CN111073636A

CN111073636A - 一种用于甲醛检测的荧光探针及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN111073636A
Application number: CN201911315921.6A
Authority: CN
Inventors: 沈健; 袁雯雯; 江玉亮; 王炳祥
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2020-04-28
Anticipated expiration: 2039-12-19
Also published as: CN111073636B

Abstract

本发明公开了一种用于甲醛检测的荧光探针及其制备方法与应用，该新型荧光探针简称为HDBC，其结构式如下式Ⅰ所示。本发明提供的新型荧光探针HDBC对甲醛具有良好的响应，可以用于环境及生物体内微量甲醛的快速检测。本发明的探针的合成过程简单、收率高、所用试剂价廉易得；所制备探针对甲醛响应灵敏，克服了现有甲醛荧光探针合成过程复杂、步骤繁琐、所用试剂昂贵响应不灵敏等缺点。因此本发明制备的甲醛探针HDBC具备应用前景。

Description

一种用于甲醛检测的荧光探针及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于环境监测技术领域，涉及一种用于甲醛检测的荧光探针及其制备方法与应用。本发明探针可以通过肉眼观察溶液颜色的变化，从而判断溶液中是否有甲醛。此外可以通过观察荧光广谱的变化判断甲醛的大概含量，从而达到定量检测的目的。

背景技术

甲醛(HCHO)是一种无色有刺激性的气体，对人眼、鼻等有刺激作用。长期吸入甲醛将引发鼻癌、消化道癌、肺癌、脑癌等疾病。此外甲醛作为人体内源物质，可以通过氨基脲敏感胺氧化酶等生物酶催化产生。研究发现，甲醛对人的认知能力和记忆能力会产生影响。因此，有效地检测、监控环境或生物中的甲醛一直是相关领域研究的热点。

目前，检测甲醛的方法有很多，比如分光光度法、电化学检测法、气相色谱法、液相色谱法等，虽然用这些方法来检测甲醛准确度高，但是受到所用设备昂贵、样品前处理繁琐、耗时耗力等条件的限制，不适用于甲醛的实时检测。因此，设计开发一种简单、快捷、能够实时检测甲醛的方法显得尤为重要。近年来，因荧光探针的敏感度高、选择性好、合成简单等特点逐渐受到科学界的关注，它通过与特定目标反应产生变化，判断甲醛的存在甚至是大概含量，从而达到检测的目的。

目前报道的甲醛荧光探针大多存在结构复杂，合成步骤多，所用试剂昂贵等缺点，不利于其在复杂的生物体内或是环境中进行检测。所以，发明一种新颖的、具有良好生物稳定性的、合成简单且能实现快速响应的用于甲醛检测的荧光探针具有重要的现实意义。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于甲醛检测的荧光探针，简称为探针HDBC。本发明所涉及的甲醛探针是一种基于萘酰亚胺衍生物与水合肼反应后的产物；该探针对环境中微量甲醛具有极好的识别性能，具有结构简单，合成步骤少，易于推广和应用等优点，克服了现有的甲醛荧光探针结构复杂，合成步骤多，制备过程中所用试剂昂贵等缺点。

本发明还提供了用于检测甲醛的荧光探针的制备方法和应用。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明所述一种用于甲醛检测的荧光探针HDBC，其结构式为式(Ⅰ)：

本发明所述的用于甲醛检测的荧光探针HDBC的制备方法，包括以下步骤：

(1)在氮气氛围下，将2-溴-1,8-萘酐加入到无水乙醇中，再加入4-氨基丁酸,回流；反应结束后，冷却到室温后有晶体析出，过滤，洗涤，得到灰白色的中间体化合物1；

(2)在氮气氛围下，将中间体化合物1和水合肼按照一定比例加入到乙醇中回流；待反应后旋干反应液，分离纯化得到最后产物。

其中，上述的甲醛荧光探针的制备路线如下所示：

本发明所述用于甲醛检测的荧光探针在环境及生物体中的甲醛检测应用。

其中，所述应用包括如下步骤：

(1)将探针HDBC溶于DMSO，制成探针母液；将探针母液稀释制成待测液，将不同浓度的甲醛加到待测液中，观察待测液在加入不同浓度甲醛后荧光光谱的变化，其中荧光激发波长为417nm；

(2)用肉眼观察待测液在加入甲醛前后颜色的变化。

进一步地，所述步骤(1)具体为：将探针HDBC溶于DMSO，制成浓度为 1mM的探针母液；将探针母液稀释到10μM制成待测液,然后将甲醛加入到待测液中；用分子荧光光谱仪测试待测液在加入不同浓度甲醛后荧光光谱的变化，如果在519nm处观察待测液的荧光强度增强，则说明待测液可以对甲醛产生响应；其中，荧光光谱激发波长为417nm。

进一步地，所述步骤(2)具体为：用肉眼观察待测液在加入甲醛前后颜色的变化，如果待测液在加入甲醛后溶液由红色变为黄色，则说明含有待测液与甲醛响应；或者，在365nm光源照射下，待测液的荧光增强，则说明待测液与甲醛响应。

其中，所述用于甲醛检测的荧光探针HDBC对甲醛的响应时间为8-10秒。

其中，所述用于甲醛检测的荧光探针HDBC检测甲醛时能抗苯甲醛、乙二醛、对羟基苯甲醛、对氯苯甲醛、2,4-二羟基苯甲醛、对羟基苯乙酮、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Mg²⁺的干扰。

本发明所述的检测甲醛的荧光探针HDBC在定量检测水环境中的甲醛和生物样品的甲醛中的应用。

本发明的核心是利用4-肼基-萘酰亚胺构筑经典的PET体系。当存在甲醛的时，肼基与甲醛发生缩合反应生成腙，进而使得原来效应消失从而荧光增强(反应机理如(Ⅱ)所示)，通过上述方案，获得荧光探针。本发明提供的用于甲醛检测的荧光探针，能快速检测甲醛的存在，对甲醛的响应时间为8-10s。响应时间为：本发明的甲醛荧光探针作用于含甲醛的水溶液，采用荧光光谱仪观察荧光光谱峰值达到最大所需时间。本发明的探针可以通过肉眼观察溶液颜色的变化，从而判断溶液中是否有甲醛；可以通过观察荧光广谱的变化判断甲醛的含量，从而达到检测甲醛的目的。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明制备的用于检测甲醛的荧光探针HDBC合成简单，原料来源广，所用试剂便宜易得；探针具有检测速度快，无干扰，选择识别性好等优点。因此，此探针具有良好的经济效益，可以规模化制备及应用。

(2)本发明用于甲醛检测的荧光探针HDBC是砖红色粉末，分子结构决定了探针良好的水溶性和光学稳定性；同时此探针在一定范围内对甲醛浓度呈线性关系，可以用于甲醛的定量检测。

附图说明

图1是实施例1中化合物1的¹H NMR图谱；

图2是实施例1中化合物1的¹³C NMR图谱；

图3是实施例1中探针HDBC的¹H NMR图谱；

图4是实施例1中探针HDBC的¹³C NMR图谱；

图5是实施例1中探针HDBC与甲醛反应前的质谱图；

图6是实施例2中探针HDBC与甲醛反应后的质谱图；

图7是实施例3中荧光探针HDBC对不同浓度甲醛的紫外滴定图；

图8是实施例4中荧光探针HDBC对不同浓度甲醛的荧光滴定图；

图9是实施例4中探针HDBC的荧光强度比(F/F₀)与所加甲醛的浓度之间的关系图；

图10是实施例5中探针HDBC与化合物的反应时间关系图；

图11是实施例6中荧光探针HDBC与常见离子或生物小分子在加入甲醛反应前后的荧光对比柱形图；图中，1，空白2，苯甲醛3，乙二醛4，对羟基苯甲醛5，对氯苯甲醛6，2,4-二羟基苯甲醛7，对羟基苯乙酮8，半胱氨酸9，高半胱氨酸10，谷胱甘肽11，Na⁺12，K⁺13，Ca²⁺14，Ba²⁺15，Mg²⁺。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实验所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

化合物1的合成：

在氮气氛围下，将1.00g 2-溴-1,8-萘酐加入到100mL无水乙醇中，再加入 0.41g4-氨基丁酸,在80℃回流12h。反应结束后，冷却到室温后有晶体析出，过滤，无水乙醇洗涤三次，得到0.98g灰白色的中间体化合物1(产率为74.8％)。

化合物1的核磁表征:¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):12.04(1H，s), 8.40(2H,dd,J₁＝7.2Hz,J₂＝8.2Hz),8.17(1H,d,J＝7.9Hz),8.07(1H,d,J＝7.9Hz), 7.87(1H,t,J＝6.9Hz),4.03(2H,t,J＝6.9Hz),2.31(2H,t,J＝7.2Hz),1.84–1.91(2H, m).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):174.48,163.32,163.27,132.83,131.84, 131.63,131.21,130.03,129.43,129.06,128.57,123.07,122.30,39.34,31.79,23.37.

化合物1的¹H NMR图谱和¹³C NMR图谱分别如图1和图2所示。

探针HDBC的合成：

在氮气氛围下，将0.7g中间体(化合物1)和4mL水合肼加入到50mL乙醇中，在80℃回流8h，待反应完全后，旋干反应液，经柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1:4，v/v)分离纯化得到最后产物0.58g(产率为67.4％)。

探针HDBC的核磁表征:¹H NMR(400MHz,D₂O)δ7.15(s,1H),7.04(s,1H), 6.90(s,1H),6.56(s,1H),5.98(s,1H),3.36(s,2H),2.10(s,2H),1.53(s,2H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ175.51,164.22,163.36,153.51,134.56,130.94, 129.73,128.60,124.46,122.13,118.80,107.74,104.31,33.26,24.34.

探针HDBC的¹H NMR图谱和¹³C NMR图谱分别如图3和图4所示。

实施例2

探针HDBC与甲醛水溶液反应前后的质谱图

取实施例1制备的探针HDBC溶于蒸馏水中，制成浓度为0.1mg/mL的待测液，用液质联用仪(HPLC-MS)测试探针的相对分子量，如图5所示，其中 312.1所在的信号峰是化合物1+[H⁺]。然后向上述探针待测液中加入150μM的甲醛水溶液,混合均匀后，用液质联用仪(HPLC-MS)测试混合溶液的相对分子量，如图6所示，其中325.1所在的信号峰是最终产物+[H⁺]。基于上述实验结论，可以初步证明反应历程与本发明的探针设计理念是吻合的。

实施例3

探针HDBC对不同浓度甲醛水溶液的滴定吸光度的变化

取实施例1制备的探针HDBC溶于DMSO中，制成浓度为1mM探针母液；将质量分数为37％的甲醛加入蒸馏水，配制成甲醛浓度为1mM的甲醛母液。将上述1mM的探针母液用DMSO稀释到10μM制成待测液，所用溶液在使用前用超声仪超声10min。室温下，用一次性吸管移取3mL上述待测液加入到石英比色皿中开始测试；待测液加入的甲醛母液终浓度分别为0、10、20、30、40、 50、60、70、80、90、100(单位：μM)。不同浓度的上述甲醛溶液加入到上述待测液中，混合均匀后用紫外分光光度计测试待测液与不同浓度甲醛反应吸光度的变化。吸光度变化情况如图7所示。由图7可见，在未加甲醛之前，探针的紫外曲线的最大吸收峰出现在449nm处，随着甲醛的加入和反应时间的延长，449 nm处的吸收峰开始逐渐增加，与此同时溶液的最大吸收峰的位置逐渐转移至435 nm，而且在435nm处溶液的吸收峰不断降低，并且在452nm处出现等吸收点。通过反应前后的紫外光谱的变化，可以说明甲醛与探针发生了化学反应。

实施例4

荧光探针HDBC对不同浓度甲醛水溶液的荧光光谱变化

取实施例1制备的探针HDBC溶于DMSO中，制成浓度为1mM探针母液；将质量分数为37％的甲醛加入蒸馏水，配制成甲醛浓度为1mM的甲醛母液。将上述1mM的探针母液用DMSO稀释到到10μM制成待测液，所用溶液在使用前用超声仪超声10min。室温下，用一次性吸管移取3mL上述待测液加入到石英比色皿中开始测试；待测液加入的甲醛母液终浓度分别为0、10、20、30、40、 50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150(单位：μM)。用荧光光谱仪测试上述待测液与不同浓度甲醛反应的荧光光谱变化(激发波长为417 nm)，荧光光谱变化情况如图8所示。由图8可见，随着甲醛浓度的逐渐增加，探针溶液在517nm处的荧光强度逐渐增强，当甲醛的浓度达到150μM时，荧光强度达到最大值。与此同时，溶液的颜色由红色变为黄色。便携式紫外灯下照射 (365nm光源)上述待测液加入甲醛溶液后，荧光明显增强。实验结果说明探针可以通过荧光光谱仪检测甲醛，并且用肉眼可观察前后的变化。(图7左上角的小插图是探针待测液与甲醛反应前后在普通光照下的变化，图8左上角的小插图是探针待测液与甲醛反应前后在紫外灯下照射(365nm)的变化)由于反应前与反应后的荧光光谱发生变化，因此进一步说明甲醛溶液与探针溶液发生了化学反应。基于以上实验结论本发明探针HDBC的设计理念是正确的。此外，如图9 所示，在甲醛浓度为0-100μM的检测范围内，探针的荧光强度(F/F₀)和甲醛的浓度之间呈现良好的线性关系，方程式为:Y＝0.9536X+0.20145,R²＝0.9945。(其中Y:荧光强度(F/F₀)，X:甲醛的浓度)这说明此探针在一定范围内可以用来定量检测甲醛。

实施例5

为考察探针对甲醛的响应时间，取实施例1制备的探针HDBC溶于DMSO 中，制成浓度为1mM探针母液；将质量分数为37％的甲醛加入蒸馏水，配制成甲醛浓度为1mM的甲醛母液。将上述1mM的探针母液用DMSO稀释到到10μ M制成待测液，所用溶液在使用前用超声仪超声10min。室温下，用一次性吸管移取3mL上述待测液加入到石英比色皿中同时加入150μM甲醛溶液，荧光动力学实验测试探针与化合物的反应时间。由图10可以看出，经过8s后，探针溶液的荧光值达到最大。

实施例6

荧光探针HDBC对常见分析物的选择性研究

从实施例3中探针待测液(10μM)中取出1mL加入到5mL的离心管中，相同条件下取出15等份，分别加入以下分析物:空白(不加分析物)，终浓度分别为50μM苯甲醛,50μM乙二醛，50μM对羟基苯甲醛,50μM对氯苯甲醛，50μM 2,4-二羟基苯甲醛，50μM对羟基苯乙酮，100μM半胱氨酸，100μM高半胱氨酸，100μM谷胱甘肽，50μM Na⁺，50μM K⁺，50μM Ca²⁺，50μM Ba²⁺，50μM Mg²⁺，混合均匀后，分别取3mL上述探针待测液与不同分析物的混合溶液来检测此混合溶液的荧光光谱变化。由图11可以发现，相对于纯探针测试液，加入苯甲醛、乙二醛、对羟基苯甲醛、对氯苯甲醛、2,4-二羟基苯甲醛、对羟基苯乙酮、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Mg²⁺的测试液荧光强度变化不太明显。然而加入甲醛后溶液的荧光强度发生了显著增强。实验结果说明探针对甲醛具有良好的选择性。

Claims

1.一种用于甲醛检测的荧光探针HDBC，其特征在于，其结构式如下式Ⅰ所示：

2.一种权利要求1所述用于甲醛检测的荧光探针HDBC的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:

(2)在氮气氛围下，将中间体化合物1和水合肼按一定比例加入到乙醇中回流；待反应后旋干反应液，分离纯化得到最后产物。

3.根据权利要求1所述用于甲醛检测的荧光探针HDBC的制备方法，其制备路线如下所示：

4.一种权利要求1所述用于甲醛检测的荧光探针HDBC在环境及生物样品中甲醛检测中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：

(1)将探针HDBC溶于DMSO(二甲基亚砜)，制成探针母液；将探针母液稀释制成待测液，然后将甲醛加到待测液中，观察待测液在加入不同浓度甲醛后荧光光谱的变化：荧光激发波长为417nm；

(2)用肉眼观察待测液在加入甲醛前后颜色的变化。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述待测液加入不同浓度甲醛后荧光光谱的变化用分子荧光光谱仪测试，激发波长为417nm。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)具体为：用肉眼观察待测溶液在加入甲醛前后颜色的变化，待测液由红色变为黄色，则说明待测液与甲醛响应；或者，在365nm光源照射下，待测液在加入甲醛后荧光增强，则说明待测液与甲醛响应。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述荧光探针HDBC对甲醛的响应时间为8-10秒。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述荧光探针HDBC在检测甲醛时能抗苯甲醛、乙二醛、对羟基苯甲醛、对氯苯甲醛、2,4-二羟基苯甲醛、对羟基苯乙酮、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Mg²⁺的干扰。

10.一种权利要求1所述的检测甲醛的荧光探针HDBC在定量检测水环境中的甲醛和生物样品的甲醛中的应用。