CN109942533B

CN109942533B - 一类香豆素腙化合物、其制备方法及应用

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Publication number: CN109942533B
Application number: CN201711386427.XA
Authority: CN
Inventors: 李新; 韩益丰; 梁星光; 卢应梅; 韩峰; 胡永洲
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2017-12-20
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2037-12-20
Also published as: CN109942533A

Abstract

本发明涉及一类选自下列化合物的香豆素腙化合物、其制备方法和应用。本发明的香豆素腙化合物或其盐本身只有微弱的荧光，但可与甲醛特异性快速反应，生成具有强荧光的产物，且荧光强度与甲醛浓度间存在线性相关，从而实现对甲醛的特异性检测和定量分析。本发明的香豆素腙化合物或其盐适用于环境中甲醛含量测定，细胞及组织中甲醛的标记成像，生物样本如组织匀浆液、血浆、尿液、唾液等样本中甲醛含量测定，以及食品、化妆品、衣物等生活样品中甲醛含量的测定。

Description

一类香豆素腙化合物、其制备方法及应用

技术领域

本发明属环境分析化学及生物检测领域，涉及一类香豆素腙化合物、其制备方法、作为检测甲醛的荧光探针分子的应用、在检测环境中及生物样本中甲醛含量中的应用。

背景技术

甲醛是一种无色气体，有特殊的刺激气味，对人眼、鼻等有刺激作用。环境中高浓度的甲醛对人体有致敏、致畸和致癌等毒性，甲醛因而在2006年被确定为1类致癌物。因此，检测环境中，尤其是家具、新装修空间、新衣物材料、甚至食品中的甲醛含量是一项重要且有实际意义的工作。

环境中高浓度甲醛的毒性作用在国内外已被深入研究。然而与之相反的是，近年来人们发现人体几乎所有细胞中均存在内源性甲醛！以大脑组织为例，研究发现，大脑组织中的生理内源性甲醛处于较高水平，其中皮层组织中甲醛浓度为0.2mmol/L左右，海马组织为0.4mmol/L左右，提示其可能参与到大脑正常的生理活动中；而大脑细胞中内源性甲醛的异常聚集可在醛酮应激、氧化应激等各种诱导因素的作用下，造成神经细胞功能障碍、变性死亡，导致学习、记忆功能障碍。目前，由于缺乏甲醛在生物原位环境中准确、简便定量分析的检测方法，甲醛的生理性和病理性作用研究受到极大限制。如何简便易行地检测和评估内源性甲醛的浓度水平和组织分布特征，对于预测和评估相关疾病的进展和程度，有着重要的临床意义。然而，常规的检测方法如分光光度法、色谱分析法等在医学和生命科学领域的应用存在诸多限制，如检测灵敏度较差，难以实现活细胞或活体组织中甲醛的实时在线检测等，这使得甲醛在活体生物样本中的生理及病理作用研究受到限制。因此，开发适用于复杂活体生物样本的灵敏度高、选择性好的甲醛快速分析检测方法对研究内源性甲醛的生理病理作用具有重要的意义。

小分子荧光探针是检测细胞内分子事件的高效工具之一。小分子荧光探针检测法具有灵敏度高，选择性好等优点，兼之小分子探针通常具有良好的生物膜通透性，且可通过调整结构优化其在生物体内的吸收代谢性质，因此更适用于活细胞/活组织中微量代谢分子的检测。目前仅有少量用于甲醛检测的荧光探针被报导，而多数存在着检测反应慢、灵敏性差的问题，且在检测甲醛的同时会消耗部分甲醛，从而扰动生物样本中内源性甲醛的浓度。因此，发展高灵敏性、且不会扰动内源性甲醛浓度的新型荧光探针，是目前探针研究领域的前沿和热点。

发明内容

本发明的一个方面，提供了一类选自下列化合物的香豆素腙化合物或其盐：

其中：

R₁各自独立地选自氢、卤素、氰基、-C(＝O)R₄、取代或未取代的C₁-C₄烷基、取代或未取代的C₁-C₄烷氧基、取代或未取代的C₆-C₁₀芳基，和取代或未取代的5-10员芳香杂环基；

R₂各自独立地选自氢和甲基；

R₃为N(R₅)₂或取代或未取代的5-10员杂环基，优选为N(R₅)₂、

R₄为羟基、取代或未取代的C₁-C₄烷氧基或-N(R₅)₂；

R₅各自独立地选自氢和C₁-C₄烷基，优选为氢或甲基。

本申请中，

C₆-C₁₀芳基指的是环上具有6-10个碳原子的芳香性碳环，例如苯基和萘基；

5-10员芳香杂环基指的是环上具有5-10个原子且包含选自N、O和S的1至4个杂原子的芳香性杂基，例如呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡啶基、咪唑基、吡唑基等

所述芳基或芳香杂环基上的取代基可以选自卤素、氰基、羟基、硝基、取代或未取代的C₁-C₄烷基、取代或未取代的C₁-C₄烷氧基、-C(＝O)R₄(R₄的定义与前述相同)等；

卤素指的是氟、氯、溴、碘，优选为氟或氯；

C₁-C₄烷基指的是具有1至4个碳原子的直链或直链烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基；

C₁-C₄烷氧基指的是具有1至4个碳原子的直链或直链烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基和叔丁氧基；

取代的C₁-C₄烷基和取代的C₁-C₄烷氧基上的取代基可以选自卤素、羟基、硝基、氰基、羧基、氨基等；特别地，取代的C₁-C₄烷基和取代的C₁-C₄烷氧基可以分别为三氟甲基和三氟甲氧基。

在优选的实施方案中，本发明的香豆素腙化合物选自下列化合物：

本发明的另一方面提供了本发明的香豆素腙化合物的制备方法，包括：

(1)将式Ia、IIa的化合物与劳森试剂反应；和

(2)将步骤(1)产物与水合肼反应得到本发明的香豆素腙化合物，

其中，R₁、R₂、R₃的定义与前述相同。

上述步骤(1)的反应可以在有机溶剂(例如干燥的甲苯)中进行，例如可以在回流条件下进行。上述步骤(2)可以在有机溶剂(例如乙醇)中进行，例如可以在回流条件下进行。反应完毕后可以经萃取、浓缩、及柱层析纯化得到本发明的香豆素腙化合物。

本发明的香豆素腙化合物或其盐是一类新型的特异性小分子荧光探针，其特征在于它本身只有微弱的荧光，但可与甲醛特异性快速反应，生成具有强荧光的产物，且荧光强度与甲醛浓度间存在线性相关，从而实现对甲醛的特异性检测和定量分析。因此，本发明的香豆素腙化合物或其盐适用于环境中甲醛含量测定，细胞及组织中甲醛的标记成像，生物样本如组织匀浆液、血浆、尿液、唾液等样本中甲醛含量测定，以及食品、化妆品、衣物等生活样品中甲醛含量的测定。

因此，本发明的再一方面提供了本发明的香豆素腙化合物或其盐作为荧光探针分子的应用，特别是作为检测甲醛的荧光探针分子的应用。所述甲醛可以是环境中的甲醛、生物样本中的甲醛、或生活样品中的甲醛。所述环境可以是室内环境或室外环境。所述生物样本例如可以为细胞代谢液、尿液、血液、唾液等。所述生活样品例如可以为食品、化妆品、衣物等。

本发明的再一方面提供了一种荧光探针，特别是检测甲醛的荧光探针，其包含本发明的香豆素腙化合物或其盐作为荧光探针分子。

本发明的又一方面提供一种检测环境中甲醛含量的方法，包括：

(1)获取本发明的香豆素腙化合物或其盐对甲醛浓度的工作曲线；

(2)将本发明的香豆素腙化合物或其盐的溶液置于待检测环境中经规定时间后测其荧光强度，并利用工作曲线计算环境中的甲醛含量。

获取上述工作曲线的方法是本领域技术人员公知的，例如可以如下得到：制备本发明的香豆素腙化合物或其盐的水溶液；将上述溶液分若干份，分别置于密闭环境中，并在环境中充入一系列浓度的甲醛，经规定时间后测其荧光强度；以及以荧光强度对甲醛浓度作图，得工作曲线。所述规定时间例如可以是1min以上，例如5min，10min，15min，30min，60min，120min，180min，240min等。

本发明的又一方面提供本发明的香豆素腙化合物或其盐在生物样本荧光成像中的应用。以活细胞中的应用为例，可通过以下步骤实现生物样本荧光成像：细胞培养基中加入本发明的香豆素腙化合物或其盐，例如使其终浓度为5～100μM，37℃下孵育30分钟，观察记录细胞荧光强度。

本发明的又一方面提供检测生物样本中甲醛含量的方法，包括：收集生物样品，加入本发明的香豆素腙化合物或其盐，经规定时间后检测生物样品中的荧光强度。所述生物样品可以为细胞代谢液、尿液、血液、唾液等。所述规定时间例如可以是1min以上，例如5min，10min，15min，30min，60min等。

本发明的又一方面提供用于检测甲醛含量的组合物，其含有本发明的香豆素腙化合物或其盐。所述组合物例如可以是含有本发明的香豆素腙化合物或其盐的试纸、探针溶液、试剂盒等。

本发明涉及的香豆素腙化合物或其盐作为检测甲醛的荧光探针分子具有以下有益效果：

(1)稳定性好，能够长期保存使用；

(2)荧光信号亮度高，检测信噪比高，灵敏度好；

(3)激发与发射波长间具有大的斯托克斯(stokes)位移，检测结果背景干扰小；

(4)具有优秀的选择性，能在复杂生物样品中特异性地检测甲醛；

(5)具有良好的生物膜通透性，因而能用于活细胞中甲醛的检测；

(6)检测反应快速，对水溶液中的甲醛，1分钟内可给出检测结果；

(7)检测响应具有可逆性，信号强度会随着待检物种中甲醛含量的增加而增强，随着待检物种中甲醛含量的降低而减弱，适合生物体中内源性甲醛的实时示踪。

附图说明

图1是实施例1-3的化合物与对比例化合物1-4对甲醛荧光响应的特异性比较。

图2是实施例1-3的化合物与对比例化合物1-4置通风环境中的荧光变化。

图3是实施例1-3的化合物与对比例化合物1-4检测新橱柜中甲醛能力的比较。

图4是实施例1-3的化合物与对比例化合物1-4检测人大脑微血管内皮细胞中的内源性甲醛的比较。

图5是显示实施例1-3的化合物与对比例化合物1-4检测APP小鼠脑片活组织海马区域的内源性甲醛的图。

图6是实施例1-3的化合物检测人血管内皮细胞培养液上清中甲醛的图。

图7是实施例1-3的化合物检测人尿液中甲醛含量的图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，以下的实施例不限制本发明的范围。

实施例1：I-1的制备

化合物I-1a和劳森试剂在干燥的甲苯中回流反应。反应结束，冷却过滤，滤液旋干溶剂后溶于乙醇，加入80％水合肼，回流反应。反应完毕，旋干溶剂，加入水，以二氯甲醛萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化，得I-1(产率65％)。LC-MS：m/z 256.145[M+H]⁺。

实施例2：II-1的制备

化合物II-1a和劳森试剂在干燥的甲苯中回流反应。反应结束，冷却过滤，滤液旋干溶剂后溶于乙醇，加入80％水合肼，回流反应。反应完毕，旋干溶剂，加入水，以二氯甲醛萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化，得II-1(产率68％)。LC-MS：m/z254.1293[M+H]⁺。

实施例3：II-2的制备

化合物II-2a和劳森试剂在干燥的甲苯中回流反应。反应结束，冷却过滤，滤液旋干溶剂后溶于乙醇，加入80％水合肼，回流反应。反应完毕，旋干溶剂，加入水，以二氯甲醛萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化，得II-2(产率73％)。LC-MS：m/z296.1340[M+H]⁺。

对比例1-4

按照CN 106632188 A中公开的方法，采用与最终产物对应的原料化合物制备了下列化合物1-4：

LC-MS：m/z

化合物1：232.1453[M+H]⁺；化合物2：191.0820[M+H]⁺；

化合物3：230.1296[M+H]⁺；化合物4：217.0980[M+H]⁺。

实验例1：荧光探针分子与甲醛反应前后的荧光变化

将实施例1-3和对比例1-4的化合物用作探针分子，分别以少量DMSO溶解，分别加入甲醛的PBS溶液，使探针分子的终浓度为10μM，甲醛终浓度为200μM，同时进行仅加入PBS缓冲液的空白实验。反应10min后使用荧光分光光计以405nm激发，记录溶液在最大发射波长下的荧光强度，进而确定探针分子与甲醛反应后荧光强度增强，结果列入下表1中。

表1

由表1可以看出，实施例1-3中化合物较对比例化合物1-4对相同浓度的甲醛呈现出更为显著的荧光增强；再者，实施例1-3化合物的发射波长较对比例化合物显著红移，激发与发射光间的斯托克斯位移显著增大，可有效避免激发光散射造成的误差，从而增加了检测的灵敏度。

实验例2：荧光探针分子对甲醛的选择性

将实施例1-3和对比例1-4的化合物用作探针分子，将乙醛、苯甲醛、乙二醛、丙酮酸、草酰乙酸、葡萄糖醛、半胱氨酸、谷胱甘肽、硫化钠、双氧水作为可能干扰甲醛分析的待测样品。

将探针分子以少量DMSO溶解，再加入PBS缓冲液配制成溶液，分别加入PBS缓冲液溶解的各类可能干扰甲醛分析的待测样品或甲醛，使探针分子的终浓度为10μM，各待测样品和甲醛终浓度为200μM。反应30min后使用荧光分光光计以405nm激发，记录溶液在最大发射波长下的荧光强度，进而确定探针分子对甲醛的选择性，结果如图1所示。

由图1可以看出，实施例1-3的化合物对甲醛响应最为灵敏；同对比例化合物1-4相比，实施例1-3的化合物对甲醛的相对选择性更好。

实验例3：荧光探针分子对甲醛浓度依赖性荧光增强

将实施例1-3和对比例1-4的化合物用作探针分子。

将探针分子以少量DMSO溶解，再加入PBS缓冲液配制成溶液，分别加入不同浓度的甲醛溶液，使探针分子的终浓度为10μM，反应10min后使用荧光分光光计以405nm激发，记录溶液在最大发射波长下的荧光强度，进而确定探针分子对甲醛浓度依赖性荧光增强。根据浓度曲线计算检测限，结果如下表2所示：

表2

由表3可以看出，实施例1-3中化合物较对比例化合物1-4对甲醛具有更低的检测限，表明其具有更高的灵敏度。

实验例4：荧光探针分子检测新橱柜中甲醛含量

将实施例1-3和对比例1-4的化合物用作探针分子。将探针分子以少量DMSO溶解，再加入PBS缓冲液配制成探针溶液。

96孔培养板中加入浓度为10μM的探针溶液，避光，开盖分别放置于通风环境和新橱柜中。使用多功能酶标仪以405nm激发，在5min，10min，15min，30min，60min，120min，180min和240min检测探针溶液在最大发射波长下的荧光强度，通风环境的检测结果如图2所示，新橱柜的检测结果如图3所示。

如图2所示，探针溶液放置于通风环境中后无显著变化。然而，如图3所示，探针溶液放置于新橱柜中5min时，荧光强度显著上升，此后随时间延长不断上升。这提示，实施例1-3和对比例1-4的化合物能快速灵敏地检测出空气环境中的甲醛。此外，从结果看，实施例1-3的化合物具有更高的灵敏性。

实验例5：荧光探针分子检测人大脑微血管内皮细胞中的内源性甲醛

将实施例1-3和对比例1-4的化合物用作探针分子。将探针分子以少量DMSO溶解配制成探针溶液。

大脑微血管内皮细胞接种于载玻片上，CO₂细胞培养箱中培养至80％左右融合率。实验分为8组，无探针组，实施例1-3组，对比例1-4组。甲醛检测实验通过在培养基中加入探针溶液使探针分子最终浓度为10μM，然后与细胞孵育15min。进行上述处理后，激光共聚焦显微镜观察细胞荧光强度变化。结果见图4。

如图4所示，实施例1-3的化合物较对比例化合物1-4的荧光染色结果更亮，说明其具有更高的灵敏性。

实验例6：荧光探针分子检测APP小鼠脑片活组织海马区域的内源性甲醛

将实施例1-3的化合物用作探针分子。将探针分子以少量DMSO溶解配制成探针溶液。

C57BL/6小鼠或老年痴呆模型APP转基因小鼠快速断头处死，取出大脑并放入4℃人工脑脊液1中。人工脑脊液1成分为(mM)：75蔗糖，87NaCl，2.5KCl，15NaH₂PO₄，7MgCl₂，0.5CaCl₂，25NaHCO₃和25葡萄糖。振动切片机平台中灌入合适4℃人工脑脊液1，将大脑放置于切片机平台，切取含有大脑海马区域的300μm厚度的冠状缝切面脑片，转移至通入95％O₂和5％CO₂的4℃人工脑脊液2中30min备用。人工脑脊液2成分为(mM)：124NaCl，3KCl，1.25NaH₂PO₄，1.0MgSO₄，2CaCl₂和26NaHCO₃。所得脑片分为八组，第1组为对照组，第2-8组为实施例1-3及对照化合物1-4染色组，通过以下方式完成：人工脑脊液2中加入探针溶液，使探针分子浓度为20μM，然后孵育C57BL/6小鼠脑片30min，进行上述处理后脑片用PBS清洗3次，激光共聚焦显微镜观察脑片荧光强度。结果见图5。

如图5所示，实施例1-3化合物的荧光染色强度显著高于对比例化合物1-4，这提示本小分子荧光探针能够可视化检测出活组织脑片中内源性甲醛，且较对比例化合物具有更高的灵敏性。

本结果表明，根据本发明的化合物作为探针分子可以用于病理模型中内源性甲醛的可视化检测。

实验例7：荧光探针分子检测人血管内皮细胞培养液上清中甲醛

本实验分为两组：无细胞组和有细胞组，无细胞组为6孔板内加入正常细胞全培养液2mL，不种入细胞；有细胞组为6孔板内加入正常细胞全培养液2mL，种入50000个血管内皮细胞EA.hy926。培养24h后，吸取两组培养液200μL至96孔培养板中，加入探针溶液使探针分子最终浓度为5μM，孵育15min。使用多功能酶标仪以405nm激发，检测探针溶液在最大发射波长下的荧光强度，结果见图6。

如图6所示，培养细胞的培养液组荧光强度显著高于无细胞的单培养液组，这提示根据本发明的化合物作为荧光探针分子能快速灵敏地检测出培养液中细胞代谢产生的甲醛。

实验例8：荧光探针分子检测人尿液中甲醛含量

取晨起空腹中段尿液10mL，立即4℃，3000rpm离心10min，吸取200μL上清尿液至96孔培养板中并加入探针溶液使探针分子最终浓度为5μM，多功能酶标仪检测尿液中荧光强度，同时设不加入探针分子的对照组，结果见图7。

如图7所示，检测组荧光强度显著高于对照组，这提示根据本发明的化合物作为荧光探针分子能快速灵敏地检测出尿液中甲醛含量。

Claims

1.选自下列化合物的香豆素腙化合物或其盐：

其中：

R₁各自独立地选自氢和C₁-C₄烷基；

R₂各自独立地选自氢和甲基；

R₃为N(R₅)₂或未取代的5-10元杂环基；

R₅各自独立地选自氢和C₁-C₄烷基。

2.权利要求1所述的香豆素腙化合物或其盐，其中，R₃为

。

3.权利要求1所述的香豆素腙化合物或其盐，其中，R₅各自独立地为氢或甲基。

4.权利要求1所述的香豆素腙化合物或其盐，其中所述香豆素腙化合物选自下列化合物：

。

5.权利要求1-4中任一项所述的香豆素腙化合物的制备方法，包括：

（1）将式Ia、IIa的化合物与劳森试剂反应；和

（2）将步骤（1）产物与水合肼反应得到香豆素腙化合物，

其中，R₁、R₂、R₃的定义与相应权利要求中相同。

6.权利要求1-4中任一项所述的香豆素腙化合物或其盐作为荧光探针分子的非疾病诊断和治疗目的的应用，其中，所述应用是作为检测甲醛的荧光探针分子的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述甲醛是环境中的甲醛、生物样本中的甲醛或生活样品中的甲醛；所述环境是室内环境或室外环境；所述生物样本选自细胞代谢液、尿液、血液、唾液；所述生活样品选自食品、化妆品、衣物。

8.一种荧光探针，其包含权利要求1-4中任一项所述的香豆素腙化合物或其盐作为荧光探针分子。

9.根据权利要求8所述的荧光探针，其是检测甲醛的荧光探针。

10.一种检测环境中甲醛含量的方法，包括：

（1）获取权利要求1-4中任一项所述的香豆素腙化合物或其盐对甲醛浓度的工作曲线；

（2）将权利要求1-4中任一项所述的香豆素腙化合物或其盐的溶液置于待检测环境中经规定时间后测其荧光强度，并利用工作曲线计算环境中的甲醛含量。

11.权利要求1-4中任一项所述的香豆素腙化合物或其盐作为检测甲醛的荧光探针分子在生物样本荧光成像中的非疾病诊断和治疗目的的应用。

12.一种检测生物样本中甲醛含量的非疾病诊断和治疗目的的方法，包括：收集生物样品，加入权利要求1-4中任一项所述的香豆素腙化合物或其盐，经规定时间后检测生物样品中的荧光强度。

13.一种用于检测甲醛含量的组合物，其含有权利要求1-4中任一项所述的香豆素腙化合物或其盐。