JP2020533573A - 誘導ラマン代謝イメージングによる抗生物質感受性の判定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年9月8日に提出され、その開示が本出願の開示の一部とみなされ、全体が参照により本明細書に組み込まれる、「METHOD FOR THE DETERMINATION OF ANTIBIOTIC SUSCEPTIBILITY THROUGH STIMULATED RAMAN METABOLIC IMAGING」と題する、米国仮出願第62/556,013の優先権を主張する。
本開示の方法に基づくSRSイメージングは、抗生物質に対する細菌の感受性を、約10分以内に判定することができる。SRSイメージングによる試験およびアガロースゲルパッドへの配置用の細菌溶液は、ブロス、例えば溶原性ブロス(LB)(LBブロス、Sigma Aldrich)中で約2時間培養して、対数期に到達させることで調製できる。次いで、細菌は、2mLの様々なタイプの培地に対して、約0.1:100から約10:100の比率で添加され得る。例示的な一実施形態では、比率は、2MLの特殊培地などの培地に対して、約1:100であり得る。いくつかの例示的な実施形態は、D2O培地、または本明細書でM9培地と呼ばれ、約2%のグルコース−d7が唯一の炭素源であり得る、他の特殊培地を使用することができる。M9培地は、C−D振動領域内の信号を最大化するように開発および選択される。所定の細菌の抗生物質への耐性を測定するために、抗生物質を約20 μg/mLの濃度で特殊培地に添加する。少なくとも約30分の培養後、約500μLのサンプルを遠心分離し、精製水で2回洗浄し、イメージングのためにアガロースゲルパッド上に配置する。図1Aに示すイメージング設定を使用して、サンプルを処理できる。
追加の試験を実施して、代謝イメージングに基づくAST法が、他の抗生物質に対して機能するかどうかを判定した。VSE E.フェカーリス(E.faecalis)31970を、5つの異なる抗生物質、バンコマイシン、リネゾリド、ダプトマイシン、ゲンタマイシンおよびエリスロマイシンと共に、グルコース−d7含有M9培地で培養した。これらの抗生物質は、細菌感染治療のために診療所で一般的に処方されており、異なる作用機序を有する。図10A〜図10Fは、グルコース−d7含有培地で1時間培養した後のVSEにおける、抗生物質を添加しない場合(対照)、および各抗生物質を最終濃度の20μg/mL添加した場合のSRSイメージングを示す。バンコマイシンおよびリネゾリドで処理した細菌でのみ、C−D信号の著しい減少が確認された。したがって、E.フェカーリス(E.faecalis)31970は、バンコマイシンおよびリネゾリドには感受性があるが、ダプトマイシン、ゲンタマイシンおよびエリスロマイシンには耐性がある、と我々の代謝イメージング法に基づいて結論付けられる。VSEに対するこれらの抗生物質のMICを、従来の培養ベースの方法により決定し、これを以下の表1に示して確認した。これら5つの抗生物質に対するVSEの感受性は、我々の代謝イメージング法によって判定された結果と一致する。
Claims (20)
- 細菌の抗生物質感受性の判定方法であって、
細菌固定化ゲルを調製することと、
栄養源を有する培地で前記細菌を培養することと、
予め選択した抗生物質を前記培地に添加して、サンプルを形成することと、
前記抗生物質および細菌を、予め選択した期間、前記培地内で培養することと、
前記サンプルを遠心分離することと、
前記サンプルを洗浄することと、
前記サンプルを前記細胞固定化ゲル上に堆積させることと、
コヒーレントラマン顕微鏡法により、前記細菌固定化ゲル上の前記サンプルの画像を収集することと
を含む方法。 - 前記サンプルの画像が、ハイパースペクトルコヒーレントラマン顕微鏡法により収集される、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルの画像が、単一周波数コヒーレントラマン顕微鏡法により収集される、請求項1に記載の方法。
- 前記固定化ゲルが、アガロースゲルを含む、請求項1記載の方法。
- 前記栄養源が、0.1〜10%のグルコース−d7のみから構成される炭素源を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記栄養源が、0〜100%の二酸化重水素を有する培地から構成される、請求項1に記載の方法。
- 前記炭素源が、グルコース−d7および二酸化重水素の両方の組み合わせで構成される、請求項1に記載の方法。
- 前記ラマンイメージングが、誘導ラマン散乱イメージング、コヒーレント反ストークスラマン散乱イメージング、またはコヒーレントラマン誘導カー効果イメージングであり得る、請求項1に記載の方法。
- 抗生物質感受性試験用の画像を収集するためのハイパースペクトル誘導ラマン散乱イメージング装置であって、
80MHzの繰り返し率を有する二重出力フェムト秒パルスレーザーであって、
ポンプビームと、
ストークスビームと、
音響光学変調器によって変調される前記ストークスビームの経路と、
前記ポンプビームおよび前記ストークスビーム間の遅延を調整する並進ステージを有する前記ポンプビームの経路と、
コンバイナーであって、前記ポンプビームと前記ストークスビームとを結合するように構成されたコンバイナーと、
レーザー走査顕微鏡であって、サンプル上に前記ポンプビームおよび前記ストークスビームを集束させるよう構成された対物レンズを有するレーザー走査顕微鏡と、オイルコンデンサーであって、前記サンプルから前記レーザーを収集するよう構成されたオイルコンデンサーとを含む二重出力フェムト秒パルス層と、
フィルターであって、前記コンデンサーの後に配置され、前記ストークスビームを除去するように構成されたフィルターと、
フォトダイオードであって、前記フィルターの後に配置され、前記ポンプビームを検出するフォトダイオードと、
ロックインアンプであって、前記ポンプビーム信号損失を抽出するように構成されたロックインアンプと
を含むイメージング装置。 - チャープ装置をさらに含み、前記チャープ装置が、前記ストークビームおよび前記ポンプビーム間で異なるパルス持続時間を形成するように構成される、請求項9に記載のイメージング装置。
- 前記チャープ装置が、長さ15cmの、2つのSF57ガラスロッドである、請求項10に記載のイメージング装置。
- 一対のフィルターが使用される、請求項9に記載のイメージング装置。
- 前記レーザー走査顕微鏡対物レンズが、60倍水対物レンズである、請求項9に記載のイメージング装置。
- 前記ポンプビームの前記パルス持続時間が、1.5〜2psの間であり、前記ストークスビームの前記パルス持続時間が、1.0〜1.4psの間である、請求項9に記載のイメージング装置。
- 前記チャープ装置が、前記ポンプビームに対して1.9ps、前記ストークスビームに対して1.3psのパルス持続時間を形成するように構成される、請求項9に記載のイメージング装置。
- 前記ポンプビームが、120fs波長可変レーザーであり、ポンプビーム経路を有し、前記ストークスビームが、1040nmを中心波長とする220fsレーザーであり、ストークスビーム経路を有する、請求項9に記載のイメージング装置。
- 顕微鏡法を使用した、細菌の抗生物質感受性の迅速な判定方法であって、
栄養源を有する培地で前記細菌を培養することと、
予め選択した濃度を有する、予め選択した抗生物質を前記培地に添加して、サンプルを形成すること、
前記サンプルを予め選択した期間、前記培地内で培養することと、
前記サンプルを遠心分離することと、
前記サンプルを洗浄することと、
前記サンプルを前記細菌固定化ゲル上に堆積させることと、
コヒーレントラマン顕微鏡法を使用して、前記細菌固定化ゲル上の前記サンプルをイメージングすることと
を含む方法。 - 前記コヒーレントラマン顕微鏡法が、誘導ラマン散乱システムを含む、請求項17に記載の方法。
- 前記誘導ラマン散乱システムが、ポンプビームおよびストークスビームを使用し、両方のビームが1つ以上のガラスロッドでチャープされ、それにより前記ポンプビームおよびストークスビームの両方について1〜2psのパルス持続時間を創出する、請求項18に記載の方法。
- 前記顕微鏡法システムが、前記ポンプビームおよび前記ストークスビーム間の遅延を調整する並進ステージをさらに含む、請求項19に記載の方法。
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