WO2018062811A1 - 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 프로브, 이를 이용한 세포 또는 조직 내 포름알데히드의 이광자 비율 기준 형광 영상화 및 농도 측정 - Google Patents

포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 프로브, 이를 이용한 세포 또는 조직 내 포름알데히드의 이광자 비율 기준 형광 영상화 및 농도 측정 Download PDF

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전용웅
류혜근
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Abstract

본 발명은 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물, 이를 이용한 세포 또는 조직 내 포름알데히드의 이광자 비율 기준 형광 영상화 및 농도 정량화에 관한 것이다. 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물이 근적외선 영역의 빛을 이용한 이광자 여기 조건에서 포름알데히드를 비율 기준 형광 영상화할 수 있어, 세포 또는 장기 조직에서 포름알데히드의 검출 및 농도 측정이 가능하므로, 내생성(endogenous) 포름알데히드의 검출 및 농도 측정, 나아가, 생체 내 포름알데히드의 생물학적 역할을 밝혀내는데 유용하게 사용할 수 있으며, 특히, 깊은 조직(결장의 움, 소장의 융모 또는 움)의 포름알데히드를 검출 또는 농도를 측정하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 프로브, 이를 이용한 세포 또는 조직 내 포름알데히드의 이광자 비율 기준 형광 영상화 및 농도 측정
본 발명은 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 프로브, 이를 이용한 세포 또는 조직 내 포름알데히드의 이광자 비율 기준 형광 영상화 및 농도 측정에 관한 것이다.
활성 카보닐 물질인 포름알데히드는 주로 발암 물질 또는 새집증후군 유발 기체로 알려져 있다. 그러나, 최근 연구에 의하면, 포름알데히드는 혈액 중에서 100 μM로, 세포 내에서는 400 μM로 높은 농도로 일정하게 유지되고, 다양한 생물학적 기능과 관련있음이 보고된 바 있다.
이러한 생체내 포름알데히드는 주로 라이신 특이 디메틸레이즈 1(lysine specific demethylase 1), JmjC 도메인-함유 단백질(JmjC domain-containing proteins), 세미카바자이드-민감성 아민 옥시데이즈(semicarbazide-sensitive amine oxidases) 등과 같은 디메틸레이즈 및 옥시데이즈 효소에 의해 그 생성이 조절된다. 또한, 디하이드로제네이즈(dehydrogenase)/S-나이트로소글루타티온 리덕테이즈(S-nitrosoglutathione reductase), 알데히드 디하이드로제네이즈 2(aldehyde dehydrogenase 2)에 의한 포름알데히드 활성 저하(active degradation) 또한 포름알데히드 생성과 관련된 알려진 경로이다.
포름알데히드는 장기 기억 저장, 회복과 관련이 있으며, 항균 활동에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 한편, 비정상적으로 높은 농도의 포름알데히드는 암, 신경변성질환(neurodegenerative diseases), 당뇨, 만성 간질환, 심장 질환 등과 관련이 있는 것으로 보고된 바 있으나, 아직까지 포름알데히드의 생물학적 역할에 관해 명확하게 밝혀지지 않고 있다.
이에, 포름알데히드의 다양한 생물학적 기능 및 이에 수반되는 생명 현상을 이해하기 위하여 포름알데히드를 정량화하고 조직 깊은 곳까지 이를 영상화하는 프로브(probe) 개발의 중요성이 대두되고 있다.
특히, 비외과적(non-invasive) 방법으로 생체내의 포름알데히드를 정량화 할 수 있는 도구가 필요한데, 생체내(in vivo) 분석을 위해 형광 신호를 이용한 감지 방법이 높은 해상도의 영상을 확보할 수 있기에 선호되고 있으나, 형광 신호를 이용한 포름알데히드 감지 방법은 아직 연구단계에 있다.
최근, Chang 및 Chan groups에서 반응 기반(reaction-based) 포름알데히드 감지하는 프로브를 개발하였다(J. Am. Chem. Soc. 137, 10886 (2015) 및 J. Am. Chem. Soc. 137, 10890 (2015)). 상기 프로브는 포름알데히드와 아민이 반응하여 이미늄 이온을 생성하고 아자-코프 재배열(aza-cope rearrangement) 이후, 가수분해를 통해 형광 신호가 켜지는(turn-on) 방식을 취하고 있다. 이러한 프로브는 세포 영상화에 효과적이지만, 단파장의 일광자 여기과정을 거친다.
신호 기반(intensity-based), 일광자 여기(one-photon excitable) 프로브는 세포 내 포름알데히드를 정성적으로 관찰하기에 유용하지만, 형광 신호는 프로브의 농도, 매질 극성(medium polarity), 온도, pH 및 장비 구성에 민감하기 때문에, 목표 물질을 정량 분석하는데는 부적합하다. 또한, 조직 영상화로의 응용에 있어서, 단파장에서의 일광자 여기를 이용한 프로브의 광퇴색(photobleaching)과 조직 자체의 자가형광(auto-fluorescence) 발생은 추가적으로 심각한 문제가 될 수 있으며, 깊은 조직의 포름알데히드는 영상화 하기 힘든 문제가 있다.
따라서, 상기 문제점을 해결할 수 있는 새로운 프로브의 개발이 필요하다.
이에, 본 발명자는 상기 문제를 해결할 수 있는 새로운 프로브를 개발하기 위하여 노력하던 중, 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 프로브가 근적외선 영역의 빛을 이용한 이광자 여기 조건에서 포름알데히드를 비율 기준 형광 영상화할 수 있어, 세포 또는 장기 조직에서 포름알데히드의 검출 및 농도 측정이 가능하므로, 내생성(endogenous) 포름알데히드의 검출 및 농도 측정, 나아가, 생체 내 포름알데히드의 생물학적 역할을 밝혀내는데 유용하게 사용할 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 포름알데히드 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 조직 또는 세포의 포름알데히드 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 창자의 융모 또는 움의 포름알데히드 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 포름알데히드 농도 측정용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 조직 또는 세포의 포름알데히드 농도 측정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 창자의 융모 또는 움의 포름알데히드 농도 측정 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 포름알데히드 검출용 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2017010615-appb-I000001
.
또한, 본 발명은 상기 포름알데히드 검출용 조성물을 동물개체로부터 분리된 조직 또는 세포에 처리하는 단계를 포함하는 조직 또는 세포의 포름알데히드 검출방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 포름알데히드 검출용 조성물을 동물개체로부터 분리된 창자의 융모 또는 움에 처리하는 단계를 포함하는 창자의 융모 또는 움의 포름알데히드 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 포름알데히드 농도 측정용 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2017010615-appb-I000002
.
나아가, 본 발명은 상기 포름알데히드 농도 측정용 조성물을 동물개체로부터 분리된 조직 또는 세포에 처리하는 단계를 포함하는 조직 또는 세포의 포름알데히드 농도 측정 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 포름알데히드 농도 측정용 조성물을 동물개체로부터 분리된 창자의 융모 또는 움에 처리하는 단계를 포함하는 창자의 융모 또는 움의 포름알데히드 농도 측정 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물이 근적외선 영역의 빛을 이용한 이광자 여기 조건에서 포름알데히드를 비율 기준 형광 영상화할 수 있어, 세포 또는 장기 조직에서 포름알데히드의 검출 및 농도 측정이 가능하므로, 내생성(endogenous) 포름알데히드의 검출 및 농도 측정, 나아가, 생체 내 포름알데히드의 생물학적 역할을 밝혀내는데 유용하게 사용할 수 있으며, 특히, 깊은 조직(결장의 움, 소장의 융모 또는 움)의 포름알데히드를 검출 또는 농도를 측정하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물이 포름알데히드와 반응할 때 나타나는 비율 기준 형광 센싱 특징에 관한 것으로, 도 1a는 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물의 포름알데히드 감지 메커니즘 및 형광 변화 사진이고, 상기 형광 변화 사진은 UV 램프 (λex = 365 nm)조사 하에 포름알데히드 및 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물이 혼합된 수용액의 형광 변화를 촬영한 것이다. 프로브 1(Probe 1)에서는 파란색(blue) 형광을 나타내었으나, 포름알데히드와 반응하여 알데히드 2(Aldehyde 2)를 형성하면서 초록색(green) 형광을 나타내는 것을 알 수 있다. 도 1b는 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(10 μM)에 포름알데히드를 0-800 μM로 처리했을 때, 포름알데히드 처리 농도에 따른 형광 적정(Fluorescence titration)을 나타낸 그래프이다. 도 1c는 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물에 처리한 포름알데히드 농도에 따른 형광 세기 비율(I533 nm/I438 nm)을 나타낸 그래프이다. 도 1d는 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물의 포름알데히드에 대한 선택성을 나타낸 그래프로, 생물학적으로 관련있는 반응을 하는 카보닐류, 산소류 및 황류(메틸글리옥살, 아세트알데히드, 글루코즈, 피루베이트, H2O2, Cys(cystein), GSH(glutathione) 및 H2S; (이때, H2S를 100 μM에서 측정한 것을 제외하고 모든 물질을 500 μM에서 측정) 존재하에 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물의 선택성을 나타낸 그래프이다. 상기 도 1의 형광 스펙트럼은 400 nm 여기 하에서, 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물 및 포름알데히드를 PBS 완충용액(pH = 7.4), 37 °C에서 3시간 배양후 얻은 것이다.
도 2는 생물학적으로 관련있는 반응을 하는 카보닐, 산소 및 황 종류(메틸글리옥살, 아세트알데히드, 글루코즈, 피루베이트, H2O2, Cys(cystein), GSH(glutathione) 및 H2S; (이때, H2S를 100 μM에서 측정한 것을 제외하고 모든 물질을 500 μM에서 측정) 존재하에 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물의 형광 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다. 상기 형광 변화 측정은 400 nm 여기 하에서, 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물 및 포름알데히드를 PBS 완충용액(pH = 7.4), 37 °C에서 3시간 배양 후 측정하였다.
도 3은 0-10 μM의 포름알데히드로 배양한 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(10 μM)의 포름알데히드 농도에 따른 비율 형광 세기(I533 nm/I438 nm) 변화를 나타낸 그래프이다. 상기 비율 형광 세기는 400 nm 여기 하에서, 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물 및 다양한 농도의 포름알데히드를 1% DMSO를 함유하는 PBS 완충용액(pH = 7.4) 10 mM, 37 °C에서 3시간 배양 후 측정하였다.
도 4는 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(10 μM) 및 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(10 μM)과 포름알데히드 (400 μM)의 혼합물의 pH(4.0-9.0)에 따른 비율 형광 세기(I533 nm/I438 nm) 변화를 나타낸 그래프이다. 상기 비율 형광 세기는 400 nm 여기 하에서, 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물 및 다양한 농도의 포름알데히드를 1% DMSO를 함유하는 PBS 완충용액(pH = 7.4) 10 mM, 37 °C에서 3시간 배양 후 측정하였다.
도 5는 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물로 세포 및 조직의 내생성 포름알데히드 및 외생성 포름알데히드의 비율 기준 형광 영상화를 나타낸 것이다. 도 5a는 각각 다른 조건에서의 MCF7 세포의 공초점 픽셀-투-픽셀(Confocal pixel-to-pixel) 비율 기준 이미지(IGreen/IBlue)이다. 상기 도 5a의 i)는 음성 대조군으로 NaHSO3 (200 μM, 30 min) 전처리 후, 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(10 μM, 3 h)처리하여 배양한 것이고, ii)는 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(10 μM, 3 h)만 단독 처리하여 배양한 것이고, iii)은 양성 대조군으로 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(10 μM, 3 h) 처리 후, 외생성 포름알데히드(1 mM, 2.5 h)를 처리하여 배양한 것이다. 도 5b는 각각 다른 조건에서의 마우스 신장 조직의 이광자 픽셀-투-픽셀 비율 기준 이미지(IGreen/IBlue)이다. 상기 도 5b의 i)는 음성 대조군으로 NaHSO3 (200 μM, 30 min) 전처리 후, 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(10 μM, 3 h)처리하여 배양한 것이고, ii)는 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(10 μM, 3 h)만 단독 처리하여 배양한 것이고, iii)은 양성 대조군으로 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(10 μM, 3 h) 처리 후, 외생성 포름알데히드(1 mM, 2.5 h)를 처리하여 배양한 것이다. 도 5c 및 5d는 상기 도 5a 및 5b의 각 조건에서의 평균 비율 값을 나타낸 막대그래프이다(OPM(one-photon microscopy) 및 TPM(two-photon microscopy)의 조건: λex , OPM = 405 nm, λem , blue = 410-440 nm, 및 λem , green = 500-600 nm (도 5a); λex , TPM = 760 nm, λem , blue = 400-440 nm, 및 λem , green = 470-550 nm (도 5b). *: p<0.05, **: p<0.005, ***: p< 0.001. 스케일바: 25 μm(도 5a); 75 μm(도 5b)).
도 6은 각각 다른 조건에서의 A549 세포의 공초점 픽셀-투-픽셀(Confocal pixel-to-pixel) 비율 기준 이미지(IGreen/IBlue)이다. 상기 도 7의 i)는 음성 대조군으로 NaHSO3 (200 μM, 30 min) 전처리 후, 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(10 μM, 3 h)처리하여 배양한 것이고, ii)는 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(10 μM, 3 h)만 단독 처리하여 배양한 것이고, iii)은 양성 대조군으로 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(10 μM, 3 h) 처리 후, 외생성 포름알데히드(1 mM, 2.5 h)를 처리하여 배양한 것이다(λex, OPM = 405 nm, λem ,blue = 410-440 nm, 및 λem , green = 500-600 nm. 스케일바: 25 μm)
도 7a는 각각 다른 조건에서의 마우스 폐 조직의 이광자 픽셀-투-픽셀 비율 기준 이미지(IGreen/IBlue)이다. 상기 도 7a의 i)는 음성 대조군으로 NaHSO3 (200 μM, 30 min) 전처리 후, 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(10 μM, 3 h)처리하여 배양한 것이고, ii)는 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(10 μM, 3 h)만 단독 처리하여 배양한 것이고, iii)은 양성 대조군으로 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(10 μM, 3 h) 처리 후, 외생성 포름알데히드(1 mM, 2.5 h)를 처리하여 배양한 것이다. 도 7b는 상기 도 7a의 각 조건에서의 평균 비율 값을 나타낸 막대그래프이다(λex , TPM = 760 nm, λem , blue = 400-440 nm, 및 λem, green = 470-550 nm. 스케일바: 75 μm.).
도 8은 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물의 내생성 포름알데히드의 이광자 비율 기준 이미지 및 정량화를 나타낸 것이다. 도 8a 내지 8e는 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(10 μM, 3 h)로 배양한 마우스의 뇌, 폐, 간, 신장 및 결장 조직의 TPM 이미지(Intensity based image) 및 상기 이미지 데이터로부터 얻은 이광자 픽셀-투-픽셀 비율 기준(IGreen/IBlue) 이미지이다. TPM 이미지 중 상단 이미지(Overlay)는 하단 왼쪽의 블루 채널 및 하단 오른쪽의 그린 채널로부터 얻은 TPM 이미지를 중첩한 것이다. 이광자 픽셀-투-픽셀 비율 기준(IGreen/IBlue) 이미지는 ~ 20 μm의 중간 깊이에서 선택된 단면도 중 하나를 나타낸다(λex, TPM = 760 nm. λem , blue = 400-440 nm. λem , green = 470-550 nm. 스케일 바 = 250 μm). 도 8f는 마우스 각 기관의 15개 조직 슬라이스로부터 얻은 평균 비율 값을 나타낸 막대 그래프로, 각 직 슬라이스의 중심점 주위의 2 μm 깊이 간격에서 수집한 5-10개의 단면도(cross-sectional images)로부터 통상적인 스레홀드 값(common threshold values)을 설정한 후, 평균 화소 세기(mean pixel intensity)를 얻었다(각각 상하에서 5%). 도 8g는 이광자 여기 조건 하에 얻은 포름알데히드 농도에 따른 형광 세기 비율(IGreen/IBlue)의 기준 커브(standard curve)로, 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(10 μM)을 PBS 완충용액 (10 mM, pH 7.4)에서 다양한 농도의 포름알데히드(0-500 μM)로 3시간 배양한 후, 각각 그린 및 블루 채널으로부터 형광을 수집한 것이다. 도 8h는 다섯개의 장기에서 계산된 포름알데히드 농도를 나타낸 막대그래프이다. 도 8f 및 도 8h의 에러바(error bars)는 ±S.D를 나타낸다.
도 9의 상단 이미지는 이광자 장 조직 영상화의 개략적인 설명을 나타낸 것이고, 도 9의 하단 이미지는 소장의 융모 및 움과 결장의 움의 영상화 위치의 개략적인 설명을 나타낸 것으로, 도 9 하단 이미지에서, 왼쪽 박스의 점선박스 (d)는 결장의 움 영역을 표시한 것이고, 중간 박스의 점선박스 (e)는 소장의 융모, 점선박스 (f)는 소장의 움을 표시한 것이다.
도 10a 내지 10c는 상기 도 9에서 표시한 점선박스 (d), (e) 및 (f)에 해당하는 결장(colon)의 움(crypts)(도 10a), 소장(small intestine)의 움(도 10c) 및 융모(villi)(도 10b)에 z-스택 오버레이드 이미지화(z-stacked overlaid)를 수행한 3D 표면 이광자 이미지(상단 이미지), 상기 도 9에서 표시한 점선박스 (d), (e) 및 (f)에 해당하는 결장의 움, 소장의 움 및 융모의 세기 기준 단면도로, 각 조직 슬라이스의 중간 깊이 주위의 2 μm의 간격으로 15개의 단면을 블루 및 그린 채널로부터 수집한 오버레이드(Overlaid) 형광 이미지(중단 이미지) 및 상기 중단 이미지에서 점선 박스로 표시된 영역의 블루 및 그린 채널에서의 발광으로부터 수행한 픽셀-투-픽셀 비율기준(Pixel-to-pixel ratiometric (IGreen/IBlue)) 이미지(하단 이미지)이다. 도 10a 내지 10c의 이미지는 모두 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(10 μM)로 3시간 배양한 조직을 TPM을 통해 얻은 이미지이다(λex, TPM = 760 nm; λem , blue = 400-440 nm, λem , green = 470-550 nm). 스케일바: 250 μm(중단 이미지, intensity based cross-section image); 80 μm(하단 이미지, pixel-to-pixel ratiometric image).
도 11은 상기 도 10a 내지 10c의 pixel-to-pixel ratiometric image 모두에 통상적인 스레홀드 값(common threshold values)을 설정한 후, 평균 화소 세기(mean pixel intensity)계산하여 얻은 평균 형광 세기 비율(IGreen/IBlue) 값을 나타낸 막대 그래프이다.
도 12는 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물과 포름알데히드의 반응 생성물의 1H NMR 데이터이다.
도 13은 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물과 포름알데히드의 반응 생성물의 13C NMR 데이터이다.
도 14는 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물과 포름알데히드의 반응 생성물의 HRMS 데이터이다.
도 15는 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물의 농도에 따른 HeLa 세포의 세포 생존도를 측정한 그래프이다. 상기 세포 생존도는 HeLa 세포 라인의 CCK-8(Cell Counting Kit-8) 대사 능력을 측정하여 얻었다. 세포를 성장 미디움에서 96-웰 플레이트에 웰당 약 5 × 103의 밀도로 접종하고, 70-80% 융합될때까지 배양하였다. 각각에 다양한 농도로 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물을 처리하고, CCK-8 용액 10 μL를 각 웰당 첨가하고, 37 °C에서 1시간 유지하였다. 4, 8, 12 시간 배양 후 450 nm 흡광도를 측정하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 이하 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되는 것이며, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 포름알데히드 농도 측정용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2017010615-appb-I000003
.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 포름알데히드 농도 측정용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2017010615-appb-I000004
이때, 상기 포름알데히드 농도 측정용 조성물은 포름알데히드의 농도를 측정함으로써, 포름알데히드의 농도를 정량화 할 수 있다.
이하, 본 발명에 따른 상기 포름알데히드 검출용 조성물 및 포름알데히드 농도 측정용 조성물에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 상기 포름알데히드 검출용 조성물 및 포름알데히드 농도 측정용 조성물은 아자-코프 재배열 모이어티(aza-Cope rearrangement moiety)를 이광자 흡수 형광체(dye)에 도입하여 재배열의 결과로 분자내 전하 이동(intramolecular charge transfer, ICT)의 변화가 크게 유도될 수 있도록 고안된 것이다.
구체적으로, 도 1a 에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 포름알데히드 검출용 조성물 및 포름알데히드 농도 측정용 조성물은 나프탈렌의 6번 탄소에 sec-호모알릴아민 모이어티가 도입됨으로써, 포름알데히드를 처리했을 때, 양이온 2-아자-코프 재배열(cationic 2-aza-Cope rearrangement)이 일어날 수 있는 이미늄이 형성되고, 재배열로 인하여 분자내 전하 이동의 변화가 크게 유도될 수 있고, 이미늄 형성 이후 이후 가수분해가 일어나 알데히드가 결합된 화합물이 생성되어 포름알데히드가 감지되는 공여체-수용체 타입의 형광체(dye)이다. 또한, 도 1a의 형광 변화 사진을 보면, 본 발명에 따른 포름알데히드 검출용 조성물 및 포름알데히드 농도 측정용 조성물은 포름알데히드 처리 전에는 파란색의 형광을 나타내나, 포름알데히드와 결합한 후에는 녹색의 형광을 나타내는 것을 알 수 있으며, 이로 인하여 포름알데히드의 감지 여부를 명확하게 알 수 있어, 포름알데히드의 검출 또는 농도 측정에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 도 1b에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 포름알데히드 검출용 조성물 및 포름알데히드 농도 측정용 조성물은 포름알데히드와 관련된 화학적 변화에 의해 생성되는 최종 생성물(알데히드 화합물)은 약 100 nm까지의 큰 발광 파장 이동을 유도한다.
구체적으로, 도 1b를 보면, 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물은 400 nm에서 일광자 여기로 인해 높은 양자수율(quantum yield, Φ = 0.92)로 483 nm에서 그자체로 강한 파란색의 형광을 나타낸다. 생물학적 농도 범위(0-800 μM)로 포름알데히드를 점진적으로 첨가하였을 때, 438 nm 에서의 probe 1의 발광은 점차적으로 감소하며, 533 nm(Φ = 0.17)에서 새로운 피크가 생성된다.
이는, 본 발명에 따른 포름알데히드 검출용 조성물 및 포름알데히드 농도 측정용 조성물이 포름알데히드와 반응함으로써, ICT 변화가 크게 유도됨을 의미한다.
따라서, 본 발명에 따른 포름알데히드 검출용 조성물 및 포름알데히드 농도 측정용 조성물이 포름알데히드와 반응하여 생성된 최종 생성물(알데히드 화합물)은 약 100 nm까지의 파장이동을 나타내며, 쌍극성 형광체로서, 이광자 여기에 의한 형광 방출이 가능하므로, 본 발명에 따른 포름알데히드 검출용 조성물 및 포름알데히드 농도 측정용 조성물은 포름알데히드와 결합하여 이광자 흡수 형광체를 형성할 수 있다.
나아가, 도 1c에 나타난 바와 같이, 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물은 포름알데히드 농도 변화에 따라 438 nm 및 533 사이의 형광 세기 비율이 선형으로 유지되며, 이광자 여기 조건 하에 선형 기준 커브(linear standard curve)는 조직내 포름알데히드의 정량적인 이광자 영상화를 얻을 수 있으므로, 본 발명에 따른 포름알데히드 검출용 조성물 및 포름알데히드 농도 측정용 조성물은 조직 내의 포름알데히드를 정량화 하는데 이용될 수 있다.
또한, 도 1d 및 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물은 잠재적으로 경쟁적인 반응을 하는 카보닐류 및 카보닐-함유 분자 (메틸글리옥살, 아세트알데히드, 글루코즈 및 피루베이트)보다 포름알데히드에 대하여 현저한 선택성을 나타낼 뿐만 아니라, H2O2 와 같은 산소류 및 시스테인, 글루타티온 및 하이드로겐 설파이드와 같은 황류보다도 포름알데히드에 대하여 현저한 선택성을 나타낸다.
따라서, 본 발명에 따른 포름알데히드 검출용 조성물 및 포름알데히드 농도 측정용 조성물은 포름알데히드만 선택적으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 물질에 의해 영향을 받지 않으므로, 정확도 및 정밀도가 높은 포름알데히드 검출이 가능하며, 특히 생체내의 내생성 포름알데히드를 높은 선택성, 정확도 및 정밀도로 검출할 수 있다.
나아가, 도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 포름알데히드 검출용 조성물 및 포름알데히드 농도 측정용 조성물의 포름알데히드 검출 한계 농도는 10 μM (300 ppb)로서, 매우 낮은 농도의 포름알데히드도 검출할 수 있으며, 이는 본 발명에 따른 포름알데히드 검출용 조성물 및 포름알데히드 농도 측정용 조성물이 고민감도로 포름알데히드를 감지할 수 있음을 나타낸다.
아울러, 본 발명에 따른 포름알데히드 검출용 조성물 및 포름알데히드 농도 측정용 조성물은 일반적인 세포내 포름알데히드 농도가 200-400 μM인 점을 감안할 때, 본 발명에 따른 포름알데히드 검출용 조성물의 검출 한계 농도가 세포내 농도에 비하여 1/40-1/20로 현저하게 낮은 농도에서도 감지할 수 있으므로, 세포 또는 조직내의 포름알데히드를 고민감도 및 높은 정확도로 검출 또는 농도를 측정할 수 있다.
또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물과 포름알데히드를 혼합하였을 때의 비율 센싱은 산성 pH(4.0) 부터 생물학적인 pH(7.4)까지 pH의 영향을 받지 않는다.
다만, pH 7.4 초과에서는 비율 형광 세기가 감소하는 경향을 나타내는데, 이는 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물이 포름알데히드와 이미늄 이온을 형성하는 것이 염기성 조건에서 보다 덜 효율적이기 때문일 것이라 예상된다.
따라서, 본 발명에 따른 포름알데히드 검출용 조성물 및 포름알데히드 농도 측정용 조성물은 4.0 내지 7.4의 pH 범위에서 pH의 영향을 받지 않고 포름알데히드를 검출할 수 있다.
나아가, 도 15에 나타난 바와 같이, 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물 처리 후, 세포 생존도를 측정한 결과, 높은 세포생존도를 나타냄으로써, 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물은 생물학적 시스템에 적용하기에 충분히 낮은 세포 독성을 나타냄을 알 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 포름알데히드 검출용 조성물 및 포름알데히드 농도 측정용 조성물은 포름알데히드를 선택적으로 검출할 수 있고, 매우 저농도의 포름알데히드도 검출 할 수 있으며, 4.0-7.4 pH 범위에 영향을 받지 않아 높은 선택성, 정확성, 정밀성 및 고민감도를 가지므로 다양한 분야의 포름알데히드 검출에 유용하게 사용될 수 있고, 특히, 생체의 세포 또는 조직에서 포름알데히드의 검출, 농도 측정 및 정량화 하는데 유용하게 사용될 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 포름알데히드 검출용 조성물을 동물개체로부터 분리된 조직 또는 세포에 처리하는 단계를 포함하는 조직 또는 세포의 포름알데히드 검출방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 포름알데히드 농도 측정용 조성물을 동물개체로부터 분리된 조직 또는 세포에 처리하는 단계를 포함하는 조직 또는 세포의 포름알데히드 농도 측정 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 포름알데히드 검출용 조성물은 세포 또는 조직의 내생성 포름알데히드를 검출하기에 충분한 민감도를 가지므로, 고민감도로 세포 또는 장기 조직의 내생성 포름알데히드의 검출할 수 있다(실험예 2-3 및 2-4, 도 5-7 참조).
또한, 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물을 사용하여 각 조직의 내생성 포름알데히드를 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 형광 분석을 통하여 농도를 정량화 하여 수치적으로 나타낼 수 있다(실험예 2-5 및 도 8 참조).
따라서, 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물은 조직 또는 세포의 포름알데히드 검출 및 농도 측정에 유용하게 사용될 수 있으므로, 이를 이용한 조직 또는 세포의 포름알데히드 검출방법 및 조직 또는 세포의 포름알데히드 농도 측정 방법 또한 조직 또는 세포의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 포름알데히드 검출용 조성물을 동물개체로부터 분리된 창자의 융모 또는 움에 처리하는 단계를 포함하는 창자의 융모 또는 움의 포름알데히드 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 포름알데히드 농도 측정용 조성물을 동물개체로부터 분리된 창자의 융모 또는 움에 처리하는 단계를 포함하는 창자의 융모 또는 움의 포름알데히드 농도 측정 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물은 조직의 내생성 포름알데히드를 검출 또는 농도 측정할 수 있을 뿐만 아니라, 깊은 조직인 결장의 움, 소장의 융모 및 움의 내생성 포름알데히드를 검출하고, 농도를 정량화 할 수 있다(실험예 3, 도 9-11 및 표 1 참조).
따라서, 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물이 근적외선 영역의 빛을 이용한 이광자 여기 조건에서 포름알데히드를 비율 기준 형광 영상화할 수 있어, 세포 또는 장기 조직에서 포름알데히드의 검출 및 농도 측정이 가능하므로, 내생성(endogenous) 포름알데히드의 검출 및 농도 측정, 나아가, 생체 내 포름알데히드의 생물학적 역할을 밝혀내는데 유용하게 사용할 수 있으며, 특히, 깊은 조직(결장의 움, 소장의 융모 또는 움)의 포름알데히드를 검출 또는 농도를 측정하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 포름알데히드 검출용 조성물 및 포름알데히드 농도 측정용 조성물에 있어서, 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,
화학식 5로 표시되는 화합물과 화학식 6로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 1);
상기 단계 1에서 제조한 화학식 4로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 3으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 2);
상기 단계 2에서 제조한 화학식 3으로 표시되는 화합물을 화학식 7로 표시되는 화합물과 반응시켜 화학식 2로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 3); 및
상기 단계 3에서 제조한 화학식 2로 표시되는 화합물을 화학식 8로 표시되는 알릴마그네슘브로마이드와 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 4);를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
[반응식 1]
Figure PCTKR2017010615-appb-I000005
본 발명에 따른 포름알데히드 검출용 조성물 및 포름알데히드 농도 측정용 조성물 상기 제조방법에 의해 간편하고 용이하게 제조할 수 있다.
상기 제조방법 1의 각 단계별 구체적인 실험방법은 특히 한정되는 것은 아니며, 통상적으로 사용되는 합성방법에 의해 수행될 수 있다.
바람직하게는, 하기 실시예 1과 같은 방법으로 수행할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(probe 1) (N-(2- 메톡시에틸 )-1-(6-( 피롤리딘 -1-일)나프탈렌-2-일) 부트 -3-엔-1- 아 민)의 제조
Figure PCTKR2017010615-appb-I000006
단계 1: 1 -(6- 브로모나프탈렌 -2-일) 피롤리딘의 제조
피롤리딘 (3.8 mL, 45.0 mmol), 6-브로모-2-나프톨 (2.0 g, 9.0 mmol), Na2S2O5 (3.6 g, 18.0 mmol), 및 탈이온수(DI water) (20 mL)의 혼합물을 145 °C에서 48 시간 교반시켰다. 상기 반응혼합물을 상온까지 냉각시킨 후, 20 mL의 물에 희선하고, CH2Cl2 (30 mL × 2)로 생성물을 추출하였다. 상기 합친 유기용액을 농축하고, 플래시 컬럼 크로마토그래피(용리액: 에틸 아세테이트/헥산 = 5/95)로 정제하여 1-(6-브로모나프탈렌-2-일)피롤리딘 (1.93 g, 78%)을 흰색 고체로 얻었다.
단계 2: 6 -( 피롤리딘 -1-일)-2- 나프탈데히드의 제조
상기 단계 1에서 얻은 1-(6-브로모나프탈렌-2-일)피롤리딘 (1.66 g, 6.0 mmol)을 무수 테트라하이드로퓨란(anhydrous THF) (15 mL)에 용해시키고, 아르곤하에 -78 °C까지 냉각시킨 후, 1.6 M nBuLi의 헥산 (0.8 mL, 7.2 mmol)을 처리하였다. 상기 반응 혼합물을 -30 °C에서 1시간 교반시킨 후, 무수 디메틸포름아마이드(anhydrous DMF) (0.7 mL, 9.0 mmol)를 처리하여 0 °C까지 승온하였다. 0 °C에서 1시간 반응시킨 후, 상기 반응 혼합물을 포화 암모늄 클로라이드 (5 mL)로 퀀칭하였다. 상기 생성물을 에틸 아세테이트 (30 mL × 2)로 추출하고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리액: 에틸 아세테이트/헥산 = 5/95)로 정제하여 6-(피롤리딘-1-일)-2-나프탈데히드 (0.95 g, 70%)를 얻었다:
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 9.99 (s, 1H), 8.13 (s, 1H), 7.90 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.00 (dd, J = 9.0, 2.4 Hz, 1H), 6.73 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.43 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 2.11-2.06 (m, 4H);
13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 192.0, 148.4, 139.1, 135.3, 131.1, 130.3, 126.6, 124.9, 123.7, 116.5, 104.8, 47.9, 25.7;
HRMS: m/z calcd for C15H15NO [M+] 225.1154; found 225.1150 [M+].
단계 3 및 4: N-(2- 메톡시에틸 )-1-(6-( 피롤리딘 -1-일)나프탈렌-2-일) 부트 -3-엔-1-아민의 제조
상기 단계 2에서 얻은 6-(피롤리딘-1-일)-2-나프탈데히드 (225 mg, 1.0 mmol) 및 2-메톡시에틸아민 (261 μL, 3 mmol)을 에탄올 (5 mL)에서 10 시간 환류시키고 상온까지 냉각시킨 후, 용매를 증발시키고, 진공하에서 12시간 유지하여 ㄱ건조된 이민 생성물을 얻었다. 상기 미정제 이민을 테트라하이드로퓨란 (5 mL)에 용해시키고, -78 °C까지 냉각한 후, 1.0 M 알릴 마그네슘 브로마이드의 THF (1.2 mL, 1.2 mmol)를 천천히 처리하였다. 상기 반응 혼합물을 상온엥서 30분간 유지하고, 메탄올(0.5 mL)로 퀀칭한 후, 셀라이트패드로 필터하였다. 상기 여액을 농축하고 컬럼 크로마토그래피 (용리액: MeOH/CH2Cl2 = 5/95)로 정제하여 N-(2-메톡시에틸)-1-(6-(피롤리딘-1-일)나프탈렌-2-일)부트-3-엔-1-아민(probe 1)(188 mg, 58%)을 흰색 고체로 얻었다:
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.66 (d, J = 9.0 Hz, 1 H), 7.61 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.58 (s, 1 H), 7.35 (dd, J = 8.5, 1.5 Hz, 1 H), 6.98 (dd, J = 9.0, 2.0 Hz, 1 H), 6.75 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 5.78-5.72 (m, 1 H), 5.13-5.03 (m, 2 H), 3.74 (t, J = 7.0 Hz, 1 H), 3.46-3.50 (m, 1 H), 3.44-3.38 (m, 5 H), 3.33 (s, 3 H), 2.68-2.63 (m, 2 H), 2.50 (t, J = 7.0 Hz, 2 H), 2.06-2.03 (m, 4 H);
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 146.0, 136.3, 135.8, 134.8, 128.8, 126.2, 126.1, 125.8, 117.4, 115.9, 104.8, 72.2, 63.0, 58.4, 48.0, 47.2, 43.0, 25.6;
HRMS: m/z calcd for C21H28N2O [M+] 324.2202; found 324.2200 [M+].
< 실험예 1> 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(probe 1)과 포름알데히드의 반응 생성물의 확인
Figure PCTKR2017010615-appb-I000007
상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물 probe 1(10 mg, 0.031 mmol)의 에탄올/PBS 완충용액 (pH = 7.4) (v/v, 1:1, 2 mL)에 755 μL의 포름알데히드 수용액(37 wt%, 9.3 mmol)을 상온에서 첨가하였다. TLC를 사용하여 반응 진행을 관찰하였으며, 1 시간 후, TLC상에 새로운 녹색 형광 스팟만이 나타남을 확인하여 반응이 종결되었음을 확인하였다. 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (10 mL)에 희석하고, 유기층을 물 (20 mL)로 세척하였다. 상기 ㅇ유기층을 감압 농축하고, 잔여물을 쇼트 패드 실리카겔(short pad silica gel)(용리액: CH2Cl2)에 통과시켜 정제하였다. 용매를 증발시킨 후, 노란색 고체를 얻었으며 상기 노란색 고체를 1H NMR, 13C NMR 및 HRMS 분석을 통하여 알데히드 화합물(aldehyde 2) (6.5 mg, 94%)이 생성되었음을 확인하였다. 1H NMR, 13C NMR 및 HRMS 분석결과는 도 12 내지 14에 나타내었다.
< 실험예 2> 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(probe 1)의 생물학적 시스템으로의 적용 가능성 평가
본 발명에 따른 포름알데히드 검출용 조성물의 생물학적 시스템으로의 적용 가능성을 평가하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
(2-1): 실험을 위한 세포의 준비 및 공초점 영상화 방법
MCF7 인간 유방암 세포는 Korean Cell Line Bank로 부터 얻었다. MCF7 세포는 10% (v/v) 소 태아 혈청(fetal bovine serum (FBS)) 및 1% (v/v) 페니실린-스트레ㅍ토마이신(penicillin-streptomycin (PS))으로 보충된 DMEM에서, 37 °C, CO2 5%의 가습 분위기하에 배양하였다. 세포가 80% 컨플루언스(confluence)에 도달할때까지 계대배양하였다. 세포를 1.0 × 105 의 밀도로 세포 배양 접시에 접종하고, 37 °C, CO2 5%의 가습 분위기하에 밤샘 배양하였다.(A549 세포도 상기와 동일하게 배양)
영상화 실험을 위하여, 상기 세포는 세가지 조건에서 배양되었다. 내생성 포름알데히드의 검출을 위하여, 세포는 probe 1(10 μM)이 함유된 DMEM에서 30분간 배양된 후, 잔여 probe 1을 제거하기 위하여 PBS(phosphate buffered saline)로 세번 세척하고, 2.5시간 추가로 배양하였다. 소듐 바이설파이트로 음성 대조군 실험을 위하여, 세포는 소듐 바이설파이트 (200 μM)이 함유된 DMEM에서 30분간 배양된 후, 잔여 소듐 바이 설파이트를 제거하기 위하여 PBS로 세번 세척하고, probe 1(10 μM)이 함유된 DMEM에서 30분간 배양된 후, 잔여 probe 1을 제거하기 위하여 PBS로 세번 세척하고, 2.5시간 추가로 배양하였다. 외생성 포름알데히드로 양성 대조군 실험을 위하여, 세포는 probe 1(10 μM)이 함유된 DMEM에서 30분간 배양된 후, 잔여 probe 1을 제거하기 위하여 PBS로 세번 세척하고, 포름알데히드(1 mM)으로 2.5시간 추가로 배양하였다.
형광 세포 이미지는 다수의 가시 레이저 라인(405, 458, 476, 488, 496, 514, 561, 594, 및 633 nm) 및 40X 대물렌즈(obj. HCX PL APO 40×/ 1.10 W CORR CS, Leica, Germany)가 장착된 Leica TCS SP5 II Advanced System을 사용하여, 공초점 현미경으로 활영하였다. 상기 일광자 영상화 실험을 위하여, 세포는 405 nm 레이저 라인으로 여기되고, 형광 발광이 두개의 발광 채널로부터 수집되었다(λem , blue = 410-440 nm 및 λem , green = 500-600 nm). 얻은 이미지는 LAS AF Lite (Leica, Germany)를 사용하여 처리하고, 모든 이미지는 대응 픽셀-투-픽셀 비율기준 이미지로 변환하였다.
(2-2): 장기 조직 샘플의 준비 및 이광자 영상화 방법
여기서, 마우스 조직에 관한 실험 절차는 동물 연구에 관한 포항공과대학교 과학 및 기술 위원회(Pohang University of Science and Technology Committee on Animal Research)에서 승인받은 프로토콜 및 한국 의료과학 학회(The Korean Academy of Medical Science)에 의해 설립된 실험 동물의 사용에 대한 지침에 따라 수행하였다.
본 실험을 위하여 Balb/C 타입 마우스(6 주령)를 사용하였다. 상기 마우스는 경추 탈골 후 해부하였다. 혈액의 제거를 위하여 PBS 버퍼로 혈액 관류를 수행하였다. 뇌, 폐, 간, 신장 및 결장의 장기는 해부하고, PBS 버퍼로 세척한 후, 50 μm 두께로 진동 블레이드 마이크로톰(vibrating blade microtome (VT1000S, Leica, Germany))을 사용하여 슬라이스하였다.
영상화 실험을 위하여, 조직은 세가지 조건으로 배양되었다. 내생성 포름알데히드의 검출 및 정량화 실험을 위하여, 조직은 probe 1(10 μM)이 함유된 DMEM에서 30분간 배양된 후, 잔여 probe 1을 제거하기 위하여 PBS(phosphate buffered saline)로 세번 세척하고, 2.5시간 추가로 배양하였다. 소듐 바이설파이트로 음성 대조군 실험을 위하여, 조직은 소듐 바이설파이트 (200 μM)이 함유된 DMEM에서 30분간 배양된 후, 잔여 소듐 바이 설파이트를 제거하기 위하여 PBS로 세번 세척하고, probe 1(10 μM)이 함유된 DMEM에서 30분간 배양된 후, 잔여 probe 1을 제거하기 위하여 PBS로 세번 세척하고, 2.5시간 추가로 배양하였다. 외생성 포름알데히드로 양성 대조군 실험을 위하여, 조직은 probe 1(10 μM)이 함유된 DMEM에서 30분간 배양된 후, 잔여 probe 1을 제거하기 위하여 PBS로 세번 세척하고, 포름알데히드(1 mM)으로 2.5시간 추가로 배양하였다. 모든 배양은 공기내 5% CO2 하에 37 °C에서 수행되었다.
상기 염색된 샘플을 영상화하기 위하여 PBS로 세번 세척하여 잔여 probe 1을 제거한 후, 슬라이드 글래스에 놓았다. 조직 샘플의 형광 이미지는 이광자 현미경(TPM)으로 촬영하였다. TPM 영상화는 Ti-Sapphire laser (Chameleon Vision II, Coherent)를 사용하여 140 fs 펄스폭 및 80 MHz 펄스 반복률(TCS SP5 II, Leica, Germany)에서 20X 대물렌즈(obj. HCX PL APO 20×/ 1.10 W CORR CS, Leica, Germany)를 통하여 수행하였다. 상기 probe 1을 위하여 이광자 여기 파장은 760 nm로 조정하였다. 각각의 발광 빛은 두개의 채널 스펙트럼(λem , blue = 400-440 nm, λem , green = 470-550 nm)으로 해결되었으며, 상기 조직 샘플은 꽉 끼는 홀더에 장착하였다. 여기 레이저 전력은 약 9.3 mW이며, 상기 이미지는 1024 × 1024 픽셀로 구성하고, 주사 속도는 전체 영상 중 100 MHz로 유지하였다.
(2-3). 세포의 내생성 포름알데히드의 검출 측정
세포의 내생성 포름알데히드를 검출할 수 있는지를 확인하기 위하여, 세포에 probe 1을 단독으로 처리하여 실험하고, 비교를 위하여 음성 대조군 및 양성 대조군 실험을 수행하였다. 음성 대조군은 무처리세포(native cells)보다 포름알데히드의 수준을 낮추기 위하여 포름알데히드와 공유 복합체(covalent complex)를 형성하는 NaHSO3를 사용하여 세포의 전처리를 수행하였다. 양성 대조군은 무처리세포(native cells)보다 포름알데히드의 수준을 높이기 위하여 세포 외부에서 세포내부로 포름알데히드(exogenous formaldehyde source)를 첨가하였다. 구체적인 세포의 준비 및 영상화 방법은 상기 실험예 (2-1)에서 설명한 바와 같으며, 그 결과를 도 5 a, 5 c 및 도 6에 나타내었다.
도 5a, 5c 및 도 6에 나타난 바와 같이, MCF7 세포 및 A549에서 음성 대조군은 현저하게 낮아진 형광 비율 수준을 나타내었고, 양성 대조군은 현저하게 강화된 형광 비율 수준을 나타내었다. 상기 음성 대조군과 양성 대조군의 현저한 형광 비율 차이는 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물이 세포의 내생성 포름알데히드를 감지하기에 충분히 높은 민감도를 가짐을 나타낸다.
따라서, 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물은 고민감도로 세포의 내생성 포름알데히드의 검출할 수 있다.
(2-4). 조직의 내생성 포름알데히드의 검출 측정
조직의 내생성 포름알데히드를 검출할 수 있는지를 확인하기 위하여, 슬라이스된 조직 샘플에 probe 1을 단독으로 처리하여 실험하고, 비교를 위하여 음성 대조군 및 양성 대조군 실험을 수행하였다. 음성 대조군은 무처리세포(native cells)보다 포름알데히드의 수준을 낮추기 위하여 포름알데히드와 공유 복합체(covalent complex)를 형성하는 NaHSO3를 사용하여 조직의 전처리를 수행하였다. 양성 대조군은 무처리세포(native cells)보다 포름알데히드의 수준을 높이기 위하여 조직 외부에서 조직내부로 포름알데히드(exogenous formaldehyde source)를 첨가하였다. 구체적인 조직의 준비 및 영상화 방법은 상기 실험예 (2-3)에서 설명한 바와 같으며, 그 결과를 도 5b, 5d 및 도 7에 나타내었다.
도 5b, 5d 및 도 7에 나타난 바와 같이, 신장 및 폐 조직에서 음성 대조군은 현저하게 낮아진 형광 비율 수준을 나타내었고, 양성 대조군은 현저하게 강화된 형광 비율 수준을 나타내었다. 상기 음성 대조군과 양성 대조군의 현저한 형광 비율 차이는 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물이 조직의 내생성 포름알데히드를 감지하기에 충분히 높은 민감도를 가짐을 나타낸다.
따라서, 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물은 고민감도로 조직의 내생성 포름알데히드의 검출할 수 있다.
(2-5). 장기 조직의 내생성 포름알데히드 정량화 평가
본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물이 조직의 내생성 포름알데히드를 정량화할 수 있는지에 대하여 평가하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
조직의 내생성 포름알데히드를 정량화 할 수 있는지 평가하기 위하여, 먼저, 건강한 마우스의 뇌, 폐, 간, 신장 및 결장 기관을 적출하였다. 상기 각 기관들을 다섯 조직 슬라이스(각 기관당 3 마우스 × 5 슬라이스 = 각 기관당 총 15 조직 샘플)로 구분하고 각 슬라이스를 본 발명에 따른 실시예 1에서 제조한 probe 1 (10 μM)로 배양한 후, TPM을 사용하여 비율 기준 영상화를 수행하였다. 이광자 여기(λex = 760 nm)하에 블루(λem = 400-440 nm) 및 그린(λem = 470-550 nm) 채널(channels)로부터 발광을 수집하였다. 상기 조직 슬라이스의 중심점 주위의 2 μm 깊이 간격에서 5-10개의 단면도(cross-sectional images)을 수집하였다. 통상적인 스레홀드 값(common threshold values)을 설정한 후, 평균 화소 세기(mean pixel intensity)를 얻었다(각각 상하에서 5%). 각 조직의 영상화 데이터에 기초하여, 픽셀-투-픽셀 비율 기준 데이터 처리를 통해 조직의 포름알데히드 농도를 정량화하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8a 내지 8e에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물을 처리하여 장기 조직들은 블루 및 그린 채널에서 각각 다른 형광 세기를 나타냄을 확인할 수 있었고, 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물을 처리하여 장기 조직들 간의 포름알데히드 농도 수준을 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 조직 내부의 포름알데히드 농도 수준을 측정할 수 있음을 확인하였다. 이는 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물이 각 조직에서 포름알데히드의 농도 수준을 정량화할 수 있음을 나타내며, 조직 내부의 포름알데히드 농도 수준 또한 정량화할 수 있음을 나타낸다.
도 8f 및 8g에 나타난 바와 같이, 각 장기는 각기 다른 포름알데히드 농도 수준을 나타내는 것을 알 수 있었다(도 8f). 형광 세기 비율 값으로부터 포름알데히드 농도를 결정하기 위하여, 기준 커브(도 8g)를 얻었다. 상기 형광 세기 비율(IGreen/IBlue) 값은 포름알데히드 농도가 증가함에 따라 증가하는 것을 알 수 있다.
기준 커브에 기초하여, 각 장기의 내생성 포름알데히드 농도를 측정하였다(도 8e).
도 8h에 나타난 바와 같이, 뇌(약 600 μM), 폐(약 550 μM), 간(약 850 μM), 신장(약 450 μM) 및 결장(약 190 μM)에서 서로 다른 포름알데히드 농도를 나타내는 것을 알 수 있었으며, 실험 장기 조직 중, 간이 약 850 μM로 가장 높은 포름알데히드 농도를 나타냈고, 결장에서 약 190 μM로 가장 낮은 포름알데히드 농도를 나타냄을 확인할 수 있었다.
상기 실험 결과로부터 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용조성물을 사용하여 각 조직의 내생성 포름알데히드를 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 형광 분석을 통하여 농도를 정량화 하여 수치적으로 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
< 실험예 3> 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(probe 1)의 깊은 조직(결장의 움, 소장의 융모 및 움)에서의 내생성 포름알데히드 수준 측정 평가
본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물(probe 1)을 사용하여 장기 조직 뿐만 아니라 보다 깊은 조직인 결장움, 소장 융모 및 소장 움에서의 내생성 포름알데히드 수준을 측정할 수 있는지에 대하여 평가하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 9-11 및 표 1에 나타내었다.
본 실험을 위하여 Balb/C 타입 마우스(6 주령)를 사용하였다. 상기 마우스는 경추 탈골 후 해부하였다. 소장을 적출한 후, 섹션을 나누었다. 공장(jejunum) 0.5 cm 길이 및 결장 0.5 cm 길이의 섹션을 길이로 절개한 후, probe 1 용액(10 μM의 HEPES 버퍼, pH 7.4)에 침지시켰다. 37 °C에서 3시간 배양한 후, PBS 버퍼로 세번 세척하였다.
상기 염색된 샘플을 슬라이드 글래스에 놓았다. 조직 샘플의 형광 이미지는 이광자 현미경(TPM)으로 촬영하였다. TPM 영상화는 Ti-Sapphire laser (Chameleon Vision II, Coherent)를 사용하여 140 fs 펄스폭 및 80 MHz 펄스 반복률(TCS SP5 II, Leica, Germany)에서 20X 대물렌즈(obj. HCX PL APO 20×/ 1.10 W CORR CS, Leica, Germany)를 통하여 수행하였다. 상기 probe 1을 위하여 이광자 여기 파장은 760 nm로 조정하였다. 각각의 발광 빛은 두개의 채널 스펙트럼(λem , blue = 400-440 nm, λem , green = 470-550 nm)으로 해결되었으며, 상기 조직 샘플은 꽉 끼는 홀더에 장착하였다. 여기 레이저 전력은 약 9.3 mW이며, 상기 이미지는 1024 × 1024 픽셀로 구성하고, 주사 속도는 전체 영상 중 100 MHz로 유지하였다.
하기 표 1은 각 조직의 포름알데히드 농도를 정량화하여 나타낸 것이다.
결장의 움 영역 소장의 융모 영역 소장의 움 영역
포름알데히드 농도 161 μM 178 μM 494 μM
도 10a 내지 10c의 상단부 3D 표면 이미지에 나타난 바와 같이, 영상화 깊이의 한계로 인하여, 결장의 움 및 소장의 융모 영역이 내강측으로부터 영상화된 것과 달리 소장의 움은 내강 측의 반대로부터 영상화 되었다. 이에, 3D 영상으로부터는 융모 및 움을 명확히 확인하기 어려운 면이 있다.
도 10a 내지 10c의 중단부 오버레이드(Overlaid) 형광 이미지에 나타난 바와 같이, 두개의 채널(블루 채널, 그린 채널)으로 부터 단면 발광을 병합한 이미지는 움과 융모의 명확한 형태학적 구분을 나타냄을 알 수 있다.
도 10a 내지 10c의 하단부 픽셀-투-픽셀 비율기준(Pixel-to-pixel ratiometric (IGreen/IBlue))이미지에 나타난 바와 같이, 블루 발광에 대한 그린 발광의 픽셀-투-픽셀 세기 비율에 기초한 각 비율기준(IGreen/IBlue) 이미지는 각 조직에서의 목적하는 특정 위치의 포름알데히드 수준 정보를 정량적으로 제공함을 알 수 있다. 도 10a 하단부 이미지는 결장의 움 영역에서 약한 세기를 나타내는 비율기준 이미지를 나타내고 있으며, 이는 결장의 움 영역의 포름알데히드 농도가 낮음을 나타낸다. 도 10b의 하단부 이미지는 소장의 융모 영역에서 약한 세기를 나타내는 비율기준 이미지를 나타내고 있으나, 결장의 움 영역보다는 강한 비율 기준 이미지를 나타내고 있으며, 이는 소장의 융모 영역은 포름알데히드 농도가 낮으나 결장의 움 영역보다는 높음을 나타낸다. 도 10c의 하단부 이미지는 소장의 움 영역에서 소장의 융모 또는 결장의 움과 비교하여 현저하게 강한 형광 세기를 나타내는 이미지를 나타내고 있으며, 이는 소장의 움 영역의 포름알데히드 농도가 소장의 융모 및 결장의 움과 비교하여 높은 농도를 나타냄을 나타낸다.
형광 세기 비율 값으로부터 포름알데히드 농도를 결정하기 위하여, 상기 도 10a 내지 10c의 하단부 비율기준 이미지 데이터를 토대로 형광 세기 비율(도 11)을 얻었으며, 이를 토대로 결장의 움, 소장의 융모 및 움의 포름알데히드 농도를 정량화 하여 수치로 나타내었다(표 1).
소장의 움 영역에서 현저하게 높은 포름알데히드 농도를 나타내는 것은 소장의 움에 존재하는 파네스 세포(Paneth cell)가 해로운 미생물로부터 줄기세포를 보호하기 위하여 다양한 항균물질을 방출하는 것과 더불어 내생성 포름알데히드를 방출하여 포름알데히드의 농도를 높임으로써, 생체 보호물질로서 기능한다는 것을 시사한다.
따라서, 본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물이 근적외선 영역의 빛을 이용한 이광자 여기 조건에서 포름알데히드를 비율 기준 형광 영상화할 수 있어, 세포 또는 장기 조직에서 포름알데히드의 검출 및 농도 측정이 가능하므로, 내생성(endogenous) 포름알데히드의 검출 및 농도 측정, 나아가, 생체 내 포름알데히드의 생물학적 역할을 밝혀내는데 유용하게 사용할 수 있으며, 특히, 깊은 조직(결장의 움, 소장의 융모 또는 움)의 포름알데히드를 검출 또는 농도를 측정하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 조성물은 내생성(endogenous) 포름알데히드의 검출 및 농도 측정, 나아가, 생체 내 포름알데히드의 생물학적 역할을 밝혀내는데 사용될 수 있고, 특히, 깊은 조직(결장의 움, 소장의 융모 또는 움)의 포름알데히드를 검출 또는 농도를 측정하는데 사용될 수 있다.

Claims (17)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 포름알데히드 검출용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017010615-appb-I000008
    .
  2. 제1항에 있어서,
    상기 포름알데히드 검출용 조성물은 포름알데히드와 결합하여 이광자 흡수 형광체를 형성하는 특징으로 하는 포름알데히드 검출용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 포름알데히드 검출용 조성물은 포름알데히드와 반응하여 비율 기준 영상화가 가능한 것을 특징으로 하는 포름알데히드 검출용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 포름알데히드 검출용 조성물은 동물개체로부터 분리된 조직 또는 세포내의 포름알데히드를 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 포름알데히드 검출용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 포름알데히드 검출용 조성물은 동물개체로부터 분리된 창자의 융모 또는 움의 포름알데히드를 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 포름알데히드 검출용 조성물.
  6. 제1항의 포름알데히드 검출용 조성물을 동물개체로부터 분리된 조직 또는 세포에 처리하는 단계를 포함하는 조직 또는 세포의 포름알데히드 검출방법.
  7. 제1항의 포름알데히드 검출용 조성물을 동물개체로부터 분리된 창자의 융모 또는 움에 처리하는 단계를 포함하는 창자의 융모 또는 움의 포름알데히드 검출방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물은, 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,
    화학식 5로 표시되는 화합물과 화학식 6으로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 1);
    상기 단계 1에서 제조한 화학식 4로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 3으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 2);
    상기 단계 2에서 제조한 화학식 3으로 표시되는 화합물을 화학식 7로 표시되는 화합물과 반응시켜 화학식 2로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 3); 및
    상기 단계 3에서 제조한 화학식 2로 표시되는 화합물을 화학식 8로 표시되는 알릴마그네슘브로마이드와 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 4);를 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 포름알데히드 검출용 조성물:
    [반응식 1]
    Figure PCTKR2017010615-appb-I000009
    .
  9. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 포름알데히드 농도 측정용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017010615-appb-I000010
    .
  10. 제9항에 있어서,
    상기 포름알데히드 농도 측정용 조성물은 포름알데히드와 결합하여 이광자 흡수 형광체를 형성하는 것을 특징으로 하는 포름알데히드 농도 측정용 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 포름알데히드 농도 측정용 조성물은 포름알데히드와 반응하여 비율 기준 영상화가 가능한 것을 특징으로 하는 포름알데히드 농도 측정용 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 포름알데히드 농도 측정용 조성물은 포름알데히드 농도 측정을 통하여 농도를 정량화할 수 있는 것을 특징으로 하는 포름알데히드 농도 측정용 조성물.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 포름알데히드 농도 측정용 조성물은 동물개체로부터 분리된 조직 또는 세포의 포름알데히드 농도를 측정할 수 있는 것을 특징으로 하는 포름알데히드 농도 측정용 조성물.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 포름알데히드 농도 측정용 조성물은 동물개체로부터 분리된 창자의 융모 또는 움의 포름알데히드 농도를 측정할 수 있는 것을 특징으로 하는 포름알데히드 농도 측정용 조성물.
  15. 제9항의 포름알데히드 농도 측정용 조성물을 동물개체로부터 분리된 조직 또는 세포에 처리하는 단계를 포함하는 조직 또는 세포의 포름알데히드 농도 측정 방법.
  16. 제9항의 포름알데히드 농도 측정용 조성물을 동물개체로부터 분리된 창자의 융모 또는 움에 처리하는 단계를 포함하는 창자의 융모 또는 움의 포름알데히드 농도 측정 방법.
  17. 제9항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물은, 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,
    화학식 5로 표시되는 화합물과 화학식 6으로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 1);
    상기 단계 1에서 제조한 화학식 4로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 3으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 2);
    상기 단계 2에서 제조한 화학식 3으로 표시되는 화합물을 화학식 7로 표시되는 화합물과 반응시켜 화학식 2로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 3); 및
    상기 단계 3에서 제조한 화학식 2로 표시되는 화합물을 화학식 8로 표시되는 알릴마그네슘브로마이드와 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계(단계 4);를 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 포름알데히드 농도 측정용 조성물:
    [반응식 1]
    Figure PCTKR2017010615-appb-I000011
    .
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