DE1493878B2 - Acylierte Peptidderivate, Verfahren zur Herstellung derselben und pharmazeutische Präparate, welche solche acylierte Peptidderivate enthalten - Google Patents

Description

CH₂

C₆H₅

CH,

X — Y — NH■CH·CO·NH·CH·CO·NH·CH·CO·NH·CH·CO·OR⁶

oder einem geschützten Derivat davon umsetzt, worin R⁶ ein niedriges Alkyl- oder Benzylradikal bedeutet, worauf sich eine Hydrogenolyse und/oder Hydrolyse anschließt, um gegebenenfalls vorliegende Schutzgruppen durch Wasserstoff zu ersetzen; wobei X und Y die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen.

4. Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Verbindung nach Anspruch 1 und ein pharmazeutisch zulässiges Träger- oder Verdünnungsmittel enthält.

Die Erfindung bezieht sich auf acylierte Peptidderivate, welche eine Stimulierung der Sekretion des sauren Magensafts bei Säugern hervorrufen.

Das Maß des Säureausstoßes eines Patienten ist wichtig bei der Bestimmung der Magenfunktion. Bisher wurde diese Messung dadurch ausgeführt, daß dem Patienten Histamin injiziert wurde und daß dann der Magensaft über einen Katheter gesammelt wurde. Die Dosis des verwendeten Histamins mußte ziemlich groß sein, nämlich 40 μg/kg. Es war deshalb immer nötig eine Antihistamindroge gleichzeitig zu verabreichen, um seine Nebeneffekte zu verringern.

Die Sekretion des sauren Magensaftes kann auch durch das natürliche Hormon Gastrin stimuliert werden. Die Verwendung von Gastrin zur Stimulierung der Magensäuresekretion ist aber nur von akademischem Interesse, da Gastrin aus natürlichen Quellen isoliert werden muß, und deshalb unverhältnismäßig teuer ist.

Es wurde nunmehr gefunden, daß gewisse acylierte Derivate von L-Tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid die Eigenschaften besitzen, die Sekretion des sauren Magensaftes in ähnlicher Weise wie das natürliche Hormon Gastrin zu stimulieren. Diese Verbindungen besitzen alle Eigenschaften von Gastrin und können somit z. B. an Stelle von Gastrin als diagnostische Mittel für die Bestimmung der Magenfunktion verwendet werden. Im allgemeinen sind sie nur geringfügig weniger wirksam als Gastrin.

Gegenstand der Erfindung ist also ein acyliertes Peptidderivat der Formel

CH₂ · SCH₃ COOH

CH,

CH,

QH₅
CH,

NH■CH·CO·NH·CH·CO·NH·CH·CO■NH■CH·CO·NH,

worin Y direkte Bindung und X ein Acylradikal aus der Gruppe Acetyl, Benzoyl, t.-Butyloxycarbonyl und Benzyloxycarbonyl; oder ein Aminoacyl oder Acylaminoacylradikal, wobei das Aminoacylradikal ausgewählt ist aus L-Alanyl, N-Methyl-L-alanyl, /J-Alanyl, Glycyl, L-Prolyl, S-Benzyl-homocysteinyl oder Pyroglutamyl und das Acylradikal ausgewählt ist aus den oben definierten Acylradikalen; oder Pivaloyl-ß-alanyl, N - 2 - Äthylhexanoylglycyl, ρ - Trifluoroacetylaminobenzoyl, ρ - Toluolsulfonyl, Carbamoyl, Acetyl- γ - aminobutyryl, Ν^ε - Benzyloxycarbonyl - L - lysyl, Ν"- Benzyloxycarbonyl - L - lysyl, W-1. - Butyloxycarbonyl-N^e-benzyloxycarbonyl-L-lysyl oder N^a-Benzyloxycarbony 1 - Ν^ε - (4 - chloro - 6 - dimethylaminotriazin-2-yl) - L - lysyl; oder Y L - Glutamyl - L - glutamyl -L alanyl-L-tyrosylglycyl, L-Alanyl-L-tyrosylglycyl oder L-Alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucylglycyl und X t.-Butyloxycarbonyl oder Benzyloxycarbonyl.

Das Salz eines acylierten Tetrapeptidderivats nach der Erfindung ist zweckmäßig ein Alkalimetallsalz, wie z. B. ein Natrium- oder Kaliumsalz, oder ein Ammoniumsalz.

Als bestimmte Beispiele für das durch X—Y— dargestellte Radikal kann man folgende Radikale nennen: N-Benzoylglycyl, Pyroglutamyl, N-Acetyl, N-Benzoyl, N"-tert.-Butyloxycarbonyl-N^e-benzyloxycarbonyl-L-lysyl, N-Benzyloxycarbonylglycyl, N-Benzyloxycarbonyl, N-tert.-Butyloxycarbonylglycyl, Glycyl, N - Benzyloxycarbonyl - L - glutamyl - L - glutamyl - L-alanyl - L - tyrosylglycyl, N - tert. - Butyloxycarbonyl, N-tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl, N-(L-2-Äthylhexanoyl) - glycyl, N - (d - 2 - Äthylhexynoyl)glycyl, N - ρ - (Trifluoracetylamino)benzoyl, N - Acetyl - ßalanyl, N"-Benzyloxycarbonyl- N^£-(4-chlor-6-dimethylaminotriazin-2-yl)-L - lysyl, N- tert. - Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucylglycyl, ,., N-BenzyloxycarbonyJ-L-prolyl, N-p-Toluolsulfonyl, N-tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-homocysteinyl, N - tert. - Butyloxycarbonyl - N - methyl - L - alanyl,

. N - Benzoyl - β - alanyl, N - Acetyl - γ - aminobutyryl, N-Carbamoyl, /3-AIanyl, N"-Benzyloxycarbonyl-L-lysyl, Ν^ε - Benzyloxycarbonyl - L - lysyl, S - Benzyl - L-. homocysteinyl, N - Benzyloxycarbonyl - β - alanyl, N - Pivaloyl - ß- alanyl, N - tert. - Butyloxycarbonyl - L-

alanyl und N - tert. - Butyloxycarbonyl - L - alanyl-L-tyrosylglycyl.

Besonders zweckmäßige acylierte Tetrapeptidderivate nach der Erfindung sind N-tert.-Butyloxycarbonyl -L- alanyl - L - phenylalanyl - l - isoleucylglycyl-, N-Acetyl-, N-Benzoyl-, N-tert.-Butyloxycarbonyl-L - alanyl, N - tert. - Butyloxycarbonyl - β - alanyl-, N - Pivaloyl - β - alanyl-, N - Benzyloxy - carbonyl - ßalanyl-, N - Acetyl - β - alanyl-, N -β- Alanyl- und N - Carbamoyl -L- tryptophenyl - L - methionyl - L-aspartyl - L - phenylalaninamid, wovon das erste, zweite, fünfte, sechste und letzte besonders bevorzugt sind.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können dadurch hergestellt werden, daß man

a) ein Tetrapeptid der Formel

CH₂SCH₃ COOH

C₆H₅

HN

H₂N · CH · CO · NH ■ CH · CO ■ NH · CH ■ CO · NH · CH · CO ■ NH₂

oder ein Salz davon mit einem Derivat einer Säure Hydrogenolyse und/oder Hydrolyse anschließt, um der Formel X—Y—OH, worin die Säurefunktion gegebenenfalls vorliegende Schutzgruppen durch aktiviert ist, oder mit einem geschützten Derivat Wasserstoff zu ersetzen; oder daß man davon oder mit einem Cyansäurederivat acyliert, 25 c) ein Derivat einer Säure der Formel

worauf sich eine Hydrogenolyse und/oder Hydrolyse anschließt, Um gegebenenfalls vorliegende Schutzgruppen durch Wasserstoff zu ersetzen; oder daß man

b) ein Derivat einer Säure der Formel

HN

CH₂
X —Y-NH CH COOH

HN

CH,

CH₂SCH₃
CH,

X — Y — NH·CH·CO■NH■CH·COOH

35 worin die Säurefunktion aktiviert ist, oder ein geschütztes Derivat davon mit einem Dipeptidamid der Formel

worin die Säurefunktion aktiviert ist, oder ein geschütztes Derivat davon mit einem Tripeptidamid der Formel

40 COOH

CH₂

C₆H₅

CH,

CH₂ ■ SCH₃ COOH

C₆H₅

45 NH, · CH · CO · NH · CH · CO ■ NH,

CH₂ CH₂ CH₂

I I oder einem Salz davon umsetzt, worauf sich eine

NH₂ · CH · CO · NH · CH · CO · NH · CH ■ CO · NH₂ 50 Hydrogenolyse und/oder Hydrolyse anschließt, um

gegebenenfalls vorliegende Schutzgruppen durch Wasserstoff zu ersetzen; oder daß man oder einem Salz davon umsetzt, worauf sich eine d) Ammoniak mit einem Ester der Formel

hn

CH,

CH₂ · SCH₃

CH,

COOH

CH₂

QH₅
CH,

X — Y — NH■CH·CO·NH■CH·CO■NH·CH·CO■NH·CH■CO·OR⁶

oder einem geschützten Derivat davon umsetzt, worin R⁶ ein niedriges Alkyl- oder Benzylradikal bedeutet, worauf sich eine Hydrogenolyse und/oder Hydrolyse anschließt, um gegebenenfalls vorliegende Schutzgruppen durch Wasserstoff zu ersetzen, wobei X und Y die oben angegebenen Bedeutungen besitzen.

Als geschützte Derivate der Säuren der Formeln X—Y — OH,

HN

CH₂

X-Y-NH · CH · COOH
und

HN

CH₂ · SCH₃
CH₂ CH₂

X — Y — NH■CH·CO·NH·CH·COOH

worin X und Y die oben angegebenen Bedeutungen *J ■ haben, können an sich bekannte geschützte Derivate verwendet werden. Zum Schützen von Aminogruppen kann man also z. B. das Benzyloxycarbonyl-, das p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, das tert.-Butyloxycarbonyl- oder das Trifluoracetylradikal verwenden, während zum Schützen von Carboxylgruppen das Methyl-, das tert.-Butyl- oder das Benzylradikal (Esterbildung) verwendet werden kann. Solche Schutzgruppen können in an sich bekannter Weise entfernt werden.

Als Derivate der Säuren der letztgenannten drei Formeln, bei denen die Säurefunktion aktiviert ist, ! können Derivate verwendet werden, die nach an sich bekannten Aktivierungsmethoden gebildet werden. Solche Methoden sind z. B. Bildung eines Säurehalogenids, z. B. des Säurechlorids; Bildung eines gemischten Anhydrids durch Reaktion mit einem Derivat einer sterisch gehinderten organischen Säure, wie z. B. Pivaloylchlorid, oder durch Reaktion mit einem Derivat der Kohlensäure, wie z. B. Äthylchlorformat, ■ oder durch Reaktion mit Diphenylphosphorylchlorid; /jj>, Bildung eines aktiven Esters, wie z. B. eines Nitrophenylesters, wie des p-Nitrophenylesters, oder eines chlorierten Phenylesters, wie des 2,4,5-Trichlorphenylesters; oder Bildung eines Azids; oder der Verwendung eines oder mehrerer Kondensierungsmittel, wie z. B. HN'-Dicyclohexylcarbodiimid oder N,N'-Carbonylbis-imidazol.

Das jeweils zu verwendende Derivat einer eine aktivierte Säurefunktion aufweisenden Säure hängt von der Säure selbst ab. Wenn also die Säurefunktion nicht an einem asymmetrischen Kohlenstoffatom angebunden ist oder wenn sie an asymmetrischen Kohlenstoffatomen einer Aminosäure, bei welcher dieAminogruppe durch ein Oxycarbonylradikal unter Bildung eines Radikals der Formel —O · CO ■ NH— acyliert ist, gebunden ist, so kann jede der erwähnten Methoden angewandt werden. Ist aber die Säurefunktion am asymmetrischen Kohlenstoffatom einer Aminosäure angebunden, bei welcher die Aminogruppe durch eine Gruppe geschützt ist, die aber kein Radikal der Formel — O · CO · NH- bildet, so stellt die Bildung des Azids die bevorzugte Methode dar.

Wenn das als Reaktionsteilnehmer verwendete Säurederivat ein Säurehalogenid, wie z. B. das Säurechlorid oder -bromid, z. B. Benzyloxycarbonylchlorid, Acetylchlorid, Benzoylchlorid oder p-Toluolsulfonylchlorid ist, so kann die Reaktion zweckmäßig in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 9 bis 10 in Gegenwart von einem säurebindenden Mittel wie Natriumhydroxyd oder Triathylamin durchgeführt werden. Wenn das als Reaktionsteilnehmer verwendete Säurederivat ein aktives Ester wie der p-Nitrophenylester oder der 2,4,5-Trichlorphenylester, oder das Azid oder ein gemischtes Anhydrid ist, so kann die Reaktion zweckmäßig in Gegenwart eines Verdünnungs- oder Lösungsmittels und einer Base, wie Triathylamin, bei etwa O bis 10⁰C durchgeführt werden. Wenn ein freies Peptid als Reaktionsteilnehmer verwendet wird, so braucht man höchstens einen äquivalenten Anteil der Base anzuwenden. Wenn aber ein Peptid als Reaktionsteilnehmer in Form eines Salzes, wie z. B. des Trifluoracetats, verwendet wird, so werden vorzugsweise ein bis zwei äquivalente Anteile der Base angewandt.

Die Reaktion bei der Verfahrensvariante d) kann zweckmäßig in Gegenwart eines Verdünnungs- oder Lösungsmittels, wie z. B. Methanol, und bei —10 bis + 5O⁰C durchgeführt werden.

Das als Ausgangsstoff verwendete Tetrapeptid kann dadurch hergestellt werden, daß ein /i-Ester des L-Aspartyl-L-phenylalaninamids mit einem Derivat des L-Methionins zur Reaktion gebracht wird, wobei sich ein ß-Ester des L-Methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamids ergibt, der dann mit einem Derivat des L-Tryprophans zur Reaktion gebracht wird, worauf das entstehende Produkt hydrolysiert wird, um dabei das Tetrapeptid zu bilden.

Das als Ausgangsstoff verwendete Tripeptidamid kann aus einem geschützten Derivat des L-Methionins und L-Aspartyl-L-phenylalanins hergestellt werden, wobei die letztere Verbindung aus einem geschützten Derivat der Asparaginsäure und Phenylalaninamid erzeugt werden kann.

Die Verbindung der Formel

HN

X —Y —NH · CH · COOH

worin X und Y die oben angegebenen Bedeutungen haben, kann durch Acylierung von L-Tryptophan mit einem Derivat der Säure X—Y — OH erzeugt werden, wobei die Säurefunktion aktiviert ist und X und Y die oben angegebenen Bedeutungen haben.

Die als Ausgangsstoff verwendete Verbindung der Formel

HN

CH₂ · SCH₃

CH₂ CH₂

X —Y — NH·CH·CO·NH·CH·COOH

worin X und Y die oben angegebenen Bedeutungen

509 517/400

haben, kann durch Acylierung von L-Tryptophanyl-L-methioninmethylester mit der Säure X—Y—OH in der oben beschriebenen Weise und anschließender Herstellung der Säure oder des aktivierten Derivats davon erzeugt werden.

Das als Ausgangsstoff verwendete Ester der Formel

HN

CH₂ · SCH₃

COOH C₆H₅

CH₂ CH₂ CH₂ CH₂

X — Y — NH·CH·CO·NH·CH■CO■NH■CH■CO·NH·CH■COOR⁶

worin X, Y und R⁶ die oben angegebenen Bedeutungen haben, kann durch Reaktion eines acylierten Derivats des L-Tryptophanyl-L-methionins mit einem Ester des L-Aspartyl-L-phenylalanins oder durch Reaktion eines acylierten Derivats des L-Tryptophans mit einem Ester des L-Methionyl-L-aspartyl-L-phenylalanins erzeugt werden.

Wie oben angegeben, sind die acylierten Tetrapeptidderivate nach der Erfindung als diagnostische und therapeutische Mittel verwendbar. Sie wirken insbesondere auf die Sekretion von Magensaft und Bauchspeichel, auf Magen- und Darmtonus sowie auf Bewegungsfähigkeit und Pepsinprodukten bei Säugern. Sie können deshalb bei Menschen als diagnostische Mittel und als Mittel zur Behandlung von Magen- und Duodenalgeschwüren sowie paralytischem Heus angewandt werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin pharmazeutische Präparate, die aus einem oder mehreren der acylierten Tetrapeptidderivate nach der Erfindung in Mischung mit einem oder mehreren nichtgiftigen pharmazeutisch zulässigen Verdünnungsmitteln oder Trägern bestehen.

Die erfindungsgemäßen Präparate können in an sich bekannter Weise mit bekannten Arzneimittelträgern hergestellt werden. Als Beispiele für solche Massen sollen gegebenenfalls überzogene Tabletten, Kapseln, wäßrige oder nichtwäßrige Lösungen oder Suspensionen, Emulsionen, wäßrige oder nichtwäßrige injizierbare Lösungen oder Suspensionen, dispergierbare Pulver und Depotmassen erwähnt werden. Die wäßrigen Lösungen können auch Dimethylsulfoxyd und/oder Natriumchlorid enthalten.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert, worin alle Mengenangaben auf das Gewicht bezogen sind.

B e i s ρ i e 1 1

Eine Lösung von 178 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamidtrifluoracetat (Schmp. 185—190⁰C mit Aufsprudeln) in 2000 Teilen Dimethylformamid wird auf 0⁰C gekühlt, worauf 50,5 Teile Triäthylamin zugegeben werden. Die Mischung wird gerührt, und 90 Teile Hippursäure-2,4,5-trichlorphenylester werden bei 0⁰C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird dann 48 Stunden auf 0⁰C gehalten. Der pH-Wert des Gemisches wird auf 1 durch tropfenweise Zugabe von einer 2n-Salzsäurelösung eingestellt, worauf 5000 Teile Eiswasser und 5000 Teile Äther zugesetzt werden. Die Mischung wird 15 Minuten bei 0⁰C gerührt und anschließend gefiltert. Der feste Rückstand wird mit Wasser gewaschen, und nach nochmaligem Waschen mit Äther wird er unter vermindertem Druck bei 40 bis 50° C getrocknet. Somit erhält man N-Benzoylglycyl-L-tryptophanyl - L - methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamid (Schmp. 237—238°C mit Zersetzung). Das Produkt kann aus Äthanol umkristallisiert werden, wobei es in Form von weißen, flockenartigen Nadeln absondert.

Das dabei verwendete Hippursäure-2,4,5-Trichlorphenylester kann wie folgt erzeugt werden: 179 Teile Hippursäure und 217 Teile 2,4,5-Trichlorphenol werden zu 2000 Teilen kochenden Acetonitril zugesetzt. Die entstehende Suspension wird rasch auf 30"C abgekühlt, worauf 206 Teile Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben werden. Die Mischung wird 3 Stunden bei 20 bis 30⁰C ununterbrochen gerührt und anschließend 5 Minuten gekocht. Die heiße Mischung wird gefiltert, und das Filtrat wird abgekühlt. Das aus dem Filtrat ausscheidende farblose Produkt wird abgefiltert und aus Äthanol umkristallisiert. Somit erhält man Hippursäure-2,4,5-trichlorphenylester (Schmp: 148—149⁰C).

Das als Ausgangsstoff verwendete L-Tryptophanyl-L - methionyl -L- phenylalaninamidtrifluoracetat (Schmp. 185—190⁰C) kann wie Beispiel 1 oder 2 der britischen Patentanmeldung 26352/64 hergestellt werden.

Beispiel 2

Bei Wiederholung von Beispiel 1 werden die 90 Teile Hippursäure-2,4,5-trichlorphenylester durch 78Teile L-Pyroglutaminsäure-2,4,5-trichlorphenylester ersetzt. Somit erhält man L-Pyroglutamyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid (Schmp. 232° C mit Zersetzung).

Das dabei verwendete L-Pyroglutaminsäure-2,4,5-trichlorphenylester kann wie folgt hergestellt werden: 206 Teile HN'-Dicyclohexylcarbodiimid werden in eine gerührten Lösung von 263 Teilen N-Benzyloxycarbonyl - L - pyroglutaminsäure und 198 Teilen 2,4,5-Trichlorphenol in 1000 Teilen trockenen Tetrahydrofurans bei 0—10⁰C hineingegeben. Die Mischung wird 16 Stunden auf 0⁰C gehalten und anschließend gefiltert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft, und der Rückstand wird aus Äthanol umkristallisiert. Somit erhält man N-Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutaminsäure-2,4,5-trichlorphenylester (Schmp. 107—108⁰C), wovon 443 Teile in 4000 Teilen Tetrahydrofuran gelöst werden, und die entstehende Lösung mit 50 Teilen eines 5%igen Palladium-auf-Holzkohle-Katalysators verrührt wird, während Wasserstoff bei 18—22°C unter Atmosphärendruck in die Mischung eingeblasen wird, bis die Entwicklung von Kohlendioxyd aufhört. Das Reaktionsgemisch wird dann zum Abtrennen des Katalysators gefiltert, worauf das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft wird. Der so erhaltene Rückstand wird, aus Methanol umkristallisiert.

Somit erhält man L-Pyroglutamyl-2,4,5-trichlorphenylester (Schmp. 162—163°C).

Beispiel 3

Bei Wiederholung von Beispiel 1 werden die 90 Teile Hippursäure-2,4,5-trichlorphenylester durch 46 Teile p-Nitrophenylacetat ersetzt. Somit erhält man N^a-Acetyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid als weißen Feststoff (Schmp. 245—246° C mit Aufsprudeln).

Beispiel 4

Bei Wiederholung von Beispiel 1 werden die 90 Teile Hippursäure-2,4,5-trichlorphenylester durch 61 Teile p-Nitrophenylbenzoat ersetzt. Somit erhält man N^-Benzoyl-L-tryptophenyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid als weißen Feststoff (Schmp. 228—230° C mit Aufsprudeln).

Beispiel 5

¹^

Bei Wiederholung von Beispiel 1 werden die 90 Teile Hippursäure-2,4,5-trichlorphenylester durch 140 Teile N¹¹ - tert. - Butyloxycarbonyl - N^c - benzyloxycarbonyl-L-lysin-2,4,5-trichlorphenylester ersetzt. Somit erhält man N^a - tert. - Butyloxycarbonyl - Ν^ε - benzyloxycarbonyl-L-lysyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid als weißen Feststoff (Schmp. 207—208°C mit Aufsprudeln).

Beispiel 6

Bei Wiederholung von Beispiel 1 werden die 90 Teile Hippursäure-2,4,5-trichlorphenylester durch 140 Teile N" - Benzyloxycarbonyl - Ν^ε - tert. - butyloxycarbonyl-L-lysin-2,4,5-trichlorphenylester ersetzt. Somit erhält man N" - Benzyloxycarbonyl - Ν^ε - tert. - butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid als weißen Feststoff (Schmp. 216—217° C mit Aufsprudeln).

Beispiel 7

40

Bei Wiederholung von Beispiel 1 werden die 90 Teile Hippursäure-2,4,5-trichlorphenylester durch 97 Teile N - Benzyl oxycarbonylglycin - 2,4,5 -1 richlorphenylester ersetzt. Somit erhält man N-Benzyloxycarbonylglycyl-L - tryptophanyl - L - methionyl - L - aspartly - L - phenylalaninamid als weißen Feststoff. (Festgestellte Analyse: C = 59,6%, H = 6,0%, N = 12,3%. Theoretische Analyse für C₃₉H₄₅O₉N₇S: C = 59,3%, H = 5,75%, N= 12,5%). Die Reinheit des Produkts wird durch Hydrolyse einer kleinen Probe mit 6 n-Salzsäurelösung bestätigt. Das entstehende Hydrolysat wird an Hand eines Beckmannschen Aminosäure-Analysator geprüft, wobei die folgenden Aminosäureverhältnisse festgestellt werden: Asparaginsäure 1,00; Glycin 1,02; Methionin 0,87; Phenylalanin 1,00.

Beispiel 8

Es werden 1250 Teile Wasser in eine Lösung von 20 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamidtrifluoracetat in 1600 Teilen Aceton hineingegeben. Der pH-Wert der Mischung wird dann auf 10,9 durch anteil weise Zugabe von n-Natriumhydroxydlösung eingestellt. Dann werden 45,4 Teile Benzyloxycarbonylchlorid zugegeben, und die so erhaltene Reaktionsmischung wird 1,5 Stunden bei 18—25° C gerührt, während der pH-Wert der Mischung durch anteilweise Zugabe von n-Natriumhydroxydlösung mittels eines selbsttätigen Titrierapparat auf 10,9 gehalten wird. Das Aceton wird dann zum größten Teil unter vermindertem Druck abgedampft, und die entstehende Mischung wird gefiltert. Der feste Rückstand wird zuerst mit Wasser gewaschen und dann mit Äthylacetat und 2n-Salzsäurelösung verrührt. Die Äthylacetatschicht wird abgetrennt und 3mal mit Wasser gewaschen, worauf sie über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann eingedampft wird. Der Verdampfungsrückstand wird in Äther suspendiert und anschließend abfiltert. Somit erhält man N-Benzoyloxycarbonyl-L - tryptophanyl - L - methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamid als weißen Feststoff. Bei der Analyse mittels Dünnschichtchromatographie unter Anwendung von Silikagel als Adsorbens und von einem Lösungssystem, bestehend aus der oberen Phase einer Mischung von 25 Teilen n-Butanol, 6 Teilen Essigsäure und 25 Teilen Wasser, ließ das Ehrlich-Reagens einen einzigen Fleck von R_F0,93 erscheinen.

Beispiel 9

Eine Lösung von 240 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamidtrifluoracetat in 2500 Teilen Dimethylformamid wird auf 0⁰C gekühlt, worauf 68,5 Teile Triäthylamin zugegeben werden. Die Mischung wird gerührt, und 123 Teile N-tert.-Butyloxycarbonylglycyl^AS-trichlorphenylester werden bei 0⁰C zugegeben. Die Mischung wird dann 60 Stunden auf 18—22°C gehalten. Es werden dann 60000 Teile Äthylacetat und 20000 Teile 2n-Salzsäurelösung zugegeben, worauf die Mischung 5 Minuten gerührt wird. Die Äthylacetatschicht wird abgetrennt und mit Wasser gewaschen. Sie wird dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der feste Rückstand wird mit 5000 Teilen Äthylacetat verrührt und dann abgefiltert. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonylglycyl - L - tryptophanyl -L- methionyl - L-aspartyl-L-phenylalaninamid als farblosen amorphen Pulver (festgestellte Analyse: C = 57,4%, H = 6,6%; N= 13,2%; theoretische Analyse für C₃₆H₄₇O₉N₇S: C = 57,3%; H = 6,3%; N = 13,0%).

Beispiel 10

Es werden 100 Teile N-tert.-Butyloxycarbonylglycyl - L - tryptophanyl -L- aspartyl -L- phenylalaninamid mit 3000 Teilen einer 75%igen wäßrigen Trifluoressigsäurelösung bei 15—20⁰C verrührt. Die entstehende Lösung wird 20 Minuten auf 20—25°C gehalten. Der Überschuß an Trifluoressigsäure wird dann unter vermindertem Druck bei einer unter 37°C liegenden Temperatur abgedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in Methanol aufgelöst, worauf das Methanol unter vermindertem Druck wieder bei einer unter 37° C liegenden Temperatur abgedampft wird. Der Rückstand wird wieder in Methanol aufgelöst, und das Methanol wird unter den gleichen Bedingungen abgedampft. Der Verdampfungsrückstand wird nunmehr mit Äther verrührt und anschließend abgefiltert. Somit erhält man Glycyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid als einen farblosen, amorphen Feststoff.

Beispiel 11

Es werden 102 Teile N-Benzyloxycarbonyl-(y-tert.-butyl) - L - glutamyl - (γ - tert. - butyl) - L - glutamyl - L-alanyl-L-tyrosylglycin in 10000 Teilen Dimethylformamid aufgelöst, und die entstehende Lösung wird auf

14 93 Ö78

0°C abgekühlt. Anschließend werden zuerst 12,6 Teile Triäthylamin und dann 33,5 Teile Diphenylphosphorylchlorid bei 0⁰C unter Rührung zugegeben, und die entstehende Mischung wird weitere 40 Minuten bei 0⁰C gerührt. Dann wird eine Lösung von 87 Teilen· L - Tryptophanyl - L - methiony 1 - L - aspartyl - L - phenylalaninamidtrifluoracetat in 5000 Teilen Dimethylformamid und 25,2 Teilen Triäthylamin zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird 18 Stunden bei 18—22°C gerührt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem ,Druck abgedampft, und der Rückstand wird mit Äthylacetat verrührt. Die Mischung wird gefiltert, und der feste Rückstand (Schmp. 220⁰C mit Zersetzung) wird mit Äthylacetat gewaschen und anschließend unter vermindertem Druck bei 40°C getrocknet. Es werden dann 30 Teile dieses Produkts in 300 Teile einer 95%igen wäßrigen Trifluoressigsäurelösung unter Rührung bei 15—20⁰C hineingegeben. Die Lösung wird 1 Stunde auf 20—25°C gehalten, worauf das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft wird. Der Rückstand wird mit Methanol verrührt, abgefiltert und unter vermindertem Druck bei 40⁰C getrocknet. Somit erhält man N-Benzyloxycarbonyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-alanyl-L-tyrosylglycyl-L-tryptophanyl-L-methionyl- L-aspartyl-L-phenylalaninamid als einen farblosen Feststoff. Bei Elektrophorese bei einem pH-Wert von 6,1 bewegte sich eine Probe des Produkts gegen die Anode als ein Einzelfleck.

Beispiel 12

Eine Lösung von 3,55 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamidtrifluoracetat in 30 Teilen Dimethylformamid wird auf 0⁰C gekühlt, worauf 1,01 Teile Triäthylamin zugegeben werden. Die Mischung wird gerührt, während 1,84 Teile N - tert. - Butyloxycarbonyl - β - alanin - 2,4,5-trichlorphenylester bei O⁰C zugesetzt werden. Das Reaktionsgemisch wird 48 Stunden auf 0⁰C gehalten und dann 24 Stunden auf 20—23°C erwärmt. Die Mischung wird dann zu 100 Teilen Eiswasser,0,37 Teilen konzentrierten Salzsäure (Dichte = 1,18), 1,2 Teilen Essigsäure und 20 Teilen Äthylacetat zugegeben. Die entstehende Mischung wird 15 Minuten bei 0—10⁰C gerührt und dann gefiltert. Der feste Rückstand wird mit Wasser und dann mit Äthylacetat gewaschen und anschließend unter vermindertem Druck bei 40—50°C getrocknet. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid (Schmp. 213° C mit Zersetzung).

Das als Ausgangsstoff verwendete N-tert.-Butyloxycarbonyl - ß-alanin- 2,4,5 - trichlorphenylester (Schmp. 94—95⁰C) kann durch Wiederholung des Verfahrens gemäß Beispiel 15 zur Herstellung von N-Acetyl- ^-alanin-2,4,5-trichlorphenylester unter Anwendung von 9,5 Teilen N-tert.-Butyloxycarbonyl-/i-alanin an Stelle der 6,55 Teile N-Acetyl-/?-alanin erzeugt werden.

B e i s ρ i e 1 13 ,

Bei Wiederholung von Beispiel 12 werden die 1,84 Teile N-tert.-Butyloxycarbonyl-//-alanin-2,4,5-trichlorphenylester durch 1,6 Teile N-(DL-2-Äthylhexanoyl)glycin-p-nitrophenylester ersetzt. Somit erhält man eine Mischung von N-(L-2-Äthylhexanoyl)- und N-(D- 2 -Äthylhexanoyl) - glycy 1 - l - try ptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid (Schmp. 228—230° C mit Zersetzung).

Das als Ausgangsstoff verwendete N-(DL-2-Äthylhexanoyl)-glycin-p-nitrophenylester (Schmp. 135 bis 136°C) kann von N-(DL-2-Äthylhexanoyl)glycin, p-Nitrophenol und N^N'-Dicyclohexylcarbodiimid nach dem Verfahren gemäß P 1 e s s und Boissonnas in HeIv. Chim. Acta., 1963, Bd. 46, S. 160, erzeugt werden.

Beispiel 14

Bei Wiederholung von Beispiel 12 werden die 1,84 Teile N- tert. - Butyloxycarbonyl - β - alanin - 2,4,5-trichlorphenylester durch 2,06 Teile N-p-(Trifluoracetylamino)benzoesäure-2,4,5-trichlorphenylester ersetzt. Somit erhält man N-p-(Trifluoracetylamino) benzoyl - L - tryptophanyl -L- methiony 1 - l - aspartyl - lphenylalaninamid (Schmp. 229—231⁰C mit Zersetzung), das aus einer wäßrigen Essigsäurelösung umkristallisiert werden kann.

Das als Ausgangsstoff verwendete N-p-(Trifluoracetylamino) - benzoesäure - 2,4,5 - trichlorphenylester (Schmp. 164—168°C) kann von der freien Säure, 2,4,5-Trichlorphenol und N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid in Äthylacetat nach dem Verfahren gemäß dem Aufsatz von Pl ess und Boissonnas in HeIv. Chim. Acta, 1963, Bd. 46, S. 160.

Beispiel 15

Es werden 3,17 Teile L-Tryptophanyl-L-methionyl-L - aspartyl - L - phenylalaninamidhydrochlorid in 30 Teilen Dimethylformamid bei 60°C aufgelöst. Die Lösung wird rasch auf 20° C gebracht, worauf 1,01 Teile Triäthylamin zugegeben werden. Die Mischung wird gerührt und auf 0°C gebracht, worauf 1,86 Teile N - Acetyl - β - alanin - 2,4,5 - trichlorphenylester zugegeben werden. Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunden beiO—5°C gerührt. Dann werden 10 Teile Wasser zugegeben, worauf die Mischung weitere 24 Stunden bei 0—5°C gerührt wird. Es werden dann 30 Teile Wasser zugesetzt, und das Gemisch wird in eine Mischung von 100 Teilen Eiswasser, 0,74 Teilen konzentrierten Salzsäure (Dichte 1,18) und 20 Teilen Äthylacetat hineingegeben. Die entstehende Mischung wird 15 Minuten bei 0—10°C gerührt und anschließend gefiltert. Der feste Rückstand wird mit Wasser und dann mit Äthylacetat gewaschen und anschließend aus einer wäßrigen 2-Äthoxyäthanollösung umkristallisiert. Somit erhält man N-Acetyl-^-alanyl-L - tryptophanyl - L - methionyl -L- aspartyl - L - phenylalaninamid (Schmp. 245° C mit Zersetzung).

Das dabei verwendete N-Acetyl-/?-alanin-2,4,5-trichlorphenylester kann wie folgt hergestellt werden: Eine Lösung von 9,87 Teilen 2,4,5-Trichlorphenol in 100 Teilen Methylenchlorid wird in eine gerührte Suspension von 6,55 Teilen N-Acetyl-ß-alanin in 250 Teilen Acetonitril hineingeben. Die Mischung wird auf 0°C gebracht und mit einer Lösung von 11 Teilen HN'-Dicyclohexylcarbodiimid in 100 Teilen Methylenchlorid behandelt. Das Reaktionsgemisch wird 40 Stunden bei 20—22°C gerührt und anschließend gefiltert. Das Filtrat wird eingedampft, und der Verdampfungsrückstand wird aus einer Mischung von Äthylacetat und Petroläther (Sdp. 60—8O⁰C) umkristallisiert. Somit erhält man N-Acetyl-ß-alanin-2,4,5-trichlorphenylester (Schmp. 88—90⁰C).

Beispiel 16

Bei Wiederholung von Beispiel 15 werden die 1,86 Teile N - Acetyl - β - alanin - 2,4,5 - trichlorphenyl-

ester durch 3,08 Teile NP-Benzyloxycarbonyl-NP-(4-chlor-6-dimethylaminotriazin-2-yl)-L-lysin-2,4,5-trichlorphenylester ersetzt. Somit erhält man N'-Benzyloxycarbonyl-N^c-(4-chlor-6-dimethylaminotriazin-2-yl)-L-lysyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl- L-phenylalaninamid (Schmp. 233⁰C mit Zersetzung).

Das hierbei verwendete N^-Benzyloxycarbonyl-N*- (4-chlor-6-dimethylaminotriazin-2-yl)-L-lysin-2,4,5-trichlorphenylester kann wie folgt hergestellt werden: Es werden 1,03 Teile Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid in eine gerührte Lösung von 0,437 Teilen N^-Benzyloxycarbonyl-N^E-N^E-(4-chlor-6-dimethylaminotriazin-2-yl)-L-lysin und 0,217 Teilen 2,4,5-Trichlorphenol in 5 Teilen trockenen Tetrahydrofurans bei 0⁰C hineingegeben. Die Mischung wird 18 Stunden bei 0—2⁰C gerührt und anschließend gefiltert. Das Filtrat wird eingedampft, und der Rückstand wird aus Äthylacetat umkristallisiert. Somit erhält man N* - Benzyloxycarbonyl - Ν^ε - (4 - chlor - 6 - dimethylaminotriazin - 2 - yl)- L - lysin - 2,4,5 - trichlorphenylester (Schmp. 167—168⁰C).

Das dabei verwendete N^-Benzyloxycarbonyl-NP-(4-chlor-6-dimethylaminotriazin-2-yl)-L-lysin kann wie folgt hergestellt werden:

Eine Lösung von 1,93 Teilen 2-Dimethylamino-4,6-dichlortriazin in 15Teilen Aceton wird in lOTeile kräftig gerührten Eiswassers während 5 Minuten tropfenweise hineingegeben. Die entstehende feinverteilte Suspension wird gerührt und auf 3O⁰C erwärmt, worauf eine Lösung von 2,8 Teilen N^a-Benzyloxycarbonyl-L-lysin in 10 Teilen n-Natriumhydroxydlösung während 10 Minuten tropfenweise bei 30 bis 35°C zugegeben wird. Die Mischung wird dann weitere 15 Minuten bei 30—35°C gerührt. Während der Zugabe und des nachträglichen Rührens wird der pH-Wert dadurch auf 10 bis 10,5 gehalten, daß 10 Teile n-Natriumhydroxydlösung tropfenweise zugegeben wird. Das Aceton wird dann zum größten Teil unter vermindertem Druck abgedampft, worauf die verbleibende wäßrige Lösung mit Essigsäure angesäuert wird. Die Mischung wird gefiltert und der feste Rückstand aus Äthanol umkristallisiert. Somit erhält man N^a-Benzyloxycarbonyl-N^E-(4-chlor-6-dimethylaminotriazin-2-yl)-L-lysin (Schmp. 161 bis 162° C).

Beispiel 17

Eine Lösung von 3,55 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl - L - aspartyl -L- phenylalaninamidtrifluoracetat in 50 Teilen Dimethylformamid wird auf 0⁰C gekühlt und mit 1,01 Teilen Triäthylamin behandelt. Es werden dann 3,43 Teile N-tert.-Butyloxycarbonyl-L - alanyl - L - phenylalanyl - L - isoleucylglycin - 2,4,5 - trichlorphenylester zugegeben, worauf die Mischung 2 Tage bei 0—5° C gerührt wird. Dann werden 50 Teile Wasser zugesetzt, und die Mischung wird noch ein Tag bei 20—25° C gerührt. Die Mischung wird auf 50—6O⁰C erwärmt und anschließend gefiltert. Der feste Rückstand wird 15 Minuten mit 100 Teilen kochenden Äthylacetats verrührt, und die heiße Mischung wird gefiltert. Der feste Rückstand wird in 150 Teilen heißer Essigsäure aufgelöst, worauf 100 Teile Wasser der Lösung zugegeben werden. Die aus der Mischung ausscheidenden Kristalle werden abgefiltert, mit einer 50%igen wäßrigen Essigsäurelösung gewaschen. Die Kristalle werden dann mit Äthylacetat gewaschen und unter Vakuum bei 40—50⁰C getrocknet. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl - L - alanyl -L- phenylalanyl - L - isoleucylglycyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid (Schmp. 248—250⁰C mit Zersetzung). Bei der Analyse mittels Dünnschichtchromatographie unter Anwendung von Silikagel als Adsorbens und von einem Lösungssystems,bestehend aus der oberen Phase einer Mischung von 40 Teilen n-Butanol, 10 Teilen Essigsäure und 50 Teilen Wasser, ließ das Ehrlich-Reagens einen einzigen Fleck von R_F 0,79 erscheinen. Bei Verwendung eines Lösungssystems, bestehend aus 75 Teilen Isobutanol und 25 Teilen einer 3%igen Ammoniumhydroxydlösung, erschien ein einziger Fleck von R_F 0,46.

Das als Ausgangsstoff verwendete N-tert.-Butyloxycarbonyl - L - alanyl -L- phenylalanyl - L - isoleucylglycin-2,4,5-trichlorpnenylester (zersetzt über 260⁰C) kann von der Säure, 2,4,5-Trichlorphenol und N^N'-Dicyclohexylcarbodiimid nach dem Verfahren gemäß dem Aufsatz von P 1 e s s und Boissonnas in der Zeitschrift HeIv. Chim. Äcta., 1963, Bd. 46, S. 160, erzeugt werden.

Beispiel 18

Eine Lösung von 1,78 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl -1. - aspartyl - L - phenylalaninamidtrifluoracetat in 15 Teilen Dimethylformamid wird auf0°C gekühlt, worauf 0,505 Teile Triäthylamin zugegeben werden. Dann werden 0,93 Teile N-Benzyloxycarbonyl-L-prolin-p-nitrophenylester zugegeben, und die Mischung wird 48 Stunden bei 0⁰C und dann 24 Stunden bei 20—22°C gerührt.Nach Zugabe von 70 Teilen Eiswasser wird die Mischung mit 20 Teilen Äthylacetat beim Rückwaschen mit Wasser gewaschen. Die wäßrige Phase und die Rückwaschabgänge werden auf einen pH-Wert von 2 mit n-Salzsäurelösung eingestellt, worauf die Mischung gefiltert wird. Der feste Rückstand wird aus Äthanol umkristallisiert. Somit erhält man N-Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid (Schmp. 238—240⁰C mit Zersetzung).

Beispiel 19

Es werden 63,3 Teile L-Tryptophanyl-L-methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamidhydrochlorid in 1000Teile Wasser mit 220 Teilen n-Natriumhydroxydlösung hineingegeben. Die Mischung wird bei 20 bis 22°C so lange gerührt, bis sich eine klare Lösung ergibt, worauf eine Lösung von 10,5 Teilen p-Toluolsulfonylchlorid in 200 Teilen Aceton während einer Stunde zugegeben wird, wobei der pH-Wert des Reaktionsgemisches durch periodische Zugabe von n-Natriumhydroxydlösung auf 10 bis 11 gehalten wird. Die Mischung wird weitere 2 Stunden bei 20—22° C gerührt, wobei der pH-Wert dadurch auf 10 bis 11 gehalten wird, daß n-Natriumhydroxydlösung bei Bedarf zugegeben wird. Die Mischung wird mit Äther extrahiert, und die wäßrige Phase wird auf einen pH-Wert von 2 mittels n-Salzsäurelösung eingestellt. Die Mischung wird gefiltert, und der feste Rückstand wird mit Wasser und dann mit Äthylacetat gewaschen. Somit erhält man N-p-Toluolsulfonyl - L -1 ryptophanyl - L - methionyl - L - aspartyl - L-phenylalaninamid (Schmp. 233—234° C mit Zersetzung).

Beispiel 20

Eine Lösung von 3,55 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl - l - aspartyl - L - phenylalaninamidtrifluor-

509 517/400

acetat in 30 Teilen Dimethylformamid wird auf 0°C gekühlt. Darauf werden zuerst 1,01 Teile Triäthylamin und dann 2,52 Teile N-tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl - L- homocystein- 2,4,5 - trichlorphenylester zugegeben, worauf die Mischung 4 Tage bei 0—5°C gerührt wird. Die Mischung wird in eine Mischung von 120 Teilen Eiswasser, 0,37 Teilen konzentrierter Salzsäure und 1,2 Teilen Essigsäure hineingegeben. Die Mischung wird 30 Minuten bei 0—10° C gerührt und dann gefiltert. Die festen Rückstände werden mit Wasser und dann mit Äther gewaschen und anschließend aus Äthanol umkristallisiert. Somit erhält man N- tert. - Butyloxycarbonyl - S - benzyl - L - homocysteinyl - L - tryptophanyl - L - methionyl - L - aspartyl-L-phenylalaninamid (Schmp. 215—216°C mit Zer-Setzung).

Das dabei verwendete N-tert.-Butyloxycarbonyl-S - benzyl -L- homocystein - 2,4,5 - trichlorphenylester kann wie folgt hergestellt werden: Es werden einer gerührten Lösung von 3,25 Teilen N-tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-homocystein und 1,98 Teilen 2,4,5-Trichlorphenol in 20 Teilen Äthylacetat 2,06 Teile N,N' - Dicyclohexylcarbodiimid bei 0—10⁰C zugegeben. Die Mischung wird bei 0° C während 18 Stunden gerührt und dann gefiltert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft, und der Verdampfungsrückstand wird aus Cyclohexan umkristallisiert. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-homocystein-2,4,5-trichlorphenylester (Schmp. 111 — 112'C).

Beispiel 21

Bei Wiederholung von Beispiel 20 werden die 2,52 Teile N - tert. - Butyloxycarbonyl - S - benzyl - L-homocystein - 2,4,5 - trichlorphenylester durch 1,92 Teile N - tert. - Butyloxycarbonyl - N - methyl - L-alanin-2,4,5-trichlorphenylester ersetzt. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-N-methyl-L-alanyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid (Schmp. 180—185°C mit Zersetzung).

Das N-tert.-Butyloxycarbonyl-N-methyl-L-alanin-2,4,5-trichlorphenylester kann als öl nach dem Verfahren gemäß dem Aufsatz von PI e s s und Boissonnas in der Zeitschrift HeIv. Chim. Acta., 1963, Bd. 46, S. 160, hergestellt werden.

Beispiel 23 Beispiel 22

Bei Wiederholung von Beispiel 20 werden die 2,52 Teile N - tert. - Butyloxycarbonyl - S - benzyl - L-homocystein-2,4,5-trichlorphenylester durch 3,09 Teile Ν^ε- Benzyloxycarbonyl - Ν^ε- tert. - butyloxycarbonyl - L-lysylglycin - 2,4,5 - trichlorphenylester ersetzt. Somit erhält man N*-Benzyloxycarbonyl-N^c-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysylglycyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid (Schmp. 200—201⁰C mit Zersetzung).

Das N" - Benzyloxycarbonyl - Ν^ε - tert. - butyloxycarbonyl - L - lysylglycin - 2,4,5 - trichlorphenylester (Schmp. 126—127°C) kann nach dem Verfahren gemäß PI ess und Boissonnas (s. HeIv. Chim. Acta., 1963, Bd. 46, S. 160) aus der entsprechenden Säure (Schmp. 131—132°C) hergestellt werden, die selbst aus dem entsprechenden Methylester (Schmp. 91—92°C) hergestellt wird, das aus N*-Benzyloxycarbonyl - Ν^ε - tert. - butyloxycarbonyl - L - lysin und Glycinmethylester nach dem bekannten Verfahren mit gemischten Anhydriden erzeugt wird.

Eine Lösung von 1,78 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamidtrifluoracetat in 15 Teilen Dimethylformamid wird auf 0⁰C gekühlt, worauf0,505 TeileTriäthylamin und l,08Teile N-Benzyloxycarbonyl-L-valin-2,4,5-trichlorphenylester zugegeben werden. Die Mischung wird 2 Tage bei 0—5°C und dann einen Tag bei 20—22⁰C gerührt. Die Mischung wird dann einer Lösung von 0,37 Teilen konzentrierter Salzsäure (Dichte 1,18) in 50 Teilen Eiswasser zugesetzt. Die entstehende Mischung wird 30 Minuten bei 20—25°C gerührt und dann gefiltert. Der feste Rückstand wird mit Wasser und dann mit Äther gewaschen und anschließend aus einer wäßrigen 2-Äthoxyäthanollösung umkristallisiert. Somit erhält man N - Benzyloxycarbonyl - L - valyl - L - tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid (Schmp. 246—247°C mit Zersetzung).

Beispiel 24

Bei Wiederholung von Beispiel 23 werden die 1,08 Teile N- Benzyloxycarbonyl - L - valin - 2,4,5 - trichlorphenylester durch 1,2 Teile N-Benzyloxycarbonyl - L - phenylalanin - 2,4.5 - trichlorphenylester. Somit erhält man N- Benzyloxycarbonyl -L- phenylalanyl-L - tryptophanyl - L - methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamid (Schmp. 241—243°C mit Zersetzung), das aus wäßriger Essigsäurelösung umkristallisiert werden kann.

Beispiel 25

Eine Lösung von 3,41 Teilen L-Tryptophanyl-i.-methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamidtrifluoracetat in 20 Teilen Dimethylformamid mit 1,01 Teilen Triäthylamin wird mit einer Lösung von 1,86 Teilen N - Benzoyl - (i - alanin - 2,4,5 - trichlorphenylester in 40 Teilen Dimethylformamid vermengt (bei 0 C). Die Lösung wird 60 Stunden auf 0°C gehalten, worauf der pH-Wert mit Zitronensäure auf 2 bis 3 eingestellt wird. Die Lösung wird dann mit 500 Teilen Eiswasser verdünnt, und der so erhaltene Feststoff wird abgefiltert, mit Wasser und dann mit Diäthyläther ge- ( waschen und anschließend aus wäßriger 2-Methoxyäthanollösung umkristallisiert. Somit erhält man N-Benzoyl-/ϊ-alanyl-L-tryptophanyI-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid (Schmp. 200—201⁰C).

Das als Ausgangsstoff verwendete N-Benzoyl-p'-alanin-2,4,5-trichlorphenylester kann wie folgt hergestellt werden: Eine Lösung von 9,87 Teilen 2,4,5-Trichlorphenol in 100 Teilen Methylendichlorid wird einer gerührten Suspension von 9,65 Teilen N-Benzoyl-/^-alanin in 250 Teilen Acetonitril bei 0°C zugesetzt, worauf eine Lösung von 11 Teilen Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid in 100 Teilen Methylendichlorid zugegeben wird. Das Reaktionsgemisch wird 40 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt und dann gefiltert. Der feste Rückstand wird mit Methylendichlorid gewaschen, und das Filtrat und die Waschabgänge werden eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird mit Petroläther (Sdp. 60—8O⁰C) zerrieben, worauf der Feststoff abgefiltert und aus einer Mischung von Äthylacetat und Petroläther (Sdp. 60—8O⁰C) umkristallisiert wird. Somit erhält man N-Benzoyl-/y-alanin-2,4,5-trichlorphenyIester (Schmp. 120— 122°C).

Beispiel 26

Bei Wiederholung von Beispiel 25 werden die 1,86 Teile N-Benzoyl-^-alanin-iAS-trichlorphenylester durch 1,63 Teile N-Acetyl-y-aminobuttersäure-2,4,5-trichlorphenylester. Das Produkt wird aus einem Methanol-Äthylacetat-Gemisch umkristallisiert. Somit erhält man N-Acetyl-y-aminobutyryl-L-tryptophanyl - L- methionyl - L-aspartyl - l- phenylalaninamid (Schmp. 217—218°C).

Das dabei verwendete N-Acetyl-y-aminobuttersäure-2,4,5-trichlorphenylester kann wie folgt hergestellt werden: Einer gerührten Suspension von 1,45 Teilen N-Acetyl-y-aminobuttersäure in 15 Teilen Acetonitril werden 1,98 Teile 2,4,5-Trichlorphenol bei 0° C zugegeben. Eine vorgekühlte Lösung von 2,3Teilen Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid in 5 Teilen Acetonitril wird dann zugegeben, worauf die Mischung 18 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt wird. Die Mischung wird gefiltert, und der feste Rückstand wird in 30 Teilen heißen Methanols aufgelöst. Dann werden 60 Teile heißen Äthylacetats zugegeben, und die Lösung wird abgekühlt. Der dabei niedergeschlagene Feststoff wird abgefiltert, und das Filtrat wird eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird aus Äthylacetat umkristallisiert, so daß man N-Acetyl- γ - aminobuttersäure - 2,4,5 - trichlorphenylester (Schmp. 122—124°C) erhält.

Beispiel 27

Einer Suspension von 1,77 Teilen L-Tryptophanyl-L - methionyl -L- aspartyl -L- phenylalaninamidtrifluoracetat in 10 Teilen Wasser und 10 Teilen Dimethylformamid werden 2,8 Teile N-Methylmorpho-Hn zugegeben, und die Mischung wird zum Auflösen 30 Minuten gerührt. Mit Eisessigsäure wird der pH-Wert der Lösung auf 8 eingestellt, worauf eine Lösung von 1,08 Teilen Kaliumcyanat in 5 Teilen Wasser zugegeben wird. Die Mischung wird 24 Stunden auf Umgebungstemperatur gehalten und dann mit 100 Teilen Wasser verdünnt. Der pH-Wert der Mischung wird mit 2n-Salzsäurelösung auf 2 bis 2,5 gebracht, worauf der niedergeschlagene Feststoff abgefiltert und aus wäßriger Dimethylformamidlösung umkristallisiert wird. Somit erhält man N-Carbamoyl - l - tryptophanyl - L - methionyl - L - aspartyl - L-phenylalaninamid (Schmp. 205—206⁰C).

Beispiel 28

Einer Suspension von 1,54 Teilen N-fert.-Butyloxycarbonyl- β - alanyl - L - tryptophanyl - L - methionyl - L-aspartyl-L-phenylalaninamid in 10 Teilen Essigsäure wird eine Mischung von 2,5 Teilen einer 3,8 n-Salzsäurelösung und Äthylacetat zugegeben. Die Mischung wird dann etwa 15 Minuten bei 20—22° C gerührt, bis sich eine klare Lösung ergibt, worauf die Lösung noch 30 Minuten bei 20—22°C gerührt wird. Dann werden 60 Teile trockenen Äthers zugegeben, und die Mischung wird gefiltert. Der feste Rückstand wird 3mal mit Äther gewaschen und anschließend bei 30—40⁰C unter Vakuum getrocknet. Somit erhält man ß-Alanyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamidhydrochlorid, das bei 208⁰C zersetzt.

Beispiel 29

Es werden 15 Teile N^a-Benzyloxycarbonyl-N^£-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-tryptophanyl-L-methionyl- L-aspartyl-L-phenylalaninamid zu 100 Teilen einer wäßrigen 80%igen Trifluoressigsäurelösung zugegeben. Die Mischung wird 45 Minuten bei 20—22⁰C gerührt, worauf 600 Teile trockenen Äthers zugesetzt werden. Die Mischung wird gefiltert, und der Feststoff wird 4mal mit trockenem Äther gewaschen und anschließend bei 20—25° C getrocknet (unter vermindertem Druck). Somit erhält man NF-Benzyloxycarbonyl - L - lysyl - L - tryptophanyl - L - methionyl - L-aspartyl - L - phenylalaninamidtrifluoracetat (Schmp. 198—200° C mit Zersetzung).

Beispiel 30

Bei Wiederholung von Beispiel 29 werden die 15 Teile des isomerischen N^-Benzyloxycarbonyl-N*- tert. - butyloxycarbonylderivats durch 15 Teile Ν^ε - tert. - Butyloxycarbonyl - N^£ - benzyloxycarbonyl-L - lysyl - L - tryptophanyl - L - methionyl - L - aspartyl - L-phenylalaninamid ersetzt. Somit erhält man N^£-Benzyloxycarbonyl-L-lysyl-L-tryptophanyl-L-methionyl- L-aspartyl-L-phenylalaninamidtrifluoracetat (Schmp.

192— 193°C mit Zersetzung).

Beispiel 31

Bei Wiederholung von Beispiel 29 werden die 15 Teile N"- Benzyloxycarbonyl - N^c- tert. - butyloxycarbonyl - L - lysyl - L - tryptophanyl - L - methionyl - L-aspartyl-L-phenylalaninamid durch 15 Teile NP-Benzyloxycarbonyl - Ν^ε - tert. - butyloxycarbonyl - L - lysylglycyl - L - tryptophanyl - L - methionyl - L - aspartyl - L-phenylalaninamid ersetzt. Somit erhält man N^a-Benzyloxycarbonyl - L - lysylglycyl - L - tryptophanyl - L-methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamidtrifluoracetat als weißen Feststoff. Bei der Analyse durch Dünnschichtchromatographie unter Anwendung von Silikagel als Adsorbens und von einem Lösungssystem, bestehend aus der oberen Phase einer Mischung von 25 Teilen n-Butanol, 6 Teilen Essigsäure und 25 Teilen Wasser, erschien ein einziger Fleck von R_F 0,67.

Beispiel 32

Es wird 1 Teil N-tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L - homocysteinyl - l - tryptophanyl - l - methionyl - laspartyl - L - phenylalaninamid zu 10 Teilen einer 80%igen wäßrigen Trifluoressigsäurelösung zugegeben. Die Mischung wird 1 Stunde bei 20—22° C gerührt, worauf 60 Teile trockenen Äthers zugegeben werden. Die Mischung wird gefiltert, und der feste Rückstand wird 4mal mit trockenem Äther gewaschen und anschließend unter vermindertem Druck bei 20—25°C getrocknet. Somit erhält man S-Benzyl-L - homocysteinyl - L - tryptophanyl - L - methionyl - laspartyl-L-phenylalaninamidtrifluoracetat. Bei der Analyse durch Dünnschichtchromatographie unter Anwendung von Silikagel als Adsorbens und von einem Lösungssystem, bestehend aus der oberen Phase einer Mischung von 25 Teilen n-Butanol, 6 Teilen Essigsäure und 25 Teilen Wasser, erschien ein einziger Fleck.

Beispiel 33

Eine Lösung von 3,17 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamidhydrochlorid in 40 Teilen Dimethylformamid wird auf 0⁰C gekühlt, worauf 1,01 Teile Triäthylamin zugegeben werden. Die Mischung wird gerührt, während 2,21 Teile N-Benzyloxycarbonyl-/?-alanin-2,4,5-trichlorphenyl-

ester bei 0°C zugegeben werden. Das Reaktionsgemisch wird 18 Stunden bei 0—5°C gerührt, worauf 10 Teile zugegeben werden. Die Mischung wird dann noch 24 Stunden bei 20—22°C gerührt. Die Mischung wird dann auf 70—75° C erwärmt, bis der Feststoff gänzlich gelöst ist (gewöhnlich nach 2 Minuten). Die entstehende heiße Lösung wird dann in eine gerührte Mischung von 500 Teilen Eiswasser, 10 Teilen n-Salzsäurelösung und 200 Teilen Cyclohexan gegossen. Die Mischung wird gefiltert, und der feste Rückstand wird mit Wasser und dann mit Äther gewaschen und anschließend aus 2-Äthoxyäthanol umkristallisiert. Somit erhält man N-Benzyloxycarbonyl - β - alanyl -L- tryptophanyl -L- methionyl -L-aspartyl - L - phenylalaninamid (Schmp. 230—232° C mit Zersetzung).

Das dabei verwendete N-Benzyloxycarbonyl-^-alanin-2,4,5-trichlorphenylester kann durch Wiederholung des Verfahrens gemäß Beispiel 20 zur Herstellung von N-tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-homocystein-2,4,5-trichlorphenylester erzeugt werden, wobei aber die 3,25 Teile N-tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-homocystein durch 2,23 Teile /?-Alanin ersetzt werden. Somit erhält man N-Benzyloxycarbonyl-/y-alanin-2,4,5-trichlorphenylester (Schmp. 94—95° C).

Beispiel 34

Eine Lösung von 3,17 Teilen L-Tryptophanel-L-methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamidhydrochlorid in 40 Teilen Dimethylformamid wird auf 0°C gekühlt, worauf 1,01 Teile Triäthylamin und dann 2,02 Teile N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanin-2,4,5-trichlorphenylester bei 0⁰C zugegeben werden. Das Reaktionsgemisch wird 48 Stunden bei 0°C gerührt und dann einer Mischung von 300 Teilen Eiswasser, 0,37 Teilen konzentrierter Salzsäure (Dichte 1,18), l,2Teilen Essigsäure und lOOTeilen Cyclohexan zugegeben. Die Mischung wird 15 Minuten bei 0—10°C gerührt und anschließend gefiltert. Der feste Rückstand wird mit Wasser und dann mit Äther gewaschen und anschließend unter vermindertem Druck bei 40—50° C getrocknet. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl - L - alanyl - l - tryptophanyl - l - methionyl - L - phenylalaninamid (Schmp. 223—225°C mit Zersetzung).

Beispiel 35

Es werden 1,01 Teile Triäthylamin einer Lösung von 3,55 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamidtrifluoracetat und 2,64 Teilen N - Pivaloyl - β - alanin - 2,4,5 - trichlorphenylester in 30 Teilen Dimethylformamid zugegeben. Die entstehende Lösung wird 2 Tage auf 20—-22° C gehalten und dann einer Mischung von 500 Teilen Eiswasser, 0,74 Teilen konzentrierter Salzsäure (D = 1,18) und 300 Teilen Cyclohexan zugesetzt. Die Mischung wird gefiltert, und der feste Rückstand wird mit Wasser und dann mit Äther gewaschen und anschließend aus wäßriger Äthanollösung umkristallisiert. Somit erhält man N-Pivaloyl-ß-alanyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid (Schmp. 218 bis 220° C). Das dabei verwendete N-Pivaloyl-^-alanin-2,4,5-trichlorphenylester kann wie folgt hergestellt werden: Einer gerührten Lösung von 0,866 Teilen N-Pivaloyl-//-alanin und 1,04 Teilen 2,4,5-Trichlorphenol in 20 Teilen Aceton werden 1,03 Teile N,N'-Dicyclohexylcarbondiimid bei 0—10° C zugesetzt. Die Mischung wird 18 Stunden bei 0—2° C gerührt und anschließend gefiltert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft, und der Verdampfungsrückstand wird aus Diisopropyläther umkristallisiert. Somit erhält man N-Pivaloyl-/?-alanin-2,4,5-trichlorphenylester (Schmp. 70—72° C).

Das dabei verwendete N-Pivaloyl-/7-alanin kann wie folgt hergestellt werden: Während 15 Minuten werden 1,23 Teile Pivaloylchlorid einer gerührten Lösung von 3,51 Teilen /J-Alaninbenzylester-p-toluolsulfonat und 2,02 Teilen Triäthylamin in 20 Teilen Chloroform bei 0—4° C zugegeben. Die Mischung wird 2 Stunden bei 20—22°C gerührt, worauf 10 Teile Wasser zugegeben werden. Die organische Phase wird abgetrennt und hintereinander mit 10 Teilen n-Natriumbicarbonatlösung, 10 Teilen Wasser,'10 Teilen 0,5 n-Salzsäurelösung und 10 Teilen Wasser. Sie wird dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend eingedampft. Der ölige Rückstand wird in 15 Teilen einer 90%igen wäßrigen Essigsäurelösung aufgelöst, und die entstehende Lösung wird 4 Stunden bei Raumtemperatur und unter Atmosphärendruck über 0,5 Teilen 5%igen Palladium-auf-Holzkohle-Katalysators hydriert. Dann wird die Mischung gefiltert, worauf das Filtrat eingedampft wird. Der Verdampfungsrückstand wird durch azeotrope Destillation mit Benzol getrocknet und anschließend aus Äthylacetat umkristallisiert. Somit erhält man N-Pivaloyl-//-alanin (Schmp. 131,5 bis 132° C).

Beispiel 36

Eine Mischung von 7,11 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamidtrifluoracetat, 2,8 Teilen tert. - Butyloxycarbonylaxid, 3,03 Teilen Triäthylamin und 80 Teilen Pyridin wird 4 Tage bei 23—25° C gerührt. Die Mischung wird dann unter einem Druck von 0,1 mm Quecksilbersäule eingedampft, worauf der Verdampfungsrückstand mit lOOTeilen Eiswasser verrührt wird. Der pH-Wert der Mischung wird dann mit einer 10%igen wäßrigen Zitronensäurelösung auf 3 eingestellt, worauf die Mischung gefiltert wird. Der feste Rückstand wird gründlich mit Wasser gewaschen und dann aus wäßriger 2-Äthoxyäthanollösung umkristallisiert. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid (Schmp. 209—210° C mit Aufsprudeln).

Beispiel 37

Eine Lösung von 0,409 Teilen N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosylglycin und 0,1 Teil Triäthylamin in 10 Teilen Tetrahydrofuran wird auf — 20°C gekühlt, worauf eine Lösung von 0,123 Teilen Pivaloylchlorid in 10 Teilen Tetrahydrofuran während 10 Minuten bei —10 bis —20° C zugegeben wird. Die Lösung wird 20 Minuten gerührt, worauf eine Lösung von 0,71 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl-L - aspartyl - L - phenylalaninamidtrifluoracetat und 0,2 Teilen Triäthylamin in 8 Teilen Dimethylformamid zugesetzt wird. Das Reaktionsgemisch wird 20 Stunden auf 0° C gehalten und dann einer Mischung von 50 Teilen Wasser, 1 Teil n-Salzsäurelösung und 0,12 Teilen Essigsäure zugegeben. Der dabei niedergeschlagene Feststoff wird abgefiltert, mit Wasser und anschließend mit kochendem Äthanol gewaschen. Der feste Rückstand wird dann abgefiltert. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyro-

sylglycy 1 - l - tryptophanyl - L - methionyl - L -aspartyl - L-phenylalaninamid (Schmp. 234° C mit Zersetzung).

Das als Ausgangsstoff verwendete N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosylglycin kann wie folgt hergestellt werden: Es werden 5,5 Teile N-tert.-Butyloxycarbonyl - L - alanyl - L - tyrosylglycinmethylester in 32 Teilen Methanol suspendiert, worauf26 Teilen-Natriumhydroxydlösung zugegeben werden. Die entstehende Lösung wird 1 Stunde bei 0°C gerührt und anschließend eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in 40 Teilen Wasser aufgelöst, und die Lösung wird mit 6,3 Teilen Zitronensäure angesäuert. Der ausscheidende Feststoff wird abgefiltert. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosylglycin (Schmp. 195—197°C nach Sintern bei 169 bis 181°C).

Das N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosylglycinmethylester (Schmp. 179—180⁰C) kann nach dem Verfahren gemäß Beispiel 3 der britischen Patentanmeldung 26 354/64 der Anmelderin hergestellt werden.

Beispiel 38

Es werden 1 Teil N-terL-Butyloxycarbonyl-^-alanyl-L - tryptophanyl - L - methionyl - L - aspartyl - l - phenylalaninamid und 1000 Teile destillierten Wassers, das 2,6 Teile η - Ammoniumhydroxydlösung enthält, 3 Stunden bei 20—22 C miteinander geschüttelt. Die entstehende Lösung wird mit 8,8 Teilen Natriumchlorid behandelt und dann dadurch sterilisiert, daß sie durch ein steriles bakteriensicheres Filter geleitet wird. Somit erhält man eine isotonische, sterile injizierbare wäßrige Lösung des N-tert.-Butyloxycarbonyl - β - alanyl - L - tryptophanyl - L - methionyl - L-aspartyl-L-phenylalaninamids, die einen Teil Peptidderivat je 1000 Teile Lösung enthält. Das ultraviolette Absorptionsspektrum der Lösung zeigte /-Minimum 246,5 Γημ (r 2080), Α-Beugung 272—-27'5 ηΐμ U 5040) und /-Maxima 280 π\μ (_f 5340) und 289 πΐμ U 4590).

Beispiel 40 Beispiel 39

40

\ Es wird 1 Teil N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-

L - tyrosylglycyl - L - tryptophanyl - L - methionyl - L \ aspartyl-L-phenylalaninamid in 200 Teilen Dimethyl- j£) sulfoxyd aufgelöst, worauf zwei äquivalente Anteile einerO, 1 n-Ammoniumhydroxydlösungzugegeben werden. Die entstehende Lösung wird auf 1000 Teile mit einer 0,9 gew/volumprozentigen wäßrigen Natriumchloridlösung als Verdünnungsmittel gebracht. Die entstehende Lösung wird dadurch sterilisiert, daß sie durch ein steriles bakteriensicheres Filter geleitet wird. Somit erhält man eine isotonische, sterile, injizierbare wäßrige Lösung des N-tert.-Butyloxycarbonyl - L - alanyl - L - tyrosylglycyl - L - tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamids.

Bei Wiederholungen dieses Verfahrens wird der 1 Teil N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosylglycyl - L - tryptophanyl - L - methionyl - L - aspartyl - L-phenylalaninamid durch 1 Teil N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucylglycyl- L - tryptophanyl - L - methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamid, oder 1 Teil N-Acetyl-, N-Benzoyl-, N-tert.-Butyloxycarbonyl - L - alanyl-, N - Pivaloyl - ß- alanyl-, N-Benzyloxycarbonyl-ß-alanyl-, N-Acetyl-ß-alanyl-, N-ß-Alanyl-, oder N-Carbamoyl-L-tryptophanyl-L-methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamid ersetzt, wobei man also entsprechende isotonische, sterile, injizierbare wäßrige Lösungen erhält.

Es werden 218 Teile N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophan - 2,4,5 - trichlorphenylester, 185 Teile L-Methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid,45,6Teile Triäthylamin 4000 Teile Dimethylformamid und 500 Teile Wasser 48 Stunden bei 0⁰C und dann 24 Stunden bei 20—25°C miteinander verrührt. Der pH-Wert der Mischung wird durch sorgfältige Zugabe von 2n-Salzsäurelösung bei 0⁰C auf 2 eingestellt, worauf 15 000 Teile Eiswasser unter Rührung zugegeben werden. Der Feststoff wird abgefiltert, mit Wasser gewaschen und dann zusammen mit 8000 Teilen Äthanol bis zum linden Kochen erwärmt. Die Mischung wird abgekühlt und gefiltert, und der feste Rückstand wird mit Äthanol gewaschen und dann unter vermindertem Druck bei 40—50°C getrocknet. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl - L - methionyl - l-aspartyl - L - phenylalaninamid (Schmp. 209—210⁰C mit Aufsprudeln).

Das als Ausgangsstoff verwendete L-Methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid (Schmp. 223—225°C) kann gemäß Beispiel 1 der britischen Patentanmeldung 35 985/64 der Anmelderin hergestellt werden.

Beispiel 41

Eine Suspension von 225 Teilen N-tert.-Butyloxycarbonyl - L - tryptophanyl - L - methioninhydrazid in 500 Teilen trockenen Tetrahydrofurans wird auf — 20°C gekühlt, worauf 500 Teile trockenen Tetrahydrofurans, die 36,5 Teile trockenen Chlorwasserstoffs enthalten, zugegeben werden, während die Mischung bei —20 bis —25° C stark gerührt wird. Die entstehende Lösung wird dann mit 61 Teilen n-Butylnitrit behandelt, worauf die Mischung noch 6 Minuten bei —20 bis -25⁰C gerührt wird. Die mattgrüne Lösung wird dann einer Lösung von 140 Teilen L-aspartyl-L-phenylalaninamid in 2000 Teilen Dimethylformamid, 100 Teilen Wasser und 151,5 Teilen Triäthylamin bei 0⁰C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 2 Tage auf O⁰C gehalten, worauf 10 000 Teile Eiswasser zugegeben werden. Der nach Filtern erhaltene feste Rückstand wird mit Wasser gewaschen und aus Äthanol umkristallisiert. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl - L- methionyl - L -aspartyl - L - phenylalaninamid (Schmp. 209—210°C mit Aufsprudeln).

Das als Ausgangsstoff verwendete N-tert.-Butyloxycarbonyl - L-tryptophanyl - L- methioninhydrazid kann wie folgt hergestellt werden: Eine Suspension von 200 Teilen L - Methioninmethylesterhydrochlorid in 1500 Teilen Chloroform wird bei 0⁰C gerührt und mit 101 Teilen Triäthylamin behandelt. Die Mischung wird weiter bei 0°C gerührt, bis der Feststoff gänzlich aufgelöst ist, worauf 304 Teile N-tert.-Butyloxycarbonyl - L - tryptophan und anschließend 206 Teile N^'-Dicyclohexylcarbodiimid bei 0—5° C zugegeben werden. Das Reaktionsgemisch wird 18 Stunden auf 0°C gehalten und dann gefiltert. Das Filtrat wird nacheinander mit 200 Teilen 10%iger wäßriger Natriumchloridlösung, 200 Teilen 10%iger wäßriger Zitronensäurelösung, 200 Teilen 10%iger Natriumchloridlösung, 200 Teilen n-Kaliumbicarbonatlösung und schließlich 3mal mit je 200 Teilen 10%iger wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen. Es wird dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in 800 Teilen Diisopropyläther gelöst,

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und die Lösung wird 1 Stunde auf O⁰C gehalten. Die so gebildeten Kristalle werden abgefiltert und unter vermindertem Druck bei 40⁰C getrocknet. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl-L-methioninmethylester als farblose Nadeln (Schmp. 98-—99°C). Von diesem Ester werden 225 Teile in 500 Teilen Methanol aufgelöst. Die Lösung wird auf 0⁰C gekühlt und dann mit 55 Teilen 100%igen Hydrazinhydrats behandelt. Das Reaktionsgemisch wird 16 Stunden auf 20—22°C gehalten und dann gefiltert. Der feste Rückstand wird mit Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck bei 40'C getrocknet. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl - L - methioninhydrazid (Schmp. 177—178 C) mit Aufsprudeln).

Beispiel 42

Eine Lösung von 360 Teilen N-tert.-Butyioxycarbonyl - L - tryptophanyl - L - methioninhydrazid in 5200 Teilen Dimethylformamid wird auf —10 C gekühlt, worauf 2000 Teile n-Salzsäurelösung und dann 4350 Teile 0,2 n-Natriumnitritlösung bei — 10 C zugegeben werden. Die Mischung wird 3 Minuten bei - 10°C gerührt, worauf 30000Teile Wasser, 58OOTeile n-Natriumbicarbonatlösung und schließlich 4000 Teile Methylenchlorid zugegeben werden. Die untere organische Schicht wird vom Gemisch abgetrennt, und die wäßrige Schicht wird mal mit Methylenchlorid (je 4000 Teile) extrahiert. Die organische Schicht und die Extrakte werden zusammengebracht und dadurch getrocknet, daß sie 5 Minuten mit wasserfreiem Magnesiumsulfat verrührt werden, worauf die Mischung gefiltert wird. Das Filtrat wird sofort einer Lösung von 274 Teilen L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylesterhydrochlorid in 10000 Teilen Dimethylformamid und 262Teilen Triäthylamin bei -10¹C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunden auf 0°C gehalten, worauf das Methylenchlorid unter vermindertem Druck bei 0^GC zum größten Teil entfernt wird. Das Reaktionsgemisch wird noch 20 Stunden auf 0°C und dann 4 Stunden auf 20—22°C gehalfen. Dann werden 40 000 Teile Methylenchlorid zugegeben, und die Lösung wird nacheinander mit 20 000 Teilen 5%iger wäßriger Zitronensäurelösung und 2mal mit je 20 000 Teilen Wasser gewaschen. Die Lösung wird dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und gefiltert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft, und der feste Rückstand wird aus einer wäßrigen Methanollösung umkristallisiert. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl - L - methionyl -L- aspartyl - L - phenylalaninmethylester als weißen kristallförmigen Feststoff (Schmp. 167—169°C). Bei der Analyse mittels Dünnschichtchromatographie unter Anwendung von SiIikagel als Adsorbens und von einem Lösungssystem, bestehend aus 100 Teilen sek.-Butanol und 44 Teilen einer 3%igen wäßrigen Ammoniaklösung, erschien ein einziger Fleck von R_F0,61. Bei der Analyse mittels Dünnschichtchromatographie unter Anwendung von Silikagel als Adsorbens und von einem Lösungssystem, bestehend aus der oberen Phase einer Mischung von 25 Teilen n-Butanol, 6 Teilen Essigsäure und 25 Teilen Wasser, erschien ein einziger Fleck von R_F 0,50.

Von diesem Methylester werden 100 Teile mit 10000 Teilen trockenen, mit Ammoniak gesättigten Methanols 72 Stunden bei 20—22°C verrührt. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck

eingedampft, und der Verdampfungsrückstand wird in 2000 Teilen Methanol aufgelöst. Eine 5%ige wäßrige Zitronensäurelösung wird tropfenweise unter Rührung zugegeben, bis der pH-Wert 2 bis 3 beträgt. Der ausscheidende Feststoff wird abgefiltert, mit Wasser gewaschen und anschließend unter vermindertem Druck bei 40⁰C getrocknet. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid (Schmp. 209 bis 210° C mit Aufsprudeln).

Das als Ausgangsstoff verwendete L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylesterhydrochlorid kann wie folgt hergestellt werden: Es werden 465 Teile N-BenzyloxycarbonyI-(/i-benzyl)-L-asparaginsäure und 280 Teile L-Phenylalaninmethylesterhydrochloridin 1200 Teilen Methylenchlorid aufgelöst. Dann werden 132 Teile Triäthylamin und anschließend 294 Teile N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid bei 0⁰C zugegeben, worauf die Mischung 1 Stunde bei 0°C und dann 16 Stunden bei 20—22°C gerührt wird. Das nach Filtern erhaltene Filtrat wird nacheinander mit 500 Teilen n-Salzsäurelösung, 500 Teilen Wasser, 500 Teilen n-Natriumbicarbonatlösung und 500 Teilen Wasser gewaschen und dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend unter vermindertem Druck eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird aus einem Gemisch von Äthylacetat und Petroläther (Sdp. 60—80⁰C) umkristallisiert. Somit erhält man N-Benzyloxycarbonyl-(/i-benzyI)-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester (Schmp. 115—116⁰C). Eine Mischung von 312Teilen dieses Esters, 4000Teilen Methanol und 300 Teilen 2n-Salzsäurelösung wird mit 50 Teilen eines 10%igen Palladium-auf-HoIzkohle-Katalysators verrührt, wobei Wasserstoff in die Mischung bei 18—22°C unter Atmosphärendruck während 3 Stunden eingeblasen wird. Das Reaktionsgemisch wird zur Entfernung des Katalysators gefiltert, und das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird unter vermindertem Druck bei 40⁰C getrocknet. Somit erhält man L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylesterhydrochlorid (Schmp. 105—HO⁰C).

Beispiel 43

Es werden 1,96 Teile N-tert.-Butyloxycarbonyl-/;-alanyl - L - tryptophanyl - L - methionyl - L - aspartyl - L-phenylalaninmethylester in 50 Teilen trockenen, mit Ammoniak gesättigten Methanols bei 0⁰C aufgelöst. Die Lösung wird 24 Stunden auf 0—2° C gehalten und dann unter vermindertem Druck eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in 40 Teilen Methanol aufgelöst, worauf 0,2 Teile Essigsäure der Lösung zugegeben werden. Der ausscheidende Feststoff wird abgefiltert und mit Methanol gewaschen. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-L - tryptophanyl - l - methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamid (Schmp. 229—230⁰C mit Zersetzung).

Das als Ausgangsstoff verwendete N-tert.-Butyloxycarbonyl-/y-alanyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester kann wie folgt hergestellt werden :Eine Lösung von 9,6 Teilen N-tert.-Butyloxycarbonyl - β - alanin - 2,4,5 - trichlorphenylester und 5,18 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl-L - aspartyl - L - phenylalaninmethylesterhydrochlorid in 50 Teilen Dimethylformamid wird auf 0⁰C gekühlt, worauf 10 Teile Wasser und dann 1,62 Teile Triäthylamin zugegeben werden. Die Mischung wird 3 Tage bei 0—2° C gerührt und dann einer Mischung

von 200 Teilen Eiswasser, 1,6 Teilen Zitronensäure, 1 Teil Essigsäure und 80 Teilen Äther zugegeben. Die Mischung wird gefiltert, und der feste Rückstand wird 3mal mit Wasser, und 3mal mit Äther gewaschen und anschließend aus Äthanol umkristallisiert. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-L-tryptophany 1 - L - methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninmethylester (Schmp. 171—172°C mit Zersetzung).

Das L - Tryptophanyl - L - methionyl - L - aspartyl - L-phenylalaninmethylester hydrochlorid kann wie folgt hergestellt werden: Eine Lösung von 7,12 Teilen N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester in 100 Teilen Essigsäure wird mit 100 Teilen 3,4 n-Salzsäurelösung in Äthylacetat bei 15—20⁰C behandelt. Die Lösung wird 3 Stunden auf 20—22° C gehalten, worauf 10000 Teile trockenen Äthers zugegeben werden. Die Mischung wird gefiltert, und der feste Rückstand wird 5mal mit Äther gewaschen und anschließend unter Vakuum bei 25°C getrocknet. Somit erhält man L - Tryptophanyl - L - methionyl - L - aspartyl - L-phenylalaninmethylester-hydrochlorid (Schmp. 180 bis 18l'C mit Zersetzung).

Beispiel 44

Es werden 3,89 Teile N-tert.-Butyloxycarbonyl-/;-alanyl-L-tryptophanhydrazid zu 20 Teilen trockenen Tetrahydrofurans, das 0,73 Teile trockenen Chlorwasserstoffs enthält, bei -2O⁰C unter starkem Rühren zugegeben. Die entstehende Lösung wird mit 1,22 Teilen n-Butylnitrit behandelt und weitere 6 Minuten bei — 20 bis —25° C gerührt. Die Mischung wird dann einer Lösung von 4,47 Teilen L-Methionyl-L-apsartyl-L-phenylalaninamidhydrochlorid in 50 Teilen Dimethylformamid, 25 Teilen Wasser und 4,24 Teilen Triäthylamin bei 0⁰C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 3 Tage bei 0° C gerührt und dann mit einer 5%igen wäßrigen Zitronensäurelösung angesäuert, derart, daß der pH-Wert auf 3,5 eingestellt wird. Die Lösung wird einer Mischung von 500 Teilen Eiswasser und 300 Teilen Äther zugegeben, und die entstehende Mischung wird gefiltert, worauf der feste Rückstand mit Wasser gewaschen und aus einer wäßrigen 2-Äthoxyäthanollösung umkristallisiert wird. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-/)'-alanyl-L-tryptophanyl-L-methi- onyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid (Schmp. 229 bis 230⁰C mit Zersetzung).

Das als ein Hauptausgangsstoff verwendete N-tert.-Butyloxycarbonyl -ff-, alanyl - L - tryptophanhydrazid kann wie folgt hergestellt werden: Es werden 10,7Teile 100%igen Hydrazinhydrats einer Lösung von 38,9 Teilen N - tert. - Butyloxycarbonyl -ff- alanyl - l - tryptophanmethylester in 400 Teilen Methanol bei 15—20⁰C zugegeben. Die Mischung wird 2 Tage auf 20—23°C gehalten und dann unter vermindertem Druck eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird mit Äthylacetat gewaschen und anschließend aus Äthanol umkristallisiert. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl - β - alanyl - L - tryptophanhydrazid (Schmp. 198—199°C mit Zersetzung).

Das N-tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-L-tryptophanmethylester kann wie folgt hergestellt werden: Eine Lösung von 3,78 Teilen N-tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanin und L-Tryptophanmethylester, das gerade aus 6,43 Teilen L-Tryptophanmethylesterhydrochlorid erzeugt worden ist, in 80 Teilen trockenen Acetons wird mit 4,12 Teilen Ν,Ν'-DicyclohexyI-carbodiimid bei 0⁰C behandelt. Die Mischung wird 48 Stunden bei 0—2°C gerührt und dann unter vermindertem Druck eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird mit 200 Teilen kochenden Äthylacetats extrahiert, und die Extrakte werden auf 2O⁰C abgekühlt und dann gefiltert. Das Filtrat wird nacheinander mit 0,5 n-Salzsäurelösung, Wasser, wäßriger n-Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen und dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird aus Äthylacetat umkristallisiert. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-L-tryptophanmethylester (Schmp. 157—158°C).

Das auch als ein Hauptausgangsstoff verwendete L - Methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamidhydrochlorid kann in an sich bekannter Weise aus der entsprechenden freien Base gebildet werden, deren Herstellung in der britischen Patentanmeldung 35985/64 der Anmelderin beschrieben ist.

Beispiel 45

Einer stark gerührten Lösung von 20 Teilen trockenen Tetrahydrofurans mit 0,73 Teilen trockenen Chlorwasserstoffs werden 5,21 Teile N-tert.-Butyloxycarbonyl-/i-alanyl-L-tryptophanyl-L-methioninhydrazid bei — 20⁰C zugegeben. Die entstehende Lösung wird mit 1,22 Teilen n-Butylnitrit behandelt und weitere 6 Minuten bei -20 bis -25°C gerührt. Die Mischung wird dann einer Lösung von 3,06 Teilen L-Aspartyl-L-phenylalaninamid in einer Mischung von 40 Teilen Dimethylformamid, 2 Teilen Wasser und 3,24 Teilen Triäthylamin bei 0⁰C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 3 Tage auf 0⁰C gehalten und dann mit einer 5%igen wäßrigen Zitronensäurelösung auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt. Die Lösung wird in 400 Teile Eiswasser eingegossen, und die entstehende Mischung wird gefiltert. Der feste Rückstand wird mit Wasser gewaschen und dann aus wäßriger 2-Äthoxyäthanollösung umkristallisiert. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-^-alanyl-L-tryptophanyl - L - methionyl - L - asparatyl - L - phenylalaninamid (Schmp. 229—230⁰C mit Zersetzung).

Das als Ausgangsstoff verwendete N-tert.-Butyloxycarbonyl - β - alanyl - L - tryptophanyl - L - methioninhydrazid kann wie folgt hergestellt werden: Einer Lösung von 19,72 Teilen N-tert.-Butyloxycarbonyl-ßalanyl - L - tryptophanyl - L - methioninmethylester in 200 Teilen Methanol werden 4,05 Teile 100%igen Hydrazinhydrats bei 15—20⁰C zugegeben. Die Mischung wird 36 Stunden auf 20—23°C gehalten und dann unter vermindertem Druck verdampft, bis 100 Teile Methanol abgedampft haben. Die Mischung wird dann gefiltert, und der feste Rückstand wird aus Äthanol umkristallisiert. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-^-alanyl-L-tryptophanyl-L-methioninhydrazid (Schmp. 218—219°C mit Zersetzung).

Das N-tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-L-tryptophanyl-L-methioninmethylester kann wie folgt hergestellt werden: Eine Lösung von 1,84 Teilen N-tert.-Butyloxycarbonyl - β - alanin - 2,4,5 - trichlorphenylester und 1,92 Teilen L-Tryptophanyl-L-methioninmethylester-hydrochlorid in 20 Teilen Dimethylformamid wird mit 0,505 Teilen Triäthylamin bei 0° C behandelt. Die Lösung wird 48 Stunden auf 0—5°C gehalten und dann einer Mischung von 100 Teilen Eis wasser, 0,06 Teilen Essigsäure und 80 Teilen Äthylacetat zugegeben. Die Äthylacetatschicht wird vom Gemisch abgetrennt. Die wäßrige Schicht wird mit 80 Teilen

Ö7Ö

Äthylacetat extrahiert, und der Extrakt wird mit der Äthylacetatschicht zusammengebracht. Dieses Gemisch wird dann nacheinander mit einer 5%igen wäßrigen Zitronensäurelösung, Wasser, einer wäßrigen n-Natriumbicarbonatlösung und schließlich Wasser, worauf es mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend unter vermindertem Druck eingedampft wird. Der Verdampfungsrückstand wird aus einem Äthylacetat-Cyclohexan-Gemisch umkristallisiert. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl- [I - alanyl - L - tryptophanyl - L - methioninmethylester (Schmp. 138—139°C).

Das L - Tryptophanyl - L - methioninmethylesterhydrochlorid kann wie folgt hergestellt werden: Eine Lösung von 8,99 Teilen N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl-L-methioninmethylester in 16 Teilen Äthylacetat wird mit 40 Teilen 3,4 n-Salzsäurelösung in Äthylacetat bei 15—20⁰C behandelt. Die Lösung wird 2 Stunden auf 20—22° C gehalten, worauf 400 Teile trockenen Äthers zugegeben werden. Die Mischung wird gefiltert, und der feste Rückstand wird 4mal mit trockenem Äther gewaschen. Somit erhält man L-Tryptophanyl-L-methioninmethylesterhydrochlorid (Schmp. 100—105⁰C mit Zersetzung).

Versuchsbericht

Die Aktivität der acylierten Tetrapeptide bei der Förderung der Sekretion von saurem Magensaft wurde durch die folgenden Verfahren gemessen:

a) Männliche gesunde Ratten mit einem Gewicht von 200 bis 260 g wurden über Nacht hungern gelassen und dann mit Urethan anästhetisiert. Hierauf wurde eine Tracheotomie durchgeführt, um sicherzustellen, daß die Atemwege klar waren. Ein Polyäthylenrohr wurde dann die Speiseröhre hinabgeschoben, bis die Spitze gerade den Magen erreichte. Die Speiseröhre wurde dann am Hals abgebunden, um ein Rücksickern von Salzlösung zu verhindern, und die Leibeshöhle wurde durch einen mittleren Längsschnitt geöffnet. Das Duodenum wurde festgelegt und zwei Ligaturen wurden in der Nähe des Pylorus herumgelegt, wobei darauf geachtet wurde, mesenterische Blutgefäße zu vermeiden. Die hintere Ligatur wurde aufgebunden und zum Zuziehen verwendet. Eine Polyäthylenkanüle wurde dann durch den Pylorus in den Magen über einen Schnitt im Duodenoum eingeführt und an Ort und Stelle festgebunden. Abschließend wurde die Leibeshöhle geschlossen,und der Magen wurde mit warmer Salzlösung mit einem konstanten Fluß von 1 ml/min über den ösophagus hinein und durch die Duodenalkanüle herausgespült. Eine Körpertemperatur von 31⁰C wurde mit Hilfe eines erhitzten Operationstisches aufrechterhalten. Das Perfusat wurde in Abständen von 10Minuten gesammelt und gegen 0,01 n-Natriumhydroxyd titriert, wobei Phenolphthalein als Indikator verwendet wurde. Die Natriumhydroxydlösung wurde von atmosphärischem Kohlendioxyd geschützt, indem sie in einem Polyäthylenreservoir gelagert wurde, das mit einem Sodaturm ausgerüstet war, welcher direkt mit einer 10 ml Mikrobürette verbunden war. Die Menge der alle 10 Minuten abgeschiedenen Säure wurde in μΕς. Salzsäure ausgedrückt.

Die Testverbindungen wurden durch intravenöse Injektion verabreicht, und die Reaktion der Säureabscheidung der Magenschleimhaut gegenüber dem Stimmulant wurde berechnet, wie es im folgenden Diagramm gezeigt ist, welches in typischer Weise die Reaktion eines Stimmulans für Magensäuresekretion zeigt.

Gesamte Säure in μΕς.

in Abständen von 10 Minuten

15 -

10 -

5 -

Grundsekretion

Gesamter Säureausstoß

Säurereaktion

Injektion der
Testverbindung

= Gesamter Säureausstoß — Grundsekretion.

Zeit in Intervallen
von 10 Minuten

Vorversuche zeigten, daß, sofern die Säurereaktion größer als oder gleich wie die Grundreaktion war, die erhaltenen Resultate aus einer Injektion bei einer Ratte sehr beträchtlich waren (p < 0,001). Es wurde gefunden, daß eine Injektion von I μg/kg Gastrin, das natürliche Hormon, das für die Magenabsekretion verantwortlich ist, nahezu immerzu eine Säurereaktion gleich der Grundsekretion ergab, und es wurden nur

solche Ratten verwendet, die eine solche Reaktion zeigten.

Die Aktivität der Testverbindung wird mit derjenigen von Gastrin in der gleichen Ratte verglichen, indem die Ratte 60 Minuten perfusiert wurde, wobei 1 g/kg Gastrin injiziert und die Reaktion wie oben gemessen wurde, worauf dann, 90 Minuten nach j der Gastrininjektion 4 g/kg der Testverbindung inji- j ziert wurden und wieder die Reaktion wie oben gemessen wurde. no

Eine Testverbindung, die eine Säurereaktion ergab, die größer als oder gleich wie die durch Gastrin hervorgerufene Reaktion war, wurde als beträchtlich aktiv als Stimulant für die Magensäuresekretion angesehen.

Die folgenden Verbindungen zeigen eine solche beträchtliche Aktivität.

X-Y-L-Try-L-Met-L-Asp-L-Phe-NH.,

worin Y = direkte Bindung und X = Acetyl, Benzoyl, ao ρ - Trifluoracetylaminobenzoyl, L- Butyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, ρ - Toluolsulfonyl, Carbamoyl, t.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl, t.-Butyloxycarbonyl-N-methyl-L-alanyl, /S-Alanyl, Acetyl-ß-alanyl, Pivaloyl-/?-alanyl, Benzoyl-jS-alanyl-, t.-Butyloxycarbonyl-/S-alanyl, Benzyloxycarbonyl -/?-alanyl, Benzoylglycyl, 2-Äthylhexanoylglycyl, N"-1. - Butyloxycarbonyl - Ν^ε-benzyloxycarbonyl -L- lysyl, N¹ - Benzyloxycarbonyl-Ν^ε -(4- chlor ο - 6 - dimethylaminotriazin - 2 - yl) - l - lysyl, Benzyloxycarbonyl -L- prolyl, t. - Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-homocysteinyl und Pyroglutamyl; worin X = t.-Butyloxycarbonyl und Y = L-Alanyl-L-tyrosylglycyl oder l - Alanyl - L - phenylalanyl - L - isoleucylglycyl und worin X = Benzyloxycarbonyl und Y = Glutamyl -L- glutamyl - L - alanyl -L- tyrosylglycyl.

b) In zwei Katzen wurde eine Magenfistel eingeführt, indem unter Pentabarbitonanästhesie eine rostfreie Stahlkanüle in den untersten Teil des Magens eingeführt wurde. Beide Katzen wurden 6 bzw. 8 Monate nach dem Eingriff beim Testverfahren verwendet.

Jede Katze wurde 15 Stunden ohne Nahrung gehalten, wobei sie jedoch Wasser erhielt, und wurde bei Bewußtsein in einen Schlingenrahmen eingehängt. Die Kanüle wurde geöffnet, und die Grundsekretion wurde 15 Minuten gesammelt. Die Testverbindung wurde in 0,15 n-Natriumchlorid aufgelöst, und der pH der Lösung wurde mit Ammoniak zwischen 7 und 8 eingestellt. Eine entsprechende Menge dieser Lösung wurde mit 0,15 n-Natriumchlorid verdünnt, und ein geeignetes Volumen, welches 10 μg Testverbindung enthielt, wurde subkutan in die Katze injiziert, nachdem die Grundsekretion gesammelt worden war. Die Magensekretion wurde dann 15 Minuten lang gesammelt, und die Menge Salzsäure, die in jeweils 15 Minuten abgeschieden wurde, wurde durch Titration gegen 0,1 n-Natriumhydroxydlösung unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt. Die Zeitdauer von 15 Minuten, während der die größte Menge Salzsäure abgeschieden wurde, wurde ermittelt, und die Menge dieser Sekretion, die kleiner als die Grundsekretion war, wurde in μΕς. ausgedrückt und als Spitzensäureausstoß bezeichnet. Der Mittelwert dieses Spitzensäureausstoßes wurde bei den beiden Katzen für eine jede der folgenden Testverbindungen ermittelt.

Die Testverbindungen besaßen die Formel

X-Y-L-Try-L-Met-L-Asp-L-Phe-NH₂

	Durch-
	schnittliche
X—Y—	Spitzensäure-
	abgabe
	in μΕς.
Y = direkte Bindung und
X = t.-Butyloxycarbonyl-	698
Benzyloxycarbonyl-	478
Carbamoyl-	585
t.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-	179
Pivaloyl-/S-alanyl-	1328
t.-Butyloxycarbonyl-jS-alanyl-	738
X = t.-Butyloxycarbonyl- und
Y = L-Alanyl-L-tyrosylglycyl-	392

509 517/400

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Acyliertes Peptidderivat der Formel

CH,

CH, · SCH,

CH, COOH

CH,

C_nH,

CH,

X — Y — NH · CH · CO ■ NH · CH · CO · NH · CH · CO ■ NH · CH ■ CO ■ NH,

worin Y direkte Bindung und X ein Acylradikal aus der Gruppe Acetyl, Benzoyl, t.-Butyloxycarbonyl und Benzyloxycarbonyl; oder ein Aminoacyl oder Acylaminoacylradikal, wobei das Aminoacylradikal ausgewählt ist aus L-Alanyl, N-Methyl-L-alanyl, ß-Alanyl, Glycyl, L-Prolyl, S-Benzylhomocysteinyl oder Pyroglutamyl und das Acylradikal ausgewählt ist aus den oben definierten Acylradikalen; oder Pivaloyl-ß-alanyl, N-2-Äthylhexanoylglycyl, ρ - Trifluoroacetylaminobenzoyl, p-Toluolsulfonyl, Carbamoyl, Acetyl-Y-aminobutyryl, Ν^ε-Benzyloxycarbonyl-L-lysyl, N^-Benzyloxycarbonyl-L-lysyl, N^a-t.-Butyloxycarbonyl-N^£-benzyloxycarbonyl-L-lysyl oder N^-Benzyloxycarbonyl - Ν^ε - (4 - chloro - 6 - dimethylaminotriazin-2-yl)-L-lysyl; oder Y L-Glutamyl-L-glutamyl - L - alanyl - L - tyrosylglycyl, l - Alanyl -L-tyrosylglycyl oder L - Alanyl - L - phenylalanyl-L-isoleucylglycyl und X t.-Butyloxycarbonyl oder Benzyloxycarbonyl.

2. N -1. - Butyloxycarbonyl - β - alanyl - L - tryptophanyl - L - methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamid.

3. Verfahren zur Herstellung eines acylierten Peptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) ein Tetrapeptid der Formel

HN

CH₂SCH₃

CH,

COOH

CH, C₆H₅
CH,

NH, · CH · CO ■ NH · CH · CO · NH ■ CH ■ CO · NH · CH · CO · NH,

oder ein Salz davon mit einem Derivat einer Säure der Formel X—Y—OH, worin die Säurefunktion aktiviert ist, oder mit einem geschützten Derivat davon oder mit einem Cyanosäurederivat acyüert, worauf sich eine Hydrogenolyse und/oder Hydrolyse anschließt, um gegebenenfalls vorliegende Schutzgruppen durch Wasserstoff zu ersetzen; oder daß man
b) ein Derivat einer Säure der Formel

HN

40

45 Hydrogenolyse und/oder Hydrolyse anschließt, um gegebenenfalls vorliegende Schutzgruppen durch Wasserstoff zu ersetzen; oder daß man c) ein Derivat einer Säure der Formel

HN

CH,

CH₂SCH₃
CH,

CH,

X —Y-NH CH COOH

55 X — Y — NH·CH·CO·NH·CH·COOH

worin die Säurefunktion aktiviert ist, oder ein geschütztes Derivat davon mit einem Dipeptidamid der Formel

worin die Säurefunktion aktiviert ist, oder ein geschütztes Derivat davon mit einem Tripeptidamid der Formel

CH₂ · SCH₃ COOH C₆H₅

CH, CH, CH,

I I I

NH₂ CH-CO-NH-CH-CO-NH CH CO NH₂ oder einem Salz davon umsetzt, worauf sich eine COOH

CH,

NH₂ · CH · CO · NH · CH · CO · NH₂

oder einem Salz davon umsetzt, worauf sich eine Hydrogenolyse und/oder Hydrolyse anschließt, um gegebenenfalls vorliegende Schutzgruppen durch Wasserstoff zu ersetzen; oder daß man

d) Ammoniak mit einem Ester der Formel

/-χ

HN

CH,

CH₂ · SCH₃ CH,

COOH