JP2009077710A - 基質プローブ、多重核磁気共鳴法による酵素活性の検出方法および酵素活性のイメージング方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】多重核磁気共鳴法を用いた酵素活性測定用の基質プローブにおいて、該プローブが、少なくとも一つの構成単位として活性状態の酵素によって選択的に認識される酵素認識部位を含み、核スピンを持ち異なる共鳴周波数を有する少なくとも3つの核磁気共鳴活性核が連結した基が前記酵素認識部位に特異的に存在することを特徴とする基質プローブを用いて、多重核磁気共鳴測定を行い、それらのプローブの存在と酵素活性とを検出する、或いは多重核磁気共鳴イメージング法により、酵素活性をイメージングする。
【選択図】図1
Description
活性状態のプロテアーゼによる前記基質ペプチドプローブの切断に伴う多重核磁気共鳴信号の変化を測定することを特徴とする核磁気共鳴法によるプロテアーゼ活性の測定方法である。
活性状態のプロテアーゼによる基質ペプチドプローブの切断に伴う多重核磁気共鳴信号の変化を測定することを特徴とするプロテアーゼ活性のイメージング方法である。
活性状態の酵素による前記基質プローブの認識、その後の化学反応に伴う基質プローブ由来の多重核磁気共鳴信号の変化を測定することを特徴とする核磁気共鳴法による酵素活性の測定方法である。
活性状態の酵素による基質プローブの認識、その後の化学反応に伴う基質プローブ由来の多重核磁気共鳴信号の変化を測定することを特徴とする酵素活性のイメージング方法である。
疾病に関連した異常な酵素活性を検出することにより疾病の位置と状態をモニタリングする工程と、を有する。
(実施例1−1:MMP2の同位体標識基質ペプチドプローブの合成)
ペプチドGPLGVRGK(H-Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Lys-NH2;配列番号1)を通常のFmoc法にて合成した。N末端側から4番目のGlyのアミノ酸骨格の1位炭素および2位炭素が13Cで標識され、N末端側から5番目のValのアミノ酸骨格の窒素が15Nで標識されているものを得るため、合成にあたって、これらの位置のGlyおよびValを結合させる際は、予めそのように同位体標識されたアミノ酸を用いた。合成は、Rink amide樹脂(Novabiochem社製)を用い、0.2 mmolスケールで合成した。合成に用いた同位体標識アミノ酸試薬(L-Valine-15N, N-FMOC誘導体、GLYCINE-13C2, F-MOC誘導体)はISOTEC社から購入した。特に断らない限り、本実験で用いた非同位体標識アミノ酸、ならびにアミノ酸合成試薬、溶媒は渡辺化学工業株式会社から購入した。アルギニン残基は、ペンタメチルジヒドロベンゾフラン− 5 − スルフォニル(pdf)基を用いて側鎖保護されたもの、一方リジン残基はt−ブトキシカルボニル(Boc)基で側鎖保護されたものを用いた。
酵素反応用緩衝液として、TCNBバッファー(50mM Tris,10mM CaCl2,150mM NaCl,0.05% Brij 35,pH7.5 )を使用した。MMP2前駆体(R&Dシステムズ社)を、製品のプロトコールに従い、1mMの4−アミノフェニル酢酸水銀(APMA;シグマ社製)によって活性化し、活性化MMP2(以後単に、MMP2という)を得た。1μgのMMP2を反応用緩衝液0.9mLに溶解させ、前記で合成した基質ペプチドを780μg加え(ペプチド濃度1 mM)、25℃で18時間、インキュベートした。
得られた同位体標識ペプチドの酵素反応前と反応後の試料について、Bruker社製DRX700装置を用いて多重NMR測定を行った。試料には10%の重水を添加して、25℃、積算回数2〜512回で測定を行った。
(実施例2−1:13Cラベル化ピルビン酸含有培地内でのHeLa細胞培養実験)
13Cラベル化ピルビン酸をDMEM(+FBS)溶液に溶解させ、7mM溶液(30ml)になるように調整し、滅菌濾過を行った。13Cラベル化ピルビン酸含有DMEM(+FBS)溶液(9ml)を入れたディッシュを3枚用意した。一枚のディッシュにつき70万個/mlのHeLa細胞を含むDMEM(+FBS, +AB)溶液(1ml)を添加し、37℃, 5% CO2の条件下で、三日間培養した。
次に、ネガティブコントロール実験として、上記条件でHela細胞非存在下での測定を行い、乳酸はHela細胞由来の酵素による代謝産物であることの確認を試みた。13Cラベル化ピルビン酸をDMEM(+FBS)溶液に溶解させ、7mMの溶液(10ml)になるように調整し、滅菌濾過を行った。13Cラベル化ピルビン酸含有DMEM(+FBS)溶液(9ml)を入れたディッシュを1枚用意した。HeLa細胞を含まないDMEM(+FBS, +AB)溶液(1ml)を添加し、37℃, 5% CO2の条件下で、三日間培養した。培養液を回収した後、ディッシュをPBS溶液(3ml)で洗浄を行い、この洗浄液も培養液と共に回収した。回収した培養液を凍結乾燥した。凍結乾燥後、析出してきた固体に重水(1ml)を加え、超音波処理・遠心操作(5min, 4500 rpm)を行った。上澄み液(50ml)を重水で更に10倍希釈し、多重共鳴NMR解析を行った。
(実施例3−1:担癌マウスの作製)
colon-26細胞を培養していたディッシュから培地を除去し、PBSで洗浄した後、Trypsin(5ml)を加え細胞を剥がした。その細胞浮遊液に培地を加えてチューブに移し遠心分離で細胞を沈殿させた後、上澄み液を除去し、PBS(10ml)に溶解させた。細胞数をカウントして、4.0×107 個/mlになるように調整したcolon-26細胞溶液を、BALB/cマウスの左足の皮下に100 ml投与した。その後、ほぼ1日間絶食させた。
担癌マウスの体重比で5g/kgとなるように13C6,2H7-D-glucose のPBS溶液(200ml)を担癌マウスに、尻尾の静脈から投与した。1時間経過後、マウスを開切し、必要な臓器 (血液(200ml)・肝臓・腎臓・癌部位・心臓) を順に取り出した。血液以外の組織を生理食塩水で洗浄した後、それぞれエッペンチューブに回収した。これに10% trichloroacetic acid (500 ml) を加え、ビーズを用いて各臓器をすり潰した後、氷上で30分間インキュベートした。遠心分離(4℃, 12000rpm, 5min)で不溶物を沈殿させた後、上澄み液を回収した。再び沈殿物に10% trichloroacetic acid (200 ml)を加え、遠心分離(4℃, 12000rpm, 5min)した後、この上澄み液も回収し、全上澄み液を凍結乾燥した。凍結乾燥した各組織の抽出物に重水(700ml)を加え、多重共鳴NMR解析を行った。
B:非標識アミノ酸
C:安定同位体標識アミノ酸
D:安定同位体標識アミノ酸もしくは非標識アミノ酸
E:プロテアーゼによるペプチド結合加水分解
F:基質ペプチドプローブ
G:多重核磁気共鳴測定によるプローブ検出ならびに結合切断検出
Claims (38)
- 多重核磁気共鳴法を用いた酵素活性測定用の基質プローブにおいて、該プローブが、少なくとも一つの構成単位として活性状態の酵素によって選択的に認識される部位(酵素認識部位)を含み、核スピンを持ち異なる共鳴周波数を有する少なくとも3つの核磁気共鳴活性核が連結した基が前記酵素認識部位に特異的に存在することを特徴とする基質プローブ。
- 前記酵素認識部位に特異的に存在する核スピンを持つ核磁気共鳴活性核が人工的に濃縮されている請求項1に記載の基質プローブ。
- 前記酵素認識部位に特異的に存在する核スピンを持つ核磁気共鳴活性核が、1H、13Cおよび15Nから選択される請求項1又は2に記載の基質プローブ。
- 前記基質プローブが、2位炭素と3位炭素が13Cで標識されているピルビン酸、もしくはその塩である請求項3に記載の基質プローブ。
- 前記基質プローブがグルコースであり、この1位〜6位の全ての炭素が13Cで標識され、1位〜6位の炭素に結合する全ての水素原子7個が重水素化されている請求項3に記載の基質プローブ。
- 前記酵素が、解糖系酵素であることを特徴とする請求項1から5のいずれかに記載の基質プローブ。
- 前記解糖系酵素が乳酸デヒドロゲナーゼであることを特徴とする請求項6に記載の基質プローブ。
- 請求項1から7のいずれかに記載の基質プローブによる多重核磁気共鳴を利用した酵素活性の測定方法であって、
活性状態の酵素による前記基質プローブの認識、その後の化学反応に伴う基質プローブ由来の多重核磁気共鳴信号の変化を測定することを特徴とする核磁気共鳴法による酵素活性の測定方法。 - 前記核磁気共鳴法が、二重核磁気共鳴法と三重核磁気共鳴法の各パルス系列を用いて各核磁気共鳴信号を取得する工程と、これらの信号を組み合わせて解析する工程と、を少なくとも有することを特徴とする請求項8に記載の酵素活性の測定方法。
- 基質プローブの存在を二重核磁気共鳴信号を用いて検出し、酵素反応を受けた該基質プローブを三重核磁気共鳴信号を用いて検出することで、前記基質プローブの存在量と前記酵素の活性とを測定することを特徴とする請求項9に記載の酵素活性の測定方法。
- 請求項1から7のいずれかに記載のプローブによる多重核磁気共鳴イメージングを利用した酵素活性のイメージング方法であって、
活性状態の酵素による基質プローブの認識、その後の化学反応に伴う基質プローブ由来の多重核磁気共鳴信号の変化を測定することを特徴とする酵素活性のイメージング方法。 - 前記核磁気共鳴イメージング法が、二重核磁気共鳴法と三重核磁気共鳴法の各パルス系列を用いて各核磁気共鳴信号を取得する工程と、これらの信号を組み合わせて解析する工程と、を有することを特徴とする請求項11に記載の酵素活性のイメージング方法。
- 基質プローブの存在を二重核磁気共鳴信号を用いて検出し、酵素反応を受けた該基質プローブを三重核磁気共鳴信号を用いて検出することで、前記基質プローブの存在量と前記酵素の活性を測定することを特徴とする請求項12に記載の酵素活性のイメージング方法。
- 疾病に関連した異常な酵素活性を検出するための、請求項1から7のいずれかに記載の基質プローブからなる核磁気共鳴イメージング用の基質プローブ。
- 疾病に関連した異常な酵素活性を検出するための、請求項1から7のいずれかに記載の基質プローブを用いた核磁気共鳴イメージング方法。
- 解糖系代謝産物の乳酸を検出するための、請求項4に記載の基質プローブ。
- 多重核磁気共鳴法を用いたプロテアーゼ活性測定用の基質ペプチドプローブにおいて、該プローブが、少なくとも一つの構成単位として活性状態のプロテアーゼによって選択的に認識され、切断されるプロテアーゼ切断部位を含み、核スピンを持ち異なる共鳴周波数を有する少なくとも3つの核磁気共鳴活性核が連結した基が前記プロテアーゼ切断部位に特異的に存在することを特徴とする基質ペプチドプローブ。
- 前記プロテアーゼ切断部位に特異的に存在する核スピンを持つ核磁気共鳴活性核が人工的に濃縮されている請求項17に記載の基質ペプチドプローブ。
- 前記プロテアーゼ切断部位に特異的に存在する核スピンを持つ核磁気共鳴活性核が、1H、13Cおよび15Nから選択される請求項17又は18に記載の基質ペプチドプローブ。
- 基質ペプチドのアミノ酸配列がGly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Lys(配列番号1)であり、N末端側から4番目のGlyのアミノ酸骨格の1位炭素および2位炭素が13Cで標識され、N末端側から5番目のValのアミノ酸骨格の窒素が15Nで標識されている請求項20に記載の基質ペプチドプローブ。
- 前記プロテアーゼがマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)であることを特徴とする請求項17から21のいずれかに記載の基質ペプチドプローブ。
- 前記プロテアーゼがマトリックスメタロプロテアーゼ2(MMP2)であることを特徴とする請求項21に記載の基質ペプチドプローブ。
- 請求項17から23のいずれかに記載の基質ペプチドプローブによる多重核磁気共鳴を利用したプロテアーゼ活性の測定方法であって、
活性状態のプロテアーゼによる前記基質ペプチドプローブの切断に伴う多重核磁気共鳴信号の変化を測定することを特徴とする核磁気共鳴法によるプロテアーゼ活性の測定方法。 - 前記核磁気共鳴法が、二重核磁気共鳴法と三重核磁気共鳴法の各パルス系列を用いて各核磁気共鳴信号を取得する工程と、これらの信号を組み合わせて解析する工程と、を少なくとも有することを特徴とする請求項24に記載のプロテアーゼ活性の測定方法。
- 基質ペプチドプローブの存在を二重核磁気共鳴信号を用いて検出し、該基質ペプチドプローブがプロテアーゼによって切断された後の物質を三重核磁気共鳴信号を用いて検出することで、前記基質ペプチドプローブの存在量と前記プロテアーゼの活性とを測定することを特徴とする請求項25に記載のプロテアーゼ活性の測定方法。
- 請求項17から23のいずれかに記載のプローブによる多重核磁気共鳴イメージングを利用したプロテアーゼ活性のイメージング方法であって、
活性状態のプロテアーゼによる基質プローブの切断に伴う多重核磁気共鳴信号の変化を測定することを特徴とするプロテアーゼ活性のイメージング方法。 - 前記核磁気共鳴イメージング法が、二重核磁気共鳴法と三重核磁気共鳴法の各パルス系列を用いて各核磁気共鳴信号を取得する工程と、これらの信号を組み合わせて解析する工程と、を有することを特徴とする請求項27に記載のプロテアーゼ活性のイメージング方法。
- 基質プローブの存在を二重核磁気共鳴信号を用いて検出し、該基質ペプチドプローブがプロテアーゼによって切断された後の物質を三重核磁気共鳴信号で検出することで、前記基質プローブの存在量と前記プロテアーゼの活性を測定することを特徴とする請求項28に記載のプロテアーゼ活性のイメージング方法。
- 疾病に関連した異常なプロテアーゼ活性を検出するための、請求項17から23のいずれかに記載の基質ペプチドプローブからなる核磁気共鳴イメージング用の基質プローブ。
- 疾病に関連した異常なプロテアーゼ活性を検出するための、請求項17から23のいずれかに記載の基質ペプチドプローブを用いた核磁気共鳴イメージング方法。
- 多重核磁気共鳴法を用いた酵素活性測定用の基質プローブにおいて、該プローブが、少なくとも一つの構成単位として活性状態の酵素によって選択的に認識される部位を含み、酵素反応によって、核スピンを持ち異なる共鳴周波数を有する少なくとも3つの核磁気共鳴活性核が連結した基が存在するようになることを特徴とする基質プローブ。
- 前記基質プローブがグルコースであり、この1位〜6位の全ての炭素が13Cで標識され、1位〜6位の炭素に結合する全ての水素原子7個が重水素化されている請求項32に記載の基質プローブ。
- 請求項32又は33に記載の基質プローブによる多重核磁気共鳴を利用した酵素活性の測定方法であって、
活性状態の酵素による前記基質プローブの認識、その後の化学反応に伴う基質プローブ由来の多重核磁気共鳴信号の変化を測定することを特徴とする核磁気共鳴法による酵素活性の測定方法。 - 請求項32又は33に記載の基質プローブによる多重核磁気共鳴イメージングを利用した酵素活性のイメージング方法であって、
活性状態の酵素による基質プローブの認識、その後の化学反応に伴う基質プローブ由来の多重核磁気共鳴信号の変化を測定することを特徴とする酵素活性のイメージング方法。 - 疾病に関連した異常な酵素活性を検出するための、請求項32又は33に記載の基質プローブからなる核磁気共鳴イメージング用の基質プローブ。
- 疾病に関連した異常な酵素活性を検出するための、請求項32又は33に記載の基質プローブを用いた核磁気共鳴イメージング方法。
- 解糖系代謝産物の乳酸あるいはアラニンを検出するための、請求項33に記載の基質プローブ。
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