CN105441065A - 检测次氯酸根离子的荧光探针及其制备方法与使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测次氯酸根离子的荧光探针及其制备方法与使用方法。本发明利用2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑构筑经典的ESIPT体系，并在5’-位直接引入偶氮苯基部分，使其更具生物和光学稳定性。当存在次氯酸根的条件下，偶氮苯基被氧化，进而使探针分子发出强荧光，本发明提供的2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑类染料的“开-关”型次氯酸根探针及其专用检测试剂盒对次氯酸根溶液具有良好的响应，并能够实现对细胞内次氯酸根的检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测次氯酸根离子的荧光探针及其制备方法与使用方法。
背景技术
次氯酸根(ClO-)是一种常见的非亲核性氧化剂，是工业和日常生活中广泛使用的清洁剂和抗菌剂的主要成分，也是生物体免疫系统最关键的活性氧物种(ROS)。在生命体内，次氯酸根(ClO-)参与了细胞内氧化还原反应和多种信号传导过程，包括血管舒张、心肌收缩、神经传递和胰岛素分泌等。而当细胞内次氯酸根(ClO-)处于非正常水平时将导致一系列生理疾病，例如关节炎、神经衰弱和癌症等(参见Imada,I.；Sato,E.F.；Miyamoto,M.；Ichimori,Y.；Minamiyama,Y.；Konaka,R.；andInoue,M.Anal.Biochem.,1999,271,53-58；Shepherd,J.；Hilderbrand,S.A.；Waterman,P.；Heinecke,J.W.；Weissleder,R.；andLibby,P.Chem.Biol.,2007,14,1221-1231)。因此，有效地检测或监控生物样品或环境样品中的次氯酸根(ClO-)已成为近年来相关领域的研究热点。
荧光检测法由于其优秀的检测灵敏度和选择性，并能实现对生物样品的实时、在线检测而受到研究者的广泛关注。2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑类荧光分子因其具有良好的光稳定性、高摩尔消光系数和量子产率以及具有独特的激发态分子内质子转移(ESIPT)等独特光学性质而成为该方法最重要的荧光母体之一，在多种待测分子的荧光检测中得到了广泛的应用。
目前已开发的用于检测次氯酸根(ClO-)的小分子荧光探针主要基于次氯酸根(ClO-)与还原性官能团之间的特异性化学反应而设计的。当存在次氯酸根(ClO-)的条件下，探针分子中的还原性官能团(如：硫醚，硒醚，肟，亚胺等等)被次氯酸根(ClO-)氧化为高价态原子(如硫醚和硒醚等)或是发生键的断裂(如：肟，亚胺等等)，导致探针分子的荧光性质发生变化，从而实现对次氯酸根(ClO-)的特异性设别。
然而，基于硫醚，硒醚为探针报告基团的探针(参见Yu,F.；Li,P.；Li,G.；Zhao,G.；Chu,T.；Han,K.J.Am.Chem.Soc.,2011,133,11030-11033；Manjare,S.T.；Kim,S.；Heo,W.D.；Churchill,D.G.Org.Lett.,2014,16,410-412)易受到生物体中其它活性氧物种(ROS)的影响。而基于肟，亚胺等为探针报告基团的探针由于亚胺在酸性条件下易于水解而易受到pH环境的影响，不利于其在复杂的生物体内进行检测。因此亟须一种新颖的、具有良好生物稳定性的且能实现生物体内在线检测的次氯酸根(ClO-)荧光探针。
发明内容
本发明为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明旨在提供一种检测次氯酸根离子的荧光探针及其制备方法与使用方法。
本发明的核心在于利用2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑构筑经典的ESIPT体系，并在5’-位直接引入偶氮苯基部分，使其更具生物和光学稳定性。探针本身的ESIPT效应被偶氮苯基抑制而无荧光发射，但当存在次氯酸根(ClO-)的条件下，偶氮基被次氯酸根(ClO-)氧化，进而使其抑制作用消失，探针分子发射出强荧光，通过上述方案，获得了“开-关”型的荧光响应，实现了对次氯酸根(ClO-)的高灵敏、特异性检测。
本发明为一种检测次氯酸根(ClO-)的荧光探针，结构式为式(I)或者式(II)，式(I)为2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑-5’-偶氮苯衍生物；
式(I)中，R为氢，或甲氧基，或羟基，或氯，或氟，或硝基，或羧基，或磺酸基中的任何一种。
(II)所示化合物(SC1)：
一种检测次氯酸根(ClO-)的荧光探针的制备方法，该方法包括如下步骤：
步骤一：在弱碱性条件下，式(III)所示水杨醛与式(IV)所示苯基重氮化合物在水中反应得到式(V)所示取代的5-偶氮基苯基水杨醛；
式(IV)与式(V)中，R为氢，或甲氧基，或羟基，或氯，或氟，或硝基，或羧基，或磺酸基中的任何一种。
步骤二：在惰性气氛下，在双氧水的存在下，式(V)所示化合物与2-氨基苯硫酚在醇中反应即得式(I)所示化合物；
步骤一中所述式(III)所示水杨醛和式(IV)所述苯基重氮化合物的摩尔比为1～10:1；所述苯基重氮化合物为氯盐；步骤一的反应温度为-10～25度；反应时间为0.1～5小时；
作为优选步骤一的反应温度为0度；反应时间为0.5小时；式(III)所示水杨醛和式(IV)所述苯基重氮化合物的摩尔比为2:1；
步骤二中所述醇为甲醇，乙醇，叔丁醇，异丙醇；式(V)所示取代的5-偶氮基苯基水杨醛和所述2-氨基苯硫酚的摩尔比为0.5～2:1；步骤二的反应温度为0～50度；反应时间为1～20小时；
作为优选该步骤二的反应温度为30度，反应时间为5小时，醇为乙醇；式(V)所示取代的5-偶氮基苯基水杨醛和所述2-氨基苯硫酚的摩尔比为0.8：1；
一种检测次氯酸根(ClO-)的荧光探针的使用方法；该方法具体包括以下步骤：
步骤1：向不同浓度次氯酸根(ClO-)的缓冲溶液中加入相同浓度的式(I)所示化合物，配置至少5种不同次氯酸根(ClO-)含量的含有式(I)所示化合物的标准溶液；
所示缓冲溶液以是磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、HEPES缓冲溶液或硼酸-硼酸钠缓冲溶液；
所示标准溶液的pH值为5～11；
所示标准溶液中式(I)所示化合物的浓度为1nM～1μM；
所示标准溶液中次氯酸根(ClO-)的含量为0.1nM～1mM；
步骤2：分别测定所述标准溶液的荧光发射光谱，激发波长为400nm，以次氯酸根(ClO-)浓度为横坐标，以I466为纵坐标，建立标准曲线；
I466表示所述标准溶液在波长为466nm处的荧光发射峰强度值；
步骤3：向待测样品中加入式(I)所示化合物，控制其浓度与所述标准溶液中式(I)所示化合物的浓度相等；测定其在激发波长为400nm的激发光下的荧光发射谱，即根据标准曲线计算得出待测样品的次氯酸根(ClO-)含量。
本发明具有如下特点：
1)本发明提供的荧光探针是黄色固体粉末，分子结构的中偶氮基团保证了探针的结构和光学稳定性。
2)本发明提供的荧光探针，其溶液对次氯酸根(ClO-)的浓度敏感，随着次氯酸根(ClO-)浓度的增加，紫外灯下观察到其水溶液的荧光由无色变为蓝色。
3)本发明提供的荧光探针，其发射波长为466nm，为荧光“开-关”型响应，能大大消除检测时检测条件差异对结果的影响，提高检测的灵敏度。
4)本发明提供的荧光探针对次氯酸根(ClO-)浓度呈线性关系，可用于次氯酸根(ClO-)的精确测量。
本发明提供的2-(2’-羟基苯基)苯并噻唑-偶氮类染料的“开-关”型次氯酸根(ClO-)探针及其试剂盒对次氯酸根(ClO-)溶液具有良好的响应，能够实现对细胞内次氯酸根(ClO-)的检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点。
附图说明
图1为实施例1制备的荧光探针SC1的合成路线。
图2为实施例6制备的SC1试剂盒对次氯酸根(ClO-)水溶液的颜色响应图。
图3为实施例6制备的SC1试剂盒对不同次氯酸根(ClO-)水溶液的荧光响应图。
图4为实施例6制备的SC1试剂盒在波长466nm下的荧光发射强度与次氯酸根(ClO-)浓度关系曲线。
图5为实施例6制备的SC1试剂盒对常见共存离子或生物小分子的荧光响应图。
图6为实施例6制备的SC1试剂盒对细胞内次氯酸根(ClO-)的荧光成像图；其中，(a)为未加SC1之前的细胞荧光成像图；(b)为加入SC1后的细胞荧光成像图；(c)为加入SC1和次氯酸根(ClO-)后细胞荧光成像图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
如图1所示，实施例1、荧光探针SC1的制备
步骤a)：在0度下，将6.10g水杨醛加入到300mL5％氢氧化钠的水溶液中，再向溶液中滴加3.51g苯基重氮氯盐，搅拌反应0.5小时后有大量黄色固体析出，过滤，冷水洗涤三次，得到中间体式(V)所示取代的5-偶氮基苯基水杨醛6.90g(产率为61％)。
步骤b)：在惰性气氛下，将0.40g5-偶氮基苯基水杨醛和0.28g2-氨基苯硫酚加入到7mL乙醇中，室温搅拌反应5小时后，向体系中加入20mL水，有大量黄色固体析出，过滤，洗涤，真空干燥，得到最后产物SC1420mg(产率为57％)，黄色固体。
1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.30(d,J＝2.1Hz,1H),8.03–7.97(m,2H),7.94–7.88(m,3H),7.55–7.49(m,3H),7.47(d,J＝7.0Hz,1H),7.42(t,J＝7.8Hz,1H),7.20(d,J＝8.9Hz,1H)；13CNMR(100MHz,Chloroform-d)δ168.92,160.54,152.58,151.58,145.72,132.71,130.70,129.12,126.88,126.24,125.86,124.90,122.70,122.27,121.65,118.68,116.75；HRMS(ESI-TOF):m/z331.0781[M+H]+,calc’d.331.0779。
实施例2、荧光探针SC1的制备
步骤a)：在-10度下，将5.00g水杨醛加入到300mL5％氢氧化钠的水溶液中，再向溶液中滴加5.76g苯基重氮氯盐，搅拌反应0.1小时后有大量黄色固体析出，过滤，冷水洗涤三次，得到中间体式(V)所示取代的5-偶氮基苯基水杨醛2.30g(产率为25％)。
步骤b)：在惰性气氛下，将0.40g5-偶氮基苯基水杨醛和0.44g2-氨基苯硫酚加入到7mL甲醇中，于0度下搅拌反应1小时后，向体系中加入20mL水，有大量黄色固体析出，过滤，洗涤，真空干燥，得到最后产物SC1270mg(产率为23％)，黄色固体。
1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.30(d,J＝2.1Hz,1H),8.03–7.97(m,2H),7.94–7.88(m,3H),7.55–7.49(m,3H),7.47(d,J＝7.0Hz,1H),7.42(t,J＝7.8Hz,1H),7.20(d,J＝8.9Hz,1H)；13CNMR(100MHz,Chloroform-d)δ168.92,160.54,152.58,151.58,145.72,132.71,130.70,129.12,126.88,126.24,125.86,124.90,122.70,122.27,121.65,118.68,116.75；HRMS(ESI-TOF):m/z331.0781[M+H]+,calc’d.331.0779。
实施例3、荧光探针SC1的制备
步骤a)：在25度下，将5.00g水杨醛加入到300mL5％氢氧化钠的水溶液中，再向溶液中滴加0.58g苯基重氮氯盐，搅拌反应5小时后有大量黄色固体析出，过滤，冷水洗涤三次，得到中间体式(V)所示取代的5-偶氮基苯基水杨醛1.80g(产率为20％)。
步骤b)：在惰性气氛下，将0.40g5-偶氮基苯基水杨醛和0.10g2-氨基苯硫酚加入到7mL叔丁醇中，于50度下搅拌反应20小时后，向体系中加入20mL水，有大量黄色固体析出，过滤，洗涤，真空干燥，得到最后产物SC1120mg(产率为41％)，黄色固体。
1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.30(d,J＝2.1Hz,1H),8.03–7.97(m,2H),7.94–7.88(m,3H),7.55–7.49(m,3H),7.47(d,J＝7.0Hz,1H),7.42(t,J＝7.8Hz,1H),7.20(d,J＝8.9Hz,1H)；13CNMR(100MHz,Chloroform-d)δ168.92,160.54,152.58,151.58,145.72,132.71,130.70,129.12,126.88,126.24,125.86,124.90,122.70,122.27,121.65,118.68,116.75；HRMS(ESI-TOF):m/z331.0781[M+H]+,calc’d.331.0779。
实施例4、荧光探针SC1的制备
步骤a)：在-5度下，将5.00g水杨醛加入到300mL5％氢氧化钠的水溶液中，再向溶液中滴加1.15g苯基重氮氯盐，搅拌反应1小时后有大量黄色固体析出，过滤，冷水洗涤三次，得到中间体式(V)所示取代的5-偶氮基苯基水杨醛1.10g(产率为59％)。
步骤b)：在惰性气氛下，将0.40g5-偶氮基苯基水杨醛和0.22g2-氨基苯硫酚加入到7mL异丙醇中，于30度下搅拌反应10小时后，向体系中加入20mL水，有大量黄色固体析出，过滤，洗涤，真空干燥，得到最后产物SC1320mg(产率为55％)，黄色固体。
1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.30(d,J＝2.1Hz,1H),8.03–7.97(m,2H),7.94–7.88(m,3H),7.55–7.49(m,3H),7.47(d,J＝7.0Hz,1H),7.42(t,J＝7.8Hz,1H),7.20(d,J＝8.9Hz,1H)；13CNMR(100MHz,Chloroform-d)δ168.92,160.54,152.58,151.58,145.72,132.71,130.70,129.12,126.88,126.24,125.86,124.90,122.70,122.27,121.65,118.68,116.75；HRMS(ESI-TOF):m/z331.0781[M+H]+,calc’d.331.0779。
实施例5、荧光探针SC1的制备
步骤a)：在10度下，将5.00g水杨醛加入到300mL5％氢氧化钠的水溶液中，再向溶液中滴加0.72g苯基重氮氯盐，搅拌反应3小时后有大量黄色固体析出，过滤，冷水洗涤三次，得到中间体式(V)所示取代的5-偶氮基苯基水杨醛0.50g(产率为43％)。
步骤b)：在惰性气氛下，将0.40g5-偶氮基苯基水杨醛和0.15g2-氨基苯硫酚加入到7mL乙醇中，于20度下搅拌反应15小时后，向体系中加入20mL水，有大量黄色固体析出，过滤，洗涤，真空干燥，得到最后产物SC1220mg(产率为56％)，黄色固体。
1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.30(d,J＝2.1Hz,1H),8.03–7.97(m,2H),7.94–7.88(m,3H),7.55–7.49(m,3H),7.47(d,J＝7.0Hz,1H),7.42(t,J＝7.8Hz,1H),7.20(d,J＝8.9Hz,1H)；13CNMR(100MHz,Chloroform-d)δ168.92,160.54,152.58,151.58,145.72,132.71,130.70,129.12,126.88,126.24,125.86,124.90,122.70,122.27,121.65,118.68,116.75；HRMS(ESI-TOF):m/z331.0781[M+H]+,calc’d.331.0779。
实施例6、式(I)所示化合物的光谱性质
称取3.9mgSC1，溶于10mLDMSO，配成母液(1mM),即得到SC1试剂盒。将100μL的此母液滴加到不同浓度次氯酸根(ClO-)的磷酸盐缓冲液中，并用相应的磷酸盐缓冲液定容到10mL。测量其荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时以400nm进行激发，发射峰的强度为I466；激发和发射的狭缝宽度分别为3/5。
图2为SC1试剂盒对次氯酸根(ClO-)水溶液的颜色响应图。由图2知，当加入次氯酸根(ClO-)水溶液后，肉眼观察到溶液的颜色由深黄色变为浅黄色，同时溶液的荧光也由几乎无荧光变为亮蓝色荧光。证明本发明试剂盒对次氯酸根(ClO-)具有直观的显色响应。
图3为SC1试剂盒对不同次氯酸根(ClO-)水溶液的荧光响应图。由图3知，随着次氯酸根(ClO-)浓度的增加，波长为466nm处的发射峰的荧光强度逐渐增大，证明本发明试剂盒对次氯酸根(ClO-)具有灵敏的荧光“开-关”型响应。
图4为SC1试剂盒在波长466nm下的荧光发射强度I466与次氯酸根(ClO-)浓度的关系曲线。由图4知，随着水溶液中次氯酸根(ClO-)浓度的增加，荧光在波长466nm下的发射强度I466逐渐增大。在次氯酸根(ClO-)浓度为0～0.1mM的范围内，发射峰的荧光强度I466与水溶液中次氯酸根(ClO-)的浓度呈良好的线性关系(R2＝0.99428)。证明本发明试剂盒可以对次氯酸根(ClO-)进行准确测量。
图5为SC1试剂盒对常见共存离子或生物小分子的荧光响应图。由图5知，常见共存阳离子、阴离子、生物小分子的加入并不能使溶液的荧光在波长466nm下的发射强度I466发生改变。证明本发明试剂盒对次氯酸根(ClO-)具有优秀的选择性。
实施例7、细胞内次氯酸根(ClO-)含量的测定
1)在37度和5％(v/v)CO2条件下，用含有10％(v/v)FBS(胎牛血清)、100U/mL盘尼西林、100μg/mL的链霉素的DMEM培养基培养HeLa细胞。细胞使用前用PBS缓冲液清洗。
2)在HeLa细胞中加入PBS(pH7.4)，再加入SC1(5μM)孵育30min，用PBS洗三遍后，进行共聚焦荧光成像，其中激发波长为400nm，收集波段为400-650nm。然后，向上述HeLa细胞中再加入NaClO(10μM)的磷酸缓冲盐溶液，继续孵育30min后，在激光共聚焦显微镜上进行成像，其中激发波长为400nm，收集波段为400-650nm。
由图6知，载有SC1的细胞在未加次氯酸根(ClO-)之前几乎无荧光发射，表明SC1具有很好的生物相容性和光学稳定性。而当加入次氯酸根(ClO-)以后，细胞呈现明显的蓝色荧光发射，表明SC1具有良好的细胞膜通透性并可以在细胞内与次氯酸根(ClO-)发生特异性响应。证明本发明试剂盒可以对细胞内的次氯酸根(ClO-)进行检测。
最后应说明的是，上述实施例仅举出以SC1化合物为荧光试剂，其余荧光试剂由于结构与性质相近，其浓度、实验激发波段选择不一一列出，然而其并非用于限定本发明。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，应当以作出各种修改和变更。
Claims (6)
1.检测次氯酸根的荧光探针,其特征在于：该荧光探针的结构式为式(I)；
式(I)中，R为氢，或甲氧基，或羟基，或氯，或氟，或硝基，或羧基，或磺酸基中的任何一种。
2.根据权利要求1所述检测次氯酸根的荧光探针，其特征在于：其结构式如式(II)，
3.检测次氯酸根的荧光探针的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
步骤一：在弱碱性条件下，式(III)所示水杨醛与式(IV)所示苯基重氮化合物在水中反应得到式(V)所示取代的5-偶氮基苯基水杨醛；
式(IV)与式(V)中，R为氢，或甲氧基，或羟基，或氯，或氟，或硝基，或羧基，或磺酸基中的任何一种；
步骤二：在惰性气氛下，在双氧水的存在下，式(V)所示化合物与2-氨基苯硫酚在醇中反应即得式(I)所示化合物；
步骤一中所述式(III)所示水杨醛和式(IV)所述苯基重氮化合物的摩尔比为1～10:1；所述苯基重氮化合物为氯盐；步骤一的反应温度为-10～25度；反应时间为0.1～5小时；
步骤二中所述醇为甲醇，乙醇，叔丁醇，异丙醇；式(V)所示取代的5-偶氮基苯基水杨醛和所述2-氨基苯硫酚的摩尔比为0.5～2:1；步骤二的反应温度为0～50度；反应时间为1～20小时。
4.根据权利要求3所述的检测次氯酸根的荧光探针的制备方法；其特征在于：
步骤一中，反应温度为0度；反应时间为0.5小时；，式(III)所示水杨醛和式(IV)所述苯基重氮化合物的摩尔比为2:1。
5.根据权利要求3所述的检测次氯酸根的荧光探针的制备方法；其特征在于：
步骤二中，反应温度为30度，反应时间为5小时，醇为乙醇；式(V)所示取代的5-偶氮基苯基水杨醛和所述2-氨基苯硫酚的摩尔比为0.8：1。
6.检测次氯酸根的荧光探针的使用方法；其特征在于：
步骤1：向不同浓度次氯酸根(ClO-)的缓冲溶液中加入相同浓度的式(I)所示化合物，配置至少5种不同次氯酸根(ClO-)含量的含有式(I)所示化合物的标准溶液；
所示缓冲溶液以是磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、HEPES缓冲溶液或硼酸-硼酸钠缓冲溶液；
所示标准溶液的pH值为5～11；
所示标准溶液中式(I)所示化合物的浓度为1nM～1μM；
所示标准溶液中次氯酸根(ClO-)的含量为0.1nM～1mM；
步骤2：分别测定所述标准溶液的荧光发射光谱，激发波长为400nm，以次氯酸根(ClO-)浓度为横坐标，以I466为纵坐标，建立标准曲线；
I466表示所述标准溶液在波长为466nm处的荧光发射峰强度值；
步骤3：向待测样品中加入式(I)所示化合物，控制其浓度与所述标准溶液中式(I)所示化合物的浓度相等；测定其在激发波长为400nm的激发光下的荧光发射谱，即根据标准曲线计算得出待测样品的次氯酸根(ClO-)含量。
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| CN105441065B (zh) | 2018-05-25 |
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Denomination of invention: Fluorescent probe for detecting hypochlorite ion and its preparation method and application method Effective date of registration: 20210830 Granted publication date: 20180525 Pledgee: Shandong juancheng Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: Heze Yichi Chemical Co.,Ltd. Registration number: Y2021980008627 |
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Date of cancellation: 20230714 Granted publication date: 20180525 Pledgee: Shandong juancheng Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: Heze Yichi Chemical Co.,Ltd. Registration number: Y2021980008627 |
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Denomination of invention: Fluorescent probe for detection of hypochlorite ion and its preparation and application methods Effective date of registration: 20230718 Granted publication date: 20180525 Pledgee: Shandong juancheng Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: Heze Yichi Chemical Co.,Ltd. Registration number: Y2023980048890 |