CN111909245B - 一种包含芳香族氨基酸的胶原靶向多肽探针,制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于胶原蛋白检测技术领域,具体涉及一种包含芳香族氨基酸的胶原靶向多肽探针、制备方法及应用。本发明所述的多肽探针将现有GPO多肽探针(Gly‑Pro‑Hyp)n中间位置的Pro替换为Tyr或Phe,构建了包含芳香族氨基酸的两个新型多肽探针FAM‑GYO:FAM‑(Gly‑Pro‑Hyp)3‑Gly‑Tyr‑Hyp‑(Gly‑Pro‑Hyp)4和FAM‑GFO:FAM‑(Gly‑Pro‑Hyp)3‑Gly‑Phe‑Hyp‑(Gly‑Pro‑Hyp)4。所述多肽探针FAM‑GYO和FAM‑GFO显著降低了现有GPO探针的三重螺旋结构稳定性,并保持了与现有GPO探针相当的靶向结合病变胶原蛋白的能力,可以特异性结合小鼠不同组织中的变性胶原蛋白,并成功的应用于不同疾病样本的组织染色,在肿瘤、纤维化等胶原蛋白相关疾病的早期检测与疗效评估等领域具有广阔的应用前景。同时,所述的多肽探针FAM‑GYO和FAM‑GFO长度较短,也没有引入复杂的非天然氨基酸,极大降低了探针合成的难度和成本。
Description
技术领域
本发明属于胶原蛋白检测技术领域,具体涉及一种包含芳香族氨基酸的胶原靶向多肽探针,制备方法及其应用。
背景技术
胶原蛋白是一组具有独特三重螺旋结构的细胞外基质蛋白。作为细胞外基质的主要组成成分,胶原蛋白在皮肤、骨骼、肌腱和韧带等结缔组织中普遍存在。它为组织发育提供了重要的结构支架,并介导了细胞粘附、增殖、迁移和分化等各种细胞行为。因此,胶原蛋白的重塑异常与癌症、纤维化和关节炎等各种关键疾病密切相关。胶原蛋白被认为是肿瘤微环境的关键成分,它可以影响肿瘤细胞的行为,增加肿瘤组织的硬度。大量的临床数据表明,胶原蛋白是癌症分化、侵袭、转移以及癌症分期的重要诊断标记物。胶原蛋白的合成和降解失衡已被发现是肺和肝纤维化的主要原因。因此,及时检测胶原蛋白对于了解这些疾病的发病机理和开发新的治疗方法至关重要。
目前,胶原蛋白的检测主要依赖于胶原蛋白抗体,其中基于ELISA的筛选发现了两种单克隆抗体E1E5和E4A11,用于特异性识别II型胶原蛋白。由于胶原蛋白的特殊三重螺旋结构,胶原蛋白抗体存在特异性不佳、亲和力弱的缺陷,并且其检测过程较复杂,重现性较差。最近发现了一种由重复的(Gly-Pro-Hyp)n序列构成的GPO多肽探针,但是(Gly-Pro-Hyp)n序列具有很强的三重螺旋结构稳定性,必须经过高温加热等预处理方法形成单链,才能特异性识别变性胶原蛋白。但是,高温加热预处理增加了组织的损伤风险,并且降温后的多肽探针又会重新折叠形成三重螺旋结构,因此,很难准确定量完全处于单链状态探针的浓度,这些缺陷极大的限制了GPO多肽探针的临床应用。
为了降低GPO多肽探针的三重螺旋结构稳定性,目前已经开发了多种方法。例如,中国专利CN110129029A公开了一种电荷排斥作用降低三重螺旋结构稳定性的胶原靶向多肽探针,它通过在GPO序列的一端修饰有多个带电荷的氨基酸获得。该设计增加了多肽探针的长度,加大了多肽探针的合成难度和成本。中国专利CN110129029A公开了一种通过在GPO序列中间位置引入大体积荧光团FAM,导致位阻效应从而降低三重螺旋结构稳定性的胶原靶向多肽探针。该设计需要引入非天然氨基酸Amp,显著增加了多肽合成的难度。
据文献报道,胶原蛋白特征性的(Gly-X-Y)n序列中X和Y位置的氨基酸类型严重影响胶原多肽的三重螺旋结构稳定性。当X位置为Pro,Y位置为Hyp时,胶原多肽的三重螺旋结构最稳定;当X或Y位置的氨基酸变为其他类型的氨基酸,胶原多肽三重螺旋结构的稳定性会不同程度降低。虽然X和Y位置的氨基酸如此重要,但是目前所有的病变胶原靶向多肽探针都是基于仅包含Pro和Hyp的(Gly-X-Y)n序列,因为氨基酸的细微变化可能会严重影响多肽探针对病变胶原蛋白的靶向结合能力,而Pro和Hyp的特殊结构可能对多肽探针特异性结合病变胶原蛋白的解链部分至关重要。
针对现有技术存在的问题,发明人意外发现,将现有靶向胶原蛋白的GPO多肽探针序列(Gly-Pro-Hyp)n中间位置的P(Pro)替换为Y(Tyr)或F(Phe),构建了特定氨基酸替换的两个新型含芳香族氨基酸的多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO。与现有的GPO探针相比,所述的多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO序列的三重螺旋结构稳定性显著降低(分别降低13℃和13.8℃),并且保持了与现有GPO探针类似的病变胶原蛋白靶向结合能力和组织染色能力。同时与现有技术公开的降低GPO探针稳定性的策略相比,本发明所述的多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO长度较短,也没有引入复杂的非天然氨基酸,显著降低了探针合成的难度和成本。本发明所述的包含芳香族氨基酸的多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO,可以特异性结合小鼠不同组织中的变性胶原蛋白,并成功的应用于病人不同疾病样本的组织染色,在肿瘤、纤维化等胶原蛋白相关疾病的早期检测与疗效评估等领域具有广阔的应用前景。
发明内容
现有靶向结合病变胶原蛋白的多肽探针GPO具有非常稳定的三重螺旋结构,需要加热等预处理才能保持单链状态,存在难以准确定量及组织损伤风险等缺陷。而目前降低GPO多肽探针稳定性的策略包括增加多肽的长度或引入复杂的非天然氨基酸,这些方法极大的增加了多肽探针合成的难度和成本。针对现有技术存在的问题,本发明的目的在于提供一种三重螺旋结构稳定性更低的靶向结合病变胶原蛋白的多肽序列,所述多肽序列为(Gly-Pro-Hyp)a-Gly-X-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)b或(Gly-Pro-Hyp)c-Gly-X-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-X-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)d,所述X为Tyr或Phe,所述a与b分别为整数,且a与b之和为5-9之间的整数,所述c与d分别为整数,且c与d之和为4-8之间的整数。
优选地,所述a与b之和为7。
优选地,所述的多肽序列为(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Tyr-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4或(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Phe-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4。
基于上述多肽序列,本发的另一目的在于提供一种热稳定性更低的靶向结合病变胶原蛋白的多肽探针,所述多肽探针包括靶向结合病变胶原蛋白的多肽序列和修饰在所述多肽序列上的荧光信号分子,所述多肽序列为(Gly-Pro-Hyp)a-Gly-X-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)b或(Gly-Pro-Hyp)c-Gly-X-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-X-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)d,所述X为Tyr或Phe,所述a与b分别为整数,且a与b之和为5-9之间的整数,所述c与d分别为整数,且c与d之和为4-8之间的整数。
优选地,所述a与b之和为7。
优选地,所述的多肽序列为(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Tyr-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4或(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Phe-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4。
优选地,所述荧光信号分子为荧光素类分子、香豆素类分子、罗丹明类分子、菁染料类分子、BODIPY类分子、方酸类分子、磷光分子、半导体量子点、碳量子点、硅量子点、硫量子点、磷量子点、钙钛矿量子点、上转化稀土纳米材料、长余辉纳米材料中的任一种。
优选地,所述荧光信号分子为羧基荧光素FAM,所述FAM修饰在多肽序列的N端。
基于上述多肽探针,本发明的另一目的在于提供一种所述多肽探针的制备方法,所述方法包括以下步骤:
a)将80-250mg的树脂加入具有筛板的反应器中,使用2-8mL的二氯甲烷溶胀树脂;
b)由15-25%哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基,通过显色反应来检测保护基的脱除程度;
c)分别将4eq的N端由Fmoc保护的氨基酸、HOBt和HBTU由DMF溶解,低温活化10-30min后,向溶液中滴加6eq的DIEA,溶液混合均匀后加入到反应器中,反应1-6hrs;
d)反应结束后,反应液由反应器中抽出,树脂分别由2-8mL的DMF和DCM洗2-4次,显色反应检测氨基酸缩合完全,树脂由15-25%哌啶/DMF溶液处理3次,分别为5min、5min和15min,树脂分别由5mL的DMF和DCM洗3次,显色反应检测保护基脱除完全;
e)之后重复步骤c)和d),直到合成目标序列的多肽。显色反应检测反应完全后,树脂分别由3-8mL的DMF和DCM洗2-4次;
f)分别称4eq取信号分子、HOBt和HBTU,由DMF溶解,低温活化10-30min后,向溶液中滴加4-10eq的DIEA,混合液加入到多肽溶液中,避光反应12-48hrs;
g)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤2-5次,然后将树脂抽干,加入切割液,切割液的组分为TFA:水的体积比为95:5,反应1-6hrs;
h)向反应液加入冰乙醚中,将多肽沉淀,然后通过离心收集沉淀,用TFA溶解沉淀,加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀,沉淀用冰乙醚洗涤2-4次后干燥,得到粗肽,粗肽由反相液相色谱纯化即得多肽探针。
本发明的另一目的在于提供一种多肽探针在制备检测病变胶原蛋白的检测试剂,和/或试剂盒,和/或成像试剂中的应用。
本发明的有益效果是:
①本发明首先提供了一种靶向结合病变胶原蛋白的多肽序列(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Tyr-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4和(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Phe-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4;
②基于上述多肽序列,本发明提供了两种新型靶向结合病变胶原蛋白的多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO;
③所述多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO可特异性的结合病变胶原蛋白,结合能力和组织染色能力与现有多肽探针GPO相当,同时显著降低了现有GPO探针的三重螺旋结构稳定性(分别降低13℃和13.8℃);
④与现有的降低GPO探针稳定性的策略相比,所述的多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO长度较短,也没有引入复杂的非天然氨基酸,显著降低了探针合成的难度和成本;
⑤本发明提供的多肽探针具有良好的荧光发光性能,可以特异性结合小鼠不同组织中的变性胶原蛋白,并成功的应用于病人不同疾病样本的组织染色,可作为组织成像试剂,广泛用于胶原蛋白相关疾病的早期诊断,有助于了解胶原蛋白相关疾病的发病机理和研究有效的治疗方法,具有广阔的应用前景。
附图说明
图1本发明所述多肽探针靶向识别变性胶原蛋白的示意图;
图2本发明所述多肽探针对变性胶原蛋白的结合能力;
图3本发明所述多肽探针对受损小鼠耳朵组织染色的荧光显微镜图;
图4本发明所述多肽探针FAM-GPO、FAM-GYO和FAM-GFO对正常、受损小鼠肠组织染色以及掩蔽实验的荧光显微镜图;
图5本发明所述多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO对小鼠不同部位损伤组织染色的荧光显微镜图;
图6本发明所述多肽探针FAM-GYO对肝纤维化、肝癌、直肠癌和食管癌组织病理切片染色的荧光显微镜图;
图7本发明所述多肽探针FAM-GFO对肝纤维化、肝癌、直肠癌和食管癌组织病理切片染色的荧光显微镜图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
由于胶原蛋白与癌症等多种严重疾病密切相关,因此特异性检测病变胶原蛋白的靶向多肽探针受到越来越多的关注。最近研究发现了一种由重复的(Gly-Pro-Hyp)n序列构成的GPO多肽探针,它可以特异性识别变性胶原蛋白。但是它具有很强的三重螺旋结构稳定性,必须加热预处理才能用于胶原蛋白的检测,从而导致组织损伤风险以及单链状态探针的浓度难以定量等问题。因此,本发明的目的在于构建既可以降低三重螺旋结构稳定性,又能够特异性结合病变胶原蛋白的(Gly-X-Y)n序列探针。
本发明将GPO多肽探针靶向胶原蛋白多肽序列(Gly-Pro-Hyp)n中间一个或几个氨基酸Pro替换为不同类型的氨基酸Tyr、Phe、Asp或Ala,构建了不同的多肽序列;结果发现,并不是所有替换后的多肽序列均能保持与病变胶原蛋白良好的结合能力,只有将多肽序列(Gly-Pro-Hyp)n最中间位置的Pro替换为Tyr或Phe后获得的多肽序列可以保持高效识别病变胶原蛋白的能力;引入芳香性氨基酸Tyr或Phe为创建新型有效的靶向胶原蛋白多肽探针提供了一种简便的策略,具体如下:
本发明首先将现有靶向胶原蛋白的GPO多肽探针序列(Gly-Pro-Hyp)n中间一个位置的Pro替换为Tyr或Phe,构建了包含芳香族氨基酸的两个新型靶向多肽序列GYO:(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Tyr-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4和GFO:(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Phe-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4,并构建了多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO;所述的多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO,显著降低了现有GPO探针的三重螺旋结构稳定性(热变温度分别降低13℃和13.8℃),并且保持了与现有GPO探针相当的靶向结合病变胶原蛋白能力和组织染色能力。其次,与现有的降低GPO探针稳定性的策略相比,所述的多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO长度较短,也没有引入复杂的非天然氨基酸,极大降低了探针合成的难度和成本。并且,本发明的实施例中也证明了本发明所述的两种多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO可特异性靶向各种类型的小鼠结缔组织中的变性胶原蛋白,成功应用于不同病人的病理组织染色,在肿瘤、纤维化等胶原蛋白相关疾病的早期检测与疗效评估等领域具有广阔的应用前景。
实施例1多肽探针的制备
1.多肽探针的设计
本实施例设计的多肽探针序列分别为:FAM-(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Tyr-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4、FAM-(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Phe-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4、FAM-(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Asp-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4、FAM-(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Ala-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4、FAM-(Gly-Pro-Hyp)2-Gly-Tyr-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Tyr-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)3、FAM-(Gly-Pro-Hyp)2-Gly-Ala-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)3;
对照多肽探针序列:FAM-Pro3-Gly3-Hyp3-Pro-Gly-Hyp2-Pro2-Gly3-Hyp3-Pro2-Gly和FAM-(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Pro-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4,其中FAM为羧基荧光素。
2.固相合成多肽序列
(1)将100mg的Rink氨树脂加入具有筛板的反应器中,使用5mL的二氯甲烷溶胀树脂;
(2)由20%哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基,显色反应检测保护基脱除完全;
(3)将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解,低温活化20min后,向溶液中滴加DIEA(6eq),溶液混合后加入到反应器中反应3hrs。
(4)反应结束后,反应液由反应器中抽出,树脂分别由5mL的DMF和DCM洗3次。显色反应检测氨基酸缩合完全,树脂由20%哌啶/DMF溶液处理3次,分别为5min、5min和15min。树脂分别由5mL的DMF和DCM洗3次,显色反应检测保护基脱除完全;
(5)重复步骤(3)、(4),直到合成目标序列的多肽。向反应器中加入FAM(4eq),HOBt(4eq)和HBTU(4eq),向溶液中滴加DIEA(6eq),30℃反应20小时,显色反应检测反应完全,树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次。
(6)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤3次。将树脂抽干,加入切割液(TFA:水=95:5),反应3hrs。
(7)反应液加入冰乙醚中,将多肽沉淀。离心收集沉淀,用少量TFA溶解沉淀,加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀,沉淀用冰乙醚洗涤3次后风干,得到粗肽。粗肽由反相液相色谱纯化,分别获得下述多肽探针:
FAM-GYO:FAM-(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Tyr-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4;
FAM-GFO:FAM-(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Phe-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4;
FAM-GDO:FAM-(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Asp-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4;
FAM-GAO:FAM-(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Ala-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4;
FAM-2GYO:FAM-(Gly-Pro-Hyp)2-Gly-Tyr-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Tyr-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)3;
FAM-2GAO:FAM-(Gly-Pro-Hyp)2-Gly-Ala-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)3;
FAM-GPO:FAM-Pro3-Gly3-Hyp3-Pro-Gly-Hyp2-Pro2-Gly3-Hyp3-Pro2-Gly;
FAM-Control:FAM-(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Pro-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4。其中合成的多肽探针如表1所示。
表1合成的多肽探针
注:G为Gly,P为Pro,O为Hyp,Y为Tyr,F为Phe,D为Asp,A为Ala
实施例2多肽探针对变性胶原蛋白靶向结合能力
在70℃的10mM的PBS(pH7.4)缓冲液中制备1mg/mL的明胶溶液,将其加入到96孔板中并风干。成膜后,用100μL在10mM的PBS(pH7.4)中配制的1%BSA封闭液封闭1h,弃去孔内溶液,PBS洗涤3次,每次3min;
分别取实施例1制备的多肽探针FAM-GPO,FAM-GYO,FAM-GFO,FAM-GDO,FAM-GAO,FAM-2GYO,FAM-2GAO和FAM-Control于10mM的PBS(pH7.4)中配制成20μM的多肽探针溶液;分别取70μL的多肽探针溶液加入到96孔板中,并在4℃下孵育4h,以使其与明胶膜结合。使用前将多肽探针溶液在80℃下加热15min以充分解链,然后立即在冰水中淬火30s。将孔板用400μL,10mM的PBS(pH7.4)洗涤3次,每次5min。利用Infinite M200(TECAN,Switzerland)上测量荧光强度(ex:495nm,em:541nm)。每次测量重复三次。
通过明胶结合实验比较多肽探针FAM-GPO,FAM-GYO,FAM-GFO,FAM-GDO,FAM-GAO,FAM-2GYO,FAM-2GAO和FAM-Control的胶原蛋白靶向结合能力。实验结果如图2中a所示,多肽探针FAM-GPO,FAM-GYO,FAM-GFO,FAM-GDO,FAM-GAO,FAM-2GYO,FAM-2GAO对变性的胶原蛋白均具有一定的结合能力,而对照探针FAM-Control基本无结合;其中多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO的荧光强度与FAM-GPO相似。结果表明:在将GPO探针中的P或/和O替换为其他非亚氨基酸的探针改良方案中,虽然绝大多数改良探针的热变温度相较于GPO探针均出现了下降,但是采用该策略改良探针与变性胶原蛋白的结合能力均发生了显著的下降现象。发明人意外的发现,如果只将GPO(Gly-Pro-Hyp)n序列的最中间位置的一个P(Pro)替换为Y(Tyr)或F(Phe),构建的多肽序列GYO:(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Tyr-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4和GFO:(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Phe-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4与现有胶原蛋白靶向序列GPO对病变胶原蛋白的结合力相当,保持了与病变胶原蛋白良好的结合能力;同时与现有胶原蛋白靶向序列GPO相比,又显著降低了三重螺旋结构的稳定性。
实施例3多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO对变性胶原蛋白靶向结合特异性
本发明公开的多肽探针对变性胶原蛋白、胃蛋白酶、胰蛋白酶和血红蛋白的结合能力的评价按照实施例2所述的实验方案进行:在70℃加热15min使溶解在0.5M乙酸中的胶原蛋白溶液(I型)变性,分别将1mg/mL的变性胶原蛋白(Ⅰ型)、血红蛋白、胃蛋白酶和胰蛋白酶溶液添加到96孔板中风干。孔板用10mM的PBS(pH7.4)洗涤3次,每次3min,甩板拍干。在使用之前将FAM-GPO、FAM-GYO和FAM-GFO溶液在80℃加热15min,并立即在冰水中淬火30s。在蛋白膜上添加70μL(20μM)的多肽探针溶液(制备同实施例1),并在4℃下孵育4h。结合结束后,用400μL,10mM的PBS(pH7.4)洗涤3次,每次5min。在Infinite M200(TECAN,Switzerland)上测量荧光(ex:495nm,em:541nm)。每个结合实验重复三次。
实验结果如图2中b所示,在96孔板上分别包被有变性胶原蛋白(灰色)、胰蛋白酶(红色)、胃蛋白酶(绿色)和血红蛋白(蓝色),结果表明,多肽探针FAM-GYO、FAM-GFO与FAM-GPO均对变性胶原蛋白具有较强的结合能力,而对其他蛋白基本无结合。这些结果表明,多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO可以高度特异性地检测变性胶原蛋白。
实施例4多肽探针对小鼠组织的靶向荧光成像
小鼠耳朵、肠、心脏、软骨和眼组织取自7-8周大的KM小鼠(18-22g)。将所有组织用的4%多聚甲醛固定1h,并包埋在石蜡中。将组织切成4μm的厚度置于经多聚赖氨酸处理的载玻片上。依次使用二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、50%乙醇和去离子水洗涤石蜡切片两次,每次5min。小鼠耳朵、肠、心脏、软骨和眼组织用85℃超纯水处理10min,以使胶原蛋白变性。将用10mM PBS配制的0.5mL(5%v/v)的山羊血清封闭液加到组织上,在室温下孵育30min以封闭非特异性结合。用吸水纸除去封闭溶液。在使用前将FAM-GPO,FAM-GYO,FAM-GFO,FAM-GDO,FAM-GAO,FAM-2GYO,FAM-2GAO或FAM-Control溶液在80℃加热15min后立即在冰水中淬火30s。加入100μL多肽探针(15μM)溶液覆盖组织,然后用石蜡膜覆盖以防止干燥,并在4℃下孵育4h。多肽探针染色后,除去石蜡膜,用吸水纸擦去多余的溶液。用在10mM的PBS(pH=7.4)中配制的200μL的DAPI(5μg/mL)溶液处理每个组织切片,染色1min。将载玻片浸入染色槽中的1×PBS缓冲液中5min,重复五次以洗去未结合的染色剂。将染色的小鼠组织切片在正置荧光显微镜(Leica DM4000B,Germany)上成像。
受损小鼠耳朵组织染色结果如图3所示,其中a为多肽探针FAM-GPO,b为多肽探针FAM-GYO,c为多肽探针FAM-GFO,d为多肽探针FAM-GDO,e为多肽探针FAM-GAO,f为多肽探针FAM-2GYO,g为多肽探针FAM-2GAO,h为对照探针FAM-Control。实验结果表明,不同多肽探针染色受损的小鼠耳朵组织的荧光显微镜照片显示出不同水平的绿色荧光,其中多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO显示出了最强的绿色荧光,相当于FAM-GPO染色结果;而多肽探针FAM-2GAO和FAM-Control显示的绿色荧光很弱,几乎失去了对变性胶原蛋白的靶向能力。这些结果证明本发明提供的多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO具有与FAM-GPO类似的组织染色能力。
进一步研究了两种结合能力最强的多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO的变性胶原蛋白靶向功能。结果如图4所示,正常肠组织染色的荧光显微照片均不显示绿色荧光,表明这三种多肽探针无法靶向完整的胶原蛋白(图4中a,d,g所示)。相比之下,染色的受损肠组织的荧光显微镜照片均显示出明显的绿色荧光,这表明三种多肽探针对变性胶原蛋白的识别具有很高的特异性(图4中b,e,h所示)。DAPI对细胞核的共染色(蓝色)证实了肠组织中胶原蛋白的独特分布。
使用多肽G(POG)10作为掩蔽剂进行了掩蔽实验,以研究三种多肽探针FAM-GPO、FAM-GYO和FAM-GFO的结合模式(图4中c,f,i所示)。实验结果表明,在用多肽探针染色之前,将掩蔽剂G(POG)10加到肠组织上。在G(POG)10的存在下,受损肠组织的荧光显微镜照片均显示弱荧光,表明G(POG)10有效地阻止了多肽探针对变性胶原蛋白的染色。多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO可能与FAM-GPO具有相同的作用机理,都是通过与解折叠位点杂交,从而特异性靶向变性的胶原蛋白。
多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO进一步用于染色受损的小鼠心脏组织切片(图5中a,d所示)、角膜组织切片(图5中b,e所示)和软骨组织切片(图5中c,f所示)。所有染色组织的荧光显微镜照片均显示出强烈的绿色荧光,表明这两种多肽探针均能在多种结缔组织中靶向变性的胶原蛋白。DAPI用于染色细胞核(蓝色)并共定位胶原蛋白。
实施例5多肽探针对人病理组织的靶向荧光成像
人肝纤维化、肝癌、直肠癌和食管癌的组织利用4%多聚甲醛固定1h,并包埋在石蜡中。将组织切成4μm的厚度置于经多聚赖氨酸处理的载玻片上。依次使用二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、50%乙醇和去离子水洗涤石蜡切片两次,每次5min。将0.5mL山羊血清的PBS溶液(5%v/v)添加到组织上,并在室温下孵育30min以阻断非特异性结合。用吸水纸除去封闭溶液。将100μL多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO(15μM)溶液覆盖组织切片。使用前,将所有多肽探针在80℃加热15min,并在冰水中淬火30s。然后用石蜡膜覆盖组织以防止干燥,并在4℃下孵育4h。多肽探针染色后,除去石蜡膜,用吸水纸擦去多余的溶液。将200μL的DAPI(5μg/mL,10mM的PBS溶解)溶液覆盖每个组织,在室温下孵育1min。DAPI染色后,将载玻片浸入10mM的PBS缓冲液的染色槽中5次,每次5min,以洗去未结合的染色剂。利用正置荧光显微镜(Leica DM4000B,Germany)对组织切片中的病变胶原蛋白和细胞核成像。
通过人病理组织进一步研究了多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO特异性靶向变性胶原蛋白的适用性,结果如图5和图6所示。用FAM-GYO和FAM-GFO染色的人肝纤维化、肝癌、直肠癌和食管癌的FFPE(福尔马林固定石蜡包埋的组织的荧光显微镜照片均显示出强烈的绿色荧光,表明FAM-GYO和FAM-GFO可以高特异性地靶向不同类型病理结缔组织中的变性胶原蛋白DAPI对细胞核的染色也证明了患病结缔组织中独特的胶原蛋白分布。这表明本发明提供的两种包含非亚氨基酸的新型多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO是与用于检测变性胶原的FAM-GPO类似的广谱生物传感器。
上述实验表明,本发明提供的新型多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO被成功地用于小鼠耳朵、肠、心脏、眼睛等不同组织和肝纤维化、肝癌、直肠癌和食管癌等不同疾病病人组织样本的染色。这两种多肽探针为构建低三重螺旋结构稳定性的胶原靶向多肽提供了新的视角,所述多肽探针的设计策略为检测病变胶原蛋白提供了高灵敏、高特异性的方法,将有助于胶原蛋白相关疾病的机理研究和治疗方法开发。
综上,本发明所述的多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO显著降低了现有GPO探针的三重螺旋结构稳定性(热变温度分别降低13℃和13.8℃),并且保持了与现有GPO探针类似的病变胶原蛋白靶向结合能力和组织染色能力。与现有的降低GPO探针稳定性的策略相比,所述的多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO长度较短,也没有引入复杂的非天然氨基酸,极大降低了探针合成的难度和成本。所述的包含芳香族氨基酸的多肽探针FAM-GYO和FAM-GFO,可用于耳朵、肠、心脏、眼睛等不同组织和肝纤维化、肝癌、直肠癌和食管癌等不同疾病病人组织样本中胶原蛋白的检测,在肿瘤、纤维化等胶原蛋白相关疾病的早期检测与疗效评估等领域具有广阔的应用前景。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (6)
1.一种靶向结合病变胶原蛋白的多肽序列,其特征在于,所述多肽序列为(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Tyr-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4或(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Phe-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4。
2.一种靶向结合病变胶原蛋白的多肽探针,其特征在于,所述多肽探针包括靶向结合病变胶原蛋白的多肽序列和修饰在所述多肽序列上的荧光信号分子,所述多肽序列为(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Tyr-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4或(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Phe-Hyp-(Gly-Pro-Hyp)4。
3.如权利要求2所述的多肽探针,其特征在于,所述荧光信号分子为荧光素类分子、香豆素类分子、罗丹明类分子、菁染料类分子、BODIPY类分子、方酸类分子、磷光分子、半导体量子点、碳量子点、硅量子点、硫量子点、磷量子点、钙钛矿量子点、上转化稀土纳米材料、长余辉纳米材料中的任一种。
4.如权利要求2或3所述的多肽探针,其特征在于,所述荧光信号分子为羧基荧光素FAM,所述羧基荧光素FAM修饰在多肽序列的N端。
5.如权利要求4所述多肽探针的制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
a)将80-250mg的树脂加入具有筛板的反应器中,使用2-8mL的二氯甲烷溶胀树脂;
b)由15-25%哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基,通过显色反应来检测保护基的脱除程度;
c)分别将4eq的N端由Fmoc保护的氨基酸、HOBt和HBTU由DMF溶解,活化10-30min后,向溶液中滴加6eq的DIEA,溶液混合均匀后加入到反应器中,反应1-6hrs;
d)反应结束后,反应液由反应器中抽出,树脂分别由2-8mL的DMF和DCM洗2-4次,显色反应检测氨基酸缩合完全,树脂由15-25%哌啶/DMF溶液处理3次,分别为5min、5min和15min,树脂分别由5mL的DMF和DCM洗3次,显色反应检测保护基脱除完全;
e)之后重复步骤c)和d),直到合成目标序列的多肽,显色反应检测反应完全后,树脂分别由3-8mL的DMF和DCM洗2-4次;
f)分别称取4eq信号分子、HOBt和HBTU,由DMF溶解,活化10-30min后,向溶液中滴加4-10eq的DIEA,混合液加入到多肽溶液中,避光反应12-48hrs;
g)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤2-5次,然后将树脂抽干,加入切割液,切割液的组分为TFA:水的体积比为95:5,反应1-6hrs;
h)向反应液加入冰乙醚中,将多肽沉淀,然后通过离心收集沉淀,用TFA溶解沉淀,加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀,沉淀用冰乙醚洗涤2-4次后干燥,得到粗肽,粗肽由反相液相色谱纯化即得多肽探针。
6.如权利要求4所述的多肽探针在制备检测病变胶原蛋白的检测试剂,和/或试剂盒,和/或成像试剂中的应用。
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