JP2015509584A - Nmrベースの代謝産物スクリーニングプラットフォーム - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたR21 AI087431のもとで政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
本発明は、NMRベースのスクリーニングプラットフォームに関する。
細胞の代謝出力は、当該細胞種類を規定する機能的ゲノムネットワーク、トランスクリプトミクスネットワークおよびプロテオミクスネットワークの合計である。メタボロミクスとは、メタボロームにおける代謝産物レベルおよび刺激の結果としての経時的なそれらの変化を包括的かつ同時的に体系的に求めることである。他の分野も例えば所与の遺伝子のコピー数、mRNAまたはタンパク質に関する情報を提供し得るが、代謝産物に関する化学的プロセスのこの研究は、全ての異常な遺伝子、RNAおよび/またはタンパク質を下流で合計する。この「代謝フィンガープリント」は、特定の細胞種類における全ての機能的または非機能的経路のスナップショットを表わす。
本開示は、公知のNMRデータ取得の多数の局面を上回る利点を提供し、新規のアプローチを利用して、高速で、偏りのない、広範囲の、定量的な超高分解能NMRデータ取得および特注のNMR分析を可能にする新規の方法について記載している。本開示は、特定の分子の代謝分解を特定、追従および特徴付けするため、ならびに、所与の細胞種類に必須の細胞メタボロミクスを分析するために使用可能な新たなNMRスクリーニング方法について記載している。本明細書に記載されている方法は、公知のNMRプロトコルがもたらす障害を回避する。すなわち、本明細書に記載されている方法は、データ取得を実行するために必要なサンプルサイズを縮小化し、分析対象の代謝産物の精製を不要にし、多次元NMRに必要な実験時間を短縮し、代謝産物の特定に必要な高分解能が得られる。当該方法が必要とする細胞は比較的少なく(200万個〜2000万個)、これにより、細胞培養物からでなく一次細胞および組織からの代謝産物を研究するために当該方法を用いることができる。また、開示されている方法は、分析の前に他の細胞代謝産物から対象の個々の代謝産物を精製する必要がない。さらに、当該新たな方法により、任意の細胞種類における所与の前駆体の特定の代謝運命を視覚化して、その結果、同様に本明細書に記載されている新規のデータ分析方法を利用してさまざまな種類の細胞において異なった形で生成される代謝産物を簡単に特定することができる。
一般に、所与の種類の細胞内の所与の前駆体分子(すなわち基質)の代謝産物をモニタリングするための本明細書に記載の新たな方法は、(a)細胞集団に標識基質、例えば13Cで標識された基質を任意に投入するステップと、(b)基質代謝産物への基質の代謝分解を可能にするのに十分な時間(例えば、実験上の疑問点に応じて、一般に5分〜24時間)にわたってステップ(a)の細胞を培養するステップと、(c)細胞から基質代謝産物を採取して、基質代謝産物のサンプル、例えば基質代謝産物の水溶性サンプルおよび脂質ベースの代謝産物の有機サンプルを得るステップと、(d)ステップ(c)のサンプルに対して多次元NMRを実行して、代謝された基質の共鳴スペクトルを求めるステップとを含み、共鳴は、基質の代謝産物の共鳴を表わす。多次元NMRをいかに実行するかということについて以下でさらに詳細に説明する。
従来の2次元NMR代謝産物プロファイリングは、1.1%で存在する13Cの天然存在度に依拠する。したがって、いかなる信号も観察するためには、大量のサンプルが必要である(平均して+2億個の細胞)。これにより、検出が培養細胞株に限定され、最も豊富な代謝産物のみが検出されることになる。必要な材料の量を減少させて、より広い濃度範囲で代謝産物を見るために、サンプル(例えば細胞、組織または腫瘍)には、13Cで標識された前駆体(グルコース、グルタミン、ピルビン酸塩およびアミノ酸が用いられたが、他の基質および他の同位体も可能である)が直接補充された。理論的には、これはサンプル負担を〜99%減少させるはずである。例えば1mMの代謝産物が、13Cの天然存在度を用いて検出されるために2億個の細胞を必要とする場合、標識を用いて同一の強度を見るのに必要な細胞はわずか200万個であろう。このステップを我々の方法に含むことにより、サンプル要件がいくつかの質量分析(mass spectrometry:M/S)アプローチについての要件と同様の要件に減少することになる。非標的M/Sでは、必要な細胞が少なくとも100万個であるが、その後に数ラウンドのクロマトグラフィ精製および検出が行われる。我々の方法は、必要な細胞数が少なく、精製が不要である。
原子が強磁場(B0)に置かれると、その分子内の電子が、印加された磁場の方向に歳差運動する。この歳差運動は、原子核に小さな磁場を作り出す。したがって、原子核における磁場(B)は、一般に、τだけ外部磁場(B0)よりも小さい。
化学シフトは、原子核の周りの化学的環境の非常に精密な測定基準である。M/Sおよびクロマトグラフィとは異なって、NMRは、同一の質量を有するが異なる化学結合性を有する分子同士を区別することができる唯一の方法のうちの1つである。しかし、この情報を利用するためには、超高分解能分光法が必要である。
上記のように、FID信号を周波数データに変換するには、フーリエ変換が必要である。しかし、原子核がZ軸の周りを+x磁化ベクトルで回転する場合、フーリエ変換は、+vおよび−vの両方においてピークを生じさせることになる。これは、フーリエ変換がベクトルの+v回転と−v回転とを区別することができないからである。周波数の符号を区別するための最も一般的な方法では、2つの異なる受信側の位相(例えば0°および90°)における信号をサンプリングする必要がある。多次元NMRの場合、これは実験時間を各次元について2倍に増加させる。我々の分析の速度を上昇させるために、ランダム位相サンプリング(random phase sampling:RPS)を利用した。ランダム位相サンプリングでは、単一の位相を用いて各ポイントを検出するが、当該位相は信号内のさまざまなポイントについてランダムに交互にされる。これにより、周波数の位相を分解するが取得時間を半分に削減することができる。
二次元NMR技術は、時間領域、すなわち直接的領域および間接的領域においてデータの二次元を生成する。直接的領域データは、実験を行ってNMR信号(例えばFID信号、エコー信号またはストロボ信号)を収集することによって生成される。言い換えれば、直接的領域は、NMR実験の時間領域である。間接的領域データは、NMR実験の時間パラメータを体系的に変化させ(例えば遅延時間をインクリメントし)、当該パラメータの各値についてNMR実験を行って、全ての実験からのNMR信号を組合わせることによって生成される。言い換えれば、間接的領域は、体系的に変化させられるパラメータの時間領域である。
一般に、本明細書に記載されている方法を用いる場合、サンプルに存在する基質代謝産物をサンプル内の他の分子から(例えばクロマトグラフィカラム(例えば、シデルマン等、トルフェナム酸薬剤の第二相代謝産物の精製および1H NMR分光学的同定、Metab Dispos、1997年6月1日、25:725−731)または当業者に周知の他の手段によって)精製または分離する必要がない。したがって、一般的な実施の形態では、NMRの前に当該方法において行われる精製のみが、水溶性サンプルまたは非水溶性サンプルへの代謝産物の分離である。
NMR代謝産物分析は、冗長で複雑である。これらの問題を回避するために、特注の「NMR代謝産物アレイ」プログラムを作成して、プロセスを自動化した。図4に示されるように、まず、スパイクイン制御を用いて、スペクトルを自動的に位相化し、整列させ、正規化する。例えば、4,4−ジメチル−4−シラペンタン−1−スルホン酸(DSS)、テトラメチルシラン(TMS)、プロピオン酸トリメチルシリル(TSP)、4,4−ジメチル−4−シラペンタン−1−トリフルオロ酢酸アンモニウム(DSA)または他のNMR標準基準化合物などの公知の材料を各サンプルに添加してもよく、その濃度は、基準として用いられて、サンプル間の相対的定量化比較を可能にし得る。次に、特注の自動ピークピッキングプログラムを用いて、各サンプルについてピークリストを生成し得て、ここで、各共鳴ピークは強度値を用いてX、Y座標に変換される。次いで、調査中のスペクトル内の全ての共鳴について「マスター」ルックアップテーブルを生成する「マスターピークリスト」プログラムを実行させ得る。このプログラムは、個々のピークリストファイルから全てのX、Yポイントを読出し、規定された許容差の範囲内の重複を除去し、調査中の全ての可能な代謝産物共鳴が求められるように、結果として生じたピークの組を標準出力に書込む。分析によっては、ヒト代謝産物データベースからのHSQCデータ全体をマスターピークリストに入力することが可能である。しかし、このアプローチをとると、必要な計算時間が長くなり、ほとんどの場合不要である。したがって、特に調査されているスペクトルについてマスタールックアップテーブルを作成することが好ましい。
本明細書では、少なくとも2つの細胞集団、例えば第1の細胞集団および第2の細胞集団によって発現が異なる基質代謝産物を特定するための新規の方法も提供される。細胞集団のうちの一方は、健康な被験者または細胞株からのものであり得て、対照群として使用可能である。当該方法は、本明細書に記載されているさまざまな方法ステップおよび技術のさまざまな特徴を用いることができ、(a)第1および第2の細胞集団に標識基質(例えば13C、15Nまたは31Pで標識された基質)を投入するステップと、(b)基質代謝産物への標識基質の代謝分解を可能にするのに十分な時間にわたってステップa)の第1および第2の細胞集団を培養するステップと、(c)ステップ(b)の第1および第2の細胞集団から基質代謝産物を採取して、第1および第2の細胞集団の各々から基質代謝産物のサンプルを得るステップと、(d)第1および第2の細胞集団の各々からのサンプルに対して多次元NMRを実行して、代謝された基質の共鳴スペクトルを求めるステップとを含み得て、共鳴スペクトルは、基質の代謝産物を表わし、当該方法はさらに、(e)特注の「NMRアレイ」プログラムを用いて共鳴スペクトルを処理するステップと、(f)第1の細胞集団の共鳴強度と第2の細胞集団の共鳴スペクトルとを比較して、どの共鳴スペクトルが発現が異なっているかを判断するステップとを含み得て、発現が異なる共鳴スペクトルは、発現が異なる代謝産物を表わす。
特定された発現が異なる代謝産物は、さまざまな表現型を示し、したがってそれらの発現は、この表現型の診断、例えば転移能の増大の診断、またはインスリン耐性の診断、または疾患の診断などに使用可能である。
さまざまな実施の形態において、少なくとも2つの細胞集団によって発現が異なる基質代謝産物を特定するための方法はさらに、基質代謝産物の生成に関与する生合成経路を特定し、代謝産物の発現差異を調節することに向けられ得る経路のタンパク質/酵素を特定するステップを含み得る。結果として、これらのタンパク質および酵素は、細胞の表現型、例えば疾患表現型、転移能または耐性を調節するための候補標的の役割を果たし得る。したがって、当該新たな方法は、治療標的を特定するための手段を提供する。一旦代謝産物が特定され、所与のサンプルについてNMR代謝産物アレイが作成されると、代謝産物の合成の経路を特定するように生合成経路のデータベースがスクリーニングされ得る。
以下の実施例に記載されているように、本明細書に記載されている方法によって、CMAS、NANS(シアル酸シンターゼとしても知られている)、およびNANA細胞表面発現が、癌細胞の移動を減少させてインビボでの腫瘍の発生を防ぐ治療標的であると確定された。したがって、別の局面において、本開示は、本明細書に記載されている新たな方法を用いて発見された標的の阻害剤を有効量投与することによって被験者の癌などの病気を(例えば転移を抑制することによって、および/または、腫瘍の発生を阻止することによって)治療するための新たな方法を含む。特に、当該方法は、治療有効量のCMASもしくはNANSの阻害剤、または、NANAの発現を低下させる治療有効量の阻害剤もしくは薬剤を、それを必要としている被験者に投与するステップを含む。例えば、リレンザおよびタミフルを含む、既にFDAの承認を得ているインフルエンザ薬である、F−NANAと呼ばれる、我々が設計および合成した分子を含む候補CMAS阻害剤を特定した。インビボマウスモデルでのこれらの薬剤の効能はテスト中であり、リレンザおよびタミフルが人間被験者で安全であることが既に評価されているので、試験中の新たな薬剤についてもFDAが迅速に承認することが予想される。
上記のように、本明細書に記載されている新たな方法は、細胞株および一次組織の両方を用いていくつかの腫瘍学モデルにおいて代謝の相違を特徴付けることが成功裏に示された。当該方法は、新規の治療的介入を設計するための手法に大きく影響する可能性を有しており、「個別化医療」の代謝産物ベースのアプローチの基礎を築き得る。
本発明は、以下の実施例にさらに記載される。以下の実施例は、以下の実施例に記載されている本発明の範囲を限定するものではなく、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定するものではない。
生体サンプルの調製:図1は、プラットフォームを全体的に説明する。各サンプルについて約2000万個の細胞を用いた(しかし、わずか200万個を用いることも可能である)。採取する前に、13Cで標識された前駆体(これらの実施例ではグルコースおよびグルタミン)を媒質に直接添加し、ユーザが規定した時間(この場合4時間)にわたって培養を行った。媒質を吸引して、リン酸緩衝生理食塩水(phosphate-buffered saline:PBS)を用いて2度洗浄した後、細胞を再びカウントして、収集した。標識を持たない同数の細胞も採取して、13Cバックグラウンド対照群の役割を果たすようにした。氷のように冷たいメタノールを添加することによって細胞を溶解し、等量の水およびクロロホルムを添加することによって水抽出を行った。遠心分離後、水溶性の有機代謝産物を別個に収集し、乾燥させて、さらなる分析の準備が整うまで保管した。さらなる精製は行わなかった。
スペクトルの折返し:上記のサンプル調製はサンプル量に対する物理的要求を軽減したが、高分解能二次元NMR分光法を記録するために長い取得時間が必要であることは、依然として問題であった。これに対処するために、複数方向からのアプローチ、すなわち、スペクトル幅を「折返す」こと、ランダム位相サンプリング(RPS)を用いること、分析において不均一サンプリング(NUS)技術およびデータ拡張を実現すること、がとられた。
NMR分析:図4に要約されているように、本明細書に記載されている方法を用いてNMR分析プロセスを自動化するために特注の「NMR代謝産物アレイ」プログラムを作成した。まず、内部制御を用いて、スペクトルを位相化し、整列させ、スケーリングする。1mMの4,4−ジメチル−4−シラペンタン−1−スルホン酸(DSS)を各サンプルに添加し、その濃度を基準として用いて、サンプル間の相対的定量化比較を行った。各サンプルについてピークリストを生成するために自動ピークピッキングプログラムを作成し、ここで、各共鳴ピークは強度値を用いてX、Y座標に変換された。次に、調査中のスペクトルにおける全ての共鳴について「マスター」ルックアップテーブルを生成する「マスターピークリスト」プログラムを作成し、その後実行した。
バックグラウンド補正:所与の前駆体のフラックスをモニタリングするために、標識前駆体を持たない同数の細胞を有する別個のスペクトルを記録した。非標識細胞からのスペクトルは、細胞内の13Cバックグラウンドを表わし、13Cで標識された基質の代謝分解を具体的に辿るためにテストスペクトルから差し引かれ得る。グルコースおよびグルタミンが細胞内の主要なエネルギ源のうちの2つであり、各前駆体の代謝分解が上手く特徴付けられる。特定の経路へのグルコースおよびグルタミンのフラックスを調べるために、標識前駆体を持たない同数の乳房腫瘍始原細胞の13C−1H HSQCスペクトル、および、基質として添加された13C−グルタミンまたは13C−グルコースのいずれかを記録した。図5Aに示されるように、この限られた数の細胞では、13Cバックグラウンドからほとんど信号が発生せず、グルタミン(図5B)およびグルコース(図5C)スペクトルはかなりはっきりしている。NMRアレイを作成することによって、複雑なNMRデータを標準的なテキストファイルに変換することができた。非標識サンプルにおける共鳴の強度値は、グルタミンまたはグルコースアレイにおけるマッチング信号から差し引かれた。図6に示されるように、NMRアレイからの強度値および共鳴代謝産物IDをプロットすることによって、所与のサンプルを通るグルコースまたはグルタミンフラックスに特有の変化を特定することが可能である。X軸は、図6のHSQCスペクトルから特定されたあらゆる代謝産物についての全ての共鳴代謝産物IDを記載している。Y軸は、各条件において各共鳴の強度がいかに変化するかを強調している。予想通り、グルタミンおよびグルコースがさまざまな代謝経路へのフラックスを引起すことが明らかである。共鳴代謝産物IDは、特異な代謝産物を特定するためにヒトメタボロームデータベースにアップロード可能な特定の13C−1H化学シフトに対応する。
プロトコル:同一の正常な乳房組織に由来して、BPLER細胞およびHMLER細胞を同一の遺伝的要因で形質転換したが、異なる培地において増殖させた。BPLERは、非常に腫瘍形成性であり、HMLER細胞の転移能よりも転移能が大きい。マウスの乳腺脂肪体に注射された50個未満のBPLER細胞は腫瘍を発生させるが、インビボで腫瘍を形成するためには10^6個以上のHMLER細胞が必要である(以下の表2)。BPLER細胞は、トリプルネガティブ乳癌腫瘍始原細胞のモデル細胞株であり、BPLER腫瘍は、トリプルネガティブ乳癌患者のものに組織学的に類似している。プロトコルによれば、均一に標識された13C−グルコースが存在する状態で約2000万個のBPLER細胞およびHMLER細胞を培養し、その後、採取して溶解させた。次いで、水層を収集して、乾燥させ、超高純度D2Oに再び溶かして、NMR分析に備えた。さらなる調査のために有機層を保管した。
NANAは、多くの場合細胞表面タンパク質に組込まれる糖である。図10に示されるように、NANAは、主要な酵素であるNANSおよびCMASを含む約15個の異なる酵素によってグルコースから抽出される。細胞生存能力の周知の分析であるCelTiterGloを用いて、NANSまたはCMASのノックダウンが細胞生存能力または細胞の増殖にほとんどまたは全く影響を及ぼさない(図11)一方で、PLK1酵素のノックダウンが全細胞の死を引起すことが観察された。
上記のように、NANAを生成してNANAをタンパク質に接着させるために用いられる主要な酵素であるNANSおよびCMASのノックダウンは、細胞増殖に対しては影響を及ぼさなかったが、BPLER細胞が移動する能力を大きく減少させた(図12に示される)。CMASおよびNANSのmRNAレベルはHMLER細胞およびBPLER細胞において等価であるが、CMASのタンパク質の発現がBPLER腫瘍始原細胞において劇的に過剰発現することを観察した(図13)。CMASの発現が腫瘍始原BPLER細胞の悪性表現型に寄与するか否かを判断するために、非侵攻性のHMLER細胞にプラスミドをトランスフェクトして、CMASを強制的に発現させた。前に記載した細胞移動分析を用いて、図14Aに示されるように、CMASの発現が強化されたHMLER細胞は、対照群と比較して、移動能を数倍に劇的に上昇させた。相互補足実験も行って、安定CMASノックダウンBPLER細胞(BPLER−shCMAS1)を作成した。予想通り、図14Bに示されるように、これらの細胞は同一の移動分析においてコロニーを形成することができなかった。これらの結果は、CMASタンパク質の発現が細胞移動および/または転移において重要であることを示唆している。今まで、癌におけるNANSまたはCMASの役割については言及されてこなかった。これは、一部には、大半の技術がmRNAレベルのみを調査するシークエンシングおよび/またはマイクロアレイ実験に依拠しているためであろう。これは、我々の方法の強みを強調する。代謝産物を精査することによって、NANAが乳房腫瘍始原BPLER細胞において非常に高く発現することが特定された。その後、その生合成経路内の酵素を精査することによって、腫瘍形成性にとって重要であろう新規の有力な標的が発見された。
CMAS/NANAの発現の喪失がインビボでの腫瘍の発生にいかに影響を及ぼすかを判断するために、図15Aに概説されている実験を行った。上記のように、CMASタンパク質を発現しない安定CMASノックダウンBPLER細胞(BPLER−shCMAS1)を作成した。我々の実験では、空ベクトルを過剰に発現させる500,000個のBPLER細胞(対照群)および(CMASを発現させない)500,000個のBPLER−shCMAS1細胞をNOD/SCIDマウスの乳腺脂肪体に注射した。この目的は、各グループ間の腫瘍サイズおよび転移数の相違を分析することであった。45日間にわたって3日ごとに、触知可能な腫瘍についてマウスを調べ、検出されると、腫瘍の高さ、長さおよび幅を直接測定して腫瘍体積を計算した。図15Bに示されるように、45日以内に、対照マウスの4/4が大きな原発腫瘍を発生させた。驚くべきことに、BPLER−shCMAS1マウスはいずれも(0/5)、いかなる触知可能な腫瘍も持たなかった。実際、90日後、BPLER−shCMAS1細胞を注射されたマウスは、腫瘍が無い状態のままであった。総合すると、インビトロおよびインビボデータは、CMASが完全に新規の真正な癌の治療標的であることを示唆している。
CMASなどの酵素は、小分子薬剤阻害のための理想的な候補である。CMASの酵素メカニズムは図16Aであり、CMASは、二価陽イオンに依存した態様でNANAのヒドロキシ基を活性化させ、その結果、CMASは、後に、入ってくるシチジン三リン酸(CTP)分子のアルファ−リン酸塩を攻撃し得て、シチジン一リン酸−NANA(CMP−NANA)中間体を形成する。NANA足場を用いて、ヒドロキシル基をフッ素と置換する基質ベースの類似体を設計および合成した(図16B)。この置換は、理論的には、NANAがCMASを結合させる能力を維持するはずであるが、酵素反応を妨げるはずである。CMAS阻害剤が存在する状態で、前に記載した細胞移動分析を用いて、BPLER細胞がもはや移動できないことが分かった(図16C)。NANA足場を用いて、細胞株に影響を及ぼす基質ベースの阻害剤を高速で設計および合成することができた。
本発明をその詳細な説明と関連付けて説明してきたが、上記の説明は例示的であるように意図されており、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないということが理解される。他の局面、利点および変形例は、以下の特許請求の範囲内である。
Claims (38)
- サンプルにおける所与の種類の細胞内の基質の代謝をモニタリングするための方法であって、
a.基質代謝産物への基質の代謝分解を可能にするのに十分な時間にわたって、前記基質を用いて第1のサンプルの所与の種類の細胞を培養するステップを備え、前記基質の少なくとも一部は、核磁気共鳴(nuclear magnetic resonance:NMR)安定同位体で任意に標識され、前記方法はさらに、
b.ステップ(a)の前記細胞から前記基質代謝産物を採取して、基質代謝産物の第2のサンプルを得るステップと、
c.ステップ(b)の前記第2のサンプルに対して多次元NMRを実行して、代謝された基質の共鳴スペクトルを求めるステップとを備え、前記共鳴スペクトルは、前記基質の代謝産物を表わし、前記多次元NMRは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちのいずれか1つを含む、方法。 - 前記多次元NMRは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちのいずれか2つを任意の組合せで含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多次元NMRは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちのいずれか3つを任意の組合せで含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多次元NMRは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちの4つ全てを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記基質は、安定同位体で標識され、前記多次元NMRは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちのいずれか2つを任意の組合せで含む、請求項1に記載の方法。
- 前記基質は、安定同位体で標識され、前記多次元NMRは、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記基質は、安定同位体で標識され、前記多次元NMRは、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記基質は、安定同位体で標識され、前記多次元NMRは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちの4つ全てを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルに存在する前記基質代謝産物は、前記サンプル内の他の分子からは精製されない、請求項1に記載の方法。
- 細胞集団内の基質濃度は、前記細胞に前記NMRで標識された基質を投入する前に、ある時間にわたって下げられる、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標識基質の前記代謝産物の共鳴は、前記基質に合わせてカスタマイズされたNMRパルスプログラムまたはフィルタリング技術またはそれら両方を用いて求められる、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞集団内の細胞の数は、2×106個未満である、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞集団は、一次細胞集団である、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
- 第1の細胞集団と第2の細胞集団との間で、発現が異なる基質代謝産物を特定するための方法であって、
a.第1および第2の細胞集団に、核磁気共鳴(NMR)安定同位体で標識された基質を任意に投入するステップと、
b.基質代謝産物への前記基質の代謝分解を可能にするのに十分な時間にわたって、ステップ(a)の前記第1および前記第2の細胞集団を培養するステップと、
c.ステップ(b)の前記第1および前記第2の細胞集団から前記基質代謝産物を採取して、前記第1および前記第2の細胞集団の各々から基質代謝産物のサンプルを得るステップと、
d.前記第1および前記第2の細胞集団の各々についてステップ(c)の前記サンプルに対して多次元NMRを実行して、前記第1の細胞集団および前記第2の細胞集団の代謝された基質の共鳴スペクトルを求めるステップとを備え、前記共鳴スペクトルは、前記基質の代謝産物を表わし、前記方法はさらに、
e.前記第1の細胞集団の前記共鳴スペクトルと前記第2の細胞集団の前記共鳴スペクトルとを比較して、どの共鳴が発現が異なっているかを判断するステップを備え、発現が異なる共鳴は、発現が異なる代謝産物を表わす共鳴特性をもたらす、方法。 - 前記多次元NMRは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちのいずれか1つを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記多次元NMRは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちのいずれか2つを任意の組合せで含む、請求項14に記載の方法。
- 前記多次元NMRは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちのいずれか3つを任意の組合せで含む、請求項14に記載の方法。
- 前記多次元NMRは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちの4つ全てを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記基質は、安定同位体で標識され、前記多次元NMRは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちのいずれか2つを任意の組合せで含む、請求項14に記載の方法。
- 前記基質は、安定同位体で標識され、前記多次元NMRは、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記基質は、安定同位体で標識され、前記多次元NMRは、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記基質は、安定同位体で標識され、前記多次元NMRは、スペクトル幅折返し、ランダム位相サンプリング、不均一サンプリング、およびダイナミックレンジデータ再構築の強化のためのデータ拡張の技術のうちの4つ全てを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記サンプルに存在する前記基質代謝産物は、前記サンプル内の他の分子からは精製されない、請求項14に記載の方法。
- 各細胞集団内の基質濃度は、前記細胞に前記NMR安定同位体で標識された基質を投入する前に、ある時間にわたって下げられる、請求項14から23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標識基質の前記代謝産物の共鳴は、特注のNMR断熱パルスプログラム、特注の取得技術、ならびに特注のNMR分析およびフィルタリングプログラムのうちのいずれか1つ以上を用いて求められる、請求項14から23のいずれか1項に記載の方法。
- 各細胞集団内の細胞の数は、2×106個未満である、請求項14から23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の細胞集団および第2の細胞集団は、一次細胞集団である、請求項14から23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の細胞集団および第2の細胞集団の各々における細胞集団は、異種の細胞集団または同種の細胞集団である、請求項14から23のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(e)の前記共鳴特性と既知の共鳴特性のデータベースとを比較して、前記共鳴特性が表わす分子構造を求め、それによって、前記第1の細胞集団と前記第2の細胞集団との間で発現が異なる前記基質代謝産物を求めるステップをさらに備える、請求項14から23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記基質代謝産物の生成に関与する生合成経路を特定し、前記代謝産物の発現差異を調節することによって前記細胞の表現型を調節することに向けられ得る前記経路のタンパク質/酵素を特定するステップをさらに備える、請求項14から23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の細胞集団および前記第2の細胞集団は、同系の集団である、請求項14から23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の細胞集団および前記第2の細胞集団は、異なる表現型を有する、請求項14から23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の細胞集団は、対照細胞集団であり、前記第2の細胞集団は、テスト化合物または薬剤と接触させられた、請求項14から23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法は、特定の細胞種類において過剰活性または過少活性の代謝経路を特定するために用いられる、請求項14から23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法は、前記第2の細胞集団内の遺伝子を抑制または過剰発現させるステップをさらに備え、前記方法は、細胞内の遺伝子の過剰発現または抑制の代謝結果を特定するために用いられる、請求項14から23のいずれか1項に記載の方法。
- 被験者の癌を治療するための方法であって、N−アシルノイラミン酸シチジリルトランスフェラーゼ(CMAS)の阻害剤、またはN−アセチルノイラミン酸シンターゼ(NANS)の阻害剤、またはN−アセチルノイラミン酸の発現を減少させる分子を、それを必要とする被験者に投与するステップを備える、方法。
- 前記阻害剤は、小分子、リボ核酸、デオキシリボ核酸、タンパク質、ペプチド、および抗体からなる群から選択される、請求項36に記載の方法。
- 前記阻害剤は、酵素である、請求項36に記載の方法。
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Yadav et al. | Special issue on chemical exchange saturation transfer MRI. |
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