Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptids
Es wurde gefunden, dass man zu einem bisher unbekannten Polypeptid der Formel I (siehe Formelblatt) gelangen kann, indem man das Nonapeptid Derivat der Formel V (siehe Formelblatt) durch Oxydation in wässriger Lösung in das Endprodukt I überführt.
Zum bisher unbekannten Nonapeptid-Derivat der Formel V kann man gelangen, indem man das neue Hexapeptid der Formel II (siehe Formelblatt), in welchem R eine bei der Peptidsynthese zum Schutz der Sulfhydrylgruppe gebräuchliche Gruppe und R' eine bei der Peptidsynthese zum Schutz der Aminogruppe gebräuchliche Gruppe bedeuten, mit einem reaktionsfähigen Derivat der freien Säure III (siehe Formelblatt), in welchem R" eine bei der Peptidsynthese zum Schutz der Aminogruppe gebräuchliche Gruppe und R"' eine bei der Peptidsynthese zum Schutz der Sulfhydrylgruppe gebräuchliche Gruppe bedeuten, zum Nonapeptid-Derivat IV (siehe Formelblatt) kondensiert und dieses durch Reduktion mit einem Alkalimetall in flüssigem Ammoniak in das Nonapeptid-Derivat V umwandelt.
Zur vorübergehenden Blockierung der Aminogruppen können dabei die zu diesem Zweck gebräuchlichen Gruppierungen wie die Carbobenzoxygruppe, die Carbo-p-chloro-benzyloxy-, die p-Toluol sulfonyl- oder die Triphenylmethylgruppe verwendet werden. Zum Schutz der Sulfhydrylgruppe führt man vorzugsweise eine Phenyl-, eine Benzyl-, eine p Bromo-benzyl-, eine p-Chloro-benzyl-, eine p-Nitrobenzyl- oder eine p-Xylylgruppe ein. Mit besonderem Vorteil verwendet man jedoch den Benzylrest.
Es wurde gefunden, dass die Verbindung I eine starke vasokonstriktorische Wirkung besitzt, wie die natürliche Vasopressine, von denen sich die neue Verbindung dadurch unterscheidet, dass sie anstelle von Lysin (Vasopressin vom Schwein) resp. Arginin (Vasopressin vom Rind) Ornithin, anstelle von Phenylalanin Isoleucin und anstelle von Tyrosin Phenylalanin enthält. Von Oxytocin unterscheidet sich die neue Verbindung durch die Anwesenheit Phenylalanins anstelle von Tyrosin und diejenige Ornithins anstelle von Leucin (siehe Formelblatt).
Bei der vorliegenden Verbindung I fehlt jedoch im Gegensatz zu den natürlichen Vasopressinen die antidiuretische Wirkungskomponente fast vollständig, oxytocischen Wirkungskomponenten weitgehend, so dass die vorliegende Verbindung I als eine Substanz mit gezieltem vasokonstriktorischem Effekt in die Therapie eingeführt werden kann. Die spezifische vasokonstriktorische Wirkung wird durch direkte Beeinflussung der Gefässmuskulatur erzielt, weshalb die vorliegende Verbindung 1 - im Gegensatz zu Adron- alin und Noradrenalin - keine vegetativ-nervösen Nebenerscheinungen hervorruft.
Das Hauptanwendungsgebiet der neuen Verbindung list die Prophylaxe und Therapie parenchymatöser Blutungen, wobei die Infiltration des Gewebes mit der Verbindung I eine ausgesprochen ischämisierende Wirkung zur Folge hat. Insbesondere bei chirurgischen Eingriffen in der Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Gynäkologie und Geburtshilfe, Urologie und Zahnheilkunde findet die vorliegende Verbindung I Anwendung. Sie wird dabei entweder dem Lokalanästheticum zugesetzt oder bei Operationen in Allgemeinnarkose mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und zur Infiltration verwendet.
Das Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel V wird beispielsweise folgendermassen ausgeführt:
Man kondensiert a-N-Carbobenzoxy-N-8-p-toluol- sulfonyl-L-ornithin mit Glycinäthylester zu a-N Carbobenzoxy-N-d-p-toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycin- äthylester. Nach Abspaltung der Carbobenzoxygruppe wird der erhaltene N-8-p-Toluolsulfonyl-Lornithyl-glycin-äthylester mit N-Carbobenzoxy-Lprolin kondensiert zu N-Carbobenzoxy-L-prolyl-N-8- p -toluolsulfonyl-L-ornithyl -glycin- äthylester, der in das entsprechende Amid umgewandelt wird.
Nach Abspaltung der Carbobenzoxygruppe wird das erhaltene L-Prolyl-N-d-p-toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycin- amid mit N-Carbobenzoxy-L- glutamulyl- Laspara- ginyl-S-benzyl-L-cystein-azid zu N-Carbobenzoxy-L glutaminyl-l- asparaginyl-S -benzyl-L- cysteinyl-l- prolyl-N-6-p -toluolsulfonyl-L- ornithyl-glycinamid kondensiert.
Nach Abspaltung der Carbobenzoxygruppe wird das erhaltene L-Glutaminyl-L-aspara ginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-d-p-toluolsul- fonyl - L - ornithyl - glycinamid mit Carbobenzoxy-Sbenzyl-L-cysteinyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-azid zu N-Carbobenzoxy-S- benzyl-l-cysteinyl- L-phenyl- alanyl-l-isoleucyl- 6,-lutaminyl-L- asparaginyl-S- benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-d-p-toluolsulfonyl-L- omithyl-glycinamid kondensiert. Dieses Nonapeptid Derivat wird mit einem Alkalimetall, vorzugsweise mit Natrium oder Kalium in flüssigem Ammoniak behandelt, so dass das lineare Nonapeptid V entsteht. Dieses wird erfindungsgemäss durch Oxydation, vorzugsweise mit Luft, Sauerstoff oder Wasserstoffperoxyd in wässeriger Lösung in das biologisch aktive, zyklische Polypeptid I, d. h.
Phe2-Orn8-Oxytocin, übergeführt. Das verfahrensgemäss hergestellte, bisher unbekannte Polypeptid I kann als freie Base oder als Salz einer organischen oder anorganischen Säure, entweder als Arzneimittel allein oder in entsprechenden Arzneiformen für parenterale, enterale oder intranasale Verabreichungen verwendet werden.
Zwecks Herstellung geeigneter Arzneiformen werden diese mit anorganischen oder organischen pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verwendet. Als Hilfsstoffe werden verwendet, z. B. für Tabletten und Dragees: Milchzucker, Stärke, Talk, Stearinsäure usw.; für Sirupe: Rohrzucker-, Invertzucker-, Glukose-Lösungen u. a.; für Injektionspräparate: Wasser, Alkohole, Glycerol, pflanzliche Öle und dergleichen; für Suppositorien: natürliche oder gehärtete Öle und Wachse u. a. Zudem können die Zubereitungen geeignete I Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmit- tel, Lösungsvermittler, Süss- und Farbstoffe, Aromantien usw. enthalten.
In den nachfolgenden Beispielen sind die Temperaturangaben in Celsiusgraden gemacht.
Beispiel 1 : a) N-a-Carbobenzoxy-N-a-p-toluolsulfonyl-L- ornithyl-glycin-äthylester
Man löst 104 g N-a-Carbobenzoxy-N-d-p-toluol- sulfonyl-L-ornithin und 27 g Glycin-äthylester in 450 ccm Acetonitril, kühlt bei 0 , gibt 51 g Dicyclohexyl-carbodiimid zu und schüttelt 4 Stunden bei Zimmertemperatur. Der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und mit Acetonitril gewaschen. Das gesamte Filtrat wird im Vakuum abgedampft. Der Rückstand kristallisiert nach Zugabe von Petroläther. Nach Umkristallisation aus n-Propanol erhält man 93 g N-a-Carbobenzoxy-N--p4eluolsul- fonyl-L-ornithyl-glycin-äthylester; Smp. 136".
La]2 = -7" (960/oiger Äthanol). b) N-Carbobenzoxy-L-prolyl-N-o-p-toluolsul- fonyl-L-ornithyl-glycin-amid
90 g N-a-Carbobenzoxy-N-d-p-toluolsulfonyl-L- ornithyl-glycin-äthylester werden in 800 ccm mit Bromwasserstoff gesättigter, wasserfreier Essigsäure gelöst. Man lässt eine Stunde stehen bei 20 , verdampft im Vakuum unterhalb 40 und wäscht den Rückstand sorgfältig mit Diäthyläther nach.
Man löst den Rückstand in 500 ccm Acetonitril, gibt 25 ccm Triäthylamin und 43 g N-Carbobenzoxy-L-prolin zu, kühlt bei 0 , fügt noch 35,5 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzu und schüttelt über Nacht bei 20 . Nach dem Abfiltrieren des Dicyclohexylharnstoffes wird das Filtrat im Vakuum bei 300 eingedampft, der Rückstand in Essigester gelöst und diese Lösung mit verdünnter Schwefelsäure und wässerigem Ammoniak gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat wird der Essigester im Vakuum abgedampft und der Rückstand in 1 Liter absolutem Äthanol gelöst. Die Lösung wird bei 0 gekühlt, mit Ammoniak gesättigt und über Nacht bei 20 stehengelassen.
Nach dem Eindampfen im Vakuum bei 30 wird der Rückstand in 100 ml Dimethylformamid gelöst und durch Zugabe von 1500 ml Essigester kristallisiert. Man erhält 66 g N-Carbobenzoxy-L-prolyl-N-a-p-toluolsulfonyl- L-ornithyl-glycidamid ; Smp. 122" (Zers).
[a] D22 = -46" (950/oiger Eisessig). c) N- Carbobenzoxy-L-glutaminyl-Lasparaginyl-
S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-d-p-toluolsul- fonyl-L-ornithyl-glycinamid
Man löst 100 g N-Carbobenzoxy-L-prolyl-N-d-p- toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycinamid in 500 ccm mit Bromwasserstoff gesättigter, wasserfreier Essigsäure, lässt während 1 Stunde bei 200 stehen und verdampft im Vakuum unterhalb 40". Der Rückstand wird mit Diäthyläther sorgfältig gewaschen und hierauf zu einer Lösung von 100 g N-Carbobenzoxy-L-glut aminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-azid [Boissonnas & coll., Helv. chim. Acta, 38, 1491 (1955)] und 26 ccm Triäthylamin in 1000 ccm Dimethylformamid zugegeben.
Man lässt über Nacht bei 20 stehen, gibt 3000 ccm Essigester hinzu, filtriert den Niederschlag ab und wäscht mit Essigester. Man erhält 105 g N-Carbobenzoxy-L-glut aminyl-L-aspara ginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-o-p-toluolsul- fonyl-Lornithyl-glycinamid; Smp. 188 (Zers.).
[a] = 330 (Dimethylformamid). d) N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L- phenylalanyl-L-isoleucyl-L-glutaminyl-L- asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl N-d-p-toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycinamid
Man löst 50 g N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L asparaginyl-S- benzyl-l-cysteinyl -L-prolyl-N-8 -p- toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycinamid in 250 ccm mit Bromwasserstoff gesättigter, wasserfreier Essigsäure und lässt während 1 Stunde bei 20 stehen.
Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum unterhalb 40 wird der Rückstand mit Diäthyläther sorgfältig gewaschen und mit einer Lösung von 31,1 g N-Carbobenzoxy-S- benzyl-l- cysteinyl-l- phenylalanyl-L-isoleucyl-azid und 7,5 ccm Triäthylamin in 250 ccm Dimethylformamid versetzt. Man lässt 2 Tage bei 200 stehen, versetzt hierauf mit 1000 ccm Essigester und wäscht den Niederschlag mit Essigester. Nach dem Trocknen im Vakuum bei 300 wird das Produkt mit warmem Methanol gewaschen.
Man erhält 45 g N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L cysteinyl - L- phenylalanyl-L-isoleucyl-L-glutaminyl-L- asparaginyl-S -benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-N-8-p- toluolsulfonyl-L-omithyl-glycinamid. Smp. 242". a]21 = (Dimethylformamid).
e) L-Cysteinyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-L glutaminyl-L-asparaginyl-L-cysteinyl-L-prolyl-
L-ornithyl-glycinamid
Man versetzt eine Lösung von 5 g N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl L-glutaminyl-l- asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L- prolyl-N-d-p-toluolsulfonyl-L-ornithyl-glycinamid in 1200 ccm trockenem flüssigem Ammoniak unter Rühren bei der Siedetemperatur der Lösung mit so viel Natrium- oder Kaliummetall, bis eine beständige blaue Färbung eingetreten ist. Nach Zugabe von 3 g Ammoniumchlorid wird die Lösung zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand enthält das L-Cysteinyl-L phenylalanyl-L-isoleucyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl- L-cysteinyl-L-prolyl-L-ornithyl-glycinamid. f) Polypeptidverbindung I
Der Rückstand, enthaltend L-Cysteinyl-L-phenyl alany-l-isoleucyl- L-glutaminyl-L- asparaginyl-l- cysteinyl-L-prolyl-L-ornithyl-glycinamid, wird in fünf Liter 0,01-n Essigsäure gelöst und bei einem pH von 6,5-8,0 durch Einleiten von Luft oder Sauerstoff während 1 Stunde bei 0-40 oxydiert. Man bringt die Lösung, die die Substanz enthält, auf einen pH von 4,0-5,0 und dampft nach Zusatz von 50 g Natriumchlorid oder von 0,64 g Methansulfonsäure zur Trockne ein, wobei ein trockenes Pulver erhalten wird, das gut haltbar ist.
Es kann aufbewahrt werden und bei Gebrauch klar gelöst werden. Man kann jedoch auch die Lösung direkt verwenden, eventuell nach Verdünnen mit Wasser oder einer Salzlösung.
Beispiel 2:
Man verfährt wie in Beispiel 1. Man oxydiert aber am Ende bei 0-10 durch Zusatz von 7,5 ccm einer l-n Lösung von Wasserstoffperoxyd in Wasser bei einem pH von 4,0-9,0 (anstatt der Oxydation durch Einleiten von Luft oder Sauerstoff).
Beispiel 3:
Man verfährt wie in Beispiel 1. Man oxydiert aber am Ende bei 0-350 durch Zusatz von 6,7 ccm l-n Lösung von Kalium-Ferricyanid in Wasser bei einem pH von 5,5-7,5.
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