DE1518269A1

DE1518269A1 - Verfahren zur Herstellung von Orn?-Vasopressin

Info

Publication number: DE1518269A1
Application number: DE19641518269
Authority: DE
Inventors: Huguenin Dr Rene; Boissonnas Dr Roger
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 1963-04-05
Filing date: 1964-04-02
Publication date: 1969-11-27
Also published as: DK112242B; SE333377B; ES298271A1; CH421129A; GB1051686A; NL6403420A; LU45809A1; DE1518269B2; AT252474B; NL130081C; OA00697A; BE646132A; FR3926M; DE1518269C3; MY6900119A; FI42568B; US3299036A; BR6458097D0

Description

Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung des neuen PoIypeptids der Formel I (siehe Formelblatt) durch Oxydation des Nonapeptids V in wässriger Lösung bei einem pH-Wert von *l· bis 9.

Es wurde gefunden, dass das Orn -Vasopressin (Formel I) eine gleich starke vasokonstriktorische Wirkung besitzt wie die natürlichen Vasopressine, von denen sich die neue Verbindung dadurch unterscheidet, dass sie anstelle von Lysin (Vasopressin vom Schwein, Formel VIa) resp. Arginin (Vasopressin vom Rind, Formel VIb) Ornithin enthält (siehe Formelblatt). Bei der Verbindung I fehlt jedoch im Gegensatz zu den natürlichen Vasopressinen die antidiuretische Wirkungskomponente weitgehend, so dass die Verbindung I als eine Substanz mit gezieltem vasokonstriktorischen Effekt in die Therapie eingeführt werden kann. Die spezifische vasokonstriktorische Wirkung wird durch direkte Beeinflussung der Gefässmuskula-

tür erzielt, weshalb die Verbindung I - im Gegensatz zu Adrenalin und Noradrenalin - keine vegetativ-nervösen

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Nebenerscheinungen hervorruft. Der selektiv vasokonstriktorische Effekt der Verbindung I war nicht vorauszusehen, weil die Struktur des Ornithinrestes zwischen der des Lysins und des Arginins liegt und man dadurch erwarten könnte, dass auch die Eigenschaften der neuen Verbindung I den Eigenschaften der beiden natürlichen Hormone entsprochen

hätten. (Zur Wirkungsweise von Om -Vasopressin vgl. auch Helv.chim.acta 46 (I963), S. I670).

Das Hauptanwendungsgebiet der neuen Verbindung I ist die Prophylaxe und Therapie parenchymatöser Blutungen, wobei die Infiltration des Gewebes mit der Verbindung I eine ausgesprochen ischämisierende Wirkung zur Folge hat. Insbesondere bei chirurgischen Eingriffen in der Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Gynäkologie und Geburtshilfe, Urologie und Zahnheilkunde kann die Verbindung I Anwendung finden. Sie wird dabei entweder dem Lokalanästheticum zugesetzt oder bei Operationen in Allgemeinnarkose mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und zur Infiltration verwendet.

Das als Ausgangsprodukt verwendete Nonapeptid V kann nach verschiedenen Verfahren erhalten werden. Ein Weg besteht darin, dass man ein Hexapeptid-Derivat II, in welchem R' eine bei der Peptidsynthese zum Schutz der Sulfhydrylgruppe gebräuchliche Gruppe und R" eine in der Peptidsynthese zum Schutz der Aminogruppe gebräuchliche Gruppe bedeuten, mit

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einem reaktionsfähigen Derivat der freien Säure III, in welchem R¹ und R" obige Bedeutung haben, zum Nonapeptid-Derivat IV kondensiert, dieses durch Reduktion mit einem Alkalimetall in flüssigem Ammoniak in das Nonapeptid V umwandelt. Die Verknüpfung der einzelnen Aminosäuren bzw. kleinerer Peptideinheiten kann in beliebiger Weise und nach allgemein bekannten Methoden erfolgen, soweit nur die in Formel V angegebene Reihenfolge der Aminosäuren erzielt wird. Zur vorübergehenden Blockierung der Aminogruppen können z.B. die Carbobenzoxygruppe, die Carbo-pchloro-benzyloxy-, die p-Toluolsulfonyl- oder die Triphenylmethylgruppe verwendet werden, zum Schutz der Sulfhydrylgruppe die Phenyl-, Benzyl-, p-Bromo-benzyl-, p-Chloro-benzyl-, p-Nitro-benzyl oder p-XyIy!gruppe.

Ein Syntheseweg des Peptide V verläuft beispielsweise wie folgt:

Man kondensiert N-a-Carbobenzoxy-N-o-p-toluolsulfonyl-L-ornithin mit Glycinäthylester zu N-a-Carbobenzoxy-N-ö-ptoluolsulfonyl-L-ornithyl-glycin-äthylester. Nach Abspaltung der Carbobenzoxygruppe wird der erhaltene N-o-ptoluolsulfonyl-L-ornithyl-glycin-äthylester mit N-Carbobenzoxy-L-prolin zu N-Carbobenzoxy-L-prolyl-N-i-p-toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycin-äthylester kondensiert, der in das entsprechende Amid umgewandelt wird. Nach Abspaltung

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der Carbobenzoxygruppe wird das erhaltene L-Prolyl-N-<>-ptoluolsulfonyl-L-ornithyl-glycinamid mit N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cystein-azid zu N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-ö-p-toluolsulfonyl-L-ornithylglycinamid kondensiert. Nach Abspaltung der Carbobenzoxygruppe wird das erhaltene L-Glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-ö-p-toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycinamid mit N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-phenylalanin-azid zu N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-ö-p-toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycinamid kondensiert. Dieses Nonapeptid-Derivat wird mit einem Alkalimetall, vorzugsweise mit Natrium oder Kalium, in flüssigem Ammoniak behandelt, so dass das lineare Nonapeptid V entsteht.

Dieses Peptid wird dann durch die erfindungsgemässe Oxydation, vorzugsweise mit Luft, Sauerstoff oder Wasserstoffperoxyd, in wässeriger Lösung in das biologisch aktive,

0
zyklische Orn -Vasopressin übergeführt. Ein entsprechendes

Syntheseschema befindet sich vor den Formelblättern.

Das Verfahrensgemäss hergestellte, bisher unbekannte Orn Vasopressin kann als freie Base oder als Salz einer organischen oder anorganischen Säure, entweder als Arzneimittel

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allein oder in entsprechenden Arzneiformen für parenterale, enterale oder intranasale Verabreichung verwendet werden. Zwecks Herstellung geeigneter Arzneiformen werden diese mit anorganischen oder organischen pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verwendet.

In den nachfolgenden Beispielen sind die Temperaturangaben in Celsiusgraden gemacht.

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•Beispiel 1;

a) N-g-Carbobenzoxy-N-^-p-toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycin-

äthylester

Man löst 104 g N-a-Carbobenzoxy-N-O-p-toluolsulfonyl-L-ornithin und 27 g Glyein-äthylester in 450 ecm Acetonitril, kühlt bei 0°, gibt 51 g Dicyclohexyl-carbodiimid zu und schüttelt 4 Stunden bei Zimmertemperatur. Der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und mit Acetonitril gewaschen. Das gesamte Piltrat wird im Vakuum abgedampft. Der Rückstand kristallisiert nach Zugabe von Petroläther. Nach Umkristallisation aus n-Propanol erhält man 95 g N-a-Carbobenzoxy-N-ö-p-toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycin-äthylester; Smp. I56⁰; [a]J^c = -6,5° (96 #igen Aethanol).

b) N-Carbobenzoxy-L-prolyl-N-fl-p-toluolsulfonyl-L-ornithylglycin-amid

90 g N-a-Carbobenzoxy-N-O-p-toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycin-äthylester werden in 800 ecm mit Bromwasserstoff gesättigter, wasserfreier Essigsäure gelöst. Man lässt eine Stunde stehen bei 20°, verdampft im Vakuum unterhalb 40° und wäscht den Rückstand sorgfältig mit Diäthyläther nach. Man löst den Rückstand in 500 ecm Acetonitril, gibt 25 ecm Triäthylamin und 45 g N-Carbobenzoxy-L-prolin zu, kühlt bei 0°, fügt noch 55,5 g Bicyclohexylcarbodiimid hinzu und schüttelt über Nacht bei 20°. Nach dem Abfiltrieren

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des Dicyclohexylharnstoffes wird das Piltrat im Vakuum bei 30° eingedampft, der Rückstand in Essigester gelöst und diese Lösung mit verdünnter Schwefelsäure und wässerigem Ammoniak gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat wird der Essigester im Vakuum abgedampft und der Rückstand in 1 Liter absolutem Aethanol gelöst. Die Lösung wird bei 0° gekühlt, mit Ammoniak gesättigt und über Nacht bei stehen gelassen. Nach dem Eindampfen im Vakuum bei 30° wird der Rückstand aus Dimethylformamid-Essigester umkristallisiert. Man erhält 58 g N-Carbobenzoxy-L-prolyl-N-d-ptoluolsulfonyl-L-ornithyl-glycinamid; Smp. 122° (mit Zersetzung) [a]_D = -46° (95 #iger Eisessig).

c) N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-ö-p-toluolsulfonyl-L-ornithyl-.glycinamid

Man löst 100 g N-Carbobenzoxy-L-prolyl-N-ö-p-toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycinamid in 500 ecm mit Bromwasserstoff gesättigter, wasserfreier Essigsäure, lässt während einer Stunde bei 20° stehen und verdampft im Vakuum unterhalb 40°. Der Rückstand wird mit Diäthyläther sorgfältig gewaschen und hierauf zu einer Lösung von 100 g N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinylazid und 26 ecm Triäthylamin in 1000 ecm Dimethylformamid zugegeben. Man lässt über Nacht bei 20° stehen, gibt 3OOO ecm Essigester hinzu, filtriert den Niederschlag

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ab und wäscht mit Essigester. Man erhält 105 g N-Carbo-

benzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-

L-prolyl-N-o-p-toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycinamid;

PO

Smp. 193°; [a]^ = -38,5° (Dimethylformamid).

d) N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-fl-p-toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycinamid Man löst 50 g N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-A-p-toluolsulfonyl-L-ornithylglycinamid in 250 ecm mit Bromwasserstoff gesättigter, wasserfreier Essigsäure und lässt während einer Stunde bei 20° stehen. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum unterhalb 4o° wird der Rückstand mit Diäthyläther sorgfältig gewaschen und mit einer Lösung von 31,5 g N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-phenylalanin-azid und 7*5 ecm Triäthylamin in 250 ecm Dimethylformamid versetzt. Man lässt 2 Tage bei 20° stehen, versetzt hierauf mit 1000 ecm Essigester und wäscht den Niederschlag mit Essigester. Nach dem Trocknen im Vakuum bei 30° wird das Produkt mit warmem Methanol gewaschen. Man erhält 45 g N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-d-p-toluolsulfonyl-L-ornithyl-glucinamid. Smp. 224°; Ia]^¹ = -41° (Dimethylformamid),

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e) L-Cysteinyl-L-tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutaminyl-L-

asparaginyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-ornithyl-glycinamid Man versetzt eine Lösung von 5 g N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl~S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-&-p-toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycinamid in 1200 ecm trockenem flüssigem Ammoniak unter Rühren bei der Siedetemperatur der Lösung mit soviel Natrium- oder Kaliummetall bis eine beständige blaue Färbung eingetreten ist. Nach Zugabe von 5 g Ammoniumchlorid wird die Lösung zur Trockne eingedampft. Der Rückstand enthält das L-Cysteinyl-L-tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-ornithyl- · glycinamid.

f) Polypeptidverbindung I

Der nach Beispiel 1 e) erhaltene Rückstand wird in 5 Liter 0,01-n Essigsäure gelöst und bei einem pH von 6,5 - 8,0 durch Einleiten von Luft oder Sauerstoff während einer Stunde bei 0 - 4o° oxydiert. Man bringt die Lösung, die die Substanz enthält, auf einen pH von 4,0 - 5*0 und dampft nach Zusatz von 50 g Natriumchlorid oder von 0,64 g Methansulfonsäure zur Trockne ein, wobei ein trockenes Pulver erhalten wird, das gut haltbar ist. Es kann aufbewahrt werden und bei Gebrauch klar gelöst werden. Man kann jedoch auch die Lösung direkt verwenden, eventuell · nach Verdünnen mit Wasser oder einer Salzlösung.

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• Im Papierchromatogramm und in der Papierelektrophorese erwies sich die Polypeptidverbindung I als homogen. Der Rf-Wert beträgt im aufsteigenden Chromatogramm (Butanol/Eisessig/Wasser 70:10:20): 0,05; (Methyl-Aethylketon/Pyridin/ Wasser 65:15:20): 0,12.

In der Hochspannungs-Elektrophorese auf Papier wandert das Polypeptid I bei pH 5,8 (Pyridin/Essigsäure/Wasser 9:1:90) 7/10 der Distanz des Histidins (E° _ft = 0,7 His); und bei pH 1,9 (Ameisensäure/Essigsäure/Wasser 15:10:75) 9/LO der Distanz des Tryptophane (E.? _n = 0,9 Try).

Die Totalhydrolyse mit 6 N Salzsäure während 16 Stunden bei 110° bei Luftabwesenheit ergibt die erwarteten Aminosäuren im richtigen Verhältnis.

Beispiel 2

Man verfährt wie in Beispiel 1, oxydiert aber am Ende bei 0 - 40° durch Zusatz von 7*5 ecm einer 1-n Lösung von Wasserstoffperoxyd in Wasser bei einem pH von 4,0 - 9*0 (anstatt der Oxydation durch Einleiten von Luft oder Sauerstoff).

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CD
CD
CN
00

LO

Bz

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CBO-4 6rn-4-OH

Tos

CBO » carbobenzoxy-Tos = p-Toluolsulfonyl Bz ■ benzyl-

tosyl

CBO-- Pro·

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-NH,

■NH,

GIy-J-NH₂

GIy

GIy-

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NH,

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1783

CONH,

|6 4 |6 5

CH,

CH₂

CH, CONH,

CH,

CH₀

I ²

NH₂-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-COn

CH,

I ^c

S
Cys

Tyr

Phe

GIu Asp

CH,

Cys

CH₂-CH₂

NH₂ CH₂ CH₂

CH₂

CH

I ² I N CH-CO-NH-CH-CO-NH-Ch₂CONH₂

Pro

Orn

GIy

CONH,
I

CH,

CONH₂ H

S-R' NHR" CH₂

CH₂

II

I 2 f2 r2 Y2 Y2 NH₂-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-Co-N CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH₂-CONh₂

GIu

Asp

Cys

Pro Orn

GIy

S-R¹

C₆H₄OH C₆H₅ CH₂

₂ CH

R"-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-OH

Cys Tyr Phe

III

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CONHg

CONH,

S-R¹

S-R¹ C₆H^OH C₆H

CH₂ ^H₂ i_Hg CH₂ CH₂ CH₂ R'^NHrCH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO

Cys

Tyr

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GIu Asp

Cys

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NHR"
CH₂

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-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CHg-CONHg

Pro

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GIy

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BAD

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?6^H4 ?^H2

^OH

CH₂

CH

CONH,

Γ² CONH₂
CH₂

NH_n-CH-CO-NH-OH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO_n

CH, I ^c s— CH,

Cys

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Cys

CH₂-CH₂ CH,

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Γ² ι

— N—- CH-CO-NH-Ch-CO-NH-CH₂-CONH₂

X GIy

Pro

Formel

tiff VI

Verbindung

VI a VI b

VI C=I

-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-NH₂

-CH₀-CH₀-CH₀-NH-C-NH₀

d d d Il C.

NH

-CH₂-CH₂-CH₂-NH₂ Lys
Arg

Orn

Lysiri-vasöpressiri ""■

Arglnin^vasopressin

erfindungsgemässes Polypeptid

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SAD ORIGINAL

Claims

Patentansprüche:

SH C₆H₄OH C₆H₅ CH₂ CONH₂ CH₂ CH₂ CH₂ CH₂ CH₂ NH^-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO

CH₂-CH₂

¹ K

-N CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH₂-CONh₂

Pro Orn GIy in wässriger Lösung bei einem pH von 4-9 oxydiert.

NeU3 Unterlagen (Art 7 ! I At=. 2 Nr. I Sau 3 dts Anderunjno·* *
2. Verfahren nach Anspruth 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Oxydation des Nonapeptids der Formel V (siehe Anspruch 1) sum Polypeptid der Formel I durch Waseerstoffperoxyd durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Oxydation des Nonapeptids der Formel V (siehe Anspruch 1) zum Polypeptid I (siehe Anspruch 1) durch Einleiten von Luft durchfuhrt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet« dass man die Oxydation des Nonapeptids der Formel V (siehe Anspruch 1) zum Polypeptid I (siehe Anspruch 1) durch Einleiten von Sauerstoff durchführt.
5. Polypeptid der Formel I und seine Säureadditionssalze.
6. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, dass es das Polypeptid der Formel I, bzw. dessen Säureadditionssalze, enthält.

57OO/SI/VK SANDOZ AG

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