CN105542756A - 一种检测甲醛的荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测甲醛的荧光探针及其制备方法与应用。本发明提供的用于检测甲醛的荧光探针的结构如式I所示。本发明同时提供了式I所示化合物的制备方法。本发明提供的用于检测甲醛的试剂盒，包括式I所示化合物和溶剂。本发明提供的萘酰亚胺类染料的“关-开”型甲醛探针及其专用检测试剂盒对甲醛溶液具有良好的响应，能够实现对细胞内甲醛的检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点。

Description

一种检测甲醛的荧光探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物与环境检测技术领域，具体涉及一种作为甲醛荧光探针材料使用的萘酰亚胺-肼衍生物及其制备方法与应用。
背景技术
甲醛(HCHO)是一种重要的化工原料和有机溶剂，被广泛的用于防腐和消毒，并常用于树脂、塑料、橡胶、染料等制造业。甲醛(HCHO)具有刺激性臭味，能强烈刺激呼吸道和消化道，毒性较大。此外，长期吸入甲醛将引发鼻癌、消化道癌、肺癌、脑癌、白血病和老年痴呆症等疾病(参见R.G.Liteplo，R.Beauchamp,M.E.Meek,R.Chenier,Formaldehyde(ConciseInternationalChemicalAssessmentDocuments)，WorldHealthOrganization:Geneva,2002)。因此，有效地检测或监控生物样品或环境样品中的甲醛一直是相关领域的研究热点。
荧光检测法由于其优秀的检测灵敏度和选择性，并能实现对生物样品的实时、在线检测而受到研究者的广泛关注。萘酰亚胺类荧光分子因其具有良好的光稳定性、高摩尔消光系数和量子产率等独特优点而成为该方法最重要的荧光母体之一，在多种待测分子的荧光检测中得到了广泛的应用。
目前仅有2篇文献报道了可用于甲醛检测的小分子荧光探针，他们均是基于氮杂Cope重排反应而设计的(参见A.Roth,H.Li,C.Anorma,andJ.Chan,AReaction-BasedFluorescentProbeforImagingofFormaldehydeinLivingCells,J.Am.Chem.Soc.,2015,137,10890-10893以及T.F.BrewerandC.J.Chang,AnAza-CopeReactivity-BasedFluorescentProbeforImagingFormaldehydeinLivingCells,J.Am.Chem.Soc.,2015,137,10886-10889)。当存在甲醛的条件下，探针分子中的活性基团与甲醛发生氮杂Cope重排反应，导致探针分子的荧光性质发生变化，从而实现对甲醛的特异性设别。
然而，这两种报道的甲醛探针存在分子结构复杂，合成步骤冗长，所用试剂昂贵，反应速度缓慢等缺点，不利于其在复杂的生物体内或是环境中进行检测。因此亟须一种新颖的、具有良好生物稳定性的、结构复杂、合成简单的且能实现快速响应检测的甲醛荧光探针。
发明内容
为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明旨在提供一种来自萘酰亚胺和肼的用于检测甲醛的荧光探针及其制备方法和应用。
本发明的核心在于利用4-肼基-1,8-萘酰亚胺构筑经典的ICT体系。当存在甲醛的条件下，肼基与甲醛发生缩合反应生成腙，进而使得原有PET效应消失而产生荧光，通过上述方案，获得荧光“关-开”型的荧光响应，大大提高了检测的灵敏度。
首先，为了达到上述目的，本发明提供了一种如式(I)所示的萘酰亚胺-对叠氮苄醇衍生物。
式(I)中，n为0～5的整数，R为甲基，或乙基，或丙基，或正丁基。
式(I)所示化合物具体可为式(II)所示化合物(Nap-AD)。
如图1所示，上述探针的制备方法包括下列步骤：
(1)式(III)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐与氨基化合物在醇中反应得到式(IV)所示取代的4-溴-1，8-萘酰亚胺。
式(IV)中，n为0～5的整数，R为甲基，或乙基，或丙基，或正丁基。
(2)在惰性气氛下，在水合肼的存在下，式(IV)所示化合物在有机溶剂中反应即得式(I)所示化合物。
上述制备方法，步骤(1)中所述氨基化合物具体可为3，6，9-三氧杂-1-氨基癸烷。
式(III)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐和所述氨基化合物的摩尔比可为1～5:1，具体可为1.5：1。
所述醇可为甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇，正丁醇，乙二醇单甲醚，具体可为乙醇。
所述反应温度可为50～120度，具体可为80度；反应时间可为1～20小时，具体可为5小时。
上述制备方法，步骤(2)中所述式(IV)所示4-溴-1，8-萘酰亚胺与水合肼的摩尔比可为1～0.1:1，具体可为0.5：1。
所述反应温度可为0～100度，具体可为80度；反应时间可为1～20小时，具体可为10小时。
所述反应溶剂在有机溶剂中进行；有机溶剂可为乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮中至少一种，具体可为乙腈。
本发明进一步提供了一种检测甲醛的试剂盒，包括式(I)所示化合物和溶剂。
式(I)所示化合物的浓度为0.001mM～100mM，具体可为1mM。
所述溶剂为水、乙醇、二甲基亚砜中任一种。
式(I)所示化合物或上述试剂盒可应用于水溶液中甲醛的检测。
所述水溶液中甲醛的含量具体可通过以下步骤进行检测：
(1)向不同浓度甲醛的缓冲盐中加入相同浓度的式(I)所示化合物，配置至少3种不同甲醛含量的含有式(I)所示化合物的标准溶液。
所示缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、HEPES缓冲溶液、硼酸-硼酸钠缓冲溶液中的任何一种，具体可以是磷酸盐缓冲溶液；
所示标准溶液的pH值为5～11，具体可以是7.2；
所示标准溶液中式(I)所示化合物的浓度为1nM～1μM；
所示标准溶液中甲醛的含量为0.1nM～1mM；
(2)分别测定所述标准溶液的荧光发射光谱，激发波长为450nm，以甲醛浓度为横坐标，以I535为纵坐标，建立标准曲线。
I535表示所述标准溶液在波长为535nm处的荧光发射峰强度值；
(3)向待测样品中加入式(I)所示化合物，控制其浓度与所述标准溶液中式(I)所示化合物的浓度相等；测定其在激发波长为450nm的激发光下的荧光发射谱，即可根据标准曲线计算得出待测样品的甲醛含量。
上述步骤(2)或步骤(3)中荧光强度可在荧光仪上进行检测。
本发明具有如下特点：
1)本发明提供的荧光探针是黄色固体，分子结构的中聚醚链保证了探针的水溶性和光学稳定性。
2)本发明提供的荧光探针，其溶液对甲醛的浓度敏感，随着甲醛浓度的增加，紫外灯下可观察到其水溶液的荧光由无变为黄色。
3)本发明提供的荧光探针，其发射波长为535nm，为荧光“关-开”型响应，能大大消除检测时检测条件差异对结果的影响，提高检测的灵敏度。
4)本发明提供的荧光探针对甲醛浓度呈线性关系，可以用于甲醛的精确测量。
本发明提供的萘酰亚胺类染料的“关-开型”甲醛探针及其试剂盒对甲醛溶液具有良好的响应，能够实现对细胞内甲醛的检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点。
附图说明
图1为实施例1制备的荧光探针Nap-AD的合成路线。
图2为实施例6制备的Nap-AD试剂盒对不同甲醛水溶液的荧光响应图。
图3为实施例6制备的Nap-AD试剂盒在波长535nm下的荧光发射强度I535与甲醛浓度关系曲线。
图4为实施例6制备的Nap-AD试剂盒对常见共存离子或生物小分子的荧光响应图。
图5为实施例6制备的Nap-AD试剂盒对细胞内甲醛的荧光成像图；其中，(a)为未加Nap-AD之前的细胞荧光成像图；(b)为加入Nap-AD后的细胞荧光成像图；(c)为加入Nap-AD和甲醛后细胞荧光成像图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、荧光探针Nap-AD的制备
步骤a)：在惰性气氛下，将5.00g4-溴-1,8-萘二甲酸酐加入到100mL无水乙醇中，再注入2.95g3，6，9-三氧杂-1-氨基癸烷，回流反应5小时。反应完全后，放置过夜有针状结晶析出，过滤，冷乙醇洗涤三次，得到中间体N-3，6，9-三氧杂癸烷基-4-溴-1,8-萘酰亚胺6.10g(产率为80％)。
步骤b)：在惰性气氛下，将5.00gN-3，6，9-三氧杂癸烷基-4-溴-1,8-萘酰亚胺和3.79g水合肼，加入到100mL丙酮中回流反应12小时。待反应完全后，旋干反应液，经柱层析分离纯化得到最后产物Nap-AD4.10g(产率为93％)，黄色固体。
1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.07(t,J＝8.3Hz,2H),7.74(d,J＝8.3Hz,1H),7.29–7.11(m,2H),6.93(d,J＝8.5Hz,1H),4.34(t,J＝5.4Hz,2H),3.93(t,J＝5.4Hz,2H),3.78(t,J＝4.5Hz,2H),3.66(t,J＝4.5Hz,2H),3.54(t,J＝4.7Hz,2H),3.39(t,J＝4.7Hz,2H),3.30(q,J＝7.0Hz,2H),1.02(t,J＝7.0Hz,3H).
实施例2、荧光探针Nap-AD的制备
步骤a)：在惰性气氛下，将5.00g4-溴-1,8-萘二甲酸酐加入到100mL无水甲醇中，再注入1.96g3，6，9-三氧杂-1-氨基癸烷，回流反应10小时。反应完全后，放置过夜有针状结晶析出，过滤，冷乙醇洗涤三次，得到中间体N-3，6，9-三氧杂癸烷基-4-溴-1,8-萘酰亚胺4.90g(产率为96％)。
步骤b)：在惰性气氛下，将5.00gN-3，6，9-三氧杂癸烷基-4-溴-1,8-萘酰亚胺和1.52g水合肼，加入到100mL乙腈中回流反应20小时。待反应完全后，旋干反应液，经柱层析分离纯化得到最后产物Nap-AD4.10g(产率为93％)，黄色固体。
1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.07(t,J＝8.3Hz,2H),7.74(d,J＝8.3Hz,1H),7.29–7.11(m,2H),6.93(d,J＝8.5Hz,1H),4.34(t,J＝5.4Hz,2H),3.93(t,J＝5.4Hz,2H),3.78(t,J＝4.5Hz,2H),3.66(t,J＝4.5Hz,2H),3.54(t,J＝4.7Hz,2H),3.39(t,J＝4.7Hz,2H),3.30(q,J＝7.0Hz,2H),1.02(t,J＝7.0Hz,3H).
实施例3、荧光探针Nap-AD的制备
步骤a)：在惰性气氛下，将5.00g4-溴-1,8-萘二甲酸酐加入到100mL无水乙二醇单甲醚中，再注入1.47g3，6，9-三氧杂-1-氨基癸烷，回流反应6小时。反应完全后，放置过夜有针状结晶析出，过滤，冷乙醇洗涤三次，得到中间体N-3，6，9-三氧杂癸烷基-4-溴-1,8-萘酰亚胺3.60g(产率为95％)。
步骤b)：在惰性气氛下，将5.00gN-3，6，9-三氧杂癸烷基-4-溴-1,8-萘酰亚胺和0.76g水合肼，加入到100mLDMF中回流反应1小时。待反应完全后，旋干反应液，经柱层析分离纯化得到最后产物Nap-AD4.30g(产率为97％)，黄色固体。
1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.07(t,J＝8.3Hz,2H),7.74(d,J＝8.3Hz,1H),7.29–7.11(m,2H),6.93(d,J＝8.5Hz,1H),4.34(t,J＝5.4Hz,2H),3.93(t,J＝5.4Hz,2H),3.78(t,J＝4.5Hz,2H),3.66(t,J＝4.5Hz,2H),3.54(t,J＝4.7Hz,2H),3.39(t,J＝4.7Hz,2H),3.30(q,J＝7.0Hz,2H),1.02(t,J＝7.0Hz,3H).
实施例4、荧光探针Nap-AD的制备
步骤a)：在惰性气氛下，将5.00g4-溴-1,8-萘二甲酸酐加入到100mL无水丙醇中，再注入0.98g3，6，9-三氧杂-1-氨基癸烷，回流反应15小时。反应完全后，放置过夜有针状结晶析出，过滤，冷乙醇洗涤三次，得到中间体N-3，6，9-三氧杂癸烷基-4-溴-1,8-萘酰亚胺2.40g(产率为95％)。
步骤b)：在惰性气氛下，将5.00gN-3，6，9-三氧杂癸烷基-4-溴-1,8-萘酰亚胺和0.51g水合肼，加入到100mLDMSO中回流反应5小时。待反应完全后，旋干反应液，经柱层析分离纯化得到最后产物Nap-AD4.00g(产率为91％)，黄色固体。
1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.07(t,J＝8.3Hz,2H),7.74(d,J＝8.3Hz,1H),7.29–7.11(m,2H),6.93(d,J＝8.5Hz,1H),4.34(t,J＝5.4Hz,2H),3.93(t,J＝5.4Hz,2H),3.78(t,J＝4.5Hz,2H),3.66(t,J＝4.5Hz,2H),3.54(t,J＝4.7Hz,2H),3.39(t,J＝4.7Hz,2H),3.30(q,J＝7.0Hz,2H),1.02(t,J＝7.0Hz,3H).
实施例5、荧光探针Nap-Ad的制备
步骤a)：在惰性气氛下，将5.00g4-溴-1,8-萘二甲酸酐加入到100mL无水正丁醇中，再注入0.59g3，6，9-三氧杂-1-氨基癸烷，回流反应13小时。反应完全后，放置过夜有针状结晶析出，过滤，冷乙醇洗涤三次，得到中间体N-3，6，9-三氧杂癸烷基-4-溴-1,8-萘酰亚胺1.40g(产率为94％)。
步骤b)：在惰性气氛下，将5.00gN-3，6，9-三氧杂癸烷基-4-溴-1,8-萘酰亚胺和0.38g水合肼，加入到100mL丙酮中回流反应17小时。待反应完全后，旋干反应液，经柱层析分离纯化得到最后产物Nap-AD3.90g(产率为88％)，黄色固体。
1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.07(t,J＝8.3Hz,2H),7.74(d,J＝8.3Hz,1H),7.29–7.11(m,2H),6.93(d,J＝8.5Hz,1H),4.34(t,J＝5.4Hz,2H),3.93(t,J＝5.4Hz,2H),3.78(t,J＝4.5Hz,2H),3.66(t,J＝4.5Hz,2H),3.54(t,J＝4.7Hz,2H),3.39(t,J＝4.7Hz,2H),3.30(q,J＝7.0Hz,2H),1.02(t,J＝7.0Hz,3H).
实施例6、式(I)所示化合物的光谱性质
称取3.7mgNap-AD，溶于10mLDMSO，配成母液(1mM),即得到Nap-AD试剂盒。将100μL的此母液滴加到不同浓度甲醛的磷酸盐缓冲液中，并用相应的磷酸盐缓冲液定容到10mL。测量其荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时以450nm进行激发，发射峰的强度为I535；激发和发射的狭缝宽度分别为1.5/3。
图2为Nap-AD试剂盒对不同甲醛水溶液的荧光响应图。由图2可知，随着甲醛浓度的增加，波长为535nm处的发射峰的荧光强度逐渐增大，证明本发明试剂盒对甲醛具有灵敏的响应。
图3为Nap-AD试剂盒在波长535nm下的荧光发射强度I535与甲醛浓度关系曲线。由图3可知，随着水溶液中甲醛浓度的增加，荧光发射值I535逐渐增大。在甲醛浓度为0～1mM的范围内，发射峰的荧光强度值I535与水溶液中甲醛的浓度呈良好的线性关系(R2＝0.99)。证明本发明试剂盒可以对甲醛进行准确测量。
图4为Nap-AD试剂盒对常见共存离子或生物小分子的荧光响应图。由图4可知，常见共存阳离子、阴离子、生物小分子的加入并不能使溶液的荧光发射值I535发生改变。证明本发明试剂盒对甲醛具有优秀的选择性。
实施例7、细胞内甲醛含量的测定
1)在37度和5％(v/v)CO2条件下，用含有10％(v/v)FBS(胎牛血清)、100U/mL盘尼西林、100μg/mL的链霉素的DMEM培养基培养HeLa细胞。细胞使用前用PBS缓冲液清洗。
2)在HeLa细胞中加入PBS(pH7.4)，再加入Nap-AD(1μM)孵育30min，用PBS洗三遍后，进行共聚焦荧光成像，其中激发波长为450nm，收集波段为450-600nm。然后，向上述HeLa细胞中再加入甲醛(10μM)的磷酸缓冲盐溶液，继续孵育30min后，在激光共聚焦显微镜上进行成像，其中激发波长为450nm，收集波段为450-600nm。
由图5可知，载有Nap-AD的细胞在未加甲醛之前无荧光，表明Nap-AD可以很好地透过细胞膜。而当加入甲醛以后，细胞呈现黄色荧光发射，表明Nap-AD可以在细胞内与甲醛发生特异性响应。证明本发明试剂盒可以在细胞中对甲醛进行检测。
最后应说明的是，上述实施例仅举出以Nap-AD化合物为荧光试剂，其余荧光试剂由于结构与性质相近，其浓度、实验激发波段选择不一一列出，然而其并非用于限定本发明。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，应当可以作出各种修改和变更。

Claims (7)

1.一种检测甲醛的荧光探针，其特征在于：该荧光探针的化学式为式(I)，
式(I)中，n为0～5的整数，R为甲基，或乙基，或丙基，或正丁基。
2.根据权利要求1所述的一种检测甲醛的荧光探针，其特征在于：其结构式如式(II)，
。
3.权利要求1或2所述的一种检测甲醛的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)式(III)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐与氨基化合物在醇中反应得到式(IV)所示取代的4-溴-1，8-萘酰亚胺；
式(IV)中，n为0～5的整数，R为甲基，或乙基，或丙基，或正丁基；
步骤(2)在惰性气氛下，在水合肼的存在下，式(IV)所示化合物在有机溶剂中反应即得式(I)所示化合物。
4.根据权利要求3所述的一种检测甲醛的荧光探针的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述式(III)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐和所述氨基化合物的摩尔比可为1～5:1；
所述醇为甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇，正丁醇或乙二醇单甲醚；
所述反应温度可为50～120度；反应时间为1～20小时。
5.根据权利要求3所述的一种检测甲醛的荧光探针的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述碱与式(IV)所示4-溴-1，8-萘酰亚胺与水合肼的摩尔比可为1～0.1:1；
所述反应温度可为0～100度；反应时间可为1～20小时；
所述反应溶剂在有机溶剂中进行；
所述有机溶剂可为乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮中至少一种。
6.一种检测甲醛的试剂盒，包括式(I)所示化合物和溶剂；
式(I)所示化合物的浓度为0.001mM～100mM；
所述溶剂为水、乙醇、二甲基亚砜中任一种。
7.一种甲醛含量的检测方法，包括如下步骤：
(1)向不同浓度甲醛的缓冲盐中加入相同浓度的式(I)所示化合物，配置至少3种不同甲醛含量的含有式(I)所示化合物的标准溶液；
所示缓冲溶液可以是磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、HEPES缓冲溶液、硼酸-硼酸钠缓冲溶液中的任何一种；
所示标准溶液的pH值为5～11；
所示标准溶液中式(I)所示化合物的浓度为1nM～1μM；
所示标准溶液中甲醛的含量为0.1nM～1mM；
(2)分别测定所述标准溶液的荧光发射光谱，激发波长为450nm，以甲醛浓度为横坐标，以I535为纵坐标，建立标准曲线；
I535表示所述标准溶液在波长为535nm处的荧光发射峰强度值；
(3)向待测样品中加入式(I)所示化合物，控制其浓度与所述标准溶液中式(I)所示化合物的浓度相等；测定其在激发波长为450nm的激发光下的荧光发射谱，即可根据标准曲线计算得出待测样品的甲醛含量。
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