DE1493878C3 - Acylierte Peptidderivate, Verfahren zur Herstellung derselben und pharmazeutische Präparate, welche solche acylierte Peptidderivate enthalten - Google Patents
Acylierte Peptidderivate, Verfahren zur Herstellung derselben und pharmazeutische Präparate, welche solche acylierte Peptidderivate enthaltenInfo
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Description
oder einem geschützten Derivat davon umsetzt, worin RA ein niedriges Alkyl- oder Benzylradikal
bedeutet, worauf sich eine Hydrogenolyse und/oder Hydrolyse anschließt, um gegebenenfalls vorliegende
Sch Litzgruppen durch Wasserstoff zu ersetzen; wobei X und Y die in Anspruch 1 angegebenen
Bedeutungen besitzen.
4. Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Verbindung nach Anspruch 1
und ein pharmazeutisch zulässiges Träger- oder Verdünnungsmittel enthält.
'5
wurde. Die Dosis des verwendeten Histamins mußte ziemlich groß sein, nämlich 40 jj.g/kg. Es war deshalb
immer nötig eine Antihistamindroge gleichzeitig zu verabreichen, um seine Nebeneffekte zu verringern.
Die Sekretion des sauren Magensaftes kann auch durch das natürliche Hormon Gastrin stimuliert
werden. Die Verwendung von Gastrin zur Stimulierung der Magensäuresekretion ist aber nur von akademischem
Interesse, da Gastrin aus natürlichen Quellen isoliert werden muß, und deshalb unverhältnismäßig
teuer ist.
Es wurde nunmehr gefunden, daß gewisse acylierte Derivate von L-Tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid
die Eigenschaften besitzen, die Sekretion des sauren Magensaftes in ähnlicher Weise
wie das natürliche Hormon Gastrin zu stimulieren. Diese Verbindungen besitzen alle Eigenschaften von
Gastrin und können somit z. B. an Stelle von Gastrin als diagnostische Mittel für die Bestimmung der
Magenfunktion verwendet werden. Im allgemeinen sind sie nur geringfügig weniger wirksam als Gastrin.
Gegenstand der Erfindung ist also ein acyliertes Peptidderivat der Formel
CH2 ■ SCH3 COOH QH5
CH2 CH2 CH2 CH2
X — Y — NH■CH·CO·NH·CH·CO■NH·CH·CO·NH■CH·CO· NH2
Die Erfindung bezieht sich auf acylierte Peptidderivate, welche eine Stimulierung der Sekretion des
sauren Magensafts bei Säugern hervorrufen.
Das Maß des Säureausstoßes eines Patienten ist wichtig bei der Bestimmung der Magenfunktion.
Bisher wurde diese Messung dadurch ausgeführt, daß dem Patienten Histamin injiziert wurde und daß
dann der Magensaft über einen Katheter gesammelt
worin Y direkte Bindung und X ein Acylradikal aus der Gruppe Acetyl, Benzoyl, t.-Butyloxycarbonyl und
Benzyloxycarbonyl; oder ein Aminoacyl oder Acylaminoacylradikal, wobei das Aminoacylradikal ausgewählt
ist aus L-Alanyl, N-Methyl-L-alanyl, />'-AlanyI,
Glycyl, L-Prolyl, S-Benzyl-homocysteinyl oder Pyroglutamyl
und das Acylradikal ausgewählt ist aus den oben definierten Acylradikalen; oder Pivaloyl-ß-alanyl,
N - 2 -Äthylhexanoylglycyl, ρ - Trifiuoroacetylaminobenzoyl, ρ - Toluolsulfonyl, Carbamoyl, Acetyl-
γ - aminobutyryl, Νε - Benzyloxycarbonyl - L - lysyl,
N*-Benzyloxycarbonyl-L-lysyl, NM.-Butyloxycarbonyl-Nc-benzyloxycarbonyl-L-lysyI
oder Na-Benzyloxycarbonyl - Νε- (4 - chloro - 6 - dimethylaminotriazin-2-yl)-L-lysyl;
oder Y l- Glutamyl- L-glutamyl -L alanyl-L-tyrosylglycyl, L-Alanyl-L-tyrosylglycyl oder
L-Alanyl - L-phenylalanyl-L-isoleucylglycyl und X
t.-Butyloxycarbonyl oder Benzyloxycarbonyl.
Das Salz eines acylierten Tetrapeptidderivats nach der Erfindung ist zweckmäßig ein Alkalimetallsalz,
wie z. B. ein Natrium- oder Kaliumsalz, oder ein Ammoniumsalz.
Als bestimmte Beispiele für das durch X—Y— dargestellte
Radikal kann man folgende Radikale nennen: N-Benzoylglycyl, Pyroglutamyl, N-Acetyl, N-Benzoyl,
N^-tert.-Butyloxycarbonyl-N'-benzyloxycarbonyl-L-lysyl,
N-Benzyloxycarbonylglycyl, N-Benzyloxycarbonyl,
N-tert.-Butyloxycarbonylglycyl, Glycyl, N - Benzyloxycarbonyl - L - glutamyl - L - glutamyl - L-alanyl
- L - tyrosylglycyl, N - tert. - Butyloxycarbonyl, N-tert.-Butyloxycarbonyl-/i-alanyl, N-(L-2-Äthylhexanoyl)
- glycyl, N - ( d - 2 - Äthylhexynoyl)glycyl, N - ρ - (Trifluoracetylamino)benzoyl, N - Acetyl - /■;-alanyl,
N" - Benzyloxycarbonyl - Νε - (4 - chlor - 6 - dimethylaminotriazin-2-yl)-L-lysyl,
N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-1
-phenylalanyl-L-isoleucylglycyl,
N-Benzyloxycarbonyl-L-prolyl, N-p-ToluoIsulfonyl,
N-tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-homocysteinyl,
N - tert. - Butyloxycarbonyl - N - methyl - l - alanyl, N - Benzoyl - /i - alanyl, N - Acetyl - γ - aminobutyryl,
N-Carbamoyl, /i-Alanyl, N*-Benzyloxycarbonyl-L-lysyl,
Νε-Benzyloxycarbonyl-L-lysyl, S-Benzyl-L-homocysteinyl,
N - Benzyloxycarbonyl - p' - alanyl, N - Pivaloyl - ß- alanyl, N - tert. - Butyloxycarbonyl - L-
alanyl und N - tert. - Butyloxycarbonyl - L - alanyli.-tyrosylglycyl.
Besonders zweckmäßige acylierte Tetrapeptidderivate nach der Erfindung sind N-tert.-Butyloxycarbonyl
-L- alanyl - L - phenylalanyl - L - isoleucylglycyl-, N-Acetyl-, N-Benzoyk N-tcrt.-Butyloxycarbonyl-L
- alanyl, N - tert. - Butyloxycarbonyl - // - alanyl-,
N - Pivaloyl - ji - alanyl-, N - Bcnzyloxy - carbon) I - j!-
alanyl-, N-Acetyl-/;-alanyl-, N-/7-Alanyl- und
N - Carbamoyl - L - tryptophenyl - i. - mcthionyl - iaspartyl
- ι. - phenylalaninamid. wovon das erste, zweite, fünfte, sechste und letzte besonders bevorzugt
sind.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können dadurch hergestellt werden, daß man
a) ein Tetrapeptid der Formel
HN CH2SCH., COOH Q1H5
CH2 CH2 CH2 CH2
H1N · CH ■ CO ■ NH ■ CH · CO · NH ■ CH ■ CO ■ NH ■ CH · CO · NH,
oder ein Salz davon mit einem Derivat einer Säure der Formel X — Y — OH, worin die Säurefunktion
aktiviert ist, oder mit einem geschützten Derivat davon oder mit einem Cvansäurederivat acyliert.
worauf sich eine Hydrogenolyse und/oder Hydrolyse anschließt, um gegebenenfalls vorliegende Sehutzgruppen
durch Wasserstoff zu ersetzen; oder daß man b) ein Derivat einer Säure der Formel
Hydrogenolyse und/oder Hydrolyse anschließt, um gegebenenfalls vorliegende Schutzgruppen durch
Wasserstoff zu ersetzen; oder daß man
c) ein Derivat einer Säure der Formel
c) ein Derivat einer Säure der Formel
HN
CH1
X-Y —NH ■ CH · COOH
HN CH1SCH,
CH2 CH2
X-Y — NH CH -CO- NH CH ■ COOIl
worin die Säurefunktion aktiviert ist, oder ein geschütztes Derivat davon mit einem Dipeptidamid
der Formel
worin die Säurefunktion aktiviert ist, oder ein geschütztes Derivat davon mit einem Tripeptidamid der
Formel
COOH
CH2
CH2
QH5
CH1
CH1
CH2 · SCH3 COOH C6H5
CH2 CH2 CH2
NH2 ■ CH · CO ■ NH -CH-CO-NH-CH-CO-Nh2
oder einem Salz davon umsetzt, worauf sich eine
NH, · CH · CO · NH ■ CH ■ CO · NH1
oder einem Salz davon umsetzt, worauf sich eine Hydrogenolyse und/oder Hydrolyse anschließt, um
gegebenenfalls vorliegende Schutzgruppen durch Wasserstoff zu ersetzen; oder daß man
d) Ammoniak mit einem Ester der Formel
d) Ammoniak mit einem Ester der Formel
HN
CH,
CH2 ■ SCH, COOH CH2 CH2
QH5
CH,
CH,
X — Y — NH·CH·CO■NH·CH·CO■NH·CH·CO·NH·CH·CO·OR"
oder einem geschützten Derivat davon umsetzt, worin R" ein niedriges Alkyl- oder Benzylradikal
bedeutet, worauf sich eine Hydrogenolyse und/oder Hydrolyse anschließt, um gegebenenfalls vorliegende
Schutzgruppen durch Wasserstoff zu ersetzen, wobei X und Y die oben angegebenen Bedeutungen besitzen.
Als geschützte Derivate der Säuren der Formeln X —Y —OH.
HN
CH2
X--Y-NH-CH-COOH
HN J CH2 SCH3
CH2 CH2
X-Y - NH ■ CH -CO-NH- CH · COOH
worin X und Y die oben angegebenen Bedeutungen haben, können an sich bekannte geschützte Derivate
verwendet werden. Zum Schützen von Aminogruppen kann man also ?.. B. das Benzyloxycarbonyl-, das
p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, das tert.-Butyloxycarbonyl- oder das Trifluoracetylradikal verwenden,
während zum Schützen von Carboxylgruppen das Methyl-, das tert.-Butyl- oder das Benzylradikal
(Esterbildung) verwendet werden kann. Solche Schutzgruppen können in an sich bekannter Weise entfernt
werden.
Als Derivate der Säuren der letztgenannten drei Formeln, bei denen die Säurefunktion aktiviert ist,
können Derivate verwendet werden, die nach an sich bekannten Aktivierungsmethoden gebildet werden.
Solche Methoden sind z. B. Bildung eines Säurehalogenids, z. B. des Säurechlorids; Bildung eines gemischten
Anhydrids durch Reaktion mit einem Derivat einer sterisch gehinderten organischen Säure, wie z. B.
Pivaloylchlorid. oder durch Reaktion mit einem Derivat der Kohlensäure, wie z. B. Äthylchlorformat,
oder durch Reaktion mit Diphenylphosphorylchlorid; Bildung eines aktiven Esters, wie z. B. eines Nitrophenylesters,
wie des p-Nitrophenylesters, oder eines chlorierten Phenylesters, wie des 2,4,5-Trichlorphenylesters;
oder Bildung eines Azids; oder der Verwendung eines oder mehrerer Kondensierungsmittel, wie z. B.
^N'-Dicyclohexylcarbodiimid oder N,N'-Carbonylbis-imidazol.
Das jeweils zu verwendende Derivat einer eine aktivierte Säurefunktion aufweisenden Säure hängt
von der Säure selbst ab. Wenn also die Säurefunktion nicht an einem asymmetrischen Kohlenstoffatom angebunden
ist oder wenn sie an asymmetrischen Kohlenstoffatomen einer Aminosäure, bei welcher die Aminogruppe
durch ein Oxycarbonylradikal unter Bildung eines Radikals der Formel —O · CO · NH— acyliert
ist, gebunden ist, so kann jede der erwähnten Methoden angewandt werden. Ist aber die Säurefunktion am
asymmetrischen Kohlenstoffatom einer Aminosäure angebunden, bei welcher die Aminogruppe durch eine
Gruppe geschützt ist, die aber kein Radikal der Formel —O · CO · NH— bildet, so stellt die Bildung
des Azids die bevorzugte Methode dar.
Wenn das als Reaktionsteilnehmer verwendete Säurederivat ein Säurehalogenid, wie z. B. das Säurechlorid
oder -bromid, z. B. Benzyloxycarbonylchlorid, Acetylchlorid, Benzoylchlorid oder p-ToluolsuIfonylchlorid
ist, so kann die Reaktion zweckmäßig in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von
9 bis IO in Gegenwart von einem säurebindenden Mittel wie Natriumhydroxyd oder Triäthylamin durchgeführt
werden. Wenn das als Reaktionsteilnehmer verwendete Säurederivat ein aktives Ester wie der
p-Nitrophenylester oder der 2,4,5-Trichlorphenyl-
[O ester, oder das Azid oder ein gemischtes Anhydrid
ist, so kann die Reaktion zweckmäßig in Gegenwart eines Verdünnungs- oder Lösungsmittels und einer
Base, wie Triäthylamin, bei etwa O bis 10 C durchgeführt werden. Wenn ein freies Peptid als Reaktionsteilnehmer
verwendet wird, so braucht man höchstens einen äquivalenten Anteil der Base anzuwenden.
Wenn aber ein Peptid als Reaktionsteilnehmer in Form eines Salzes, wie z. B. des Trifluoracetats, verwendet
wird, so werden vorzugsweise ein bis zwei äquivalente Anteile der Base angewandt.
Die Reaktion bei der Verfahrensvariante d) kann zweckmäßig in Gegenwart eines Verdünnungs- oder
Lösungsmittels, wie z. B. Methanol, und bei —10 bis + 50 C durchgeführt werden.
Das als Ausgangsstoff verwendete Tetrapeptid kann dadurch hergestellt werden, daß ein /i-Ester des
L-Aspartyl-L-phenylalaninamids mit einem Derivat
des i.-Methionins zur Reaktion gebracht wird, wobei sich ein /»'-Ester des L-Methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamids
ergibt, der dann mit einem Derivat des L.-Tryprophans zur Reaktion gebracht wird, worauf
das entstehende Produkt hydrolysiert wird, um dabei das Tetrapeptid zu bilden.
Das als Ausgangsstoff verwendete Tripeptidamid kann aus einem geschützten Derivat des L-Methionins
und L-Aspartyl-L-phenylalanins hergestellt werden,
wobei die letztere Verbindung aus einem geschützten Derivat der Asparaginsäure und Phenylalaninamid
erzeugt werden kann.
Die Verbindung der Formel
HN
45
45
CH2
X —Y—NH ■ CH COOH
X —Y—NH ■ CH COOH
worin X und Y die oben angegebenen Bedeutungen haben, kann durch Acylierung von L-Tryptophan mit
einem Derivat der SäureX—Y — OH erzeugt werden,
wobei die Säurefunktion aktiviert ist und X und Y die oben angegebenen Bedeutungen haben.
Die als Ausgangsstoff verwendete Verbindung der Formel
HN
CH2 · SCH3
CH2 CH,
CH2 CH,
X — Y — NH■CH·CO·NH·CH·COOH
worin X und Y die oben angegebenen Bedeutungen
worin X und Y die oben angegebenen Bedeutungen
509 649/16
i 4 9 ό 8 7 β
haben, kann durch Acylierung von L-Tryptophanyl-L-methioninmethylester
mit der Säure X—Y — OH in der oben beschriebenen Weise und anschließender
Herstellung der Säure oder des aktivierten Derivats davon erzeugt werden.
Das als Ausgangsstoff verwendete Ester der Formel
HN
CH2 · SCH, COOH
CH, CH1
Q1H5
CH,
CH,
X — Y — NH · CH · CO · NH ■ CH · CO · NH · CH ■ CO · NH ■ CH · COOR'1
worin X, Y und R6 die oben angegebenen Bedeutungen
haben, kann durch Reaktion eines acylierten Derivats des L-Tryptophanyl-L-methionins mit einem Ester
des L-Aspartyl-L-phenylalanins oder durch Reaktion
eines acylierten Derivats des i.-Tryptophans mit einem Ester des L-Methionyl-L-aspartyl-i.-phenylalanins erzeugt
werden.
Wie oben angegeben, sind die acylierten Tetrapeptidderivate nach der Erfindung als diagnostische
und therapeutische Mittel verwendbar. Sie wirken insbesondere auf die Sekretion von Magensaft und
Bauchspeichel, auf Magen- und Darmtonus sowie auf Bewegungsfähigkeit und Pepsinprodukten bei Säugern.
Sie können deshalb bei Menschen als diagnostische Mittel und als Mittel zur Behandlung von Magen- und
Duodenalgeschwüren sowie paralytischem Heus angewandt werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin pharmazeutische Präparate, die aus einem oder mehreren der acylierten
Tetrapeptidderivate nach der Erfindung in Mischung mit einem oder mehreren nichtgiftigen pharmazeutisch
zulässigen Verdünnungsmitteln oder Trägern bestehen.
Die erfindungsgemäßen Präparate können in an sich bekannter Weise mit bekannten Arzneimitteiträgern
hergestellt werden. Als Beispiele für solche Massen sollen gegebenenfalls überzogene Tabletten,
Kapseln, wäßrige oder nichtwäßrige Lösungen oder Suspensionen, Emulsionen, wäßrige oder nichtwäßrige
injizierbare Lösungen oder Suspensionen, dispergierbare Pulver und Depotmassen erwähnt werden. Die
wäßrigen Lösungen können auch Dimethyisulfoxyd und/oder Natriumchlorid enthalten.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert, worin alle Mengenangaben auf das
Gewicht bezogen sind.
B e i s ρ i e 1 1
Eine Lösung von 178 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl
- L - aspartyl - L - phenylalaninamidtrifluoracetat (Schmp. 185—19O0C mit Aufsprudeln) in
2000 Teilen Dimethylformamid wird auf 00C gekühlt,
worauf 50,5 Teile Triäthylamin zugegeben werden. Die Mischung wird gerührt, und 90 Teile Hippursäure-2,4,5-trichlorphenylester
werden bei OC zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird dann 48 Stunden
auf 00C gehalten. Der pH-Wert des Gemisches wird
auf 1 durch tropfenweise Zugabe von einer 2n-Salzsäurelösung eingestellt, *worauf 5000 Teile Eiswasser
und 5000 Teile Äther zugesetzt werden. Die Mischung wird 15 Minuten bei 00C gerührt und anschließend
gefiltert. Der feste Rückstand wild mit Wasser gewaschen, und nach nochmaligem Waschen mit Äther
wird er unter vermindertem Druck bei 40 bis 50° C getrocknet. Somit erhält man N-Benzoylglycyl-L-tryptophanyl
- L - methionyl - L - aspartyl -1. - phenylalaninamid
(Schmp. 237—238 C mit Zersetzung). Das Produkt kann aus Äthanol umkristallisiert
werden, wobei es in Form von weißen, flockenartigen Nadeln absondert.
Das dabei verwendete Hippursäure-2.4,5-Trichlorphenylester kann wie folgt erzeugt werden: 179 Teile
Hippursäure und 217 Teile 2,4,5-Trichlorphenol werden
zu 2000 Teilen kochenden Acetonitril zugesetzt. Die entstehende Suspension wird rasch auf 30 C
abgekühlt, worauf 206 Teile Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid
zugegeben werden. Die Mischung wird 3 Stunden bei 20 bis 300C ununterbrochen gerührt und anschließend
5 Minuten gekocht. Die heiße Mischung wird gefiltert, und das Filtrat wird abgekühlt. Das aus
dem Filtrat ausscheidende farblose Produkt wird abgefiltert und aus Äthanol umkristallisiert. Somit
erhält man Hippursäure-2,4,5-trichlorphenylester (Schmp. 148—149°C).
Das als Ausgangsstoff verwendete L-Tryptophanyl-L
- methionyl - L - phenylalaninamidtrifluoracetat (Schmp. 185—1900C) kann wie Beispiel 1 oder 2
der britischen Patentanmeldung 26 352/64 hergestellt werden.
Bei Wiederholung von Beispiel 1 werden die 90 Teile Hippursäure-2,4,5-trichlorphenylester durch 78Teile
L-Pyroglutaminsäure-2,4,5-trichlorphenylester ersetzt. Somit erhält man L-Pyroglutamyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid
(Schmp. 232° C mit Zersetzung).
Das dabei verwendete L-Pyroglutaminsäure-2,4,5-trichlorphenylester
kann wie folgt hergestellt werden: 206 Teile N^'-Dicyclohexylcarbodiimid werden in
eine gerührten Lösung von 263 Teilen N-Benzyloxycarbonyl - L - pyroglutaminsäure und 198 Teilen
2,4,5-Trichlorphenol in 1000 Teilen trockenen Tetrahydrofurans bei 0—100C hineingegeben. Die Mischung
wird 16 Stunden auf 00C gehalten und anschließend
gefiltert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft, und der Rückstand
wird aus Äthanol umkristallisiert. Somit erhält man N-Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutaminsäure-2,4,5-trichlorphenylester
(Schmp. 107—108° C), wovon
443 Teile in 4000 Teilen Tetrahydrofuran gelöst werden, und die entstehende Lösung mit 50 Teilen eines
5%igen Palladium-auf-Holzkohle-Katalysators verrührt
wird, während Wasserstoff bei 18—22''C unter Atmosphärendruck in die Mischung eingeblasen wird,
bis die Entwicklung von Kohlendioxyd aufhört. Das Reaktionsgemisch wird dann zum Abtrennen
des Katalysators gefiltert, worauf das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft wird. Der so erhaltene
Rückstand wird aus Methanol umkristallisiert.
Somit erhält man L-Pyroglutamyl-2,4,5-trichlorphenylester (Schmp. 162- I63°C).
Bei Wiederholung von Beispiel 1 werden die 90 Teile Hippursäure-2,4,5-trichlorphenylester durch 46 Teile
p-Nitrophenylacetat ersetzt. Somit erhält man Na-Acetyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid
als weißen Feststoff (Schmp. 245—246°C
mit Aufsprudeln).
Bei Wiederholung von Beispiel 1 werden die90Teile
Hippursäure-2,4,5-trichlorphenylester durch 61 Teile p-Nitrophenylbenzoat ersetzt. Somit erhält man
NJ-Benzoyl-L-tryptophenyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid
als weißen Feststoff (Schmp. 228-230 C. mit Aufsprudeln).
F
Bei Wiederholung von Beispiel 1 werden die90Teile Hippursäure-2,4,5-trichlorphenylester durch 140 Teile
N* - tert. - Butyloxycarbonyl - Νε - benzyloxycarbonyl-L-lysin-2,4,5-trichlorphenylester
ersetzt. Somit erhält man N3 - tert. - Butyloxycarbonyl - Νε - benzyloxycarbonyl-L-lysyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid
als weißen Feststoff (Schmp. 207—208'C mit Aufsprudeln).
Bei Wiederholung von Beispiel 1 werden die90Teile Hippursäure-2,4,5-trichlorphenylester durch 140 Teile
N* - Benzyloxycarbonyl - Νε - tert. - butyloxycarbonyl-L-lysin-2,4,5-trichlorphenylester
ersetzt. Somit erhält man N2 - Benzyloxycarbonyl - Νε - tert. - butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenytalaninamid
als weißen Feststoff (Schmp. 216—217 C mit Aufsprudeln).
40
Bei Wiederholung von Beispiel 1 werden die90 Teile Hippursäure-2,4,5-trichlorphenylester durch 97 Teile
N-Benzyloxycarbonylglycin^AS-trichlorphenylester
ersetzt. Somit erhält man N-Benzyloxycarbonylglycyl-L
- tryptophany 1 - L - methionyl - L - aspartly - L - phenylalaninamid als weißen Feststoff. (Festgestellte Analyse:
C = 59,6%, H = 6,0%, N = 12,3%. Theoretische Analyse für C39H45O9N7S: C = 59,3%, H = 5,75%,
N= 12,5%). Die Reinheit des Produkts wird durch Hydrolyse einer kleinen Probe mit 6n-Salzsäurelösung
bestätigt. Das entstehende Hydrolysat wird an Hand eines Beckmannschen Aminosäure-Analysator
geprüft, wobei die folgenden Aminosäureverhältnisse festgestellt werden: Asparaginsäure 1,00;
Glycin 1,02; Methionin 0,87; Phenylalanin 1,00.
Es werden 1250 Teile Wasser in eine Lösung von 20 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamidtrifluoracetat
in 1600 Teilen Aceton hineingegeben. Der pH-Wert der Mischung wird dann auf 10,9 durch anteilweise Zugabe von n-Natriumhydroxydlösung
eingestellt. Dann werden 45,4 Teile Benzyloxycarbonylchlorid zugegeben, und die so erhaltene Reaktionsmischung wird 1,5 Stunden bei
18—25° C gerührt, während der pH-Wert der Mischung
durch anteilweise Zugabe von n-Natriumhydroxydlösung mittels eines selbsttätigen Titrierapparat
auf 10,9 gehalten wird. Das Aceton wird dann zum größten Teil unter vermindertem Druck abgedampft,
und die entstehende Mischung wird gefiltert. Der feste Rückstand wird zuerst mit Wasser
gewaschen und dann mit Äthylacetat und 2n-Salzsäurelösung verrührt. Die Äthylacetatschicht wird
abgetrennt und 3mal mit Wasser gewaschen, worauf sie über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet
und dann eingedampft wird. Der Verdampfungsrückstand wird in Äther suspendiert und anschließend
abfiltert. Somit erhält man N-Benzoyloxycarbonyl-L
- tryptophanyl - L - methionyl - L - asparty 1 - L - phenylalaninamid
als weißen Feststoff. Bei der Analyse mittels Dünnschichtchromatographie unter Anwendung
von Silikagel als Adsorbens und von einem Lösungssystem, bestehend aus der oberen Phase
einer Mischung von 25 Teilen n-Butanol, 6 Teilen Essigsäure und 25 Teilen Wasser, ließ das Ehrlich-Reagens
einen einzigen Fleck von RF0,93 erscheinen.
Eine Lösung von 240 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl
- L - aspartyl - L - phenylalaninamidtrifluoracetat in 2500 Teilen Dimethylformamid wird auf 0°C
gekühlt, worauf 68,5 Teile Triäthylamin zugegeben werden. Die Mischung wird gerührt, und 123 Teile
N-tert.-Butyloxycarbonylglycyl-2,4,5-trichlorphenylester
werden bei O'JC zugegeben. Die Mischung wird
dann 60 Stunden auf 18—22°C gehalten. Es werden
dann 60000 Teile Äthylacetat und 20000 Teile 2n-Salzsäurelösung zugegeben, worauf die Mischung
5 Minuten gerührt wird. Die Äthylacetatschicht wird abgetrennt und mit Wasser gewaschen. Sie wird dann
über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der feste
Rückstand wird mit 5000 Teilen Äthylacetat verrührt und dann abgefiltert. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonylglycyl
- L - tryptophanyl - L - methionyl - L-aspartyl-L-phenylalaninamid
als farblosen amorphen Pulver (festgestellte Analyse: C = 57,4%, H = 6,6%; N= 13,2%; theoretische Analyse für C36H47O9N7S:
C = 57,3%; H = 6,3%; N = 13,0%).
Beispiel 10
Es werden 100 Teile N-tert.-Butyloxycarbonylglycyl
- L - tryptophanyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamid
mit 3000 Teilen einer 75%igen wäßrigen Trifluoressigsäurelösung bei 15—20° C verrührt. Die entstehende
Lösung wird 20 Minuten auf 20—250C
gehalten. Der Überschuß an Trifluoressigsäure wird dann unter vermindertem Druck bei einer unter 37° C
liegenden Temperatur abgedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in Methanol aufgelöst, worauf
das Methanol unter vermindertem Druck wieder bei einer unter 37° C liegenden Temperatur abgedampft
wird. Der Rückstand wird wieder in Methanol aufgelöst, und das Methanol wird unter den gleichen
Bedingungen abgedampft. Der Verdampfungsrückstand wird nunmehr mit Äther verrührt und anschließend
abgefiltert. Somit erhält man Glycyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid
als einen farblosen, amorphen Feststoff.
Beispiel 11
Es werden 102 Teile N-Benzyloxycarbonyl-(y-tert.-butyl)
- L - glutamyl - (y - tert. - butyl) - L - glutamyl - L-alanyl-L-tyrosylglycin
in 10000 Teilen Dimethylformamid aufgelöst, und die entstehende Lösung wird auf
O'C abgekühlt. Anschließend werden zuerst 12.6 Teile
Triäthylamin und dann 33,5 Teile Diphenylphosphorylchlorid bei 0°C unter Rührung zugegeben, und die
entstehende Mischung wird weitere 40 Minuten bei O'C gerührt. Dann wird eine Lösung von 87 Teilen
L - Try ptophanyl - L - met hionyl - L - aspartyl - l - phenylalaninamidtrifiuoracetat
in 5000 Teilen Dimethylformamid und 25,2 Teilen Triäthylamin zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird 18 Stunden bei
18—22°C gerührt. Das Lösungsmittel wird unter
vermindertem Druck abgedampft, und der Rückstand wird mit Äthylacetat verrührt. Die Mischung
wird gefiltert, und der feste Rückstand (Schmp. 220 C mit Zersetzung) wird mit Äthylacetat gewaschen
und anschließend unter vermindertem Druck bei 40 C getrocknet. Es werden dann 30 Teile dieses Produkts
in 300 Teile einer 95%igen wäßrigen Trifhioressigsäurelösung
unter Rührung bei 15-20 C hineingegeben. Die Lösung wird 1 Stunde auf 20-25 C gehalten, worauf das Lösungsmittel unter vermindertem
Druck abgedampft wird. Der Rückstand wird mit Methanol verrührt, abgefiltert und unter vermindertem
Druck bei 40"C getrocknet. Somit erhält man N - Benzyloxycarbonyl - L -glutamyl -L- glutamyl-L-alanyl-L-tyrosylglycyl-L-try
ptophanyl-L-met hionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid
als einen farblosen Feststoff. Bei Elektrophorese bei einem pH-Wert von 6,1 bewegte sich eine Probe des Produkts gegen
die Anode als ein Einzelfleck.
Beispiel 12
Eine Lösung von 3,55 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl
- L - aspartyl - L - phenylalaninamidtrifiuoracetat in 30 Teilen Dimethylformamid wird aufO C
gekühlt, worauf 1,01 Teile Triäthylamin zugegeben werden. Die Mischung wird gerührt, während
1,84 Teile N-tert.-Butyloxycarbonyl-/)'-alanin-2.4,5-trichlorphenylester
bei 00C zugesetzt werden. Das Reaktionsgemisch wird 48 Stunden auf 0°C gehalten
und dann 24 Stunden auf 20—23°C erwärmt. Die Mischung wird dann zu 100 Teilen Eiswasser.0.37 Teilen
konzentrierten Salzsäure (Dichte = 1,18), 1.2 Teilen Essigsäure und 20 Teilen Äthylacetat zugegeben. Die
entstehende Mischung wird 15 Minuten bei 0—10 C
gerührt und dann gefiltert. Der feste Rückstand wird mit Wasser und dann mit Äthylacetat gewaschen und
anschließend unter vermindertem Druck bei 40—50° C
getrocknet. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid
(Schmp. 213°C mit Zersetzung).
Das als Ausgangsstoff verwendete N-tert.-Butyloxycarbonyl-/?-alanin-2,4,5-trichlorphenylester
(Schmp. 94—95°C) kann durch Wiederholung des Verfahrens
gemäß Beispiel 15 zur Herstellung von N-Acetyl-/^-alanin-2,4,5-trichlorphenylester
unter Anwendung von 9,5 Teilen N-tert.-Butyloxycarbonyl-^-alanin an
Stelle der 6,55 Teile N-Acetyl-ß-alanin erzeugt werden.
Beispiel 13
Bei Wiederholung von Beispiel 12 werden die 1,84 Teile N -tert.- Butyloxycarbonyl-ß- alanin -2,4,5-trichlorphenylester
durch 1,6 Teile N-(DL-2-Äthylhexanoyl)glycin-p-nitrophenylester ersetzt. Somit erhält
man eine Mischung von N-(L-2-Äthylhexanoyl)- und N-(D-2-Äthylhexanoyl)-glycyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid
(Schmp. 228—230° C mit Zersetzung).
Das als Ausgangsstoff verwendete N-(Di.-2-Äthylhexanoyl)-glycin-p-nitrophenylester
(Schmp. 135 bis 136 C) kann von N-(DL-2-Äthylhexanoyl)glycin, p-Nitrophenol
und N^N'-Dicyclohexylcarbodiimid nach
dem Verfahren gemäß P I e s s und B ο i s s ο η η a s in HeIv. Chim. Acta., 1963. Bd. 46. S. 160. erzeugt
werden.
Beispiel 14
Bei Wiederholung von Beispiel 12 werden die
1,84 Teile N-tert.-Butyloxycarbonyl -/;-alanin-2.4.5-trichlorphenylester
durch 2,06 Teile N-p-(Trifluoracetylamino)benzoesäure-2,4,5-trichlorphenylester
ersetzt. Somit erhält man N-p-(Trifluoracetylamino) benzoyl-L-try ptophanyl -L-met hionyl -i.-asparlyl -!.-phenylalaninamid
(Schmp. 229-231 C mit Zersetzung), das aus einer wäßrigen Essigsäurelösung umkristallisiert
werden kann.
Das als Ausgangsstoff verwendete N-p-(Trifluoracetylamino)
- benzoesäure - 2,4,5 - trichlorphenylester (Schmp. 164—168"C) kann von der freien Säure.
2,4,5-Trichlorphenol und Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid
in Äthylacetat nach dem Verfahren gemäß dem Aufsatz von P less und Boissonnas in HeIv.
Chim. Acta, 1963, Bd. 46. S. 160.
Beispiel 15
Es werden 3,17 Teile L-Tryptophanyl-i.-methionyl-L
- aspartyl - L - phenylalaninamidhydrochlorid in 30 Teilen Dimethylformamid bei 60 C aufgelöst. Die
Lösung wird rasch auf 20: C gebracht, worauf 1,01 Teile
Triäthylamin zugegeben werden. Die Mischung wird gerührt und auf 00C gebracht, worauf 1.86 Teile
N - Acetyl - /i - alanin - 2,4,5 - trichlorphenylester zugegeben
werden. Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunden beiO—5°C gerührt. Dann werden 10 Teile Wasser
zugegeben, worauf die Mischung weitere 24 Stunden bei 0—5rC gerührt wird. Es werden dann 30 Teile
Wasser zugesetzt, und das Gemisch wird in eine Mischung von 100 Teilen Eiswasser. 0,74 Teilen konzentrierten
Salzsäure (Dichte 1,18) und 20 Teilen Äthylacetat hineingegeben. Die entstehende Mischung
wird 15 Minuten bei 0—10°C gerührt und anschließend
gefiltert. Der feste Rückstand wird mit Wasser und dann mit Äthylacetat gewaschen und anschließend
aus einer wäßrigen 2-Äthoxyäthanollösung umkristallisiert.
Somit erhält man N-Acetyl-p'-alanyl-L
- tryptophanyl - L- methionyl - L - aspartyl -1. - phenylalaninamid
(Schmp. 245°C mit Zersetzung).
Das dabei verwendete N-Acetyl-/i-alanin-2,4,5-trichlorphenylester
kann wie folgt hergestellt werden: Eine Lösung von 9,87 Teilen 2,4,5-Trichlorphenol in
100 Teilen Methylenchlorid wird in eine gerührte Suspension von 6,55 Teilen N-Acetyl-ß-alanin in
250 Teilen Acetonitril hineingeben. Die Mischung wird auf 00C gebracht und mit einer Lösung von
11 Teilen N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid in 100 Teilen
Methylenchlorid behandelt. Das Reaktionsgemisch wird 40 Stunden bei 20—22°C gerührt und anschließend
gefiltert. Das Filtrat wird eingedampft, und der Verdampfungsrückstand wird aus einer Mischung
von Äthylacetat und Petroläther (Sdp. 60—8O0C)
umkristallisiert. Somit erhält man N-Acetyl-//-alanin-2,4,5-trichlorphenylester
(Schmp. 88—900C).
Beispiel 16
Bei Wiederholung von Beispiel 15 werden die 1,86 Teile N-Acetyl - /i- alanin- 2,4,5 -trichlorphenyl-
ester durch 3,08 Teile Na-Benzyioxycarbonyl-N':-
(4-chlor-6-dimethylaminotriazin-2-yl)-L-lysin-2.4.5-trichlorphenylester
ersetzt. Somit erhält man N°-Benzyloxycarbonyl-Nf-(4-chlor-6-dimethylaminotriazin-2-yl)-L-lysyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-
L-phenylalaninamid (Schmp. 233°C mit Zersetzung).
Das hierbei verwendete N^-Benzyloxycarbonyl-N1-(4-chlor-6-dimethylaminotriazin-2-yl)-L-lysin-2,4,5-trichlorphenylester
kann wie folgt hergestellt werden: Es werden 1.03 Teile Ν,Ν'-Dicyclohcxylcarbodiimid
in eine gerührte Lösung von 0,437 Teilen N"-Benzyloxycarbonyl-Nc-N':-(4-chlor-6-dimethylaminotriazin-2-yl)-L-lysin
und 0,217 Teilen 2,4,5-Trichlorphenol in 5 Teilen trockenen Tetrahydrofurans bei OC
hineingegeben. Die Mischung wird 18 Stunden bei 0—2 C gerührt und anschließend gefiltert. Das Filtrat
wird eingedampft, und der Rückstand wird aus Äthylacetat umkristallisiert. Somit erhält man
N3 - Benzvioxycarbonyl - N£ - (4 - chlor - 6 - dimethylaminotriazin
- 2 - yl)- L- lysin -2,4,5- trichlorphenylester
(Schmp. 167-168 C).
Das dabei verwendete NF-Benzyloxycarbonyl-N'-(4-chlor-6-dimethylaminotriazin-2-yl)-L-lysin
kann wie folgt hergestellt werden:
Eine Lösung von l,93Teilen 2-Dimethylamino-4,6-dichlortriazin in ISTeilen Aceton wird in lOTeile kräftig
gerührten Eiswassers während 5 Minuten tropfenweise hineingegeben. Die entstehende feinverteilte
Suspension wird gerührt und auf 300C erwärmt, worauf eine Lösung von 2,8 Teilen N^-Benzyloxycarbonyl-L-lysin
in 10 Teilen n-Natriumhydroxydlösung während 10 Minuten tropfenweise bei 30 bis 35°C zugegeben wird. Die Mischung wird dann
weitere 15 Minuten bei 30—35°C gerührt. Während
der Zugabe und des nachträglichen Rührens wird der pH-Wert dadurch auf 10 bis 10,5 gehalten, daß
10 Teile n-Natriumhydroxydlösung tropfenweise zugegeben wird. Das Aceton wird dann zum größten
Teil unter vermindertem Druck abgedampft, worauf die verbleibende wäßrige Lösung mit Essigsäure
angesäuert wird. Die Mischung wird gefiltert und der feste Rückstand aus Äthanol umkristallisiert. Somit
erhält man NP-Benzyloxycarbonyl-N^-chlor-o-dimethylaminotriazin-2-yl)-L-lysin
(Schmp. 161 bis 1620C).
Beispiel 17
Eine Lösung von 3,55 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl
- L - aspartyl - L - phenylalaninamidtrifluoracetat in 50 Teilen Dimethylformamid wird auf 00C
gekühlt und mit 1,01 Teilen Triäthylamin behandelt. Es werden dann 3,43 Teile N-tert.-Butyloxycarbonyl-L
- alanyl - l - phenylalanyl - L - isoleucylglycin - 2,4,5 - trichlorphenylester zugegeben, worauf die Mischung
2 Tage bei 0—5°C gerührt wird. Dann werden 50 Teile
Wasser zugesetzt, und die Mischung wird noch ein Tag bei 20—25 C gerührt. Die Mischung wird auf
50—6O0C erwärmt und anschließend gefiltert. Der
feste Rückstand wird 15 Minuten mit 100 Teilen
kochenden Äthylacetats verrührt, und die heiße Mischung wird gefiltert. Der feste Rückstand wird
in 150 Teilen heißer Essigsäure aufgelöst, worauf 100 Teile Wasser der Lösung zugegeben werden.
Die aus der Mischung ausscheidenden Kristalle werden abgefiltert, mit einer 50%igen wäßrigen
Essigsäurelösung gewaschen. Die Kristalle werden dann mit Äthylacetat gewaschen und unter Vakuum
bei 40—50 C getrocknet. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl
- L - alanyl - L - phenylalanyl - L - isoleucylglycyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid
(Schmp. 248—2500C mit Zersetzung).
Bei der Analyse mittels Dünnschichtchromatographie unter Anwendung von Silikagel als
Adsorbens und von einem Lösungssystems,bestehend aus der oberen Phase einer Mischung von 40 Teilen
n-Bulanol, 10 Teilen Essigsäure und 50 Teilen Wasser,
ließ das Ehrlich-Reagens einen einzigen Fleck von RF 0,79 erscheinen. Bei Verwendung eines Lösungssystems, bestehend aus 75 Teilen Isobutanol und
25 Teilen einer 3%igen Ammoniumhydroxydlösung, erschien ein einziger Fleck von RF 0,46.
Das als Ausgangsstoff verwendete N-tert.-Butyloxycarbonyl
- L - alanyl - L - phenylalanyl - L - isoleucylglycin-2,4,5-trichlorphenylester (zersetzt über 2600C)
kann von der Säure, 2,4,5-Trichlorphenol und N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid nach dem Verfahren
gemäß dem Aufsatz von P 1 e s s und Boissonnas ίη der Zeitschrift HeIv. Chim. Acta., 1963, Bd. 46,
S. 160. erzeugt werden.
Beispiel 18
Eine Lösung von 1,78 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl
- L. - aspartyl - L - phenylalaninamidtriftuoracetat in 15 Teilen Dimethylformamid wird auf0JC
gekühlt, worauf 0.505 Teüe Triäthylamin zugegeben werden. Dann werden 0.93 Teile N-Benzyloxycarbonyl-L-prolin-p-nitrophenylester
zugegeben, und die Mischung wird 48 Stunden bei 0' C und dann 24 Stunden
bei 20—22 C gerührt Nach Zugabe von 70 Teilen Eiswasser wird die Mischung mit 20 Teilen Äthylacetat
beim Rückwaschen mit Wasser gewaschen. Die wäßrige Phase und die Rückwaschabgänge werden
auf einen pH-Wert von 2 mit n-Salzsäurelösung eingestellt,
worauf die Mischung gefiltert wird. Der feste Rückstand wird aus Äthanol umkristallisiert. Somit
erhält man N-Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid
(Schmp. 238—240 C mit Zersetzung).
Beispiel 19
Es werden 63,3 Teile L-Tryptophanyl-L-methionyl
- L - aspartyl - L - phenylalaninamidhydrochlorid in lOOOTeile Wasser mit 220Teilen n-Natriumhydroxydlösung
hineingegeben. Die Mischung wird bei 20 bis 22°C so lange gerührt, bis sich eine klare Lösung
ergibt, worauf eine Lösung von 10,5 Teilen p-Toluolsulfonylchlorid
in 200 Teilen Aceton während einer Stunde zugegeben wird, wobei der pH-Wert des Reaktionsgemisches durch periodische Zugabe von
n-Natriumhydroxydlösungauf 10 bis 11 gehalten wird.
Die Mischung wird weitere 2 Stunden bei 20—22° C
gerührt, wobei der pH-Wert dadurch auf 10 bis 11
gehalten wird, daß n-Natriumhydroxydlösung bei Bedarf zugegeben wird. Die Mischung wird mit
Äther extrahiert, und die wäßrige Phase wird auf einen pH-Wert von 2 mittels n-Salzsäurelösung eingestellt.
Die Mischung wird gefiltert, und der feste Rückstand wird mit Wasser und dann mit Äthylacetat
gewaschen. Somit erhält man N-p-Toluolsulfonyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid
(Schmp. 233—234rC mit Zersetzung).
Eine Lösung von 3,55 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl
- l - aspartyl - L - phenylalaninamidtrifluor-
509 649/16
acetat in 30 Teilen Dimethylformamid wird auf OC gekühlt. Darauf werden zuerst 1,01 Teile Triüthylamin
und dann 2,52 Teile N-tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-homocystein-2.4,5-trichlorphenylester
zugegeben, worauf die Mischung 4 Tage bei 0—5°C
gerührt wird. Die Mischung wird in eine Mischung von 120 Teilen Eiswasser, 0,37 Teilen konzentrierter
Salzsäure und 1.2 Teilen Essigsäure hineingegeben. Die Mischung wird 30 Minuten bei 0—10 1C gerührt
und dann gefiltert. Die festen Rückstände werden mit Wasser und dann mit Äther gewaschen und anschließend
aus Äthanol umkristallisiert. Somit erhält man N - tert. - Butyloxycarbonyl - S - benzyl - l - homocysteinyl
- L - tryptophanyl -L- methionyl -L- aspartyl-L-phenylalaninamid
(Schmp. 215 -216 C mit Zer-Setzung).
Das dabei verwendete N-tert.-Butyloxycarbonyl-S - benzyl - L - homocystein - 2.4.5 - trichlorphenylester
kann wie folgt hergestellt werden: Es werden einer gerührten Lösung von 3,25 Teilen N-tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-t,-homocystein
und 1,98 Teilen 2,4,5-Trichlorphenol in 20 Teilen Äthylacetat 2,06 Teile
N,N' - DicyclohexylcarbodiiiTiid bei 0—IOC zugegeben.
Die Mischung wird bei 0"C während 18 Stunden gerührt und dann gefiltert. Das Filtrat wird
unter vermindertem Druck eingedampft, und der Verdampfungsrückstand wird aus Cyclohexan umkristallisiert.
Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-homocystein-2,4,5-trichlorphenylester
(Schmp. 111 — 112 C).
Bei Wiederholung von Beispiel 20 werden die 2,52 Teile N - tert. - Butyloxycarbonyl - S - benzyl - 1.-homocystein
- 2,4,5 - trichlorphenyiester durch 1,92 Teile N - tert. - Butyloxycarbonyl - N - methyl - lalanin
- 2,4,5 - trichlorphenylester ersetzt. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-N-methyi-L-alanyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid
(Schmp. 180—185°C mit Zersetzung).
Das N-tert.-Butyloxycarbonyl-N-methyl-L-alanin-2,4,5-trichlorphenylester
kann als öl nach dem Verfahren gemäß dem Aufsatz von P1 e s s und
Boissonnas in der Zeitschrift HeIv. Chim. Acta.. 1963, Bd. 46, S. 160, hergestellt werden.
Bei Wiederholung von Beispiel 20 werden die 2,52 Teile N - tert. - Butyloxycarbonyl - S - benzyl - L-homocystein-2,4,5-trichlorphenylester
durch 3,09 Teile N^Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysylglycin
- 2,4,5 - trichlorphenylester ersetzt. Somit erhält man N'-Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysylglycyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-
L-aspartyl-L-phenylalaninamid (Schmp. 200—2010C
mit Zersetzung).
Das Ν" - Benzyloxycarbonyl - Νε - tert. - butyloxycarbonyl
- L - lysylglycin - 2,4,5 - trichlorphenylester (Schmp. 126—127°C) kann nach dem Verfahren gemaß
Pless und Boissonnas (s. HeIv. Chim.
Acta., 1963, Bd. 46, S. 160) aus der entsprechenden Säure (Schmp. 131—132°C) hergestellt werden, die
selbst aus dem entsprechenden Methylester (Schmp. 91—92°C) hergestellt wird, das aus N'-Benzyloxycarbonyl
- Νε - tert. - butyloxycarbonyl - L - lysin und
Glycinmethylester nach dem bekannten Verfahren mit gemischten Anhydriden erzeugt wird.
Beispiel 23
Eine Lösung von 1,78 Teilen i.-Tryptophanyl-L-methionyl
- L - aspartyl - 1. - phenylalaninamidtrifiuoracetat in 15 Teilen Dimethylformamid wird auf 00C
gekühlt, woraufO,505 Teile Triäthylamin und 1.08Teile N- Benzyloxycarbonyl -1,- valin - 2,4,5- trichlorphenylester
zugegeben werden. Die Mischung wird 2 Tage bei 0—5°C und dann einen Tag bei 20 22 C gerührt.
Die Mischung wird dann einer Lösung von 0.37 Teilen konzentrierter Salzsäure (Dichte 1.18) in 50 Teilen
Eiswasser zugesetzt. Die entstehende Mischung wird 30 Minuten bei 20—25"C gerührt und dann gefiltert.
Der feste Rückstand wird mit Wasser und dann mit Äther gewaschen und anschließend aus einer wäßrigen
2-Äthoxyäthanollösung umkristallisiert. Somit erhält man N - Benzyloxycarbonyl -1. - val vl -1. - tryptophanyl-L-methionyl-L-aspart}
l-i.-phenylaianinamid (Schmp.
246 -247 C mit Zersetzung).
Beispiel 24
Bei Wiederholung von Beispiel 23 weiden die 1,08 Teile N - Benzyloxycarbonyl -1. - valin - 2.4,5 - trichlorphenylester
durch 1,2 Teile N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanin-2,4,5-trichlorphenylester.
Somit erhält man N- Benzyloxycarbonyl -1. - phenylalanyl-L-tryptophanyl-L-methionyl
-1. -aspartyl -1. - phenylalaninamid (Schmp. 241-243 C mit Zersetzung),
das aus wäßriger Essigsäurelösung umkristalüsiert werden kann.
Be
i s ρ i e 1 25
Eine Lösung von 3,41 Teilen i.-Tryplophanyl-L-methionyl
-L- aspartyl -1, - phenylalaninamidtrifluoracetat in 20 Teilen Dimethylformamid mit 1,01 Teilen
Triäthylamin wird mit einer Lösung von 1,86 Teilen N - Benzoyl - β - alanin - 2,4,5 - trichlorphenylester in
40 Teilen Dimethylformamid vermengt (bei 0 C). Die Lösung wird 60 Stunden auf OC gehalten, worauf
der pH-Wert mit Zitronensäure auf 2 bis 3 eingestellt wird. Die Lösung wird dann mit 500 Teilen Eiswasser
verdünnt, und der so erhaltene Feststoff wird abgefiltert, mit Wasser und dann mit Diäthylather gewaschen
und anschließend aus wäßriger 2-Methoxyäthanollösung umkristallisiert. Somit erhält man
N-Benzoyl-ß-alanyl-L-tryptophanyl-1-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid
(Schmp. 2(X)—20 Γ C).
Das als Ausgangsstoff verwendete N-Benzoyl-^'-alanin-2,4,5-trichlorphenylester
kann wie folgt hergestellt werden: Eine Lösung von 9,87 Teilen 2,4,5-Trichlorphenol
in 100 Teilen Methylendichlorid wird einer gerührten Suspension von 9,65 Teilen N-Benzoyl-/i-alanin
in 250 Teilen Acetonitril bei O'C zugesetzt, worauf eine Lösung von 11 Teilen Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid
in 100 Teilen Methylendichlorid zugegeben wird. Das Reaktionsgemisch wird 40Stunden
bei Umgebungstemperatur gerührt und dann gefiltert. Der feste Rückstand wird mit Methylendichlorid
gewaschen, und das Filtrat und die Waschabgänge werden eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird mit Petroläther (Sdp. 60—8O0C)
zerrieben, worauf der Feststoff abgefiltert und aus einer Mischung von Äthylacetat und Petro'äther (Sdp.
60—8O0C) umkristallisiert wird. Somit erhält man
N-Benzoyl-/i-alanin-2,4,5-trichlorphenylester (Schmp.
120—122°C).
Bei Wiederholung von Beispiel 25 werden die 1.86 Teile N - Benzoyl - /; - alanin - 2,4,5 - trichlorpheny I-ester
durch 1,63 Teile N-Acetyl-y-aminobuttersaure-2.4,5-irichlorphenylester.
Das Produkt wird aus einem M et ha nol-Äthylacetat-Gemisch umkristallisiert.
Somit erhält man N-Acetyl-y-aminobutyryl-i.-tryptophanyl-t.-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid
(Schmp. 217 218 C).
Das dabei verwendete N-Acetyl-y-aminobuttersäure-2,4,5-trichlorphenylester
kann wie folgt hergestellt werden: Einer gerührten Suspension von 1,45 Teilen N-Acetyl-;'-aminobuttersäure in 15 Teilen
Acetonitril werden 1,98 Teile 2,4,5-Trichlorphenol bei
0 C zugegeben. Eine vorgekühlte Lösung von 2,3Teilen !^,N'-Dicyclohexylcarbodiimid in 5 Teilen Acetonitril
wird dann zugegeben, worauf die Mischung 18 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt wird. Die Mischung
wird gefiltert, und der feste Rückstand wird in 30 Teilen heißen Methanols aufgelöst. Dann werden
60 Teile heißen Äthylacetats zugegeben, und die Lösung wird abgekühlt. Der dabei niedergeschlagene
Feststoff wird abgefiltert, und das Filtrat wird eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird aus
Äthylacetat umkristallisiert, so daß man N-Acetyl- ;>
- aminobuttersäure - 2,4,5 - trichlorphenylester (Schmp. 122—-124'C) erhält.
e ι s ρ ι e
27
hiner Suspension von 1,77Teilen L-Tryptophanyl-L
- methionyl - l - aspartyl - L - phenylalaninamidtrifluoracetat
in 10 Teilen Wasser und 10 Teilen Dimethylformamid werden 2,8 Teile N-Methylmorpholin
zugegebeii, und die Mischung wird zum Auflösen 30 Minuten gerührt. Mit Eisessigsäure wird der
pH-Wert der Lösung auf 8 eingestellt, worauf eine Lösung von 1,08 Teilen Kaliumcyanat in 5 Teilen
Wasser zugegeben wird. Die Mischung wird 24 Stunden auf Umgebungstemperatur gehalten und dann
mit 100 Teilen Wasser verdünnt. Der pH-Wert der Mischung wird mit 2n-Salzsäurelösung auf 2 bis 2,5
gebracht, worauf der niedergeschlagene Feststoff abgefiltert und aus wäßriger Dimethylformamidlösung
umkristallisiert wird. Somit erhält man N-Carbamoy 1 -L- tryptophanyl - L - methionyl - L - aspartyl - L-phenylalaninamid
(Schmp. 205—2060C).
Einer Suspension von 1,54 Teilen N-tert.-Butyloxycarbonyl-
β - alanyl - L - tryptophanyl - l - methionyl - L-aspartyl-L-phenylalaninamid
in 10 Teilen Essigsäure wird eine Mischung von 2,5 Teilen einer 3,8n-SaIzsäurelösung
und Äthylacetat zugegeben. Die Mischung wird dann etwa 15 Minuten bei 20—22°C
gerührt, bis sich eine klare Lösung ergibt, worauf die Lösung noch 30 Minuten bei 20—22°C gerührt wird.
Dann werden 60 Teile trockenen Äthers zugegeben, und die Mischung wird gefiltert. Der feste Rückstand
wird 3mal mit Äther gewaschen und anschließend bei 30—40°C unter Vakuum getrocknet. Somit erhält
man /)'-Alanyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamidhydrochlorid,
das bei 208°C zersetzt.
Es werden 15 Teile N'-Benzyloxycarbonyl-NMert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-
L-aspartyl-L-phenylalaninamid zu 100 Teilen einer
wäßrigen 80%igen Trifluoressigsäurelösung zugegeben. Die Mischung wird 45 Minuten bei 20—22°C
gerührt, worauf 600 Teile trockenen Äthers zugesetzt werden. Die Mischung wird gefiltert, und der Feststoff
wird 4mal mit trockenem Äther gewaschen und anschließend bei 20----25"C getrocknet (unter vermindertem
Druck). Somit erhält man N*-Benzyloxycarbonyl - L - lysyl - L - tryptophanyl - L - methionyl - L-aspartyl
-1. - phenylalaninamidtrifiuoracetat (Schmp. 198-200 C mit Zersetzung).
Beispiel 30
Bei Wiederholung von Beispiel 29 werden die 15 Teile des isomerischen N'-Benzyloxycarbonyl-N'-tert.
- butyloxycarbonylderivats durch 15 Teile Nc - tert. - Butyloxycarbonyl - Nc - benzyloxycarbonyli.-lysyll-tryptophanyl-L-methionyl
- L-aspartyl -L-phenylalaninamid ersetzt. Somit erhält man Nc-Benzyloxycarbony
1- L- lysyl -L -tryptophanyl - L-methionyl-ι.-aspartyl-l-phenylalaninamidtrifiuoracetat
(Schmp.
192—193 C mit Zersetzung).
Beispiel 31
Bei Wiederholung von Beispiel 29 werden die I 5 Teile N"- Benzyloxycarbonyl - Νε- tert. - butyloxycarbonyl
- L - lysyl -1. - tryptophanyl - L - methionyl - L-aspartyi-L-phenylalaninamid
durch 15 Teile N^-Benzyloxycarbonyi - N'c- tert. - butyloxycarbonyl -L-iysylglycyl
- L - tryptophanyl - f. - methionyl - L - aspartyl - L-phenylalaninamid ersetzt. Somit erhält man Na-Benzyloxycarbonyl
- L - lysylglycyl -L- tryptophanyl - L-methiony! - L - aspartyl -1. - phenylalaninamidtrifiuoracetat
als weißen Feststoff. Bei der Analyse durch Dünnschichtchromaiographie unter Anwendung von
Silikagel als Adsorbens und von einem Lösungssystem, bestehend aus der oberen Phase einer Mischung
von 25 Teilen n-Butanol, 6 Teilen Essigsäure und 25 Teilen Wasser, erschien ein einziger Fleck
von RF 0,67.
Beispiel 32
Es wird 1 Teil N-tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L
- homocysteinyl - L - tryptophanyl - L - methionyl - L-aspartyl - L - phenyialaninamid zu 10 Teilen einer
80%igen wäßrigen Trifluoressigsäurelösung zugegeben. Die Mischung wird 1 Stunde bei 20—22°C
gerührt, worauf 60 Teile trockenen Äthers zugegeben werden. Die Mischung wird gefiltert, und der feste
Rückstand wird 4mal mit trockenem Äther gewaschen und anschließend unter vermindeitem Druck bei
20—25°C getrocknet. Somit erhält man S-Benzyl-L
- homocysteinyl - L - tryptophanyl - L - methionyl - L-aspartyl-L-phenylalaninamidtrifiuoracetat.
Bei der Analyse durch Dünnschichtchromatographie unter Anwendung von Silikagel als Adsorbens und von
einem Lösungssystem, bestehend aus der oberen Phase einer Mischung von 25 Teilen n-Butanol,
6 Teilen Essigsäure und 25 Teilen Wasser, erschien ein einziger Fleck.
B e i s ρ i e 1 33
Eine Lösung von 3,17 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl
- l - aspartyl - L - phenylalaninamidhydro- chlorid in 40 Teilen Dimethylformamid wird auf 0^C
gekühlt, worauf 1,01 Teile Triäthylamin zugegeben werden. Die Mischung wird gerührt, während 2,21 Teile
N-Benzyloxycarbonyl-fj-alanin^AS-trichlorphenyl-
ester bei O1C zugegeben werden. Das Reaktionsgemisch wird 18 Stunden bei 0-- 5 C gerührt, worauf
10 Teile zugegeben werden. Die Mischung wird dann noch 24 Stunden bei 20-22 C gerührt. Die Mischung
wird dann auf 70-75 C erwärmt, bis der Feststoff gänzlich gelöst ist (gewöhnlich nach 2 Minuten).
Die entstehende heiße Lösung wird dann in eine gerührte Mischung von 500 Teilen Eiswasser.
10 Teilen n-Salzsäurelösung und 200 Teilen Cyclohexan
gegossen. Die Mischung wird gefiltert, und der feste Rückstand wird mit Wasser und dann mit Äther
gewaschen und anschließend aus 2-Äthoxyäthanol umkristallisiert. Somit erhält man N-Benzyloxycarbonyl
- [1 - alanyl -L - tryptophan}! -1. - methionyl -L-aspartyl
- L - phenylalaninamid iSchmp. 230—232 C
mit Zersetzung).
Das dabei verwendete N-Benzyloxycarbonyl-/;-alanin-2,4,5-trichlorphenylester
kann durch Wiederholung des Verfahrens gemäß Beispiel 20 zur Herstellung von N-teil.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-homocystein-2,4.5-trichlorphenylester
erzeugt werden, wobei aber die 3,25 Teile N-lert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-i.-homocyslein
durch 2.23 Teile ,/-Alanin ersetzt
werden. Somit erhält man N-Benzyloxycarbonyl-/;'-alanin-2,4.5-lrichlorphenylester
(Schmp. 94—95 C).
Beispiel 34
Eine Lösung von 3,17 Teilen L-Tryptophanel-L-methionyl
- L - aspartyl - 1. - phenylalaninamidhydrochlorid in 40 Teilen Dimethylformamid wird auf OC
gekühlt, worauf 1.01 Teile Triätliylamin und dann 2,02 Teile N - tert. - Butyloxycarbonyl - L - alanin - 2,4,5-trichlorphenylester
bei OC zugegeben werden. Das Reaktionsgemisch wird 48 Stunden bei 0 C gerührt
und dann einer Mischung von 300 Teilen Eiswasser. 0,37 Teilen konzentrierter Salzsäure (Dichte 1.18),
l,2Teilen Essigsäure und lOOTeilen Cyclohexan zugegeben. Die Mischung wird 15 Minuten bei 0—IOC
gerührt und anschließend gefiltert. Der feste Rückstand wird mit Wasser und dann mit Äther gewaschen
und anschließend unter vermindertem Druck bei 40—500C getrocknet. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl
- L - alanyl - L - tryptophanyl - L - methionyl - L - phenylalaninamid (Schmp. 223—2250C
mit Zersetzung).
Beispiel 35
Es werden 1,01 Teile Triäthylamin einer Lösung von 3,55 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamidtrifluoracetat
und 2,64 Teilen N - Pivaloyl - fi - alanin - 2,4,5 - trichlorphenylester in
30 Teilen Dimethylformamid zugegeben. Die entstehende Lösung wird 2 Tage auf 20—22°C gehalten
und dann einer Mischung von 500 Teilen Eiswasser, 0,74 Teilen konzentrierter Salzsäure (D =1,18) und
300 Teilen Cyclohexan zugesetzt. Die Mischung wird gefiltert, und der feste Rückstand wird mit Wasser
und dann mit Äther gewaschen und anschließend aus wäßriger Äthanollösung umkristallisiert. Somit erhält
man N-Pivaloyl-ß-alanyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid
(Schmp. 218 bis 220''C). Das dabei verwendete N-Pivaloyl-^-alanin-2,4,5-trichlorphenylester
kann wie folgt hergestellt werden: Einer gerührten Lösung von 0,866 Teilen N-Pivaloyl-//-alanin und 1,04 Teilen 2,4,5-Trichlorphenol
in 20 Teilen Aceton werden 1,03 Teile N,N'-Dicyclohexylcarbondiimid
bei 0—-10'' C zugesetzt. Die Mischung wird 18 Stunden bei 0 2 C gerührt und
anschließend gefiltert. Das Fillrat wird unter vermindertem Druck eingedampft, und der Verdampfungsrückstand
wird aus Diisopropyläther umkristallisiert. Somit erhält man N-Pivaloyl-/i-alanin-2,4,5-trichlorphenylester
(Schmp. 70-- 72 C).
Das dabei verwendete N-Pivaloyl-//-alanin kann wie folgt hergestellt werden: Während 15 Minuten
werden 1,23 Teile Pivaloylchlorid einer gerührten Lösung von 3,51 Teilen /i-Alaninbenzylester-p-toluolsulfonat
und 2,02 Teilen Triäthylamin in 20 Teilen Chloroform bei 0-4 C zugegeben. Die Mischung
wird 2 Stunden bei 20 22 C gerührt, worauf 10 Teile Wasser zugegeben werden. Die organische Phase
wird abgetrennt und hintereinander mit 10 Teilen n-Natriumbicarbonatlösung, 10 Teilen Wasser, 10 Teilen
0,5n-Salzsäurelösung und 10 Teilen Wasser. Sie wird dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet
und anschließend eingedampft. Der ölige Rückstand wird in 15 Teilen einer 90%igen wäßrigen
Essigsäurelösung aufgelöst, und die entstehende Lösung wird 4 Stunden bei Raumtemperatur und unter
Atmosphärendruck über 0,5 Teilen 5%igen PaIIadium-auf-Holzkohle-Katalysators
hydriert. Dann wird die Mischung gefiltert, worauf das F;iltrat eingedampft
wird. Der Verdampfungsrückstand wird durch azeotrope Destillation mit Benzol getrocknet und anschließend
aus Äthjlacetat umkristallisiert. Somit erhält man N-Pivaloy|-/;-alanin (Schmp. 131,5 bis
132 C).
Beispiel 36
Eine Mischung von 7,11 Teilen t.-Tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamidtrifluoracetat,
2,8 Teilen tert. - Butyloxycarbonylaxid, 3,03 Teilen Triäthylamin und 80 Teilen Pyridin wird
4 Tage bei 23—25 C gerührt. Die Mischung wird dann unter einem Druck von 0,1 mm Quecksilbersäule
eingedampft, worauf der Verdampfungsrückstand mit 100 Teilen Eiswasser verrührt wird. Der
pH-Wert der Mischung wird dann mit einer 10%igen wäßrigen Zitronensäurelösung auf 3 eingestellt, worauf
die Mischung gefiltert wird. Der feste Rückstand wird gründlich mit Wasser gewaschen und dann aus
wäßriger 2-Äthoxyäthanollösung umkristallisiert. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid
(Schmp. 209—2100C mit Aufsprudeln).
Eine Lösung von 0,409 Teilen N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosylglycin
und 0,1 Teil Triäthylamin in 10 Teilen Tetrahydrofuran wird auf — 20° C gekühlt, worauf eine Lösung von 0,123 Teilen
Pivaloylchlorid in 10 Teilen Tetrahydrofuran während 10 Minuten bei —10 bis —20'C zugegeben wird.
Die Lösung wird 20 Minuten gerührt, worauf eine Lösung von 0,71 Teilen L-Tryptophanyl-L-methionyl-L
- aspartyl - L - phenylalaninamidtrifluoracetat und 0,2 Teilen Triäthylamin in 8 Teilen Dimethylformamid
zugesetzt wird. Das Reaktionsgemisch wird 20 Stunden auf 0' C gehalten und dann einer Mischung
von 50 Teilen Wasser, 1 Teil n-Salzsäurelösung und 0,12 Teilen Essigsäure zugegeben. Der dabei niedergeschlagene
Feststoff wird abgefiltert, mit Wasser und anschließend mit kochendem Äthanol gewaschen.
Der feste Rückstand wird dann abgefiltert. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-i.-alanyl-L-tyro-
sylglycyl - L - tryptophanyl -1. - methionyl -1. - aspartyl -lphenylalaninamid
(Schmp. 234° C mit Zersetzung).
Das als Ausgangsstoff verwendete N-iert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosylglycin
kann wie folgt hergestellt werden: Es werden 5,5 Teile N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosylglycinmethylester
in 32 Teilen Methanol suspendiert, worauf 26 Teile n-Natriumhydroxydlösung
zugegeben werden. Die entstehende Lösung wird 1 Stunde bei 0nC gerührt und
anschließend eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in 40 Teilen Wasser aufgelöst, und die
Lösung wird mit 6,3 Teilen Zitronensäure angesäuert. Der ausscheidende Feststoff wird abgefiltert. Somit
erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-t.-tyrosylglycin
(Schmp. 195— 197° C nach Sintern bei 169 bis 181°C).
Das N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosylglycinmethylester
(Schmp. 179—18(PC) kann nach dem Verfahren gemäß Beispiel 3 der britischen Patentanmeldung
26 354/64 der Anmelderin hergestellt werden.
Beispiel 38
Es werden 1 Teil N-tert.-Butyloxycarbonyl-p'-alanyli.
- tryptophanyl - L - methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamid
und 1000 Teile destillierten Wassers, das 2,6 Teile η - Ammoniumhydroxydlösung enthält,
3 Stunden bei 20—22°C miteinander geschüttelt.
Die entstehende Lösung wird mit 8,8 Teilen Natriumchlorid behandelt und dann dadurch sterilisiert, daß
sie durch ein steriles bakteriensicheres Filter geleitet wird. Somit erhält man eine isotonische, sterile
injizierbare wäßrige Lösung des N-tert.-Butyloxycarbonyl - ß- alanyl - L - tryptophanyl - L - methionyl - L-aspartyl-L-phenylalaninamids,
die einen Teil Peptidderivat je 1000 Teile Lösung enthält. Das ultraviolette Absorptionsspektrum der Lösung zeigte /.-Minimum
246,5 ma U- 2080), A-Beugung 272—275 m.x U 5040)
und /.-Maxima 280 ηΐμ U 5340) und 289 ma (^ 4590).
B e i s ρ i e 1 39
Es wird 1 Teil N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L
- tyrosylglycy] - L - tryptophanyl -L- methionyl - L aspartyl-L-phenylalaninamid in 200 Teilen Dimethylsulfoxyd
aufgelöst, worauf zwei äquivalente Anteile einer0,l n-Ammoniumhydroxydlösungzugegeben werden.
Die entstehende Lösung wird auf 1000 Teile mit einer 0,9 gew/volumprozentigen wäßrigen Natriumchloridlösung
als Verdünnungsmittel gebracht. Die entstehende Lösung wird dadurch sterilisiert,
daß sie durch ein steriles bakteriensicheres Filter geleitet wird. Somit erhält man eine isotonische, sterile,
injizierbare wäßrige Lösung des N-tert.-Butyloxycarbonyl - L - alanyl - L - tyrosylglycyl - L - tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamids.
Bei Wiederholungen dieses Verfahrens wird der 1 Teil N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosylglycyl
- L - tryptophanyl - L - methionyl - L - aspartyl - L-phenylalaninamid
durch 1 Teil N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucylglycyl-
L - tryptophanyl - l - methionyl - L - aspartyl - l - phenylalaninamid, oder 1 Teil N-Acetyl-, N-Benzoyl-, N-tert.-Butyloxycarbonyl
- L - alanyl-, N - Pivaloyl - ß- alanyl-, N-Benzyloxycarbonyl-^-alanyl-, N-Acetyl-/i-alanyl-,
N-ß-Alanyl-, oder N-Carbamoyl-L-tryptophanyl-L-methionyl
- L - aspartyl - L - phenylalaninamid ersetzt, wobei man also entsprechende isotonische, sterile,
injizierbare wäßrige Lösungen erhält.
24
Beispiel 40
Beispiel 40
Es werden 218 Teile N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-(ryptophan
- 2,4,5 - trichlorphenylester, 185 Teile L-Methionyl-t.-aspartyl-L-phenylalaninamid,45,6Teile
Triäthylamin 4000 Teile Dimethylformamid und 500 Teile Wasser 48 Stunden bei O0C und dann
24 Stunden bei 20—25'C miteinander verrührt. Der
pH-Wert der Mischung wird durch sorgfältige Zugabe von 2n-Salzsäurelösung bei 0°C auf 2 eingestellt,
worauf 15000 Teile Eiswasser unter Rührung zugegeben werden. Der Feststoff wird abgefiltert, mit
Wasser gewaschen und dann zusammen mit 8000 Teilen Äthanol bis zum linden Kochen erwärmt. Die
Mischung wird abgekühlt und gefiltert, und der feste Rückstand wird mit Äthanol gewaschen und dann
unter vermindertem Druck bei 40—50°C getrocknet.
Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid
(Schmp. 209— 21O0C mit Aufsprudeln).
Das als Ausgangsstoff verwendete L-Methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid
(Schmp. 223—225°C) kann gemäß Beispiel 1 der britischen Patentanmeldung
35 985/64 der Anmelderin hergestellt werden.
Eine Suspension von 225 Teilen N-tert.-Butyloxycarbonyl
-L- tryptophanyl -1. - methioninhydrazid in 500 Teilen trockenen Tetrahydrofurans wird auf
— 20°C gekühlt, worauf 500 Teile trockenen Tetrahydrofurans,
die 36,5 Teile trockenen Chlorwasserstoffs enthalten, zugegeben werden, während die
Mischung bei —20 bis —25°C stark gerührt wird.
Die entstehende Lösung wird dann mit 61 Teilen n-Butylnitrit behandelt, worauf die Mischung noch
6 Minuten bei —20 bis —25°C gerührt wird. Die mattgrüne Lösung wird dann einer Lösung von
140 Teilen L-aspartyl-L-phenylalaninamid in 2000
Teilen Dimethylformamid, 100 Teilen Wasser und 151,5 Teilen Triäthylamin bei O0C zugegeben. Das
Reaktionsgemisch wird 2 Tage auf 00C gehalten, worauf 10 000 Teile Eiswasser zugegeben werden.
Der nach Filtern erhaltene feste Rückstand wird mit Wasser gewaschen und aus Äthanol umkristallisiert.
Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl
- L - methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamid (Schmp. 209—2100C mit Aufsprudeln).
Das als Ausgangsstoff verwendete N-tert.-Butyloxycarbonyl
- L-tryptophanyl - L-methioninhydrazid kann wie folgt hergestellt werden: Eine Suspension von
200 Teilen L- Methioninmethylesterhydrochlorid in 1500 Teilen Chloroform wird bei 00C gerührt und
mit 101 Teilen Triäthylamin behandelt. Die Mischung wird weiter bei 00C gerührt,bis der Feststoff gänzlich
aufgelöst ist, worauf 304 Teile N-tert.-Butyloxycarbonyl-L - tryptophan und anschließend 206 Teile
Ν,Ν'-Dicyclonexylcarbodiimid bei 0—50C zugegeben
werden. Das Reaktionsgemisch wird 18 Stunden auf 0°C gehalten und dann gefiltert. Das Filtrat wird
nacheinander mit 200 Teilen 10%iger wäßriger Natriumchloridlösung, 200 Teilen 10%iger wäßriger Zitronensäurelösung,
200 Teilen 10%iger Natriumchloridlösung, 200 Teilen n-Kaliumbicarbonatlösung und
schließlich 3mal mit je 200 Teilen 10%iger wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen. Es wird dann über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in 800 Teilen Diisopropyläther gelöst.
509 649/16
und die Lösung wird 1 Stunde auf OC gehalten. Die so gebildeten Kristalle werden abgefiltert und unter
vermindertem Druck bei 4OC getrocknet. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl-L-methioninmethylester
als farblose Nadeln (Schmp. 98—99 C). Von diesem Ester werden 225 Teile in
500 Teilen Methanol aufgelöst. Die Lösung wird auf 00C gekühlt und dann mit 55 Teilen 100%igen Hydrazinhydrats
behandelt. Das Reaktionsgemisch wird 16 Stunden auf 20-— 22' C gehalten und dann gefiltert.
Der feste Rückstand wird mit Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck bei 40 C getrocknet.
Somit erhalt man N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl
- L. - methioninhydrazid (Schmp. 177—178 C)
mit Aufsprudeln).
Beispiel 42
Eine Lösung von 360 Teilen N-teri.-Butyloxycarbonyl
- t. - tryptophanyl - 1. - methioninhydrazid in 5200 Teilen Dimethylformamid wird auf -10 C gekühlt,
worauf 2000 Teile n-Salzsäurelösung und dann 4350 Teile 0.2 n-Natriumnitritlösung bei — 10 C zugegeben
werden. Die Mischung wird 3 Minuten bei - IO°C gerührt, worauf 3()O()ofeile Wasser, 5800Teile
n-Natriumbicarbonatlösung und schließlich 4000 Teile Methylenchlorid zugegeben werden. Die untere organische
Schicht wird vom Gemisch abgetrennt, und die wäßrige Schicht wird mal mit Methylenchlorid (je
4000 Teile) extrahiert. Die organische Schicht und die Extrakte werden zusammengebracht und dadurch
getrocknet, daß sie 5 Minuten mit wasserfreiem Magnesiumsulfat verrührt werden, worauf die Mischung
gefiltert wird. Das Filtrat wird sofort einer Lösung von 274 Teilen t.-Aspartyl-L-phenylalaninmethylesterhydrochlorid
in 10000 Teilen Dimethylformamid und 262Teilen Triäthylamin bei — 10~C
zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunden auf O0C gehalten, worauf das Methylenchlorid unter
vermindertem Druck bei 0 C zum größten Teil entfernt wird. Das Reaktionsgemisch wird noch
20 Stunden auf 0 C und dann 4 Stunden auf 20—220C gehalten. Dann werden 40 000 Teile
Methylenchlorid zugegeben, und die Lösung wird nacheinander mit 20 000 Teilen 5%iger wäßriger
Zitronensäurelösung und 2mal mit je 20 000 Teilen Wasser gewaschen. Die Lösung wird dann über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und gefiltert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck
eingedampft, und der feste Rückstand wird aus einer wäßrigen Methanollösung umkristallisiert. Somit
erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl - L - methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninmethylester
als weißen kristallförmigen Feststoff (Schmp. 167—169°C). Bei der Analyse mittels Dünnschichtchromatographie
unter Anwendung von SiIikagel als Adsorbens und von einem Lösungssystem,
bestehend aus 100 Teilen sek.-Butanol und 44 Teilen einer 3%igen wäßrigen Ammoniaklösung, erschien
ein einziger Fleck von RF 0,61. Bei der Analyse mittels
Dünnschichtchromatographie unter Anwendung von Silikagel als Adsorbens und von einem Lösungssystem,
bestehend aus der oberen Phase einer Mischung von 25 Teilen n-Butanol, 6 Teilen Essigsäure und 25 Teilen
Wasser, erschien ein einziger Fleck von RF 0,50.
Von diesem Methylester werden 100 Teile mit 10000 Teilen trockenen, mit Ammoniak gesättigten
Methanols 72 Stunden bei 20—22° C verrührt. Das
Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck eingedampft, und der Verdampfungsrückstand wird
in 2000 Teilen Methanol aufgelöst. Eine 5%ige wäßrige Zitronensäurelösung wird tropfenweise unter
Rührung zugegeben, bis der pH-Wert 2 bis 3 beträgt. Der ausscheidende Feststoff wird abgefiltert, mit
Wasser gewaschen und anschließend unter vermindertem Druck bei 40 C getrocknet. Somit erhält man
N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-i.-phenylalaninaniid
(Schmp. 209 bis 210 1C mit Aufsprudeln).
Das als Ausgangsstoff verwendete L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylesterhydroclilorid
kann wie folgt hergestellt werden: Es werden 465 Teile N-Benzyloxycarbonyl-(/i'-benzyl)-L-asparaginsüure
und 280Teile L-Phenylalaninmethylesterhydrochlorid in 1200 Teilen
Methylenchlorid aufgelöst. Dann werden 132 Teile Triäthylamin und anschließend 294 Teile N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
bei 0 C zugegeben, worauf die Mischung 1 Stunde bei 0 C und dann 16 Stunden
bei 20—22 C gerührt wird. Das nach Filtern erhaltene
Filtrat wird nacheinander mit 500 Teilen n-Salzsäurelösung,
500 Teilen Wasser, 500 Teilen n-Natriumbicarbonatlösung und 500 Teilen Wasser gewaschen
und dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend unter vermindertem Druck
eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird aus einem Gemisch von Äthylacetat und Petroläther
(Sdp. 60—80 C) umkristallisiert. Somit erhält man
N-Benzyloxycar bony 1-(,>'-benzyl )-i.-aspartyl-L-phenylalaninmethylester
(Schmp. 115 116 C). Eine Mischung von 312Teilen dieses Esters. 4000Teilen Methanol
und 300 Teilen 2n-Salzsäurelösung wird mit 50 Teilen eines I0%igen Palladium-auf-Holzkohle-Katalysators
verrührt, wobei Wasserstoff in die Mischung bei 18—22 C unter Almosphärendruck während
3 Stunden eingeblasen wird. Das Reaktionsgemisch wird zur Entfernung des Katalysators gefiltert,
und das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird unter
vermindertem Druck bei 40 C getrocknet. Somit erhält man L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylesterhydrochlorid
(Schmp. 105-110 C).
Es werden 1,96 Teile N-tert.-Butyloxycarbonyl-/;-alanyl-L-tryptophanyl
- L- methionyl - L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester
in 50 Teilen trockenen, mit Ammoniak gesättigten Methanols bei OC aufgelöst.
Die Lösung wird 24 Stunden auf 0--2:C gehalten und dann unter vermindertem Druck eingedampft.
Der Verdampfungsrückstand wird in 40 Teilen Methanol aufgelöst, worauf 0,2 Teile Essigsäure der
Lösung zugegeben werden. Der ausscheidende Feststoff wird abgefiltert und mit Methanol gewaschen.
Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-p'-alanyl-L
- tryptophanyl - L - methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamid
(Schmp. 229—230 C mit Zersetzung).
Das als Ausgangsstoff verwendete N-tert.-Butyloxycarbonyl-/i-alanyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester
kann wie folgt hergestellt werden :Eine Lösung von 9,6 Teilen N-tert.-Butyloxycarbonyl
- fi - alanin - 2,4,5 - trichlorphenylester und 5,18 Teilen l - Tryptophanyl -1.-methionyl-L
- aspartyl - L - phenyla'.aninmethylesterhydrochlorid in 50 Teilen Dimethylformamid wird auf 00C gekühlt,
worauf 10 Teile Wasser und dann 1,62 Teile Triäthylamin zugegeben werden. Die Mischung wird
3 Tage bei 0—2°C gerührt und dann einer Mischung
von 200 Teilen Eiswasser, 1,6 Teilen Zitronensäure, 1 Teil Essigsäure und 80 Teilen Äther zugegeben. Die
Mischung wird gefiltert, und der feste Rückstand wird 3mal mit Wasser, und 3mal mit Äther gewaschen
und anschließend aus Äthanol umkristallisiert. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-p'-alanyl-r.-tryptophanyl
-L-methionyl -L-aspartyl -L- phenylalaninmethylester
(Schmp. 171 — 172°C mit Zersetzung).
Das L-Tryptophanyl - L- methionyl - L -aspartyl - L-phenylalaninmethylester
hydrochlorid kann wie folgt hergestellt werden: Eine Lösung von 7,12 Teilen N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninmethylester
in 100 Teilen Essigsäure wird mit 100 Teilen 3,4 n-Salzsäurelösung
in Äthylacetat bei 15—20°C behandelt. Die
Lösung wird 3 Stunden auf 20—22"C gehalten, worauf
10 000 Teile trockenen Äthers zugegeben werden. Die Mischung wird gefiltert, und der feste Rückstand
wird 5mal mit Äther gewaschen und anschließend unter Vakuum bei 25C getrocknet. Somit erhält
man L - Tryptophanyl - L - methionyl - l - aspartyl - L-phenylalaninmethylester-hydrochlorid
(Schmp. 180 bis 181 "C mit Zersetzung).
Es werden 3,89 Teile N-tert.-Butyloxycarbonyl-/-;-alanyl-L-tryptophanhydrazid
zu 20 Teilen trockenen Tetrahydrofurans, das 0,73 Teile trockenen Chlorwasserstoffs
enthält, bei —20°C unter starkem Rühren zugegeben. Die entstehende Lösung wird mit 1,22 Teilen
n-Butylnitrit behandelt und weitere 6 Minuten bei -20 bis — 25°C gerührt. Die Mischung wird dann
einer Lösung von 4,47 Teilen L-Methionyl-L-apsartyl-L-phenylalaninamidhydrochlorid
in 50 Teilen Dimethylformamid, 25 Teilen Wasser und 4,24 Teilen Triäthylamin bei OC zugegeben. Das Reaktionsgemisch
wird 3 Tage bei 00C gerührt und dann mit einer 5%igen
wäßrigen Zitronensäurelösung angesäuert, derart, daß der pH-Wert auf 3,5 eingestellt wird. Die Lösung wird
einer Mischung von 500 Teilen Eiswasser und 300 Teilen Äther zugegeben, und die entstehende Mischung
wird gefiltert, worauf der feste Rückstand mit Wasser gewaschen und aus einer wäßrigen 2-Äthoxyäthanollösung
umkristallisiert wird. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-Zi'-alanyl-L-tryptophanyl-L-methi-
onyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid (Schmp. 229 bis
230 C mit Zersetzung).
Das als ein Hauptausgangsstoff verwendete N-tert.-Butyloxycarbonyl
- [1 - alanyl - L - tryptophanhydrazid kann wie folgt hergestellt werden: Es werden 10,7 Teile
100%igen Hydrazinhydrats einer Lösung von 38,9 Teilen N - tert. - Butyloxycarbonyl - β - alanyl - l - tryptophanmethylester
in 400 Teilen Methanol bei 15—20 C
zugegeben. Die Mischung wird 2 Tage auf 20—23 C
gehalten und dann unter vermindertem Druck eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird mit
Äthylacetat gewaschen und anschließend aus Äthanol umkristallisiert. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl
- (i - alanyl - L - tryptophanhydrazid (Schmp. 198—1990C mit Zersetzung).
Das N-tert.-Butyloxycarbonyl-/v'-alanyl-L-tryptophanmethylester
kann wie folgt hergestellt werden: Eine Lösung von 3,78 Teilen N-tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanin
und L-Tryptophanmethylester, das gerade aus 6,43 Teilen L-Tryptophanmethylesterhydrochlorid
erzeugt worden ist, in 80 Teilen trockenen Acetons wird mit 4,12 Teilen Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid
bei 0°C behandelt. Die Mischung wird 48 Stunden bei 0—2 C gerührt und dann unter vermindertem
Druck eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird mit 200 Teilen kochenden Äthylacetats
extrahiert, und die Extrakte werden auf 20 C abgekühlt und dann gefiltert. Das Filtrat wird nacheinander
mit 0,5 n-Salzsäurelösung, Wasser, wäßriger n-Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen
und dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Verdampfungsrückstand
wird aus Äthylacetat umkristallisiert. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-^-alanyl-L-tryptophanmethylester
(Schmp. 157—158°C).
Das auch als ein Hauptausgangsstoff verwendete L - Methionyl - L - aspartyl - L - phenylalaninamidhydrochlorid
kann in an sich bekannter Weise aus der entsprechenden freien Base gebildet werden, deren Herstellung
in der britischen Patentanmeldung 35985 64 der Anmelderin beschrieben ist.
Einer stark gerührten Lösung von 20 Teilen trockenen Tetrahydrofurans mit 0,73 Teilen trockenen Chlorwasserstoffs
werden 5,21 Teile N-tert.-Butyloxycarbonyl-/(-alanyl-L-tryptophanyl-L-methioninhydrazid
bei —20 C zugegeben. Die entstehende Lösung wird mit 1,22 Teilen n-Butylnitrit behandelt und weitere
6 Minuten bei -20 bis —25°C gerührt. Die Mischung
wird dann einer Lösung von 3,06 Teilen ι -Aspartyl-L-phenylalaninamid in einer Mischung von
40 Teilen Dimethylformamid, 2 Teilen Wasser und 3,24 Teilen Triäthylamin bei O1C zugegeben. Das
Reaktionsgemisch wird 3 Tage auf 00C gehalten und dann mit einer 5%igen wäßrigen Zitronensäurelösung
auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt. Die Lösung wird in 400 Teile Eiswasser eingegossen, und
die entstehende .Mischung wird gefiltert. Der feste Rückstand wird mit Wasser gewaschen und dann aus
wäßriger 2-Äthoxyäthanollösung umkristallisiert. Somit erhält man N-tert.-ButyloxycarbonyI-/;-alanyl-i.-tryptophanyl
- L - methionyl - L - asparatyl - L - phenylalaninamid (Schmp. 229—230°C mit Zersetzung).
Das als Ausgangsstoff verwendete N-tert.-Butyloxycarbonyl-/V-alanyl
-L- tryptophanyl -L-methioninhydrazid kann wie folgt hergestellt werden: Einer
Lösung von 19,72 Teilen N-tert.-Butyloxycarbonyl-/;-alanyl
- l - tryptophanyl - L - methioninmethylester in 200 Teilen Methanol werden 4,05 Teile 100%igen
Hydrazinhydrats bei 15 —20'C zugegeben. Die Mischung wird 36 Stunden auf 20—23°C gehalten und
dann unter vermindertem Druck verdampft, bis 100 Teile Methanol abgedampft haben. Die Mischung
wird dann gefiltert, und der feste Rückstand wird aus Äthanol umkristallisiert. Somit erhält man
N-tert.-Butyloxycarbonyl-/)-alanyl-L-tryptophanyl-L-methioninhydrazid
(Schmp. 218—219°C mit Zersetzung).
Das N- tert. - Butyloxycarbonyl - jl-alanyl - L- tryptophanyl-L-methioninmethylester
kann wie folgt hergestellt werden: Eine Lösung von 1,84 Teilen N-tert.-Butyloxycarbonyl
- /;- alanin - 2,4,5 - trichlorphenylester und 1,92 Teilen L-Tryptophanyl-L-methioninmethylester-hydrochlorid
in 20 Teilen Dimethylformamid wird mit 0,505 Teilen Triäthylamin bei 00C behandelt.
Die Lösung wird 48 Stunden auf 0—5°C gehalten
und dann einer Mischung von 100 Teilen Eiswasser, 0,06 Teilen Essigsäure und 80 Teilen Äthylacetat zugegeben.
Die Äthylacetatschicht wird vom Gemisch abgetrennt. Die wäßrige Schicht wird mit 80 Teilen
Äthylacetat extrahiert, und der Extrakt wird mit der Äthylacetatschicht zusammengebracht. Dieses Gemisch
wird dann nacheinander mit einer 5%igen wäßrigen Zitronensäurclösung, Wasser, einer wäßrigen
n-Natriumbicarbonatiösung und schließlich Wasser, worauf es mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet
und anschließend unter vermindertem Druck eingedampft wird. Der Verdampfungsrückstand wird
aus einem Äthylacetat-Cyclohexan-Gemisch umkristallisiert. Somit erhält man N-tert.-Butyloxycarbonyl-/■;
- alanyl - l - tryptophanyl -1. - methioninmethylester
(Schmp. 138 —139X).
Das L - Tryptophanyl - ι. - methioninmethylesterhydrochlorid kann wie folgt hergestellt werden: Eine
Lösung von 8,99 Teilen N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl -1. - methioninmethylester in 16 Teilen
Äthylacetat wird mit 40 Teilen 3,4 n-Salzsäurelösung
in Äthylacetat bei 15 20 C behandelt. Die Lösung wird 2 Stunden auf 20 -22 C gehalten, worauf
400 Teile trockenen Äthers zugegeben werden. Die Mischung wird gefiltert, und der feste Rückstand
wird 4mal mit trockenem Äther gewaschen. Somit erhält man L-Tryptophanyl-L-methioninmethylesterhydrochlorid
(Schmp. 100—105X- mit Zersetzung).
Versuchsbericht
Die Aktivität der acylierten Tetrapeptide bei der Förderung der Sekretion von saurem Magensaft
wurde durch die folgenden Verfahren gemessen:
a) Männliche gesunde Ratten mit einem Gewicht von 200 bis 260 g wurden über Nacht hungern gelassen
und dann mit Urethan anästhetisiert. Hierauf wurde eine Tracheotomie durchgeführt, um sicherzustellen,
daß die Atemwege klar waren. Ein Polyäthylenrohr wurde dann die Speiseröhre hinabge-
Gesamte Säure in y.Eq.
in Abständen von 10 Minuten
15 -
10 -
5 -
schoben, bis die Spitze gerade den Magen erreichte. Die Speiseröhre wurde dann am Hals abgebunden,
um ein Rücksickern von Salzlösung zu verhindern, und die Leibeshöhle wurde durch einen mittleren
Längsschnitt geöffnet. Das Duodenum wurde festgelegt und zwei Ligaturen wurden in der Nähe des
Pylorus herumgelegt, wobei darauf geachtet wurde, mesenterischc Blutgefäße zu vermeiden. Die hintere
Ligatur wurde aufgebunden und zum Zuziehen verwendet. Eine Polyäthylenkanüle wurde dann durch
den Pylorus in den Magen über einen Schnitt im Duodenoum eingeführt und an Ort und Stelle festgebunden.
Abschließend wurde die Leibeshöhle geschlossen.und der Magen wurde mit warmer Salzlösung
mit einem konstanten Fluß von 1 ml/min über den ösophagus hinein und durch die Duodenalkanüle herausgespült.
Eine Körpertemperatur von 31X wurde mit Hilfe eines erhitzten Operationstisches aufrechterhalten.
Das Perfusat wurde in Abständen von 10 Minuten gesammelt und gegen 0,01 n-Natriumhydroxyd
titriert, wobei Phenolphthalein als Indikator verwendet wurde. Die Natriumhydroxydlösung wurde
von atmosphärischem Kohlendioxyd geschützt, indem sie in einem Polyäthylenreservoir gelagert wurde,
das mit einem Sodaturm ausgerüstet war, welcher direkt mit einer 10 ml Mikrobürette verbunden war.
Die Menge der alle 10 Minuten abgeschiedenen Säure wurde in μΕς. Salzsäure ausgedrückt.
Die Testverbindungen wurden durch intravenöse Injektion verabreicht, und die Reaktion der Säureabscheidung
der Magenschleimhaut gegenüber dem Stimmulant wurde berechnet, wie es im folgenden
Diagramm gezeigt ist. welches in typischer Weise die Reaktion eines Stimmulans für Magensäuresekretion
zeigt.
Injektion der
Testverbindung
Testverbindung
Zeit in Intervallen
von 10 Minuten
von 10 Minuten
Grundsekretion
Gesamter Säureausstoß
Säurereaktion
f.
u + v + w-fx + y + z.
Gesamter Säureausstoß — Grundsekretion.
Vorversuche zeigten, daß, sofern die Säurereaktion größer als oder gleich wie die Grundreaktion war, die
erhaltenen Resultate aus einer Injektion bei einer Ratte sehr beträchtlich waren (p
< 0,001). Es wurde gefunden, daß eine Injektion von 1 [xg/kg Gasirin,
das natürliche Hormon, das für die Magenabsekretion verantwortlich ist, nahezu immerzu eine Säurereaktion
gleich der Grundsekretion ergab, und es wurden nur
solche Ratten verwendet, die eine solche Reaktion zeigten.
Die Aktivität der Testverbindung wird mit derjenigen von Gastrin in der gleichen Ratte verglichen,
indem die Ratte 60 Minuten perfusiert wurde, wobei 1 g/kg Gastrin injiziert und die Reaktion wie oben
gemessen wurde, worauf dann, 90 Minuten nach ; der Gastrininjektion 4 g/kg der Testverbindung inji- ;
ziert wurden und wieder die Reaktion wie oben gemessen wurde. !io
Eine Testverbindung, die eine Säurereaktion ergab, die größer als oder gleich wie die durch Gastrin hervorgerufene
Reaktion war, wurde als beträchtlich aktiv als Stimulant für die Magensäuresekretion angesehen.
Die folgenden Verbindungen zeigen eine solche beträchtliche Aktivität.
X-Y-L-Try-L-Met-L-Asp-L-Phe-NH2
worin Y = direkte Bindung und X = Acetyl, Benzoyl, ρ - Trifluoracetylaminobenzoyl, L- Butyloxycarbonyl,
Benzyloxycarbonyl, ρ - Toluolsulfonyl, Carbamoyl, t.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl, t.-Butyloxycarbonyl-N-methyl-L-alanyl,
ß-Alanyl, Acetyl-/S-alanyl, Pivaloyl-/S-alanyl,
Benzoyl-ß-alanyl-, t.-Butyloxycarbonyl-/?-
alanyl, Benzyloxycarbonyl-ß-alanyl, Benzoylglycyl,
2-Äthylhexanoylglycyl, N"-t.-Butyloxycarbonyl-Νε-benzyloxycarbonyl
- l - lysyl, N" - Benzyloxycarbonyl-Νε
- (4 - chloro - 6 - dimethylaminotriazin - 2 - yl) - L - lysyl, Benzyloxycarbonyl - L - prolyl, t. - Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-homocysteinyl
und Pyroglutamyl; worin X = t.-Butyloxycarbonyl und Y = L-Alanyl-L-tyrosylglycyl
oder L - Alanyl - L - phenylalanyl - L - isoleucylglycyl und worin X = Benzyloxycarbonyl und Y
= Glutamyl - L - glutamyl -L- alanyl -L- tyrosylglycyl.
b) In zwei Katzen wurde eine Magenfistel eingeführt, indem unter Pentabarbitonanästhesie eine rostfreie
Stahlkanüle in den untersten Teil des Magens eingeführt wurde. Beide Katzen wurden 6 bzw.
8 Monate nach dem Eingriff beim Testverfahren 4P
verwendet.
Jede Katze wurde 15 Stunden ohne Nahrung gehalten, wobei sie jedoch Wasser erhielt, und wurde bei
Bewußtsein in einen Schlingenrahmen eingehängt. Die Kanüle wurde geöffnet, und die Grundsekretion
wurde 15 Minuten gesammelt. Die Testverbindung wurde in 0,15 n-Natriumchlorid aufgelöst, und der
pH der Lösung wurde mit Ammoniak zwischen 7 und 8 eingestellt. Eine entsprechende Menge dieser Lösung
wurde mit 0,15 n-Natriumchlorid verdünnt, und ein geeignetes Volumen, welches 10 μg Testverbindung
enthielt, wurde subkutan in die Katze injiziert, nachdem die Grundsekretion gesammelt worden war.
Die Magensekretion wurde dann 15 Minuten lang gesammelt, und die Menge Salzsäure, die in jeweils
15 Minuten abgeschieden wurde, wurde durch Titration
gegen 0,1 n-Natriumhydroxydlösung unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt.
Die Zeitdauer von 15 Minuten, während der die größte Menge Salzsäure abgeschieden wurde,
wurde ermittelt, und die Menge dieser Sekretion, die kleiner als die Grundsekretion war, wurde in μΕς.
ausgedrückt und als Spitzensäureausstoß bezeichnet. Der Mittelwert dieses Spitzensäureausstoßes wurde
bei den beiden Katzen für eine jede der folgenden Testverbindungen ermittelt.
Die Testverbindungen besaßen die Formel
X-Y-L-Try-L-Met-L-Asp-L-Phe-NH2
Durch- | |
schnittliche | |
X—Y— | Spitzensäure- |
abgabe | |
in μΕς. | |
Y = direkte Bindung und | |
X = t.-Butyloxycarbonyl- | 698 |
Benzyloxycarbonyl- | 478 |
Carbamoyl- | 585 |
t.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl- | 179 |
Pivaloyl-/3-alanyl- | 1328 |
t.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl- | 738 |
X = t.-Butyloxycarbonyl- und | |
Y = L-Alanyl-L-tyrosylglycyl- | 392 |
509 517/400
Claims (3)
- Patentansprüche:Acyliertes Peptidderivat der FormelCH2 · SCH3 COOH C6H5CH, CH2 CH2 CH2 X — Y — NH·CH·CO·NH·CH■CO■NH·CH·CO·NH·CH·CO■NH,worin Y direkte Bindung und X ein Acylradika! aus der Gruppe Acetyl, Benzoyl, t.-Butyloxycarbonyl und Benzyloxycarbonyl; oder ein Aminoacyl oder Acylaminoacylradikal, wobei das Aminoacylradikal ausgewählt ist aus i.-Alanyl, N-Methyl-L-alanyl, p'-Alanyl, Glycyl, L-Prolyl, S-Benzylhomocysteinyl oder Pyroglutamyl und das Acylradikal ausgewählt ist aus den oben definierten Acylradikalen; oder Pivaloyl-p'-alanyl, N-2-Äthylhexanoylglycyl, ρ - Trifluoroacetylaminobenzoyl, p-Toluolsulfonyl, Carbamoyl, Acetyl-Y-aminobutyryl, N£-Benzyloxycarbonyl-L-lysyl, N*-Benzyloxycarbonyl-L-lysyl, Nx-1.-Butyloxycarbony 1-NE-benzyloxycarbonyl-L-lysyl oder N*-Benzyloxycarbonyl - Nc - (4 - chloro - 6 - dimethylaminotriazin-2-yl)-L-lysyl; oder Y i.-Glutamyl-L-glutamyl - L - alanyl - L - tyrosylglycyl, l - Alanyl -1.-tyrosylglycyl oder L - Alanyl - 1. - phenylulanyli.-isoleucylglycyl und X t.-Butyloxycarbonyl oder Benzyloxycarbonyl.
- 2. N -1. - Butyloxycarbonyl - rl - alanyl -1. - tryptophanyl - l- methionyl - L -aspartyl - L - phenylalaninamid.
- 3. Verfahren zur Herstellung eines acylierten Peptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mana) ein Tetrapeptid der FormelHNCH,CH2SCH, CH,COOH
CH,QH,CH,NH, · CH · CO ■ NH · CH · CO ■ NH CH · CO ■ NH · CH · CO ■ NH,oder ein Salz davon mit einem Derivat einer Säure der Formel X—Y — OH, worin die Säurefunktion aktiviert ist, oder mit einem geschützten Derivat davon oder mit einem Cyanosäurederivat acyliert, worauf sich eine Hydrogenolyse und/oder Hydrolyse anschließt, um gegebenenfalls vorliegende Schutzgruppen durch Wasserstoff zu ersetzen; oder daß manb) ein Derivat einer Säure der FormelHNHydrogenolyse und/oder Hydrolyse anschließt, um gegebenenfalls vorliegende Schutzgruppen durch Wasserstoff zu ersetzen; oder daß man c) ein Derivat einer Säure der FormelHNCH,CH2SCH3
CH,CH,X —Y-NH CH COOH55worin die Säurefunktion aktiviert ist, oder ein geschütztes Derivat davon mit einem Tripeptidamid der Formel X —Y —NH CH CO ■ NH CH COOHworin die Säurefunktion aktiviert ist, oder ein geschütztes Derivat davon mit einem Dipeptidamid der FormelCOOH
CH2CH,CH2 ■ SCH3
CH,COOHCH,C6H5CH,NH2 CH CO NH CH CO NH CH CO NH2 oder einem Salz davon umsetzt, worauf sich eine65 NH, ■ CH · CO · NH ■ CH · CO · NH,oder einem Salz davon umsetzt, worauf sich eine Hydrogenolyse und/oder Hydrolyse anschließt, um gegebenenfalls vorliegende Schutzgruppen durch Wasserstoff zu ersetzen; oder daß mand) Ammoniak mit einem Ester der FormelHNCH2 · SCHj COOH C6H5CH, CH2 CH1 CH, I ! " \ 'X — Y-NH- CH ■ CO ■ NH · CH ■ CO · NH ■ CH ■ CO · NH ■ CH ■ CO · OR6
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