eine höhere erreichbare Maximalwirkung.

Beispiele 1. Darstellung von Fluorenylmethoxycarbonyl-Iod-Tyrosin

Entsprechend einer Gabriel-Synthese wurden Tyrosin und Phthalsäureanhydrid miteinander in Eisessig 20 h umgesetzt, und das Reaktionsprodukt mit Iod und Hg(II)-acetat zu N-Phthalyl-L-monoiodtyrosin umgesetzt. Anschließend wurde die Schutzgruppe mit Phenylhydrazin abgespalten. Das Reaktions produkt wurde in Gegenwart von Na₂CO₃, Wasser und Aceton mit Fluorenylmethoxycarbonyl-N-hydroxysuccinimid umgesetzt. Nach Ansäuern mit HCl erhielt man das gewünschte Fmoc-Iod-Tyrosin.

2. Synthese des Peptides (1) H₂N-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-3-Iodtyro sinamid

Es wurde nach dem bekannten Syntheseprotokoll in Fmoc-Strate gie nach Atherton & Sheppard verfahren. Bei einem Beladungs grad von 0,55 mmol/g wurden 272,7 mg Rink-Harz vorgelegt, mit Dimethylformamid vorgequollen und danach die Schutzgruppe mit 20% Piperidin in Dimethylformamid (DMF) abgespalten. 0,9 mmol Fmoc-Iod-Tyrosin wurden nach Spülen mit DMF mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in DMF zugegeben. Nach Spülen mit DMF und Methanol wurde die Schutzgruppe mit 20% Piperidin in DMF abgespalten und nach weiterem Spülen die nächste Aminosäure gekoppelt. Dazu wurde Fmoc-Prolin-OH zu sammen mit O-((1H-Benzotriazol-1-yl)-NNNN-tetramethyluromi num-tetrafluoroborat (TBTU), 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT), Diisopropylethylamin (DIPEA) in DMF mit dem Peptid umgesetzt.

Nach Spülen wurde wiederum die Schutzgruppe mit Piperidin, DMF abgespalten und nach weiterem Spülen das Reaktionsprodukt mit Fmoc-Hydroxyprolin-OH wie oben beschrieben umgesetzt. Nach jeweils Spülen und Abspalten wurden auf diese Weise nacheinander Fmoc-Glycin-OH, Fmoc-Alanin-OH und Fmoc-Gly cin-OH gekoppelt. Am Ende wurde die Schutzgruppe mit 20% Piperidin in DMF abgespalten, gespült und über 6 h bei 0,1 mbar getrocknet. Am Ende wurde das Harz abgespalten durch Zugabe von Trifluoressigsäure und 5% Wasser über 2 h, das Produkt gespült, einrotiert, in Eisessig gelöst und mit Diethylether umgefällt. Der Niederschlag wurde abgezogen und über eine semipräparative HPLC in bekannter Weise gereinigt. Man erhielt 7,6 mg des neuen Peptids (Molmasse: 701,6).

3. Analog Beispiel 1 und 2 wurde das Peptid (2) H₂N-Gly-Ala-Gly- Hyp-Pro-3-Fluortyrosinamid erhalten Anwendung

Die Substanz (1) wurde an isolierten, nach der Langendorff-Tech nik druckkonstant (70 cm H₂O) mit Tyrodelösung perfundierten Ka ninchenherzen intracoronar in steigenden Konzentrationen (10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7 Mol/l) infundiert, und es wurde simultan ein epi kardiales Potentialmapping durchgeführt, vgl. J. Pharmacol. Methods 22, 197 (1989), Circulation 87, 617 (1993).

Bei diesen Untersuchungen wurde an 256 Stellen der epikardialen Herzoberfläche simultan ein unipolares Elektrokardiogramm regis triert, so daß daraus an allen 256 Orten die lokale epikardiale Aktionspotentialdauer bestimmt werden konnte. Aus diesen Daten wurde dann die Verteilung der Aktionspotentialdauer um den Mit telwert und die Änderung dieser Verteilung durch die Substanz im Vergleich zu AAP10 geprüft. Es zeigte sich für beide Substanzen eine zunehmende Leptocurtosis der Kurve, das heißt unter dem Einfluß von AAP10 wie auch unter dem des neuen Peptids lagen kon zentrationsabhängig zunehmend mehr Werte in der Nähe des Mittel wertes. So fanden sich unter Kontrollbedingungen 50% aller Werte in einem Bereich um ± 5 ms um den Mittelwert, unter AAP10 dagegen bis maximal 74% (10^-8 Mol/l), unter dem neuen Peptid aber sogar bis zu 90% (10^-7 Mol/l). Das bedeutet, daß durch das neue Peptid die Dispersion der epikardialen Aktionspotentialdauer deutlich gesenkt wird und daß diese Senkung ausgeprägter ist als die durch AAP10 erreichbare.

Tabelle 1

Konzentrationsabhängige Wirkung auf die Dispersion der epikardialen Potentialdauer unter dem antiarrhythmischen Peptid AAP10 und dem neuen Peptid

Besonders deutlich wird die bessere Wirkung des neuen Peptids, wenn man die Zahl der Werte für die epikardiale Potentialdauer (ARI) betrachtet, die weniger als 5 ms vom Mittelwert abweichen. Im Intervall ± 5 ms um den Mittelwert lagen bei dem neuen Peptid unter Kontrollbedingungen 54%, dagegen schon bei 10^-10 Mol/l 71%, bei 10^-9 Mol/l 73%, 10^-8 Mol/l 75%, bei 10^-7 Mol/l bis zu 90% der ARI-Werte in dem Intervall ± 5 ms um den Mittelwert. Bei AAP10 wurden Werte über 70% erst in Konzentrationen oberhalb 10^-8 Mol/l erreicht, wobei ein Maximum von 74% nicht überschrit ten wurde.

Die neue Substanz zeigt gegenüber AAP10 eine Wirkung schon bei niedrigerer Konzentration und eine größere maximal erzielbare Wirkung von bis zu 90% gegenüber 74% bei AAP10 (%-Werte: n% der epikardialen Aktionspotentiale zeigten eine Dauer, die im Bereich von ± 5 ms um den Mittelwert streute, was einer Abnahme der Dis persion entspricht). Damit ist das neue Peptid nicht nur poten ter, sondern auch hinsichtlich der maximalen Wirkung effektiver als AAP10 und stellt daher einen Fortschritt gegenüber AAP10 dar.

Proarrhythmisches Risiko

Die neue Substanz wie auch AAP10 zeigen beide ein besonders ge ringes proarrhythmisches Risiko verglichen mit herkömmlichen An tiarrhythmika (Tabelle 2).

Tabelle 2 Veränderung des proarrhythmischen Risikos (der Vektor feldähnlichkeit) (näheres zu diesem Parameter und den Ergebnissen mit den klassischen Antiarrhythmika vgl. Circulation 87, 617 (1993)) unter AAP10, dem neuen Peptid, Lidocain und Flecainid in üblichen therapeutischen Konzentrationen (freie Plasmakonzen tration)

Je niedriger der Wert der Selbstähnlichkeit der Vektorfelder ist, desto höher ist die proarrhythmische Wirkung der Substanz. Alle Konzentrationen entsprechen üblichen therapeutischen freien Plas makonzentrationen. Von den üblichen Klasse I Antiarrhythmika ge hört Lidocain zu denen mit anerkanntermaßen noch relativ geringem proarrhythmischen Risiko, während Flecainid nach allgemeiner Ein schätzung ein sehr hohes proarrhythmisches Risiko aufweist.

Claims

1. H₂N-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-3-Iodtyrosinamid.

2. H₂N-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-3-Iodtyrosinamid zur Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.

3. H₂N-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-3-Fluortyrosinamid.

4. H₂N-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-3-Fluortyrosinamid zur Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.